Estudio de la localización subcelular de polifenol - Platina

Estudio de la localización subcelular de polifenol - Platina

ESTUDIO DE LA LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DE POLIFENOL OXIDASA DE
Annona cherimola MEDIANTE LA EXPRESIÓN TRANSITORIA DE
CONSTRUCTOS CON LA PROTEÍNA GFP
Humberto Prieto1, Christian Montes3, Pablo Zamora4, Álvaro Castro4, Mauricio González-Agüero1,2, Bruno G. Defilippi1,2 y Reinaldo Campos-Vargas1,2.
1 Instituto de Investigaciones Agropecuarias, INIA, Santa Rosa 11610, Santiago, Chile.
2 Núcleo Milenio en Biotecnología Celular Vegetal (PCB-MN)
3 Facultad de Ciencias Químicas y Farmaceúticas, Universidad de Chile, Av. Vic. Mackenna 20, Santiago, Chile.
4 Facultad de Química y Biología, Universidad de Santiago de Chile, Av. Bdo. O’Higgins 3363, Santiago, Chile.
E-mail: [email protected]
La chirimoya (Annona cherimola Mill.) es una fruta atractiva para aplicaciones como precortado o procesamiento mínimo. Sin embargo, la chirimoya presenta una
marcada susceptibilidad al pardeamiento, condición que se atribuye principalmente a la acción de la polifenol oxidasa (PPO). Recientes trabajos permitieron
identificar, secuenciar y analizar experimentalmente el transcrito de largo completo de PPO en chirimoya (Acppo). La proteína predicha (AcPPO) presentó dos
codones ATG de inicio, generando un análisis complejo del N-terminal por técnicas bioinformáticas de procesamiento de secuencias en relación a la
compartimentalización de la enzima. Un análisis de eventos post-transduccionales involucrados en la destinación final y distribución funcional de AcPPO fue realizado
por fusión de dos putativas señales N-terminal y proteína fluorescente verde (GFP). Construcciones tanto con el largo completo (primer ATG) o la segunda mitad
(segundo ATG) fueron estudiadas separadamente en ensayos de expresión transitoria. La infección de hojas de Nicotiana tabacum con Agrobacterium tumefaciens
conteniendo clones descritos anteriormente fueron evaluados con microscopía confocal. La existencia de una secuencia mínima en el N-terminal necesaria para dirigir
AcPPO hacia cloroplasto fue establecida, apoyando la idea que los genes clonados generan una proteína que es destinada en estos organelos.
INTRODUCCIÓN
Los frutos de chirimoya deben mantenerse a bajas temperaturas
(8-10°C) para retrasar su ablandamiento durante la postcosecha.
Sin embargo, una vez retornada a temperatura ambiente, los frutos
sufren pardeamiento muy aceleradamente, particularmente luego
de sufrir cualquier daño mecánico, condición principalmente
atribuida a la actividad polifenol oxidasa (PPO). Nuestro grupo
recientemente ha obtenido una secuencia del largo completo del
gen de PPO en este fruto. Un análisis más detallado de su
secuencia aminoacídica y estructura, ha mostrado que
efectivamente corresponde a una enzima con actividad cresolasa y
que exhibe un pro-péptido N-terminal (NTPP) (Prieto et al., 2007).
Sin embargo, el análisis bioinformático detallado de este NTPP ha
generado una confusa información de su predicción funcional. En
este trabajo se estudió la compartimentalización subcelular para la
PPO de chirimoya (AcPPO) y se estableció el fragmento mínimo
necesario de NTPP responsable de esta distribución.
Ananas comosus
Ipomea batatas
Lycopersicon esculentum
Nicotiana tabacum
Oryza sativa
Solanum tuberosum
Spinacia oleracea
Triticum aestivum
Trifolium pratense
Vicia faba
Vitis vinifera
Annona cherimola
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
MATLSKLASQ PITPPLSPLP PLHAPSLTKS FTTTFLSPVG VPN------- ----HPVIRS HANLRSNKRM PTSLRAASPA ATYSWALGGL YGATTGLGLN -RRAAAAPIL APDLSTCGPP
---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------APIQ APEISKCVVP
MSSSTPNTLP LLSTNKSLSS PFTNN--HST FLSKPSQPFL HGR------- -RCQSFKVSC NV--GEHDKN ----LDAVDR RNVLLGLGGF YGAANLAPLA S----AAPIP PPDLKSCGVA
ILASSSSTLP -LCANKTPSS SFTNTNTNSS FFAKPSQLFL HGK------- -RNQNFKFSC NANSGEHDKN ----LDAVDR RNVLLGLGGL YGAANLAPLA T----AAPIP PPDLKSCSKA
MESINVAPGT TATPRMAPPP P--PPCITN- ----LQSTLR YNN------- ----LLLHRK TKGWKPRN-- -VSCRVDRRD VLLGISGAAA MVATQGGGG- ---ALAAPIQ APDLGDCHQP
-MASLCN--- --SSSTSLKT PFTSSSTSLS STPKPSQLFI HGK------- -RNQMFKVSC KVTNNNGDQN QNVETNSVDR RNVLLGLGGL YGVANAIPLA AS---AAPAP PPDLSSCSIA
-MATLSSPTI ITTTSILLNN PFLPKTPQLS AHHHRGVRSV NGKVS----C QTKNNNGNDE NNQFQLIQNP NTNTPYLLDR RNILLGLGGM YAALGSEGAN YYNTLAAPIL -PDVEKCTLS
---------- ------AAAS ACLPPRKPVA GAGKQGRSRL LCK------- -------CEA TSRGAGTGDD DDLVLRRLDR RDVLLGLTGV GATGAINLGG LALATDDAVL ATCVTVPVTD
MISISSSPLS LMS-LNISSN FNTSSSLQYP FSQKQHQPSK NRK------P KHHKIACTSN DTNQNSPKEQ EQKP---SPR RNVLIGLGGL YGAT-TLTNN NSLAFGAPVP IPDLTKCVIP
MTSIS--ALS FISTINVSSN SKISHSSVYP FLQKQHQSSK LRK------P KRQ-VTCSSN N-NQNNPKEE QELSNIVGHR RNVLIGLGGI YG---TLATN -PSALASPIS PPDLSKCVPP
---MASLPWS LTTSTAIANT TNISAFPPSP LFQRASHVPV ARNRSRRFAP SKVSCNSANG DPNSDSTSDV RETSSGKLDR RNVLLGIGGL YGAAGGLGAT KPLAFGAPIQ APDISKCGTA
-MGRPRLQFS AISLAFCLVA VAFPSNLLVS CCHAADQSVL LGE------- ---------- -------NNN IYASNGFGWL KNLIYEMGGG WLSGTHVPAV GEAEKTRSSL APNLTTCHRS
Figura 1. Análisis bioinformático del AcPPO NTPP.
Para conocer el correcto codón de inicio del ORF Acppo, se analizaron los dos primeros residuos de metionina de la secuencia predicha, y se buscaron señales de destinación
utilizando SignalP e iPSORT. La primera metionina predijo un péptido señal de 29 amino ácidos (AA’s) con un sitio de corte en LLVS/CR; la segunda metionina predijo un
péptido de transito de 22 AA’s con destinación a cloroplasto y un sitio de corte en KTRS/SL. Estos resultados sugieren que el AcPPO NTPP poseería uno o dos péptidos señal
que difieren en la ubicación subcelular para PPO de chirimoya. Las flechas indican sitios de corte.
1
Estrategia
288
GFP
NTPP
AcPPO
secuencia
completa
ORIV
Análisis bioinformático
(iPSORT, signalP)
C OL E1 OR I
RB
N OS-P
K an (R )
pGWB5
N OS-T
1 7 960 bp
Clonamiento direccional
fragmento NTPP
(pENTR-D, Invitrogen)
35S-P
attR 1
LB
C m(R)
35S-P
ccd B
H yg ro (R )
Expresión vector
quimera EGFP (pGWB5)
1
A. tumefaciens
transformación
(cepa GV3101)
117
GFP
R1
attR 2
N OS-T
Infiltración tabaco
N. tabaccum BY-2
crecimiento
(4 semanas)
Ensayo expresión
transiente
(microscopio confocal)
Análisis datos
(Zeiss AIM 4.0,
Alemania)
GFP
N OS-T
139
DISCUSIÓN
En estos experimentos se demuestra que AcPPO es destinada y almacenada en cloroplastos
debido a la existencia de la secuencia N-terminal del pro-peptido (NTPP), la cual sirve como una
señal de destinación subcelular. Esta compartimentalización ha sido descrita previamente en otros
sistemas vegetales (Chevalier et al., 1999) y permite mantener la actividad PPO aislada físicamente
de sus sustratos, evitando la formación innecesaria de o-quinonas en células saludables o sin
daño. Se ha descrito que algunas catecol oxidasas requieren una activación post-traduccional, que
en algunos casos, significa la ruptura de un péptido N- o C-terminal por proteasas (Chevalier et al.,
1999; Yoruk and Marshall, 2003; Jukanti, 2006), la evidencia que se obtuvo en este trabajo, sugiere
que AcPPO debe tener el mismo tipo de regulación postraduccional, involucrando el NTPP que
hemos disectado funcionalmente. Trabajos adicionales son requeridos para conocer la importancia
de este péptido en la regulación de la actividad de AcPPO.
REFERENCIAS
§Chevalier T, de Rigal D, Mbeguie AMD, Gauillard F, Richard-Forget F, Fils-Lycaon BR (1999) Molecular cloning and
characterization of apricot fruit polyphenol oxidase. Plant Physiol. 119: 1261-1270.
§Jukanti AK (2006) Molecular and biochemical characterization of polyphenol oxidases in developing kernels and senscing
leaves of wheat (Triticum aestivum). Funct. Plant. Biol. 33: 685-696
§Prieto H, Utz D, Castro A, Aguirre C, Gonzalez-Aguero M, Valdes H, Cifuentes N, Defilippi BG, Zamora P, Zuniga G,
Campos-Vargas R (2007) Browning in Annona cherimola Fruit: Role of Polyphenol Oxidase and Characterization of a
Coding Sequence of the Enzyme. J. Agric. Food Chem .55: 9208-9218
§Yoruk R, Marshall MR (2003) Physicochemical properties and function of plant polyphenol oxidase: a review. J. Food
Biochem. 27: 361-422
288
Cl
GFP
PAL
GFP
Figura 2. Expresión transitoria de fusiones NTPP-GFP.
Se analizó la localización subcelular de AcPPO y la importancia de cada una de las dos metioninas iniciales mediante la
construcción de vectores de expresión que contienen la proteína verde fluorescente (GFP) fusionada con el NTPP completo
(Figura 2-A); con los primeros 39 AAs que incluyen el primer péptido señal predicho (R1, Figura 2-B); con los AAs 46 al 96
que incluyen al segundo péptido señal (CL, Figura 2-C); y finalmente con los 30 primeros AAs de fenilalanina amonio-liasa
(PAL, Figura 2-D) como control de fluorescencia. Estas construcciones se utilizaron en experimentos de transformación
transitoria de hojas de tabaco (Nicotiana tabaccum, cv. Bright Yellow 2) utilizando infiltración con Agrobacterium tumefaciens
GV3101. Los productos expresados fueron visualizados 24 horas post-infección mediante microscopía confocal.
El NTPP completo mostró fluorescencia GFP totalmente compartimentalizada y co-localizada con la emisión corespondiente
a clorofila, indicando su ubicación subcelular en cloroplasto; cuando se expresó el primer peptido señal (R1) la fluorescencia
fue uniforme y poco intensa (sin localización subcelular); al expresar el segundo péptido señal, se detectó nuevamente una
co-localización con la emisión correspondiente a clorofila. Estos resultados determinan que AcPPO se almacena
compartimentalizada en el cloroplasto, además sugieren que el primer potencial péptido señal podría no ser necesario para la
localización intracelular de AcPPO. Sin embargo el segundo péptido, como había sido predicho por el procesamiento
bioinformático, debería ser el responsable de esta localización.
Agradecimientos: Eduardo Tapia, Alvaro Sequeida, Carolina Zuñiga.
Este trabajo fue financiado en parte por proyecto Fondecyt 1040011