Ortiz.G.(2011).

Transcripción

Ortiz.G.(2011).

Introducción a la Biotecnología 2011
IIB-UNSAM
Introducción a los
Bioprocesos
Gastón Ortiz
[email protected]
Introducción a los Bioprocesos
Una breve historia
Desde 5000 AC las civilizaciones egipcias y más tarde las
chinas comienzan a producir alimentos y bebidas
fermentadas.
Sin embargo, pasan casi 7000 años para descubrir el
origen microbiano de la fermentación (1856).
Otros 50 en utilizar las bacterias para producir compuestos
químicos industriales (1900).
70 años más para obtener el primer organismo transgénico
(1972).
Y 5 años más para la obtención de la primera proteína
humana expresada en bacteria. (somatostatina 1977)
¿Que es un bioproceso?
Es todo proceso industrial que involucra la manipulación
de organismos vivos o sus componentes celulares para
proveer bienes o servicios
Bienes: (antibióticos, hormonas, fermentos, vacunas,
ácidos orgánicos, amino ácidos, biocombustibles,
biomasa, etc.)
Servicios (biorremediación, biolixiviación, tratamiento
de efluentes)
De acuerdo a su definición tenemos: Bioprocesos
y biotransformaciones.
BIOPROCESO
Son los procesos mediante los cuales determinados SUSTRATOS
(nutrientes) son transformados por acción biológica (microorganismos,
células, tejidos) en BIOMASA y diversos PRODUCTOS
Biocatalizador
Glucosa + amonio + sales + oxígeno
BIOMASA + PRODUCTOS + calor
Moléculas sencillas
Moléculas complejas
Fuentes de carbono y energía, fuente de
Nitrógeno y sales
BIOTRANSFORMACIÓN
Antibióticos, drogas, vacunas, efluente
tratado, vitaminas, ácidos orgánicos,
aminoácidos, proteínas, hormonas,
Son los procesos en los que sustratos naturales o sintéticos
son MODIFICADOS por medio de una Actividad Enzimática
Enzimas,
células
inmovilizadas
Sustrato + agua
Moléculas complejas
Almidón
Sustrato modificado
Moléculas sencillas
Glucosa Fructosa
Un bioproceso se caracteriza entonces por:
Uso de un catalizador biológico: Enzima,
microorganismos, células vegetales, células
animales, células insecto, hongos filamentosos,
algas, plantas y animales
Uso de un Biorreactor: La reacción ocurre en
forma controlada
Artificial
Generación de un Producto o Servicio
Upstream Process
Downstream Process
Aspectos básicos de un proceso Biotecnológico
Upstream Processing
Elección del
microorganismo.
Preparación de medio
(Formulación).
Esterilización.
Preparación del inoculo.
Process
Elección del reactor.
Elección del sistema de
operación: Bacth; Alimentado;
Sistema Continuo; etc.
Estequeometría y cinética.
Instrumentación y control.
Downstream Processing
Recuperación del
producto por medio de
operaciones unitarias
(físicas/químicas)
Acondicionamiento y
estabilización del
producto
Formulación del producto
El microorganismo productor
Tenemos varias posibilidades
Partir del microorganismo productor wild type
Microorganismos modificados genéticamente
para tal fin.
Recurrir a sistemas de expresión heteróloga
Microorganismos productores wild type
Ventajas
Generalmente suele ser el mejor productor.
(seleccionado por la naturaleza)
La manipulación genética es mínima o nula, esto
nos ahora tiempo y dinero.
Posibles desventajas
Puede que no cumpla con las normas GRAS
(Generally recognized as safe)
Su utilización pueden presentar dificultades al
momento del escalado y etapas danwstream. Ej
hongos filamentosos.
Algunos microorganismos productores wild type
Ac. orgánicos
Alcoholes
Algunos microorganismos productores wild type
Antibióticos
Enzimas
Sistemas de expresión heteróloga
Son utilizados para la producción de proteínas
recombinantes
Ventajas
Sistemas preparados para una finalidad determinada
Amplia variedad de hospedadores
Gran variedad de herramientas moleculares disponibles
(vectores, marcadores de selección, etc.)
Desventajas
No siempre el producto final posee las mismas
características que el deseado.
Es por eso que debemos poner énfasis en elegir el mejor
sistema de expresión para nuestro fin
A tener en cuenta para la elección del sistema de expresión
Productividad (es difícil determinar a priori pero se un buen tip es
comenzar con una búsqueda de bibliografía)
Complejidad estructural
Modificaciones postraduccionales
Bioactividad de la proteína de interés
Manipulación del sistema de expresión
Bioseguridad del sistema de expresión
Sistemas de expresión heteróloga:
Escherichia coli
Ventajas
Alta tasa de crecimiento
Amplio conocimiento de su genética y fisiología
Fácil manipulación genética: gran variedad de vectores y cepas disponibles,
alta eficiencia de transformación, etc)
Fácil de cultivar
Bajo costo de cultivo
Alta acumulación de proteínas recombinantes (30% del total celular).
Lisis y recuperación relativamente sencilla
Desventajas
No es GRAS
Contaminación con endotoxinas
Proteínas intracelular con formación de cuerpos de inclusión
No posee modificaciones postranducionales
Escherichia coli
Desventajas
No todos los genes se expresan eficientemente debido a:
Características de la secuencia nucleotídica del gen endógeno.
Estabilidad y eficiencia traducción del RNAm
Diferencias de uso de determinados codones de
Deficiencia en el folding proteico, capacidad limitada de formación de
puentes S-S.
Toxicidad de la proteína recombinante
No es GRAS
Contaminación con endotoxinas
Proteínas intracelular con formación de cuerpos de inclusión
Generalmente se requiere un refolding de la proteína
No posee modificaciones post-traduccionales
Levaduras: (S. cerevisiae, K. lactis y P. pastoris)
Ventajas
Unicelular eucariota, fácil crecimiento y manipulación
Capacidad para realizar modificaciones postraduccionales
(glicosilación, acetilación, fosforilación, eliminación del Met1, procesamiento proteolítico de precursores)
Fácilmente escalable
Bajo o nulo nivel de endotoxinas
Proteínas extracelulares e intracelulares
Desventajas
Baja eficiencia de transformación
Hiperglicosilación (S. cerevisiae principalmente)
Crecimiento microbiano
En un medio de cultivo apropiado los microorganismos se dividen
hasta que algún nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato
limitante)
También puede detenerse el crecimiento por acumulación de
alguna substancia inhibidora formada por los mismos
microorganismos.
Hay dos aspectos claramente diferenciables que nos permiten
interpretar al crecimiento microbiano ya sea en un erlenmeyer como
en un reactor:
Estequiométrico:
Nos permite conocer la concentración final de microorganismos a
obtener a partir de datos de la composición del medio de cultivo,
saber si hay formación de algún producto, etc.
Cinético:
Nos dice con qué velocidad se lleva a cabo el proceso.
Crecimiento microbiano (Estequiometría)
Rendimientos
Dada la ecuación de crecimiento microbiano
S FCE + N FN + B O2
X Biomasa + P Producto + W H2O + C CO2
Para poder conocer la Estequiometría del proceso es necesario conocer los coeficientes
(S, N, B, X, P, W y C) para ello introduciremos el concepto de:
Rendimiento: Se define como la cantidad en gramos de producto formado (biomasa,
EtOH, CO2,H2O etc) o reactivos consumidos (FN, Oxigeno), sobre gramos de fuente de
carbono y energía consumida FCE (glucosa, glicerol, etc)
Por que el signo
negativo ?
Como seria el rendimiento para el nitrógeno ?
El carbono mol (C-mol)
Si deseamos efectuar cálculos estequiométricos debemos conocer el
rendimiento en moles.
La pregunta es ¿qué peso de células (o biomasa) corresponde a "un mol"?.
Experimentalmente se vio que la composición elemental promedio de un
microorganismo es en (% p/p): C = 46.5; H = 6.49; 0 = 31.0; N = 10.85
De la cual podemos definir una "fórmula mínima": CH1.79O0.5N0.2 (en la que
está representado el 95% p/p de la biomasa el otro 5% son sales)
Entoces definimos un C-mol de biomasa como la cantidad de biomasa que
contiene un átomo gramo de Carbono.
Podemos definir 1 C-mol de FCE: Ej 1C-mol de glucosa (C6H12O6) esta
representado por CH20 y pesará 30 g
En general para obtener los gramos de 1C-moles de un compuesto dado
es:
Cn Hf Oq Nm
C Hf/n Oq/n Nm/n
12+ f/n + 16.q/n + 14.m/n
Donde σX tiene unidades de (cmol/g) de X
Donde σS tiene unidades de (cmol/g) de S
Ecuación de crecimiento y balances de materia
Balance de Carbono: Puesto que los rendimientos están referidos
a 1 C-mol de fuente de Carbono y energía, resulta
¿Como seria el balance de materia para el Nitrogeno?
Tarea plantear los
balances para el resto
de los componentes
Hidrogeno y Oxigeno
¿De que factores de pende el rendimiento celular? Ayuda. fórmula mínima
de la biomasa: CH1.79O0.5N0.2
• Yx/s es f (FCE, FN) y de cómo son estos son metabolizados
• De la naturaleza microorganismo y como este aprovecha dichas fuentes
Crecimiento microbiano (Cinética)
Velocidades volumétricas y especificas
Donde
µ = rx/X
Los rendimientos pueden expresarse como
cocientes de velocidades
Y x/s = rx/rs = µ/qs
• Como se ve r1 (t1) = r2 (t2), esto
nos llevaría a pensar que el
microorganismo consume FCE a
la misma velocidad en ambos
tiempos. Esto es engañoso por
que al final del cultivo hay mas
células
•A diferencia de las velocidades
volumétricas, las velocidades
especifica nos dan idea de lo que
ocurre en el cultivo
Ecuación de Monod dependencia de µ con el Sustrato limitante
El sustrato limitante es aquel que controlara la velocidad de crecimiento
del microorganismo. Ojo no necesariamente tiene que ser la FCE
Monod estudio la dependencia del µ con el sustrato limitante y encontró
que la incorporación de un sustrato limitante a la célula sigue una
cinética del tipo de Michaelis-Menten
Supuestos de Monod
•El proceso difusión del sustrato limitante
es rápido comparado con la cinética de
crecimiento
•El sustrato es metabolizado por una
única E que controla la velocidad de todo
el metabolismo
•El proceso sigue la cinética de
Michaelis-Menten
¿De que factores depende el µ ?
La composición del medio de
cultivo (FCE, FN) afectan al µ
El sustrato limitante
S >> Ks µ = µm
S<< Ks µ = f (S)
¿De que factores depende el µ ?
pH
10 g/l FCE
Mantenimiento celular
Vimos que el rendimiento celular puede expresarse como
Y x/s = rx/rs = µ/qs
Pero esta ecuación solo nos dice que el consumo de sustrato
solo es posible cuando hay crecimiento.
Pregunta: ¿puede ocurrir consumo de sustrato sin que se
produzca crecimiento (generación de biomasa)?
Resp. Si por que el microorganismo debe mantener su
homeostasis.
A este consumo de FCE sin crecimiento de biomasa se lo
conoce como mantenimiento celular (propuesto por Pirt)
rs = r’s + ms.X
Otra forma de la ecuación de Pirt
Ecuación de Pirt
qs = (µ / Y’x/s) + ms.X
Divido por µ .X
1/Yx/s = (1
1 / Y’x/s) + ms/µ
µ
Y’x/s es el rendimiento máximo teórico el que tendría si no hay
mantenimiento celular en tanto que el Yx/s es el real el que mido
Mantenimiento celular
¿Qué factores afectan el mantenimiento?
Ayuda
(qs - (µ / Y’x/s)) / X = ms
Resp. Todos los factores que afectan al µ y al Y’x/s
Temperatura,
pH
Composición del medio de cultivo particularmente
naturaleza del sustrato limitante (recordar la
dependencia de µ con S “Monod” )
Presión osmótica
Transferencia de Oxigeno. Modelo de la Película
¿Como llega el oxigeno al
microorganismo?
1°debe este disolverse en el líquido
(Burbujas). Ley de Henry
(PO2 = H.C*)
2°debe transferirse desde la burbuja al
microorganismo. Ley de Fick
(JO2 = -DO2 .(dC/dX))
El modelo que combina estos dos
principios es el modelo de la película,
este nos dice
Que existe una película estanca de
líquido alrededor de la burbuja en donde
la transferencia de materia sigue la ley
de Fick
La fuerza impulsora de esta
transferencia es la diferencia de
Concentraciones entre el seno del liquido
y la Burbuja
Transferencia de Oxigeno Kla
Fick
Henry
C* = PO2 / H
JO2 = -DO2 . (dC/dL)
Transferencia de Oxigeno.
Factores que afectan al Kla.
Agitación: si aumenta la agitación aumenta el Kla por que:
Disminuye el espesor de la película (pendiente mas pronunciada)
Disminuye el tamaño de la burbuja el área volumétrica (A)
aumenta.
Viscosidad del cultivo: si aumenta la viscosidad disminuye el
Kla por que:
Aumenta el espesor de la película
Temperatura: el Kla aumenta con la raíz cuadrada de la
temperatura, dado que el coeficiente de difusión aumenta con la
temperatura.
Detergentes: aumentan el Kla dado que disminuyen la tensión
superficial forman burbujas mas chicas aumenta el área
volumétrica de transferencia
Antiespumantes: estos aumentan la tensión superficial,
burbujas mas grandes, disminuye el Kla
Consumo de Oxigeno
Bueno sabemos que:
El suministro de oxigeno esta dado por Ro2
La velocidades de consumo de un sustrato limitante esta dada por la
ecuación de Monod.
Al valor al cual C >> Ko se lo conoce como Cc (critico) y tiene un valor
del 15% de C*,en estas condiciones qo2 es independiente del oxigeno
disuelto.
Por lo que para que el microorganismo no note la falta de oxigeno,
es decir no se limite en oxigeno.
El suministro debe igualar durante todo el transcurso del cultivo a la
velocidad de consumo de oxigeno ro2 max o qo2 max.
Para que esto suceda el Kla de nuestro reactor tiene que cumplir con
la siguiente igualdad.
Kla = ro2 max / (C* - Cc)
Transferencia de Oxigeno
Equipo
Tubo de ensayo sin agitación
Erlenmeyer de 1000 ml, con 10% de su
capacidad y agitación
Reactor tipo tanque agitado
Kla
10
50-150
100-1000 según la
agitación
Tipo Celular
µmax
Kla apropiado
Cél. Animales
0.01-0.04
1-25
Cél. Vegetales
0.007-0.03
20-30
Bacterias
0.6-1.4
100-1000
Levaduras
Hongos filamentosos
0.2 - 0.6
100-1000
Bioreactores
Como ya se menciono anteriormente, el equipo donde se realiza el
proceso se denomina biorreactor o fermentador,
El mismo debe garantizar un ambiente uniforme y adecuado para el
desarrollo de los microorganismos
Para eso un biorreactor debe poseer:
Sistema de Mezclado:
Sistema de Termostatización:
Debe suministrar oxígeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo
Sistema de Esterilidad:
Debe mantener constante y homogénea la temperatura.
Sistema de Oxigenación:
Debe mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen de
cultivo a fin de prevenir la sedimentación o la flotación.
Minimizar los gradientes de concentración de nutrientes.
El diseño debe ser tal que permita mantener el cultivo puro (acero pulido reactores
de mas de 100 l o vidrio menor volumen).
Fácil de limpiar y de esterilizar (por calor húmedo preferentemente)
Mantener la asepsia durante el transcurso del cultivo (filtros de aire)
Sistema de Control y Automatización:
Debe garantizar las condiciones estables de pH, O2, agitación y temperatura como
mínimo, también puede controlarse el volumen por medio de la alimentación, nivel
de espuma, etc.
Biorreactores de uso mas frecuentes
Tanque agitado
Ventajas
Alta flexibilidad de operación
(controlada por agitación y flujo
de gas).
Desventajas
Mecánicamente complejos
(agitador, eje, sellos, etc.).
En muchas ocasiones provocan
alta cizalladura.
Transferencia de O2 limitada
por el diseño de las paletas
Difíciles de limpiar; mayores
posibilidades contaminación en
operaciones extendidas
Air Lift
Características
Estructura sencilla.
Agitación por inyección de aire.
Separación física de las corrientes
ascendentes y descendentes.
Adecuado rendimiento de
transferencia de materia y calor.
Bajo shear.
Usos:
Cultivo de células animales, vegetales,
procesos con catalizadores inmovilizados,
producción de proteínas unicelulares a
partir de metanol y tratamiento de aguas
residuales.
Columna de burbujeo
Características
Estructura sencilla.
Agitación por inyección de aire.
Bajo shear.
Adecuado rendimiento de transferencia de
materia y calor.
Bajo costo.
Usos:
Producción de levaduras de panificación,
cerveza, vinagre, tratamiento de aguas
residuales.
Biorreactores
Agitación mecánica (Tanques
agitados)
Agitación neumática (Airlift, y
Columnas de burbujeo)
Mecánicamente complejos (agitador,
eje, sellos, etc.)
Mecánicamente simples y robustos
En muchas ocasiones provocan alta
cizalladura
Muy baja cizalladura, adecuados para
cultivos frágiles
Carga de gas limitada
por inundación del impelente
Flexibilidad de operación (controlada
por velocidad impelente y flujo de
gas)
Difíciles de limpiar; mayores
posibilidades contaminación en
operaciones extendidas
En medios no-Newtoniano se crean
canales de gas a través de zona
impelente
Posibilidad de admitir altas cargas de gas
(especialmente los airlift)
Limitada flexibilidad. Requieren de un
diseño más cuidadoso
Fáciles de limpiar, posibilitan operación
aséptica extendida
Distribución más uniforme de la turbulencia
Sistemas de operación o de cultivo
Llamamos así al modo de operar el biorreactor, este puede
ser de forma continua o discontinua.
Suponemos mezclado
perfecto
Balance de materia
Velocidad de
acumulación
Velocidad de
Velocidad de
salida
consumo
Velocidad de
Velocidad de
formación
ingreso
Acumulación de volumen
Dependiendo como sean F1 y F2 tenemos tres
tipos de cultivos.
Opera en continuo
• Si F1 = F2 Tenemos un Cult. Continuo.
• Si F1>0 y F2=0 Tenemos un Cult. Alimentado.
Opera en discontinuo
• Si (F1 y F2)= 0 Tenemos un Batch.
Cultivo en batch
Es el cultivo mas simple
Se realiza a volumen constante
La composición inicial del medio de cultivo determina el curso del cultivo
Ecuación de diseño de un batch
En un Batch tenemos que
F1 = F2 =0
Por lo que
Entonces el balance de materia nos queda
Como V= cte
Batch
= 0 = cte
Descripción matemática del Batch en fase
exponencial
¿Para que nos sirve todo esto?
Para calcular el tiempo que nos
demandara el proceso.
Descripción matemática del Batch limitado en
Oxigeno
¿Que sucede si el cultivo se nos limita en Oxigeno?
¿los microorganismos continúan creciendo?
¿el tiempo del proceso se verá afectado?
Resp. 2: Sí , el tiempo del
Resp. 1: Sí, continúan creciendo.
proceso será mayor ¿Por
En estas condiciones el
qué?
microorganismo continua creciendo
pero quien manda a que velocidad
debe hacerlo es el sustrato limitante
en este caso el Oxigeno
Características de un cultivo batch
La duración del cultivo batch depende
esencialmente de las condiciones iniciales del
cultivo.
Una vez inoculado el medio, la concentración de
biomasa aumenta a expensas de los nutrientes
disponibles.
Cuando el sustrato que limita el crecimiento se
agota, finaliza el batch.
El crecimiento puede cesar también por la
acumulación de algún producto toxico. (esto se puede
solucionar con un cultivo continuo)
Cultivo continuo
Batch
Se inicia
con un
batch
Cult. continuo
Ecuación de diseño de un cultivo continuo
Cult. continuo
En un C. Continuo tenemos que F1 = F2 = F
Por lo que
= 0 = cte
V= cte
El balance de materia nos queda
Despejando V
En el estado estacionario
Donde D = F / V y es la
velocidad de dilución.
Balances de materia en continuo
Biomasa
Sustrato: Para el sustrato tenemos
El sustrato limitante es quien controla la velocidad de
crecimiento en el C.C, por lo que podemos escribir la
ecuación de Monod en términos de la velocidad de
dilución D
Combinando los balances de Biomasa y Sustrato tenemos la
dependencia de X con D
Balances de materia en continuo
Combinando los balances de Biomasa y Sustrato en el estado
estacionario, tenemos la dependencia de X con D.
Nos dice que cual será la concentración de biomasa en el estado
estacionario
Situación real
cuando tengo
mantenimiento
Velocidad
óptima de
operación 80%
del µmax
Dc
Dilución critica
cuando el D es
igual al µmax
Cultivo continuo
Aplicaciones del cultivo continuo
Permite obtener los parámetros de crecimiento µmax, ms,
Ks, Y’x/s, entre otros.
Permite realizar estudios fisiológicos.
Podemos discriminar los efectos de la velocidad de
crecimiento µ, de la composición del medio de cultivo y del pH
y la Temperatura, sobre la fisiología celular del
microorganismo.
Permite realizar estudios de ingeniería metabólica.
Inconvenientes del cultivo continuo
Inestabilidad genética de la cepa en cultivos extendidos
(perdida de plásmidos)
Riesgos de contaminación en cultivos extendidos.
Cultivo Batch Alimentado
En este tipo de cultivos el volumen
varia con el tiempo debido a la
alimentación esto permite mantener
controlada la concentración “Ci”
dentro del reactor.
El objetivo de este cultivo es
Al igual que el continuo es evitar la acumulación de
productos tóxicos o inhibitorios
Controlar la velocidad de crecimiento µ de forma constante
(alimentado exponencial) o por debajo de cierto valor
(alimentado lineal)
Incrementar la obtención de productos como intermediarios
del metabolismo primario y proteínas recombinantes
Maximizar la producción de biomasa o de proteínas
unicelulares.
Productos
Productos de bajo peso molecular: alcoholes,
ác. orgánicos, aa, nucleótidos, antibióticos, etc.
Tipo I: Productos finales del catabolismo anaeróbico
Tipo II: Intermediarios del metabolismo primario
Tipo III: Productos del metabolismo secundario
Productos de alto peso molecular:
polisacáridos, proteínas, antígenos, enzimas etc.
Productos Tipo I (productos finales del
catabolismo anaeróbico)
En este grupo tenemos: etanol, acido láctico, acético, butírico,
butanol y otros compuestos asociados a procesos anaeróbicos.
Su formación es consecuencia directa de la degradación FCE
acoplada a la producción de ATP por fosforilación al nivel del
sustrato.(proceso anaeróbico)
Siguen una cinética qp =αµ + β
Donde β es directamente proporcional al ms y α con
1/Y’x/s.
Por lo que para este tipo de productos busco:
Que el mantenimiento sea grande, por ejemplo vario temperatura
o tonicidad del medio.
Que m se lo mas pequeño posible, lo logro por ejemplo limitando
en Nitrógeno al cultivo.
En definitiva busco un Y’x/s bajo de forma tal que todo el sustrato
sea destinado a la formación de productos
Productos Tipo II (Intermediarios del
metabolismo primario)
En este grupo tenemos: aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y
ácidos orgánicos provenientes del ciclo de krebs.
En este caso los procesos de obtención son aerobios.
A diferencia de los productos tipo I, no existe una dependencia
directa entre la FCE y la obtención del producto.
Al ser compuestos intermediarios del metabolismo primario,
los microorganismos mas utilizados son los modificados
genéticamente y estos se combinan con un buen sistema de
cultivo (generalmente batch alimentado o cultivo continuo).
Ejemplo: producción de lisina por Corynebacteriuin
glutamicum mutante en homoserina deshidrogenasa
auxotrofo para metionina y treonina
Productos Tipo II (Ej. producción de lisina)
La estrategia para obtener
lisina consiste en:
Realizar el cultivo en
condiciones tales que la
concentración de treonina
libre sea mínima. ¿Cómo se
logra esto?
Limitando el cultivo en
treonina (batch alimentado
exponencial o cultivo
continuo)
Esto nos demuestra lo
importante que resulta la
elección del sistema de
cultivo adecuado para
nuestra cepa.
Retroinhibición
concertada
Auxotrofo
Productos Tipo III (Metabolitos secundarios)
En este grupo tenemos: antibióticos, las toxinas, los alcaloides y las
giberelinas.
Frecuentemente los precursores específicos para la biosíntesis de estos
productos son obtenidos por modificación de metabolitos primarios.
Estos precursores suelen ser limitantes de la biosíntesis.
Estos productos requieren un gasto de ATP adicional por lo que es conveniente
que el ms sea lo menor posible.
Por otra parte las fuentes de nitrógeno fácilmente metabolizadas como sulfato
de amonio no son recomendables, en su lugar se utiliza harina de soja.
Los productos de este grupo se forman cuando los microorganismos crecen a µ
bajos.
Es conveniente contar con microorganismos deficientes en los mecanismos de
regulación de la síntesis de los precursores.
A µ altos las enzimas asociadas al metabolismo secundario se encuentran reprimidas
(represión catabólica)
Finalmente estos tipos de productos producen un feed back negativo (su
acumulación inhibe su síntesis)
Pregunta: ¿que sistema de cultivo elijo para este tipo de productos?
El cultivo continuo o bath alimentado, ya que con esto puedo controlar el µ y mantener
a raya el feed back negativo del producto
Resumen productos Tipo: I, II y III
Producto
I
II
III
Biomasa
Tipo cultivo
¿ms?
¿µ
µ?
Sistema de cultivo
Anaerobio
Alto
Bajo
Batch limitado en
nitrógeno
Batch alimentado
Cultivo continuo
Aerobio
Alto o Bajo
(depende del
producto)
Bajo
Batch alimentado
Cultivo continuo
Aerobio
Bajo
(la formación de
producto consume
energía)
Bajo
Batch alimentado
Cultivo continuo
Bajo
Alto
(siempre y cuando a m
altos no forme
productos).
Ej. efecto crabtree en
S. cereviciae
Batch alimentado
Aerobio
Productos de alto peso molecular
En este grupo tenemos: polisacáridos, proteínas,
antígenos, enzimas, etc.
Es importante entender la cinética de formación le estos
productos, para ello definimos:
La concentración intrínseca de nuestro producto i (enzima,
antígeno, etc) se define como: (Ri = Xi/X)
Donde Xi es la cantidad de producto que obtenemos g.proteínas, UE, etc y X son los g.biomasa.
Por otra parte la velocidad neta de formación de nuestro producto será igual
a lo que se forma menos lo que se degrada.
La variación de la concentración intrínseca en el tiempo es:
Tenemos dos factores que afectan a Ri
La velocidad neta de producción
La velocidad con la que se diluye (µ.Ri)
Productos de alto peso molecular
Para maximizar su producción
Entonces
Es decir quiero un crecimiento balanceado, en donde
la velocidad de producción debe ser igual a la de
dilución
¿Cómo lo logro?
Experimentando a varios
D en un continuo
K. lactis limitado en lactosa
D (h-1)
Ri (UE/mg.biomasa)
0,1
8,25
0,25
18,3
Enzima inducible en
K. Latis
1. SEPARACIÓ
SEPARACIÓN CELULAR
remoció
remoción del
componente má
más
abundante
Es muy importante la elecció
elección del
PASO INICIAL, ya que es el que debe
eliminar la mayorí
mayoría de los
contaminantes. Los pasos
subsiguientes son empleados para
eliminar los contaminantes de menor
importancia
Intracelular
2. DISRUPCIÓ
DISRUPCIÓN CELULAR
3. REMOCIÓ
REMOCIÓN DE RESTOS CELULARES
Y DESECHOS
Extracelular
4. CONCENTRACIÓ
CONCENTRACIÓN
5. PURIFICACIÓ
PURIFICACIÓN DE ALTA RESOLUCIÓ
RESOLUCIÓN
6 ACABADO
1. Remoción celular: centrifugación y filtración.
2. Disrupción celular y separación de restos celulares:
•
•
Homogenizadores: La técnica más recomendada para alta escala son los
homogeinizadores (Gaulin homogenizer).
•
Operan a densidades celular del 15 a 20 % del peso seco.
•
La concentración celular no afecta la eficiencia
•
Es necesario refrigerar (4-5ºC)
Los modelos más grandes operan a 6,000 L/h (levaduras y bacterias)
•
•
Molinos de perlas
•
Las células se rompen mediante la abración generada por pequeñas perlas de vidrio
(0.3-0.4mm φ)
•
concentración de células afecta la eficiencia, la concentración óptima ∼ 30-60% peso
húmedo
•
Los modelos mas grandes operan a 2000 L/h
Ruptura química o enzimática
•
Limitado a baja escala (Lysozyme, Triton, otras)
3. Separación de restos celulares
•
centrifugación (no adecuada)
•
Ultrafiltración (300,000 – 500,000 o mayor)
•
Microfiltración (0.1µ m.)
•
Partición en dos fases acuosas
•
CDR (cell Debris Remover: Whatman)
4. Concentración
•
Los productos deben concentrarse hasta 10-50 veces.
•
Técnica preferida : Ultrafiltración
•
partición líquido-líquido. Extracción con solventes
•
Precipitación (sulfato de NH4)
•
Evaporación o destilación
Purificación de alta resolución
5.
•
•
•
•
Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)
Cromatografía de intercambio iónico de alta
resolución
Cromatografía de afinidad
Cromatografía metal quelante (IMAC)
Acabado
6.
•
•
Esterilización y estabilización del producto
Deshidratación, liofilizado, estabilización (sales)
¿Cómo elegimos las operaciones y la secuencias ?
Utilizando de las reglas de oro de la purificación
REGLA 1 “Elegir procesos de separación basados en diferentes
propiedades físicas, químicas o bioquímicas”
REGLA 2 “Separar las impurezas más abundantes primero”
Es importante eliminar el agua en las primeras etapas del proceso.
Tratar de reducir el material de trabajo hasta un 90% del volumen inicial
REGLA 3 “Seleccionar un procesos que permita aprovechar al
máximo las diferencia entre las propiedades fisicoquímicas del
producto y los contaminantes.
Se deben conocer las propiedades del producto y de las principales
impurezas
REGLA 4 “Realizar las separaciones más caras y difíciles al
final”
KEEP IT SIMPLE!
Bibliografía
Microbiología Industrial. Rodolfo Ertola,
Osvaldo Yantorno y Carlos Mignone.
Encyclopedia of Bioprocess Tech [Vols 1-5,
Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation]
- M. Flickinger, S. Drew (Wiley, 1999)
Bioprocess Engineering Principles. Pauline M.
Doran
Cat. de Biotecnología - Bioprocesos II UNQUI
Cat. de Ingeniería bioquímica UNLP

Ortiz.G.(2011).

Transcripción

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