Práctico Parvovirus - Sección Genética Evolutiva

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ORGANIZACIÓN, FUNCIÓN Y VARIABILIDAD DEL GENOMA 2010
PRÁCTICO
“Obtención, secuenciación, ensamblaje y anotación de un genoma
viral simple”
Introducción
El modelo que se utilizará como genoma viral simple es el Parvovirus Canino tipo 2 (CPV–
2). Es un virus ADN simple hebra de pequeño tamaño (5.2 kb) que codifica para proteínas
estructurales (VP1 y VP2) y no-estructurales (NS).
Este virus emergió hace cerca de 30 años y rápidamente se extendió por todo el mundo
causando enteritis hemorrágica aguda y miocarditis en perros de corta edad. Se cree que se originó a
partir del Virus de la Panleucopenia felina o de un virus cercano perteneciente al subgrupo de
parvovirus de carnívoros (Fig. 1).
Poco después de su expansión, CPV-2 fue reemplazado por nuevas variantes antigénicas
(CPV-2a/2b/2c), capaces de infectar además nuevos hospederos.
CPV-2 es un claro ejemplo de un virus con la capacidad de evolucionar en corto tiempo,
ampliar el rango de huésped, expandirse rápidamente en la población susceptible y generar ciclos
pandémicos. Por esa razón, su estudio reviste gran importancia no sólo desde el punto de vista
sanitario sino también como modelo evolutivo viral.
Figura 1. Evolución del parvovirus canino a partir de virus
relacionados con la Panleucopenia felina (FLPV) y la enteritis
en visones (MEV). Se indican los cambios de aminoácidos en
la proteína VP2 que diferencias los distintos virus y variantes
antigénicas. Estas variaciones producen cambios de huésped
y propiedades biológicas.
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Objetivo:
Aplicar conjuntamente técnicas moleculares y bioinformáticas para la anotación de un genoma
simple.
Actividades:
•
Amplificar mediante PCR, secuencias solapantes del genoma de CPV.
•
Analizar las secuencias obtenidas.
•
Ensamblar el genoma utilizando el programa DNASTAR-Lasergene (SeqMan) a partir de la
secuencias obtenidas.
•
Anotar el genoma mediante el uso del programa Artemis.
•
Establecer las diferencias de la secuencia ensamblada con cepas de referencia depositadas en
la base de datos.
Amplificación por PCR
Para la obtención de la secuencia del genoma de CPV realizaremos la técnica de reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) de modo de obtener ADN en suficiente cantidad para su posterior
secuenciación. Esta es una técnica muy rápida que permite, a partir de una sola copia de una
molécula de ADN, obtener muchas copias de dicho ADN. Esta técnica aprovecha las características
de la replicación del ADN, es decir que a partir de un pequeño cebador la polimerasa puede
proseguir la síntesis de una cadena. Se debe contar con dos cebadores adecuados, uno para cada
cadena. Utilizaremos distintos juegos de cebadores “forward” y “reverse” de modo de amplificar
fragmentos de alrededor de 800 pb que sean solapantes entre sí, lo que nos permitirá, una vez
obtenidas las secuencias de dichos fragmentos, ensamblarlos en una única secuencia.
1) Diseñe una reacción de PCR estableciendo las cantidades de cada componente y las
condiciones de la reacción de amplificación. Complete los cuadros que se encuentran a
continuación.
Componente
Concentración inicial
Concentración final
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Volumen
Mix p/
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Como molde se utilizará una solución de ADN proveniente de una extracción de una
muestra de materia fecal de perro. Todas las reacciones llevan este mismo molde. Cada reacción se
hará con un par de cebadores específicos. Los otros componentes de la reacción son comunes y
pueden prepararse en una mezcla única que posteriormente se dividirá en tubos para cada reacción.
Calcule también los volúmenes para la preparación de este “mix” común.
Etapa
Primera desnaturalización
Temperatura
o
Tiempo
94 C
5 minutos
____ ciclos:
Desnaturalización
Hibridización o Annealing
Extensión
__ o C
__ o C
__ o C
__ segundos
__ segundos
__ segundos
Extensión final
__ o C
7 minutos
Una vez culminada la reacción de PCR en el termociclador, los productos son analizados y
separados por electroforesis en gel de agarosa. Ésta nos permite visualizar el producto obtenido,
corroborar su tamaño y calidad y extraerlo de la matriz para purificarlo y secuenciarlo. Para ello
realizará un gel de agarosa al 0,8% en TAE (Tris-Acetato-EDTA), conteniendo 0,5 ug/ml de
bromuro de etidio. Tras una corrida electroforética a 90 Voltios, se observará el gel en un
transiluminador con luz ultravioleta y se recortarán las bandas deseadas para su purificación.
Ensamblado de secuencias de ADN.
La secuenciación automática de ADN permite obtener tramos de secuencias que raramente
sobrepasan los 800 pb. Estas secuencias tienen que ser posteriormente ensambladas para formar
contig (conjunto de secuencias con regiones superpuestas), los cuales son nuevamente ensamblados
para formar contigs mayores. Este ensamblaje requiere de regiones de superposición de las
secuencias y de programas específicos que identifiquen dichas regiones y alineen en forma
secuencial los distintos tramos de secuencias obtenidos. Para este práctico utilizaremos el programa
DNASTAR-Lasergene (SeqMan). El genoma será ensamblado a partir de las secuencias obtenidas
por PCR.
Actividades
Ensamblado de las secuencias
1) Abra el programa DNASTAR-Lasergene (SeqMan). Se abrirán diferentes ventanas. Utilizando el
comando Add Sequences, suba los diferentes archivos obtenidos de la secuenciación automática
(carpeta secuenciación). En la misma ventana le aparecerá la opción Assemble. Tras el ensamblado
le aparecerá una ventana con el reporte del mismo, ¿qué datos extrae? ¿Como explica los resultados
obtenidos?
2) Para facilitar el ensamblado adicione una secuencia del gen bank (archivo MEV) de un genoma
viral taxonómicamente relacionado con su objeto de estudio (MEV, virus de la enteritis del visón).
Este se usará como molde o esqueleto en donde podamos ensamblar las secuencias de interés.
3) Para visualizar en forma gráfica el ensamblado vaya a la opción contig/strategy view. ¿Se
encuentra el genoma de referencia totalmente cubierto por las secuencias ensambladas?
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4) Obtenga una secuencia consenso (formato fasta) de su ensamblado previa eliminación de la
secuencia esqueleto (contig/Save consensus).
5) Compare esta secuencia con la secuencia del genoma completo de CPV (archivo CPV).
Anotación del genoma
Abra la secuencia del CPV (archivo CPV) con el programa Artemis y realice la anotación
del genoma.
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