fiebre tifoidea

BIOMEDICA
Vol. 1. No. 2
- 1981
FIEBRE TIFOIDEA
DIAGNOSTICO POR PRUEBAS INMUNOENZIMATICAS: ELlSA
Este trabajo describe el desarrollo y normalización de una
técnica inmunoenzimática para el diagnóstico indirecto de la
Fiebre Tifoidea. El método permite u n análisis simple y objetivo
de los resultados. La reacción enzimatica es proporcional a la
concentración de anticuerpos en el suero contra el antígeno
somático-0, por tanto, el método es cuantitativo. Por lo demas. la
técnica tiene un alto grado de especificidad para Salmonella
typhi, ya que los sueros de pacientes con Salmonelosis causada
por Salrnonella enteritidis serotipos paratyphi A, B y
typhimurium dieron resultados negativos, en forma similar a los
presentados por el grupo control antes de la vacunación
específica.
Los resultados obtenidos con esta thcnica permitieron definir el
nivel de anticuerpos que puede presentar una población control
supuestamente sana frente a los niveles inducidos por la
enfermedad. Los resultados postvacunales en el grupo control
mostraron títulos sorprendentemente bajos; un analisis de este
fenómeno se presentó'en forma amplia. Igualmente se proponeq
futuras investigaciones sobre este campo.
INTRODUCCION
problemas de normalización e interpretación
que la hacen de poca utilidad. cuando no d e
caprichosos resultados, llegándose a que su
confiabilidad sea cuestionada por numerosos autores (4.5).
La fiebre tifoidea continúa siendo un
problema de salud pública para vastas
zonas del mundo (1).El diagnóstico de esta
entidad exige la confirmación por el laboratorio mediante el aislamiento e identificación
Muchos procedimientos serológicos s e han
del agente causal. Las pruebas indirectas explorado en los últimos años buscando
mediante la determinación y cuantificación sencillez, sensibilidad y especificidod en la
de anticuerpos circulantes específicos con- medición de la afinidad d e un suero por su
tra los determinantes antigénicos del micro- antígeno homólogo (6.7). El desarrollo y
organismo son obviamente útiles y se han avance acelerado de las técnicas iumunovenido utilizando desde la instroducción de euzimáticas (71 hace suponer, que pueda
las técnicas de aglutinación de Widal ( 2 . 3 ) . utilizarse ventajosamente un procedimiento
Sin embargo. esta técnica tiene serios similar para el diagnóstico indirecto de la
Fiebre Tifoidea.
Irfe Sección Diagnóstico, Investigación y Referencia.
Instituto Nacional de salud.
Jefe, Grupo de Bioquimica. Sección Diagnóstico,
~
~
~
~ y ~~ t ~ i
~f ~ , ,~~~t i t~, , t~~~i
ó~ ~~de
~
salud.
El presente trabajo tiene por objeto
presentar el desarrollo y normalización d e
un
inmunoenzimático
p a r a tal
~~ procedimiento
i i ~ ~.
~
~
l
fin.
MIGUEL G U Z M A N . MOISES WASSERMAN
MATERIALES Y METODOS
Preporoción d e los sueros:
Para conformar la población problema
fueron aceptados e n el estudio los pacientes
con un cuadro clínico d e Fiebre Tifoidea y
de Salmonelosis por Solmonello enteritidis,
serotipos paratyphi A, B y typhimurium,
comprobado por hemocultivo positivo con
aislamiento e identificación bioquímica y
serológica del agente etiológico. A cada uno
de estos pacientes s e le tomó una muestra d e
sangre de 10 cc. Luego de la retracción del
coágulo el suero fue retirado asepticamente,
adicionado d e azida d e sodio (1 mg/ ml) y
guardado p a r a procesamiento posterior.
Con el objeto de tener un grupo control, se
conformó un grupo de 100 voluntarios,
aparentemente sanos, a quienes s e les hizo
una historia clínica, seleccionándose entonces. aquellos que no tuvieron antecedentes
sospechosos de haber padecido Fiebre Tifoidea. A cada uno de ellos se le tomó una
muestra d e 10 cc. de sangre la cual fue
procesada como en el caso anterior. Inmediatamente después de la sangría s e inyectaron por vía sub-cutánea con una dosis de 0.5
cc. de vacuna antitifoidea [INS). Una segunda dosis les fue aplicada 15 días después.
Pasados 30 días de esta segunda inoculación
se tomó una segunda muestra d e sangre la
cual s e procesó como s e indicó antes.
Cepa:La cepa utilizada p a r a la extracción
del antígeno somático 0 fue una cepa d e
Solmonello typhi la No. 224 aislada y
estudiada por la Unidad de Enterobacterias
del Instituto Nacional d e Salud [INS).
Vocuno: La vacuna utilizada en este
estudio fue una preparación del Instituto
Nacional de Salud (INS), la cual contiene por
dosis de 1 ml., 109 microorganismos muertos
(8).
Otros materiales uti1izados:IgG purificada
a partir de un suero monoespecífico anti IgG
humano obtenido en cabra: producido por la
Unidad de Inmunoquímica del I.N.S.
Fosfatasa alcalina [Tipo VII); Paranitrofeni1 fosfato; Dietanolamina y fenol: Sigma
Chem. Co. Louissiana U.S.A. Glutaraldehido
8% grado para microscopía electrónica:
Polysciences-Paul Valley U.S.A. Tween 20:
Serva. Heidelberg. Medio de Cultivo y Caldo
tripticase de soya: Difco. Michigan. U.S.A.
Placas de microtitulación p a r a ELISA:
Dynatech-Alexandria, VA. U.S.A.
Preparación d e Antígeno:
Para la obtención y purificación del
antígeno somático O, d e Solmonella typhi s e
cultivó sobre a g a r nutritivo una cepa tipo d e
Solmonello typhi. Luego d e comprobarse un
adecuado crecimiento s e seleccionó una
colonia la que, suspendida asépticamente en
10 m1 de caldo estéril d e tripticase de soya,
s e incubó por 18 horas a l término d e l a s
cuales y t r a s comprobarse un buen crecimiento s e utilizó como cultivo base p a r a
inocular 1 ml. por c a d a fiola de 1 L.
conteniendo 300 ml. de caldo estéril d e
tripticase d e soya. Luego d e u n a incubación
a 37°C por 18 horas, se removió asépticamente d e cada fiola u n a muestra p a r a
determinar por cultivo y pruebas bioquímicas la pureza d e los mismos. Los cultivos
fueron centrifugados a 10.000 xg. 30 minutos
en centrífuga MSE Highspeed 18 refrigerada. Las células bacterianas sedimentadas,
fueron resuspendidas en un volumen apropiado de solución salina estéril y lavadas por
tres veces consecutivas. Luego s e resuspendió el sedimento en 15 C.C. de agua destilada
estéril. Esta operación s e realizó a 4°C. Para
la extracción del polisacárido s e utilizó una
modificación (9) d e la técnica d e Westphal
(10): el material anterior fue mezclado con
10 volúmenes d e acetona a -2OSC, manteniéndose a esta temperatura por 60 minutos,
con eventuales agitaciones: posteriormente
s e centrifugó a 2.000 xg por 15 minutos y el
sedimento s e resuspendió y centrifugó para
lavarlo con 5 volúmenes de acetona fría. El
sedimento se dejó secar a temperatura
ambiente y s e trituró en un mortero estéril
de porcelana. El producto así obtenido fue
resuspendido en agua destilada a una
concentración del 6% [peso/volumen). Esta
mezcla fue homogenizada y calentada en
baño de agua basta los 65%. s e le adicionó
un volumen igual de una solución 90% d e
fenol en agua y se continuó su calentamiento
a 6 5 ° C . bajo agitación constante, por 5
FIEBRE TIFOIDEA
-
DIAGNOSTICO POR PRUEBAS
minutos. La mezcla fue luego enfriada a 0°C
y centrifugada a dicha temperatura a
2.000 xg utilizando un color horizontal.
Con la anterior operación se logró la
separación nítida de dos fases lo cual
permitió remover cuidadosamente la fase
acuosa que es la que contiene el lipopolisacárido, esta fase fue exhaustivamente dializada contra agua destilada con el objeto de
remover el fenol contaminante. La solución
así purificada se centrifugó a 100.000 xg por
4 horas, obteniéndose en el sedimento el
lipopolisacárido en forma de un gel el cual
fue resuspendido en un volumen adecuado
de agua destilada estéril y lavado en forma
similar al proceso anterior por dos veces. El
sedimento final fue resuspendido en agua
destilada, liofilizado y conservado para su
utilización posterior.
Preparación del Conjugado:
El conjugado de anti-IgG-humana con
Fosfatasa Alcalina fue preparado según la
técnica de Voller y col. (111, utilizando
y-globulina anti-IgG-Humana en Cabra que
contenía 1280 unidades precipitantes por ml.
De ésta fueron suspendidos 2 mg en 1 ml. de
una solución de Fosfatasa Alcalina que
contenía 5000 U/ml. en solución 3.2 M de
Sulfato de Amonio. La preparación se dializó
contra solución salina buffer de Fosfatos pH
7.2., posteriormente se adicionó gluturaldehido hasta una concentración de 0.2% se
incubó a 25°C por una y media hora y se
dializó contra una solución buffer de
Tris-HCL-0.05 M pH 8.0. La mezcla se diluyó
luego en solución de Tris-HCL-0.05 M pH 8.0
conteniendo 1010 de albúmina y 0.02% de
Azida de sodio. El volumen final fue de 4 ml.
Prueba InmunoenzimOtica:
Para realizar la prueba inmunoenzimática
se utilizaron microplacas de poliestireno
(Dynatech M 129 A). Cada uno de los
orificios fue llenado con 0.2 m1 de una
solución del lipopolisacárido en buffer de
carbonato 0.05M pH 9.6. preparada para
contener 1;5 Ó 10 mcg/ml. Las placas fueron
incubadas por tres horas a temperatura
ambiente en cámara húmeda para permitir
la adsorción del lipopolisacáricÍo al p18stico.
Posteriormente fueron intensamente lavadas
con solución salina buffer aue contenía
0.05% de Tween 20 permitiendo que en cada
ocasión el líquido de lavado permaneciera
en los orificios por períodos de 5 minutos y
removiéndolo por succión. Se hicieron diluciones dobles progresivas de los sueros a
titular en solución salina-buffer-Tween 20,
las que vertidas en su orificio correspondiente se incubaron por tres horas a
temperatura ambiente en cámara húmeda;
al término de este tiempo las placas fueron
lavadas intensamente en forma similar a la
anterior. El conjugado anti-IgG humanafosfatasa Alcalina fue diluído 1:400 en
solución salina-buffer-tween 20 y agregado
en cada orificio en cantidad de 0.2 ml. Las
placas fueron luego incubadas por 16 horas
v posteriormente lavadas en forma similar a
10; pasos anteriores. Para revelar la reacción enzimática se utilizó como substrato
una solución de Paranitrofenilfosfato de
concentración 1 mg/ml, en buffer de
Dietanolamina al 10% pH 9.8., de la cual
se agregó un volumen de 0.2 m1 por
orificio. La reacción se dejó operar
por 30 minutos. al término de los
cuales se frenó mediante la adición de 0.05
ml. de una solución 3M de NaOH y se leyó su
absorbancia en un espectrofotómetro
Dynatech a 405 nm. En cada prueba se
incluyeron controles adecuados los cuales
incluyen: un suero de reconocida positividad
anti-antigeno-0 de Salmonella typhi uno
negativo y los controles propios del sistema
enzimático empleado.
RESULTADOS:
Se purificaron dos formas químicas de!
antígeno-0 de Salmonelle typhi; lipopolisacárido, y polisacárido. Para la técnica aquí
descrita
el lipopolisacárido,
es
de
preferible utilización por
su
buena
capacidad de adsorción a las paredes
de tubos de polipropileno o de poliestereno.
A partir de 1.5 litros de cultivo de salmonella
en la fase logarítmica de su crecimiento, se
extrajeron 11 mg.de lipopolisacárido (Tabla
1).
MIGUEL GUZMAN. MOISES WASSERMAN
TABLA No. 1
F I G U R A N < >1
% DEL
PESO MOJI\W
FRACCION
% DEL
PESO SECO
4.0
-
0.35
8.75
1000
L!POP~~~Q.C~,~~O
0.011
ant$em-o iraxinai
0.28
3.1
0.18
2 .O
Cultivo
15 litros.
Polvo .itr.cto
ficeton..
Pali3acdrido
Anflgsna-0
0.007
Tabla No. 1. EFICIENCIA EN LA PURIFICACION DEL ANTIGENO-O DE SALMONELLA
TYPHI.
Al realizar la reacción enzimática de
acuerdo a lo recomendado por Engvall y
Perlmann (7). se encontró que ésta, medida
por absorbancia, aumenta en forma directamente proporcional a la concentración del
antígeno como puede verse en la figura No.
1. Las diferencias observadas en la absorbancia en el suero positivo patrón en
ausencia del antígeno y en este mismo suero
con antígeno a concentraciones de 1 mcg/ml
o más, son estadísticamente significativas;
las probabilidades de que estas diferencias
sean debidas al azar, están muy por debajo
de P: 0.005.
Se encontró también que la absorbancia
es proporcional a la concentración del suero
problema como lo muestran las figuras 1 y 2,
presentando una marcada significación estadística para las diferencias entre las
absorbancias producidas por el suero problema y por el suero control, utilizando el
antígeno somático-0 específico a la concentración de 1 mcg/ml [Figura 2). Las probabilidades de que este fenómeno sea debido al
azar, son nuevamente menores de P: 0.005.
Figura No. 1 . DEPENDENCIA DE LA RESPUESTA ENZIMATICA EN LA CONCENTRACION DE ANTIGENO-O.
Un suero control positivo fue usado en las
diluciones indicadas en las abcisas. El lipopolisacárido fue adsorbido a los orificios de la
microplaca de titulación a concentraciones de 1
mcg/ml
A;
5
mcg/ml
O
n
ylOmcg/ml o.
Como control los orificios apropiados en la
microplaca fueron tratados en idéntica forma,
pero con buffer de adsorción libre de lipod . El conjugado inpolisacárido 0
munoenzimático se us6 a una dilución de 1/400.
niente de un paciente con Fiebre Tifoidea. En
el experimento descrito en la figura 3b. las
diferencias en las tres diluciones de los
La técnica detecta en forma específica sueros de pacientes con Salmonellosis por
anticuerpos contra Solmonello typhi: los paratyphi By typhimurium y el suero control
sueros control producen una reacción enzi- no tiene significación estadística alguna.
mática mínima: es una línea base de muy mientras que los valores de absorbancia del
baja absorbancia (Figuras 2, 3a y 3b). Los suero del paciente con Fiebre Tifoidea son
sueros de pacientes con Salmonelosis por significativamente más altos. En el experiSolmonello enteritidis serotipos paratyphy mento de la figura 3a sin embargo, en la
A,B y typhimurium (Figura 3) mostraron una dilución de suero 1 5 0 la diferencia entre el
reacción enzimAtica, similar a la que produ- suero del paciente con Salmonellosis por
ce el suero control negativo y mucho más poratiphi A y Fiebre Tifoidea podría ser
baja que la producida por un suero prove- casual.
FIEBRE TIFOIDEA
-
DIAGNOCTICO POR PRUEBAS..
FIGURA No. 3
F I G U R A No. 2
2.0
O
-
14
1O
A
0.8
as
0.6
-
g
0d
$
b
b.
02
o.,
(1,501
(dlll
1111001
11/200)
Ao.2
Figura No. 2. DEPENDENCIA DE LA
RESPUESTA
ENZIMATICA
EN
LA
CONCENTRACION
DE
ANTICUERPOS
CONTRA ANTIGENO-O.
Se determinó, a las diluciones indicadas, las
absorbancias inducidas por l a incnbación con:
un suero control positivo a Salmonella typhi,
previa adsorción del lipopolisacárido a concentración de 1 mcg/ml
m
O en su
ausencia -o
y con un suerocontrol
negativo previa adsorción del lipopolisacárido a
1 mcg/rni
LA
o en su ausencia
. El conjugado inmunoenzim&A
tico se usó a una dilución de 1/400.
Tomando e n c u e n t a que: a ) En los s u e r o s
control negativo h a y cierto grado d e ahsorbancia, b) L~ ahsorbancia
disminuye a
medida que disminuye la concentración del
antígeno y del incremento e n l a dilución del
suero, g u a r d a n d o esta variable relativa
proporcionalidad p a r a todos 10s sueros,
positivos o negativos. Y. c) Los valores d e l a
a b s o r b a n c i a oscilan e n el mismo s u e r o p e r o
s e mantiene l a proporción relativa e n t r e el
s u e r o problema y el s u e r o control, se optó
entonces p o r introducir u n p a t r ó n d e medida
que, siendo fácil d e aplicar d i e r a m á s exacta
idea d e l a s concentraciones d e a n t i c n e r ~ o se
hiciera posible l a comparación e n t r e resul-
-
1.7
IW I V ~ I I
2.0
2.3
FIGURA No. 3. ESPECIFICIDAD DE LA
TECNICA.
a) Se determinó las absorbancias icducidas por
diluciones de sueros obtenidos de pacientes:
o
; infeco
control no infectado
tado con Salmonellaparatyphi B O
0 ;
Con S a h o n e l l a t @ h ~ m ~ 7 i u mL
A
Y
'On
Whi o. Las
microplacas fueron previamente adsorbidas con
lipopolisacárido a concentración de 1 mcg/ml. El
conjugado inmunoenzimático se usó a una
dilución de 1,400.
b) En distinto experimento se determinó las
absorbancias inducidas por diluciones de
obtenidos de Dacientes: control no infectado
o; infectado con Salmonella
+,aratv*hi A
A
A
con salmonella
I v l > h t L o--o . Las inicroo~acasfueron
idsorbidas con lipopolisacárido a concentración
de 1 mccr/ml. El coniucrado inmunoenzimático se
usó en dilución 1/860:
45
MIGUEL G U Z M A N .
tados. Se introdujo entonces en el estudio el
Indice (o relación) Ap / Ac; relación entre la
absorbancia del suero problema con el suero
control, en el momento d e la prueba. Esta
medida s e hace constante, así sean l a s
oscilaciones en las absorbancias al momento
y así sean las diluciones de los sueros e"
prueba. Del análisis estadístico aplicado a
los resultados obtenidos en las pruebas
practicadas en 2 0 sueros, tomados al a z a r
dentro de los sueros en estudio, s e obtuvo la
certeza de que las variaciones entre resultados para un mismo suero son atribuidas a l
azar en el 95% de los casos y de que el índice
es el mismo cualquiera que sea l a dilución
del suero, con u n a seguridad también del
95%.
MOISES WASSERMAN
el grupo d e pacientes e s d e 2.92 con
intervalo d e 2.43 a 3.41 y p a r a el grupo d e
vacunados e s de 1.35 con intervalo de
confiedencia de 1.19 a 1.51.
Utilizando estos criterios técnicos s e midió
el título d e anticuerpos en los sueros d e un
grupo de pacientes con Fiebre Tifoidea y en
el grupo compuesto de 92 personas aparen- Figura No. 4. T I T U L O DE ANTICVERPOS
temente s a n a s y sin antecedentes conocidos EN UNA POBLACION VACUNADA CONTRA
de Salmonellosis o Fiebre Tifoidea. antes y S A L M O N E L L A TYPHI.
después de s e r vacunado contra S. typhi. La Se calculó el índice de absorbancia Ap/Ac
distribución de los títulos s e puede apreciar dividiendo la absorbancia inducida por un suero,
en l a Figura No. 4 y en las tablas 2 y 3. Los por el promedio de absorbancias producidas por
resultados en la población problema y tres sueros control negativos tratados en las
control son perfectamente distintos. La mismas condiciones. La gráfica muestra los
probabilidad de que la población problema porcentajes por grupos de índice de absorbancia
1 ;
tenga un valor promedio de dos o menos de para 3 poblaciones: control 7
e infectada con
dos es inferior a 0.005. La probabilidad de vacunada
. . .. .... .
ti: .. .::...:i.::i.:.::~::.$::?;24
que l a población control tenga un valor Salmonella t y p h i
promedio de uno con cinco o mayor e s
TABLA No. 2
bastante inferior a 0.005.
En el grupo control post-vacunado se
descartaron los casos cuyo índice de absorbancia [Ap/Ac) determinado antes de la
vacunación fue de 1.5 o mayor. La vacunación aumenta el promedio del índice de
absorbancia en forma significativa (Tabla
3). Sin embargo. solo un 30.44°10 d e los
vacunados tuvieron un alza en el título de
anticuerpos contra S. typhi.
No hay significación estadística p a r a l a
diferencia encontrada entre los porcentajes
de alza según una o dos dosis de vacuna
(Tabla 4).
El promedio del índice de absorbancia
p a r a el grupo control; e s de 1.33 con
intervalo d e confidencia d e 1.20 a 1.46; p a r a
POBLACIONES
Tabla No.2.DISTRIBUCION DE LAS POBLACIONES PROBLEMA Y CONTROL POR GRUPOS DE INDICE DE ABSORBANCIA (Ap/Ac) .
El indice de absorbancia fue calculado como se
explica en e! texto. El grupo problema fue formado
por pacientes con infección de Salmonella typhi
comprobada por hemocultivo. El grupo control fue
escogido al azar entre voluntarios sin antecedentes
sospechosos de haber padecido una Fiebre Tifoi
dea.
FIEBRE TIFOIDEA
TABLA
NO.
-
DIAGNOSTICO POR PRUEBAS.
3
Tabla No. 3 . DISTRIBUCION DE LA POBLACION VACUNADA POR GRUPOS DE INDICE
DE ABSORVANCIA Ap/Ac) . Entre la población
vacunada se tomaron únic)mente aqeullos que
antes de la vacunación presentaban un índice de
absirbancia Ap/Ac inferior a 1,5. Los demás se
descartaron por considerarlos como probables de
haber tenido contacto con la Salmonella typhz ya
por infección o por vacunación.
TABLA No. 4
DOSIS
NO ALZA
DOS DOSIS
TOTAL
16
TOTAL
75,OO
25.00
69,56
30,44
23
Tabla No. 4. DISTRIBUCION DE LOS CASOS
VACUNADOS SEGUN VACUNACION CON
UNA O DOS DOSIS.
Se tomaron solo los casos que antes de la
vacunación tenían un índice de absorbancia Ap/Ac
inferior a 1,5. Se consi(ieraron como alzas significativas en los índices aquellas que sobrepasaron las
dos y media desviaciones estandar de la diferencia
calculada sobre la tabla No. 3.
DISCUSION:
La fiebre tifoidea e s p a r a países de escaso
desarrollo sanitario un problema importante. En 1975 se informaron más de 32.000
casos en las Américas, excluidos los Estados
Unidos (1). En Colombia, e s frecuente. En
1978 nuestro laboratorio estudió más d e 200
casos incluida una epidemia en una guarnición con más de 100 casos. En la ciudad d e
Bogotá e s de común ocurrencia habiéndose
presentado inclusive epidemias intrafamiliares (12). La confirmación de su diagnós-
tic0 descansa en el hemocultivo positivo e n
las primeras semanas de l a enfermedad, sin
embargo un diagnóstico serológico indirecto
y específico e s altamente deseable. Tradicionalmente la aglutinación introducida por
Widal, s e h a venido utilizando, sin embargo
el hecho de utilizar una suspensión d e
microorganismos hace que el antígeno sea
una mezcla cruda de componentes con
posibilidad d e reacciones cruzadas que
recienten s u especificidad. El uso incontrolado de antígenos comerciales diveros, la
valoración subjetiva d e la aglutinación y l a
mala normalización hacen difícil s u interpretación y demeritan s u confiabilidad. En
un estudio (4) en el que cuatro laboratorios
analizaron los mismos sueros, con idéntico
protocolo d e trabajo y utilizando los mismos
reactivos se encontraron discrepancias del
36%; estas llegaron a l 76% cuando los
laboratorios utilizaron s u s propios reactivos
y sus propios protocolos de trabajo. Otros
autores encuentran porcentajes de falsa
positividad hasta d e 8% y d e falsa negativid a d de 30% (5) lo cual los hace afirmar que
el procedimiento d e antígenos febriles es:
"no específico, pobremente estandarizado.
frecuentemente confuso y difícil d e interpretar". En países como el nuestro en donde el
control de calidad es un concepto exótico y
donde no existe ningún control biológico
estatal, el uso diagnóstico d e los antígenos
febriles e s altamente peligroso por la cantid a d d e epidemias falsas d e Fiebre Tifoidea
que s e denuncian en base a sus resultados.
Por todo ésto, e s apenas lógico explorar
nuevos procedimientos. La técnica aquí
propuesta tiene ventajas definidas ya que
utiliza un antígeno puro, el lipopolisacárido,
asegurando así la especificidad de la reacción. El uso de reactivos ordenados en una
reacción secuencia1 precisa, asegura una
normalización inviolable y la lectura hecha
en base a una reacción enzimática mensurable espectrofotométricamente elimina los
factores subjetivos d e lectura. La utilización
del antígeno-0 purificado d e Salmonello
typhi en lugar d e l a mezcla cruda de
antígenos y de tipos diferentes d e Salmonella
typhi usados en el método de los antígenos
febriles (2,3), además d e sentar las ventajas
anteriormente mencionadas comunes al trabajar con sistemas definidos, evita el problema d e la persistencia por períodos muy
MIGUEL G U Z M A N .
largos, de altos títulos contra el antígeno H
en sueros de personas que han tenido
contacto con Solmonello (13).
Los sueros de pacientes infectados con
Salmonella enteritidis serotipos typhimurium, paratyphi A y paratyphi B produjeron
reacciones enzimáticas similares a las obtenidas con sueros control negativos. Esto
sugiere una alta especificidad para detección de infecciones por Solmonella typhi.
Esta especificidad es en cierta forma sorprendente, pues el antígeno somático-0 de S.
v p h i comparte el determinante número 1 2
con los serotipos paratyphi y typhimurium
(14).
El método es reproducible por lo menos en
el marco limitado del presente trabajo:
puede ser fácilmente estandarizado para
una sola dilución y podría eventualmente ser
montado como método de rutina en cualquier
laboratorio de centros asistenciales u organismos de salubridad.
La producción del antígeno purificado no
confronta mayores problemas y su rendimiento es eficiente ya que de uno y medio
litros de cultivo en crecimiento logaritmico
se obtuvo alrededor de 11 mg. de
lipopolisacárido. Esta cantidad es suficiente
para realizar más de 50.000 pruebas. El
conjugado inmunoenzimático es relativamente de sencilla fabricación y podría ser
también regularmente suministrado por un
centro de referencia como el Instituto
Nacional de Salud.
Un hecho que conviene ser discutido es la
pobre respuesta de IgG inducida por la
vacunación sobre nuestro grupo control y
estudiada mediante la técnica aquí propuesta. Solamente 30% presentó una respuesta
que puede interpretarse como una seroconversión. Este hecho sugiere la búsqueda de
vacunas más eficientes que induzcan una
buena respuesta a base de IgG, ya que según
numerosos estudios las vacunas en uso a
base de microorganismos muertos inducen
Lna respuesta mayor de IgM (15, 16, 17,18) y
es un hecho conocido qu* la protección
conferida es muy baja y de muy corta
duración, (19) en cambio la enfermedad
induce una buena respuesta a base de IgG
como lo miiestra en forma clara este trabajo
y está demostrado que la inmunidad induci-
MOISES W A S S E R M A N
da por la enfermedad es factor decisivo en la
recuperación de los pacientes y que confiere
un grado de resistencia que hace improbable
un segundo ataque de Fiebre Tifoidea.
En conclusión creemos que la prueba
inmunoenzimática en fase sólida (ELISA)
aquí propuesta, para el diagnóstico de
Fiebre Tifoidea es altamente promisoria y
que un estudio más amplio debe realizarse
para probar su validez estadística, su
reproducibilidad y confiabilidad.
SUMMARY
The hereby presented work describes the
developpment o£ a n "Enzime-linked Immuno
Sorbent Assay [ELISA)" for the indirect
diagnosis of Typhoid Fever. It is posible, by
means of this technique, to do a n objective
and neat analysis of the results. The
technique is a quantitative one, since the
extent o£the enzymatic reaction is proportional to the concentration of circulating
antibodies against the somatic antigen
(O-antigen] of Salmonella typhi. Furthermore,
the technique is highly specific for
Salmonella typhi. Sera from patients who
suffered infections caused by SalmoneUa
enteritidis serotypes paratyphy A,B and
typhimurium
gave
negative
results,
undistinguishable from those obtained with
sera from a n uninfected control group.
The technique was useful a s well, to
define the level of antibodies against the
somatic antigen of Salmonella cyphi in a
population which was assumed a s a healthy
one and to compare it with the level o£
antibodies induced by the illness.
Post-vaccinational levels of antibodies
were determined and found surprisingly low
The results a r e widely discussed.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al doctor Mario
Salazar Niño, del Grupo de Microbiología e
Inmunología del Instituto Nacional de Salud,
por su invaluable ayuda en la recolección de
sueros y conformación del grupo control,
y al doctor Alvaro Aguilera, Jefe de la
Oficina de Epidemiología y Red Nacional de
Laboratorio, por el análisis estadístico de los
resultados.
FIEBRE TIFOIDEA
-
DIAGNOSTICO POR P R U E B A S . .
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