Bajar el manual completo - EU-RL GMFF

Transcripción

CURSO DE FORMACIÓN SOBRE
ANÁLISIS DE LA PRESENCIA DE
ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS
EN MUESTRAS DE ALIMENTOS
MANUAL DEL
PARTICIPANTE
Editado por Maddalena Querci, Marco Jermini y Guy Van den Eede
La presente publicación también se encuentra on-line en la dirección siguiente:
http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/documentation.htm
ISBN: 978-92-79-04831-9
Numero de catalogo: LB-X1-07-033-ES-C
WORLD HEALTH ORGANIZATION
REGIONAL OFFICE FOR EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE
BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE
ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD
OFICINA REGIONAL PARA EUROPA
ANÁLISIS DE LA PRESENCIA DE
ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS
EN MUESTRAS DE ALIMENTOS
MANUAL DEL
PARTICIPANTE
La presente publicación también se encuentra on-line en la dirección siguiente:
http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/documentation.htm
ISBN: 978-92-79-04831-9
Numero de catalogo: LB-X1-07-033-ES-C
II
Ni la Comisión Europea ni ninguna persona que actúe en su nombre se responsabilizará del
uso que pudiera hacerse de esta información.
Puede obtenerse información sobre la Unión Europea
a través del servidor Europa
en la siguiente dirección de Internet
http://europa.eu
Luxemburgo: Oficina de Publicaciones Oficiales
de las Comunidades Europeas, 2007
ISBN-978-92-79-04831-9
© Comunidades Europeas, 2007
Reproducción autorizada, con indicación de la fuente bibliográfica
Printed in Italy
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos
III
EDITORES
Maddalena QUERCI
Comisión Europea
Centro Común de Investigación
Instituto de la Salud y la Protección de los Consumidores
Unidad de biotecnología y OGM
Coordinadora del área científica de la biología molecular
Dirección electrónica: [email protected]
Marco JERMINI
Repubblica e Cantone Ticino http://www.ti.ch
Dipartimento della sanità e della socialità
Divisione della salute pubblica
Laboratorio Cantonale - Bellinzona
Guy VAN DEN EEDE
Comisión Europea
Centro Común de Investigación
Instituto de la Salud y la Protección de los Consumidores
Unidad de biotecnología y OGM
Jefe de Unidad
IV
V
Prólogo
El Instituto de la Salud y la Protección de los Consumidores del Centro Común de
Investigación de la Comisión Europea y el Programa de Seguridad Alimentaria
dentro del Centro Europeo para el Medio Ambiente y la Salud (División de Roma) de
la Organización Mundial de la Salud han organizado conjuntamente una serie de
cursos de formación sobre «Análisis de la presencia de organismos genéticamente
modificados en muestras de alimentos».
El Centro Común de Investigación presta apoyo científico y técnico a las políticas
comunitarias colaborando con las direcciones generales de la Comisión Europea e
interactuando con las instituciones, organizaciones e industrias europeas mediante
la formación de redes con laboratorios de los Estados miembros. La tarea general
del Centro Europeo para el Medio Ambiente y la Salud de la OMS es prestar ayuda
de forma completa y coordinada tanto a las autoridades como a los ciudadanos
europeos en el ámbito de la salud ambiental. Estos cursos de formación se inscriben
en la colaboración entre ambas instituciones para fomentar aspectos relativos a la
inocuidad de los alimentos en la región europea de la OMS, tanto dentro como fuera
de las fronteras de la propia UE, teniendo en cuenta especialmente los países
candidatos a la adhesión a la UE, así como los países de Europa central y oriental
con economías de transición.
El objetivo de los cursos de formación es ayudar al personal de los laboratorios de
control a familiarizarse con las técnicas de detección molecular y a adaptar sus
instalaciones y programas de trabajo para permitir la realización de análisis que se
ajusten a los actos normativos a escala mundial en el campo de la biotecnología.
Los cursos se destinan a enseñar técnicas de detección molecular a personal de
laboratorio con buen nivel de conocimientos analíticos, pero con poca o ninguna
experiencia en este ámbito concreto.
El Centro Común de Investigación se ha comprometido a proporcionar formación
sobre la detección y cuantificación de los OGM y, además de los cursos de
formación, ofrece (y ha ofrecido en el pasado) formación individual para
VI
necesidades específicas. Se ha pedido con frecuencia formación sobre este tema
debido a su importancia ante el aumento de la necesidad de cumplir la normativa
europea, tanto vigente como en fase de elaboración.
A lo largo de los años, la Unidad de biotecnología y OGM ha conseguido un
profundo conocimiento de los diferentes aspectos relativos a la detección y
cuantificación de los OGM, y ha elaborado, adaptado o validado métodos
avanzados para su detección y cuantificación.
El conocimiento de estas técnicas se ha transferido a los laboratorios colaboradores
mediante publicaciones, proyectos conjuntos, formación individual o cursos
específicos. También se han explicado detalles técnicos a personal en formación
mediante presentaciones verbales o breves notas escritas. La Unidad de
biotecnología y OGM, consciente de la necesidad de disponer de una fuente
permanente de información, ha redactado el presente Manual, que describe algunas
de las técnicas utilizadas en nuestro laboratorio.
A lo largo de los cursos se atiende a los siguientes temas:
-
extracción de ADN de materias primas y productos transformados
-
cribado de productos alimentarios para detectar la presencia de OGM
mediante reacción en cadena de la polimerasa, tanto simple como anidada
-
cuantificación de OGM en ingredientes mediante reacción en cadena de la
polimerasa en tiempo real
-
cuantificación de OGM en ingredientes mediante prueba de inmunoabsorción
enzimática.
El Manual se ha preparado en el Instituto de la Salud y la Protección de los
Consumidores del Centro Común de Investigación, como información de base para
los participantes en los cursos y con la finalidad de proporcionar una información
teórica y práctica sobre las metodologías y protocolos utilizados en la actualidad. La
materia abarca una amplia variedad de técnicas de detección, identificación,
caracterización y cuantificación de OGM, y se incluye información teórica que se
considera importante y básica para quien desee introducirse y trabajar en el campo
de la detección de OGM.
VII
Esperamos que la estructura y el contenido del Manual ayuden a los participantes
en el curso (y también a otros usuarios) para la transmisión y difusión de las
capacidades adquiridas en el contexto de los diferentes entornos de trabajo según
las necesidades.
No se ha intentado en ningún momento competir con la información disponible en
libros de texto o publicaciones periódicas. Lo que pretende el Manual es
complementar la información que se encuentra en la literatura especializada.
Para facilitar su difusión y consulta, esta publicación se encuentra también en línea
en la dirección: http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/documentation.htm.
Los miembros del personal del CCI que han participado en la preparación del
Manual han sido supervisados por Maddalena Querci y se mencionan en el índice
junto a su aportación.
Vaya desde aquí nuestro agradecimiento especial también a todos los miembros del
personal de la Unidad de biotecnología y OGM que, aunque no se mencionen uno a
uno, han contribuido al éxito de la preparación del Manual.
Manifestamos también nuestro agradecimiento a Margarita Aguilera-Gomez por su
colaboración en la revisión del Manual.
Dra. Maddalena Querci
Coordinadora del curso
Junio de 2006
VIII
Observaciones iniciales de la Organización Mundial de la Salud
La Organización Mundial de la Salud otorga gran prioridad a la seguridad en el uso y
aplicación de la biotecnología moderna para la producción y transformación de
alimentos. Por este motivo, desde los primeros años noventa la OMS trabaja mucho
en la organización de consultas con expertos sobre la inocuidad de los alimentos
derivados de la biotecnología. En mayo de 2000, la LIII Asamblea Mundial de la
Salud adoptó una resolución en el sentido de que la OMS debía ayudar a los
Estados miembros a aportar una base científica para las decisiones sobre la salud
en relación con los alimentos modificados genéticamente. Asimismo, el Consejo
Ejecutivo de la OMS contempló la posibilidad de que se exploraran otras
consideraciones pertinentes en colaboración con otros organismos.
La Comisión del Codex Alimentarius (CCA) es un organismo intergubernamental
creado para elaborar normas internacionales sobre los alimentos. Su objetivo
primario es proteger la salud de los consumidores y garantizar unas prácticas leales
en el comercio alimentario. La OMS es una de las organizaciones madre de la CCA
desde su creación en 1963. En el marco de las actividades del Codex Alimentarius,
la OMS y su organización hermana dentro de la ONU, la FAO, participan en el
Grupo de acción intergubernamental especial del Codex sobre alimentos obtenidos
por medios biotecnológicos, en el Comité del Codex sobre etiquetado de los
alimentos y en el Comité del Codex sobre métodos de análisis y muestreo.
El Programa de Seguridad Alimentaria en Europa de la OMS colabora con el Centro
Común de Investigación (CCI) de la Comisión Europea desde el año 2000 en la
organización de cursos de formación sobre técnicas de detección de organismos
genéticamente modificados (OGM) en alimentos. La finalidad de esta formación es
capacitar en biotecnología analítica al personal de los laboratorios de control de
alimentos y fomentar el uso de métodos validados y armonizados para detectar
OGM en Europa y en el resto del mundo.
Unos métodos adecuados de análisis y muestreo son fundamentales para que un
etiquetado apropiado de los alimentos aumente la transparencia de los procesos de
producción y facilite la trazabilidad, lo que redundará en la mejora de los sistemas
IX
de seguridad de los alimentos. Para permitir un acceso más amplio a estos
métodos, se ha decidido publicar en la red el Manual utilizado durante los cursos de
formación conjuntos CCI/OMS. Los métodos presentados en este Manual se ajustan
a los considerados por el Comité del Codex sobre métodos de análisis y muestreo.
El Programa de Seguridad Alimentaria de la OMS en Europa reconoce la
importancia de la colaboración con el Centro Común de Investigación de la
Comisión Europea, institución científica reconocida en todo el mundo en el ámbito
de los OGM, y seguirá fomentando las actividades de capacitación en el ámbito de
los métodos de detección de OGM en los alimentos, tanto en Europa como en otras
regiones.
Dra. Cristina Tirado, veterinaria
Consejera Regional de Seguridad Alimentaria de la OMS en Europa
X
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en
Muestras de Alimentos
MANUAL DEL PARTICIPANTE
Índice
Sesión
Titulo
Autores
1
Panorama, introducción general sobre los
organismos genéticamente modificados (OGM),
legislación comunitaria
M. Querci, G. Van den Eede,
M. Jermini
2
Presentación del Manual, métodos de trabajo e
introducción del curso
M. Querci
3
Muestras utilizadas durante el curso
M. Querci, N. Foti
4
Extracción y purificación de ADN
M. Somma
5
Electroforesis en gel de agarosa
M. Somma, M. Querci
6
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
M. Somma, M. Querci
7
Características de la soja Roundup Ready, del
maíz MON810 y del maíz Bt-176
M. Querci, M. Mazzara
8
Características de los sistemas cualitativos de
PCR descritos en el Manual
M. Querci, M. Mazzara
9
Detección cualitativa mediante PCR del maíz
MON810, del maíz Bt-176 y de la soja Roundup
Ready
M. Querci, M. Maretti,
M. Mazzara
10
PCR cuantitativa para la detección de OGM
F. Weighardt
11
Detección cuantitativa de la soja Roundup Ready
mediante PCR en tiempo real
N. Foti
12
Detección cuantitativa de la soja Roundup Ready
mediante ELISA
F. Eyquem
Apéndice Ejemplo de programa de trabajo
M. Querci
Análisis de la Presencia de Organismos
Genéticamente Modificados en Muestras de
Alimentos
Sesión nº 1
Panorama, Introducción General sobre los
Organismos Genéticamente Modificados (OGM),
Legislación Comunitaria
M. Querci, G. Van den Eede, M. Jermini
Panorama, Introducción General sobre los Organismos Genéticamente Modificados (OGM), Legislación Comunitaria
2
Índice
Sesión nº 1
Panorama, Introducción General sobre los Organismos
Genéticamente Modificados (OGM), Legislación Comunitaria
Introducción
3
Modificación genética de los vegetales
4
Legislación comunitaria
5
Inocuidad y etiquetado de alimentos obtenidos mediante la biotecnología moderna; la
perspectiva de la OMS
13
Anexo 1. Legislación comunitaria sobre la comercialización de OGM, con inclusión de los
programas relacionados de etiquetado y control
17
Sesión nº 1
3
Introducción
Aparte del abanico de líneas vegetales modificadas genéticamente desplegado por partes
de las regiones agrícolas del mundo, todos los cultivares actualmente cultivados son
producto de la domesticación intensiva a partir de un estado silvestre original mediante la
continuidad de la selección y la reproducción controlada para conseguir un producto más
productivo, más resistente a las plagas o de una calidad mejor o diferente respecto a las
líneas ancestrales anteriores. Tales cambios, que se llevan produciendo desde la primera
domesticación de plantas para su explotación por el hombre, implican el intercambio o
recombinación de caracteres deseados, o genes, mediante el cruce continuo a lo largo del
tiempo dentro de una especie o entre grupos de especies con estrecha relación y
compatibles sexualmente. En las últimas décadas se ha hecho posible producir cruces no
solo entre plantas que son compatibles en la naturaleza, sino también entre plantas cuyos
cruces se consideran estériles naturalmente. Como ejemplos de técnicas que se utilizan en
tales casos pueden citarse las de recuperación de embriones, el cultivo de embriones in
vitro o in vivo, los cultivos de óvulos y ovarios, la polinización in vitro y la fertilización in vitro.
Por otra parte, pueden obtenerse cambios mutacionales, por ejemplo mediante irradiación
de semillas.
Los procedimientos tradicionales de hibridación y selección presentan una serie de
inconvenientes. Uno de los principales es que los obtentores suelen desear introducir
determinados caracteres aislados, más que transferir y recombinar genomas enteros. Otro
consiste en que la selección y clasificación de variedades genéticamente estables es un
proceso lento.
Parece que estas desventajas se alivian mediante la aplicación de tecnologías de
transformación y recombinación de ADN. Se ha introducido el término «organismos
genéticamente modificados» (OGM) para describir a los organismos cuyo material genético
se ha modificado de una forma que no se da en la naturaleza en condiciones normales de
hibridación o recombinación natural. El OGM en sí debe ser una unidad biológica capaz de
multiplicarse o transmitir material genético. Aplicado a los vegetales, el término se refiere a
plantas en cuyo genoma (hospedador) se han introducido de forma estable uno o varios
genes procedentes de otras especies, mediante técnicas de transferencia genética y
cuando en la mayoría de los casos se ha comprobado que tales genes introducidos hacen
que se obtenga un producto génico (una proteína). El proceso de introducir genes en
especies no emparentadas y conseguir que funcionen se denomina «transformación
genética».
El análisis de notificaciones de liberaciones experimentales en la UE pone de manifiesto
como caracteres estudiados con mayor frecuencia los siguientes: tolerancia a los
Sesión nº 1
4
herbicidas, restauración de la fertilidad o esterilidad masculina, resistencia a los insectos
derivada de Bacillus thurigiensis, resistencia a los virus, resistencia a los hongos y
alteración
de
la
biosíntesis
de
almidón
(para
más
información,
véase
en
http://gmoinfo.jrc.ec.europa.eu/).
Modificación genética de los vegetales
Aunque hay muchas variaciones sobre el tema de la transformación de los vegetales, son
pocos los métodos principales de modificación genética de estos seres vivos. La primera de
las tecnologías, desarrollada en la década de 1980, utiliza una especie bacteriana
(Agrobacterium tumefaciens) para conseguir el gen que interesa introducir en el vegetal
hospedador.
Agrobacterium, microorganismo patógeno para los vegetales, se conoce desde el inicio del
siglo XX. En la naturaleza, A. tumefaciens tiene la excepcional capacidad de transferir un
segmento particular de ADN (ADN-T) de su plásmido inductor de tumores (Ti) al núcleo de
las células infectadas, donde se integra después de forma estable en el genoma
hospedador y se transcribe, provocando la enfermedad de la agalla de la corona. El
fragmento ADN-T está flanqueado por repeticiones directas de 25 pares de bases, que
actúan como señal de elemento cis para la maquinaria de transferencia.
Los científicos aprovechan el fenómeno de que cualquier ADN extraño situado entre estos
extremos de ADN-T puede transferirse a células vegetales para desarrollar cepas de
Agrobacterium en que se ha sustituido algún gen patógeno por ADN seleccionado
específicamente.
Desde este descubrimiento se ha logrado avanzar notablemente en la comprensión del
proceso de transferencia génica a células vegetales mediante Agrobacterium. No obstante,
la especie Agrobacterium tumefaciens infecta de forma natural solo a plantas
dicotiledóneas, por lo que muchos vegetales de importancia económica, como los cereales
(que son monocotiledóneas), han quedado en gran medida al margen de la manipulación
genética. Para estos casos se han desarrollado métodos alternativos de transformación
directa, como la transferencia mediante polietilenglicol, la microinyección, los protoplastos y
la tecnología de electroporación de células intactas y lanzagenes (biolística).
Sin embargo, la transformación mediante Agrobacterium tiene diversas ventajas sobre los
métodos de transformación directa. Principalmente, reduce el número de ejemplares del
transgén, lo que puede hacer que se produzcan menos problemas de cosupresión e
inestabilidad de los transgenes.
Sesión nº 1
5
En ambos casos, las células (tanto las infectadas con Agrobacterium como las obtenidas
con el lanzagenes «biolístico») se utilizan para regenerar plantas completas, que llevan el
nuevo gen o genes de interés. Estas plantas son objeto de pruebas, se reproducen de
forma intensiva y finalmente proporcionan semillas para una nueva generación de líneas
vegetales modificadas genéticamente.
Legislación comunitaria1, 2
El uso de organismos genéticamente modificados (su liberación al medio ambiente, cultivo,
importación y, en particular, su utilización como alimentos o ingredientes alimentarios) está
reglamentado en la Unión Europea mediante un conjunto de procedimientos estrictos. Los
primeros instrumentos jurídicos de la Comunidad (Directiva 90/220/CEE del Consejo y
Directiva 90/219/CEE del Consejo) se publicaron en 1990 con el propósito específico de
proteger la salud humana y animal y el medio ambiente.
Actualmente, el principal instrumento jurídico comunitario, considerado como el marco
jurídico horizontal que rige el sector de la biotecnología en la Unión Europea, es la Directiva
2001/18/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 12 de marzo de 2001, sobre la
liberación intencional en el medio ambiente de organismos genéticamente modificados. La
Directiva 2001/18/CE deroga a la Directiva 90/220/CEE del Consejo y refuerza las normas
anteriores sobre la liberación de OGM en el medio ambiente, estableciendo principios de
evaluación del riesgo ambiental, obligaciones de seguimiento (ambiental) tras la
comercialización, información al público, etiquetado y trazabilidad en todas las fases de
comercialización, y la creación de un registro molecular, entre otras medidas.
Según la Directiva 2001/18/CE, las autorizaciones vigentes concedidas en virtud de la
Directiva 90/220/CEE del Consejo deben renovarse para evitar disparidades y tener
plenamente en cuenta las condiciones de autorización establecidas en la Directiva
2001/18/CE. La autorización (renovable) se concede por un plazo máximo de diez años a
partir de la fecha de la autorización.
Tras la comercialización de un OGM como producto o componente de un producto, el
notificador debe velar por que el seguimiento tras la comercialización y la presentación de
informes se lleven a cabo con arreglo a las condiciones especificadas en la autorización.
1
En el anexo 1 se encuentra una lista casi completa, aunque no exhaustiva, de los Reglamentos y Directivas de
la Unión Europea sobre OGM.
2
La situación reflejada es la del 9 de junio de 2004.
Sesión nº 1
6
Cuadro 1. Vegetales modificados genéticamente y autorizados para su comercialización en
la UE según la Directiva 90/220/CEE del Consejo
Producto
Línea
Claveles
Claveles
Notificante
Caracteres principales
Número de la Decisión de la
Comisión/fecha
Florigene
Color de la flor
modificado
20.10.1998 (autorización del Estado
Duración modificada de
la flor cortada
Color de la flor
modificado
Florigene
Claveles
Florigene
miembro)
miembro)
miembro)
Maíz
Zea mays L.
línea MON 810
Monsanto
Expresión del gen
cryIA(b) de Bt
98/294/CE de 22 de abril de 1998
Maíz*
Zea mays L.
línea Bt-11
Novartis
Tolerancia al glufosinato
de amonio y expresión
del gen cryIA(b) de Bt
Maíz
Zea mays L.
T25
AgrEvo
de amonio
Colza de
primavera*
Brassica napus
L. ssp. oleifera
AgrEvo
de amonio
Colza
Brassica napus
L. oleifera
Metzg. MS1,
RF2
Plant
Genetic
Systems
de amonio
97/393/CE de 6 de junio de 1997
Colza
Brassica napus
L. oleifera
Metzg. MS1,
RF1
Plant
Genetic
Systems
de amonio
Maíz
Zea mays L.
línea Bt-176
(maíz
Maximizer)
Ciba-Geigy
de amonio y expresión
del gen de la endotoxina
de Bt
97/98/CE de 23 de enero de 1997
Achicoria
con
esterilidad
masculina**
Cichorium
intybus L.
Bejo-Zaden
BV
de amonio
96/424/CE de 20 de mayo de 1996
Soja*
Glycine max L.
(Roundup
Ready)
Monsanto
Tolerancia al glifosato
Colza
Brassica napus
L. oleifera
Metzg. MS1Bn
x RF1Bn
Plant
Genetic
Systems
de amonio
96/158/CE de 6 de febrero de 1996
Tabaco
Variedad ITB
1000 OX
SEITA
Tolerancia al bromoxinilo
* Cultivo en la UE no autorizado.
** Solo para la producción de semillas.
Sesión nº 1
7
La Directiva 2001/18/CE, aplicada en cada Estado miembro mediante normas nacionales,
se refiere tanto a los ensayos de campo a pequeña escala (liberaciones voluntarias con
fines experimentales, objeto de la parte B de la Directiva) como a las disposiciones de
comercialización de los OGM (objeto de la parte C). Como se indica en el cuadro 1, se ha
autorizado un total de 18 OGM según el antiguo procedimiento 90/220/CEE (de ellos,
quince se refieren a vegetales, tres de los cuales por autorización de los Estados
miembros). Hasta ahora, se han presentado más de 25 solicitudes de comercialización de
OGM para su autorización según la Directiva 2001/18/CE (para obtener mas información
sobre la situación de los expedientes en la dirección http://gmoinfo.jrc.ec.europa.eu/).
La utilización confinada de microorganismos genéticamente modificados se regula mediante
una Directiva «hermana» (Directiva 98/81/CE del Consejo, de 26 de octubre de 1998, por
la que se modifica la Directiva 90/219/CEE relativa a la utilización confinada de
microorganismos genéticamente modificados).
Además de las Directivas antes mencionadas, a lo largo de los años se ha ido elaborando y
aplicando una serie de instrumentos jurídicos verticales, en los que se trata más
específicamente la aprobación y la seguridad en el uso de los OGM destinados al consumo
humano. La comercialización dentro de la Comunidad de nuevos alimentos y nuevos
ingredientes alimentarios era objeto hasta hace poco de un acto legislativo vertical, el
Reglamento (CE) nº 258/97, que se refería específicamente a lo siguiente:
- alimentos e ingredientes alimentarios que contengan organismos genéticamente
modificados con arreglo a la Directiva 90/220/CEE, o que consistan en dichos organismos;
- alimentos e ingredientes alimentarios producidos a partir de organismos genéticamente
modificados, pero que no los contengan;
- alimentos e ingredientes alimentarios de estructura molecular primaria nueva o modificada
intencionadamente;
- alimentos e ingredientes alimentarios consistentes en microorganismos, hongos o algas u
obtenidos a partir de estos;
- alimentos e ingredientes alimentarios consistentes en vegetales, u obtenidos a partir de
ellos, e ingredientes alimentarios obtenidos a partir de animales, excepto los alimentos e
ingredientes alimentarios obtenidos mediante prácticas tradicionales de multiplicación o de
selección y cuyo historial de uso alimentario sea seguro;
- alimentos e ingredientes alimentarios que se hayan sometido a un proceso de producción
no utilizado habitualmente, que provoca en su composición o estructura cambios
significativos que afectan a su valor nutritivo, a su metabolismo o a su contenido en
sustancias indeseables.
Sesión nº 1
8
La cuestión concreta del etiquetado de alimentos GM (modificados genéticamente) es
objeto de varios instrumentos jurídicos. Los requisitos de etiquetado se mencionaban por
primera vez en el Reglamento (CE) nº 258/97 (Reglamento sobre nuevos alimentos), pero
ciertas líneas GM de maíz y de soja fueron sometidas posteriormente a normas de
etiquetado al entrar en vigor el Reglamento (CE) nº 1139/98 del Consejo.
De hecho, como antes de que entrara en vigor el Reglamento (CE) nº 258/97 ya se habían
comercializado dos OGM (la soja Roundup Ready y el maíz Maximizer), en el Reglamento
(CE) nº 1139/98 se establecieron a posteriori requisitos de etiquetado específicos para
ellos.
En el Reglamento (CE) nº 258/97 se establecían requisitos específicos de etiquetado para
que el consumidor final estuviera informado de cualquier cambio de las características o
propiedades alimentarias, tales como la composición, el valor nutritivo o los efectos
nutritivos, o el uso previsto del alimento, responsable de que un nuevo alimento o
ingrediente alimentario dejara de ser equivalente a un alimento o ingrediente alimentario
existente. Actualmente, se han autorizado y pueden comercializarse legalmente en la UE
productos de diecisiete modificaciones genéticas (véase el cuadro 2). Una soja GM y un
maíz GM fueron autorizados en virtud de la Directiva 90/220/CEE antes de la entrada en
vigor del Reglamento sobre nuevos alimentos. Los demás (alimentos transformados
derivados principalmente de siete colzas oleaginosas GM y cinco maíces GM, y aceite de
dos semillas de algodón GM) se han notificado como sustancialmente equivalentes de
acuerdo con el Reglamento sobre nuevos alimentos y se han autorizado según el
procedimiento simplificado.
El Reglamento (CE) nº 1139/98 del Consejo establecía un modelo de etiquetado basado en
el principio de que un alimento o ingrediente GM deja de considerarse equivalente a uno
existente no GM si puede detectarse la presencia de ADN o de proteína derivados de la
modificación genética. Los aditivos estaban excluidos de los requisitos de etiquetado hasta
la entrada en vigor del Reglamento (CE) nº 50/2000 de la Comisión.
El Reglamento (CE) nº 1139/98 fue modificado posteriormente por el denominado
«Reglamento de umbrales» (Reglamento (CE) nº 49/2000 de la Comisión, de 10 de enero
de 2000, por el que se modifica el Reglamento (CE) nº 1139/98 del Consejo), que intentaba
resolver el problema planteado por la contaminación inadvertida e introducía el concepto de
umbral.
Sesión nº 1
9
Cuadro 2. Alimentos modificados genéticamente autorizados en la Unión Europea3
Modificación
1
GTS 40/3/2
Vegetal
Soja
Solicitante
Rasgo
Posibles usos
alimentarios
Fecha
Base
jurídica
Monsanto
Protección
contra
insectos y
tolerancia a
herbicidas
Alimentos de soja
incluidos bebidas,
tofu, aceite, harina
o lecitina.
3.4. 96
Dir.
90/220/CEE,
art. 13
Alimentos de maíz
incluidos granos,
aceite, harina de
maíz, azúcar y
jarabe.
23.1. 97
Dir.
90/220/CEE,
art. 13
2
Bt 176
Maíz
Ciba-Geigy
Protección
contra
insectos y
tolerancia a
herbicidas
3
TOPAS 19/2
Colza
oleaginosa
AgrEvo
Tolerancia a
herbicidas
Tolerancia a
herbicidas
Aceite de colza.
Entre los productos
obtenidos del
aceite de colza
pueden citarse
alimentos fritos,
productos de
panadería y
aperitivos.
24.6. 97
Reg. (CE) nº
258/97, art. 5
24.6. 97
Reg. (CE) nº
258/97, art. 5
24.6. 97
Reg. (CE) nº
258/97, art. 5
21.11. 97
Reg. (CE) nº
258/97, art. 5
6.2. 98
Reg. (CE) nº
258/97, art. 5
6.2.98
Reg. (CE) nº
258/97, art. 5
6.2.98
Reg. (CE) nº
258/97, art. 5
23.10.98
Reg. (CE) nº
258/97, art. 5
8.11.99
Reg. (CE) nº
258/97, art. 5
8.11.99
Reg. (CE) nº
258/97, art. 5
26.4.00
Reg. (CE) nº
258/97, art. 5
19.12.02
Reg. (CE) nº
258/97, art. 5
19.12. 02
Reg. (CE) nº
258/97, art. 5
4
MS1 / RF2
Colza
oleaginosa
Plant
Genetic
Systems
5
MS1 / RF1
Colza
oleaginosa
Plant
Genetic
Systems
Tolerancia a
herbicidas
6
GT 73
Colza
oleaginosa
Monsanto
Tolerancia a
herbicidas
7
MON 810
Maíz
Monsanto
Protección
contra
insectos
8
T 25
Maíz
AgrEvo
Tolerancia a
herbicidas
9
Bt 11
Maíz
Novartis
Protección
contra
insectos
10
MON 809
Maíz
Pioneer
Protección
contra
insectos
11
Falcon GS
40/90
Colza
oleaginosa
Hoechst /
AgrEvo
Tolerancia a
herbicidas
12
Liberator L62
Colza
oleaginosa
Hoechst /
AgrEvo
Tolerancia a
herbicidas
13
MS8/RF3
Colza
oleaginosa
Plant
Genetic
Systems
Tolerancia a
herbicidas
14
1445
Algodón
Monsanto
15
531
Algodón
Monsanto
Protección
contra
insectos
16
pRF69/pRF93
Bacillus
subtilis
F.
Hoffmann La Roche
Riboflavina
Vitamina B2
23.3. 00
Reg. (CE) nº
258/97, art. 5
17
Bt11
Maíz
Syngenta
Resistencia a
insectos
Maíz dulce
19.5. 04
Reg. (CE) nº
258/97, art. 7
3
Fuente: Comisión Europea:
2010.
Tolerancia a
herbicidas
Derivados de maíz
incluidos aceite de
maíz, harina,
azúcar y jarabe.
Entre los derivados
del maíz pueden
citarse aperitivos,
productos de
panadería,
alimentos fritos,
artículos de
confitería y
refrescos.
Aceite de colza
incluidos alimentos
fritos, productos de
panadería y
aperitivos.
Aceite de semilla
de algodón, los
alimentos fritos,
productos de
panadería y
aperitivos.
http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm.
Último acceso enero de
Sesión nº 1
10
El Reglamento establecía que no se aplicarían a los alimentos los requisitos específicos
adicionales de etiquetado en caso de que la presencia en los ingredientes alimentarios de
material obtenido de los organismos genéticamente modificados no superara la proporción
del 1 % en cada uno de los ingredientes alimentarios.
Por otra parte, a fin de establecer que la presencia de este material era accidental, los
operadores debían aportar pruebas de que habían tomado las medidas oportunas para no
utilizar organismos genéticamente modificados.
Por diversas razones, como la controvertida opinión de diferentes asociaciones de usuarios
en relación con los OGM, las dificultades de interpretación y aplicación de los instrumentos
jurídicos promulgados a lo largo del tiempo o la ausencia de legislación comunitaria
específica sobre piensos GM, se llegó al convencimiento de que era necesario unificar,
actualizar y completar los instrumentos jurídicos en este ámbito.
Finalmente, en octubre de 2003 se publicaron dos Reglamentos que, al modificar o derogar
instrumentos jurídicos anteriores, proporcionaron una guía más completa e informativa
sobre estas cuestiones.
En concreto, se trata de los siguientes: el Reglamento (CE) nº 1829/2003 del Parlamento
Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2003, sobre alimentos y piensos
modificados genéticamente, y el Reglamento (CE) nº 1830/2003 del Parlamento Europeo y
del Consejo, de 22 de septiembre de 2003, relativo a la trazabilidad y al etiquetado de
organismos genéticamente modificados y a la trazabilidad de los alimentos y piensos
producidos a partir de éstos, y por el que se modifica la Directiva 2001/18/CE.
En el Reglamento (CE) nº 1829/2003 se han reforzado y ampliado las normas sobre
evaluación de la seguridad. Mediante este Reglamento se introducen por primera vez
normas específicas sobre piensos GM y se consagran los requisitos de etiquetado de
alimentos y piensos GM, que hasta ahora eran tratados solo parcialmente en el Reglamento
(CE) nº 1139/98 del Consejo y en el Reglamento (CE) nº 49/2000 de la Comisión.
Como característica principal, este Reglamento aplica el principio de una sola llave y una
sola puerta: una sola autorización permite la utilización tanto en alimentos como en piensos,
llenando así el vacío legal sobre la aprobación de productos para piensos y abandonando a
la vez el procedimiento simplificado que se basaba en el concepto de la «equivalencia
sustancial».
De conformidad con el Reglamento (CE) nº 1829/2003 (vigente desde el 18 de abril de
2004), el solicitante debe presentar un expediente completo donde se indique un método de
detección de la modificación genética concreta de que se trate. El expediente y, en
particular, sus partes sobre evaluación del riesgo para el medio ambiente y para la
seguridad de los alimentos, han de ser evaluados por la Autoridad Europea de Seguridad
Sesión nº 1
11
Alimentaria (creada en virtud del Reglamento (CE) nº 178/2002 del Parlamento Europeo y
del Consejo, de 28 de enero de 2002). Los métodos de detección indicados por el solicitante
deben ser evaluados y validados por el laboratorio comunitario de referencia (creado en
virtud del Reglamento (CE) nº 1829/2003).
En el Reglamento se definen nuevos umbrales mínimos para el etiquetado. Se ha reducido
al 0,9 % el umbral del 1 % especificado en el Reglamento (CE) nº 49/2000 de la Comisión
respecto a la presencia accidental de OGM autorizados. Por otra parte, se ha establecido un
umbral del 0,5 % respecto a la presencia accidental de OGM no autorizados, con carácter
transitorio, siempre que hayan sido objeto de un dictamen favorable del comité o comités
científicos pertinentes. La UE reconoce el derecho de los consumidores a la información y al
etiquetado como instrumento para elegir con conocimiento de causa. Desde 1997 es
obligatorio el etiquetado para indicar la presencia de OGM como tales o formando parte de
un producto. Sin embargo, el Reglamento (CE) nº 1830/2003 refuerza las normas vigentes
sobre etiquetado de alimentos GM: extiende el etiquetado obligatorio a todos los alimentos y
piensos, independientemente de la detectabilidad, y define la trazabilidad como la
capacidad de seguir la traza de los OGM y los productos producidos a partir de OGM en
todas las fases de su comercialización a lo largo de las cadenas de producción y
distribución.
Así pues, es necesario disponer de métodos no solo para detectar la eventual presencia de
un OGM en una matriz alimentaria, sino también para identificar el OGM en concreto y
medir su cantidad en diferentes ingredientes de alimentos y piensos.
Pueden utilizarse métodos cualitativos de detección en un cribado inicial de los productos
alimentarios, para investigar la presencia de compuestos específicos (ADN o proteínas) de
OGM. Es posible efectuar así análisis cualitativos de productos muestreados en las
estanterías de los supermercados, en los suministros almacenados en las existencias, o en
otros puntos remontando la cadena de distribución.
Si los análisis cualitativos proporcionan una indicación de la presencia de OGM, con un
ensayo cuantitativo posterior podría obtenerse una respuesta decisiva sobre el requisito de
etiquetado.
Como se ha señalado anteriormente, se introduce en el marco normativo un nuevo
componente fundamental del procedimiento legislativo: el laboratorio comunitario de
referencia (CRL). En el contexto del Reglamento (CE) nº 1829/2003, el CCI, asistido por la
Red Europea de Laboratorios OGM, ha sido nombrado laboratorio comunitario de referencia
(http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/).
El CRL tiene el mandato de evaluar y validar métodos analíticos para garantizar que «se
ajustan al objetivo de cumplir la normativa» y de asesorar sobre aspectos científicos y
técnicos en caso de litigio.
Sesión nº 1
12
En la legislación citada se exige la disponibilidad de métodos de análisis que sean seguros,
precisos y robustos. Esto implica una actividad de investigación que contribuya a la
armonización y normalización del enfoque y del conjunto de procedimientos analíticos y sus
características en todos los laboratorios comunitarios de ejecución y control en relación con
los OGM.
La armonización y normalización de los procedimientos y sus características dentro de los
laboratorios europeos de control ya lleva varios años siendo señalada por el CCI como
elemento fundamental para el éxito de cualquier instrumento legislativo de control.
Efectivamente, la Unidad de biotecnología y OGM del Instituto de la Salud y la Protección
de los Consumidores del CCI propone y fomenta desde 1999 la formación de una red de
laboratorios de ejecución participantes en asuntos relacionados con los OGM.
La Red Europea de Laboratorios OGM se inauguró oficialmente en diciembre de 2002
(http://engl.jrc.ec.europa.eu/). La gestión y las actividades de secretaría son coordinadas por
la Comisión Europea (DG Centro Común de Investigación – CCI). Esta Red, que contaba
anteriormente con 47 laboratorios de control de los Estados miembros, ha crecido
recientemente hasta tener 71 componentes, de los que 24 proceden de los últimos países
adheridos a la Unión Europea. La presidencia y la secretaría de la Red son responsabilidad
de la Unidad de biotecnología y OGM del Instituto de la Salud y la Protección de los
Consumidores del CCI.
El objetivo de la Red Europea de Laboratorios OGM consiste en crear una plataforma única
de expertos activos en el muestreo, detección, identificación y cuantificación de OGM en
semillas, granos, alimentos, piensos y muestras ambientales, para plantear y tratar temas
técnicos, como:

desarrollo de métodos para el análisis cuali y cuantitativo;

transferencia de tecnología, formación y creación de capacidad;

validación y estudios de aptitud de métodos adecuados para el cribado de diversas
matrices en cuanto a la presencia de OGM o para la estimación de las cantidades de
OGM presentes;

materiales de referencia (este aspecto corresponde al Instituto de Materiales y
Medidas de Referencia del CCI);

estrategias y métodos de muestreo de los diferentes productos GM (semillas,
granos, materias primas, productos para el consumidor final o las colectividades);

bases de datos y bioinformática y requisitos para la identificación inequívoca de
OGM y creación de bases que contengan tales datos moleculares.
En el contexto de las actividades de la Red, los cursos de formación deben considerarse
uno de los principales instrumentos para conseguir los objetivos antes citados.
Sesión nº 1
13
Inocuidad y etiquetado de alimentos obtenidos mediante la
biotecnología moderna; perspectiva de la OMS4
La liberación de OGM en el medio ambiente y la comercialización de alimentos GM han
provocado un debate público en muchas partes del mundo. Es probable que este debate
continúe en el contexto más amplio de otros usos de la biotecnología (p. ej., en medicina) y
sus consecuencias para la sociedad. Aunque los temas debatidos suelen ser muy similares
(costes y beneficios, aspectos relacionados con la inocuidad), el resultado del debate
cambia de un país a otro. Actualmente no hay consenso sobre aspectos como la utilidad del
etiquetado y de la trazabilidad de los alimentos GM para disipar la inquietud de los
consumidores. Esto se ha puesto de manifiesto en los debates efectuados en la Comisión
del Codex Alimentarius a lo largo de los últimos años. La Comisión del Codex Alimentarius
(Codex; http://www.codexalimentarius.net/web/index_es.jsp) es el organismo conjunto
FAO/OMS encargado de compilar las normas, códigos de prácticas, orientaciones y
recomendaciones
que
constituyen
el
Codex
Alimentarius,
el
código
alimentario
internacional. A pesar de la falta de consenso sobre estos temas, se ha avanzado bastante
en la armonización de las opiniones sobre la evaluación del riesgo. Sin embargo, el Codex
está a punto de adoptar principios sobre la evaluación del riesgo antes de la
comercialización que muestran un aumento del entendimiento a nivel internacional (véase la
prepublicación de los «Principios para el análisis de riesgos de alimentos obtenidos por
medios
biotecnológicos
modernos»,
CAC/GL
44-2003,
en
la
dirección
ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/princ_gmfoods_es.pdf).
Los diferentes organismos GM contienen diferentes genes insertados de formas diversas.
Esto significa que los distintos alimentos GM y su inocuidad deben evaluarse caso por caso
y que no es posible hacer declaraciones generales sobre la seguridad de todos los
alimentos GM. Según la OMS, los alimentos GM actualmente disponibles en el mercado
internacional han sido objeto de evaluaciones del riesgo y no es probable que presenten
riesgos para la salud humana. Además, no se han puesto de manifiesto efectos sobre la
salud humana que fueran resultado del consumo de tales alimentos por la población en
general de los países en que se han autorizado. La evaluación de la inocuidad de los
alimentos GM debe basarse en el uso continuo de evaluaciones del riesgo según los
principios del Codex y, en su caso, con seguimiento tras la comercialización.
4
Para obtener información completa sobre las actividades de la OMS y de otras agencias de la ONU en relación
con los alimentos obtenidos mediante la biotecnología moderna, véase en la dirección
http://www.who.int/foodsafety/en/.
Sesión nº 1
14
El etiquetado de los alimentos producidos por biotecnología puede estar relacionado o no
con la inocuidad de los alimentos per se, pero la OMS lo toma como una herramienta para
aumentar la transparencia de los procesos de producción de alimentos.
Es posible que
este etiquetado facilite también el desarrollo de estrategias de trazabilidad, que podrían
contribuir a mejorar los programas nacionales de inocuidad de los alimentos e
indirectamente, por tanto, la propia inocuidad de los alimentos en general. Así pues, es
evidente la importancia de disponer de unos métodos adecuados de análisis y muestreo.
La OMS trabaja en el desarrollo de principios y recomendaciones sobre la seguridad y la
evaluación del riesgo de alimentos obtenidos mediante biotecnología. Los resultados
obtenidos a lo largo de diversas consultas de expertos constituyen la base de unas
orientaciones nacionales y actualmente se está en fase de incorporarlos a orientaciones
reconocidas internacionalmente. El enfoque según el principio de la equivalencia sustancial
se elaboró para evaluar la seguridad de la primera generación de plantas modificadas
genéticamente y muchos lo consideran adecuado. No obstante, esta idea es criticada
actualmente. Las actividades que se están llevando a cabo deben tener en cuenta estos
argumentos y contribuir a la consecución de unos ajustes y mejoras con base científica.
La Consulta FAO/OMS de expertos sobre aspectos relacionados con la inocuidad de los
alimentos modificados genéticamente de origen vegetal, celebrada en el año 2000, admitió
que el concepto de equivalencia sustancial puede utilizarse como enfoque comparativo
centrado en las similitudes y diferencias entre los alimentos modificados genéticamente y su
contraparte convencional. Simultáneamente, manifestó su opinión de que el concepto de
equivalencia sustancial no es en sí una evaluación de la inocuidad ni un criterio, sino tan
solo
un
punto
de
partida
para
la
evaluación
de
la
inocuidad
(http://www.fao.org/ag/agn/food/risk_biotech_aspects_en.stm).
La próxima generación de alimentos GM será la de vegetales con un valor nutritivo
mejorado, cruzando así el límite con los alimentos funcionales y nutracéuticos. Las futuras
estrategias de evaluación de la inocuidad de los alimentos tendrán que referirse a los
cambios metabólicos más complejos causados por las modificaciones genéticas dadas. Las
evaluaciones tendrán que ir considerando cada vez más el impacto de un alimento GM
sobre la situación nutricional general, habida cuenta de las diferentes necesidades de los
países desarrollados y en desarrollo.
Actualmente no está implantado ningún sistema normativo internacional específico. Sin
embargo, hay varios organismos internacionales que participan en la elaboración de
protocolos sobre OGM. Como se ha dicho antes, el Codex está elaborando principios sobre
el análisis del riesgo de los alimentos GM para la salud humana. La premisa de estos
Sesión nº 1
15
principios exige una evaluación previa a la comercialización, efectuada caso por caso y con
inclusión de un estudio tanto de los efectos directos (del gen insertado) como de los efectos
imprevistos (que pueden producirse como consecuencia de la inserción de un nuevo gen).
Los principios se encuentran en una fase avanzada de elaboración, pero aún no se han
adoptado (véase la prepublicación de los «Principios para el análisis de riesgos de
alimentos obtenidos por medios biotecnológicos modernos», CAC/GL 44-2003, en la
dirección ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/princ_gmfoods_es.pdf). Estos y otros principios del
Codex en fase de elaboración (incluidos los Principios sobre métodos de análisis y
muestreo) carecen de efecto vinculante sobre la legislación nacional, pero se citan
específicamente en el Acuerdo sobre la aplicación de las medidas sanitarias y fitosanitarias
de la Organización Mundial del Comercio (Acuerdo SPS) y pueden utilizarse como
referencia en caso de litigios comerciales.
Teniendo en cuenta el trabajo efectuado entre 1999 y 2003 por el Grupo de acción
intergubernamental
especial
del
Codex
sobre
alimentos
obtenidos
por
medios
biotecnológicos (http://www.fao.org/ag/agn/agns/biotechnology_codex_en.asp), el Comité
del Codex sobre etiquetado de los alimentos y el Comité del Codex sobre métodos de
análisis y muestreo, seguirán siendo objeto de atención preferente de la OMS la elaboración
de orientaciones aceptadas generalmente para la evaluación de la inocuidad de los
alimentos obtenidos mediante biotecnología, los aspectos de la comunicación del riesgo (p.
ej., mediante el etiquetado) y, por tanto, la elaboración de métodos adecuados de análisis.
Por
tanto,
la
OMS
sigue
organizando
consultas
de
expertos
(http://www.who.int/foodsafety/biotech/consult/en/index.html) para elaborar principios y
metodologías de evaluación del riesgo, gestión del riesgo y comunicación del riesgo en
relación con alimentos producidos mediante biotecnología, y coordinando la colaboración
entre países desarrollados y en desarrollo en el ámbito de los métodos de detección.
El Departamento de Inocuidad de los Alimentos, dentro de la OMS, está terminando un
estudio basado en evidencias sobre las implicaciones de la biotecnología moderna de los
alimentos para la salud y el desarrollo humanos. El impulso para el estudio procede de una
resolución de la LIII Asamblea Mundial de la Salud, celebrada en mayo de 2000, según la
cual la OMS debe reforzar su capacidad de ayudar a los Estados miembros a sentar las
bases científicas de las decisiones sobre la moderna biotecnología alimentaria, y de velar
por la transparencia, excelencia e independencia de los dictámenes emitidos.
El
estudio
(http://www.who.int/foodsafety/biotech/who_study/en/index.html)
pretende
complementar los esfuerzos de otros organismos internacionales reuniendo la información
ya existente y analizándola según corresponde al mandato de la OMS. A fin de aumentar la
Sesión nº 1
16
transparencia del proceso, la OMS ha colaborado con la FAO y ha contado con la
participación de una serie de interlocutores y grupos de interés. El objetivo principal es el de
crear una base de conocimiento accesible para ayudar a los Estados miembros, organismos
de normas internacionales y otros interlocutores a alcanzar un consenso transparente y
global sobre la evaluación y la aplicación de la biotecnología. Finalmente, la OMS pretende
establecer unos cimientos basados en pruebas factibles para construir una evaluación más
holística de la biotecnología para el futuro.
Este estudio se dirigía a poner en su contexto la contribución general que puede aportar a la
salud y desarrollo humanos la biotecnología moderna de los alimentos. Incluye la aplicación
de la biotecnología moderna de los alimentos a los microorganismos, vegetales y animales.
Se
adoptó
un
planteamiento
integrado
(holístico)
para
identificar
los
aspectos
fundamentales que afectan directa o indirectamente a la salud y desarrollo humanos, y
establecer cuáles son las pruebas disponibles. Los principales aspectos relacionados con
las pruebas son los siguientes:
investigación y desarrollo;
impacto sobre la salud humana (inocuidad de los alimentos y efectos ambientales);
seguridad del abastecimiento alimentario, coste y acceso a la tecnología;
aspectos éticos, legales y sociales;
iniciativas para crear capacidad.
Se recopilaron datos procedentes de una bibliografía muy amplia, de Internet y de una
investigación por encuesta, avalada por unas 120 respuestas a un cuestionario que se
había planteado a una amplia gama de interlocutores y expertos en mayo de 2002. También
se han incorporado las observaciones procedentes de un debate electrónico de
interlocutores, celebrado entre enero y abril de 2003.
Asimismo se han incluido las
opiniones de los participantes (entre los que había representantes de los gobiernos, de los
consumidores, de la industria y de las organizaciones no gubernamentales (ONG), de
países tanto desarrollados como en desarrollo) en una reunión de interlocutores celebrada
los días 5 y 6 de junio de 2003 en Ginebra.
El informe redactado como resultado de este proceso de consulta será utilizado
directamente por la OMS para planificar sus actividades en el futuro respecto al uso y
aplicación de la biotecnología moderna en la salud y desarrollo humanos.
Sesión nº 1
17
Anexo 1. Legislación comunitaria sobre la comercialización de
OGM, con inclusión de los programas relacionados de etiquetado y
control
Directiva 90/220/CEE del Consejo, de 23 de abril de 1990, sobre la liberación intencional en
el medio ambiente de organismos genéticamente modificados (DO L 117 de 8.5.1990,
p. 15).
Derogada por:
Directiva 2001/18/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 12 de marzo de 2001,
sobre la liberación intencional en el medio ambiente de organismos genéticamente
modificados y por la que se deroga la Directiva 90/220/CEE del Consejo. (DO L 106 de
17.4.2001, p. 1).
Directiva 90/219/CEE del Consejo, de 23 de abril de 1990, relativa a la utilización confinada
de microorganismos genéticamente modificados (DO L 117 de 8.5.1990, p. 1).
Modificada por:
Directiva 98/81/CE del Consejo, de 26 de octubre de 1998, por la que se modifica la
Directiva 90/219/CEE relativa a la utilización confinada de microorganismos genéticamente
modificados (DO L 330 de 5.12.1998, p. 13).
Reglamento (CE) n° 258/97 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 27 de enero de
1997, sobre nuevos alimentos y nuevos ingredientes alimentarios (DO L 43 de 14.2.1997,
p. 1).
Reglamento (CE) nº 178/2002 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 28 de enero de
2002, por el que se establecen los principios y los requisitos generales de la legislación
alimentaria, se crea la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria y se fijan
procedimientos relativos a la seguridad alimentaria (DO L 31 de 1.2.2002, p. 1).
Reglamento (CE) nº 1139/98 del Consejo, de 26 de mayo de 1998, relativo a la indicación
obligatoria, en el etiquetado de determinados productos alimenticios fabricados a partir de
organismos genéticamente modificados, de información distinta de la prevista en la Directiva
79/112/CEE (DO L 159 de 3.6.1998, p. 4).
Sesión nº 1
18
Directiva 97/4/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 27 de enero de 1997, por la
que se modifica la Directiva 79/112/CEE del Consejo, relativa a la aproximación de las
legislaciones de los Estados miembros en materia de etiquetado, presentación y publicidad
de los productos alimenticios destinados al consumidor final (DO L 43 de 14.2.1997, p. 21).
Directiva 96/21/CE del Consejo, de 29 de marzo de 1996, por la que se modifica la Directiva
94/54/CE de la Comisión, relativa a la indicación en el etiquetado de determinados
productos alimenticios de otras menciones obligatorias distintas de las previstas en la
Directiva 79/112/CEE (DO L 88 de 5.4.1996, p. 5).
Directiva 94/54/CE de la Comisión, de 18 de noviembre de 1994, relativa a la indicación en
el etiquetado de determinados productos alimenticios de otras menciones obligatorias
distintas de las previstas en la Directiva 79/112/CEE del Consejo (DO L 300 de 23.11.1994,
p. 14).
Reglamento (CE) nº 49/2000 de la Comisión, de 10 de enero de 2000, por el que se
modifica el Reglamento (CE) nº 1139/98 del Consejo relativo a la indicación obligatoria, en
el etiquetado de determinados productos alimenticios fabricados a partir de organismos
genéticamente modificados, de información distinta de la prevista en la Directiva
79/112/CEE (DO L 6 de 11.1.2000, p. 13).
Reglamento (CE) nº 50/2000 de la Comisión, de 10 de enero de 2000, relativo al etiquetado
de los productos alimenticios e ingredientes alimentarios que contienen aditivos y aromas
modificados genéticamente o producidos a partir de organismos genéticamente modificados
(DO L 6 de 11.1.2000, p. 15).
Directiva 89/397/CEE del Consejo, de 14 de junio de 1989, relativa al control oficial de los
productos alimenticios (DO L 186 de 30.6.1989, p. 23).
Directiva 93/99/CEE del Consejo, de 29 de octubre de 1993, sobre medidas adicionales
relativas al control oficial de los productos alimenticios (DO L 290 de 24.11.1993, p. 14).
Recomendación de la Comisión, de 25 de enero de 2002, relativa a un programa
coordinado de control oficial de productos alimenticios para el año 2002 (2002/66/CE) (DO L
26 de 30.1.2002, p. 8).
Sesión nº 1
19
Reglamento (CE) nº 1829/2003 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre
de 2003, sobre alimentos y piensos modificados genéticamente (DO L 268 de 18.10.2003,
p. 1).
Reglamento (CE) n° 1830/2003 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre
de 2003, relativo a la trazabilidad y al etiquetado de organismos genéticamente modificados
y a la trazabilidad de los alimentos y piensos producidos a partir de éstos, y por el que se
modifica la Directiva 2001/18/CE (DO L 268 de 18.10.2003, p. 24).
Reglamento (CE) n° 641/2004 de la Comisión, de 6 de abril de 2004, sobre las normas de
desarrollo del Reglamento (CE) n° 1829/2003 del Parlamento Europeo y del Consejo en lo
relativo a la solicitud de autorización de nuevos alimentos y piensos modificados
genéticamente, la notificación de productos existentes y la presencia accidental o
técnicamente inevitable de material modificado genéticamente cuya evaluación de riesgo
haya sido favorable (DO L 102 de 7.4.2004, p. 14).
Directiva 79/112/CEE del Consejo, de 18 de diciembre de 1978, relativa a la aproximación
de las legislaciones de los Estados Miembros en materia de etiquetado, presentación y
publicidad de los productos alimenticios destinados al consumidor final (DO L 33 de
8.2.1979, p. 1).
Reglamento (CE) n° 65/2004 de la Comisión, de 14 de enero de 2004, por el que se
establece un sistema de creación y asignación de identificadores únicos a los organismos
genéticamente modificados (DO L 10 de 16.1.2004, p. 6).
Reglamento (CE) n° 882/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 29 de abril de
2004, sobre los controles oficiales efectuados para garantizar la verificación del
cumplimiento de la legislación en materia de piensos y alimentos y la normativa sobre salud
animal y bienestar de los animales (DO L 165 de 30.4.2004, p. 1/141).
Sesión nº 1
Alimentos
Sesión nº 2
Presentación del Manual, Métodos de Trabajo e
Introducción del Curso
M. Querci
Presentación del Manual, Métodos de Trabajo e Introducción del Curso
2
Índice
Sesión nº 2
Presentación del Manual, Métodos de Trabajo e Introducción del
Curso
Cómo detectar OGM
3
Ventajas y limitaciones intrínsecas de los enfoques del ADN y de las proteínas
4
Consideraciones generales y presentación del Manual
7
Bibliografía
11
Sesión nº 2
3
Cómo detectar OGM
Como se ha visto anteriormente, las plantas transgénicas se caracterizan por la
inserción de un nuevo gen (o de un nuevo conjunto de genes) en sus genomas. El
nuevo gen o genes se traducen y la nueva proteína se expresa. Esto proporciona a
la planta una característica nueva, como la resistencia a determinados insectos o la
tolerancia a ciertos herbicidas. La base de todas las técnicas de detección de OGM
consiste en explotar la diferencia entre la variedad no modificada y la planta
transgénica. Esto puede hacerse detectando el nuevo ADN transgénico que se ha
insertado, o la nueva proteína expresada, o (si la proteína actúa de enzima)
utilizando el análisis químico para detectar el producto de la reacción enzimática.
Hay dos planteamientos científicos que se utilizan generalmente en la actualidad
para detectar modificaciones genéticas en plantas como la soja, el maíz, el algodón
y otras. Uno es el ELISA (ensayo de inmunoabsorción enzimática), con el que se
estudia la presencia de proteínas específicas explotando la especificidad de la unión
entre un antígeno expresado y un anticuerpo diana; el otro es la PCR (reacción en
cadena de la polimerasa), basada en la detección de secuencias nuevas de ADN
insertadas en el genoma de la planta. Estos métodos muestran la ausencia o
presencia del OGM en la muestra, pero a veces también pueden dar una indicación
cuantitativa (porcentaje) sobre la muestra estudiada.
El primer método validado a nivel comunitario es uno de cribado que aplica la PCR y
es capaz de detectar la mayoría de los OGM cuya comercialización está autorizada
actualmente (Lipp et al., 1999). Este método, elaborado por Pietsch et al. (1997), se
basa en la detección de las secuencias de control que flanquean al gen introducido,
y que son el promotor 35S y el terminador nos. La validación fue coordinada por la
antigua Unidad de productos alimentarios y bienes de consumo del Instituto de la
Salud y la Protección de los Consumidores, del Centro Común de Investigación, y se
hizo en colaboración con el Instituto de Medidas y Materiales de Referencia del CCI,
encargado de la producción de los apropiados materiales de referencia certificados.
Como se señala más arriba, también hay actividades de investigación para el
desarrollo de métodos relativos a las proteínas. Se ha validado un método muy
específico para la detección de soja Roundup Ready utilizando ELISA (Lipp et al.,
2000)
y
se
han
elaborado
otros
(http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm).
Sesión nº 2
4
Ventajas y limitaciones intrínsecas de los enfoques del ADN y de
las proteínas
El enfoque del ADN
Cada vez se utilizan más los métodos analíticos basados en la técnica de la PCR
para la detección de secuencias de ADN asociadas con OGM.
La PCR permite la amplificación selectiva de segmentos específicos de ADN
presentes con baja frecuencia en una mezcla compleja con otras secuencias de
ADN. En la PCR, los pequeños fragmentos de ADN complementario se llaman
cebadores y se utilizan por pares. Estos cebadores se diseñan para hibridarse con
sitios de reconocimiento de la secuencia complementaria en hebras opuestas del
gen de interés. A través de una serie de ciclos térmicos diferenciales repetitivos, una
enzima ADN polimerasa ayuda a la replicación y a la amplificación exponencial de la
secuencia situada entre el par de cebadores. Finalmente, estos fragmentos
amplificados se someten a electroforesis en gel normal para poder detectar su
presencia en función de la determinación de su tamaño.
Se han desarrollado muchos métodos basados en esta PCR que pueden detectar y
cuantificar los OGM presentes en plantas agrícolas utilizadas como alimentos y
piensos. Por otra parte, la determinación de la identidad genética permite la
segregación y la trazabilidad (preservación de la identidad) a lo largo de la cadena
de distribución de las plantas GM.
Un requisito previo fundamental de la detección de OGM es el conocimiento del tipo
de modificación genética, incluida la conformación molecular del gen introducido y
los elementos reguladores (promotores y terminadores) que lo flanqueen. Para el
análisis es necesario disponer de una cantidad mínima de material de muestra con
ADN intacto, incluido el gen diana.
La PCR es una técnica de laboratorio cuya realización exige personal formado y
material especializado.
A continuación se indican algunas de las características clave del diagnóstico por
PCR:
- Puede ser extremadamente sensible, capaz de detectar la presencia de unos
pocos ejemplares (e incluso de un solo ejemplar) de un gen o secuencia diana de
interés dentro de todo el material genético de un organismo (genoma). Como
resultado de esta elevada sensibilidad, pueden obtenerse falsos positivos con
niveles muy bajos de contaminación accidental. Por tanto, ha de extremarse la
atención para evitar la contaminación cruzada.
Sesión nº 2
5
- Exige poco tiempo de elaboración de los reactivos comparando con los ensayos
inmunológicos (síntesis de cebador frente a producción de anticuerpos).
- Casi todos los reactivos necesarios están disponibles en el comercio y pueden
obtenerse fácilmente de varias fuentes. Sin embargo, hace falta una autorización
para utilizar algunos de ellos en actividades de diagnóstico comerciales.
- El análisis de las muestras lleva un día aproximadamente.
- La PCR puede discriminar entre diferentes tipos de modificación genética (también
denominados productos transgénicos) si se efectúa adecuadamente. Los métodos
de diagnóstico para identificar productos transgénicos específicos necesitan más
tiempo de elaboración y actividades de validación.
El enfoque de las proteínas
El método de ensayo de proteínas utiliza anticuerpos específicos de la proteína de
interés. La técnica ELISA detecta o mide la cantidad de proteína de interés en una
muestra que puede contener otras muchas proteínas diferentes. Utiliza un
anticuerpo para ligar la proteína específica, un segundo anticuerpo para amplificar la
detección (fase optativa) y un conjugado de anticuerpo con una enzima, cuyo
producto genera una reacción coloreada, que es fácil de observar y cuantificar
comparando con una curva patrón de la proteína de interés.
Para la ejecución adecuada del ensayo hace falta también personal formado y
material especializado.
Entre las características fundamentales de los ensayos con ELISA están las
siguientes:
- Menor sensibilidad que la PCR, por lo que es más difícil que aparezcan «falsos
positivos» debidos a pequeños niveles de contaminación.
- Elevados costes iniciales para el desarrollo del ensayo y la obtención de
anticuerpos y patrones de proteínas.
- Reducidos costes por muestra, una vez elaborados los reactivos.
- No puede discriminar entre diferentes modos y modelos de expresión de diferentes
productos transgénicos que expresan características proteínicas similares.
- Los métodos de proteínas exigen un notable tiempo de preparación de los
reactivos y del método.
- Los métodos de ensayo de proteínas son prácticos y eficaces cuando se produce
una proteína detectable. Sin embargo, es posible que los productos modificados
genéticamente se formen solo durante ciertas fases del desarrollo o en
determinadas partes de los vegetales, por lo que resultaría poco probable que tales
productos fueran detectados sin problemas por la técnica ELISA. Por otra parte, las
Sesión nº 2
6
transformaciones industriales desnaturalizan fácilmente las proteínas, lo que plantea
dificultades para el uso de métodos ELISA con fracciones de alimentos
transformados.
Teniendo todo esto en cuenta, ha de quedar claro que el ELISA y la PCR deben
considerarse mutuamente complementarios y no se excluyen entre sí.
Cuadro 2. Comparación resumida de los métodos ELISA y PCR
Método
Objeto
Duración
ELISA
Proteínas
2 - 8 horas
PCR
ADN
1 – 3 días
Facilidad de
utilización
Moderada; exige
conocimiento de las
prácticas de laboratorio;
los ensayos son
específicos de especie y
de variedad.
Escasa; requiere
formación y material
especializados.
Resultados
Confirma una
modificación genética
específica y permite la
cuantificación.
Muy sensible; tiende a
dar falsos positivos;
confirma la presencia de
ADN GM y permite la
cuantificación.
Sesión nº 2
7
Consideraciones generales y presentación del Manual
La validación del método es crítica tanto para los laboratorios como para las
autoridades de control. Lo ideal es que un número limitado de laboratorios
capacitados verifique las características de cada método en cuanto a su capacidad
de dar resultados reproducibles, sensibles y específicos. El Centro Común de
Investigación de la Comisión Europea fue el primero en validar los métodos ELISA y
PCR para materias primas constituidas por soja Roundup Ready y un método PCR
para maíz Maximizer (Bt-176), así como un método PCR tanto para soja Roundup
Ready
como
para
maíz
Maximizer
(Bt-176)
en
fracciones
de
alimentos
transformados (Lipp et al., 1999, 2000 y 2001). Después se han desarrollado y
validado algunos otros métodos de análisis tanto cuali como cuantitativo. Para
obtener mas información sobre los métodos validados de detección y cuantificación
de OGM en la dirección: http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm
La preparación de las muestras, tanto si se aplican métodos de ADN como de
proteínas, es crítica para la detección y la cuantificación. Es importante saber las
limitaciones de cada procedimiento en función del aspecto que interese (p. ej.,
análisis cuali o cuantitativo). Tanto el tamaño de la muestra como los procedimientos
de muestreo influyen muchísimo en las conclusiones que puedan extraerse de estos
métodos de ensayo.
Los dos tipos de métodos dependen fundamentalmente de la disponibilidad de
materiales de referencia certificados que sean adecuados. Las muestras
utilizadas en el curso son materiales de referencia certificados producidos en el
IRMM del CCI (Trapmann et al., 2002 y 2001). Las características y los certificados
correspondientes se presentan en la sesión nº 3.
Otra fase crítica, que debe
mencionarse aunque no se va a efectuar durante el curso, es la homogeneización
de la muestra.
La figura 1 resume las distintas fases efectuadas durante el curso. Es fundamental
optimizar la extracción del ADN para garantizar la presencia y calidad del ADN
extraído y amplificable por PCR. Este aspecto es particularmente importante, ya que
la mayoría de los productos alimentarios comercializados a base de soja o maíz
están muy transformados. Es bien sabido que el ADN puede degradarse
considerablemente durante la transformación de los alimentos, sobre todo por
tratamiento térmico en presencia de agua. Por tanto, a medida que se transforman
más los alimentos, puede disminuir el número de fragmentos de ADN que siguen
siendo suficientemente largos y conteniendo intacta la secuencia de interés para
permitir la detección de la presencia de OGM en alimentos transformados. Además,
Sesión nº 2
8
un método verdaderamente adecuado de extracción del ADN debe conseguir la
eliminación de las sustancias inhibidoras que pueda haber en la muestra. Este tema
se tratará en la sesión nº 4. Se han elaborado diversos métodos de extracción de
ADN y son muchas las empresas comerciales que producen kits especializados
listos para usarse. Durante el curso se hablará sobre las características y la validez
de los diferentes protocolos disponibles. Sin embargo, para evitar la implicación
directa de empresas comerciales, se ha decidido efectuar la extracción del ADN con
el denominado método CTAB, protocolo validado y versátil que ha demostrado su
idoneidad para varias matrices diferentes.
Tras la extracción del ADN, las muestras (así como los productos de la PCR) se
analizan mediante electroforesis en gel de agarosa (sesión nº 5).
En la sesión nº 6 se presentan los principios, ventajas y desventajas de la reacción
en cadena de la polimerasa.
Como ya se ha indicado, la utilización eficaz de las técnicas modernas para la
detección de OGM depende de la disponibilidad de información exacta. La detección
de OGM exige el conocimiento al menos parcial de la secuencia del gen diana y del
tipo de modificación genética. En la sesión nº 7 se presentan las características
específicas de las líneas transgénicas de maíz MON810, maíz Bt-176 y soja
Roundup Ready.
Se han elaborado distintos planteamientos de PCR para la detección de los OGM
autorizados. La especificidad de la PCR depende de la selección exacta de los
cebadores. Los cebadores de la PCR pueden dirigirse a diferentes elementos
utilizados en el proceso de transformación. Pueden obtenerse sistemas de detección
de PCR de «banda ancha», denominados generalmente «métodos de cribado»,
diseñando cebadores específicos de las secuencias más comunes utilizadas en la
transformación. Se trata generalmente de las secuencias reguladoras (promotor y
terminador). Los vegetales modificados genéticamente pueden dividirse también en
«categorías» según el gen estructural introducido. Otra forma más de dirigir la
especificidad de la reacción es elegir unos cebadores específicos de las secuencias
de ADN localizadas en distintos elementos genéticos (p. ej., promotor-gen
estructural, gen estructural-terminador). Finalmente, siempre que se disponga de
información específica y completa sobre la secuencia, a fin de obtener métodos
realmente específicos de un determinado vegetal modificado genéticamente, pueden
elaborarse
sistemas
«con
especificidad
de
línea»
(específicos
de
una
transformación) seleccionando una combinación «única» de secuencias, presente
tan solo en esa línea transformada concreta. Esto se consigue generalmente
diseñando cebadores con hibridación en la región del ADN en la que se incluye el
Sesión nº 2
9
empalme del sitio de integración. El empalme entre el ADN insertado (ADN-T) y el
ADN hospedador ofrece una secuencia nucleotídica única que constituye una diana
ideal para un ensayo muy específico por PCR. Los métodos realizados durante el
curso se resumen en la figura 1, y se describen con detalle en la sesión nº 8. La
parte experimental de los métodos y protocolos se encuentra en la sesión nº 9.
Como se indica anteriormente, la necesidad de cuantificar el OGM presente en una
muestra hizo que se elaboraran muchos protocolos basados en la PCR, los cuales
permiten no solo una respuesta cualitativa (presencia / ausencia), sino también una
indicación, más o menos precisa (según el método elegido) de la cantidad relativa
del OGM presente en una muestra determinada. Los dos planteamientos de ADN
más comunes son la PCR competitiva y la PCR en tiempo real (sesión nº 10). La
PCR en tiempo real se efectúa utilizando una instrumentación específica y compleja,
que por ahora solo puede adquirirse en unas pocas empresas comerciales. En la
sesión nº 11 se indican los protocolos que se van a seguir durante el curso.
Finalmente, la sesión nº 12 contiene una introducción general al planteamiento
serológico de la detección de organismos genéticamente modificados. En concreto
se explicará la técnica ELISA y se proporcionará el protocolo para efectuar un
ensayo ELISA específico de Roundup Ready.
Sesión nº 2
10
Homogeneización de la
muestra
No se efectuará durante
el curso
Materias primas y
transformadas
Extracción del ADN
Comprobación de la presencia de ADN
vegetal por PCR
+
-
ADN vegetal presente
Sin ADN vegetal detectable
PCR de cribado
+
Vegetal GM
PCR-lectina para soja y
PCR-zeína para maíz
Detección de elementos reguladores
(promotor 35S y terminador nos)
Vegetal no GM
Detección de
OGM específicos
por PCR anidada
Detección de OGM
mediante ELISA
Cuantificación del
ADN mediante
espectrofotometría
Cuantificación del
OGM mediante PCR
en tiempo real
Figura 1. Diagrama de flujo de los métodos utilizados durante el curso.
Sesión nº 2
11
Bibliografía
Lipp, M., Anklam, E. y Stave, J.W. (2000). Validation of an immunoassay for
detection and quantification of a genetically modified soybean in food and food
fractions using reference materials: Interlaboratory study. Journal of AOAC
International 83, 919–927.
Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. y
Anklam, E. (2001). Validation of a method based on polymerase chain reaction
for the detection of genetically modified organisms in various processed
foodstuffs. European Food Research Technology 212, 497-504.
Lipp, M., Brodmann, P., Pietsch, K., Pauwels, J. y Anklam, E. (1999). IUPAC
collaborative trial study of a method to detect genetically modified soy beans and
maize in dried powder. Journal of AOAC International 82, 923–928.
Pietsch, K., Waiblinger, H.-U., Brodmann, P. y Wurz, A. (1997). Screening-Verfahren
zur
Identifizierung
„gentechnisch
veränderter”
plfanzlicher
Lebensmittel.
Deutsche Lebensmittel Rundschau 93, 35–38.
Trapmann. S., Catalani, P., Conneely, P., Corbisier, P., Gancberg, D., Hannes, E.,
Le Guern, L., Kramer, G. N., Prokisch, J., Robouch, P., Schimmel, H., Zeleny, R.,
Pauwels, J., Van den Eede, G., Weighardt, F., Mazzara, M. y Anklam, E. (2002).
The certification of reference materials of dry-mixed soya powder with different
mass fractions of Roundup Ready™ soya. Certified Reference Materials IRMM410S.
(https://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/reference_materials_catalogue/catalogue/atta
chements/ERM-BF410_report.pdf) (Último acceso enero de 2010)
Trapmann, S., Le Guern, L., Prokisch, J., Robouch, P., Kramer, G. N., Schimmel, H.,
Pauwels, J., Querci, M., Van den Eede, G. y Anklam, E. (2001). The certification
of reference materials of dry mixed maize powder with different mass fractions of
MON810
maize.
Certified
Reference
Materials
IRMM-413.
chements/ERM-BF413_report.pdf). (Último acceso enero de 2010)
Sesión nº 2
Alimentos
Sesión nº 3
Muestras Utilizadas durante el Curso
M. Querci, N. Foti
BUREAU RMEGIONAL
ORGANIZACIÓN
UNDIAL DE
DE LA
L'ESUROPE
ALUD
ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
2
Índice
Sesión nº 3
3
Material de Referencia Certificado
3
Composición de las materias primas y procesadas distribuidas entre los participantes
4
Lista de muestras distribuidas durante el curso.
6
Resultados previstos por PCR
6
Bibliografía
7
Sesión 3
3
En el curso se ensayarán distintos métodos para detectar la presencia de maíz
MON810 y soja Roundup Ready en diversas materias. Con este fin se utilizarán
mezclas de maíces y sojas no GM y GM (MON810 en el caso del maíz y Roundup
Ready en el de la soja) respectivamente, en distintos grados de concentración. Se
utilizarán dos tipos de materiales:
•
materiales de referencia certificados
•
diversas materias primas y procesadas distribuidas entre los participantes.
Material de referencia certificado
Las materias primas vegetales utilizadas en el curso son los materiales de referencia
certificados IRMM-410S (soja Roundup Ready) e IRMM-413 (maíz MON810). El
IRMM-410S y el IRMM-413 consisten en dos series de CRM de polvo desecado de
soja y maíz, respectivamente, con distintas fracciones de masa (0; 0,1; 0,5; 1; 2; y
5 %) de polvo desecado preparado a partir de soja Roundup Ready y maíz MON810
modificados genéticamente. Los CRM se produjeron en el Instituto de Materiales y
Medidas de Referencia (http://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/homepage.htm) para Fluka
Chemie AG (Buchs, Suiza) en el marco de la colaboración con el Instituto de la
Salud y la Protección de los Consumidores (http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/) del Centro
Común de Investigación de la Comisión Europea (Ispra, Italia) (Trapmann et al.,
2002 y 2001) y están concebidos para la validación de métodos de detección de
alimentos modificados genéticamente. Dado que la cuantificación de ADN y/o
proteínas puede variar en función de las variedades, las conclusiones cuantitativas
de las mediciones de muestras desconocidas deben extraerse con las debidas
precauciones.
El polvo de soja desecado con soja GM Roundup Ready se ha elaborado a partir de
semillas completas de una línea de soja no modificada (Asgrow A1900) y la soja
modificada genéticamente 40-3-2 Roundup Ready (línea Asgrow AG5602 RR). El
polvo de maíz desecado con maíz GM MON810 se ha elaborado a partir de granos
completos del cultivar no modificado DK512 y el cultivar MON810 DK513.
Sesión 3
4
Composición de las materias primas y procesadas distribuidas
entre los participantes
Se comprobarán distintas materias: galletas, leche en polvo, migas de aperitivos
secos y harina.
Materias primas
Mezcla de harinas. A fin de obtener un 0,5 % de cada OGM (peso en seco total), se
puso soja RR (IRMM-410S) al 1 % junto a harina con un 1 % de MON810 (IRMM413). Se pesaron 50 GM de ambas harinas y se introdujeron directamente en tubos
de reacción preparados para la extracción de ADN. La harina con un 1 % de
MON810 es el material de referencia certificado IRMM-413 (con un 1 % de maíz
MON810).
Migas de aperitivos secos
La muestra se extrajo de un programa de comprobación de la idoneidad de OGM
(Programa GeMMA, ronda 06, material de ensayo GMO-06B). El material se preparó
a partir de aperitivos secos a base de soja no modificada genéticamente disponibles
en el mercado y aperitivos con soja modificada genéticamente.
Migas de aperitivos
1 372 g de aperitivos a base de soja no modificada genéticamente y
secos
28 g de aperitivos con soja modificada genéticamente
Antes de proceder a la mezcla, cada material se molió y tamizó hasta obtener un
conjunto de migas homogéneo, tras lo cual se mezclaron en un tambor durante una
noche. Por último, los materiales se mezclaron durante aproximadamente una hora
utilizando un mezclador giratorio y se guardaron a –20 °C.
Galletas
El material se produjo en el Instituto de la Salud y la Protección de los Consumidores
del CCI y se utilizó para validar un método de PCR para soja Roundup Ready y maíz
Maximizer (Bt-176) en fracciones de alimentos transformados (Lipp et al., 2001).
Las harinas desecadas de soja y maíz se pesaron y mezclaron con los otros
ingredientes en la proporción indicada a continuación.
Sesión 3
Galletas # 1
5
250 g de maíz (0 % OGM), 250 g de soja (0 % OGM), 300 g de trigo, 200 g de
azúcar, 100 g de mantequilla, 10 g de sal, 16 g de levadura artificial con aroma
de vainilla y 2 huevos
Los ingredientes se mezclaron minuciosamente con 600 ml de agua y la masa se
homogeneizó, se extendió uniformemente en un bandeja de horno y se coció en un
horno precalentado a 180 ºC con recirculación de aire durante 10 min. A
continuación, el material se retiró del horno, se cubrió para evitar su contaminación y
se dejó enfriar a temperatura ambiente. Posteriormente se guardó a –20 °C.
Leche de soja en polvo
La muestra se extrajo de la ronda 05 del Programa GeMMA de comprobación de la
idoneidad.
1 700 g de leche de soja en polvo de EE.UU. se mezclaron en un tambor durante
una noche con 300 g de aislado de proteínas de soja Roundup Ready, tras lo cual se
repartieron distintas submuestras (10 g) en frascos de plástico taponados a rosca y
se guardaron a temperatura ambiente antes de su distribución.
Galletas MON810
Este material se produjo en la Unidad de biotecnología y OGM del CCI.
La harina desecada de maíz se pesó y mezcló con los otros ingredientes en la
proporción indicada a continuación.
Galletas MON810
*
200 g de harina de trigo, 100 g de harina de maíz* (2 % OGM), 150 g de
azúcar, 100 g de mantequilla y 1 huevo.
*La harina de maíz con un 2 % de MON810 se obtuvo añadiendo harina de maíz
silvestre a harina MON810 al 100 % y mezclándolas durante 30 minutos.
Los ingredientes se mezclaron minuciosamente, se extendieron uniformemente en
un bandeja de horno y se cocieron en un horno precalentado a 180 ºC con
recirculación de aire durante10 min. A continuación, el material se retiró del horno,
se cubrió para evitar su contaminación y se dejó enfriar a temperatura ambiente.
Posteriormente se guardaron a 4 °C hasta su utilización.
Sesión 3
6
Lista de muestras distribuidas durante el curso.
Características
% de OGM (ingrediente específico)
Muestra
Soja RR
Maíz MON810
0%
1%
2,2 %
8,9 %
-
0%
1%
1%
2%
Galletas # 1
Mezcla de harinas
Harina MON810
Migas de aperitivos secos
Galletas MON810
Resultados previstos por PCR
MUESTRA
IRMM- 410S-0 (0 %)
IRMM- 410S-1 (0,1 %)
IRMM- 410S-2 (0,5 %)
IRMM- 410S-3 (1 %)
IRMM- 410S-4 (2 %)
IRMM- 413-0 (0 %)
IRMM- 413-1 (0,1 %)
IRMM- 413-2 (0,5 %)
IRMM- 413-3 (1 %)
IRMM- 413-4 (2 %)
Galletas # 1
Mezcla de harinas
Harina MON810
Migas
de
aperitivos
secos
Galletas MON810
zeína
lectina
35S
nos
E35S/hsp7
0(b)
CTP/EPSPS
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
+
-
Sesión 3
7
Bibliografía
Trapmann. S., Catalani, P., Conneely, P., Corbisier, P., Gancberg, D., Hannes, E.,
Le Guern, L., Kramer, G. N., Prokisch, J., Robouch, P., Schimmel, H., Zeleny, R.,
Pauwels, J., Van den Eede, G., Weighardt, F., Mazzara, M. y Anklam, E. (2002).
The certification of reference materials of dry-mixed soya powder with different
mass fractions of Roundup Ready™ soya. Certified Reference Materials IRMM410S.
chements/ERM-BF410_report.pdf). (Último acceso enero de 2010)
Trapmann, S., Le Guern, L., Prokisch, J., Robouch, P., Kramer, G. N., Schimmel, H.,
Pauwels, J., Querci, M., Van den Eede, G. y Anklam, E. (2001). The certification
of reference materials of dry-mixed maize powder with different mass fractions of
MON810
maize.
Certified
Reference
Materials
IRMM-413.
chements/ERM-BF413_report.pdf) (Último acceso enero de 2010)
GeMMA Scheme-GMO analysis Round 06. GMO Proficiency Testing (octubre de
2001). Report N. GMO 06.
GeMMA Scheme-GMO analysis Round 05. GMO Proficiency Testing, (octubre de
2001). Report N. GMO 05.
Sesión 3
Alimentos
Sesión nº 4
Extracción y Purificación de ADN
M. Somma
2
Índice
Sesión nº 4
Introducción
3
Métodos de extracción
4
Métodos de purificación
4
Método de extracción y purificación con CTAB
6
Cuantificación del ADN mediante espectrofotometría
9
Principios de la cuantificación de ADN por espectrofotometría
10
Determinación de la concentración de ácidos nucleicos
11
Práctica
13
Bibliografía
17
Sesión nº 4
3
Introducción
La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primara etapa de la
mayoría de los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de
recombinación de ADN. En este caso, los métodos de extracción permiten obtener
ácidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para después realizar
análisis específicos de modificaciones genéticas mediante la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los ácidos nucleicos son dos de los
elementos más importantes en ese tipo de análisis. Si se desea obtener ácidos
nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es preciso
aplicar métodos de extracción adecuados. Los contaminantes capaces de inhibir el
análisis PCR se enumeran en el cuadro 1. Con objeto de evitar los falsos negativos
debidos a la presencia de inhibidores de la PCR en la muestra, se recomienda
vivamente efectuar un experimento de control de la inhibición de la PCR, que suele
hacerse mediante PCR específica de vegetales (eucariotas o cloroplastos) o de la
especie.
Cuadro 1. Inhibidores de la PCR.
Inhibidor
Dodecilsulfato sódico
Fenol
Etanol
Isopropanol
Acetato de sodio
Cloruro de sodio
EDTA
Hemoglobina
Heparina
Urea
Mezcla de reacción
Concentración de inhibición
> 0,005 %
> 0,2 %
>1%
>1%
> 5 mM
> 25 mM
> 0,5 mM
> 1 GM/ml
> 0,15 UI/ml
> 20 mM
> 15 %
Dada la gran variedad de métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos
existentes, la elección de la técnica más adecuada suele efectuarse conforme a los
criterios siguientes:
•
ácido nucleico diana;
•
organismo fuente;
•
material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.);
•
resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificación);
•
uso posterior (PCR, clonación, etiquetado, transferencia, RT-PCR, síntesis de
ADNc, etc.).
Sesión nº 4
4
A continuación se recogen los principios de algunos de los métodos de extracción y
purificación de ácidos nucleicos que más se emplean en la actualidad.
Métodos de extracción
Para extraer los ácidos nucleicos del material biológico es preciso provocar una lisis
celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos
de células. El procedimiento de lisis idóneo suele consistir en un equilibrio de
técnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo
(un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el ácido nucleico
diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes:
•
rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.);
•
tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles,
etc.);
•
digestión enzimática (Proteinasa K, etc.).
Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al
mismo tiempo. Por ejemplo, una misma solución puede contener detergentes que
solubilicen las membranas celulares y sales caotrópicas fuertes que inactiven las
enzimas intracelulares. Tras la lisis celular y la inactivación de las nucleasas, los
restos de células se eliminan fácilmente por filtración o precipitación.
Métodos de purificación
Los métodos empleados para purificar los ácidos nucleicos de extractos celulares
suelen ser combinaciones de dos o más técnicas de las siguientes:
•
extracción/precipitación;
•
cromatografía;
•
centrifugación;
•
separación por afinidad.
En los párrafos siguientes se describen brevemente estas técnicas (Zimmermann et
al., 1998).
Extracción/precipitación
A menudo se efectúa una extracción con disolventes para eliminar los
contaminantes de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una
combinación de fenol y cloroformo con objeto de eliminar las proteínas. Para
concentrar los ácidos nucleicos suele realizarse una precipitación con isopropanol o
etanol. Si la cantidad de ácido nucleico diana es escasa, puede añadirse a la mezcla
Sesión nº 4
5
un portador inerte (como el glucógeno) para favorecer la precipitación. También
puede realizarse una precipitación selectiva con concentraciones salinas elevadas
(precipitación salina) o una precipitación de las proteínas mediante cambios del pH.
Cromatografía
Pueden emplearse diversas técnicas cromatográficas de separación: permeación
sobre gel, intercambio iónico, adsorción selectiva o unión por afinidad. La
permeación sobre gel aprovecha las propiedades de las partículas porosas del gel
para tamizar moléculas. Se emplea una matriz con poros de tamaño definido, que
dejan pasar las moléculas más pequeñas por difusión, pero no las más grandes, que
quedan eluidas en el volumen vacío. Así pues, las moléculas quedan eluidas por
orden de tamaño decreciente. La cromatográfica de intercambio iónico es otra
técnica, que se basa en la interacción electrostática de la molécula diana con un
grupo funcional de la matriz en columna. Los ácidos nucleicos (polianiones lineales
con fuerte carga negativa) pueden eluirse de las columnas de intercambio iónico con
simples Tampones salinos. En la cromatografía de adsorción, los ácidos nucleicos
se fijan selectivamente en sílice o vidrio, en presencia de determinadas sales (por
ejemplo, sales caotrópicas), mientras que otras moléculas biológicas no se fijan. A
continuación, los ácidos nucleicos pueden eluirse con agua o un tampón hiposalino y
se obtiene una muestra que puede emplearse directamente en las aplicaciones
posteriores.
Centrifugación
La centrifugación selectiva constituye un método de purificación eficaz. Así, por
ejemplo, la ultracentrifugación en gradientes autogenerados de CsCl con fuerzas g
elevadas se lleva empleando mucho tiempo para purificar plásmidos. La
centrifugación suele asociarse a otros métodos, como la cromatografía de columna
centrifugada, en cuyo caso se combina la permeación sobre gel y la centrifugación
para separar el ADN o ARN de contaminantes más pequeños (sales, nucleótidos,
etc.), intercambiar tampones o seleccionar según el tamaño. Algunos procedimientos
combinan la adsorción selectiva en matriz cromatográfica (véase el apartado anterior
«Cromatografía») y la elución por centrifugación para purificar de forma selectiva un
tipo de ácido nucleico.
Separación por afinidad
En los últimos años, cada vez son más los métodos de purificación que combinan la
inmovilización por afinidad de ácidos nucleicos y la separación magnética. Por
ejemplo, los ARNm poli A + pueden unirse a partículas magnéticas revestidas de
Sesión nº 4
6
estreptavidina mediante oligo dT marcados con biotina, y el complejo de partículas
puede eliminarse de la solución (y de los contaminantes libres) con un imán. Esta
técnica en fase sólida simplifica la purificación de los ácidos nucleicos, pues permite
sustituir las etapas de centrifugación, extracción orgánica y separación de fases por
una operación de separación magnética, única y rápida.
Método de extracción y purificación con CTAB
El protocolo del método del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) fue elaborado
por Murray y Thompson en 1980 (Murray y Thompson, 1980) y publicado
posteriormente, en 1987, por Wagner y sus colaboradores (Wagner et al., 1987). El
método es adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y alimentos
derivados de vegetales y está especialmente indicado para eliminar los polisacáridos
y los compuestos polifenólicos, que, de otro modo, alterarían la pureza del ADN y,
por tanto, su calidad. Este procedimiento se ha aplicado con frecuencia en genética
molecular de los vegetales y ha sido probado en ensayos de validación para detectar
OGM (Lipp et al., 1999; 2001). Se han elaborado algunas variantes adicionales para
adaptar el método a una amplia gama de matrices de alimentos transformados o sin
transformar (Hupfer et al., 1998; Hotzel et al., 1999; Meyer et al., 1997; Poms et al.,
2001).
Principios del método del CTAB: lisis, extracción y precipitación
Las células vegetales pueden lisarse con el detergente iónico bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB), que forma un complejo insoluble con los ácidos nucleicos en
medio hiposalino. De ese modo, los polisacáridos, los compuestos fenólicos y los
demás contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden eliminarse por
lavado. El complejo de ADN se solubiliza aumentando la concentración salina y se
precipita con etanol o isopropanol. En esta sección se describirán los principios de
las tres etapas principales: la lisis de la membrana celular, la extracción del ADN
genómico y su precipitación.
Lisis de la membrana celular: Tal como se ha mencionado anteriormente, la
primera etapa de la extracción del ADN es la rotura de la membrana celular y
nuclear, para lo cual la muestra homogeneizada se trata primero con el tampón de
extracción, que contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB. Todas las membranas biológicas
presentan la misma estructura general, integrada por moléculas de lípidos y de
proteínas, unidas por interacciones no covalentes.
Sesión nº 4
7
ADN
Membrana
nuclear
Figura 1. Representación simplificada de las membranas celulares1.
Tal como muestra la figura 1, las moléculas lipídicas están ordenadas en una doble
capa continua, en la que las moléculas proteínicas están «disueltas». Las moléculas
lipídicas están formadas por extremos hidrófilos, denominados «cabezas», y
extremos hidrófobos, denominados «colas». En este método, el detergente (CTAB)
contenido en el tampón de extracción provoca la lisis de la membrana. Dado que la
composición de los lípidos y del detergente es similar, el componente de CTAB del
tampón de extracción captura los lípidos que integran la membrana celular y nuclear.
La figura 2 ilustra el mecanismo de solubilización de los lípidos con un detergente.
Figura 2. Solubilización de los lípidos.
1
Las ilustraciones que figuran en esta página y en las siguientes proceden del Genetic Science
Learning Center, Universidad de Utah, http://gslc.genetics.utah.edu.
Sesión nº 4
8
La figura 3 ilustra cómo se libera el ADN genómico cuando el detergente captura los
lípidos y las proteínas al entrar en contacto la membrana celular y el tampón de
extracción con CTAB. Con una concentración salina (NaCl) determinada, el
detergente forma un complejo insoluble con los ácidos nucleicos. El EDTA es un
componente quelante, que se une al magnesio, entre otros metales. El magnesio es
un cofactor de la desoxirribonucleasa. Al unir el magnesio al EDTA, la actividad de la
desoxirribonucleasa presente disminuye. El Tris-HCl confiere a la solución la
capacidad de amortiguar el pH (un pH inferior o superior daña el ADN). Es
importante señalar que, como los ácidos nucleicos se degradan fácilmente en esta
fase de la purificación, debe reducirse al mínimo el tiempo transcurrido entre la
homogeneización de la muestra y la adición de la solución tampón con CTAB. Una
vez que se han roto las membranas de la célula y de los orgánulos (como los que se
encuentran alrededor de las mitocondrias y los cloroplastos), se purifica el ADN.
Figura 3. Rotura de la membrana celular y extracción del ADN genómico.
Extracción - En esta etapa, se separan los complejos formados por los ácidos
nucleicos y el CTAB de los polisacáridos, los compuestos fenólicos, las proteínas y
los demás lisados celulares disueltos en la solución acuosa. Es especialmente
importante eliminar los polisacáridos y los compuestos fenólicos, pues pueden inhibir
numerosas reacciones enzimáticas. En concentraciones hiposalinas (NaCl < 0,5 M),
los contaminantes de los complejos de ácidos nucleicos no precipitan y pueden
eliminarse
extrayendo
la
solución
acuosa
con
cloroformo.
El
cloroformo
desnaturaliza las proteínas y facilita la separación de las fases acuosa y orgánica. La
fase acuosa suele constituir la fase superior. No obstante, si dicha fase es densa
debido a la concentración salina (> 0,5 M), formará la fase inferior. Además, si el pH
de la solución acuosa no se ha equilibrado debidamente (pH 7,8 – 8,0), los ácidos
nucleicos tenderán a repartirse en la fase orgánica. Si es preciso, la extracción con
Sesión nº 4
9
cloroformo se realizará dos o tres veces, con objeto de eliminar por completo las
impurezas de la capa acuosa. Para perfeccionar la extracción de los ácidos
nucleicos, puede retroextraerse la fase orgánica con una solución acuosa, que se
añade a continuación al extracto anterior. Una vez purificados los complejos de
ácidos nucleicos, puede procederse a la precipitación, última etapa del
procedimiento.
Precipitación - En esta última etapa se separan los ácidos nucleicos del detergente,
para lo cual la solución acuosa se trata primero con una solución de precipitación
compuesta por una mezcla de CTAB y NaCl en concentración elevada (NaCl >
0,8 M). Una alta concentración salina es necesaria para que se forme un precipitado
de ácidos nucleicos. Puede ser preferible emplear acetato de sodio en lugar de NaCl
por su capacidad tampón. En estas condiciones, el detergente, que es más soluble
en alcohol que en agua, puede eliminarse por lavado, mientras que los ácidos
nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con etanol al 70 % permite una mayor
purificación o elución de los ácidos nucleicos de la sal residual.
Cuantificación del ADN mediante espectrofotometría
El ADN, el ARN, los oligonucleótidos e incluso los mononucleótidos pueden
cuantificarse directamente en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir,
midiendo la absorbancia A (o densidad óptica, DO) de luz ultravioleta (también
puede hacerse en el intervalo visible). Si la muestra es pura, es decir, no contiene
cantidades significativas de contaminantes como proteínas, fenol o agarosa, la
medición espectrofotométrica de la irradiación ultravioleta absorbida por las bases es
sencilla y exacta. En este método, los tampones acuosos con escasa concentración
iónica (por ejemplo, tampón TE) resultan idóneos. La concentración de ácidos
nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y comparando con un blanco. La
interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un «cociente». Dado
que las proteínas absorben a 280 nm, se emplea el cociente A260/A280 para calcular
la pureza de los ácidos nucleicos. Los cocientes respectivos del ADN y el ARN puros
son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una absorción a 230 nm significa que la muestra
está contaminada con hidratos de carbono, péptidos, fenoles, compuestos
aromáticos u otras sustancias. El cociente A260/A230 de las muestras puras es de 2,2
aproximadamente.
Cuando la cantidad disponible de ácidos nucleicos es escasa, puede emplearse el
método de la placa de agarosa con bromuro de etidio. Permite calcular la cantidad
de ácidos nucleicos a partir de la intensidad de la fluorescencia emitida por el
Sesión nº 4
10
bromuro de etidio irradiado con luz UV, comparándola con unos patrones de
concentración.
Principios de la cuantificación de ADN por espectrofotometría
El espectrofotómetro se funda en la transmisión de la luz a través de una solución
para determinar la concentración de un soluto presente en la misma. El aparato
funciona conforme a un principio sencillo: se irradia una muestra con una radiación
luminosa de longitud de onda conocida y se mide la energía luminosa transmitida
con una célula fotoeléctrica situada detrás de la muestra.
Tal como muestra la figura 4, el espectrofotómetro de haz único consta de una
fuente luminosa, un prisma, un recipiente con la muestra y una célula fotoeléctrica.
Los distintos elementos están conectados a los sistemas eléctricos o mecánicos
adecuados para controlar la intensidad luminosa y la longitud de onda y para
convertir en variaciones de tensión la energía recibida en la célula fotoeléctrica. Las
variaciones de tensión se miden en un contador o se registran en un ordenador para
su posterior análisis.
F
i
g
Figura 4. Representación esquemática de la transmisión de la luz.
Cada molécula absorbe la energía radiante a una longitud de onda específica, a
partir de la cual es posible extrapolar la concentración de un soluto en una solución.
Con arreglo a la ley de Lambert-Beer, existe una relación lineal entre la absorbancia
A (también denominada densidad óptica, DO) y la concentración de la
macromolécula, conforme a la ecuación siguiente:
A = DO = εlc
(1)
donde ε es el coeficiente de extinción molar, c es la concentración y l es el paso de
luz de la cubeta. Las proteínas y los ácidos nucleicos absorben la luz en el intervalo
Sesión nº 4
11
ultravioleta, a longitudes de onda comprendidas entre los 210 y los 300 nm. Tal
como se ha señalado anteriormente, la absorbancia máxima de las soluciones de
ADN y ARN corresponde a 260 nm y la de las soluciones de proteínas, a 280 nm.
Dado que las soluciones de ADN y ARN absorben parcialmente la luz a 280 nm y las
que contienen proteínas hacen lo propio a 260 nm, el cociente de los valores
obtenidos a 260 nm y a 280 nm (A260/A280) proporciona una estimación del grado de
pureza de los ácidos nucleicos. Los cocientes A260/A280 respectivos del ADN y el
ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Con un paso de luz de 10 mm y una
longitud de onda de 260 nm, una absorbancia A = 1 corresponde aproximadamente
a 50 µg/ml de ADN bicatenario, 37 µg/ml de ADN monocatenario, 40 µg/ml de ARN o
30 µg/ml de oligonucleótidos. Si la muestra también contiene proteínas, el cociente
A260/A280 será considerablemente inferior a dichos valores y no podrá determinarse
con exactitud la cantidad de ácidos nucleicos. Debe precisarse que la
espectrofotometría no permite identificar de forma fiable impurezas de ARN
presentes en las soluciones de ADN. Puede emplearse la absorbancia a 325 nm
para poner de manifiesto la presencia de restos en la solución o la suciedad de la
cubeta.
Determinación de la concentración de ácidos nucleicos
Elección de la cubeta. La cantidad de solución de ácidos nucleicos necesaria para
medir la absorbancia A depende de la capacidad de la cubeta. Debe elegirse una
cubeta apropiada atendiendo al intervalo de concentración de la muestra, el factor
de dilución y el volumen de la muestra. En la mayor parte de los procedimientos
empleados para detectar OGM, el volumen de ADN genómico disponible varía entre
50 y 100 µl. Para la cuantificación espectroscópica de pequeños volúmenes de
ácidos nucleicos se emplean diversos tipos de cubetas de microvolumen, cuya
capacidad oscila entre 5 y 70 µl.
Preparación. Para calibrar el espectrofotómetro es importante:
•
establecer el paso de luz correcto;
•
establecer el factor correcto (ADN bicatenario, ADN monocatenario o ARN);
•
medir la solución en blanco (establecer la referencia), que será agua o solución
tampón (A260 = 0);
•
cerciorarse de que la referencia establecida se renueva periódicamente;
•
medir una cantidad conocida de ácidos nucleicos puros para comprobar la
fiabilidad de la referencia establecida.
Sesión nº 4
12
Medición en una muestra desconocida. Para medir la concentración, se utilizan
cantidades determinadas de solución de ADN en función de la capacidad de la
cubeta empleada (por ejemplo, 5 µl de ADN diluidos en 195 µl de agua si la
capacidad de la cubeta es inferior a 0,2 ml). Después de calibrar el
espectrofotómetro y de añadir la solución de ácidos nucleicos, se tapa la cubeta, se
mezcla la solución y se mide la absorbancia. Con objeto de reducir los errores de
pipeteado, debe efectuarse la medición al menos dos veces y siempre con 5 µl de
solución de ADN, como mínimo. Se desaconsejan los valores de A260 inferiores a
0,02 o comprendidos entre 1 y 1,5 (según el instrumental empleado) por el elevado
margen de error que entrañan.
La concentración c de un ácido nucleico determinado presente en una solución se
calcula conforme a las ecuaciones siguientes:
•
ADN monocatenario:
c(pmol/µl) = A260/0,027
•
ADN bicatenario:
c(pmol/µl) = A260/0,020
•
ARN monocatenario:
c(pmol/µl) = A260/0,025
•
Oligonucleótido:
c(pmol/µl) = A260100/1,5NA+0,71NC+1,20NG + 0,84NT
donde A260 es la absorbancia medida a 260 nm.
El cuadro 2 recoge un ejemplo de los valores de la absorbancia de ADN de timo de
ternera muy purificado, en suspensión en un tampón TNE 1x, considerando que el
ADN de referencia es ADN bicatenario, con una A260 = 1 a 50 µg/ml, en una cubeta
cuyo paso de luz es de 10 mm. La concentración nominal de ADN era de 25 µg/ml.
Cuadro 2. Valores de la absorbancia de ADN de timo de ternera muy purificado, en
tampón TNE 1x.
Longitud de
onda
325
280
260
230
Absorbancia
0,01
0,28
0,56
0,30
A260/A280
Conc. (µg/ml)
2,0
-
28
-
Sesión nº 4
13
Práctica
Instrumental
OBSERVACIONES
Antes de utilizar todo el instrumental hay que esterilizarlo y eliminar todos los
residuos de ADN. Para evitar la contaminación, deben usarse puntas de pipeta con
barrera protectora contra aerosoles.
•
Instrumental reductor (hoja de bisturí estéril, mortero, etc.)
•
Baño maría o calentador
•
Microcentrifuga
•
Micropipetas
•
Mezclador de torbellino
•
Tubos para microcentrifuga de 1,5 ml
•
Bandejas de pesar o equivalente
•
Espátulas
•
Balanza capaz de efectuar mediciones de 0,01 g
•
Asas
•
Soporte para tubos de microcentrifuga
• Optativo: desecador en vacío para secar los sedimentos de ADN.
Reactivos
OBSERVACIONES
Todos los productos químicos han de ser de calidad de biología molecular. El agua
desionizada y los Tampones han de esterilizarse en autoclave antes de su
utilización. Ningún producto químico debe contener ADN ni desoxirribonucleasa.
• Bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB)
Nº CAS 124-03-8
• Cloroformo
• Isopropanol
• Na2EDTA
Nº CAS 6381-92-6
• Etanol
• NaCl
• Proteinasa K
Sesión nº 4
14
• Ribonucleasa A
• Trometamol (Tris-HCl)
• Agua desionizada esterilizada
Tampón a base de CTAB
CTAB 20 g/l
4g
NaCl 1,4 M
16,4 g
Tris-HCl 0,1 M
3,15 g
Na2EDTA 20 mM
1,5 g
•
Añadir 100 ml de agua desionizada;
•
ajustar el pH a 8,0 con NaOH 1 M;
•
completar hasta 200 ml y esterilizar en autoclave;
•
conservar el Tampon a 4°C (seis meses como máximo).
Solución de precipitación a base de CTAB
CTAB 5 g/l
1g
NaCl 0,04 M
0,5 g
•
Añadir 100 ml de agua desionizada;
•
ajustar el pH a 8,0 con NaOH 1 M;
•
completar hasta 200 ml y esterilizar en autoclave;
•
conservar la solución a 4°C (seis meses como máximo).
NaCl 1,2 M
•
Disolver 7,0 g de NaCl en 100 ml de agua desionizada;
•
esterilizar en autoclave y conservar a temperatura ambiente.
Solución de etanol al 70 % (v/v)
Mezclar 70 ml de etanol puro y 30 ml de agua desionizada estéril.
Ribonucleasa A 10 GM/ml: conservar a –20°C.
Endopeptidasa K 20 GM/ml: conservar a –20°C.
Sesión nº 4
15
Procedimiento
Debe efectuarse en condiciones estériles. La contaminación durante la preparación
de la muestra puede evitarse empleando material desechable y soluciones de
descontaminación y evitando la formación de polvo.
•
Depositar 100 GM de muestra homogénea en un tubo estéril de 1,5 ml para
microcentrífuga;
•
añadir 300 µl de agua desionizada estéril y mezclar con un asa;
•
añadir 500 µl de tampón a base de CTAB y mezclar con un asa;
•
añadir 20 µl de proteinasa K (20 GM/ml), agitar e incubar a 65°C durante 30-90
*
minutos ;
•
•
añadir 20 µl de ribonucleasa A (10 GM/ml), agitar e incubar a 65°C durante 5-10
*
minutos ;
centrifugar durante 10 minutos a 16 000 g aproximadamente;
•
trasladar el sobrenadante a un tubo de microcentrifugación que contenga 500 µl
de cloroformo y agitar durante 30 segundos;
•
centrifugar durante 10 minutos a 16,000 g hasta que se separen las fases;
•
trasladar 500 µl de la capa superior a otro tubo de microcentrifugación que
contenga 500 µl de cloroformo y agitar;
•
centrifugar durante 5 minutos a 16 000 g;
•
trasladar la capa superior a otro tubo de microcentrifugación;
•
añadir 2 volúmenes de solución de precipitación a base de CTAB y mezclar
pipeteando;
•
incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente;
•
•
desechar el sobrenadante;
•
disolver el precipitado en 350 µl NaCl (1,2 M);
•
añadir 350 µl de cloroformo y agitar durante 30 segundos;
•
centrifugar durante 10 minutos a 16,000 g hasta que se separen las fases;
•
trasladar la capa superior a otro tubo de microcentrifugación;
•
añadir 0,6 volúmenes de isopropanol y agitar;
•
*
Estas etapas optativas se suelen incluir ahora en el método de extracción con CTAB para
aumentar el rendimiento de la extracción de ADN genómico de matrices muy complejas.
Sesión nº 4
16
•
•
añadir 500 µl de solución de etanol al 70 % y agitar con cuidado;
•
•
•
secar los sedimentos y volver a disolver el ADN en 100 µl de agua desionizada
estéril.
La solución de ADN puede conservarse en la nevera dos semanas como máximo o
en el congelador a - 20°C durante más tiempo.
Sesión nº 4
17
Bibliografía
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Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 207, 81–90.
Sesión nº 4
Alimentos
Sesión nº 5
Electroforesis en gel de agarosa
M. Somma, M. Querci
Electroforesis en Gel de Agarosa
2
Índice
Sesión nº 5
Introducción
3
Principios físicos de la electroforesis en gel de agarosa
3
Componentes de la electroforesis en gel de agarosa
6
Práctica
8
Bibliografía
12
Sesión nº 5
3
Introducción
La electroforesis en gel es un método que se emplea para separar macromoléculas
en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas. El término
electroforesis describe la migración de las partículas cargadas bajo la influencia de
un campo eléctrico. «Electro» se refiere a la electricidad y «foresis», del griego
phoros, significa «trasladar».
Así pues, la electroforesis en gel es una técnica
consistente en aplicar corriente eléctrica a las moléculas para que atraviesen una
placa de gel. La fuerza motriz de la electroforesis es la tensión eléctrica aplicada a
los electrodos en ambos extremos del gel.
Las propiedades de una molécula
determinan la velocidad con que un campo eléctrico puede desplazarla a través de
un medio gelatinoso.
Muchas macromoléculas biológicas importantes (por ejemplo, los aminoácidos, los
péptidos, las proteínas, los nucleótidos y los ácidos nucleicos) poseen grupos
ionizables y, a un pH determinado, existen en solución como especies cargadas
eléctricamente, sean cationes (+) o aniones (-). Según la naturaleza de la carga
neta, las partículas cargadas migrarán hacia el cátodo o hacia el ánodo. Así, por
ejemplo, cuando se aplica un campo eléctrico a un gel con pH neutro, los grupos
fosfato del ADN cargados negativamente lo harán migrar hacia el ánodo
(Westermeier, 1997).
La electroforesis en gel de agarosa es un método normalizado que se utiliza para
separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. Se trata de una técnica sencilla y
rápida que permite diferenciar fragmentos de ADN que no pueden separarse
adecuadamente con otros procedimientos. Por otra parte, el ADN puede localizarse
en el gel tiñendo con una concentración baja de bromuro de etidio, que es un agente
intercalante fluorescente que se utiliza como colorante.
En las siguientes secciones se presentan los principios físicos, los componentes
(matriz de gel, tampón, tampón de carga y marcador) y los procedimientos para
preparar la electroforesis en gel de agarosa (Sambrook et al., 1989).
Principios físicos de la electroforesis en gel de agarosa
La electroforesis en gel es una técnica que se emplea para separar los ácidos
nucleicos y las proteínas. La separación de las macromoléculas depende de dos
variables: carga y masa. Cuando una muestra biológica, como por ejemplo el ADN,
se mezcla en una solución tampón y se aplica a un gel, esas dos variables actúan
conjuntamente.
La corriente eléctrica de un electrodo repele las moléculas, al
Sesión nº 5
4
tiempo que el otro electrodo las atrae. La fuerza de fricción del material de gel actúa
como «tamiz molecular», separando las moléculas en función de su tamaño.
Durante la electroforesis, las macromoléculas son empujadas a través de los poros,
dependiendo su tasa de migración por el campo eléctrico de los siguientes factores:
• fuerza del campo
• tamaño y forma de las moléculas
• hidrofobicidad relativa de las muestras
• fuerza iónica y temperatura del tampón en que se desplazan las moléculas.
Para tener una idea cabal del proceso de separación de las partículas cargadas en
la electroforesis en gel, conviene tener presentes las simples ecuaciones referidas a
esta técnica. Cuando se aplica tensión a los electrodos se genera un gradiente de
potencial (E), que puede expresarse con la siguiente ecuación:
E = V/d
(1)
donde V, medida en voltios, es la tensión aplicada y d, la distancia en cm entre los
electrodos.
Al aplicarse el gradiente de potencial (E) se genera una fuerza (F) en una molécula
cargada, que puede expresarse con la siguiente ecuación:
F = Eq
(2)
donde q corresponde a la carga en culombios que lleva la molécula. Esta es la
fuerza, medida en newtons, que empuja la molécula cargada hacia el electrodo.
Existe asimismo una resistencia de fricción que ralentiza el desplazamiento de las
moléculas cargadas. Esta fuerza de fricción es función de los siguientes factores:
• tamaño hidrodinámico de la molécula
• forma de la molécula
• tamaño de poro del medio en que tiene lugar la electroforesis
• viscosidad del tampón.
La velocidad v de una molécula cargada en un campo eléctrico depende del
gradiente de potencial, la carga y la fuerza de fricción de la molécula, y puede
expresarse con la siguiente ecuación:
v = Eq / f
(3)
donde f es el coeficiente de fricción.
La movilidad electroforética (M) de un ión puede entonces determinarse dividiendo la
velocidad del ión por el gradiente de potencial:
M=v/E
(4)
Sesión nº 5
5
Además, de la ecuación (3) se infiere que la movilidad electroforética M puede
expresarse de modo equivalente como la carga de la molécula (q) dividida por el
coeficiente de fricción (f):
M=q/f
(5)
Cuando se aplica una diferencia de potencial, las moléculas que poseen distintas
cargas globales comenzarán a separarse debido a sus diferentes movilidades
electroforéticas.
La movilidad electroforética es un parámetro significativo y
característico de las moléculas o partículas cargadas y depende del valor de pK del
grupo cargado y del tamaño de la molécula o partícula. Incluso las moléculas con
cargas semejantes empezarán a separarse si sus tamaños moleculares son distintos
por cuanto estarán sometidas a fuerzas de fricción diferentes. El ADN bicatenario
lineal migra por las matrices de gel a velocidades inversamente proporcionales al
log10 del número de pares de bases.
Las moléculas más grandes migran más
despacio debido a la mayor resistencia de fricción y a la menor eficacia del
desplazamiento a través de los poros del gel.
La corriente que atraviesa la solución entre los electrodos es conducida
principalmente por los iones del tampón, si bien una pequeña proporción lo es por
los iones de la muestra. La relación entre intensidad I, tensión V y resistencia R se
expresa según la ley de Ohm:
R=V/I
(6)
Esta ecuación muestra que, para una resistencia R dada, es posible acelerar la
separación electroforética aumentando la tensión V aplicada, lo cual dará lugar al
correspondiente incremento de la intensidad de la corriente I. La distancia migrada
será proporcional a la intensidad y al tiempo. Con todo, el aumento de tensión (V) y
el incremento correspondiente de intensidad e (I) ocasionaría uno de los principales
problemas que plantea la mayor parte de las formas de electroforesis, a saber, la
generación de calor. Este fenómeno queda ilustrado con la siguiente ecuación, en la
que la potencia (W, medida en vatios) generada durante la electroforesis equivale al
producto de la resistencia multiplicado por el cuadrado de la intensidad:
W = I2R
(7)
Dado que la mayor parte de la potencia producida en el proceso electroforético se
disipa en forma de calor, pueden producirse los siguientes efectos perjudiciales:
•
aumento de la tasa de difusión de los iones de la muestra y del tampón, con el
consiguiente ensanchamiento de las muestras separadas
•
formación de corrientes de convección, con la consiguiente mezcla de las
muestras separadas
Sesión nº 5
•
6
inestabilidad térmica de las muestras, que son bastante sensibles al calor (por
ejemplo, desnaturalización del ADN)
•
disminución de la viscosidad del tampón y, por ende, reducción de la resistencia
del medio.
Componentes de la electroforesis en gel de agarosa
Agarosa
La agarosa, coloide natural que se extrae de las algas, es un polisacárido lineal (con
un peso molecular medio de ~12 000 Da) formado por la repetición de la unidad
básica, la agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6anhidrogalactosa. La agarosa es muy frágil y las manipulaciones pueden destruirla
con facilidad.
Los geles de agarosa poseen grandes «poros» y se emplean
fundamentalmente para separar las moléculas grandes con un peso molecular de
más de 200 kDa.
Los geles de agarosa permiten una electroforesis rápida, pero con una resolución
limitada por cuanto las bandas que se forman en los geles tienen tendencia a ser
difusas y a esparcirse. Ello obedece al tamaño de los poros y no puede controlarse.
Los geles de agarosa se obtienen por suspensión de agarosa seca en polvo en un
tampón acuoso, tras lo cual se hace hervir la mezcla hasta que la agarosa se funde
y se convierte en una solución transparente. A continuación, se vierte esta solución
en un molde para gel y se deja enfriar a temperatura ambiente hasta que se forma
un gel rígido. Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad viene
determinada por su concentración.
Tampón de electroforesis
La movilidad electroforética del ADN se ve afectada por la composición y la fuerza
iónica del tampón de electroforesis. En ausencia de iones, la conductancia eléctrica
es mínima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. En un tampón de
elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se genera una
importante cantidad de calor. En el peor de los casos, el gel se funde y el ADN se
desnaturaliza.
Se dispone de varios tipos de tampones para la electroforesis de ADN nativo
bicatenario. Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato (TBE) o trisfosfato (TPE) a una concentración de aproximadamente 50 mM (pH 7,5 – 7,8). Los
tampones de electroforesis suelen prepararse en forma de soluciones concentradas
Sesión nº 5
7
y se conservan a temperatura ambiente. El TBE se utilizaba inicialmente a una
concentración de trabajo de 1x en el caso de la electroforesis en gel de agarosa. No
obstante, una solución de trabajo de 0,5x proporciona un poder más que suficiente y
en la actualidad prácticamente todas las electroforesis en gel de agarosa se
practican utilizando esta concentración.
Concentración de agarosa
Un fragmento de ADN de un tamaño determinado migra a diferentes velocidades a
través de los geles según la concentración de agarosa.
En función de la
concentración de agarosa o tampón, se pueden separar segmentos de ADN que
contengan de 20 a 50 000 pb. En los geles horizontales, la agarosa se emplea por
lo general en concentraciones comprendidas entre un 0,7 % y un 3 % (véase el
cuadro 1).
Cuadro 1. Concentración recomendada de gel de agarosa para separar moléculas de
ADN lineales.
% de agarosa
Gamas de tamaños de
ADN (pb)
0,75
10 000 – 15 000
1,0
500 – 10 000
1,25
300 – 5 000
1,5
200 – 4 000
2,0
100 – 2 500
2,5
50 – 1 000
ADN marcador
Para una tensión, un gel de agarosa y unas concentraciones de tampón
determinadas, la distancia de migración depende del peso molecular del material
inicial.
Así pues, debe cargarse un ADN marcador de tamaño conocido en las
ranuras situadas en los extremos derecho e izquierdo del gel. Generalmente un
marcador contiene un número determinado de segmentos de ADN conocidos, lo cual
facilita la labor de determinar el tamaño de los ADN desconocidos en caso de que se
produjese alguna distorsión sistemática del gel durante la electroforesis.
Sesión nº 5
8
Tampón de carga
Las muestras de ADN que deben cargarse en el gel de agarosa se mezclan en
primer lugar con un tampón de carga que por lo general contiene agua, sacarosa y
un colorante (por ejemplo, cianol de xileno, azul de bromofenol, verde de
bromocresol, etc.). La cantidad máxima de ADN que puede cargarse depende del
número de fragmentos. La cantidad mínima de ADN que puede detectarse mediante
fotografía de los geles teñidos con bromuro de etidio es de aproximadamente 2 ng
en una banda de 0,5 cm de ancho. Si una banda de este ancho contiene más de
500 ng de ADN, la ranura estará sobrecargada y se producirá emborronamiento. El
tampón de carga se emplea con tres fines:
•
aumentar la densidad de las muestras para que las gotas de ADN caigan
uniformemente en el pocillo
•
añadir color a la muestra, simplificando de este modo el proceso de carga
•
incorporar un colorante a la muestra que, en un campo eléctrico, se desplace
hacia el ánodo a una velocidad previsible.
Práctica
Advertencia: El bromuro de etidio es una sustancia mutágena/carcinógena potente y
moderadamente tóxica.
Se deberán llevar siempre guantes cuando se manipulen
soluciones y geles que contengan bromuro de etidio.
Instrumental
•
Unidad de electroforesis horizontal con alimentación eléctrica
•
Horno microondas o incubador-agitador
•
Micropipetas
•
Tubos de reacción de 1,5 ml
•
Balanza que pueda pesar 0,01 g
•
Espátulas
•
Soporte para tubos de reacción
•
Material de vidrio
•
Transiluminador (radiación UV, 312 nm)
•
Instrumentos para documentación (por ejemplo, cámara Polaroid o magnetoscopio).
Sesión nº 5
9
Reactivos
•
Agarosa adecuada para electroforesis de ADN
•
Tris[hidroximetil] aminometano (Tris)
•
Ácido bórico
•
Na2EDTA
CAS 6381-92-6
•
Bromuro de etidio
CAS 1239-45-8
•
Sacarosa
•
Cianol de xileno FF
•
ADN marcadores:

CAS 77-68-1
CAS 2650-17-1
Lambda ADN EcoRI/HindIII digerido (u otros marcadores adecuados
similares)

Escalera de ADN de 100 pb.
Tampón de TBE 10x (1 litro)
•
Tris [hidroximetil] aminometano (Tris)
54,0 g
Ácido bórico
27,5 g
Na2EDTA
7,44 g
Mezclar el reactivo con agua desionizada para obtener una solución de un litro con
un pH de 8,3.
•
Conservar a temperatura ambiente.
Tampón de carga 6x (10 ml)
•
Cianol de xileno FF
0,025 g
Sacarosa
4g
Añadir sacarosa y cianol de xileno FF al agua desionizada para obtener 10 ml de
solución.
•
Mezclar la solución, pasar por autoclave y conservar a 4°C.
Sesión nº 5
10
Procedimiento
•
Sellar los bordes de un molde de plástico limpio y seco con cinta adhesiva o de
otro modo.
Colocar el peine adecuado de modo que se formen pocillos
completos al añadir la solución de agarosa.
•
Diluir tampón de TBE 10x y preparar la cantidad adecuada de tampón de TBE
0,5x para llenar la cubeta de electroforesis y preparar el gel.
•
Pesar la agarosa en polvo según lo indicado en el cuadro 2 y añadirla a una
cantidad apropiada de tampón de TBE 0,5x en un matraz de Erlenmeyer con
tapa suelta (normalmente 150 ml de solución de gel para un molde de 15 x 15
cm y 100 ml de gel para un molde de 15 x 10 cm).
0,8 - 1%
1,5%
2,0%
•
genómico
GM4
ADN
GM3
GM08
GM07
CRYIA4
HA-nos118-r
CRYIA3
HA-nos118-f
p35S-cf3
p35S-cr4
ZEIN4
GMO4
ZEIN3
GMO3
Cuadro 2. Concentraciones de gel de agarosa empleadas durante el curso.
X
X
X
X
X
X
X
X
Calentar la mezcla en un horno microondas o al baño maría hasta que se
disuelva la agarosa (comprobar el volumen de la solución tras haberla
calentado).
•
Enfriar la mezcla a 50 - 60°C y añadir bromuro de etidio (de una solución madre
de 10 mg/ml) hasta lograr una concentración final de 0,2 µg/ml y mezclar bien.
•
Verter la solución en el molde y dejar que se forme el gel. La cantidad de gel
empleado debe corresponder a un grosor de aproximadamente 3 - 5 mm.
•
Una vez completamente formado el gel, retirar cuidadosamente el peine y la
cinta adhesiva y colocar el gel en la cubeta de electroforesis.
•
Añadir tampón de TBE 0,5x a la unidad de electroforesis de modo que el gel
quede cubierto por una capa de aproximadamente 2 - 5 mm.
Sesión nº 5
11
Preparar muestras y marcador para ADN genómico del siguiente modo:
Muestra
Agua
Tampón de carga
Muestra
Marcador
3 µl
2 µl
5 µl
10 µl
Agua
Tampón de carga
λ ADN EcoR I / Hind III
6 µl
2 µl
2 µl
10 µl
Preparar muestras y marcador para productos de PCR del siguiente modo:
Muestra
Tampón de carga
Muestra
•
Marcador
2 µl
8 µl
10 µl
Escalera de ADN de 100 pb15 µl
Cargar 10 µl de cada muestra en pocillos consecutivos y el ADN marcador
adecuado en las calles primera y última.
•
Cerrar la tapa de la cubeta del gel y conectar los cables eléctricos para que el
ADN migre hacia el ánodo y aplicar una tensión de 5 - 10 V/cm.
•
Hacer la electroforesis hasta que el cianol de xileno haya recorrido la distancia
adecuada a través del gel (~ 40 - 60 minutos).
•
Desconectar la corriente y retirar los cables y la tapa de la cubeta. Introducir el
gel en un transiluminador UV y fotografiarlo.
•
Tirar el gel en el recipiente para residuos sólidos destinado al bromuro de etidio
previsto a tal fin.
Sesión nº 5
12
Bibliografía
Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989). «Gel electroforesis of DNA» en:
Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (Eds.) Molecular Cloning: a Laboratory
Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, USA, capítulo 6.
Westermeier, R. (1997). Electroforesis in Practice: a Guide to Methods and
Applications of DNA and Protein Separation, VCH, Weinheim.
Sesión nº 5
Alimentos
Sesión nº 6
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
M. Somma, M. Querci
ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
2
Índice
Sesión nº 6
Introducción
3
Componentes, estructura y replicación del ADN
3
Principios de la PCR
9
Instrumentación y componentes para la PCR
12
Diseño de cebadores para la PCR
18
PCR especializada
22
La PCR en la práctica
24
Bibliografía
32
Sesión nº 6
3
Introducción
La invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por K. Mullis y sus
colaboradores en 1985 ha revolucionado la biología molecular y la medicina
molecular (Saiki et al., 1985). La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica
in vitro utilizada para amplificar enzimáticamente una región determinada de ADN
situada entre dos regiones de ADN cuya secuencia se conoce. Mientras que antes
solo podían obtenerse cantidades mínimas de un gen específico, ahora incluso un
único ejemplar de un gen puede amplificarse con la PCR hasta un millón de
ejemplares en tan solo unas pocas horas.
Las técnicas de PCR se han hecho indispensables para muchos procedimientos
comunes, como la clonación de fragmentos específicos de ADN, la detección e
identificación de genes para diagnóstico y medicina legal, y en la investigación de
modelos de expresión de los genes. Más recientemente, la PCR ha permitido la
investigación de nuevos campos, como el control de la autenticidad de los alimentos,
la presencia de ADN modificado genéticamente y la contaminación microbiológica.
Para comprender los principios de la PCR y sus aplicaciones, debe atenderse en
primer lugar a la naturaleza de la molécula del ADN, por lo que en la sección
siguiente se describen la estructura y la replicación del ADN.
Componentes, estructura y replicación del ADN
Componentes. Una molécula de ADN consta de dos cadenas en hélice,
complementarias y antiparalelas, formadas por unidades alternantes de ácido
fosfórico y desoxirribosa, con uniones transversales de bases púricas y pirimidínicas,
lo que constituye una estructura helicoidal dextrógira, y lleva la información genética
codificada en la secuencia de las bases. En las células eucarióticas, la mayor parte
del ADN se encuentra en el núcleo y se conoce como ADN cromosómico. Está
separado del resto de la célula (citoplasma) por una membrana de dos capas
(membrana nuclear). Por otra parte, puede haber ADN extracromosómico en las
mitocondrias y cloroplastos.
Los elementos estructurales del ADN, llamados nucleótidos, son los siguientes:
•
dATP, desoxiadenosina-trifosfato;
•
dGTP, desoxiguanosina-trifosfato;
•
dTTP, desoxitimidina-trifosfato;
•
dCTP, desoxicitidina-trifosfato.
Sesión nº 6
4
Para mayor facilidad, estos cuatro nucleótidos se denominan dNTP (por las siglas en
inglés de desoxinucleósido-trifosfato). Un nucleótido está formado por tres grandes
partes: una base púrica (adenina, A, o guanina, G), o una base pirimidínica (citosina,
C, o timina, T), un azúcar pentosa (desoxirribosa) y un grupo trifosfato. Como se
muestra en la figura 1, una base púrica o pirimidínica está unida a un anillo de
pentosa por un enlace N-glucosídico, y un grupo fosfato está unido al átomo de
carbono 5' del azúcar por un enlace diéster. En el ácido ribonucleico, ARN, la timina
está sustituida por el uracilo (U) y la molécula de desoxirribosa por la ribosa.
Nucleótido
azúcar + fosfato
Desoxiadenosina trifosfato = dATP
Desoxiguanosina trifosfato = dGTP
Desoxicitidina trifosfato : dCTP
Desoxitimidina trifosfato = dTTP
Figura 1. Componentes de los nucleótidos (imagen: Andy Vierstraete, 1999).
Estructura. La figura 2 indica cómo forman los nucleótidos una cadena de ADN. El
ADN se forma uniendo los nucleótidos entre el grupo fosfato de un nucleótido (que
se sitúa en el átomo de C nº 5 de la molécula de azúcar) y el hidroxilo del átomo de
C nº 3 de la molécula de azúcar del nucleótido anterior. Para efectuar este enlace,
se separa un grupo difosfato, con liberación de energía. Los nuevos nucleótidos se
añaden siempre en el extremo 3’ de la cadena. Como se indica en la figura 3, el
ADN es bicatenario (excepto en algunos virus) y las dos cadenas o hebras se
aparean entre sí de forma muy precisa. Cada base de una cadena se aparea con un
solo tipo de base de la cadena contraria, formando un par de bases (pb): A siempre
Sesión nº 6
5
se une con T mediante dos puentes de hidrógeno, y C siempre se une con G
mediante tres puentes de hidrógeno. De esta manera, las dos cadenas son
mutuamente complementarias y una de las cadenas puede servir de ADN molde
para formar la otra.
Extremo 5’
Extremo 3’
Figura 2. Formación de una cadena de ADN a partir de los distintos nucleótidos
(imagen: Andy Vierstraete, 1999).
Las bases forman un núcleo hidrófobo dentro de la doble hélice. Los azúcares y los
grupos fosfato (en su forma aniónica) constituyen la capa hidrófila exterior de la
molécula. En condiciones fisiológicas, la hélice de ADN bicatenario es más estable
que una hélice de ADN monocatenario.
Sesión nº 6
6
Genoma= total de todos los cromosomas
Mitocondria
Fragmento de cromosoma
Membrana plasmática
Retículo endoplásmico
Aparato de Golgi
Citoesqueleto filamentoso
Cromosoma
Núcleo
Lisosoma
Gen
Pares de bases de los
nucleótidos
Esqueleto de azúcar y fosfato
Puente de hidrógeno
Base
Figura 3. Estructura del ADN de una célula (imagen: Andy Vierstraete, 1999).
Sesión nº 6
7
Replicación. El ADN contiene toda la información genética que define la estructura
y la función de un organismo. Hay tres procesos diferentes encargados de la
transmisión de la información genética:
• replicación;
• transcripción;
• traducción.
Durante la replicación, un ácido nucleico bicatenario se duplica para formar copias
idénticas. Con este proceso se perpetúa la información genética. Durante la
transcripción, un segmento de ADN que constituye un gen se lee y se transcribe en
una secuencia monocatenaria de ARN. El ARN pasa del núcleo al citoplasma.
Finalmente, durante la traducción, la secuencia de ARN se traduce a una secuencia
de aminoácidos que forman una proteína (Alberts et al., 1983).
La replicación del ADN es el proceso en que se basa la amplificación por PCR, y se
va a describir en detalle.
Durante la replicación, la molécula de ADN se desenrolla y cada cadena se convierte
en un ADN molde para la síntesis de una cadena complementaria nueva. Cada
molécula hija, consistente en una cadena nueva y una vieja de ADN, es una copia
exacta de la molécula madre.
Hebra original
Hebra nueva
Cebador de ARN
Hebra
retrasada
Hebra adelantada
Las flechas indican la dirección de
la replicación del ADN
Fragmento de Okazaki
Figura 4. La horquilla de replicación.
Sesión nº 6
8
Para desenrollar la doble hélice y sintetizar una nueva hebra de ADN hacen falta
varias enzimas. La topoisomerasa y la helicasa se encargan de desenrollar el ADN
rompiendo la estructura superenrollada y cortando una sola hebra de ADN. A
continuación, una primasa (parte de un agregado de proteínas denominado
primosoma) une un pequeño cebador de ARN al ADN monocatenario, para actuar
como extremo 3'OH a partir del cual la ADN polimerasa inicia la síntesis. Este
cebador de ARN es eliminado finalmente por la ribonucleasa H y el hueco se rellena
mediante la ADN polimerasa I. En esta fase, la ADN polimerasa avanza a lo largo de
una molécula monocatenaria de ADN (una hebra sencilla), recogiendo dNTP libres
para unirlos mediante puentes de hidrógeno a los dNTP complementarios situados
en dicha hebra sencilla de ADN (A con T y G con C), y mediante un enlace
fosfodiéster covalente al nucleótido anterior de la propia hebra nueva. La energía
conservada en el trifosfato se utiliza para unir covalentemente cada nuevo nucleótido
a la segunda hebra en crecimiento. Hay diferentes formas de ADN polimerasa, pero
es la ADN polimerasa III la que se encarga de la síntesis progresiva de nuevas
hebras de ADN. La ADN polimerasa actúa solo desde el extremo 5’ hacia el 3’.
Como una de las hebras de la doble hélice tiene el sentido 5’-3’ y la otra el 3’-5’, la
ADN polimerasa sintetiza una segunda copia de la hebra 5’-3’ (hebra retrasada) a
tramos (fragmentos de Okazaki) (Ogawa y Okazaki, 1980). La síntesis de las nuevas
copias de la hebra 5’-3’ se muestra en la figura 4. La otra hebra, la hebra
adelantada, puede avanzar directamente con la síntesis, desde el extremo 5' al 3',
según se va desenrollando la hélice. La ADN polimerasa no puede empezar la
síntesis ex novo a partir de una hebra sencilla desnuda, sino que necesita la
presencia de un cebador con un grupo 3’OH libre al que pueda unir un dNTP.
Una ligasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre un extremo 3’OH y
un 5’fosfato, libres y adyacentes. Así puede rellenarse el hueco que queda cuando
se elimina el cebador de ARN. Ha de señalarse la importancia de la presencia de
proteínas de unión a ADN monocatenario para mantener la estabilidad de la
horquilla de replicación. El ADN monocatenario es muy lábil, o inestable, y estas
proteínas se unen a él mientras es monocatenario, protegiéndolo así de la
degradación.
Sesión nº 6
9
Principios de la PCR
La PCR se basa en el mecanismo de la replicación in vivo del ADN: el ADN
bicatenario se desenrolla y pasa a ADN monocatenario, se duplica y se vuelve a
enrollar. Esta técnica consiste en ciclos repetitivos de:
•
desnaturalización del ADN por fusión a temperatura elevada, a fin de convertir el
ADN bicatenario en ADN monocatenario;
•
unión (anillamiento) de dos oligonucleótidos, utilizados como cebadores, al ADN
diana;
•
extensión de la cadena de ADN por adición de nucleótidos a partir de los
cebadores utilizando ADN polimerasa como catalizador, en presencia de iones
Mg2+.
Los oligonucleótidos consisten normalmente en secuencias relativamente cortas,
que son diferentes entre sí y complementarias de los sitios de reconocimiento que
flanquean el segmento de ADN diana que debe amplificarse. Las fases de
desnaturalización del ADN molde, anillamiento del cebador y extensión del cebador
constituyen un «ciclo» del método de amplificación por PCR. La figura 5 ilustra las
tres fases principales del proceso de amplificación por PCR.
30-40 ciclos de 3 fases
Fase 1: desnaturalización
Fase 2: unión
Cebadores directos
e inversos
Fase 3: extensión
Sólo dNTPs
Figura 5. Fases de la amplificación por PCR (imagen: Andy Vierstraete, 1999).
Sesión nº 6
10
Tras cada ciclo, las hebras de ADN recién sintetizadas pueden servir de ADN molde
para el ciclo siguiente. Como se indica en la figura 6, el producto principal de esta
reacción exponencial es un segmento de ADN bicatenario cuyos extremos vienen
definidos por los extremos 5’ de los oligonucleótidos cebadores y cuya longitud viene
dada por la distancia entre los cebadores. Los productos de una primera ronda de
amplificación efectiva son moléculas de ADN de diferentes tamaños, cuyas
longitudes pueden superar la distancia entre los sitios de unión de los dos
cebadores. En la segunda ronda, estas moléculas generan hebras de ADN de
longitud definida que se acumulan de forma exponencial en rondas posteriores de
amplificación y constituyen los productos dominantes de la reacción. Así, la
amplificación, que es el número final de ejemplares de la secuencia diana, se
expresa con la siguiente ecuación:
(2n-2n)x
(1)
donde n es el número de ciclos, 2n es el número de moléculas del primer producto
obtenidas tras el primer ciclo y de los segundos productos obtenidos tras el segundo
ciclo con longitud indefinida, x es el número de ejemplares del ADN molde original.
Teóricamente, al cabo de 20 ciclos de PCR habrá una amplificación de 220 veces,
suponiendo que cada ciclo tiene un rendimiento del 100 %. El rendimiento de una
PCR varía de un ADN molde a otra y depende del grado de optimización que se
haya conseguido.
En los párrafos siguientes se encuentra una descripción pormenorizada de las tres
fases de la amplificación por PCR (desnaturalización del ADN molde, anillamiento
del cebador y extensión) (Sambrook et al., 1989).
4° ciclo
gen deseado
3er ciclo
2° ciclo
1er ciclo
35° ciclo
ADN plantilla
4
8
16
32
ejemplares ejemplares ejemplares ejemplares
68000 millones de
ejemplares
Figura 6. La amplificación exponencial del ADN mediante PCR.
Sesión nº 6
11
Desnaturalización del ADN molde
Durante la desnaturalización, la hebra doble se funde, abriéndose para dar ADN
monocatenario, y se detienen todas las reacciones enzimáticas (es decir, la
extensión de un ciclo anterior). Las dos cadenas complementarias se separan por el
aumento de la temperatura, lo que se denomina desnaturalización. Para obtener la
desnaturalización del ADN, la temperatura suele aumentarse hasta unos 93 - 96°C.
De esta manera se rompen los fuertes puentes de H y aumenta el número de bases
desapareadas. La reacción se completa cuando todo el ADN bicatenario se
convierte en monocatenario. La temperatura a la que la mitad del ADN bicatenario
ha pasado a monocatenario se denomina temperatura de fusión, Tf. El proceso de
desnaturalización depende del tipo de disolvente, de la concentración salina y del pH
utilizado; por ejemplo, la temperatura de fusión desciende al bajar la concentración
salina, al subir el pH y en presencia de disolventes orgánicos como el formaldehído.
El valor de la Tf también se puede ver afectado por la concentración de G/C y T/A.
La Tf de una estructura de ADN que contiene una elevada proporción de G/C es más
alta que la de un ADN más rico en T/A. Por ejemplo, Serratia marcescens tiene
aproximadamente un 60 % de G/C y una Tf de unos 94 °C, mientras que
Pneumococcus tiene aproximadamente un 40 % de G/C y una Tf de unos 85 °C.
Anillamiento del cebador
La unión o rehibridación de las hebras de ADN se efectúa a una temperatura inferior
(generalmente, entre 55 y 65 ºC). Una vez se ha reducido la temperatura, las dos
hebras complementarias de ADN monocatenario tienden a formar de nuevo una
molécula de ADN bicatenario. En esta fase, los cebadores se mueven libremente y
es continua la formación y la ruptura de puentes de hidrógeno entre el cebador
monocatenario y el ADN molde también monocatenaria. Los enlaces más estables
duran un poco más (los cebadores que se corresponden exactamente con el ADN
molde) y es en ese pequeño fragmento de ADN bicatenario (ADN molde con
cebador) donde puede fijarse la polimerasa y empezar a copiar el ADN molde.
Cuando se han introducido unas cuantas bases, el enlace iónico entre el ADN molde
y el cebador es tan fuerte que ya no se rompe.
Extensión del cebador
En esta fase, los cebadores se extienden a lo largo de la secuencia diana utilizando
una ADN polimerasa termoestable (frecuentemente se trata de la ADN Taq
polimerasa) en presencia de dNTP, lo que produce la duplicación del material diana
Sesión nº 6
12
inicial. La temperatura de trabajo ideal para la ADN polimerasa Taq es de 72 ºC.
Cuando los cebadores se han extendido unas cuantas bases, ejercen una atracción
iónica más fuerte sobre el ADN molde, lo que reduce la probabilidad de que se
invierta el proceso. Los cebadores que no se corresponden exactamente se vuelven
a soltar (debido a la temperatura elevada) y no dan lugar a la extensión del
fragmento. Las bases (complementarias del ADN molde) se unen al cebador en el
extremo 3’ (la polimerasa añade dNTP desde 5’ hacia 3’, leyendo el ADN molde
desde 3’ hacia 5’). La duración del tiempo necesario para las fases de extensión del
cebador puede aumentar si es larga la región de ADN que se va a amplificar; sin
embargo, en la mayoría de experimentos de PCR es suficiente un tiempo de 1 min
para conseguir una extensión completa.
Instrumentación y componentes para la PCR
Instrumentos
El proceso de la PCR ha podido automatizarse gracias a dos importantes avances:
a) el uso de ADN polimerasas termoestables, que resisten a la inactivación a
temperaturas elevadas; así pues, es posible que una alícuota inicial de
polimerasa se mantenga a lo largo de muchos ciclos del protocolo;
b) el desarrollo de baños termostatizados que pueden subir y bajar rápidamente su
temperatura
de
forma
automatizada
y
programada;
se
denominan
termocicladores o máquinas de PCR.
Se utilizan diversos diseños de termocicladores como, por ejemplo, calentamiento y
refrigeración por fluidos, calentamiento por resistencia eléctrica y refrigeración por
fluidos, y calentamiento por resistencia eléctrica y refrigeración por semiconductores.
En la figura 7 se muestra un perfil típico de los ciclos de temperatura de un protocolo
de tres fases.
Sesión nº 6
13
Fase 1 :
Desnaturalización de la ADN
Temperatura (°C)
Fase 3 :
Extensión
del cebador
Un « ciclo »
Fase 2 :
Hibridación del
cebador
Minutos
Figura 7. Perfil de ciclos de temperatura de la PCR.
Para que la PCR tenga éxito son fundamentales los parámetros ya mencionados de
los ciclos térmicos, en sus fases de desnaturalización, anillamiento del cebador y
extensión del cebador, así como los componentes utilizados y el número de ciclos
descritos en los párrafos siguientes.
ADN diana
En principio puede efectuarse la amplificación por PCR si está presente al menos un
ejemplar intacto del gen diana. Si el número de ejemplares del gen diana es mayor,
también lo será la probabilidad de que tenga éxito la amplificación del ADN.
Cualquier alteración, como una muesca en el ADN diana, puede bloquear la
amplificación por PCR. El tamaño de la secuencia diana puede variar entre < 0,1 y
unas cuantas kilobases. La cantidad total de ADN utilizada normalmente para la
PCR está entre 0,05 y 1,0 µg, lo que permite la detección de ejemplares solos de la
secuencia diana. Aunque las muestras no tienen que estar muy purificadas, sí es
necesario eliminar algunos contaminantes, como la heparina, el formol, los agentes
quelantes de Mg2+ o los detergentes, para evitar que inhiban el proceso de
amplificación.
Cebadores
Generalmente se utilizan cebadores de 16 a 30 nucleótidos de longitud, lo que
permite que la temperatura de anillamiento sea razonablemente elevada. Los
cebadores no deben tener tramos de secuencias con una polibase (p. ej., poli-dG) ni
Sesión nº 6
14
motivos repetidos, ya que podrían hibridarse de forma inadecuada con el ADN
molde. Deben evitarse las secuencias repetidas invertidas, a fin de prevenir la
formación de estructuras secundarias del cebador, que impedirían su hibridación con
el ADN molde. También deben evitarse las secuencias complementarias de otros
cebadores utilizados en la PCR, para prevenir la hibridación entre cebadores o la
formación de dímeros de cebadores (esto es especialmente importante en relación
con el extremo 3’ del cebador). Siempre que sea posible, conviene que el extremo 3’
del cebador tenga gran proporción de bases G y C para aumentar la hibridación del
extremo que se quiere extender. La distancia entre cebadores debe ser inferior a 10
kb en longitud. Normalmente se observa una importante reducción del rendimiento
cuando los cebadores se encuentran a más de unos 3 kb de distancia entre sí. La
concentración usual de oligonucleótidos para la PCR es de 1 µM. Esto resulta
suficiente para al menos 30 ciclos de amplificación. La presencia de oligonucleótidos
a una concentración superior puede provocar la amplificación no deseada de
secuencias distintas de la diana.
Por el contrario, la PCR no es eficaz si la
concentración del cebador es limitante.
ADN polimerasa
El método original de PCR utilizaba el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de
E. coli (Saiki et al., 1985). Sin embargo, esta enzima se desnaturaliza a
temperaturas inferiores a las necesarias para desnaturalizar la mayoría de ADN
molde bicatenario. Así pues, en los primeros experimentos era necesario añadir más
enzima a la reacción tras cada ciclo. Por otra parte, había que trasladar las muestras
desde un baño a una temperatura hasta otro a otra temperatura para permitir el
desarrollo de las distintas fases de desnaturalización, anillamiento y polimerización.
Evidentemente, el uso de una ADN polimerasa termorresistente ha facilitado el
proceso porque ha dejado de ser necesario añadir enzimas tras cada fase de
desnaturalización. En principio, las ADN polimerasas solo pueden incorporar
nucleótidos al extremo 3’ de un polinucleótido. La primera ADN polimerasa
termoestable utilizada fue la ADN polimerasa Taq, aislada de la bacteria Thermus
aquaticus (Saiki et al., 1988). Aunque esta enzima es probablemente la más utilizada
a efectos de la PCR, en el comercio pueden encontrarse algunas otras ADN
polimerasas. En el cuadro 1 se recogen las propiedades de algunas ADN
polimerasas termoestables que se utilizan actualmente para la PCR (Newton y
Graham, 1994).
Sesión nº 6
15
Cuadro 1. Características de algunas ADN polimerasas utilizadas para la PCR.
Fuente
Aplicación
T½ de actividad
a 95 ºC (min)
Actividad
exonucleásica
de 5’ a 3’
Actividad
exonucleásica
de 3’ a 5’
Procesividad
Velocidad de
extensión
(nt/s)
Extremos de
ADN
resultantes
PM en kDa
Taq/
AmpliTaq
Vent
DeepVent
Pfu
Tth
UITma
Thermus
aquaticus
Thermococcus
litoralis
Pyrococcus
GB-D
Pyrococcus
furiosus
Thermus
thermophilus
Thermotoga
maritima
Taq: natural
AmpliTaq:
para
ingeniería
genética
Para
ingeniería
genética
Para
ingeniería
genética
Natural
Para
ingeniería
genética
Para
ingeniería
genética
40
1380
400
>120
20
> 50a
Sí
No
No
No
Sí
No
No
Sí
Sí
Sí
No
Sí
50-60
?
7
?
30-40
?
75
?
>80
60
>33
?
3’A
> 95 %
romos
> 95 %
romos
?
3’A
Romos
94
?
?
92
94
70
ADN polimerasa Taq/AmpliTaq. Como ya se ha indicado, esta enzima se aisló de
la bacteria Thermus aquaticus que vive en una fuente caliente del parque nacional
de Yellowstone, de EE.UU., a temperaturas próximas a los 85 ºC. La temperatura
óptima de funcionamiento de esta enzima es de 70 a 80 ºC, a la que la bacteria
sintetiza ADN a la velocidad de 35 – 100 nucleótidos/segundo. Se conoce como
procesividad el número medio de nucleótidos que incorpora una enzima al ADN
antes de separarse del ADN molde. La ADN polimerasa AmpliTaq es un enzima
modificada genéticamente expresada por E. coli. Como AmpliTaq es recombinante,
su pureza y reproducibilidad son superiores a las del tipo silvestre. Sin embargo, es
posible que durante la amplificación del ADN se produzca contaminación con
algunas secuencias homólogas de E. coli. En tal caso, se recomienda el uso de una
ADN polimerasa que no se haya expresado con E. coli como organismo hospedador.
Tanto la ADN polimerasa Taq como la AmpliTaq poseen actividad exonucleásica de
5’ a 3’, con lo que eliminan nucleótidos por delante de la cadena en crecimiento.
Sesión nº 6
16
ADN polimerasas Vent, DeepVent, Pfu y UITma. Estas enzimas tienen actividad
exonucleásica de 3’ a 5’, que les permite eliminar los residuos mal apareados hasta
que se forme un extremo con bases correctamente unidas. Sin embargo, la actividad
exonucleásica de 3’ a 5’ puede provocar la degradación de los cebadores. Por tanto,
la enzima solo debería añadirse una vez iniciada la reacción, o bien habría que
utilizar cebadores modificados químicamente.
ADN polimerasa AmpliTaqGold. Esta enzima consiste en una ADN polimerasa
AmpliTaq, inactiva a temperatura ambiente, y que solo puede activarse durante un
periodo de incubación a 94 ºC. En este caso, el programa del termociclador debe
incluir un tiempo de pre-incubación a la temperatura de 92 – 95 ºC. En caso de PCR
con liberación gradual es posible suprimir el tiempo de pre-incubación, pero deben
efectuarse al menos 10 ciclos más que con la PCR clásica.
Tampones de reacción y MgCl2 en las PCR
Además de los reactivos que participan directamente en la reacción, la PCR necesita
un tampón adecuado, cuya composición depende del tipo y de las características de
la enzima utilizada. La mayoría de los proveedores proporcionan normalmente un
tampón 10x para utilizarlo con la enzima respectiva. El tampón de reacción más
común utilizado con la ADN polimerasa Taq/AmpliTaq contiene:
•
Tris 10 mM, pH 8,3
•
KCl 50 mM
•
MgCl2 1,5-2,5 mM.
En la PCR es fundamental la presencia de cationes divalentes. La concentración de
MgCl2 en la mezcla final de reacción suele estar entre 0,5 y 5,0 mM, y la
concentración óptima se determina empíricamente (Innis y Gelfand, 1990).
Los iones Mg2+:
•
forman un complejo soluble con los dNTP, lo cual es fundamental para la
incorporación de estos;
•
estimulan la actividad polimerásica;
•
aumentan la Tf de la interacción cebador / ADN molde (con lo que estabilizan la
interacción entre las dos cadenas).
Sesión nº 6
17
Generalmente, una concentración baja de Mg2+ provoca un rendimiento bajo (o
incluso nulo), mientras que una concentración elevada de Mg2+ hace que se
acumulen productos inespecíficos (errores de cebado). Es importante evitar que en
la solución de ADN molde haya una concentración elevada de agentes quelantes,
como el EDTA, o de grupos iónicos con carga negativa, como el fosfato. En la
bibliografía actual se encuentran discusiones sobre diversos tampones y
suplementos de la PCR, como el DMSO, el PEG 6000, la formamida, el glicerol, la
espermidina y los detergentes no iónicos, utilizados para aumentar la especificidad o
el rendimiento de la reacción (Roux, 1995). Efectivamente, algunas ADN
polimerasas alcanzan su nivel óptimo de actividad solo en presencia de tales
suplementos (Rolfs et al., 1992).
Desoxirribonucleósido-trifosfatos
Para la síntesis de ADN hacen falta desoxirribonucleósido-trifosfatos libres (dNTP).
La concentración de cada uno de los dNTP para la PCR debe estar entre 20 y
200 µM, y los cuatro dNTP deben utilizarse a concentraciones equivalentes para
minimizar los errores de incorporación (Innis et al., 1988). Hay varios fabricantes que
suministran dNTP de elevada pureza, bien como soluciones madre de cada uno de
los dNTP o bien como mezcla de los cuatro dNTP. Las soluciones madre de dNTP
(generalmente 100 mM) se deben ajustar a un pH de 7,0-7,5 con Na OH 1 M para
garantizar que el pH de la reacción final no baja de 7,1 (Sambrook et al., 1989); sin
embargo, ahora se suministran muchas soluciones madre de dNTP con el pH ya
ajustado.
Número de ciclos y efecto de meseta
El número de ciclos de amplificación necesarios para producir una banda visible en
un gel depende mucho de la concentración inicial del ADN diana. A fin de amplificar
50 moléculas diana se recomienda hacer entre 40 y 45 ciclos, mientras que para
amplificar 3x105 moléculas hasta la misma concentración es suficiente con entre 20 y
30 ciclos (Innis y Gelfand, 1990). Esta falta de proporcionalidad se debe al efecto
denominado de meseta, que es la atenuación de la velocidad exponencial de
acumulación del producto en las últimas etapas de una PCR, cuando el producto
alcanza la concentración de 0,3-1,0 nM. Puede deberse a una degradación de los
Sesión nº 6
18
reactivos (dNTP, enzima), agotamiento de los reactivos (cebadores o dNTP: lo
primero con productos cortos y lo segundo con productos largos), inhibición por el
producto final (formación de pirofosfato), competencia por los reactivos por parte de
productos inespecíficos, competencia por la unión con el cebador mediante nueva
hibridación del producto concentrado (10 nM) (Innis y Gelfand, 1990). Si no se
obtiene el producto deseado tras 30 ciclos, debe tomarse una pequeña muestra (1
µl) del producto amplificado, la cual se mezclará y volverá a amplificar durante 20 o
30 ciclos en una nueva mezcla de reacción, en lugar de prolongar la tanda haciendo
más ciclos. En algunos casos en que es limitante la concentración del ADN molde,
esta nueva amplificación puede proporcionar un buen producto, mientras que la
extensión de los ciclos a más de 40 no lo hace.
Diseño de cebadores para la PCR
Es posible que el parámetro más crítico para tener éxito con la PCR sea el diseño de
los cebadores. A igualdad de todos los demás factores, un cebador mal diseñado
puede hacer que fracase una PCR. La secuencia del cebador determina varios
aspectos, como la posición y la longitud del producto, su temperatura de fusión y
finalmente el rendimiento (Innis y Gelfand, 1994). Un cebador mal diseñado puede
hacer que se consiga poco producto o incluso ninguno, debido a una amplificación
inespecífica o a la formación de dímeros de cebador, lo que puede llegar a competir
con la formación de producto hasta suprimirla. El objetivo de la presente nota de
aplicación es dar normas que deben seguirse en el diseño de cebadores para la
PCR. En otras publicaciones puede encontrarse un tratamiento más completo de
este tema (Dieffenbach et al., 1995).
Selección del cebador
Al diseñar cebadores para PCR hay que tener en cuenta diversas variables. Entre
ellas cabe destacar:
•
la longitud del cebador;
•
la temperatura de fusión (Tf);
•
la especificidad;
•
las secuencias complementarias del cebador;
•
el contenido de G/C y los tramos de polipirimidina (T, C) o polipurina (A, G);
Sesión nº 6
•
19
la secuencia del extremo 3’.
En las secciones siguientes se habla de cada uno de estos elementos críticos.
Longitud del cebador
Dado que la especificidad, la temperatura y el tiempo de hibridación dependen en
parte de la longitud del cebador, este parámetro es crítico para que tenga éxito la
PCR. En general, los oligonucleótidos que tienen entre 18 y 24 bases presentan una
especificidad extrema de secuencia, siempre que la temperatura de hibridación sea
óptima. La longitud del cebador también influye en la eficacia de la hibridación. En
general, cuanto más largo sea el cebador, menos eficaz será la hibridación. Al
cebarse menos ADNs moldes en cada fase, esto puede hacer que disminuya de
forma significativa la cantidad de producto amplificado. No obstante, los cebadores
tampoco deben ser demasiado cortos, salvo que la aplicación lo exija
específicamente. Como se comenta más abajo, el objetivo debe ser diseñar un
cebador con una temperatura de anillamiento de al menos 50 ºC.
La relación entre temperatura de hibridación y temperatura de fusión es una de las
«cajas negras» de la PCR. Una regla empírica general es utilizar una temperatura de
hibridación inferior en 5 ºC a la temperatura de fusión. Con frecuencia es posible que
la temperatura de hibridación determinada de esta forma no sea óptima y haya que
efectuar experimentos de tanteo para determinar la verdadera temperatura óptima.
La manera más fácil de hacerlo es con un termociclador de gradiente.
Temperatura de fusión (Tf)
Es importante no olvidar que son dos los cebadores que se añaden a una PCR en
relación con un sitio o diana. Los dos cebadores oligonucleotídicos deben diseñarse
de forma que tengan temperaturas de fusión similares. Si los cebadores no se
ajustan bien en cuanto a su Tf, la amplificación será menos eficaz o incluso podrá no
darse en absoluto, ya que el cebador con la Tf más elevada funcionará mal a
temperaturas más bajas y es posible que el cebador con la Tf más baja no trabaje a
temperaturas más elevadas. La forma más precisa de calcular las temperaturas de
fusión de los oligonucleótidos es utilizar cálculos termodinámicos del vecino más
próximo con la fórmula:
Tfcebador = ∆H [∆S+ R ln (c/4)] -273,15°C + 16,6 log 10 [K+]
(2)
Sesión nº 6
20
donde H es la entalpía y S es la entropía de la formación de la hélice, R es la
constante molar de los gases y c es la concentración de los cebadores.
La forma más fácil de hacerlo es con paquetes de programas informáticos de
diseños
de
cebadores
Afortunadamente,
con
que
la
existen
fórmula
en
el
siguiente
mercado
puede
(Sharrocks,
calcularse
1994).
una
buena
aproximación de trabajo de este valor (válido generalmente para oligonucleótidos de
entre 18 y 24 bases):
Tf = 2(A+T) + 4(G+C)
(3)
donde A, T, G y C son las bases púricas y pirimidínicas.
El cuadro 2 muestra los valores correspondientes a cebadores de diversas
longitudes que se han calculado mediante esta ecuación (denominada fórmula de
Wallace) y suponiendo un contenido de GC del 50 % (Suggs et al., 1981).
Cuadro 2. Cálculo de la longitud de los cebadores con la ecuación de Wallace.
Longitud del
cebador
Tf = 2(A+T) + 4(G+C)
Longitud del
cebador
Tf = 2(A+T) + 4(G+C)
4
12°C
22
66°C
6
18°C
24
72°C
8
24°C
26
78°C
10
30°C
28
84°C
12
36°C
30
90°C
14
42°C
32
96°C
16
48°C
34
102°C
18
54°C
36
108°C
20
66°C
38
114°C
Las temperaturas calculadas según la fórmula de Wallace son imprecisas en los
extremos de este cuadro. Al calcular las temperaturas de fusión de los cebadores,
ha de velarse por que la temperatura de fusión del producto sea suficientemente
baja como para obtener el 100 % de fusión a 92 ºC. Este parámetro ayuda a
Sesión nº 6
21
conseguir una PCR más eficaz, aunque no siempre es necesario para que la PCR
tenga éxito. En general, los productos que tienen entre 100 y 600 pares de bases se
amplifican de forma eficaz en muchas PCR. En caso de duda, la Tf del producto
puede calcularse con la fórmula siguiente:
Tf =81,5 + 16,6 (log10 [K+] + 0,41 (% G+C)-675/longitud
(4)
Especificidad
Como ya se ha indicado, la especificidad del cebador depende al menos
parcialmente de su longitud. Es evidente que hay muchos más oligonucleótidos
distintos con 24 bases que con 15. Dicho esto, los cebadores han de elegirse de
forma que tengan una secuencia única dentro del ADN molde que debe amplificarse.
Un cebador diseñado con una secuencia muy repetitiva dará como resultado un
borrón al amplificar ADN genómico. Sin embargo, el mismo cebador puede dar una
sola banda si se amplifica un solo clon de una genoteca. Como la ADN polimerasa
Taq es activa en una amplia banda de temperaturas, la extensión del cebador se
producirá a las temperaturas inferiores de hibridación. Si la temperatura es
demasiado baja, podrá darse un cebado inespecífico, que podrá ser extendido por la
polimerasa si hay una corta homología en el extremo 3’. En general, los mejores
resultados se obtienen con una temperatura de fusión de 55 a 72 ºC (lo que
corresponde a una longitud del cebador de entre 18 y 24 bases, según la regla de
Wallace).
Secuencias complementarias del cebador
Es absolutamente necesario que el diseño de los cebadores no incluya ninguna
homología interna del cebador de más de 3 pares de bases. Si un cebador tiene
alguna de estas zonas de auto-homología, pueden formarse estructuras con
cambios bruscos u horquillas, parcialmente bicatenarias, capaces de interferir con la
hibridación al ADN molde. Otro peligro relacionado es la homología entre cebadores.
Una homología parcial en las regiones centrales de dos cebadores puede interferir
con la hibridación. Si la homología se produce en el extremo 3’ de cualquiera de los
cebadores, pueden formarse dímeros de cebadores, que en general impiden la
formación del producto deseado por un mecanismo de competencia.
Sesión nº 6
22
Contenido de G/C y tramos de polipirimidina (T, C) o polipurina (A, G)
La composición de bases de los cebadores debe ser de entre un 45 y un 55 % de
GC. La secuencia del cebador debe elegirse de forma que no haya tramos de poli-G
ni poli-C que puedan favorecer la hibridación inespecífica. También deben evitarse
los tramos de poli-A y poli-T, ya que pueden «respirar» y abrir tramos del complejo
cebador-ADN molde, lo que puede reducir la eficacia de la amplificación. También
deben evitarse los tramos de polipirimidina (T, C) y polipurina (A, G). Lo ideal es que
el cebador tenga una mezcla casi aleatoria de nucleótidos, un contenido de GC del
50 % y una longitud aproximada de 20 bases. De esta manera, la Tf estará en la
banda de 56 – 62 ºC (Dieffenbach et al., 1995).
Secuencia del extremo 3’
Se ha visto claramente que la posición terminal 3' de los cebadores de la PCR es
fundamental para evitar errores de cebado. Ya se ha explorado el problema de las
homologías de cebadores en estas regiones. Otra variable importante es la inclusión
de un residuo de G o C en el extremo 3’ de los cebadores. Este «cepo de GC»
contribuye a que sea correcta la unión en el extremo 3’, debido a la mayor fortaleza
del puente de hidrógeno de los residuos de G/C. Esto también ayuda a mejorar la
eficacia de la reacción por minimizar las eventuales aberturas que pudiera haber.
PCR especializada
Además de la amplificación de una secuencia diana de ADN por los procedimientos
normales de PCR que se han descrito, se han desarrollado varios tipos
especializados de PCR para aplicaciones específicas.
PCR anidada
Pueden utilizarse conjuntos anidados de cebadores para mejorar el rendimiento de
la PCR de la secuencia diana de ADN (Newton y Graham, 1994). La PCR con
Sesión nº 6
23
cebadores anidados se efectúa haciendo entre 15 y 30 ciclos con un primer conjunto
de cebadores y después otros 15 a 30 ciclos con un segundo conjunto de cebadores
respecto a una región interna del producto de ADN amplificado en primer lugar. Así
pues, el fragmento más largo producido en la primera ronda de PCR se utiliza como
ADN molde para la segunda PCR. El método de PCR anidada puede aumentar
espectacularmente la sensibilidad y la especificidad de la amplificación del ADN.
Mejora particularmente la especificidad porque esta técnica elimina casi siempre los
eventuales productos de amplificación inespecíficos que perturban el proceso. Esto
se debe a que tras la primera ronda de PCR es poco probable que los eventuales
productos inespecíficos sean suficientemente complementarios de los cebadores
anidados y puedan servir de ADN molde para la amplificación posterior, y así lo que
se amplifica preferentemente es la secuencia diana. No obstante, un inconveniente
de esta extrema sensibilidad es el mayor riesgo de contaminación, y deben
extremarse las precauciones cuando se realiza esta PCR, sobre todo en un
laboratorio de diagnóstico.
PCR Múltiplex
Mientras que la PCR normal utiliza en general un solo par de cebadores para
amplificar una secuencia específica, la PCR Múltiplex utiliza múltiples pares de
cebadores para amplificar muchas secuencias simultáneamente. La presencia de
muchos cebadores de PCR en un solo tubo puede causar muchos problemas, como
el aumento de la formación de productos de PCR con errores de cebado, dímeros de
cebadores y la discriminación de la amplificación de fragmentos más largos de ADN
(Atlas y Bey, 1994).
Para este tipo de amplificación por PCR, se eligen cebadores con temperaturas de
hibridación similares. Las longitudes de los productos amplificados deben ser
similares; si hay grandes diferencias entre las longitudes de los ADN diana se
favorece la amplificación de la diana más corta respecto a la más larga, lo que
implica diferencias en el rendimiento de los productos amplificados. Por otra parte,
los tampones de PCR Múltiplex contienen un aditivo de la polimerasa Taq, que
reduce la competencia entre amplicones y la discriminación de fragmentos más
largos de ADN durante la PCR Múltiplex.
Los productos de la PCR Múltiplex pueden seguir hibridándose con una sonda
específica del gen con fines de verificación.
Sesión nº 6
24
La PCR en la práctica
Como ya se ha visto en secciones anteriores, la utilización de la PCR está muy
difundida porque se trata de una técnica potente de análisis y preparación. No
obstante, dada la naturaleza de este procedimiento, es posible que cantidades traza
de ADN contaminante sirvan de ADN molde, lo que provocaría la amplificación de un
ácido nucleico distinto del diana (falsos positivos). Así pues, resulta fundamental
realizar la amplificación por PCR en un entorno libre de ADN. El riesgo de
contaminación se reduce si se dispone de zonas de trabajo físicamente separadas y
dotadas de su propio material. El requisito previo más importante para reducir al
mínimo la tasa de falsos resultados positivos es el cumplimiento estricto de las
normas de descontaminación (descontaminación de ácidos nucleicos, prevención de
la formación de aerosoles, etc.). La contaminación de la PCR puede deberse a
fuentes diversas, como las siguientes:
•
mesas de laboratorio, equipos y pipetas, que pueden estar contaminados con
preparados anteriores de ADN, o con fragmentos de restricción purificados;
•
contaminación cruzada entre muestras;
•
productos de amplificaciones anteriores por PCR.
Esta sección recoge algunas recomendaciones, con el fin de definir los requisitos
normales para el establecimiento y mantenimiento de un entorno limpio para
cualquier sistema de ensayo con PCR, independientemente del número de muestras
tratadas (Roth et al., 1997).
Métodos físicos de prevención
Instalaciones de los laboratorios. Para evitar la contaminación, debe disponerse
de zonas de trabajo separadas físicamente de la forma siguiente:
1. Zona de preparación de muestras
Esta sala consiste de una zona en que se efectúan todas las fases previas a la
amplificación del ADN molde (p. ej., aislamiento y purificación del ADN).
2. Sala de disposición de la PCR
Esta sala «limpia» se dedica a los procesos de preparación de la PCR en sí (p.
ej., mezcla maestra, diluciones de cebadores, etc.).
3. Zona post-PCR
Esta zona se reserva a la amplificación de la secuencia del ADN diana, y a la
detección y análisis de los productos de la PCR.
Sesión nº 6
25
Por otra parte, han de seguirse las normas generales siguientes:
•
Todas las salas deben contener su propio material (batas, guantes, reactivos y
suministros).
•
Los reactivos y demás material deben etiquetarse con el nombre del contenido y
la fecha de preparación.
•
Ha de utilizarse un sistema de flujo unidireccional, es decir, nunca se han de
trasladar materiales, muestras ni equipos de las zonas post-PCR a lugares prePCR.
•
Deben utilizarse tubos de reacción para PCR desechables, libres de
desoxirribonucleasa y de ribonucleasa.
•
Han de utilizarse puntas de pipeta especiales, que impidan la formación de
aerosoles, y los juegos de pipetas serán exclusivos (se utilizarán solo para la
PCR) y, de preferencia, del tipo de desplazamiento positivo.
•
Siempre que sea posible, prepárese la PCR en una campana extractora dotada
de luz UV. En la campana extractora hay de poner una microcentrifuga y guantes
desechables que se utilizarán exclusivamente para la PCR.
•
Las mesas y estantes se lavarán periódicamente con lejía al 10 %, seguida de
etanol al 70 %.
Manipulación de las muestras
•
Utilícense técnicas estériles y llévense puestos guantes recientes siempre que se
trabaje en las zonas antes descritas. Hay que cambiarse de guantes con
frecuencia, sobre todo si se sospecha que se han contaminado con soluciones
que contengan ADN molde.
•
Para preparar los reactivos de la PCR y el ADN molde han de utilizarse siempre
materiales de vidrio, de plástico y pipetas nuevos o esterilizados.
•
Pasar por autoclave todos los reactivos y soluciones que puedan sufrir este
tratamiento sin que se vean afectadas sus propiedades. Por supuesto, no deben
pasar por autoclave los cebadores, los dNTP ni la ADN Taq polimerasa.
•
Debe disponerse de un conjunto propio de reactivos y soluciones de PCR que
solo se utilizarán con este fin, y dichos reactivos se almacenarán en pequeñas
cantidades.
•
Cuando se pipetea el ADN, ha de evitarse la formación de aerosoles que puedan
transportar contaminantes.
Sesión nº 6
•
26
Siempre han de efectuarse reacciones de control, como por ejemplo un control
negativo («sin ADN»), que contenga todos los componentes de la reacción
excepto el ADN molde, y un control positivo que se haya utilizado con éxito en
PCR anteriores.
Sesión nº 6
27
Métodos bioquímicos de prevención
Uracil-ADN glucosilasa. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) puede
amplificar una sola molécula más de mil millones de veces. Así, es posible amplificar
una cantidad incluso minúscula de un contaminante, lo que daría lugar a un falso
positivo. Tales contaminantes suelen ser productos de anteriores amplificaciones por
PCR (contaminación por arrastre). Por tanto, se han elaborado métodos para evitar
esta contaminación.
Una estrategia frecuente es sustituir el dTTP por dUTP durante la amplificación por
la PCR, para formar ADN que contenga uracilo (U-ADN) (Longo et al., 1990). El UADN contaminante de la muestra se eliminará tratando las mezclas de PCR
posteriores con uracil-ADN glucosilasa (UNG) antes de la amplificación por PCR y
descomponiendo después los polinucleótidos pirimidínicos a temperatura elevada
(95 ºC) en condiciones alcalinas (durante la fase de desnaturalización inicial) (véase
la figura 8).
UracilADN
─►
Glucosilasa
Calor
─►
pH alcalino
A=Adenina
U=Uracilo
G=Guanina
Figura 8. Reacción de la uracil-ADN glucosilasa.
Por supuesto, este método exige que todas las PCR del laboratorio se realicen con
dUTP en lugar de con dTTP.
Ha de tenerse en cuenta lo siguiente cuando se utilicen productos de PCR que
contengan dU en aplicaciones posteriores:
Sesión nº 6
•
28
los productos de PCR que contienen dU funcionan tan bien como los que
contienen dT cuando se utilizan como dianas de hibridación o como ADN moldes
para la técnica del didesoxi;
•
los productos de PCR que contienen dU pueden clonarse directamente si se
transforman en hospedadores bacterianos UNG-;
•
un sustrato que contenga dU es digerido fácilmente por ciertas enzimas de
restricción comunes (p. ej., EcoR I y BamH I), mientras que otras (p. ej., Hpa I,
Hind II, Hind III) presentan una actividad reducida sobre estos sustratos;
•
no se recomienda utilizar ADN con dU en estudios sobre la unión a proteínas ni
sobre la interacción del ADN con proteínas.
Desoxirribonucleasa I, exonucleasa III. Otros métodos bioquímicos se basan en el
tratamiento del ADN contaminado con desoxirribonucleasa I, exonucleasa III o con
una enzima de restricción que contenga una secuencia de reconocimiento dentro del
ADN diana. Sin embargo, dadas las condiciones desfavorables en que debe
efectuarse la reacción, estas enzimas presentan el inconveniente de reducir la
eficacia de la amplificación por PCR.
Preparación de la mezcla para la PCR (mezcla maestra)
Los reactivos fundamentales para la PCR son agua, el tampón de reacción, una
ADN polimerasa termoestable, cebadores oligonucleotídicos, desoxinucleótidos
(dNTP) y ADN molde (diana), así como iones de magnesio (Mg2+). En general, todos
los reactivos (excepto el ADN molde) se mezclan en un solo tubo, con un volumen
suficiente según el número de reacciones que se vaya a realizar (mezcla maestra).
La mezcla maestra se reparte a continuación en alícuotas en varios tubos y se
añade el ADN molde. El uso de una solución maestra reduce el riesgo de
contaminación y mejora el rendimiento de la PCR por los motivos siguientes:
•
se garantiza una calidad uniforme de la solución respecto a todos los reactivos
para una serie de análisis;
•
disminuye el riesgo de contaminación de la solución original y de las resultantes;
•
pueden pipetearse volúmenes mayores;
•
hay menos etapas de pipeteado, con lo que se ahorra tiempo.
El éxito en la amplificación de la región de interés depende de la cantidad y de la
calidad del ADN molde. La cantidad de ADN molde necesaria es función de la
complejidad de la muestra de ADN. Teniendo en cuenta que el tamaño del genoma
Sesión nº 6
29
nuclear varía según los organismos, la concentración de ADN debe mantenerse
constante (generalmente 10 ng/µl). El cuadro 3 muestra una comparación del
tamaño del genoma de varias especies vegetales utilizadas con frecuencia en la
transformación vegetal, así como el número correspondiente de ejemplares de
genoma en una cantidad definida de ADN.
Cuadro 3. Comparación del tamaño del genoma de varias especies vegetales y
número correspondiente de ejemplares de genoma en una cantidad definida de
ADN.
Muestra
Tamaño del
Ejemplares de genoma en
Ejemplares de genoma
genoma
1 µg ADN
en
1 ng ADN
Maíz
5 x 109 pb
1,85 x 105
185
Soja
1,55 x 109 pb
5,98 x 105
598
Tabaco
3,8 x 109 pb
2,43 x 105
245
Arroz
8
4 x 10 pb
2,31 x 10
6
2310
Por ejemplo, en un plásmido de 4 kb con un inserto de 1 kb, la diana de interés es el
25 % del ADN aportado. A la inversa, un gen de 1 kb en el genoma del maíz (5 x 109
pb) representa
alrededor
del
0,00002 %
del
ADN
aportado.
Hace
falta
aproximadamente un millón de veces más ADN del genoma del maíz para mantener
el mismo número de ejemplares de la diana por reacción. Para optimizar los
resultados, deben utilizarse > 104 ejemplares de la secuencia diana como ADN
molde inicial para obtener una señal al cabo de 25 o 30 ciclos. Aunque en la práctica
es posible amplificar menos de 10 ejemplares de una secuencia diana, en este caso
podría ser necesario un número mayor de ciclos de PCR para detectar una señal por
electroforesis en gel. Los protocolos generales aplicados habitualmente consideran
un número de ciclos entre 30 y 40. Debe vigilarse un aumento del número de ciclos,
ya que entonces podría incrementarse la amplificación inespecífica.
Controles
Como se señalaba en la sección anterior, se encuentran fuentes posibles de
contaminación por todo el laboratorio. Tanto las muestras como el personal de
laboratorio, el sistema de aire acondicionado, el equipo y los reactivos pueden ser
Sesión nº 6
30
fuente de contaminación. Entre los agentes contaminantes pueden citarse los
siguientes:
1. contaminación por arrastre de ADN diana amplificado en PCR anteriores;
2. contaminación cruzada entre muestras, lo que supone la transferencia de ADN
diana de una muestra a otra;
3. ADN genómico de preparados de muestras anteriores;
4. degradación de productos por reacciones de descontaminación.
Mientras que las tres primeras formas de contaminación producen falsos positivos, el
último tipo produce falsos negativos. Esta forma de contaminación, observada en
primer lugar por Niederhauser y colaboradores en 1994, provoca la inhibición de las
PCR (Niederhauser et al., 1994). De hecho, la descontaminación con el método
UNG favorece la formación de complejos con los cebadores.
Para obtener resultados fiables, con las PCR siempre hay que utilizar controles tanto
positivos como negativos. El cuadro 4 indica algunos de los controles más utilizados
para garantizar el resultado de los procedimientos de amplificación de ácido
nucleico.
Cuadro 4. Controles que deben introducirse en los ensayos con PCR.
Control
Método
Contaminación de los reactivos con
el ADN diana
Control negativo de la PCR sin ADN molde
(solo mezcla maestra)
Especificidad de la reacción
Controles para detectar productos
secundarios e inespecíficos
Desarrollo y sensibilidad de la
reacción
Controles positivos y negativos para verificar
que se cumplen las condiciones y
rendimientos buscados
Integridad de la mezcla de PCR
PCR con control positivo de ADN
Controles positivos
Hay que comprobar mediante controles positivos la eficacia de la extracción y
amplificación del ADN. Lo ideal es dar límites de detección en equivalentes
genómicos, lo que permitiría la producción de controles de sensibilidad definidos,
con pequeños números de ejemplares. Como norma, debe disponerse de un
Sesión nº 6
31
preparado de referencia que contenga una concentración conocida del ADN diana
estudiado.
Controles negativos
Puede darse contaminación (arrastre de productos amplificados o ácidos nucleicos)
durante el aislamiento y la purificación del ADN diana, así como durante la
preparación de la mezcla de reacción para la amplificación. Por tanto, es necesario
introducir un control negativo con la mezcla de reacción para la amplificación.
Sesión nº 6
32
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Sesión nº 6
Alimentos
Sesión nº 7
Características de la Soja Roundup Ready, del Maíz
MON810 y del Maíz Bt-176
M. Querci y M. Mazzara
Características de la Soja Roundup Ready, del Maíz MON810 y del Maíz Bt-176
2
Índice
Sesión nº 7
Características de la Soja Roundup Ready, del Maíz MON810 y del
Maíz Bt-176
Características de la soja Roundup Ready
3
Características del maíz MON810
7
Características del maíz Bt-176
11
Bibliografía
17
Sesión nº 7
3
Características de la soja Roundup Ready1
Identificación sucinta
Denominación
GTS 40-3-2
Solicitante
Monsanto Canada Inc.
Especie vegetal
Glycine max L. (soja)
Caracteres nuevos
Nueva tolerancia al glifosato, ingrediente
activo del herbicida Roundup
Método de introducción del
Aceleración de partículas (biolística)
nuevo carácter genético
Utilización propuesta
Producción de soja para la alimentación
animal (principalmente harina y copos
tostados desgrasados) y el consumo
humano (principalmente aceite, fracciones
de proteínas y fibra dietética)
Información de base
Monsanto Canada Inc. ha desarrollado la línea de soja GTS 40-3-2 para permitir la
utilización de glifosato como forma alternativa de lucha contra las malas hierbas en
la producción de soja.
El desarrollo de GTS 40-3-2 se ha basado en la tecnología de recombinación de
ADN, mediante la introducción de una forma tolerante al glifosato del gen de la
enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), aislada de la cepa CP4 de
Agrobacterium tumefaciens, en la variedad comercial de soja "A5403" (Asgrow Seed
Company).
Descripción del nuevo carácter
Tolerancia al glifosato
El ingrediente activo de Roundup, el glifosato, es un herbicida sistémico postemergente utilizado en todo el mundo como agente de lucha contra las malas
hierbas no selectivo. El glifosato actúa como inhibidor competitivo de la 5enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa, enzima esencial de la ruta bioquímica del
shikimato que participa en la producción de los aminoácidos aromáticos: fenilalanina,
1
Procedentes de la Agencia Canadiense de Inspección Alimentaria, Documento de decisión DD95-05.
Sesión nº 7
4
tirosina y triptófano (figura 1). La inhibición de la EPSPS supone la interrupción del
crecimiento y la muerte de la planta.
Esta enzima esencial presenta una amplia distribución entre vegetales, hongos y
microorganismos, pero el gen introducido de tolerancia al glifosato codifica una
versión bacteriana (derivada de la cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens)
sumamente insensible al glifosato y que puede, por tanto, satisfacer las necesidades
metabólicas de aminoácidos aromáticos de la planta.
El gen EPSPS está regulado por un fuerte promotor constitutivo del virus del
mosaico de la coliflor (P- CaMV E35S) y termina con el terminador de la nopalina
sintasa (T-nos) de Agrobacterium tumefaciens (figura 2). Se ha clonado en el
extremo 5’ del gen de la tolerancia al glifosato, una secuencia de ADN derivada de
plantas que codifica un péptido de tránsito al cloroplasto (CTP4 de Petunia hibrida).
El péptido señal fusionado al gen EPSPS facilita la importación de la enzima recién
traducida a los cloroplastos, donde se encuentran la ruta del shikimato y los sitios de
acción del glifosato. Una vez ha tenido lugar la importación, se retira el péptido de
tránsito y se degrada rápidamente mediante una proteasa específica.
La EPSP sintasa se encuentra abundantemente en la naturaleza y, en principio, no
es tóxica ni alergénica. Al someterla a análisis comparativos con bases de datos de
secuencias de polipéptidos tóxicos o alergénicos, la secuencia de aminoácidos de la
enzima no muestra ninguna homología significativa con ninguna toxina o alérgeno
conocido.
fosfoenolpiruvato
+
eritrosa-4-fosfato
shikimato-3-fosfato
fosfoenolpiruvato
glifosato (Roundup)
N-(fosfonometil)glicina
5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfato
fenilalanina
tirosina
triptófano
Figura 1
La EPSPS cataliza la reacción
de
shikimato-3-fosfato
y
fosfoenolpiruvato (PEP) para
formar 5-enolpiruvilshikimato3-fosfato (EPSP) y fosfato. El
EPSP
es
un
producto
intermedio en la síntesis de los
aminoácidos
aromáticos.
Como consecuencia de la
inhibición
de
esta
ruta
bioquímica, se altera la
síntesis
de
proteínas,
provocando la muerte de la
planta.
La EPSPS es el único objetivo
fisiológico del glifosato en las
plantas, y ninguna otra enzima
que utilice PEP es inhibida por
el glifosato.
Sesión nº 7
P-E35S
CTP4
CP4 EPSPS
5
T-nos
Figura 2. Representación esquemática del casete del gen de soja Roundup Ready
(modificado a partir de Padgette et al., 1995).
Método de desarrollo
La variedad comercial de soja A5403 (Asgrow Seed Co.) se ha transformado
mediante un bombardeo de partículas de oro, con el vector plasmídico PV-GGMT04
recolectado de Escherichia coli (véase la figura 3). El plásmido PV-GGMT04
contenía el gen CP4 EPSPS que codifica la tolerancia al glifosato, el gen gus de
producción de ß-glucuronidasa como marcador genético y el gen nptII de resistencia
a antibióticos (kanamicina). El transformante original seleccionado mostró dos sitios
de integración, uno con el marcador genético gus y otro con el gen de tolerancia al
glifosato. Esos dos sitios se segregaron posteriormente de forma independiente en la
generación sexual siguiente, y se observó mediante análisis que la línea GTS 40-3-2
contenía un único sitio de inserción en el que solo estaba integrado el gen de
tolerancia al glifosato.
Figura 3. Mapa plasmídico que incluye los elementos genéticos del vector PV-GGMT04
utilizado en la transformación 40-3-2 de la soja RR, (procedente de Monsanto, 2000)
Sesión nº 7
6
Estabilidad de la inserción de los caracteres introducidos
Los datos originales (Padgette et al., 1995, 1996) indicaron que GTS 40-3-2 contenía
un único casete génico CP4 EPSPS funcional, consistente en el promotor E35S del
virus del mosaico de la coliflor (CaMV), un péptido de tránsito del cloroplasto, la
secuencia de codificación CP4 EPSPS y la secuencia de poliadenilación nos.
No se observaron incorporaciones de ninguna región de codificación desde fuera del
gen de fusión del vector plasmídico original. En las generaciones posteriores no se
observó más segregación del gen de fusión descrito más arriba, lo que revelaba que
la línea GTS 40-3-2 era homocigótica para el gen de fusión. Los análisis del ADN
realizados en seis generaciones mostraron que la inserción era estable.
En estudios de caracterización más recientes se ha comprobado que, durante la
integración del ADN insertado, se habían producido varias modificaciones y que,
además del inserto primario funcional, el producto 40-3-2 de la soja Roundup Ready
contiene dos pequeños segmentos no funcionales de ADN insertado de 250 pb y 72
pb, respectivamente (Monsanto, 2000; Windels et al., 2001)
Decisión de reglamentación
La soja Roundup Ready (RR) es actualmente la única línea de soja transgénica cuya
comercialización está aprobada en la UE. Tras su autorización en los EE. UU. en
1994, la Decisión 96/281/CE de la Comisión, de 3 de abril de 1996, permitió su
importación a la Unión Europea. La citada Decisión autoriza la importación de
semillas a la UE únicamente para su transformación industrial en productos
inviables, incluidos piensos, productos alimenticios y otros productos en los que se
utilicen fracciones de soja.
Sesión nº 7
7
Características del maíz MON8102
Denominación
Maíz
producto
de
la
transformación
MON810 (nombre comercial YieldGard)
Solicitante
Monsanto Canada Inc.
Especie vegetal
Zea mays L. (maíz)
Caracteres nuevos
Resistencia al piral del maíz (Ostrinia
nubilalis)
Aceleración de partículas (biolística)
Producción de Z. mays para el consumo
humano (productos de molienda húmeda
o seca o aceite de semillas) y harina y
ensilado para alimentación del ganado.
El maíz producto de la transformación MON810 (YieldGard) ha sido desarrollado por
Monsanto Canada Inc. específicamente para ser resistente al piral del maíz (Ostrinia
nubilalis) y proporcionar un método de lucha contra las pérdidas de las cosechas
ocasionadas por la alimentación del piral de maíz en su fase de larva, sin utilizar los
plaguicidas convencionales.
La línea MON810 se ha desarrollado utilizando la tecnología de recombinación del
ADN y el bombardeo con microproyectiles de células vegetales para introducir un
gen que codifique la producción de una proteína insecticida presente en la
naturaleza (derivada de Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki). Esta proteína es activa
contra determinadas especies de Lepidoptera, el orden de insectos al que
pertenecen las mariposas y polillas, incluido el piral del maíz. Más concretamente, la
proteína expresada en la línea MON810 es una forma truncada de una proteína
insecticida, la δ-endotoxina CRYIA(b), y protege a las plantas de maíz de los daños
causados por las larvas del piral del maíz en las hojas y tallos.
2
Procedentes de la Agencia Canadiense de Inspección Alimentaria, Documento de decisión 97-19.
Sesión nº 7
8
Descripción del nuevo carácter
Resistencia al piral del maíz
Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki es una bacteria que forma endosporas, grampositiva y presente en el suelo. En su fase esporogénica, además de la endospora,
produce varios cristales de proteína insecticida, incluida la δ-endotoxina CRYIA(b),
activa contra determinados insectos lepidópteros como el piral del maíz, la tórtrix de
las yemas de la picea, el gusano telarañoso, la palomilla gitana, la palomilla de dorso
de diamante, la lagarta del girasol, el gusano de la yema del tabaco y la oruga de la
col. Se ha demostrado en numerosas ocasiones que la proteína no es tóxica para los
seres humanos, para otros animales vertebrados ni para los insectos beneficiosos
(Lee et al., 1995). La línea MON810 fue transformada con una copia del gen cryIA(b)
bajo el control del potente promotor constitutivo reforzado CaMV 35S y la secuencia
principal del intrón de HSP70 del maíz (figura 4).
La secuencia de codificación cryIA(b) de Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki HD-1 fue
modificada para optimizar y maximizar la expresión de la δ-endotoxina CRYIA(b) en
las plantas. La proteína resulta tóxica para las larvas de lepidópteros tras romperse
para dar un núcleo bioactivo y resistente a la tripsina. Se cree que la actividad
insecticida depende de la unión de los fragmentos activos a receptores específicos
presentes en células epiteliales del mesogastrio de insectos sensibles y de la
posterior formación de poros, lo que altera el equilibrio osmótico y, finalmente, deriva
en lisis celular. Las plagas de lepidópteros específicas del maíz, sensibles a la
proteína, son el piral del maíz y el gusano Helicoverpa zea.
La secuencia de aminoácidos de la toxina expresada en el maíz modificado resultó
ser idéntica a la producida de forma natural y equivalente a la proteína producida
como plaguicida biológico, ampliamente utilizada por la industria alimentaria
ecológica.
P-E35S
hsp70
cryIA(b)
T-nos
Figura 4. Representación esquemática de la construcción genética cryIA(b) del
plásmido PV-ZMBK07 utilizado en la transformación de MON810, que incluye el
promotor reforzado CaMV 35S, el intrón de hsp70 del maíz y el gen sintético de la δendotoxina cryIA(b) seguido del terminador nos (modificado de BATS, 2003).
Sesión nº 7
9
La línea MON810 se obtuvo a partir del genotipo Hi-II de maíz mediante
transformación biolística con una mezcla de ADN plasmídicos, PV-ZMBK07 y PVZGMT10. El plásmido PV-ZMBK07 contiene el gen cryIA(b) (figura 5) y el plásmido
PV-ZGMT10 contiene los genes CP4 EPSPS y gox. Ambos plásmidos contienen
también el gen nptII (para la selección bacteriana) bajo el control de un promotor
bacteriano, y un origen de replicación de un plásmido pUC (ori-pUC) necesario para
la replicación de los plásmidos en E. coli. Los dos vectores se introdujeron mediante
el
bombardeo
con
microproyectiles
en
células
vegetales
cultivadas.
Se
seleccionaron las células transformadas con tolerancia al glifosato y a continuación
se cultivaron en un medio de cultivo tisular para la regeneración de plantas
(Armstrong et al., 1991).
Los análisis moleculares proporcionados por los autores indicaron que sólo los
elementos de la construcción genética PV-ZMBK07 se integraron en el genoma de la
línea MON810 como un inserto único, consistente en el promotor reforzado CaMV
35S (E35S), la secuencia principal de hsp70 y el gen truncado cryIA(b). La señal de
terminación en 3' de nos, presente en el plásmido PV-ZMBK07, se perdió mediante
un truncamiento en 3’ del casete del gen y, por consiguiente, no se integró en el
genoma hospedador (BATS, 2003).
CryIA(b)
Figura 5. Representación esquemática del plásmido PV-ZMBK07 utilizado en la
formación de la línea MON810 (procedente de Agbios Database on Essential
Biosafety).
Sesión nº 7
10
Estabilidad de inserción de los caracteres introducidos
Los datos facilitados por los autores muestran que la segregación y la estabilidad
corresponden a un único sitio de inserción del gen cryIA(b) en el genoma de
MON810. La estabilidad de la inserción se demostró mediante múltiples
generaciones de cruces. La línea de maíz se ha cruzado con varios genotipos de
maíz diferentes durante 4 generaciones, manteniendo la protección contra el piral del
maíz. La línea MON810 deriva de la tercera generación de retrocruzamiento. La
integración estable del inserto único se demostró a través de las tres generaciones
mediante análisis de transferencia de Southern.
La Agencia de Protección del Medio Ambiente de EE. UU. autorizó en julio de 1996
la plantación de la línea de maíz MON810 en dicho país. La comercialización de esta
línea de maíz en la UE se autorizó mediante la Decisión 98/294/CE de la Comisión,
de 22 de abril de 1998.
La Agencia Canadiense de Inspección Alimentaria elaboró el Documento de decisión
97-19 para su aprobación en la alimentación humana y animal. La línea MON810
está también autorizada en Argentina, Australia, Japón, Sudáfrica y Suiza.
Esta línea de maíz se destina al consumo humano (producto de molienda húmeda,
seca o aceite de semillas) y harina y ensilado para alimentación del ganado.
Sesión nº 7
11
Características del maíz Bt-1763
Denominación
Maíz producto de la transformación 176 Bt
Solicitante
Ciba Seeds de Ciba-Geigy y Mycogen
Corporation
Especie vegetal
Zea mays L. (maíz)
Caracteres nuevos
Resistencia al piral del maíz (Ostrinia
nubilalis);
tolerancia
al
herbicida
glufosinato de amonio
Aceleración de partículas (biolística) en
embriones inmaduros
Para cultivo como maíz en grano híbrido
Ciba Seeds y Mycogen Corporation han desarrollado una línea de maíz resistente al
piral del maíz. Esta línea de maíz, denominada producto Bt-176, ha sido
transformada mediante la tecnología de recombinación de ADN y el bombardeo con
microproyectiles de embriones para producir una proteína insecticida, derivada de
Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki, activa contra determinadas especies de
Lepidoptera, el orden de insectos al que pertenecen las mariposas y polillas, incluido
el piral del maíz. Concretamente, esta proteína es una forma truncada de la δendotoxina CRYIA(b) y protege las plantas de maíz contra los daños causados por
las larvas del piral del maíz con su alimentación. Además, esta línea de maíz fue
cotransformada con un gen que confiere tolerancia al herbicida glufosinato de
amonio, utilizado para seleccionar las plantas transformadas en fases muy
tempranas de desarrollo.
Descripción de los caracteres nuevos
Resistencia al piral del maíz
Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki es una bacteria que forma endosporas, grampositiva y presente en el suelo. En su fase esporogénica, además de la endospora,
produce varios cristales de proteína insecticida, incluida la δ-endotoxina CRYIA(b),
3
Procedentes de la Agencia Canadiense de Inspección Alimentaria, Documento de decisión DD96-09.
Sesión nº 7
12
activa contra determinados insectos lepidópteros como el piral del maíz, la tórtrix de
las yemas de la picea, el gusano telarañoso, la palomilla gitana, la palomilla de dorso
de diamante, la lagarta del girasol, el gusano de la yema del tabaco y la oruga de la
col. Se ha demostrado en numerosas ocasiones que la proteína no es tóxica para los
seres humanos, para otros animales vertebrados ni para los insectos beneficiosos
(Lee et al., 1995).
Se desarrolló un gen sintético cryIA(b), derivado de la cepa HD-1 de Bacillus
thuringiensis ssp. kurstaki, que codifica una forma truncada de la δ-endotoxina
CRYIA(b), y modificada para aumentar su expresión en el maíz. El gen sintético
tiene aproximadamente una homología del 65 % en lo que respecta a los nucleótidos
con el gen nativo (Koziel et al., 1993). La proteína CRYIA(b) truncada contiene la
región insecticida de la CRYIA(b) nativa. Se cree que la actividad insecticida
depende de la unión del fragmento activo a los receptores específicos presentes en
células epiteliales del mesogastrio de insectos sensibles y de la posterior formación
de poros, lo que altera el equilibrio osmótico y deriva en lisis celular, interrupción de
la alimentación y finalmente muerte del insecto.
La línea Bt-176 se obtuvo por transformación con dos construcción genéticas
sintéticos del gen cryIA(b). Un construcción genética está bajo control transcripcional
del promotor de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (P-PEPC) del maíz y se expresa en
tejidos verdes. El segundo construcción genética está bajo el control del promotor de
una proteína kinasa dependiente de calcio (P-CDPK) del maíz y se expresa
específicamente en el polen. Ambas construcciones genéticas se terminan con un
terminador extraído del virus del mosaico de la coliflor (T-CaMV 35S) y también
incluye el intrón 9 del gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (véanse las figuras 6 y
7).
La finalidad de la expresión de la proteína CRYIA(b) en los tejidos verdes es hacer la
planta resistente a la primera generación de larvas del piral del maíz, que se
alimenta de las hojas. La expresión en polen se dirige a la segunda generación de
larvas de piral del maíz, ya que éstas se alimentan de polen.
La proteína CRYIA(b) de las hojas del producto de transformación Bt-176 se sometió
a estudios de digestibilidad in vitro simulando condiciones gástricas de mamífero y
se demostró su degradación como proteína dietética convencional.
Sesión nº 7
13
T-35S
cryIA(b)
P-CDPK
PEPC Intr # 9
Figura 6. Representación esquemática del gen sintético cryIA(b) bajo el control del
promotor CDPK (de Matsuoka et al., 2000).
PEPC Intr # 9
T-35S
cryIA(b)
P-PEPC
Figura 7. Representación esquemática del gen sintético cryIA(b) bajo el control del
promotor PEPC (de Matsuoka et al., 2000).
Tolerancia al herbicida glufosinato de amonio
El gen de la tolerancia al glufosinato de amonio (gen bar), extraído de la bacteria
común
del
suelo
Streptomyces
hygroscopicus,
codifica
una
fosfinotricina
acetiltransferasa (PAT) bajo control transcripcional del promotor constitutivo CaMV
35S, activo en todos los tejidos vegetales, excepto en el polen. La fosfinotricina, un
inhibidor de la glutamina sintetasa, es la fracción activa del glufosinato de amonio. La
actividad herbicida de la fosfinotricina se caracteriza por la inhibición de la glutamina
sintetasa resultante de la acumulación de cantidades letales de amoniaco en la
planta. La PAT cataliza la acetilación de fosfinotricina, de tal modo que elimina su
actividad herbicida.
El L- isómero de la fosfinotricina (L-PPT) es ampliamente utilizado como un agente
de amplio espectro para luchar contra las malas hierbas. El L-PPT es el ingrediente
activo del herbicida glufosinato de amonio desarrollado por Hoechst y denominado
BASTA. Este isómero es un análogo estructural de glutamato, el sustrato de la
Sesión nº 7
14
glutamina sintetasa (véase la comparación entre el L-PPT y el glutamato en la
figura 8).
O
CH3 —
H
H
P — CH2 — CH2 — C — COOH
OH
HOOC — CH2— CH2 — C— COOH
NH2
NH2
Figura 8. El L-isómero de fosfinotricina (izquierda) comparado con el glutamato
(derecha).
En un principio, el L-PPT fue aislado de Streptomyces viridochromogenes, que
sintetiza sólo el L-isómero de la fosfinotricina. El glufosinato de amonio sintético es
una mezcla equimolar y racémica de los isómeros D- y L- de la PPT (la D-PPT no
exhibe actividad herbicida). Se ha demostrado que la PAT actúa específicamente
sobre la fosfinotricina, ya que no se ha observado ninguna otra actividad con otros
sustratos comunes de la acetiltransferasa, como el piruvato, la colina o la serina.
Mediante estudios de digestibilidad in vitro, simulando condiciones gástricas de
mamífero simuladas, llevados a cabo sobre la PAT expresada en E. coli, se vio que
esta proteína se digiere como una proteína dietética convencional.
El gen de la tolerancia al glufosinato de amonio se introdujo como un marcador
genético que permitía la identificación de embriones transformados en un medio
selectivo para poder realizar un seguimiento de los genes introducidos durante el
cultivo de las plantas. Como ya se ha notificado (FSANZ, 2000), los datos
moleculares indican que la línea Bt-176 contiene una sola copia del gen bar, bajo la
regulación transcripcional del promotor 35S y el terminador 35S extraídos del virus
del mosaico de la coliflor (P-CaMV 35S y T-CaMV 35S, respectivamente) (véase la
figura 9).
P-35S
bar T-35S
Figura 9. Representación esquemática del gen bar (extraído de Matsuoka et al.,
2000).
Sesión nº 7
15
La línea Bt-176 se obtuvo mediante la transformación biolística de la línea
endogámica de maíz CG00526 (Zea mays L.) con dos plásmidos. Los dos
construccion geneticas sintéticos del gen cryIA(b) se clonaron juntos en un único
vector plasmídico (pCIB4431). Un segundo vector plasmídico (pCIB3064) contenía el
gen de la tolerancia al herbicida (bar), aislado de la bacteria del suelo Streptomyces
hygroscopicus. Los dos vectores se introdujeron en la línea de maíz CG00526
mediante el bombardeo con microproyectiles de embriones inmaduros. Con análisis
moleculares de la planta transformada se vio que en el genoma de la línea de maíz
están integradas dos o más copias de cada construcción genética plasmídica. Los
resultados de ensayos y análisis de transferencia de Northern indican que el gen de
la resistencia a la ampicilina (gen bla), regulado por un promotor bacteriano (utilizado
para la selección de los vectores en entornos bacterianos) no se expresó en tejidos
de hojas ni en polen de la planta. Se seleccionaron dos productos transgénicos
independientes de la transformación del maíz para posteriores cruces y
caracterizaciones: el 171 y el 176 (Koziel et al., 1993).
La presencia en maíz Bt-176 de los genes cryIA(b) (Koziel et al.,1993), bar y bla
(Privalle, 1994) se confirmó mediante estudios de caracterización adicionales. Los
datos comunicados por Food Standards Australia New Zealand (FSANZ, 2000)
también indican que puede haber hasta seis copias de los genes cryIA(b) y bla
presentes en Bt-176, y al menos dos del gen bar (junto con el promotor 35S), tal
como determinó el análisis de Southern frente al ADN del maíz Bt-176 (Privalle,
1994).
Estabilidad de inserción de los caracteres
Según la información comunicada (FSANZ, 2000), se determinó que la producción
de las proteínas CRYIA(b) y PAT en hojas y polen de plantas cultivadas en
invernadero era estable tras cuatro generaciones sucesivas de retrocruzamientos.
Los análisis de segregación indicaron que los caracteres de resistencia al piral del
maíz y tolerancia al herbicida se segregan como caracteres mendelianos vinculados.
Un estudio realizado con 3 240 plantas indicó que solo cinco plantas (el 0,15 %) se
consideraron con tolerancia al glufosinato de amonio pero susceptibles de ser
dañadas por larvas de piral del maíz.
Sesión nº 7
16
En agosto de 1995, la Agencia de Protección del Medio Ambiente de los Estados
Unidos aprobó con reservas la comercialización de maíz de campo derivado del
producto de transformación 176 hasta el año 2000.
La comercialización de esta línea de maíz se autorizó en la UE mediante la Decisión
97/98/CE de la Comisión, de 23 de enero de 1997. Esta línea de maíz se destina al
cultivo, producción de semillas y producción de ensilado y grano para la alimentación
animal y grano para la transformación industrial (Decisión 97/98/CE de la Comisión).
Sesión nº 7
17
Bibliografía
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Monsanto Canada Inc.'s Glyphosate Tolerant Soybean (Glycine max L.) Line GTS
40-3-2. http://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/bio/dd/dd9505e.shtml (Último
acceso enero de 2010)
Office. Decision Document 97-19: Determination of the Safety of Monsanto
Canada Inc.'s YieldgardTM Insect Resistant Corn (Zea mays L.) Line MON810.
http://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/bio/dd/dd9719e.shtml (Último acceso
enero de 2010)
Decisión 97/98/CE de la Comisión, de 23 de enero de 1997, relativa a la
comercialización de maíz (Zea mays L.) modificado genéticamente con una
alteración de las propiedades insecticidas conferidas por el gen de la endotoxina
Bt, combinada con una mayor resistencia al herbicida glufosinato de amonio, con
arreglo a la Directiva 90/220/CEE del Consejo. (DO L 31 de 1.2.1997, p. 69).
Sesión nº 7
18
Decisión 96/281/CE de la Comisión, de 3 de abril de 1996, relativa a la
comercialización de semillas de soja (Glycine max L.) modificada genéticamente
con una mayor resistencia al herbicida glifosato, de conformidad con la Directiva
90/220/CEE del Consejo. (DO L 107 de 30.4.1996, p. 10).
Decisión 98/294/CE de la Comisión, de 22 de abril de 1998, relativa a la
comercialización de maíz (Zea mays L. línea MON 810) modificado
genéticamente con arreglo a la Directiva 90/220/CEE del Consejo. (DO L 131 de
5.5.1998, p. 33).
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an
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and
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Sesión nº 7
19
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Sesión nº 7
Alimentos
Sesión nº 8
Características de los Sistemas Cualitativos de PCR
Descritos en el Manual
M. Querci y M. Mazzara
Características de los Sistemas Cualitativos de PCR Descritos en el Manual
2
Índice
Sesión nº 8
Características de los Sistemas Cualitativos de PCR Descritos en el
Manual
Características de los sistemas cualitativos de PCR descritos en el Manual
3
PCR específica de plantas
3
Detección del gen de la lectina
3
Detección del gen de la zeína
3
Método de cribado: detección del promotor CaMV 35S y del terminador nos
4
Detección del promotor CaMV 35S
5
Detección del terminador nos
5
PCR específica de OGM
7
Detección específica del casete génico CTP/EPSPS en la soja Roundup Ready
7
Detección del gen cryIA(b) sintético del maíz Bt-176
7
Detección específica del casete del promotor E35S / exón-intrón de hsp70 del maíz
MON810
9
Bibliografía
11
Sesión nº 8
3
Características de los sistemas cualitativos de PCR descritos en el
Manual
En este curso se utilizarán diferentes sistemas de detección: 1) se emplearán
cebadores específicos de plantas para confirmar la presencia y la calidad (capacidad
de amplificación) del ADN extraído de las muestras; 2) el denominado «método de
cribado», basado en la detección específica de las secuencias reguladoras más
comunes, el promotor 35S y el terminador nos. Esos dos métodos se efectuarán con
arreglo a un protocolo de PCR simple. Por último, se utilizarán cebadores
específicos de OGM en «PCR anidada» para la detección selectiva y la identificación
de las diferentes líneas transgénicas. El presente capítulo incluye una introducción
sucinta de los diferentes sistemas utilizados para la detección y caracterización de la
soja Roundup Ready, del maíz MON810 y del gen cryIA(b) del maíz Bt-176. Para
más información sobre las secuencias y la composición de los cebadores, véase la
Sesión nº 9.
PCR específica de plantas
Detección del gen de la lectina
Para la identificación del ADN de la soja, se utilizarán los cebadores GMO3 y GMO4
(Meyer et al., 1996), que amplifican un fragmento del gen de la lectina (Le1),
específico de la soja.
Como se ha indicado anteriormente, el objetivo es confirmar la presencia y la calidad
del ADN extraído de las muestras que contienen soja, entendiéndose aquí por
calidad del ADN su capacidad de amplificación por la PCR. Los cebadores GMO3 y
GMO4 se utilizan como PCR anidada para la segunda PCR-soja notificada por
Meyer y Jaccaud (1997) sobre el ADN extraído de alimentos transformados.
El
producto previsto es un amplicón de 118 pb.
Detección del gen de la zeína
Los cebadores ZEIN3 y ZEIN4 (Studer et al., 1997) específicos del gen de la zeína
en el caso del maíz (Ze1, codificación de una proteína de 10 kb) se utilizarán para
confirmar la presencia y la calidad del ADN extraído de muestras que contienen
Sesión nº 8
4
maíz. Por lo que respecta al gen de la lectina, los cebadores ZEIN3 y ZEIN4 se
diseñaron en principio como cebadores internos (segunda ronda de PCR) en un
sistema de PCR anidada para la detección de ADN de maíz extraído de alimentos
transformados. Si el ADN diana extraído está presente, intacto y es amplificable, se
prevé la amplificación de una banda de 277 pb.
Método de cribado: detección del promotor CaMV 35S y del
terminador nos
La detección del promotor 35S y del terminador nos por PCR constituye el
denominado «método de cribado» para la identificación de productos alimenticios
derivados de plantas modificadas genéticamente. El uso del promotor 35S y del
terminador nos como secuencias diana permite la detección de la mayoría de los
productos alimenticios modificados genéticamente, ya que hasta ahora están
presentes en casi todos los vegetales modificados genéticamente autorizados por la
UE (Hemmer, 1997). Las características de algunas líneas de maíz cuya
comercialización está autorizada en la UE figuran, a modo de ejemplo, en el
cuadro 1. Los cebadores específicos del promotor 35S y del terminador nos
empleados durante el curso se utilizaron para validar un método de PCR para la
detección de la soja Roundup Ready y del maíz Maximizer (Bt-176) en fracciones de
alimentos transformados (Lipp et al., 2001).
Cuadro 1. Características de algunas líneas de maíz transgénico cuya
comercialización está autorizada en la UE.
Línea Bt 176
CibaGeigy
Bt, bar
PEPC
CDPK
Gen o genes
introducidos
bar
cryIA(b)/int.9 PEPC
cryIA(b)/int.9 PEPC
Línea Bt-11
Novartis
Bt, pat
35S
cryIA(b)/int. IVS6
nos
Línea T25
AgrEvo
pat
35S
pat
35S
Línea MON810
Monsanto
Bt
E35S
E35S
cryIA(b)/int.hsp70
cryIA(b)/int.hsp70
-
Denominación
Empresa
Carácter
Promotor
35S
Terminador
35S
35S
35S
Sesión nº 8
5
Detección del promotor CaMV 35S
Este promotor regula la expresión de los genes de numerosas plantas transgénicas,
como la soja Roundup Ready y la línea de maíz Bt-176. Para su detección
específica, se utilizarán los cebadores p35S-cf3 y p35S-cr4 (Lipp et al., 2001). El
amplicón previsto es un fragmento de 123 pb, como se indica en la figura 1 que
viene a continuación, en el que los cebadores p35S-cf3 y p35S-cr4 se han colocado
en la región correspondiente de la secuencia del promotor CaMV 35S.
ID
AC
FT
FT
FT
A18053_3; parent: A18053
A18053;
promoter
396..1779
/note="35S3 promoter sequence derived from cauliflower
mosaic virus isolate CabbB-JI”
SQ
Sequence 1384 bp;
1140
1200
nnnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnn
nnnnnnnnn
ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag
acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga catctccact gacgtaaggg
p35S-cf3
atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc
1320
p35S-cr4
atttggagag gacacgctga aatcaccagt ctctctctat aaatctatct ctctctctat
1380
aacc
1384
//
1260
Figura 1. Secuencia parcial del promotor 35S derivado del virus del mosaico de la
coliflor (CaMV) y sitios de hibridación de los cebadores p35S-cf3 y p35S-cr4.
Los cebadores HA-nos118-f y HA-nos118-r (Lipp et al., 2001) se utilizan para la
detección del terminador nos, que está presente en la soja Roundup Ready y en
otras líneas de plantas transgénicas (p. ej., la línea de maíz Bt-11). La amplificación
del terminador nos dará lugar a la producción de un fragmento de ADN de 118 pb.
Sesión nº 8
6
En la figura 2, los cebadores HA-nos118-f y HA-nos118-r se han colocado dentro de
la secuencia de la parte transgénica de la soja Roundup Ready.
151
HA-nos118-r >
nnnnnnnnnn nnnnnnnnga tccccgatct agtaacatag atgacaccgc
251
gcgcgataat ttatcctagt ttgcgcgcta tattttgttt tctatcgcgt
< HA-nos118-f
attaaatgta taattgcggg actctaatca taaaaaccca tctcataaat
301
aacgtcatgc attacatgtt aattattaca tgcttaacgt aattcaacag
351
aaattatatg ataatcatcg caagaccggc aacaggattc aatcttaaga
201
/ /
1601
gatccaggtg tcgccttcct tacggatcct ggcgcccatg gcctgcatgg
1651
1701
ccttgcccgt attgatgacg tcctcgcctt ccagaaggcc ggtgatgcgc
GM09 >
gtttcaccgc tcgcgagacc gccgaacatg aaggaccggt gggagatcga
1751
cttgtcgccg ggaatgcgga cggttccgga aaggccagag gatttgcggg
1801
cggttgcggg ccggctgctt gcaccgtgaa gcatgcaggc tgtagccact
1851
gatgctgaaa tcctaaagga acaaaacttt tgcataaaaa ttgaatcttt
1901
tttcaaaacc aacatagaat ttgctgaatt tttcagtttt ttagatccaa
GM08 >
aaacaagaaa acttgaagat ttaggaactt ggggtttatg gaaattggaa
1951
2001
2151
ttgggattaa gggtttgtat cccttgagcc atgttgttaa tttgtgccat
p35S-cr4 >
tcttgaaaga tctgctagag tcagcttgtc agcgtgtcct ctccaaatga
< GM07
aatgaacttc cttatataga ggaagggtct tgcgaaggat agtgggattg
< GM05
< p35S-cf3
tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc acatcaatcc acttgctttg
2201
aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg
2251
ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag gcatcttcaa cgatggcctt
2301
tcctttatcg caatgatggc atttgtagga gccaccttcc ttttccacta
2351
tcttcacaat aaagtgacag atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt
2401
ccggatatta ccctttgttg aaaagtctca catcg
2051
2101
Figura 2. Secuencia de la parte transgénica de la soja Roundup Ready de Monsanto
con arreglo a la patente WO 92/04449.
Sesión nº 8
7
PCR específica de OGM
Los cebadores de amplificación utilizados para la identificación de la soja Roundup
Ready, el maíz Bt-176 y el maíz MON810 se eligieron por su capacidad para
detectar, de manera específica, la estructura genética insertada en los genomas de
la soja Roundup Ready y de los maíces Bt-176 y MON810, respectivamente.
Detección específica del casete génico CTP/EPSPS en la soja Roundup Ready
Las parejas de cebadores GMO9/GMO5 y GMO8/GMO7 se diseñaron para la
detección específica del transgén de la soja Roundup Ready por PCR anidada
(Meyer y Jaccaud, 1997). Los cebadores externos GMO9 and GMO5 son
complementarios de la secuencia de ADN correspondiente al gen CP4 EPSPS y al
promotor CaMV 35S. La amplificación del ADN con esos dos cebadores da lugar a
un amplicón de 447 pb. Los cebadores internos, GMO8 y GMO7, son
complementarios del gen epsps de la petunia y del promotor CaMV 35S. La
amplificación del ADN con esos cebadores internos da lugar a un fragmento de
169 pb, como se indica en la figura 2.
Detección del gen cryIA(b) sintético del maíz Bt-176
Las parejas de cebadores CRYIA1/CRYIA2 y CRYIA3/CRYIA4 se concibieron para
la detección específica del gen cryIA(b) sintético mediante PCR anidada (Studer et
al., 1997). Los cebadores externos, CRYIA1 y CRYIA2, y los internos, CRYIA3 y
CRYIA4, son complementarios de la secuencia de ADN del gen cryIA(b). Como se
indica en la figura 3, los dos cebadores externos (CRYIA1/CRYIA2) delimitan un
fragmento de 420 pb, mientras que el par CRYIA3/CRYIA4 produce un fragmento
de 189 pb.
Sesión nº 8
8
ID
I41419
standard; ADN; UNC; 1947 bp.
AC
I41419;
………
DE
Sequence 3 from patent US 5625136.
………
RA
Koziel M.G., Desai N.M., Lewis K.S., Kramer V.C., Warren G.W., Evola
S.V.,
RA
Crossland L.D., Wright M.S., Merlin E.J., Launis K.L., Rothstein S.J.,
RA
Bowman C.G., Dawson J.L., Dunder E.M., Pace G.M., Suttie J.L.;
RT
"Synthetic DNA sequence having enhanced insecticidal activity in
maize";
RL
Patent number US5625136-A/3, 29-APR-1997.
………
FT
source
1..1947
FT
/db_xref="taxon:12908"
FT
/organism="unclassified"
SQ
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
Sequence 1947 bp; 412 A; 729 C; 528 G; 278 T; 0 other;
atggacaaca accccaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag
gtggaggtgc tgggcggcga gcgcatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg
agcctgaccc agttcctgct gagcgagttc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg
gtggacatca tctggggcat cttcggcccc agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc
gagcagctga tcaaccagcg catcgaggag ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg
gagggcctga gcaacctgta ccaaatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac
cccaccaacc ccgccctgcg cgaggagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc
ctgaccaccg ccatccccct gttcgccgtg cagaactacc aggtgcccct gctgagcgtg
tacgtgcagg ccgccaacct gcacctgagc gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag
cgctggggct tcgacgccgc caccatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc
ggcaactaca ccgaccacgc cgtgcgctgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt
cccgacagcc gcgactggat caggtacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg
ctggacatcg tgagcctgtt ccccaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg
agccagctga cccgcgagat ttacaccaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc
cgcggcagcg cccagggcat cgagggcagc atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg
aacagcatca ccatctacac cgacgcccac cgcggcgagt actactggag cggccaccag
atcatggcca gccccgtcgg cttcagcggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc
cebador directo CRYIA1 en la PCR externa
atgggcaacg ctgcacctca gcagcgcatc gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc
1080
accctgagca gcaccctgta ccgtcgacct ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg
1140 cebador directo CRYIA3 en la PCR interna (anidada)
agcgtgctgg acggcaccga gttcgcctac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg
1200
Sesión nº 8
9
taccgcaaga gcggcaccgt ggacagcctg gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg
1260
cebador inverso CRYIA4 en la PCR interna
(anidada)
ccacctcgac agggcttcag ccaccgtctg agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc
1320
agcaacagca gcgtgagcat catccgtgca cctatgttca gctggattca ccgcagtgcc
1380
gagttcaaca acatcatccc cagcagccaa atcacccaga tccccctgac caagagcacc
1440 cebador inverso CRYIA2 en la PCR externa
aacctgggca gcggcaccag cgtggtgaag ggccccggct tcaccggcgg cgacatcctg
1500
cgccgcacca gccccggcca gatcagcacc ctgcgcgtga acatcaccgc ccccctgagc
1560
cagcgctacc gcgtccgcat ccgctacgcc agcaccacca acctgcagtt ccacaccagc
1620
atcgacggcc gccccatcaa ccagggcaac ttcagcgcca ccatgagcag cggcagcaac
1680
ctgcagagcg gcagcttccg caccgtgggc ttcaccaccc ccttcaactt cagcaacggc
1740
agcagcgtgt tcaccctgag cgcccacgtg ttcaacagcg gcaacgaggt gtacatcgac
1800
cgcatcgagt tcgtgcccgc cgaggtgacc ttcgaggccg agtacgacct ggagagggct
1860
cagaaggccg tgaacgagct gttcaccagc agcaaccaga tcggcctgaa gaccgacgtg
1920
accgactacc acatcgatca ggtgtag
Figura 3. Gen cryIA(b) optimizado insertado en maíz Bt-176: secuencia del gen
cryIA(b) SEQ ID No. 3 con arreglo a la patente estadounidense nº 5625136 y a
Genebank Accession nº 141419.
Detección específica del casete del promotor E35S / exón-intrón de hsp70 del
maíz MON810
Las parejas de cebadores GM1/GM2 y GM3/GM4 fueron diseñadas para la
detección específica del casete del promotor E35S / exón-intrón 1 de hsp70
mediante PCR anidada (Zimmermann et al., 1998). Esta construcción génica es
específica del maíz MON810. Los cebadores externos, GM1 y GM2, se hibridan con
la secuencia del promotor E35S y con la región del intrón 1 de hsp70,
respectivamente, mientras los cebadores internos son complementarios de la
secuencia de ADN del promotor E35S y de la región del exón 1 de hsp70,
respectivamente. Como se indica en la figura 4, los dos cebadores externos
(GM1/GM2) producen un fragmento de 401 pb, mientras que el par GM3/GM4
produce un fragmento de 149 pb.
Sesión nº 8
10
intrón de hsp70
exón 1 de hsp70
Plant P-E35S
DNA
intrón 1 de hsp70
exón 2 de hsp70
401 pb
GM1
149 pb
GM3
GM2
GM4
Figura 4. Representación esquemática de parte del casete de maíz MON810, que incluye
el promotor reforzado CaMV 35S y el intrón de hsp70 del maíz, y la posición relativa de los
cebadores GM1, GM2, GM3 y GM4 (modificado de Zimmermann et al., 1998).
Sesión nº 8
11
Bibliografía
Hemmer, W. (1997). Foods Derived from Genetically Modified Organisms and
Detection Methods. Biosafety Research and Assessment of Technology Impacts
of the Swiss Priority Program Biotechnology – Report 2/97, 61 pages.
http://www.bats.ch/bats/publikationen/1997-2_gmo/index.php
(Último acceso
enero de 2010)
Meyer, R., Chardonnens, F., Hubner, P. y Luthy, J. (1996). Polymerase chain
reaction (PCR) in the quality and safety assurance of food: detection of soya in
processed meat products. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und Forschung A 203, 339-344.
Meyer, R. y Jaccaud, E. (1997). Detection of genetically modified soya in processed
food products: development and validation of a PCR assay for the specific
detection of Glyphosate-Tolerant Soybeans. Proceedings of the EURO FOOD
CHEM IX Conference, Interlaken, Switzerland, Event No. 220 1, 23–28.
Studer, E., Dahinden, I., Lüthy, J. y Hübner, P. (1997). Nachweis des gentechnisch
veränderten “Maximizer"-Mais mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Mitteilungen aus dem Gebiet der Lebensmittel und Hygiene 88, 515–524.
Zimmermann, A., Liniger, M., Lüthy, J. y Pauli, U. (1998). A sensitive detection
method for genetically modified MaisGardTM corn using a nested-PCR system.
Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 31, 664-667.
Sesión nº 8
Alimentos
Sesión nº 9
Detección Cualitativa mediante PCR del Maíz
MON810, del Maíz Bt-176 y de la Soja Roundup
Ready
M. Querci, M. Maretti, M. Mazzara
2
Qualitative Detection of MON810 Maize, Bt-176 Maize and Roundup Ready Soybean by PCR
Índice
Sesión nº 9
Detección Cualitativa mediante PCR del Maíz MON810, del Maíz
Bt-176 y de la Soja Roundup Ready
Práctica
3
Introducción
3
PCR específica de plantas: gen de la lectina de soja
6
PCR específica de plantas: gen de la zeína de maíz
9
Método de cribado para detectar vegetales genéticamente modificados
12
Detección del promotor 35S
12
14
Detección específica mediante PCR anidada del maíz MON810, del maíz Bt-176 y de la
soja Roundup Ready
17
Detección del maíz MON810
17
Detección del maíz Bt-176
22
Detección de la soja Roundup Ready
26
Sesión 9
3
Práctica
Introducción
Los protocolos siguientes son métodos basados en la PCR que permiten el cribado de OGM
(mediante el promotor 35S y el terminador nos) y la detección de OGM específicos (soja
Roundup Ready, maíz MON810 y maíz Bt-176) en material bruto y transformado por
comparación con muestras correspondientes no modificadas genéticamente (soja y maíz).
Los métodos que siguen sólo permiten obtener resultados cualitativos con una indicación de
la presencia o ausencia de la secuencia diana en la muestra.
Instrumental
•
Micropipetas
•
Termociclador
•
Microcentrífuga
•
•
•
Tubos de reacción para PCR de 0,2 ml
•
Tubos para microcentrífuga de 1,5 ml
•
Sala estéril aparte con campana ultravioleta
OBSERVACIONES
Todo el instrumental debe estar libre de ADN y, cuando sea posible, esterilizarse antes de
su uso.
Para evitar la contaminación, deben usarse puntas de pipeta con barrera, protegidas contra
la formación de aerosoles.
Reactivos
•
dATP
CAS1923-31-7
•
dCTP
CAS102783-51-7
•
dGTP
CAS93919-41-6
•
dTTP
CAS18423-43-3
•
Tampones de PCR concentrados 10 veces (normalmente distribuidos por el
proveedor de ADN polimerasa Taq).
Sesión 9
4
•
MgCl2 25 mM
•
ADN polimerasa Taq
•
Oligonucleótidos de uso anterior y posterior
•
Aceite mineral (necesario si se utiliza un termociclador sin tapa caliente)
•
Agua libre de nucleasa
Solución madre de dNTP 4 mM
•
Los dNTP puede suministrarse en soluciones madre recombinadas (con dATP,
dCTP, dGTP, dTTP en la misma concentración) o separados en distintas soluciones
madre. Si se utilizan soluciones separadas, los distintos dNTP deben disolverse en
agua desionizada esterilizada para obtener una solución madre final de dNTP 4 mM.
•
Dividir en alícuotas y guardar a –20 °C. Los dNTP se mantienen estables durante
varios meses.
Solución de cebador 20 µM
Los oligonucleótidos del cebador suelen suministrarse liofilizados, por lo que debe diluirse
hasta alcanzar una concentración de 20 µM.
•
Preparar una solución de cebador 20 µM siguiendo las instrucciones del proveedor.
- 1 µM = 1 pmol/µl, por tanto 20 µM = 20 pmol/µl.
- X nmol de cebador + 10 X µl de agua esterilizada = 100 pmol/µl = 100 µM.
- Incubar 5 min a 65 °C, agitar e incubar durante otros 3 min a 65°C.
- Dilución 1:5. Preparar 1 tubo de microcentrífuga con 400 µl de agua esterilizada y
añadir 100 µl de la solución de cebador (100 µM). Concentración final: 20 µM.
•
Dividir en alícuotas pequeñas y guardar a –20 °C. Las alícuotas guardadas a –20 °C
se mantienen estables durante al 6 meses. los cebadores liofilizados se mantienen
estables a –20 ºC durante un máximo de tres años.
Tampón PCR 10x
•
El tampón para PCR 10x, con KCl 500 mM, Tris-HCI 100 mM (pH 9,0 a 25 °C) y
Tritón X-100 al 1 % suele suministrarse junto con la ADN polimerasa Taq y está listo
para su uso. El tampón debe mezclarse y centrifugarse brevemente antes de cada
uso.
•
Las alícuotas se guardan a –20 °C y se mantienen estables durante varios meses.
Sesión 9
5
Solución de MgCl2 25 mM
La solución de MgCl2 «de grado PCR» suele suministrarse junto con la ADN Taq polimerasa
y lista para su uso. La solución debe mezclarse (mezclador de torbellino) antes de cada uso
y centrifugarse brevemente (para destruir el gradiente de concentración que puede formarse
en caso de conservación prolongada). Guardar a –20 °C.
Alícuotas de agua libre de nucleasa
Se preparan alícuotas de agua desionizada, esterilizada y libre de nucleasa para la mezcla
maestra y para la dilución del ADN. En cada serie de análisis debe utilizarse una alícuota
distinta.
Sesión 9
6
PCR específica de plantas: gen de la lectina de soja
La identificación del ADN de la soja se realiza con el gen lectina como diana.
La presencia de ADN amplificable de soja en la muestra se determina mediante PCR con
los cebadores GMO3 y GMO4.
Características de los cebadores GMO3 y GMO4
Secuencia
Longitud
Peso molecular (g/mol)
Punto de fusión * (G/C)
GMO3
GCCCTCTACTCCACCCCCATCC
22
6471,6
65,1
Secuencia
Longitud
GMO4
GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG
23
6981,1
59,6
*Suponiendo que la [Na+] sea de 50 mM.
Controles
Es importante realizar ensayos de control con cada análisis por PCR. Los controles
negativos están diseñados para comprobar si los reactivos de la PCR están contaminados
con ADN. Los controles positivos con muestras caracterizadas también son críticos para
determinar la eficacia y la especificidad de la PCR.
Al realizar análisis con PCR deben incluirse los siguientes controles:
•
Control positivo: ADN puro, aislado de la soja convencional
•
Control negativo: ADN puro, aislado de otras especies y libre del gen lectina
•
Control sin plantilla: control negativo de la mezcla maestra, utilizando agua en
vez de ADN.
Preparación de la mezcla maestra
Los reactivos necesarios para una serie de 10 muestras (con controles positivos, negativos
y sin plantilla) se mezclan siguiendo las instrucciones indicadas en el cuadro 1.
Sesión 9
7
El procedimiento se aplica a una muestra con 48 µl de mezcla maestra de GMO3 y GMO4 y
2 µl de solución de ADN. Durante la preparación de la mezcla maestra todas las soluciones
se guardan en hielo.
Cuadro 1. Mezcla maestra GMO3-GMO4
Concentración
final
Mezcla maestra
para una muestra
Mezcla maestra para
10 muestras
1x
2,5 mM
0,2 mM
0,5 µM
0,5 µM
0,025 U/µl
32,75 µl
5 µl
5 µl
2,5 µl
1,25 µl
1,25 µl
0,25 µl
327,5 µl
50 µl
50 µl
25 µl
12,5 µl
12,5 µl
2,5 µl
48 µl
480 µl
Agua desionizada esterilizada
Tampón para PCR 10x
MgCl2 25 mM
dNTP 4 mM
Oligonucleótido GMO3 20 µM
ADN polimerasa Taq
TOTAL
•
Preparar un tubo para microcentrífuga de 1,5 ml
•
Añadir los reactivos siguiendo el orden indicado en el cuadro 1
•
Agitar suavemente la mezcla maestra de GMO3 y GMO4 por pipeteado y centrifugar
brevemente
•
Dividir la mezcla maestra en alícuotas de 48 µl en tubos de reacción de PCR de 0,2 ml
•
Añadir 2 µl de la solución de ADN a dichas alícuotas
•
Agitar suavemente y centrifugar brevemente
•
Colocar los tubos de reacción de PCR en el termociclador
Programa PCR* (GMO3/GMO4)
Temperatura
95 ˚C
Tiempo
3 min
Desnaturalización
Anillamiento
Extensión
Número de ciclos
95 ˚C
63 ˚C
72 ˚C
40
30 s
30 s
30 s
Extensión final
72 ˚C
4 ˚C
3 min
∞
Desnaturalización inicial
Sesión 9
8
Tras la amplificación, las muestras se centrifugan brevemente y se colocan en hielo.
* Nota: En el curso se utilizarán termocicladores Perkin Elmer Gene Amp PCR system
9600, ABI 9700. La utilización de modelos o marcas de termocicladores distintos
producirá los mismos resultados siempre que se los programas de PCR se adapten y
comprueben en consecuencia1.
Análisis de los productos de la PCR
Tras la amplificación de la secuencia diana, se analizan los productos de la PCR mediante
electroforesis en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio. Se mezclan 8 µl de una
reacción de PCR con 2 µl de tampón de carga, tras lo cual se cargan las muestras en el gel
de agarosa (1,5 %). Se realiza una migración a 100 V durante 1 hora. Se someten a
electroforesis marcadores de tamaño (15 µl de una escalera de 100 pb) en pocillos
adyacentes del gel, de forma que pueda determinarse con precisión el tamaño de los
amplicones. Completado el ciclo, el ADN del gel puede visualizarse mediante
transiluminación ultravioleta. Para llevar un registro fiel del resultado del ensayo, puede
fotografiarse el gel.
Interpretación de los resultados
El sistema se comprueba utilizando la pareja de cebadores GMO3-GMO4 para detectar el
gen de la lectina sin modificar; la calidad de amplificación del ADN extraído se ve
confirmada por una banda de 118 pb, específica del gen lectina.
El control positivo amplificará una banda de 118 pb. Los controles negativo y sin plantilla no
deben arrojar una banda visible.
Si los controles positivo o negativo no dan los resultados esperados, el análisis por PCR de
las muestras seleccionadas no es válido.
Si los controles arrojan los resultados esperados y la muestra no presenta una banda a
118 pb, significa que la muestra no contiene ADN de soja amplificable. Conviene observar
que éste (como otros protocolos de esta sesión) es un método cualitativo que sólo permite
obtener un resultado cualitativo (disyuntiva sí-no).
1
El CCI y la OMS no promocionan ningún instrumento utilizado en los cursos de formación
o mencionado en el presente manual. Los análisis realizados en nuestros laboratorios
deberían reproducirse fácilmente utilizando otros instrumentos, siempre que se tengan en
cuenta las características divergentes del sistema usado.
Sesión 9
9
PCR específica de plantas: gen de la zeína de maíz
La identificación del ADN del maíz se realiza con el gen zeína como diana.
La presencia en la muestra de ADN adecuadamente amplificable de maíz se determina
mediante PCR con los cebadores ZEIN3 y ZEIN4.
Características de los cebadores ZEIN3 y ZEIN4
Secuencia
Longitud
ZEIN3
AGTGCGACCCATATTCCAG
19
5772,3
55,2
Secuencia
Longitud
ZEIN4
GACATTGTGGCATCATCATTT
21
6410,9
51,7
Controles
•
Control positivo: ADN puro, aislado del maíz convencional
•
Control negativo: ADN puro, aislado de otras especies y libre del gen zeína
•
vez de ADN.
El procedimiento se aplica a una muestra con 48 µl de mezcla maestra de ZEIN3 y ZEIN4 y
Sesión 9
10
Cuadro 2. Mezcla maestra ZEIN3-ZEIN4
Concentración Mezcla Mezcla maestra
final
maestra
para 10
para una
muestras
muestra
Tampón de PCR 10x
MgCl2 25 mM
dNTP 4 mM
Oligonucleótido ZEIN3 20 µM
Oligonucleótido ZEIN4 20 µM
ADN polimerasa Taq
1x
2,5 mM
0,2 mM
0,5 µM
0,5 µM
0,025 U/µl
TOTAL
32,75 µl
5 µl
5 µl
2,5 µl
1,25 µl
1,25 µl
0,25 µl
327,5 µl
50 µl
50 µl
25 µl
12,5 µl
12,5 µl
2,5 µl
48 µl
480 µl
•
•
•
Agitar suavemente la mezcla maestra de ZEIN3 y ZEIN4 por pipeteado y centrifugar
brevemente
•
•
•
•
Colocar los tubos de reacción de PCR en el termociclador.
Programa PCR (ZEIN3/ZEIN4)
Temperatura
95 ˚C
Tiempo
3 min
Desnaturalización
Anillamiento/Extensión
Número de ciclos
96 ˚C
60 ˚C
40
1 min
1 min
Extensión final
72 ˚C
4 ˚C
3 min
∞
Sesión 9
11
Tras la amplificación del ADN, se analizan los productos de la PCR mediante electroforesis
en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio. Se mezclan 8 µl de la solución con
2 µl de tampón de carga, tras lo cual se carga la mezcla en el gel de agarosa (1,5 %). Se
realiza una migración a 100 V durante 1 hora. Se someten a electroforesis marcadores de
tamaño (15 µl de una escalera de 100 pb) en pocillos adyacentes del gel, de forma que
pueda determinarse con precisión el tamaño de los amplicones. Completado el ciclo, el ADN
del gel puede visualizarse mediante transiluminación ultravioleta. Para llevar un registro fiel
del resultado del ensayo, puede fotografiarse el gel.
La calidad de amplificación del ADN extraído se comprueba utilizando la pareja de
cebadores ZEIN3-ZEIN4 para detectar el gen de la zeína del maíz sin modificar. Si el ADN
extraído tiene suficiente calidad de amplificación, se observará en el gel una banda
específica del gen de la zeína de 277 pb.
El control positivo debería también amplificar una banda de 277 pb.
Los controles negativo y sin ADN molde no deben arrojar una banda visible.
Si los controles arrojan los resultados esperados y la muestra no presenta una banda a
277 pb, significa que la muestra no contiene ADN de maíz amplificable.
Sesión 9
12
Método
de
cribado
para
detectar
vegetales
genéticamente
modificados
Los genes están sometidos a la regulación de promotores y terminadores. Las secuencias
más utilizadas para la regulación de un transgén son el promotor 35S (derivado del virus del
mosaico de la coliflor) y el terminador nos (derivado de Agrobacterium tumefaciens). La
detección de una de estas secuencias reguladoras en una muestra con soja o maíz indica la
presencia de OGM. En la soja Roundup Ready, pueden detectarse tanto el promotor 35S
como el terminador nos, mientras que en las líneas de maíz Bt-176 y MON810 sólo se da la
presencia del promotor 35S.
Detección del promotor 35S
Características de los cebadores p35S-cf3 y p35S-cr4
Secuencia
Longitud
p35S-cf3
CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG
21
6414.5
57,4
Secuencia
Longitud
p35S-cr4
TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC
25
7544,2
56,3
Controles
•
Control positivo: ADN del material de referencia (maíz del que un 0,5 % es GM)
•
Control negativo: ADN del material de referencia (maíz del que un 0 % es GM)
•
Control sin ADN molde: control negativo de la mezcla maestra, utilizando agua
en vez de ADN.
Sesión 9
13
El procedimiento se aplica a una muestra con 48 µl de mezcla maestra de p35S-cf3 y p35Scr4 y 2 µl de solución de ADN. Durante la preparación de la mezcla maestra todas las
soluciones se guardan en hielo.
Cuadro 3: Mezcla maestra de p35S-cf3 y p35S-cr4
Concentración Mezcla maestra Mezcla maestra
final
para una
para 10 muestras
muestra
MgCl2 25 mM
dNTP 4 mM
Oligonucleótido p35S-cf3 20 µM
Oligonucleótido p35S-cr4 20 µM
ADN polimerasa Taq
1x
2,5 mM
0,2 mM
0,5 µM
0,5 µM
0,025 U/µl
TOTAL
32,75 µl
5 µl
5 µl
2,5 µl
1,25 µl
1,25 µl
0,25 µl
327,5 µl
50 µl
50 µl
25 µl
12,5 µl
12,5 µl
2,5 µl
48 µl
480 µl
•
•
•
Agitar suavemente la mezcla maestra de p35S-cf3 y p35S-cr4 por pipeteado y
centrifugar brevemente
•
•
•
•
Programa PCR (p35S-cf3 y p35S-cr4)
Temperatura Tiempo
95 ˚C
3 min
Desnaturalización
Anillamiento
Extensión
Número de ciclos
95 ˚C
62 ˚C
72 ˚C
50
25 s
30 s
45 s
Extensión final
72 ˚C
4 ˚C
7 min
∞
Sesión 9
14
Tras la amplificación, se analizan los productos de la PCR mediante electroforesis en gel de
agarosa en presencia de bromuro de etidio. Se mezclan 8 µl de la solución con 2 µl de
tampón de carga, tras lo cual se carga la solución en el gel de agarosa (2,5 %). Se realiza
una migración a 100 V durante 1 hora. Se someten a electroforesis marcadores de tamaño
(15 µl de una escalera de 100 pb) en pocillos adyacentes del gel, de forma que pueda
determinarse con precisión el tamaño de los amplicones. Completado el ciclo, el ADN del
gel puede visualizarse mediante transiluminación ultravioleta. Para llevar un registro fiel del
resultado del ensayo, puede fotografiarse el gel.
Para la detección del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor se utiliza el par de
cebadores p35S-cf3/p35S-cr4, que rinde un fragmento de 123 pb. Este promotor regula la
expresión de los genes de numerosas plantas transgénicas, como la soja Roundup Ready y
la línea de maíz Bt-176. El control positivo amplificará una banda de 123 pb. Los controles
negativo y sin plantilla no deben arrojar una banda visible. Si los controles positivo o
negativo no dan los resultados esperados, el análisis por PCR de las muestras
seleccionadas no es válido.
Si los controles arrojan los resultados esperados y la muestra presenta una banda de
123 pb, significa que la muestra contiene ADN modificado.
Características de los cebadores HA-nos 118-f y HA-nos 118-r
Secuencia
Longitud
HA-nos 118-f
GCATGACGTTATTTATGAGATGGG
24
7462,8
56,2
Secuencia
Longitud
HA-nos 118-r
GACACCGCGCGCGATAATTTATCC
24
7296,9
61,2
Sesión 9
15
Controles
•
Control positivo: ADN del material de referencia (soja de la que un 0,5 % es GM
[soja Roundup Ready])
•
Control negativo: ADN del material de referencia (soja de la que un 0 % es GM)
•
en vez de ADN.
El procedimiento se aplica a una muestra con 48 µl de mezcla maestra de HA-nos118-f y
HA-nos118-r y 2 µl de solución de ADN. Durante la preparación de la mezcla maestra todas
las soluciones se guardan en hielo.
Cuadro 4. Mezcla maestra de HA-nos118-f y HA-nos118-r
Concentración
final
MgCl2 25 mM
dNTP 4 mM
Oligonucleótido HA-nos118-f 20 µM
Oligonucleótido HA-nos118-r 20 µM
ADN polimerasa Taq
1x
2,5 mM
0,2 mM
0,5 µM
0,5 µM
0,025 U/µl
TOTAL
Mezcla Mezcla maestra
maestra
para 10
para una
muestras
muestra
32,75 µl
5 µl
5 µl
2,5 µl
1,25 µl
1,25 µl
0,25 µl
327,5 µl
50 µl
50 µl
25 µl
12,5 µl
12,5 µl
2,5 µl
48 µl
480 µl
•
•
•
Agitar suavemente la mezcla maestra de HA-nos118-f y HA-nos118-r por pipeteado y
centrifugar brevemente
•
•
•
Sesión 9
16
•
Programa PCR (HA-nos118-f/HA-nos118-r)
Temperatura
95 ˚C
Tiempo
3 min
Desnaturalización
Anillamiento
Extensión
Número de ciclos
95 ˚C
62 ˚C
72 ˚C
50
25 s
30 s
45 s
Extensión final
72 ˚C
4 ˚C
7 min
∞
Desnaturalización
inicial
Para la detección del terminador nos se utiliza el par de cebadores HA-nos118-f/HAnos118-r, que rinde un fragmento de 118 pb. El terminador nos está presente en la soja
Roundup Ready y en otras líneas de plantas transgénicas (p. ej., la línea de maíz Bt-11).
El control positivo amplificará una banda de 118 pb. Los controles negativo y sin plantilla no
deben arrojar una banda visible. Si los controles positivo o negativo no dan los resultados
esperados, el análisis por PCR de las muestras seleccionadas no es válido.
118 pb, significa que la muestra contiene ADN modificado.
Sesión 9
17
Detección específica mediante PCR anidada del maíz MON810, del
maíz Bt-176 y de la soja Roundup Ready
Detección del maíz MON810
El sistema de detección es específico del maíz MON810. Los elementos diana son el
promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor y la región de hsp70 exón1-intrón1, que
son respectivamente una secuencia reguladora constitutiva y un gen de una proteína de
choque térmico que produce un mayor nivel de transcripción.
Características de los cebadores GM1, GM2, GM3 y GM4
Secuencia
Longitud
GM1
TATCTCCACTGACGTAAGGGATGAC
25
7665,1
59,6
Secuencia
Longitud
GM2
TGCCCTATAACACCAACATGTGCTT
25
7560.2
57.9
Secuencia
Longitud
GM3
ACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTC
25
7472,2
61,2
Secuencia
Longitud
GM4
GCATTCAGAGAAACGTGGCAGTAAC
25
7722,9
59,6
Sesión 9
18
Controles
•
Control positivo: ADN del material de referencia (maíz del que un 0,1 % es GM
[MON810])
•
•
en vez de ADN.
Preparación de la mezcla maestra 1
El procedimiento se aplica a una muestra con 48 µl de mezcla maestra de GM1 y GM2 y 2
µl de solución de ADN. Durante la preparación de la mezcla maestra todas las soluciones
Cuadro 5. Mezcla maestra GM1-GM2
Concentración
final
MgCl2 25 mM
dNTP 4 mM
Oligonucleótido mg1 20 µM
ADN polimerasa Taq
1x
2,5 mM
0,2 mM
0.5 µM
0,5 µM
0,025 U/µl
TOTAL
Mezcla
maestra
para una
muestra
Mezcla maestra
para 10
muestras
32,75 µl
5 µl
5 µl
2,5 µl
1.25 µl
1,25 µl
0,25 µl
327,5 µl
50 µl
50 µl
25 µl
12.5 µl
12,5 µl
2,5 µl
48 µl
480 µl
•
•
•
Agitar suavemente la mezcla maestra de GM1 y GM2 por pipeteado y centrifugar
brevemente
•
•
•
Sesión 9
19
•
Programa PCR (mg1/mg2)
Temperatura
95 ˚C
Tiempo
3 min
Desnaturalización
Anillamiento
Extensión
Número de ciclos
95 ˚C
60 ˚C
72 ˚C
35
45 s
50 s
50 s
Extensión final
72 ˚C
4 ˚C
3 min
∞
Desnaturalización
inicial
Los reactivos necesarios para una serie de 10 muestras se mezclan siguiendo las
instrucciones indicadas en el cuadro 6. El procedimiento se aplica a una muestra con 49 µl
de mezcla maestra de GM3 y GM4 y 1 µl de solución de ADN preamplificado de la primera
PCR. Durante la preparación de la mezcla maestra todas las soluciones se guardan en
hielo.
Cuadro 6. Mezcla maestra GM3-GM4
Concentración
final
MgCl2 25 mM
dNTP 4 mM
ADN polimerasa Taq
TOTAL
1x
2,5 mM
0,2 mM
0,5 µM
0,5 µM
0,025 U/µl
Mezcla
maestra
para una
muestra
Mezcla
maestra
para 10
muestras
33,75 µl
5 µl
5 µl
2,5 µl
1,25 µl
1,25 µl
0,25 µl
337,5 µl
50 µl
50 µl
25 µl
12,5 µl
12,5 µl
2,5 µl
49 µl
490 µl
Sesión 9
20
•
•
•
Agitar suavemente la mezcla maestra de GM3 y GM4 por pipeteado y centrifugar
brevemente
•
•
•
•
Programa de la PCR anidada (mg3-mg4)
Temperatura
95 ˚C
Tiempo
3 min
Desnaturalización
Anillamiento
Extensión
Número de ciclos
95 ˚C
60 ˚C
72 ˚C
40
45 s
50 s
50 s
Extensión final
72 ˚C
4 ˚C
3 min
∞
Desnaturalización
inicial
una migración a 100 V durante 1 hora. Se emplean marcadores de tamaño (15 µl de una
escalera de 100 pb) en pocillos adyacentes del gel, de forma que pueda determinarse con
precisión el tamaño de los amplicones. Completado el ciclo, el ADN del gel puede
visualizarse mediante transiluminación ultravioleta. Para llevar un registro fiel del resultado
del ensayo, puede fotografiarse el gel.
Sesión 9
21
Las parejas de cebadores mg1-mg2 y mg3-mg4 se diseñaron para la detección específica
de la transformación MON810 mediante PCR anidada, que rinde un fragmento final de PCR
anidada de 149 pb. La especificidad viene dada por el hecho de que los cebadores están
diseñados en la región que comprende el promotor E-35S y el gen exón/intrón de hsp70. El
control positivo amplificará una banda de 189 pb. Los controles negativo y sin plantilla no
deben arrojar una banda visible.
149 pb, significa que la muestra contiene ADN de maíz MON810.
Sesión 9
22
Detección del maíz Bt-176
El gen diana es el gen cryIA(b), que protege la planta de insectos como el piral del maíz.
Características de los cebadores CRYIA1, CRYIA2, CRYIA3 y CRYIA4
Secuencia
Longitud
CRYIA1
CGGCCCCGAGTTCACCTT
18
5394,6
59,5
Secuencia
Longitud
CRYIA2
CTGCTGGGGATGATGTTGTTG
21
6519,2
57,6
Secuencia
Longitud
CRYIA3
CCGCACCCTGAGCAGCAC
18
5397,6
61,7
Secuencia
Longitud
CRYIA4
GGTGGCACGTTGTTGTTCTGA
21
6479,2
57,6
Controles
•
Control positivo: ADN del material de referencia (maíz del que un 0,1% es GM
[Bt-176])
•
•
en vez de ADN.
y sin plantilla) se mezclan siguiendo las instrucciones indicadas en el cuadro 7. El
Sesión 9
23
procedimiento se aplica a una muestra con 48 µl de mezcla maestra de CRYIA1 y CRYIA2 y
Cuadro 7. Mezcla maestra CRYIA1-CRYIA2
Concentración Mezcla maestra
Mezcla maestra
final
para una muestra para 10 muestras
MgCl2 25 mM
dNTP 4 mM
Oligonucleótido CRYIA1 20 µM
ADN polimerasa Taq
1x
2,5 mM
0,2 mM
0,5 µM
0,5 µM
0,025 U/µl
TOTAL
32,75 µl
5 µl
5 µl
2,5 µl
1,25 µl
1,25 µl
0,25 µl
327,5 µl
50 µl
50 µl
25 µl
12,5 µl
12,5 µl
2,5 µl
48 µl
480 µl
•
•
•
Agitar suavemente la mezcla maestra de CRYIA1 y CRYIA2 por pipeteado y centrifugar
brevemente
•
•
•
•
Programa PCR (CRYIA1-CRYIA2)
Temperatura
95 ˚C
Tiempo
3 min
Desnaturalización
Anillamiento
Extensión
Número de ciclos
95 ˚C
60 ˚C
72 ˚C
25
40 s
40 s
40 s
Extensión final
72 ˚C
4 ˚C
3 min
∞
Sesión 9
24
instrucciones indicadas en el cuadro 8.
El procedimiento se aplica a una muestra con 49 µl de mezcla maestra de CRYIA3 y
CRYIA4 y 1 µl de solución de ADN preamplificado de la primera PCR. Durante la
preparación de la mezcla maestra todas las soluciones se guardan en hielo.
Cuadro 8. Mezcla maestra CRYIA3-CRYIA4
Concentración
final
MgCl2 25 mM
dNTP 4 mM
ADN polimerasa Taq
1x
2,5 mM
0,2 mM
0,5 µM
0,5 µM
0,025 U/µl
Mezcla
maestra
para una
muestra
Mezcla
maestra
para 10
muestras
33,75 µl
5 µl
5 µl
2,5 µl
1,25 µl
1,25 µl
0,25 µl
337,5 µl
50 µl
50 µl
25 µl
12,5 µl
12,5 µl
2,5 µl
49 µl
490 µl
TOTAL
•
•
•
Agitar suavemente la mezcla maestra de CRYIA3 y CRYIA4 por pipeteado y centrifugar
brevemente
•
•
•
•
Sesión 9
25
Programa de la PCR anidada (CRYIA3/CRYIA4)
Temperatura
95 ˚C
Tiempo
3 min
Desnaturalización
Anillamiento
Extensión
Número de ciclos
95 ˚C
60 ˚C
72 ˚C
35
40 s
40 s
40 s
Extensión final
72 ˚C
4 ˚C
3 min
∞
Las parejas de cebadores CRYIA1-CRYIA2 y CRYIA3-CRYIA4 se diseñaron para la
detección específica del gen sintético cryIA(b) mediante PCR anidada, que rinde un
fragmento final de PCR anidada de 149 pb. Este gen está presente en la línea del maíz Bt176 y en otras líneas (p. ej., la línea del maíz Bt-11).
El control positivo amplificará una banda de 189 pb.
Los controles negativo y sin plantilla no deben arrojar una banda visible.
189 pb, significa que la muestra contiene ADN de maíz Bt-176.
Sesión 9
26
Detección de la soja Roundup Ready
La diana es el gen CP4 EPSPS, que confiere resistencia al herbicida Roundup.
Características de los cebadores GMO5, GMO9, GMO7 y GMO8
Secuencia
Longitud (pb)
GM05
CCACTGACGTAAGGGATGACG
21
6479,4
59,5
Secuencia
Longitud (pb)
GM09
CATGAAGGACCGGTGGGAGAT
21
6559,4
59,5
Secuencia
Longitud (pb)
GMO7
ATCCCACTATCCTTCGCAAGA
21
6309,6
55,8
Secuencia
Longitud (pb)
GM08
TGGGGTTTATGGAAATTGGAA
21
6579,8
51,7
Controles
•
Control positivo: ADN del material de referencia (soja de la que un 0,1% es GM
[soja Roundup Ready])
•
Control negativo: ADN del material de referencia (soja de la que un 0 % es GM)
•
vez de ADN.
Sesión 9
27
Concentración Mezcla maestra Mezcla maestra
final
para una muestra para 10 muestras
MgCl2 25 mM
dNTP 4 mM
ADN polimerasa Taq
1x
2,5 mM
0,2 mM
0,5 µM
0,5 µM
0,025 U/µl
TOTAL
32,75 µl
5 µl
5 µl
2,5 µl
1,25 µl
1,25 µl
0,25 µl
327,5 µl
50 µl
50 µl
25 µl
12,5 µl
12,5 µl
2,5 µl
48 µl
480 µl
•
•
•
brevemente
•
•
•
•
Sesión 9
28
Programa PCR (GMO5-GMO9)
Temperatura
95 ˚C
Tiempo
3 min
Desnaturalización
Anillamiento
Extensión
Número de ciclos
95 ˚C
60 ˚C
72 ˚C
25
30 s
30 s
40 s
Extensión final
72 ˚C
4 ˚C
3 min
∞
Desnaturalización
inicial
instrucciones indicadas en el cuadro 10.
1 µl de solución de ADN preamplificado de la primera PCR. Durante la preparación de la
mezcla maestra todas las soluciones se guardan en hielo.
Concentración
final
MgCl2 25 mM
dNTP 4 mM
ADN polimerasa Taq
1x
2,5 mM
0,2 mM
0,5 µM
0,5 µM
0,025 U/µl
TOTAL
•
Mezcla
maestra
para una
muestra
Mezcla
maestra
para 10
muestras
33,75 µl
5 µl
5 µl
2,5 µl
1,25 µl
1,25 µl
0,25 µl
337,5 µl
50 µl
50 µl
25 µl
12,5 µl
12,5 µl
2,5 µl
49 µl
490 µl
Preparar un tubo para microcentrifuga de 1,5 ml
Sesión 9
29
•
•
brevemente
•
•
•
•
Programa de la PCR anidada (GMO7-GMO8)
Temperatura
95 ˚C
Tiempo
3 min
Desnaturalización
Anillamiento
Extensión
Número de ciclos
95 ˚C
60 ˚C
72 ˚C
35
30 s
30 s
40 s
Extensión final
72 ˚C
4 ˚C
3 min
∞
Desnaturalización
inicial
Las parejas de cebadores GMO5-GMO9 y GMO7-GMO8 se diseñaron para la detección
específica de la construcción genética de la soja Roundup Ready mediante PCR anidada,
Sesión 9
30
que rinde un fragmento de PCR anidada de 169 pb. Los cebadores GMO5 y GMO7 son
complementarios del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor; el GM09 se hibrida
con el gen CP4 EPSPS de Agrobacterium sp., cepa CP4, y el GMO8 con el gen CTP
EPSPS.
El control positivo amplificará una banda de 169 pb.
Los controles negativo y sin plantilla no deben arrojar una banda visible. Si los controles
positivo o negativo no dan los resultados esperados, el análisis por PCR de las muestras
seleccionadas no es válido.
169 pb, significa que la muestra contiene ADN de la soja Roundup Ready.
Sesión 9
Alimentos
Sesión nº 10
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM
F. Weighardt
2
Índice
Sesión nº 10
Introducción
3
Métodos de cuantificación basados en la PCR
4
Historia de las técnicas de PCR en tiempo real
7
Principios de la PCR en tiempo real
7
Principios de cuantificación con la PCR en tiempo real
13
Bibliografía
20
Sesión nº 10
3
Introducción
Una vez comprobado que un producto alimenticio ha dado positivo en relación con
una o más modificaciones genéticas (soja Roundup Ready, maíz Bt-176, maíz Bt-11,
maíz MON810 y maíz T25), los pasos analíticos posteriores consisten en determinar
si se cumple la legislación vigente (Reglamento (CE) nº 1829/2003 y Reglamento
(CE) nº 1830/2003) midiendo la cantidad de cada OGM presente en cada ingrediente
(figura 1).
Los Reglamentos mencionados disponen que todos los productos que contengan
OGM, consistan en OGM o estén producidos a partir de OGM deben ir etiquetados
como tales.
No es exigible el etiquetado de los productos que incluyan materiales que contengan
OGM, consistan en OGM o estén producidos a partir de OGM en proporción no
superior al 0,9% de los ingredientes alimenticios individualmente considerados,
siempre que esta presencia sea accidental o técnicamente inevitable.
Todos los ingredientes (harina, sémola, aceite, etc.) derivados de una misma
especie (p. ej., maíz, soja, colza, etc.) se consideran colectivamente un solo
ingrediente (p. ej., maíz).
Maíz GM
0,6%
Soja no GM
99,4%
Maíz no GM
99,4%
Soja GM
0,6%
Figura 1. No se exige etiquetado. La cantidad tanto de soja GM como de maíz GM
está por debajo del umbral legal.
Si, por ejemplo, un ingrediente derivado exclusivamente del maíz contiene menos de
un 0,9 % de maíz GM, no es necesario etiquetar el alimento obtenido a partir de él.
Por el contrario, si contiene más de un 0,9 % de maíz GM, es obligado etiquetar los
Sesión nº 10
4
productos alimenticios derivados. Esto es así incluso si en el producto final,
considerando la suma de todos los ingredientes derivados de especies distintas (p.
ej., soja y maíz), la cantidad relativa de maíz GM desciende por debajo del 0,9 %. Si
están presentes dos o más variedades distintas de maíz GM, habrá que sumar sus
concentraciones y utilizar el porcentaje total para determinar si es necesario o no
etiquetar (figura 2). Si la suma resultante está por debajo del umbral del 0,9 %, no
será obligado etiquetar.
Maíz Bt 176
0,6%
Soja no GM
100%
Maíz no GM
98,8%
Maíz Bt 11
0,6%
Figura 2. Es necesario etiquetar en razón del ingrediente maíz. La suma de las
modificaciones Bt-11 (0,6 %) y Bt-176 (0,6 %) rebasa el umbral del 0,9 % exigido
para el etiquetado.
El contenido relativo de OGM (porcentaje) se determina normalizando la cantidad de
secuencias específicas del OGM con respecto a la cantidad de un gen específico de
la planta (p. ej., el de la lectina en el caso de la soja y los de la invertasa o la zeína
en el del maíz). El porcentaje de OGM resultante se expresa, por lo tanto, así: OGM
(%)= ADN-GM/ADN-referencia x 100.
Métodos de cuantificación basados en la PCR
Un grave inconveniente de la PCR convencional es la ausencia de información
cuantitativa exacta debido a la eficiencia de la amplificación. Si la eficiencia de la
Sesión nº 10
5
reacción permaneciera constante para cada ciclo de amplificación, la concentración
de ADN posterior a la PCR sería directamente proporcional a la cantidad de ADN
diana inicial. Lamentablemente, la eficiencia de la amplificación varía de una
reacción a otra, así como en ciclos sucesivos de una misma reacción. En particular,
en los últimos ciclos de la PCR los productos de la amplificación se forman de
manera no exponencial y a una velocidad de reacción desconocida.
La cuantificación del ADN basada en la PCR convencional se apoya en la medición
en el punto final, a fin de conseguir la sensibilidad máxima, cuando la amplificación
alcanza el rendimiento máximo (la denominada «fase meseta»). En esta etapa la
reacción ha superado la fase exponencial, a causa fundamentalmente del
agotamiento de los reactivos y de la inactivación térmica gradual de la polimerasa
utilizada. Por ello, la correlación resultante entre la concentración del producto final y
el número de moléculas diana iniciales es limitada.
Para superar este problema se han desarrollado técnicas como la PCR competitiva
cuantitativa (PCR-CC) y la PCR en tiempo real, que se proponen establecer una
relación entre la concentración de ADN diana y la cantidad de producto de la PCR
generada por la amplificación.
PCR competitiva cuantitativa
Uno de los primeros métodos de PCR cuantitativa desarrollados es la PCR
competitiva cuantitativa (Giacca et al., 1994; Studer et al., 1998; Hardegger et al.,
1999). Este método se basa en la coamplificación de la plantilla de ADN diana y
cantidades definidas de un patrón de ADN interno (competidor) que portan los
mismos sitios de unión del cebador. Dado que se conoce la cantidad de competidor
inicial y que la eficiencia de la amplificación es la misma en los ADN competidor y
diana, la proporción de las cantidades de los dos productos de la PCR, determinada
por ejemplo mediante electroforesis en gel, es representativa de la proporción de los
ADN diana y competidor presentes en la mezcla de reacción antes de la
amplificación.
Normalmente un competidor es un plásmido linearizado que lleva la misma
secuencia de nucleótidos que el ADN diana, salvo una supresión o inserción que
permite, una vez coamplificado, obtener dos bandas de distinto tamaño tras una
electroforesis de geles estándar.
Sesión nº 10
6
ADN amplificado de la diana
ADN amplificado del competidor
Figura 3. Coamplificación de una cantidad fija de ADN diana con distintas
cantidades de ADN competidor.
La PCR competitiva se ha utilizado con éxito para cuantificar tanto el ADN como en
ARN, pero su intervalo dinámico se limita a una proporción diana/competidor
comprendida entre aproximadamente 1:10 y 10:1. De hecho, la máxima exactitud se
obtiene
encontrando el
punto de
equivalencia
en el
que
la proporción
diana/competidor es 1:1 (figura 3). Para conseguir una proporción adecuada, habrá
que ensayar varias diluciones.
Otro inconveniente de este método es la necesidad de construir y caracterizar un
competidor diferente para cada diana que se vaya a cuantificar. En realidad, incluso
diferencias pequeñas en la eficiencia de la amplificación pueden comprometer
gravemente la exactitud de la cuantificación mediante la PCR competitiva
cuantitativa. Por último, al final de la reacción, la PCR competitiva exige una
cuantificación adecuada de los amplicones de la diana y del competidor, lo que suele
exigir un laborioso tratamiento ulterior.
La PCR competitiva es un método semicuantitativo que comporta la comparación de
un patrón (el competidor) con la muestra. Los resultados solo pueden indicar un
valor inferior, igual o superior a una concentración patrón definida.
No obstante, el sistema de la PCR competitiva tiene la ventaja de que los
laboratorios no necesitan adquirir equipos especializados, ya que puede aplicarse
con el instrumental habitual de un laboratorio de biología molecular y PCR.
PCR en tiempo real
La PCR en tiempo real representa una metodología de la PCR más exacta y más
utilizada actualmente. Al contrario que en el caso de las determinaciones en el punto
final, los sistemas de PCR en tiempo real monitorizan la reacción a medida que tiene
lugar. En este tipo de sistema, la PCR se acopla a la emisión de una señal
fluorescente proporcional a la cantidad de producto de la PCR producido en ciclos
posteriores. Esta señal se intensifica proporcionalmente a la cantidad de producto de
Sesión nº 10
7
la PCR generado en cada ciclo de reacción sucesivo. Registrando la cantidad de
emisión fluorescente en cada ciclo, es posible monitorizar la PCR durante su fase
exponencial. El primer incremento significativo de la fluorescencia se correlaciona
con la cantidad inicial de plantilla diana (Ahmed, 2002).
Historia de las técnicas de PCR en tiempo real
Higuchi et al. (1992,1993) fueron los pioneros del análisis de la cinética de la PCR al
diseñar un sistema capaz de detectar los productos de la PCR a medida que se
acumulan. Este sistema «de tiempo real» incluía la molécula intercalante de bromuro
de etidio en cada mezcla de reacción. Para llevar a cabo las rondas se utilizaba un
termociclador adaptado para irradiar las muestras con luz ultravioleta y capaz de
detectar la fluorescencia resultante con una cámara CCD (dispositivo de
acoplamiento de cargas) controlada por ordenador y refrigerada. A medida que
´tenía lugar la amplificación, se producían cantidades crecientes de ADN bicatenario,
con bromuro de etidio intercalado, que inducían un aumento de la fluorescencia. Al
representar gráficamente la emisión de luz fluorescente frente al número de ciclo, el
sistema producía gráficos de la amplificación que daban una imagen más completa
del proceso de la PCR que el estudio de la acumulación del producto tras un número
de ciclos fijo.
Principios de la PCR en tiempo real
La especificidad del método de la PCR en tiempo real depende de las sustancias
utilizadas para generar y monitorizar la reacción de amplificación y del instrumento
utilizado para monitorizar la señal. Se han desarrollado varias sustancias al efecto:
colorantes de intercalación (bromuro de etidio, SYBR Green I) y sondas de
hibridación (sondas TaqMan, sondas FRET, balizas moleculares, Scorpions y
sondas TaqMan Minor Groove Binder).
PCR en tiempo real con uso del colorante SYBR Green I
La primera aplicación de la PCR en tiempo real derivó directamente de los
experimentos de Higuchi et al. (1992, 1993), sin más que sustituir el bromuro de
etidio por un agente intercalante del ADN bicatenario, fluorescente, menos tóxico y
más específico y sensible (entre 10 y 25 veces), el SYBR Green I (Haugland, 2002).
El colorante SYBR Green I se une al surco menor del ADN bicatenario, pero no al
ADN monocatenario. A consecuencia de esta unión, se potencia enormemente
Sesión nº 10
8
(entre 800 y 1 000 veces) la fluorescencia (excitación aprox. a 488 nm y 254 nm;
emisión aprox. a 560 nm). Al iniciarse la PCR, el aumento de la cantidad de ADN
recién sintetizado produce un incremento de la señal fluorescente (Figura 4). No
obstante, el sistema de detección de secuencias basado en el SYBR Green I
presenta una limitación, que es la falta de especificidad de su modo de
reconocimiento del ADN. Por este motivo, se cuantifican todas las moléculas de ADN
bicatenario presentes en una PCR, incluidos los productos de la PCR no específicos
y los dímeros de los cebadores. Para resolver este problema y sustraer el
componente de la cuantificación debido a los ADN no específicos y a los dímeros de
cebadores en algunos dispositivos, es posible realizar un análisis de la curva de
fusión. Tras la fase final de la PCR, los productos se funden lentamente y se recogen
los datos de fluorescencia. Toda vez que cada ADN bicatenario tiene una
temperatura de fusión específica, es posible cuantificar los componentes que tienen
temperaturas de fusión diferentes en una única mezcla de reacción, eliminando así
de la cuantificación los componentes no específicos.
Métodos de la PCR en tiempo real basados en sondas específicas para una
secuencia
El problema de la especificidad de la detección por fluorescencia del amplicón se ha
resuelto utilizando sondas específicas para una secuencia con un marcado
fluorescente diseñado en el interior del par de cebadores de la PCR. El proceso de
hibridación (y degradación final) de la sonda no suele interferir con la acumulación
exponencial del producto de la PCR. Se utilizan ahora unos pocos principios
diferentes para conseguir reacciones de cuantificación basadas en la PCR en tiempo
real específicas.
Sondas FRET (transferencia de energía de resonancia fluorescente)
La FRET se basa en la transferencia de energía de un fluoróforo donador a un
fluoróforo aceptor (figura 4) (Haugland, 2002). Las condiciones básicas de la FRET
son:
•
Las moléculas del donador y del aceptor deben estar muy próximas (habitualmente
10–100 Å).
•
El espectro de absorción del aceptor debe solaparse con el espectro de emisión de
fluorescencia del donador.
Sesión nº 10
•
9
Las orientaciones de los dipolos de transición del donador y el aceptor deben ser
aproximadamente paralelas.
Si los fluoróforos donador y aceptor están muy próximos, la excitación del donador
por la luz azul desencadena una transferencia de energía al aceptor, que entonces
puede emitir luz de una longitud de onda mayor. La formación de productos de la
PCR
puede
monitorizase
utilizando
dos
sondas
de
oligonucleótidos
con
específicidad de secuencia con una marca fluorescente, denominadas sondas de
hibridación, además de los cebadores de la PCR. Las sondas de hibridación se
diseñan como pares en los que una sonda se marca con el colorante donador (3’fluorescina) y la otra con el aceptor (5’- Red 640 o 5’-Red 705). Dado que la FRET
disminuye con la sexta potencia de la distancia, es necesario diseñar las sondas de
hibridación de manera que se hibriden a regiones adyacentes de la plantilla de ADN
(usualmente están separadas por una distancia de 1-5 nucleótidos). Si se hibridan
ambas sondas, los dos colorantes se aproximan mucho y la FRET al colorante
aceptor produce una señal mensurable mediante fluorometría.
Sondas de degradación (principio TaqMan)
El ensayo TaqMan aprovecha la actividad exonucleásica 5' - 3' de la ADN
polimerasa Taq
para dividir una sonda de degradación durante la PCR (Lie y
Petropoulos, 1998). La sonda de degradación, o TaqMan, suele ser un
oligonucleótido de 20-30 bases de longitud (usualmente con una Tf 10 °C superior a
la Tf de los cebadores) que contiene un colorante delator fluorescente en el extremo
5' y un colorante inhibidor en el 3' (figura 4). Al estar bloqueado el extremo 3', la
sonda no puede extenderse como un cebador. Durante la PCR, en presencia de una
diana, la sonda se hibrida específicamente entre los sitios de los cebadores directo e
inverso. Cuando la sonda está intacta, la proximidad del colorante delator al
colorante inhibidor produce la supresión de la fluorescencia delatora principalmente
por transferencia de energía de tipo Forster (Forster, 1948; Lakowicz, 1983). Durante
la reacción, la actividad exonucleásica 5’-3’ de la ADN polimerasa Taq degrada la
sonda entre los colorantes delator e inhibidor solamente si la sonda se hibrida con la
diana. De esta manera, la fluorescencia aumenta a medida que progresa la
amplificación. La acumulación de producto de la PCR se detecta monitorizando el
incremento de la fluorescencia del colorante delator. Este proceso tiene lugar en
cada ciclo y no interfiere con la acumulación exponencial del producto. Las sondas
de degradación, a diferencia de las FRET, liberan fluorocromos en cada ciclo,
añadiendo más colorante al previamente liberado. En consecuencia, la señal
Sesión nº 10
10
fluorescente se potencia considerablemente en cada ciclo. El ensayo TaqMan utiliza
unos parámetros de los ciclos térmicos y unas condiciones de la PCR que son
universales. Las sondas fluorogénicas exigen, eso sí, que no haya G en el extremo
5'. Una G adyacente al colorante delator inhibe la fluorescencia incluso tras la
división.
I. SYBR Green
Figura 4.
Diferentes
principios de la
PCR en tiempo
II. Sondas de hibridación
real.
I. SYBR green I.
II. Sondas FRET
(transferencia de
energía de
III. Sondas TaqMan
resonancia
fluorescente).
III. Sondas
de
degradación
TaqMan 5`
Sesión nº 10
11
Balizas moleculares
Las balizas moleculares son sondas de ADN diseñadas para contener una estructura
en forma de piruleta. La secuencia del abultamiento de la piruleta es complementaria
de la diana específica de la sonda y las secuencias del estrechamiento se diseñan
de manera que sean mutuamente complementarias (figura 5) (Tyagi y Kramer,
1996). Los extremos 5’ y 3’ de la sonda se unen covalentemente a un fluoróforo y a
un inhibidor. Cuando se cierra la estructura de piruleta, el fluoróforo y el inhibidor se
aproximan. En este caso, todos los fotones emitidos por el fluoróforo son absorbidos
por el inhibidor. En presencia de una secuencia complementaria, la sonda se
despliega y se hibrida con la diana. El fluoróforo se ve desplazado del inhibidor y la
sonda inicia su fluorescencia.
Figura 5. Principio de las balizas moleculares.
Scorpions
Otra posibilidad es la que ofrece la familia de sondas denominadas Scorpions. Un
Scorpion consiste en una secuencia de sonda específica con estructura de piruleta
(figura 6) (Thelwell et al., 2000).
Se une un fluoróforo al extremo 5' y la señal fluorescente que da es inhibida en la
estructura de piruleta por una fracción unida al extremo 3'. La piruleta se une al
extremo 5' de un cebador. Tras la extensión del cebador del Scorpion, durante la
amplificación, la secuencia de sonda específica puede unirse a su complemento
dentro de la misma hebra de ADN. Esta hibridación abre el abultamiento de la
Sesión nº 10
12
piruleta de manera que deja de inhibirse la fluorescencia y puede observarse un
incremento de la señal. Un bloqueante de la PCR situado entre el cebador y la
secuencia del estrechamiento evita que pase a leerse el abultamiento de la piruleta,
lo que podría ocasionar su apertura en ausencia de la secuencia diana específica. El
carácter unimolecular de la hibridación presenta ciertas ventajas con respecto a los
sistemas de sonda homogénea. A diferencia de los ensayos con balizas
moleculares, TaqMan o FRET, los ensayos con Scorpion no requieren una sonda
independiente aparte de los cebadores.
Cebador
Desnaturalización
Hibridación
Extensión
Figura 6. Principio de las sondas Scorpion.
Sondas TaqMan MGB
Un MGB (enlazante al surco menor) es una pequeña molécula en forma de media
luna que encaja muy bien en el surco menor del ADN bicatenario (Kutyavin et al.,
2000). En las sondas TaqMan, el grupo MGB está unido al extremo 3' junto con el
colorante inhibidor (figura 7). Cuando la sonda TaqMan se hibrida, el MGB estabiliza
el apareamiento incorporándose al surco menor del ADN bicatenario creado entre la
sonda y la secuencia diana. La estabilización es mucho más eficaz cuando las
Sesión nº 10
13
secuencias coinciden perfectamente (es decir, no hay desparejamiento). Además del
superior potencial discriminador, la mayor estabilidad hace que las sondas TaqMan
MGB sean muy cortas (normalmente de 13 a 20 bases) en comparación con las
sondas TaqMan estándar (de 18 a 40 bases), sin detrimento del respeto de las
directrices de diseño. Las sondas TaqMan MGB presentan varias ventajas para la
PCR cuantitativa, especialmente para los ensayos Múltiples. El mejor rendimiento
espectral hace posible una precisión y una coherencia superiores entre los distintos
ensayos, y la mayor especificidad de la hibridación permite una discriminación más
precisa de las dianas. Además, al ser la sonda más pequeña se facilita el diseño de
ensayos, pues las sondas se pueden encajar en regiones diana más cortas, tales
como «ventanas» de consenso entre conservación o divergencia de la secuencia. El
tamaño del amplicón puede reducirse al mínimo utilizando sondas MGB más cortas
que pueden contribuir a mejorar la coherencia entre ensayos.
Figura 7. Principio de las sondas MGB.
Principios de cuantificación con la PCR en tiempo real
Cuantificación relativa
El contenido en OGM de una muestra puede expresarse como la cantidad de
material modificado genéticamente en la cantidad total de material. Para determinar
este valor en un sistema basado en la PCR en tiempo real es necesario medir el
número de secuencias de ADN de un gen de referencia endógeno (para usarlo como
Sesión nº 10
14
«normalizador»), así como el número de secuencias de ADN diana específicas del
OGM. El gen de referencia debe escogerse de manera que sea específico de la
especie, presente en una sola copia por genoma haploide, representado como tal de
manera estable en líneas diferentes de la misma especie y tan amplificable como los
caracteres GM en el análisis (aunque esto se deba más a un buen diseño de
cebadores-sonda). En la cuantificación relativa se plantea un problema debido a la
interpretación del porcentaje de contenido de OGM, que no se especifica en la
legislación; por consiguiente, puede entenderse como contenido en OGM (en
porcentaje) el peso del ingrediente modificado puro en relación con el peso total del
ingrediente puro (p. ej., peso de maíz GM con respecto al peso total del maíz
contenido en la muestra). Desde un punto de vista analítico, es conveniente calcular
el porcentaje de OGM como el número de secuencias de ADN diana por secuencia
específica de taxón diana, pero esta definición no incorpora algunas características
importantes de las líneas de OGM; por este motivo, es preciso sopesar
cuidadosamente los siguientes parámetros en la interpretación de los resultados:
a) La ploidía de la transformación. Es posible que la modificación genética tenga una
ploidía diferente de la de la transformación wt (p. ej., tetraploide en vez de diploide).
b) La cigosidad del evento. El carácter GM podría ser homocigótico o heterocigótico.
c) El número de inserciones por genoma haploide de una única construcción
genética artificial. Un construcción genética se puede insertar en una única copia por
genoma haploide o en varias copias.
El punto c) puede obviarse diseñando el sistema cebador-sonda en la frontera de la
inserción de la construcción genética en el genoma. Como las secuencias de
frontera son únicas, el sistema así construido presentará la doble ventaja de ser
específico de la transformación y excluir de la cuantificación las inserciones múltiples
de la misma construcción genética. Los puntos a) y b) se resuelven empíricamente
utilizando materiales de referencia que sean homogéneos con la muestra (p. ej.,
material de referencia de harina de maíz para cuantificar la harina de maíz).
Alternativamente, pueden calibrarse patrones de cuantificación diferentes de los
materiales de referencia certificados (p. ej., secuencias de ADN clonadas o mezclas
de ADN genómico) utilizando materiales de referencia certificados a fin de corregir
las discrepancias moleculares en la cuantificación. Una manera ampliamente
aceptada de solventar los problemas relacionados con los puntos a) y b) es expresar
el porcentaje de OGM en términos de genomas haploides.
En cualquier caso, es preciso tener en cuenta este aspecto de la cuantificación al
desarrollar el método, dado que el límite de detección (LOD) y el límite de
Sesión nº 10
15
cuantificación (LOQ) se ven influidos por el número real de copias que se
cuantifican.
Diseño de un experimento de cuantificación de OGM en tiempo real
El diseño de un análisis de la PCR en tiempo real debe incluir los siguientes
componentes:
- Un sistema de PCR diseñado para detectar una secuencia de ADN diana
específica de un OGM.
- Un segundo sistema de PCR diseñado para detectar una secuencia de referencia
endógena, posiblemente específica de la especie, pero que se pueda utilizar como
«normalizador» en los cálculos de la concentración o las concentraciones relativas
de OGM.
- Curvas patrón para la diana y la referencia endógena. Para cada muestra
experimental, se determina la cantidad de diana y de referencia endógena a partir de
la curva patrón adecuada. La cantidad de diana se normaliza con la cantidad de
referencia endógena para obtener la concentración relativa de la diana. Para
satisfacer los requisitos estadísticos, las curvas patrón deben incluir por lo menos 4
puntos de concentración distintos. Cada punto de la curva patrón, así como la
muestra, debe cargarse al menos por triplicado.
Además, habrá que añadir un control negativo (NTC o control sin ADN molde) tanto
respecto al gen de referencia como a las cuantificaciones de OGM. Pueden utilizarse
también otros controles (p. ej., control negativo de la diana de ADN y control positivo
de la diana de ADN).
Por último, la cuantificación del gen de referencia y de la secuencia específica del
OGM debe tener lugar en el mismo ciclo de PCR (coamplificación), no en ciclos
diferentes, para evitar una posible fluctuación estadística entre experimentos
distintos.
PCR en tiempo real Múltiplex
Dependiendo de las sustancias y del instrumental utilizados en la cuantificación, es
posible diseñar PCR en tiempo real para llevar a cabo la cuantificación de las
secuencias de referencia y OGM por separado en tubos distintos o en los mismos
tubos en tanto que reacción «Múltiplex».
Ambas posibilidades tienen sus ventajas y sus inconvenientes. Con las reacciones
múltiples se ahorran tiempo y reactivos (es posible analizar el doble de muestras en
un único experimento) y se evitan los errores de configuración entre la medida del
Sesión nº 10
16
gen de referencia y del gen diana del OGM, al producirse en el mismo tubo, pero
resultan menos sensibles (en términos de LOQ) a causa de la interferencia entre las
dos reacciones y del distinto consumo de reactivos en ambas. El uso de reacciones
separadas para medir el gen de referencia y el gen diana del OGM, por su parte,
permite obtener mayor sensibilidad en términos de LOQ, pero exige disponer del
doble de reactivos y de pocillos en el equipo de PCR en tiempo real, y es mayor el
riesgo que suponen, p. ej., los errores de pipeteado, al medir una muestra. La
disponibilidad de múltiples colorantes delatores para las sondas TaqMan permite
detectar la amplificación de más de una diana en el mismo tubo. El colorante delator
(FAM) puede distinguirse del otro (VIC) gracias a las diferentes longitudes de onda
de sus máximos de emisión. Así por ejemplo, la disponibilidad de múltiples
colorantes con distintas longitudes de onda de emisión (FAM, TET, VIC y JOE)
permite realizar ensayos TaqMan Múltiplex. El colorante TAMRA se usa como
inhibidor en la sonda y el ROX como referencia pasiva en la mezcla de reacción. Se
recomienda la combinación de FAM (diana) y VIC (control endógeno) para obtener
los mejores resultados, ya que la diferencia entre sus máximos de emisión es la más
amplia. Por el contrario, JOE y VIC nunca deben combinarse. La realización de
ensayos TaqMan Múltiplex en los sistemas de detección de secuencias ABI PRISM
7700, 7900, 7500, 7300 y 7000 es posible gracias a su capacidad para detectar
colorantes múltiples con longitudes de onda de emisión distintas.
Análisis gráfico de los datos de una PCR en tiempo real
A medida que progresa la PCR, se recogen datos sobre fluorescencia (valores Rn)
para construir un gráfico de la cantidad de señal frente al número de ciclo (es decir,
el tiempo). Habitualmente el gráfico se construye a escala semilogarítmica. En la
PCR en tiempo real es posible distinguir tres fases distintas: una primera fase de
«latencia» con ligeras fluctuaciones en los valores correspondientes a la señal de
fondo; una segunda fase exponencial, con valores que se incrementan en paralelo, y
una tercera fase en la que los valores tienden a situarse en una «meseta» (figura 8).
Sesión nº 10
17
Fase
exponencial
Intervalo
«meseta»
Valor umbral
Fluorescencia de
fondo
Figura 8. Gráfico de la PCR en tiempo real. Se señalan las fases típicas de una PCR
en tiempo real.
Si la PCR en tiempo real constituye una herramienta potente, esto se debe a que la
cuantificación no se produce en la fase final de la reacción (la meseta), sino en la
fase en que el crecimiento exponencial de la cantidad de ADN amplificado (Rn)
alcanza un valor significativamente superior a la señal de fondo. Al medir de esta
manera, mejora considerablemente la exactitud de la cuantificación, ya que existe
una correlación directa entre la cantidad de plantilla inicial y la fase en la que la
amplificación empieza a ser exponencial. En la PCR en tiempo real, se define
experimentalmente como ciclo umbral (CT) aquel ciclo en que la señal de
fluorescencia alcanza el valor medio de las señales de fluorescencia medidas entre
el ciclo tercero y el decimoquinto incrementado en diez desviaciones estándar.
Cuanto mayor es la cantidad inicial de ADN genómico, antes se detecta el producto
acumulado en el proceso de la PCR, y más bajo es el valor CT. En la práctica, a
menudo es el operador el que elige la línea umbral que determina el valor CT, lo que
constituye uno de los elementos subjetivos de la PCR en tiempo real. La línea
umbral debe situarse por encima de cualquier actividad basal y dentro de la fase de
crecimiento exponencial, que adquiere forma lineal en la transformación logarítmica
(todas las líneas son paralelas). Debe situarse siempre en el nivel en que empiezan
a coincidir más los gráficos de las réplicas. A veces las réplicas presentan, al
Sesión nº 10
18
comienzo de la fase exponencial, una ligera divergencia que se atenúa o desaparece
según progresa la reacción.
Cálculo del contenido en OGM
El resultado de una PCR en tiempo real es un valor ∆Rn, diferencia entre Rn+ (señal
de fluorescencia que incluye todos los componentes) y Rn- (señal de fondo de la
reacción – línea de base de la lectura de una muestra de control sin plantilla).
El contenido de OGM de una muestra se puede determinar de dos maneras:
1. Se trazan dos curvas patrón, basadas en cantidades distintas de ADN:
- la primera con un sistema de cuantificación específico para el gen de referencia;
- la segunda con un sistema de cuantificación específico para la diana GM.
Para cada muestra, se determinan mediante interpolación con la curva patrón las
cantidades correspondientes a la diana específica y al gen de referencia. Luego se
calcula el contenido (porcentaje) de ADN GM como el cociente entre la cantidad de
la secuencia diana GM y la cantidad de la secuencia del gen de referencia
(GM/referencia * 100).
Conviene tener presente que, necesariamente, las muestras analizadas deben estar
situadas entre los límites inferior y superior de ambas curvas patrón. Es preciso
excluir los valores atípicos, ya que suelen relacionarse con errores de cuantificación.
2. Método de comparación de CT (∆∆CT): En este método no se usan cantidades
conocidas de patrones, sino que se compara la cantidad relativa de la secuencia
diana del OGM con la secuencia del gen de referencia. La curva patrón se obtiene
cargando una serie de muestras con concentraciones diferentes y conocidas del
OGM (p. ej., materiales de referencia certificados del IRMM). El resultado es una
curva patrón de valores ∆∆CT (∆CT = CT gen de referencia - CT
OGM).
El contenido de OGM
se obtiene calculando el valor ∆CT de la muestra y comparándolo con los valores
obtenidos con los patrones.
Para que este método dé buenos resultados, es preciso que las eficiencias de
amplificación de los sistemas de PCR diana y de referencia sean similares. Una
manera sensible de controlarlo es fijarse en cómo varía ∆CT (la diferencia entre los
dos valores CT de dos PCR correspondientes a la misma cantidad inicial de plantilla)
con la dilución de la plantilla. Si las eficiencias de los dos amplicones son
aproximadamente iguales, la representación gráfica del logaritmo de la cantidad
frente a ∆CT será una línea casi horizontal (pendiente <0,10). Esto significa que
ambas PCR tienen la misma eficiencia en el intervalo de cantidades de plantilla
iniciales. Si el gráfico pone de manifiesto que la eficiencia es desigual, deberá
aplicarse el método de la curva patrón para cuantificar los OGM. Debe determinarse
Sesión nº 10
19
el intervalo dinámico para: 1) las concentraciones mínima y máxima de las dianas
para las que los resultados son exactos y 2) las razones mínima y máxima de dos
cantidades de gen para las que los resultados son exactos. En la PCR en tiempo
real competitiva convencional, el intervalo dinámico se limita a una proporción
diana/competidor de aproximadamente 10:1 a 1:10 (la máxima exactitud se obtiene
para una proporción 1:1). La PCR en tiempo real puede conseguir un intervalo
dinámico mucho más amplio.
Sesión nº 10
20
Bibliografía
Reglamento (CE) nº 1829/2003 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de
septiembre de 2003, sobre alimentos y piensos modificados genéticamente, DO L
268 de 18.10.2003, pp. 1-23.
Reglamento (CE) n° 1830/2003 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de
septiembre de 2003, relativo a la trazabilidad y al etiquetado de organismos
genéticamente modificados y a la trazabilidad de los alimentos y piensos producidos
a partir de éstos, y por el que se modifica la Directiva 2001/18/CE, DO L 268 de
18.10.2003, pp. 24-28.
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Sesión nº 10
21
Kutyavin, I.V., Afonina, I.A., Mills, A., Gorn, V.V., Lukhtanov, E.A., Belousov, E.S.,
Singer, M.J., Walburger, D.K., Lokhov, S.G., Gall, A.A., Dempcy, R., Reed, M.W.,
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Ready soybean in some representative foods. Journal of Agricultural Food Chemistry
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Sesión nº 10
Alimentos
Sesión nº 11
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready
mediante PCR en Tiempo Real
N. Foti
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante la PCR en Tiempo Real
2
Índice
Sesión nº 11
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante PCR en
Tiempo Real
Práctica
3
Introducción
3
PCR en tiempo real utilizando el ABI PRISM 7700
3
PCR en tiempo real utilizando el lightcycler (Roche)
9
Bibliografía
15
Sesión nº 11
3
Práctica
Introducción
Los protocolos siguientes son métodos basados en la PCR en tiempo real para la
cuantificación de una línea de soja GM específica (soja Roundup Ready) en material
bruto y transformado. Las cuantificaciones de la PCR en tiempo real se llevan a
cabo con dos termocicladores de PCR distintos equipados para detectar la
amplificación en tiempo real midiendo la fluorescencia: el ABI PRISM 7700 SDS
(Applied Biosystems) y el LightCycler (Roche).
La PCR en tiempo real se utiliza para amplificar una secuencia de ADN diana de
referencia endógena (particular de la soja), más una secuencia de ADN diana que
indica la presencia de soja genéticamente modificada (soja Roundup Ready).
Ambos ensayos comprenden dos sistemas de PCR independientes, cada uno de
ellos con sus propios cebadores de ADN y sondas marcadas por colorantes. Un
sistema de PCR detecta una secuencia de ADN diana específica del OGM y el otro
es un sistema de referencia endógeno que actúa como referencia cuantitativa para
detectar soja GM y no GM.
Nota: Los protocolos que figuran en el presente Manual se han seleccionado por su
valor didáctico y deben considerarse ejemplos básicos de cuantificación de OGM
mediante el método de la PCR en tiempo real. Recomendamos la consulta periódica
de las fuentes y la bibliografía pertinentes para conocer los protocolos desarrollados
y validados más recientemente. Nótese además que estos protocolos se han
seleccionado en función del instrumental disponible en nuestro laboratorio. Ni el CCI
ni la OMS promueven en modo alguno el uso exclusivo de una marca comercial
concreta.
PCR en tiempo real utilizando el ABI PRISM 7700
Protocolo de la PCR en tiempo real específica de la soja RR: método de PCR
Múltiplex
Este método consiste en una amplificación/cuantificación del gen de referencia de la
lectina y una parte del casete insertado de soja RR utilizando un ensayo de PCR
Múltiplex (dos PCR en el mismo tubo) (Foti et al., 2006). Las sondas TaqMan de
lectina y RR se marcan con los colorantes VIC y FAM respectivamente, lo que
Sesión nº 11
4
permite detectar la amplificación de más de una diana en el mismo tubo. El colorante
«delator» (FAM) puede distinguirse del VIC gracias a las diferentes longitudes de
onda de sus máximos de emisión. El ABI PRISM 7700 SDS es capaz de detectar
múltiples colorantes con longitudes de onda de emisión distintas.
La cantidad de colorante de la soja RR (FAM) se normaliza con la cantidad de
colorante de la materia vegetal (VIC) detectada en cada muestra. Se obtiene así un
valor ∆CT para cada muestra replicada, que se promedia. Estos valores se comparan
con una curva de calibración obtenida del ∆CT de los patrones con concentración
conocida de soja RR (método CT comparativo o ∆∆CT).
Este procedimiento ha sido aplicado con éxito a varias materias primas, ingredientes
y alimentos que contienen soja (p. ej., piensos, bebidas de soja, yogures, harinas,
lecitina, etc.).
El rendimiento analítico del método ha sido comprobado satisfactoriamente durante
varios procedimientos de ensayo de la aptitud (p. ej., FAPAS, GIPSA).
Instrumental y reactivos
•
Sistema detector de secuencias ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems)
•
Placas de reacción de 96 pocillos MicroAmp Optical (Nº Cat. N801-0560)
•
Tapas MicroAmp Optical (Nº Cat. N801-0935)
•
Mezcla maestra de PCR universal TaqMan (Nº Cat. 4304437) 2X con el siguiente
contenido:
ADN polimerasa AmpliTaq Gold en Tampón TaqMan 2x (5U/µl),
AmpErase UNG (1U/ml), dNTP 200 µM con dUTP, Referencia pasiva 1
•
Microcentrífuga
•
Centrifugadora refrigerada para tubos cónicos de 15 ml
•
Micropipetas
•
•
•
•
Tubos de centrifugación cónicos de polipropileno de 15 ml
•
Agua sin nucleasa
•
Cebadores específicos (Le-F y Le-R) y sonda (Le-Probe) del gen de referencia
•
Cebadores específicos (RR-F y RR-R) y sonda (RR-Probe) del transgén.
Sesión nº 11
5
Características de los cebadores y la sonda del gen de referencia
Secuencia
Longitud (pb)
Peso molecular
Secuencia
Longitud (pb)
Peso molecular
Secuencia
Longitud (pb)
Peso molecular
Le-F
TCC ACC CCC ATC CAC ATT T
19
5586,0
Le-R
GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA
24
7532
Le-Probe
5’-(VIC)-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT
CG-(TAMRA)-3'
23
7019,0
Características de los cebadores y la sonda del transgén
Secuencia
Longitud (pb)
Peso molecular
RR-F
GCC ATG TTG TTA ATT TGT GCC AT
23
7014
Secuencia
Longitud (pb)
Peso molecular
RR-R
GAA GTT CAT TTC ATT TGG AGA GGA C
25
7712
Secuencia
Longitud (pb)
Peso molecular
RR-Probe
5’-(FAM)-CTT GAA AGA TCT GCT AGA
GTC AGC TTG TCA GCG-(TAMRA)-3'
33
10137
Sesión nº 11
6
•
Descongelar, agitar suavemente y centrifugar la cantidad de componentes que exige
la reacción. Los reactivos descongelados deben mantenerse en hielo.
•
A uno de los tubos de centrifugación de 15 ml mantenido en hielo, añadir los
siguientes componentes en el orden en que se mencionan (salvo el ADN) para
preparar las mezclas maestras. Cada extracto de ADN se analizará por triplicado.
Nótese que se preparan cuatro mezclas de reacción más para ayudar a calcular los
errores de pipeteado debidos a la viscosidad de la solución.
Cuadro 1. Preparación de la mezcla maestra para una placa de ensayo de PCR Múltiplex.
Concentración en la
PCR
Agua desionizada estéril
Mezcla maestra universal
TaqMan 2X
Cebador Le-F (20 µM)
Mezcla
Mezcla maestra Mezcla maestra
maestra
para una
para una placa
(32+4 muestras)
para el
muestra
recipiente (3 repeticiones)
de reacción
(µl)
18,3
54,9
1976,4
1x
25
75
2700
40 nM
0,1
0,3
10,8
Cebador Le-R (20 µM)
Cebador RR-F (20 µM)
40 nM
0,1
0,3
10,8
100 nM
0,25
0,75
27
Cebador RR-R (20 µM)
100 nM
0,25
0,75
27
Sonda Le-Probe (10 µM)
100 nM
0,5
1,5
54
Sonda RR-Probe (10 µM)
100 nM
50-250 ng
0,5
1,5
54
5
15
50
150
ADN
TOTAL
•
Agitar suavemente y centrifugar brevemente.
•
Preparar un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml para cada muestra de ADN que
se vaya a someter a ensayo: muestras de curvas patrón (soja RR–CRM al 0,1, 0,5,
1, 2, y 5 %) muestras desconocidas y muestras de control (0 % de soja RR, ADN de
soja RR y control sin plantilla o NTC).
•
Añadir a cada tubo de microcentrifugación la cantidad de mezcla maestra necesaria
para 3 repeticiones (135 µl de mezcla maestra). Añadir a cada tubo la cantidad de
ADN necesaria para 3 repeticiones (es decir, 15 µl de ADN). Agitar en el mezclador
de torbellino al menos tres veces durante aproximadamente 10 segundos. Este paso
Sesión nº 11
7
es muy importante, ya que contribuye a reducir al mínimo la variabilidad entre las
cuatro réplicas de cada muestra.
•
Pasar brevemente por una microcentrífuga. Colocar la placa de reacción de 96
pocillos sobre una base y verter una alícuota de 50 µl en cada pocillo
horizontalmente de izquierda a derecha. Tras añadir las mezclas maestras a una fila
vertical de pocillos, cubrirlos con tapas ópticas utilizando el instrumento
correspondiente.
Nota: no debe escribirse en la placa óptica ni tocar la tapa.
•
Cerciorarse de que las alícuotas de mezcla maestra cargadas están en el fondo de
los pocillos, sin que haya salpicaduras ni burbujas en los lados o las tapas.
•
Colocar la placa en el instrumento ABI PRISM 7700; abrir una nueva ventana de
configuración de placa para asignar el tipo de muestra a cada pocillo: el tipo de
muestra de control interno (IPC) está asociado al colorante VIC y la incógnita
(UNKN) a la capa de colorante FAM.
•
Someter las muestras a los ciclos descritos en el cuadro 2.
Cuadro 2. Programa de ciclos del ensayo Múltiplex de la soja RR en el SDS ABI PRISM
7700.
Seleccionar: Modo PCR en tiempo real
Volumen de reacción de 50 µl
Paso:
1
2
3
4
Fase
UNG
Amplificación
Desnaturalización
Hibridación y
extensión
T °C
50o C
95o C
95o C
60o C
Tiempo
120 s
600 s
15 s
60 s
Adquisición
No
No
No
Medida
Ciclos
1x
1x
45x
Análisis de los datos e interpretación de los resultados
Una vez completada la ronda, se analizan los datos usando el software del SDS ABI
PRISM 7700, obteniéndose los valores CT de cada colorante delator para cada
muestra.
Es importante numerar correctamente las muestras en la ventana Plate Setup del
software del SDS. Cada pocillo debe recibir un número único en el campo Replicate;
las réplicas de la misma muestra deben recibir el mismo número.
Sesión nº 11
8
Se analiza la ronda seleccionando analyse en el menú de análisis para acceder
automáticamente a la ventana de gráfico de amplificación; se ajusta el valor umbral
para las capas FAM y VIC.
Tras el análisis, se exportan los resultados de la ronda en un archivo excel. Al abrir
el archivo de resultados exportado en Microsoft Excel, aparecerá un cuadro que
contendrá dos conjuntos de datos correspondientes a las capas de colorante FAM y
VIC con los valores CT de cada pocillo.
Se calculan los promedios CT (FAM) y CT (VIC) de cada grupo de réplicas para
calcular los valores ∆CT (CT FAM – CT VIC).
Para cada muestra, se calcula el porcentaje de OGM analizando el ∆CT de la
muestra, comparándolo con el conjunto de valores log (% OGM) y ∆CT obtenidos del
conjunto de patrones de concentración.
Sesión nº 11
9
PCR en tiempo real utilizando el LightCycler (Roche)
Protocolo de la PCR en tiempo real específica de la soja RR
Este método consiste en una amplificación/cuantificación del gen de referencia
lectina y una parte del casete insertado de soja RR, realizadas en dos reacciones
PCR independientes (BgVV, EU Tender Report, 2000). Los dos sistemas de PCR
utilizan sondas marcadas con FAM.
Para cada muestra, se determina la cantidad de secuencias específicas de soja GM
y la secuencia del gen de referencia (lectina) a partir de las adecuadas curvas patrón
preparadas, tanto para el transgén, como para el gen de referencia. El contenido de
soja GM se divide por la cantidad de gen de referencia, obteniéndose así un valor
normalizado de soja GM.
Instrumental y reactivos
•
Sistema Roche LightCycler
•
Capilares para muestras LightCycler, Roche, Nº Cat. 1909339
•
Adaptador de capilares LightCycler, Roche, Nº Cat. 1909312
•
Sondas de hibridación FastStart DNA Master para LightCycler,
Roche, Nº Cat.
3003248 con ADN polimerasa Taq FastStart, mezcla de dNTP (con dUTP en lugar
de dTTP) y Tampon de reacción, conc. 10x; agua esterilizada de grado PCR
•
Seroalbúmina
bovina
(SAB),
sin
nucleasa
(libre
de
ribonucleasa
y
dexosirribonucleasa) p. ej., Promega Nº Cat. R9461 (1 µg/µl)
•
ADN polimerasa Taq Platinum 5U/µl (junto con el Tampon original 10x y MgCl2 50
mM), Invitrogen – Life Technologies Nº Cat. 10966026
•
Microcentrífuga
•
Micropipetas
•
•
•
•
Agua sin nucleasa
•
Cebadores específicos (GM1-F y GM1-R) y sonda (GM1-Probe) del gen de
referencia
•
Cebadores específicos (GM2–F, GM2-R) y sonda (GM2-Probe) del transgén.
Sesión nº 11
10
Características de los cebadores y la sonda del gen de referencia
GM1-F
5'-CCA GCT TCG CCG CTT CCT TC-3'
Secuencia
GM1-R
5'-GAA GGC AAG CCC ATC TGC AAG CC-3'
Secuencia
Secuencia
GM1-Probe
5'-(FAM)-CTT CAC CTT CTA TGC CCC TGA CAC -(TAMRA)-3'
Características de los cebadores y la sonda del transgén
Secuencia
GM2-F
5'-CAT TTG GAG AGG ACA CGC TGA-3'
Secuencia
GM2-R
5'-GAG CCA TGT TGT TAA TTT GTG CC-3'
Secuencia
GM2-Probe
5'-(FAM)-CAA GCT GAC TCT AGC AGA TCT TTC (TAMRA)-3'
Curvas patrón
En cada ronda se generan las dos curvas patrón con 5 diluciones patrón de ADN
diferentes. Se efectúan reacciones simples con cada ADN patrón de calibración con
ambas mezclas maestras.
Se construyen curvas patrón para la cuantificación del ADN de soja total y de la
secuencia GM con soluciones de ADN patrón a valores de concentración
decrecientes comenzando con el 2 % de ADN de soja RR con Tampon TE (0,1 M,
pH 8,0). Se utilizarán aproximadamente 100 ng de ADN para el primer punto de las
curvas patrón. Las diluciones y concentraciones de las curvas patrón se resumen en
el cuadro 3.
Sesión nº 11
11
Cuadro 3. Cantidad de ADN y diluciones de las curvas patrón.
PTR 1
PTR 2
PTR 3
PTR 4
PTR 5
Cantidad de ADN
(ng)/reacción
% de
ADN de
soja
% de ADN
GM
Factor de
dilución
100
50
25
12,5
6,25
100
50
25
12,5
6,25
2
1
0,5
0,25
0,125
1:2
1:4
1:8
1:16
•
Descongelar, agitar suavemente y centrifugar la cantidad de componentes requerida
para la ronda. Los reactivos descongelados deben mantenerse en hielo.
•
Para cada sistema, añadir los siguientes componentes en el orden en que se
mencionan (salvo el ADN) a un tubo de centrifugación de 1,5 ml mantenido en hielo
para preparar las mezclas maestras. Nótese que las dos mezclas de reacción llevan
un exceso de volumen para tener en cuenta los errores de pipeteado debidos a la
viscosidad de la solución.
Cuadro 4. Preparación de la mezcla maestra para el sistema GM1.
Componente
Tampón pol.asa Taq Platinum 10x
MgCl2 (50 mM)
dATP, dGTP, dCTP,dTTP (4 mM)
Cebador GM1-F (20 µM)
Cebador GM1-R (20 µM)
GM1-Probe (10 µM)
SAB sin nucleasa (1 µg/µl)
Polimerasa Taq Platinum (5 U/µl)
Agua sin nucleasa
ADN
Volumen total:
Concentración
en la PCR
1x
4 mM
0,8 mM
500 mM
500 nM
200 nM
0,1 mg/ml
0,8 U
#
µl/reacción
Total µl
(para 18
reacciones)
2
1,6
4
0,5
0,5
0,4
2
0,16
6,85
2
36
28,8
72
9
9
7,2
36
2,9
123,5
18 µl+2 µl
ADN
324,2 µl
(sin ADN)
Sesión nº 11
12
Cuadro 5. Preparación de la mezcla maestra para el sistema GM2.
Componente
Concentración
en la PCR
Tampón pol.asa Taq Platinum 10x
MgCl2 (50 mM)
dATP, dGTP, dCTP,dTTP (4 mM)
Cebador GM2-F (20 µM)
Cebador GM2-R (20 µM)
GM2-Probe (10 µM)
SAB sin nucleasa (1 µg/µl)
Polimerasa Taq Platinum (5 U/µl)
Agua sin nucleasa
ADN
1x
4 mM
0,8 mM
500 mM
500 nM
200 nM
0,1 mg/ml
0,8 U
#
Volumen total:
µl/reacción
Total µl
(para 18
reacciones)
2
1,6
4
0,5
0,5
0,4
2
0,16
6,85
2
36
28,8
72
9
9
7,2
36
2,9
123,5
18 µl+2 µl
ADN
324,2 µl
(sin ADN)
•
Agitar suavemente y centrifugar brevemente.
•
Preparar dos (uno para el sistema GM1 y otra para el GM2) tubos de reacción de 0,5
ml para cada muestra de ADN que se vaya a someter a ensayo (muestras de curva
patrón y muestras desconocidas).
•
Añadir a cada tubo la cantidad de mezcla maestra necesaria para 2 repeticiones (36
µl de mezcla maestra). Añadir a cada tubo la cantidad de ADN adecuada para 2
repeticiones (es decir, 4 µl de ADN). Agitar en el mezclador de torbellino al menos
tres veces durante aproximadamente 10 segundos. Este paso es muy importante
para reducir al mínimo la variabilidad entre las réplicas de cada muestra.
•
Colocar los capilares en el adaptador de centrifugación preenfriado.
•
Pipetear 20 µl de mezcla maestra a cada capilar según el esquema facilitado. (véase
el cuadro 6 «Configuración de las placas – orden de carga» - carrusel LightCycler
estándar).
•
Pasar brevemente por una microcentrífuga a baja velocidad (aprox. 1 150 rpm). Esta
etapa garantiza la concentración de todo el volumen de la mezcla de reacción en la
punta del capilar.
•
Transferir los capilares al carrusel LightCycler (Roche).
•
Someter las muestras a los ciclos descritos en el cuadro 7.
Sesión nº 11
13
Cuadro 6. Configuración de las placas – orden de carga del carrusel LightCycler: posiciones
1 a 16 = sistema GM1, posiciones 17 a 32 = sistema GM2. Cada muestra de ADN por
duplicado para los sistemas del gen de referencia y del transgén (OGM)
Posició
n
Muestra
(%)
Posició
n
Muestra
(%)
Posició
n
Muestra
(%)
1
PTR (100)
13
U2
25
PTR (0,125)
2
PTR (100)
14
U2
26
PTR (0,125)
3
PTR (50)
15
NTC
27
U1
4
PTR (50)
16
NTC
28
U1
5
PTR (25)
17
PTR (2)
29
U2
6
PTR (25)
18
PTR (2)
30
U2
7
PTR (12,5)
19
PTR (1)
31
NTC
8
PTR (12,5)
20
PTR (1)
32
NTC
9
PTR (6,25)
21
PTR (0,5)
10
PTR (6,25)
22
PTR (0,5)
11
U1
23
PTR (0,25)
12
U1
24
PTR (0,25)
Cuadro 7. Programa de ciclos para el sistema LightCycler
Seleccionar: pendiente 20° C/s en todos los pasos.
Modo pantalla fluorescente: F1/1
Desnaturalización:
Ciclos:
1
Tipo:
Ninguno
Nº
de Temp.
segmento
1
96 °C
Modo pantalla fluorescente
F1/1
Tiempo
Pendiente
Temp.
2ª
diana
Incremento
Demora del
incremento
(ciclos)
Modo de
adquisición
120 s
20 °C/s
0 °C
0 °C
0
Ninguno
Ciclos:
Ciclos:
45
Tipo:
Cuantificación
Nº
de Temp.
segmento
Tiempo Pendiente
F1/1
Temp.
2ª
diana
Incremento
Demora del
incremento
(ciclos)
Modo de
adquisición
Ninguno
1
95 °C
5s
20 °C/s
0 °C
0 °C
0
2
60 °C
15 s
20 °C/s
0 °C
0 °C
0
Sencillo
3
72 °C
15 s
20 °C/s
0 °C
0 °C
0
Ninguno
Refrigeración:
Ciclos:
1
Tipo:
Ninguno
Nº
de Temp.
segmento
1
40 °C
F1/1
Tiempo
Pendiente
Temp.
2ª
diana
Incremento
Demora del
incremento
(ciclos)
Modo de
adquisición
30 s
20 °C/s
0 °C
0 °C
0
Ninguno
Sesión nº 11
14
Durante la ronda, hacer clic en el botón EDIT SAMPLE e introducir los nombres de las
muestras en la pantalla de carga. Definir todas las posiciones (incluido el ADN calibrador)
como «Unknowns».
Análisis de los datos e interpretación de los resultados
•
Para analizar los datos, seleccionar Fluorescence F1/F2 en la ventana frontal de
análisis de datos.
•
Para cuantificar, hacer clic en el botón de cuantificación.
•
El software de LightCycler ofrece dos métodos de cuantificación distintos: el método
del «máximo de la segunda derivada» y el método de los «puntos de ajuste». Para la
cuantificación con el kit de detección de ADN de soja RR es preferible utilizar el
segundo método. Seleccionar lo siguiente: ajuste de la línea base = Proportional;
número de puntos = 2.
•
Realzar
la
curva
patrón
junto
con
todas
las
reacciones
desconocidas
correspondientes.
•
Abrir la carpeta Step 2: Noise Band.
•
Llevar la banda de ruido a una posición de 0,1. Dicha banda puede desplazarse
manualmente utilizando el ratón o presionando el botón que se encuentra debajo del
botón Chance Graph Settings. Al pulsar este botón, aparece la ventana Manual
Cursor Adjustment y es posible definir el valor del cursor como 0,1.
•
Abrir la carpeta Step 3: Analysis.
•
En Step 3: Analysis se calculan los puntos de corte y las correspondientes
concentraciones de los patrones de calibración y las plantillas de ADN
desconocidas.
•
Controlar el valor de r de la curva patrón. Son aceptables los valores de r ≥ -0,98,
siendo óptimo el valor r = -1.
Sesión nº 11
15
Bibliografía
EU Tender Report. (2000). Development of qualitative as as well quantitative
detection methods to identify a genetic modification in soybean and maize
products. Report of the EU tender n. XXIV/98/A3/001.
LightCycler Operator’s Manual, version 3.0 (Roche Molecular Biochemicals).
User Bullettin #2. Relative quantitation of gene expression. ABI PRISM 7700
Sequence Detection System. PE Applied Biosystems, 1997.
User Bullettin #5. Múltiplex PCR with TaqM VIC probes .ABI PRISM 7700 Sequence
Detection System. PE Applied Biosystems, 1998.
Foti, N., Onori, R., Donnarumma, E., De Sanctis, B., and Miraglia, M. (2006). RealTime PCR multiplex method for the quantification of Roundup Ready soybean in
raw material and processed food. European Food Research and Technology
Journal 222, 209-216.
Sesión nº 11
Alimentos
Sesión nº 12
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready
mediante ELISA
F. Eyquem
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA
2
Índice
Sesión nº 12
Introducción
3
La técnica ELISA
8
Práctica
12
Diagrama de flujo
21
Bibliografía
22
22
Sesión nº 12
3
Introducción
La detección inmunológica específica de una proteína nueva sintetizada por un gen
introducido durante la transformación constituye un método alternativo de
identificación de plantas modificadas genéticamente. Hay que tener presente, no
obstante, que la modificación genética no siempre tiene por finalidad específica la
producción de una proteína nueva y no siempre se traduce en unos niveles de
expresión de la proteína útiles para la detección. Además, algunas proteínas se
expresan solo en determinadas partes de la planta (están utilizándose ya promotores
con especificidad tisular para fines concretos) o se expresan a niveles diferentes en
partes distintas o durante fases distintas del desarrollo fisiológico.
Se ha comunicado que los niveles de expresión de los productos transgénicos en las
plantas se sitúan entre el 0 y el 2 % de la proteína soluble total, incluso con
utilización de potentes promotores constitutivos para activar la expresión (Longstaff,
1995). En la mayor parte de los casos, no obstante, los niveles de expresión
comunicados (p. ej., en cultivos GM aprobados) se sitúan por debajo del límite
superior del 2 % (Hemmer, 1997).
Los inmunoensayos son sistemas de medición analítica que utilizan anticuerpos
como reactivos de ensayo. Los anticuerpos son proteínas específicas aisladas a
partir del suero de animales que solo se unen físicamente a la sustancia que ha
provocado su producción. Los anticuerpos se fabrican inyectando la sustancia que
se quiere detectar (p. ej., CP4 EPSPS, la proteína que confiere resistencia al
herbicida Roundup) a animales como el conejo o el ratón, cuyas células somáticas
reconocen la sustancia como «extraña» y responden produciendo anticuerpos contra
ella. Después se purifican los anticuerpos, se acoplan a un marcador detectable y se
utilizan como reactivos para detectar la sustancia de interés.
Un requisito previo para el desarrollo de métodos inmunológicos de detección es
disponer de anticuerpos específicos dirigidos contra la proteína nueva que se quiere
detectar. Además, es necesario que la muestra o las proteínas de interés no se
degraden significativamente.
Los anticuerpos son un instrumento precioso para el biólogo en la detección y
cuantificación de antígenos en mezclas complejas. Todos los inmunoensayos se
basan en la unión específica del anticuerpo al antígeno.
Interacciones anticuerpo-antígeno
Al describir las propiedades de los anticuerpos en tanto que proteínas, la mayoría de
los inmunólogos citará la capacidad de estas moléculas para precipitar los antígenos
Sesión nº 12
4
de una solución, aun cuando la precipitación de anticuerpos apenas se utilice ya
para aislar o detectar antígenos experimentalmente y los anticuerpos raramente
precipitan antígenos in vivo, salvo en el caso de algunas enfermedades
autoinmunes. El valor pedagógico de la reacción de precipitación por anticuerpos,
ilustrada en la figura 1, es que refleja nítidamente muchas de las propiedades
fundamentales y universales de las moléculas de anticuerpo. Esta técnica
demuestra, entre otras cosas, que:
•
los anticuerpos (lgG) séricos son bivalentes en sus reacciones con antígenos y
tienen la capacidad de entrecruzar antígenos;
•
los antígenos son a menudo multivalentes en sus interacciones con los
anticuerpos;
•
los anticuerpos séricos suelen ser policlonales en la naturaleza, y
•
los anticuerpos son sumamente específicos en lo que se refiere a las estructuras
que reconocen en las moléculas antigénicas.
Cuadro 1. Curva de precipitación de un sistema de un antígeno y sus anticuerpos.
ANTISUERO POLICLONAL
Mioglobina
Zona de exceso de
anticuerpos
Zona de
equivalencia
Zona de exceso de
antígeno
Sobrenadantes: Exceso de Ac
Exceso de Ag
ANTICUERPO MONOCLONAL
Anticuerpo precipitado
Antígeno añadido
En la representación gráfica de la cantidad de anticuerpo precipitada frente a la
concentración de antígeno (siendo constante el total de anticuerpo) se distinguen
tres zonas:
Sesión nº 12
5
- una «zona de exceso de anticuerpo» en la que queda inhibida la precipitación y
puede detectarse un exceso de anticuerpo en el sobrenadante;
- una «zona de equivalencia» de precipitación máxima, en la que anticuerpos y
antígenos forman grandes complejos insolubles (de tonos azules) y no se puede
detectar en el sobrenadante ni el antígeno ni el anticuerpo;
- una «zona de exceso de antígeno» en la que queda inhibida la precipitación y
puede detectarse un exceso de antígeno en el sobrenadante.
Aun cuando la reacción de precipitación se presta magníficamente a la
caracterización de las interacciones entre anticuerpos policlonales y antígenos
multivalentes, no suele resultar muy útil para caracterizar las interacciones entre
antígenos y anticuerpos monoclonales, salvo en caso de que los antígenos exhiban
múltiples epítopos idénticos (como las estructuras repetitivas de hidratos de carbono
que se encuentran en los polisacáridos, por ejemplo).
Solo entonces podrá un
anticuerpo monoclonal monoespecífico entrecruzar y precipitar antígeno. Sin
embargo, habitualmente los anticuerpos monoclonales se pueden caracterizar
mediante tipos de medición más refinados que aportan detalles sobre la interacción
entre anticuerpo y antígeno, tales como la constante de equilibrio y las tasas
cinéticas de asociación y disociación.
Nunca se insistirá bastante en la utilidad de los anticuerpos para la detección y
aislamiento de antígenos, dado el amplio espectro de aplicaciones extremadamente
potentes de los anticuerpos que se ha ido desarrollando a lo largo de los años. La
utilidad de los anticuerpos se ve además reforzada por su estabilidad relativa en
varias reacciones de modificación química, que alteran la estructura del anticuerpo
sin destruir su capacidad para unirse a antígenos. Los anticuerpos han sido
marcados químicamente con compuestos fluorescentes, magnéticos, radiactivos y
de otros tipos a fin de facilitar la detección o aislamiento de antígenos en
condiciones experimentales diversas.
Preparación de anticuerpos monoclonales
El sistema inmunitario de un organismo es capaz de reconocer como invasoras las
sustancias extrañas al mismo, como las bacterias y los virus patógenos y otros
agentes infecciosos, denominadas antígenos. Nuestras defensas naturales contra
estos agentes infecciosos son los anticuerpos, proteínas que buscan los antígenos y
ayudan a destruirlos.
Los anticuerpos presentan dos características de gran utilidad. En primer lugar, son
extremadamente específicos, es decir, cada anticuerpo se une a un antígeno
Sesión nº 12
6
particular para atacarlo. En segundo lugar, algunos anticuerpos, una vez activados
por la presencia de una enfermedad, siguen confiriendo resistencia a ella.
Esta segunda característica es la que permite desarrollar vacunas. Una vacuna es
un preparado de bacterias o virus muertos o debilitados que, al ser introducido en el
organismo, estimula la producción de los anticuerpos correspondientes a los
antígenos que contiene.
La primera característica de los anticuerpos, su especificidad, es la responsable de
que la tecnología de anticuerpos monoclonales sea tan valiosa. Los anticuerpos no
solo pueden utilizarse con fines terapéuticos, para proteger de la enfermedad, sino
también en el diagnóstico de una amplia variedad de enfermedades y en la
detección de la presencia en la sangre de medicamentos, de productos víricos y
bacterianos y de otras sustancias inusuales o anormales.
Dado que estas sustancias de lucha contra la enfermedad tienen usos muy diversos,
se ha investigado durante mucho tiempo su producción en cantidades puras. El
método convencional era inyectar el antígeno a un animal de laboratorio y luego, una
vez formados los anticuerpos, recogerlos del suero sanguíneo (el suero sanguíneo
que contiene anticuerpos se llama antisuero). Este método, sin embargo, presenta
dos problemas: produce antisuero que contiene sustancias no deseadas y produce
una cantidad muy pequeña de anticuerpos utilizables.
La tecnología de anticuerpos monoclonales permite producir grandes cantidades de
anticuerpos puros utilizando células que producen anticuerpos de forma natural y
una clase de células que puede crecer continuamente en cultivo. Si formamos un
híbrido que combine la característica de la «inmortalidad» con la capacidad de
producir la sustancia deseada disponemos, desde luego, de una fábrica de
anticuerpos en funcionamiento permanente.
En la tecnología de anticuerpos monoclonales se fusionan células tumorales
capaces de replicarse indefinidamente con células de mamífero que producen un
anticuerpo. El resultado de esta fusión celular es un «hibridoma» que produce
anticuerpos continuamente. Estos anticuerpos se llaman monoclonales porque
proceden de un único tipo de célula, el hibridoma, mientras que los producidos por
métodos convencionales derivan de preparados que contienen muchos tipos de
células, por lo que se denominan policlonales. Se da a continuación un ejemplo de la
obtención de anticuerpos monoclonales.
Producción de anticuerpos monoclonales
Un mieloma es un tumor de la médula ósea que puede adaptarse para que crezca
permanentemente en un cultivo. Al fusionar células de mieloma con células de bazo
Sesión nº 12
7
de mamífero productoras de anticuerpos, se halló que las células híbridas
resultantes,
o
hibridomas,
producían
grandes
cantidades
de
anticuerpos
monoclonales. Este producto de una fusión celular combinaba las cualidades
deseadas de los dos tipos de células diferentes, a saber, la capacidad de
crecimiento continuo y la de producir grandes cantidades de anticuerpo puro.
Como las células híbridas seleccionadas producen un solo anticuerpo específico,
son más puros que los anticuerpos policlonales producidos mediante técnicas
convencionales
y
pueden
resultar
más
efectivos
que
los
medicamentos
convencionales para combatir la enfermedad, ya que estos no solamente atacan a la
sustancia extraña, sino también a las células del propio organismo, produciendo a
veces efectos secundarios no deseados tales como reacciones alérgicas. Los
anticuerpos monoclonales atacan a la molécula diana y solo a ella, y sus efectos
secundarios son mínimos o inexistentes.
Producción de anticuerpos monoclonales
Inmunización de un ratón
para estimular la
producción de anticuerpos
Se cultivan células tumorales
en un cultivo tisular
Se aislan células formadoras de
anticuerpos a partir del bazo
Las células formadoras de anticuerpos se funden
con células tumorales cultivadas para formar
hibridomas
Selección de hibridomas para la
producción de anticuerpos
Hibridomas productores de
anticuerpos clonados
Anticuerpos monoclonales
aislados para su cultivo
Sesión nº 12
8
La técnica ELISA
Definición
Un ensayo de inmunosorción enzimática («Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay»)
es cualquier inmunoensayo enzimático que utilice un inmunorreactivo (antígeno o
anticuerpo) marcado con una enzima y un inmunosorbente (antígeno o anticuerpo
unido a un soporte sólido). Para medir una concentración desconocida pueden
usarse diversos métodos (p. ej., unión competitiva entre el reactivo marcado y el
elemento desconocido sin marcar).
ELISA (Clark y Adams, 1977) se basa en interacciones específicas entre anticuerpos
y antígenos. Los reactivos clave en ELISA son los anticuerpos, que son proteínas
solubles producidas por el sistema inmunitario en respuesta a una infección por una
sustancia extraña (llamada «antígeno»). En caso de la detección de OGM, el
antígeno puede ser la nueva proteína sintetizada.
Esta técnica se aplica en la evaluación, en fase experimental, del nivel de expresión
de la(s) proteína(s) sintetizada(s) por el nuevo gen introducido. Por ello, es posible
encontrar información sobre la producción y el uso de anticuerpos específicos en
muchos artículos que describen la creación de plantas transgénicas (Mohapatra et
al., 1999).
Solo se dispone comercialmente de unos cuantos anticuerpos específicos dirigidos
contra proteínas que son producto de los transgenes utilizados en cultivos
modificados genéticamente aprobados: sirvan de ejemplo los anticuerpos contra el
producto del gen nptII, NPTII, o APH(3')II y contra el producto del gen gus.
Sesión nº 12
9
Existen tres métodos distintos de realizar el ensayo ELISA:
a) ELISA indirecto
lavado
Pocillo
revestido
de antígeno
Añadir
anticuerpo
específico
Añadir
anticuerpo
secundario
conjugado
con enzima
b) ELISA sándwich
lavado
lavado
Pocillo
revestido de
anticuerpo
Añadir
antígeno
lavado
Añadir
sustrato y
medir
color
lavado
lavado
Añadir (Ag-Ac)
al pocillo
revestido de
antígeno
Añadir
sustrato (s)
y medir
color
Añadir
anticuerpo
secundario
conjugado
con enzima
c) ELISA competitivo
Incubar
anticuerpo
con antígeno
lavado
lavado
Añadir
anticuerpo
secundario
conjugado
con enzima
Añadir
sustrato
sin color
Un método de detección específica de la soja Roundup Ready basado en ELISA fue
desarrollado, sometido a prueba y validado por Lipp et al. (2000).
El método se basa en el uso de anticuerpos específicos dirigidos contra la proteína
CP4 EPSPS (5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa, enzima procedente de
Agrobacterium sp., cepa CP4) (Padgette et al., 1995), que es la proteína que
confiere la tolerancia frente al herbicida Roundup en la soja Roundup Ready. Los
resultados preliminares indican que este método (que se aplica utilizando un kit
comercia de ELISA) es capaz de detectar la presencia de OGM en material de soja
bruto en concentraciones que se sitúan entre el 0,3 % y el 5 %.
Principio
Para la detección de la proteína CP4 EPSPS se utiliza
un ensayo de
inmunoadsorción enzimática (ELISA) directo de tipo sándwich, según se muestra en
las siguientes figuras:
Sesión nº 12
10
Y Anticuerpo monoclonal
Superficie
revestida
Se reviste la superficie de una placa de microvaloración con un anticuerpo de
captura monoclonal específico.
Antígeno
Superficie revestida
Cuando se añade la muestra de interés, el anticuerpo de captura se une al antígeno.
Los componentes de la muestra que no se han unido se eliminan mediante lavado.
HRP
Anticuerpo detector
Superfic. revestida
Tras el lavado, se añade un anticuerpo policlonal, unido covalentemente a la
peroxidasa de rábano (HRP), que es específica para un segundo sitio antigénico en
la proteína CP4 EPSPS unida.
TM
TM
Superfic. revestida
Sesión nº 12
11
Tras otro lavado, se añade el cromógeno tetrametilbencidina de la peroxidasa de
rábano. La peroxidasa de rábano genera una señal de color que es proporcional a la
concentración de antígeno en un intervalo lineal. Para detener el desarrollo del color
se añade una solución de parada. El nivel de color producido se mide a una longitud
de onda de 450 nm.
Sesión nº 12
12
Práctica
(GMO Food Ingredient Testing, Soya kit User’s Guide (1999). Strategic Diagnostics,
1
Inc., Rev. 052099, Vers. 1.8.)
Introducción
El siguiente protocolo especifica un método ELISA para la determinación de la
proteína CP4 EPSPS expresada en la soja Roundup Ready en productos agrícolas
brutos y elaborados como las harinas de soja y las proteínas aisladas de soja.
El método es aplicable a muestras que han sido poco o en absoluto tratadas, por lo
que la proteína CP4 EPSPS no está desnaturalizada. Por ejemplo, la temperatura a
la que se transforman los ingredientes de los alimentos puede repercutir en las
posibilidades de detección de la proteína. Según los datos, las temperaturas de
transformación de no más de 65 °C durante no más de 60 minutos permiten una
detección fiable.
El método ha sido validado para la detección de la proteína CP4 EPSPS y puede
usarse para determinar la concentración de la proteína en la muestra en el intervalo
del 0,3 % al 5 % (p/p) usando material de referencia específico. El kit puede
emplearse igualmente a niveles de detección más bajos (0,05 % a 0,3 %) con
modificaciones en el protocolo.
Instrumental
•
Tubos de centrifugación cónicos de polipropileno de 15 ml
•
Tubos de ensayo de vidrio de 12 X 75 mm
•
Hojas de plástico o aluminio para envolver
•
Cinta de plástico o lavador de placas manual
•
Frascos lavadores, p. ej. de 500 ml
•
Pipetas de precisión capaces de transferir de 20 µl a 500 µl
•
•
Bandejas de pesar o equivalentes
•
Espátulas
•
Balanza capaz de efectuar mediciones de 0,01 g
1
El kit que se describe en esta sesión era el único protocolo validado disponible en el comercio en el
momento en que se organizaron los cursos y se preparó el presente Manual. El CCI y la OMS no
promocionan ninguna marca concreta de kits disponibles en el comercio.
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•
Centrifugadora que pueda trabajar a 5 000 - 10 000 rpm
•
Lector de placas de microvaloración capaz de leer una absorbancia a 450 nm
•
Horno de incubación capaz de mantener 37 °C
•
Tamiz de 450 µm de abertura o equivalente
•
Tamiz de 150 µm de abertura (malla 100) o equivalente
•
Pipeta multicanal, p. ej., de 50 µl a 300 µl (opcional)
•
Depósitos de reactivo para distribución multicanal (opcional)
•
Lavador de placas automático (opcional)
•
Soporte para tubos de centrifugación de 15 ml (opcional).
Reactivos
Generalidades
Durante los análisis, y a menos que se indique otra cosa, se utilizarán solamente
reactivos de grado analítico y agua desionizada o destilada.
Cualquier desviación de los criterios de rendimiento definidos podría indicar una
merma de la estabilidad de un reactivo. En caso de que los componentes del
sustrato hayan ya virado de transparente a azul, deberá descartarse el reactivo. No
deberán usarse soluciones tampón turbias.
Todos los componentes del kit deberán almacenarse a una temperatura de entre
2 °C y 8 °C. El período de validez de los componentes del kit viene indicado por su
fecha de caducidad. Sobre la base de ensayos de estabilidad acelerados, la fecha
de caducidad del kit de ensayo se ha fijado en 9 meses a una temperatura de entre
2 °C y 8 °C.
La solución madre «conjugado de soja» de conjugado de anticuerpo y la solución de
trabajo de conjugado de anticuerpo deberán almacenarse a una temperatura de
entre 2 °C y 8 °C hasta la fecha de caducidad del kit. El tampón de lavado de trabajo
diluido deberá almacenarse a una temperatura de entre 2 °C y 8 °C sin sobrepasar
la fecha de caducidad del kit.
Reactivos que suelen facilitarse con el kit de ensayo
•
Tampón de extracción de soja, tampón de borato de sodio, pH 7,5
•
Tampón de extracción de soja, PBS, Tween 20, seroalbúmina bovina, pH 7,4
•
Pocillos en tiras revestidas (12 tiras de 8 pocillos cada una revestidas con los
anticuerpos de captura monoclonales y un portatiras)
•
Conjugado de soja, proteína anti-CP4 EPSPS de conejo, liofilizada
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•
Diluyente del conjugado de soja, suero de ratón inactivado por calor al 10 %
•
Sustrato cromogénico, K-Blue, tetrametilbencidina (TMB), peróxido de
hidrógeno, dimetilformamida al 5 % como disolvente de base
•
Solución de parada, ácido sulfúrico al 0,5 %
•
Tampón de lavado concentrado diez veces, PBS, Tween 20, pH 7,1
•
Patrones de referencia negativos y positivos.
Procedimiento
Limitación del procedimiento
Este sistema de ensayo de la modificación genética mediante ELISA solo es válido
para muestras en las que la expresión de la proteína CP4 EPSPS se pueda
correlacionar con el nivel de material modificado genéticamente presente en los
patrones de referencia utilizados.
El kit de ELISA ha sido diseñado para ofrecer un rendimiento óptimo a una
temperatura ambiente de 15 °C a 30 °C. La absorbancia del patrón de referencia
más elevado debe ser superior a 0,8 y no estar fuera del intervalo lineal del
espectrómetro (el límite superior varía según el aparato). Es importante tener
presente que los valores de la densidad óptica aumentan más deprisa a
temperaturas superiores a 30 °C. En consecuencia, si la temperatura es elevada,
será necesario acortar el tiempo de incubación del sustrato. A temperaturas bajas
(inferiores a 15 °C), por el contrario, habrá que alargar dicho tiempo.
Medidas encaminadas a evitar la contaminación durante la preparación de la muestra
Generalidades. El sistema ELISA de ensayo de OGM es una técnica
extremadamente sensible capaz de detectar cantidades muy pequeñas de
contaminantes GM. Por este motivo, es imperativo que todo el instrumental utilizado
para procesar las muestras de soja sea limpiado a fondo entre dos lotes de
muestras. Los procedimientos que se mencionan a continuación incluyen un primer
paso de eliminación física de cuantas partículas sea posible. El segundo paso, un
lavado con alcohol, tiene por finalidad desnaturalizar la muestra de manera que no
reaccione durante el ensayo con ninguna proteína GM que pueda haber quedado en
el instrumental.
Sesión nº 12
15
Limpieza del triturador o batidora. Cepillar con un cepillo de cerdas suave. Lavar
el cepillo periódicamente y remojarlo en una solución de alcohol. Secar el cepillo
antes de volver a usarlo. Enjugar con una bayeta suave o un paño de laboratorio.
Lavar con alcohol, que puede tenerse almacenado para su uso en una botella con
pulverizador o pitorro. Se recomiendan dos lavados o pulverizaciones. Luego, se
enjuagará a fondo con agua. Secar al aire o, si es preciso reutilizar enseguida el
instrumento, con un secador de pelo comercial.
Limpieza del tamiz. El polvo de soja suele endurecerse, atascando el tamiz.
Sacudir bruscamente el tamiz contra una superficie dura para desprender el material
endurecido.
Cepillar con un cepillo de cerdas suave y limpio. Lavar el cepillo periódicamente y
remojarlo en una solución de alcohol durante al menos un minuto. Secar el cepillo
antes de volver a usarlo. Enjugar con una bayeta suave.
Remojar en alcohol durante al menos cinco minutos y luego enjuagar a fondo con
agua. Secar al aire o, si es preciso reutilizarlo enseguida, con un secador de pelo
comercial.
Una alternativa sería el uso de un baño de ultrasonidos seguido de un secado al
aire.
Limpieza de la zona de trabajo. También es importante la limpieza de la zona de
trabajo. Dado que el ensayo es muy sensible, una ligerísima contaminación por
polvo GM del tubo de ensayo podría conducir a un falso positivo. Hay que evitar la
contaminación por polvo de soja en la zona de trabajo. No debe permitirse que el
polvo de soja de un proceso contamine el instrumental que se usará en un proceso
posterior. Lo ideal es realizar el ensayo en un espacio separado de la instalación en
la que se efectúa el triturado y la preparación de la muestra, a fin de evitar la posible
contaminación por polvo.
Preparación de la muestra
Debe tomarse de la muestra de laboratorio una submuestra incremental homogénea.
Si la muestra es de semillas de soja en bruto, se colocarán al menos 500 g en una
batidora adecuada y se triturarán durante 3 minutos aproximadamente, o hasta que
sea suficientemente fina para atravesar los tamices. Para análisis cuantitativos,
deberá obtenerse un tamaño de partícula inferior a 150 µm, y para análisis
cualitativos, inferior a 450 µm. En la fase de tamizado debe ponerse cuidado en
evitar la contaminación, así como en evitar el calentamiento excesivo. La batidora
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permitirá
mezclar
y
triturar
la
muestra.
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Se
tomará
una
submuestra
de
aproximadamente 100 g de material triturado, que se pasará a través de un tamiz
con un tamaño de poro de 450 µm (malla 40). Al menos el 90 % de esta submuestra
deberá atravesar el tamiz de 450 µm. Puede usarse este material directamente si se
trata de un ensayo cualitativo, pero si es cuantitativo debe volverse a pasar por un
tamiz con tamaño de poro de 150 µm. Como se ha demostrado que el material que
atraviesa el tamiz de 450 µm es homogéneo, basta hacer pasar por el tamiz de
150 µm suficiente material para obtener la muestra final.
Otros tipos de muestras deben recibir un tratamiento semejante, aunque puedan
utilizarse tamaños de muestra más pequeños.
Procedimiento de ensayo
Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente antes de usarlos.
Se sacan las tiras revestidas y el portatiras de la bolsa de papel de aluminio. Tras
extraer el número de tiras adecuado, hay que volver a cerrar siempre la bolsa.
Hacen falta diez pocillos para los patrones de referencia y los blancos de ensayo.
Cada placa debe tener sus propios patrones y controles. Si se utiliza un lavado
manual, pegar con cinta de plástico los bordes de todas las tiras necesarias para un
ciclo al portatiras, a fin de evitar que caigan accidentalmente de este durante el
lavado.
Preparación del conjugado de anticuerpo
Solución madre de conjugado de anticuerpo. Pipetear 1 ml de diluyente de
conjugado de soja procedente de la botella de diluyente de conjugado de soja en el
frasco de conjugado de soja. Agitar en el mezclador de torbellino durante 10 s
aproximadamente.
Solución de trabajo de conjugado de anticuerpo. Volver a poner 240 µl de
conjugado de soja reconstituido en la botella de diluyente de conjugado de soja.
Marcar la botella con la fecha del día y mezclar invirtiéndola 20 veces.
Preparación del tampón de lavado
Dejar que el tampón de lavado concentrado diez veces alcance la temperatura
ambiente.
Diluir dicho tampón concentrado en agua desionizada para preparar el tampón de
lavado de trabajo (p. ej., 50 ml de tampón de lavado concentrado diez veces en 450
ml de agua desionizada).
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Añadir al lavador de placas automático o al frasco lavador.
Extracción de muestras y patrones de referencia
Se extraen las muestras y los patrones de referencia negativos y positivos en las
mismas condiciones y por duplicado, según se describe a continuación.
Cuando vayan a pesarse las muestras, pesar cada patrón de referencia por orden de
concentración creciente y luego las muestras.
Pesar 0,5 g ± 0,01 g de cada patrón de referencia y de la muestra en distintos tubos
de centrifugación de polipropileno de 15 ml. Para evitar la contaminación, limpiar la
espátula entre cada pesada.
Añadir 4,5 ml de tampón de extracción de soja en cada uno de los tubos que
contienen una muestra de 0,5 g y agitar en un mezclador de torbellino durante 10 s.
Centrifugar las mezclas a aproximadamente 5000 rpm durante 15 minutos.
Utilizando una pipeta de transferencia, retirar cuidadosamente el sobrenadante sin
aspirar material sólido y colocarlo en un tubo de centrifugación de 15 ml limpio y
etiquetado.
Antes de comenzar el ensayo, diluir los extractos de la muestra y los extractos del
patrón de referencia con tampón de ensayo de soja con arreglo a lo indicado en el
cuadro 1.
Los extractos de proteína deben almacenarse a entre 2 °C y 8 °C, pero no durante
más de un día de trabajo.
Cuadro 1. Intervalos de dilución en función de la matriz
Matriz
Dilución
Semillas de soja
Harina de soja
Harina de soja desgrasada
Aislado de proteínas
1:300
1:300
1:300
1:10
Dilución de extractos de muestras
Para el control negativo extraído, para cada referencia positiva extraída y para cada
muestra, se precisan dos tubos de ensayo de 12 X 75 mm para realizar la dilución.
Pipetear 280 µl del tampón de ensayo de soja en uno de los dos tubos de ensayo de
12 x 75 mm.
Pipetear 380 µl del tampón de ensayo de soja en el otro tubo de ensayo de 12 x 75
mm. Marcar el tubo de 280 µl con la inscripción «1:15» y el de 380 µl con «1:300».
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Pipetear 20 µl de cada extracto de muestra en el tubo «1:15» y agitar en el
mezclador de torbellino.
Transferir 20 µl del tubo «1:15» agitado al tubo «1:300» y agitar en el mezclador de
torbellino.
Repetir los mismos pasos para el control negativo, para cada referencia positiva y
para los extractos de muestra.
Procedimiento de inmunoensayo ELISA
Generalidades
El kit de ensayo ELISA puede utilizarse en distintos formatos con cualquier número
de bandas de 8 pocillos. Se recomienda seguir un sistema de carga aleatorio.
Todos los pocillos de reacción deben emplearse por duplicado, calculándose el valor
medio de absorbancia de cada pocillo. Cada ciclo está integrado por el blanco del
tampón de ensayo, el control negativo y la referencia positiva.
Una vez iniciado un ensayo, deben completarse todas sus etapas sin interrupción.
Adición de la muestra
Añadir 100 µl de extractos diluidos y el blanco de ensayo a los pocillos oportunos.
Usar puntas desechables distintas en cada etapa de pipeteo para evitar la
contaminación cruzada. Cubrir la placa con hoja de aluminio o de plástico para evitar
la contaminación y la evaporación.
Incubación de la muestra
Incubar la placa de microvaloración a 37 °C durante 1 hora.
Lavado
Lavar 3 veces con 300 µl de tampón de lavado.
Lavado manual. Vaciar los pocillos invirtiéndolos sobre un fregadero o un
contenedor de residuos adecuado. Utilizando un frasco lavador de 500 ml que
contenga solución de lavado de trabajo, llenar cada pocillo hasta el borde, dejar
reposar 60 s, y luego vaciar la placa como se acaba de indicar. Repetir el lavado un
total de 3 veces. Eliminar el líquido y las burbujas residuales sacudiendo boca abajo
la placa sobre varias capas de toallas de papel.
Se impedirá que las tiras caigan del marco sujetándolas con cinta adhesiva.
Lavado automático. Al final del período de incubación, aspirar el contenido de
todos los pocillos utilizando un lavador de micropocillos, y luego llenarlos con
tampón de lavado de trabajo. Repetir la aspiración y el llenado un total de 3 veces.
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Por último, aspirar todos los pocillos mediante el lavador de micropocillos y sacudir
la placa invertida sobre una pila de toallas de papel para eliminar las gotitas
residuales de tampón de lavado y las burbujas.
No hay que dejar que los pocillos se evaporen, ya que esto podría afectar al
rendimiento del ensayo.
Un lavado inadecuado puede ocasionar resultados erróneos. Tanto si se utiliza un
lavador manual como automático, es importante cerciorarse de que todos los
pocillos de ensayo se lavan con idénticos volúmenes.
Adición del conjugado de anticuerpo
Añadir 100 µl de solución de trabajo de conjugado de anticuerpo a cada pocillo.
Cubrir la placa para evitar la contaminación y la evaporación.
Incubación
Incubar la placa de microvaloración a 37 °C durante 1 hora.
Lavado
Concluido el período de incubación, repetir el lavado según lo anteriormente
descrito.
Adición del sustrato
Añadir 100 µl de la solución de color a cada pocillo.
Agitar suavemente la placa e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
La adición de sustancia cromogénica debe efectuarse sin interrupciones. Mantener
la misma secuencia e intervalo de tiempo durante el pipeteo. Proteger la placa de
microvaloración de la luz del día, para evitar que se altere la intensidad del color.
Adición de la solución de parada
Al final del período de incubación, añadir 100 µl de solución de parada a cada
pocillo, pipeteándola en la misma secuencia en que se haya añadido el reactivo de
color.
La adición de solución de parada debe efectuarse sin interrupciones. Proteger la
placa de microvaloración de la luz del día, para evitar que se altere la intensidad del
color.
Lectura de la absorbancia
Utilizando un lector de microplacas equipado del filtro adecuado para efectuar
lecturas a 450 nm, medir la absorbancia de cada pocillo de ensayo.
Sesión nº 12
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Todas las lecturas deben efectuarse dentro de los 30 minutos siguientes a la adición
de la solución de parada.
Tomar nota de los resultados obtenidos y calcular los valores medios de
absorbancia, o recurrir a un programa informático.
Evaluación
Deben usarse los valores de los patrones para desarrollar una curva patrón. El valor
del blanco de ensayo deberá sustraerse de todos los valores de las muestras y
patrones de referencia. Se utilizarán los valores medios corregidos correspondientes
a cada punto de referencia duplicado para crear una curva patrón. Luego se
utilizarán los datos promedio de cada muestra duplicada para interpolar una
concentración a partir de dicha curva.
Criterios de aceptación o rechazo de un ciclo
Para tener validez, cada ciclo deberá satisfacer los criterios de aceptación o rechazo
del procedimiento. Un ciclo consistirá en lo siguiente: el blanco de ensayo, la
extracción de cada patrón GM de referencia positiva, el control negativo y cada
muestra desconocida. Todos los extractos de proteína y el blanco de ensayo se
utilizarán en duplicados. Si un ciclo no satisface los criterios de aceptación del
ensayo, deberá repetirse íntegramente.
Ciclo
Criterios
Blanco de tampón de ensayo
A450nm < 0,30
Patrón 0 % GM
A450nm < 0,30
Referencia 2,5 %
A450nm > 0,8
Todos los patrones positivos
CV de los duplicados < 15 %
Muestras desconocidas
CV de los duplicados < 20 %
Sesión nº 12
21
Diagrama de flujo
Diagrama de la extracción de la muestra y del patrón de referencia
Procedimiento
Volumen/peso
Descripción
Pesada
0,5 g
Pesar muestras, blanco de ensayo y patrones de
referencia
Adición
4,5 ml
Añadir el tampón de extracción
Mezclado
Mezclar la muestra con el tampón de extracción
hasta que quede homogénea
Centrifugado
5000 rpm
Centrifugar la muestra a 5000 rpm durante 15
minutos
Eliminar el sobrenadante y pasarlo a un tubo
limpio
Dilución
1:300 o 1:10 según Diluir las muestras y patrones de referencia
el material
investigado
Diagrama del procedimiento de inmunoensayo ELISA
Procedimiento
Volumen
Descripción
Adición
100 µl
Pipetear los extractos diluidos de muestras, patrones
de referencia y blanco tampón de ensayo en los
correspondientes pocillos
Incubación
Incubar 1 h a 37 °C
Lavado
Lavar 3 veces con tampón de lavado
Adición
100 µl
Incubación
Distribuir el conjugado de anticuerpo en cada pocillo
de ensayo
Incubar 1 h a 37 °C
Lavado
Lavar 3 veces con tampón de lavado
Adición
100 µl
Incubación
Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Adición
Medida de
absorbancia
Distribuir la solución de color en cada pocillo
100 µl
la
Distribuir la solución de parada en cada pocillo de
ensayo
Medir el valor de la absorbancia de cada pocillo en un
lector de placas a 450 nm
Sesión nº 12
22
Bibliografía
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Sesión nº 12
Alimentos
Apéndice
Ejemplo de programa de trabajo
(Base metodológica para un curso de una semana)
M. Querci
2
PRIMER DÍA: LUNES
9:00
Introducción del curso, presentación de los organizadores y participantes
9:30
Teoría: Introducción sobre los procedimientos generales para la detección de
OGM y contenido del curso
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS: EXTRACCIÓN DE ADN
10:00
Práctica: Extracción de ADN por el método del bromuro de cetil-trimetil
amonio (CTAB) (1ª parte)
10:30
Descanso
11.:00
Teoría: Electroforesis en gel para análisis de ácidos nucleicos
Práctica: Preparación de geles de agarosa
12:00
Práctica: Extracción de ADN por el método del CTAB (2ª parte)
13:00
Almuerzo
14:00
Práctica: Extracción de ADN por el método del CTAB (3ª parte)
15:15
Práctica: Aplicación de la muestra en geles de agarosa
16:00
Descanso
16:20
Teoría: Consideraciones generales sobre la organización de un laboratorio
de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Resolución de problemas, etc.
17:20
Práctica: Interpretación de geles de agarosa
Análisis de la presencia de organismos genéticamente modificados en muestras de alimentos
Apéndice
3
SEGUNDO DÍA: MARTES
PCR CUALITATIVA
9:00
Teoría: Introducción y utilización de la PCR para la detección de soja y maíz
transgénicos
9:30
Práctica: PCR para los productos transgénicos maíz MON810 y soja
Roundup Ready

Con especificidad de los vegetales: detección de los genes de la zeína y
de la lectina
10:15
Descanso
10:40
Preparación de geles de agarosa
11:00
Seminario: Muestreo y validación: conceptos básicos
12:30
Almuerzo
14:00
Aplicación de la muestra en geles de agarosa
14:30
Teoría: Características de la soja Roundup Ready y del maíz MON810 e
introducción de la PCR anidada específica de OGM
15:15
Interpretación de los geles de agarosa (PCR específica de zeína y lectina)
16:00
Descanso
16:15
Práctica: PCR para los productos transgénicos maíz MON810 y soja
Roundup Ready

Con especificidad de los OGM: detección del promotor 35S y del
terminador nos
17:00
Seminario: Introducción a la legislación europea sobre OGM
Apéndice
4
TERCER DÍA: MIÉRCOLES
PCR CUALITATIVA
9:00
Práctica: PCR anidada para la detección específica de los productos
transgénicos maíz MON810 y soja Roundup Ready (primera PCR)
10:00
Preparación de geles de agarosa
10:30
Descanso
11:00
Seminario: Ensayo de OGM y garantía de calidad analítica
12:00
Aplicación de las muestras en geles de agarosa (PCR del promotor 35S y del
terminador nos)
12:30
Almuerzo
13:30
Práctica: PCR anidada para la detección específica de los productos
transgénicos maíz MON810 y soja Roundup Ready (segunda PCR)
14:00
Interpretación de los geles de agarosa (PCR del promotor 35S y del
terminador nos)
15:00
Práctica: Preparación de geles de agarosa
15:30
Descanso
15:45
Práctica: Aplicación de las muestras de geles de agarosa (PCR anidada)
16:00
Teoría: Introducción de la PCR en tiempo real (RT-PCR) para la detección y
cuantificación de OGM
17:30
Práctica: Interpretación de geles de agarosa (PCR específica de los
productos transgénicos maíz MON810 y soja Roundup Ready)
Apéndice
5
CUARTO DÍA: JUEVES
PCR EN TIEMPO REAL (RT-PCR) CUANTITATIVA
9:00
Práctica: Cuantificación del ADN y preparación de muestras para la PCR en
tiempo real (RT-PCR)
9:30
Práctica: PCR en tiempo real (RT-PCR) para la detección específica de la
soja transgénica Roundup Ready utilizando:

el analizador LightCycler (de Roche) (Grupo 1)

el secuenciador ABI PRISM 7700 (de Applied Biosystems) (Grupo 2)
Descanso
13:00
Almuerzo
14:00
Práctica: PCR en tiempo real (RT-PCR) para la detección específica de la
soja Roundup Ready utilizando:

el analizador LightCycler (de Roche) (Grupo 2)

el secuenciador ABI PRISM 7700 (de Applied Biosystems) (Grupo 1)
15:30
Teoría: Análisis de datos: introducción a varios medios estadísticos
16:30
Descanso
17:00
Práctica: Continuación de la PCR en tiempo real (RT-PCR) para la detección
específica de la soja transgénica Roundup Ready
Apéndice
6
QUINTO DÍA: VIERNES
DETECCIÓN CUANTITATIVA DE SOJA ROUNDUP READY MEDIANTE ELISA
9:00
Teoría: Enfoque serológico de la detección de OGM
9:20
Práctica: ELISA, primera parte
10:00
Descanso
10:30
Seminario: Enfoque serológico de la detección de OGM
11:30
Práctica: ELISA, segunda parte
12:00
Almuerzo
13:00
Práctica: ELISA tercera parte
14:00
15:00
Seminario: Ámbitos de negociaciones internacionales sobre la seguridad del
uso de organismos genéticamente modificados
16:00
Debate general y conclusiones
Apéndice
Comisión Europea
DG Centro Común de Investigación, Instituto de la Salud y la Protección de los Consumidores
Titulo: Curso de Formación Sobre Análisis de La Presencia de Organismos Genéticamente
Modificados en Muestras de Alimentos - Manual del Participante
Editado por M. Querci, M. Jermini y G. Van den Eede
Luxemburgo: Oficina de Publicaciones Oficiales de las Comunidades Europeas
2007 – 238 pp. – 21 x 29,7cm
ISBN 978-92-79-04831-9
Resumen
El Instituto de la Salud y la Protección de los Consumidores del Centro Común de Investigación de la
Comisión Europea y el Programa de Seguridad Alimentaria dentro del Centro Europeo para el Medio
Ambiente y la Salud (División de Roma) de la Organización Mundial de la Salud han organizado
conjuntamente una serie de cursos de formación sobre «Análisis de la presencia de organismos
genéticamente modificados en muestras de alimentos».
El Centro Común de Investigación presta apoyo científico y técnico a las políticas comunitarias
colaborando con las direcciones generales de la Comisión Europea e interactuando con las
instituciones, organizaciones e industrias europeas mediante la formación de redes con laboratorios
de los Estados miembros. La tarea general del Centro Europeo para el Medio Ambiente y la Salud de
la OMS es prestar ayuda de forma completa y coordinada tanto a las autoridades como a los
ciudadanos europeos en el ámbito de la salud ambiental. Estos cursos de formación se inscriben en
la colaboración entre ambas instituciones para fomentar aspectos relativos a la inocuidad de los
alimentos en la región europea de la OMS, tanto dentro como fuera de las fronteras de la propia UE,
teniendo en cuenta especialmente los países candidatos a la adhesión a la UE, así como los países
de Europa central y oriental con economías de transición.
El objetivo de los cursos de formación es ayudar al personal de los laboratorios de control a
familiarizarse con las técnicas de detección molecular y a adaptar sus instalaciones y programas de
trabajo para permitir la realización de análisis que se ajusten a los actos normativos a escala mundial
en el campo de la biotecnología. Los cursos se destinan a enseñar técnicas de detección molecular a
personal de laboratorio con buen nivel de conocimientos analíticos, pero con poca o ninguna
experiencia en este ámbito concreto.
El Centro Común de Investigación se ha comprometido a proporcionar formación sobre la detección y
cuantificación de los OGM y, además de los cursos de formación, ofrece (y ha ofrecido en el pasado)
formación individual para necesidades específicas. Se ha pedido con frecuencia formación sobre este
tema debido a su importancia ante el aumento de la necesidad de cumplir la normativa europea, tanto
vigente como en fase de elaboración.
A lo largo de los años, la Unidad de biotecnología y OGM ha conseguido un profundo conocimiento
de los diferentes aspectos relativos a la detección y cuantificación de los OGM, y ha elaborado,
adaptado o validado métodos avanzados para su detección y cuantificación.
El conocimiento de estas técnicas se ha transferido a los laboratorios colaboradores mediante
publicaciones, proyectos conjuntos, formación individual o cursos específicos. También se han
explicado detalles técnicos a personal en formación mediante presentaciones verbales o breves notas
escritas. La Unidad de biotecnología y OGM, consciente de la necesidad de disponer de una fuente
permanente de información, ha redactado el presente Manual, que describe algunas de las técnicas
utilizadas en nuestro laboratorio.
A lo largo de los cursos se atiende a los siguientes temas:
extracción de ADN de materias primas y productos transformados
cribado de productos alimentarios para detectar la presencia de OGM mediante reacción en
cadena de la polimerasa, tanto simple como anidada
cuantificación de OGM en ingredientes mediante reacción en cadena de la polimerasa en
tiempo real
cuantificación de OGM en ingredientes mediante prueba de inmunoabsorción enzimática.
El Manual se ha preparado en el Instituto de la Salud y la Protección de los Consumidores del Centro
Común de Investigación, como información de base para los participantes en los cursos y con la
finalidad de proporcionar una información teórica y práctica sobre las metodologías y protocolos
utilizados en la actualidad. La materia abarca una amplia variedad de técnicas de detección,
identificación, caracterización y cuantificación de OGM, y se incluye información teórica que se
considera importante y básica para quien desee introducirse y trabajar en el campo de la detección de
OGM.
La misión del Centro Común de Investigación consiste en proporcionar apoyo científico y
técnico para la elaboración, el desarrollo, la aplicación y la supervisión de las políticas de la
Unión Europea, en función de su propia demanda. Siendo un servicio de la Comisión
Europea, el CCI funciona como centro de referencia en materia científica y tecnológica
para la Unión. Encontrándose próximo al proceso de elaboración de políticas, sirve al
interés común de los Estados Miembros, al tiempo que se mantiene independiente de
intereses particulares, ya sean privados o nacionales.
LB-X1-07-033-ES-C
Misión del CCI

Bajar el manual completo - EU-RL GMFF

Transcripción

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