manual de practicas de laboratorio de microbiologia general

Transcripción

Casa abierta al tiempo
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
UNIDAD IZTAPALAPA
manual de prácticas
laboratorio
MICROBIOLOGÍA
GENERAL
María de los Angeles Aquiahuatl Ramos
María de Lourdes Pérez Chabela
DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected]
Rector General
Dr. Luis Mier y Tetón Casanueva
Secretario General
Dr. Ricardo Solís Rosales
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA - Iztapalapa
Rector
Dr. José Lema Labadie
Secretario
Mtro. Luis Javier Melgoza Valdivia
División de Ciencias Biológicas y de la Salud
Director
Dr. J. Gerardo Saucedo Castañeda
Secretario Académico
M. en C. Arturo L. Preciado López
Departamento de Biotecnología
jefe del Departamento
Dr. J. Mariano García Garibay
ISBN 970-31-0141-0
Primera Edición: 2004
Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa
Av. San Rafael Atlixco No. 186 Col. Vicentina.
Del. Iztapalapa, C.P. 09340 México, D.F.
Impreso y hecho en México
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laboratorio
MICROBIOLOGÍA
GENERAL
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de los Angeles Aquiahuatl Ramos
María de Lourdes Pérez Chabela
Agradecemos al Director de la División de Ciencias Biológicas y de la
Salud Dr. Gerardo Saucedo Castañeda por todo el apoyo para la publicación de este manual de prácticas del laboratorio de ,¡ —*: :: ^
GENERAL
Al Sr. Jorge Lodigliani por su apoyo en el procesado de las fotografías.
Al Dr. Alfonso Totosaus y al Sr. Wilfrido Rodríguez por su ayuda en el
diseño de las figuras.
A toda la gente que revisó este manual, que con sus aportaciones enriquecieron este trabajo.
índice
7
PRESENTACIÓN
9
RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIANTE
o
•o
PRÁCTICA # 1
Preparación y esterilización de materiales y medios de cultivo
o
12
14
15
15
16
20
22
22
23
24
28
30
31
31
32
Preparación del material de vidrio y medios de cultivo
Esterilización de materiales y medios de cultivo
Preparación de las cajas de Petri y tubos con medios de cultivo
Prueba de esterilidad de materiales
t
A
ao
•o
PRÁCTICA # 2
Preparación, fijación y coloración simple de frotis
Preparación de frotis
Fijación del frotis
Tinción simple
Observación al microscopio
PRÁCTICA # 3
Tinción diferencial de Gram y tinciones selectivas
Tinción diferencial de Gram
Tinción selectiva de endosporas
Tinción negativa para observación de cápsulas
Observaciones al microscopio
36
38
38
39
40
PRÁCTICA # 4
Métodos de cultivo y aislamiento de bacterias
Técnica de estría cruzada
Siembra en tubos con caldo y agar nutritivo
Siembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivos
Condiciones de incubación
46
48
49
49
49
PRÁCTICA # 5
Métodos de cultivo y descripción morfológica de hongos
Siembra de hongos
Descripción macroscópica de levaduras y mohos
Descripción microscópica de levaduras
Descripción microscópica de mohos en montaje con cinta adhesiva
54
56
57
57
PRÁCTICA # 6
Pruebas de diferenciación bioquímica
Técnica de Inoculación en cajas de Petri
Técnicas de Inoculación en tubos
Evaluación de actividades metabólicas
manual de prácticas del
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64
66
67
68
PRÁCTICA # 7
Métodos de cuantificación de microorganismos
Técnica turbidimétrica
Técnica de cuenta directa en cámara de Neubauer
Técnica de dilución y siembra en placa
74
76
77
PRÁCTICA # 8
Efecto del pH y la temperatura en el crecimiento microbiano
Efecto de la Temperatura
Efecto del pH
82
84
84
PRÁCTICA # 9
Efecto de la actividad de agua en el crecimiento microbiano
Efecto de la presión osmótica y actividad de agua (aw) en hongos y bacterias
Efecto de la desecación
90
92
92
PRÁCTICA # 10
Curva de crecimiento bacteriano
Inoculación e incubación del cultivo
Tratamiento de las muestras
97
BIBLIOGRAFÍA GENERAL
101
Anexo 1
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Y COLORANTES
105
Anexo 2
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
115
Anexo 3
ATLAS DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS
La Microbiología, es una ciencia relativamente reciente con respecto a otras ramas de
la Biología. El estudio de los microorganismos se inició a partir de que Antonie van
Leeuwenhoek en 1670 inventó el microscopio, y que a partir de los estudios de Luis
Pasteur en 1876, se logró el mayor desarrollo y reconocimiento de los microorganismos o
•o
como actores de una gran diversidad de procesos.
i
Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas de enfermedades en plantas, animales y humanos también es cierto que desde la
antigüedad algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos de
producción de alimentos fermentados como quesos, vino, pan y cerveza, entre
o
otros y actualmente se ha reconocido su importancia en diversas áreas de inves- •o
tigación básica, en la industria alimentaria, ambiental y farmacéutica.
II
El objetivo general del curso práctico de Microbiología General es que el alumno se
inicie en el conocimiento de la biología básica de los microorganismos, en sus
características morfológicas, nutricionales de crecimiento, control y que adquiera las habilidades necesarias para su manipulación en el laboratorio.
Este manual está dirigido a estudiantes que iniciarán su experiencia en el manejo de
los microorganismos, por lo que consideramos de gran importancia incluir al
principio del mismo una serie de recomendaciones relacionadas con las reglas
generales del laboratorio y los principales procedimientos que el estudiante
deberá aprender, para que manipule en forma adecuada a los microorganismos
y garantizar tanto su seguridad como la de sus compañeros.
Este manual contiene 10 prácticas, diseñadas para que el estudiante se familiarice
gradualmente con los procedimientos de cultivo y observación de bacterias y
hongos. El orden de presentación, corresponde al programa del curso teórico
trimestral de Microbiología General, que forma parte del plan de estudio de las
carreras de Ingeniería de los Alimentos e Ingeniería Bioquímica Industrial impartidas en la UAM-Iztapalapa.
En cada práctica se presentan los Objetivos y una breve Introducción para facilitar la
comprensión de los mismos, después se indican los Materiales necesarios y
Procedimientos a realizarse en forma de instrucciones numeradas que se complementan con figuras y esquemas.
Posteriormente, en cada práctica se proponen formas de presentación de los resultados en cuadros, para que el alumno recopile sus observaciones. También se incluyen preguntas en forma de cuestionarios que el estudiante debeiá resolver consultando los materiales bibliográficos sugeridos al final de este manual.
También se presentan tres Anexos que contienen las indicaciones para la preparación
de soluciones y colorantes (anexo 1) y de medios de cultivo (anexo 2), necesarios para la realización de cada una de las prácticas; así como uno (anexo 3) de
fotografías ilustrativas de algunos procedimientos y pruebas bioquímicas de
diferenciación microbiana.
Consideramos que este material puede ser de gran ayuda para los profesores y alumnos de la
UAM en el curso de Microbiología General, está elaborado de acuerdo a la infraestructura de los laboratorios y a la programación trimestral del curso, con sesiones de 4 horas/
semana.
Dra. Ma. de Los Angeles Aqulahuatl
Dra. Ma. de Lourdes Pérez Chabela
i
a
o
RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIA!*
Reglas de laboratorio
1.
Durante las sesiones, siempre deberá usar una bata de laboratorio bien abotonada, que deberá quitarse
antes de abandonar el laboratorio.
2.
No deberá sacar del laboratorio ningún equipo, medios o cultivos microbianos.
3.
Evitar la acumulación sobre la mesa de trabajo de objetos no relacionados con la práctica de laboratorio.
Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona especificada por el profesor.
4.
Se prohibe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimento o bebida dentro del laboratorio.
5.
Se prohibe fumar, aplicarse cosméticos o tocarse la cara con las manos o algún otro objeto. Se deberá lavar
meticulosamente las manos con jabón y agua antes de salir del laboratorio, incluso cuando salga por breves
periodos.
6.
Por seguridad no debeiá pipetear oralmente ningún tipo de cultivos microbianos, esta actividad deberá
realizarse con pipetas accionadas de forma mecánica o automática, tratando de evitar la formación de
aerosoles.
7.
No se admitirán visitas personales que distraigan la atención y pongan en riesgo la seguridad en el trabajo
que se realiza.
a
•o
Procedimientos de laboratorio
1.
Antes y después de cada sesión piáctica los alumnos deberán limpiar las mesas de trabajo con el desinfectante que se le proporcionará para este fin.
2.
Cuando se utilice el mechero, este deberá colocarse alejado del microscopio y otros equipos así como de
sus cuadernos o prendas de vestir.
3.
Al concluir cada sesión el estudiante deberá asegurarse de que los materiales de desecho u objetos contaminados sean colocados en recipientes específicos para ello, colocados en lugares apropiados, que les indicará
el profesor.
4.
Siempre deberá dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analíticas,
autoclave, potenciómetros, etc.) y reportar al maestro cualquier irregularidad en el funcionamiento.
5.
En caso de producirse un incendio o una herida personal, el alumno deberá notificarlo de inmediato al
profesor. En el caso de derrame de cultivos o rotura de recipientes con cultivos activos, deberá conservar la
calma y además de informar al profesor, seguir inmediatamente el procedimiento:
a. Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersión
b. Poner abundante solución desinfectante sobre las toallas
manual de prácticas del LABORATORIO PE NIICROBlOLOGt**
c. Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el receptáculo destinado a la
eliminación de materiales contaminados.
Materiales indispensables en cada sesión de laboratorio
1.
2.
3.
Bata de laboratorio limpia y con botones
El protocolo de la práctica y bitácora de laboratorio
Un pedazo de tela sin pelusa, cerillos, tijeras, cinta de enmarcar, marcador indeleble o etiquetas pequeñas.
i
o
o
o
Preparación y esterilización de materiales
y medios de cultivo
Objetivos
introducción
Que el alumno conozca los principios
generales de las técnicas de estéril!zación de materiales de vidrio y medios de cultivo de uso común en Microbiología. Observará el efecto de
Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cambios de condiciones ambientales y en la medida en que se han podido
adaptar a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad de
hábitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de tipo físico y químico.
trol de la contaminación microbiana
en el laboratorio.
Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y esterilización para limitar su presencia o eliminarlos. La esterilización es
un método de eliminación total de todo tipo de organismo y que
asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras
que la desinfección es un proceso que solamente elimina formas
vegetativas de los microorganismos.
o
La esterilización con calor seco y húmedo son los procedimientos de
mayor utilización en Microbiología. El calor seco desnaturaliza las
enzimas y destruye a los microorganismos por oxidación, por ejemplo al ponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno
a 150-180°C durante 2 horas. Estos métodos se aplican principalmente en la esterilización de asas de inoculación y todo tipo de
material de vidrio y quirúrgico.
Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones, y cultivos bacterianos que se desechan, el más
recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a
presión para alcanzar temperaturas de 121 °C. El material se deja a
esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse de la destrucción de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor.
Cuando se requiere esterilizar diferentes materiales sensibles al calor como
las soluciones de vitaminas, aminoácidos, etc. se esterilizan por
filtración en membranas estériles de 0,2 mieras de diámetro y para
el caso de materiales plásticos es recomendable el uso de gases
como oxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies
generalmente se desinfectan con radiaciones U.V. o compuestos
químicos en forma líquida como: los fenoles, compuestos
cuaternarios de amonio (alquildimetil bencilamonio), formaldehído,
alcoholes, halógenos y detergentes.
Cada uno de estos procedimientos tienen ventajas y desventajas de uso,
los sistemas de filtración son muy eficientes y rápidos para la esterilización pero sólo se aplican en pequeños volúmenes. Los fenoles
y compuestos cuaternarios de amonio son muy efectivos para la
desinfección de superficies pero son muy corrosivos. Los
detergentes y los alcoholes tienen actividad limitada contra esporas bacterianas y algunos virus por lo que sólo son desinfectantes.
13
m a n u a l
d e p r á c t i c a s d e l
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Materiales
7 tubos de cultivo de 16 x 150 mm con tapón de baquelita
3 tubos de cultivo de 16 x 150 mm sin tapón de baquelita
9 cajas de Petri de vidrio
3 pipetas de 1 o 2 mL
3 pipetas de 10 mL
1 pipeta Pasteur
3 matraces Erlenmeyer de 250 mL
1 parrilla de calentamiento con agitación
1 autoclave
(O
a
1 potenciómetro
1 horno de calor seco
1 mechero Fisher
1 incubadora a 35°C
1 hisopo estéril, algodón y gasa
papel manila o estraza para envolver
Caldo nutritivo (Anexo 2.1)
Medio de agar nutritivo (Anexo 2.2)
Medio de agar papa dextrosa PDA (Anexo 2. 6)
Medio mínimo de sales (Anexo 2.3 )
Soluciones amortiguadoras pH 4 y 7
Procedimiento
El profesor explicará los principios generales de trabajo en el laboratorio de Microbiología, enfatizando en la
desinfección de áreas así como en la preparación y esterilización de los medios de cultivo y materiales necesarios
para el trabajo cotidiano con microorganismos. También hará las demostraciones necesarias para que el estudiante aprenda a envolver los materiales, así como su manejo en condiciones asépticas.
Preparación del material de vidrio y medios de cultivo
1.
Lavar perfectamente las cajas de Petri y pipetas con escobillón y detergente. Enjuagar con abundante agua
corriente.
2.
Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con una piceta, por las paredes interiores. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningún
otro medio.
3.
Una vez seco el material, se procederá a envolver las cajas de Petri y pipetas con papel de estraza. Para los
tubos y matraces se elaborarán tapones de algodón y gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre los
que finalmente se les colocará un capuchón de papel.
4.
Preparar 20 mL de Caldo Nutritivo (CN) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y ajustar el pH a 6.5-7.0 en un
potenciómetro, agregando con una pipeta Pasteur poco a poco solución de HCI 0.1 M o solución de NaOH
0.1 M, en caso de que el pH sea más alcalino o ácido respectivamente. Vaciar 5 mL en cuatro tubos de cultivo
con tapón de baquelita que deberán cerrar sin llegar al tope.
14
5.
Preparar 120 mL de Agar Nutritivo (AN), calentar la mezcla en una parrilla con agitación constante hasta
ebullición, durante 1 minuto (cuidar que no se proyecte) y vaciar enseguida 5 mL de medio en tres tubos
con tapón de rosca. Enjuagar inmediatamente la pipeta para evitar que se solidifique el agar. El resto se
esteriliza en el autoclave.
6.
Preparar 120 mL de medio de cultivo Papa dextrosa agar (PDA) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL, ajustar
el pH del medio a 5.0-5.6. Colocar un magneto de agitación y calentar hasta ebullición durante 1 minuto;
cuidando de que no se proyecte o derrame. Posteriormente vaciar 7 mL de medio en tres tubos que se
taparán con tapón de algodón y gasa. El resto se esteriliza en el autoclave.
7.
Preparar 120 mL de medio de cultivo Mínimo de sales (MM) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL
I
a
Esterilización de materiales y medios de cultivo •oo
1.
Las cajas de Petri y pipetas envueltas se colocaran en horno a 150 °C durante 2 horas. Después de sacarlas,
dejarlas enfriar y abrir los paquetes únicamente en área aséptica.
2.
Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo a las siguientes instrucciones:
a. Revisar que el nivel de agua coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario añadir agua
destilada.
b. Conectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto. Acomodar los medios y materiales en la canasta del autoclave y colocarla dentro.
c. Cerrar la puerta, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y esperar a que salga el vapor
de agua por el orificio de purgado. Después cerrar este orificio con la válvula de seguridad.
d. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121 °C o 15 Ibs de presión revisando continuamente la
escala del manómetro. Una vez alcanzada esta temperatura deberá bajarse el nivel de calentamiento moviendo la perilla de control al nivel medio o bajo.
e. Mantener el equipo en estas condiciones durante 15 minutos
f. Apagar la autoclave y dejar que baje la presión al valor de "0". Quitar la válvula de seguridad y con la ayuda
de guantes de asbesto o una jerga húmeda abrir cuidadosamente la puerta, de adelante hacia atrás para
evitar quemaduras por la salida del vapor.
Preparación de las cajas de Petri y tubos con medios de cultivo
1.
Los tubos con medios de cultivo con agar, se deberán colocar en una superficie inclinada de tal forma que el
medio se solidifique a una distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo.
2.
Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado de la autoclave se enfríen a una temperatura
aproximada de 40-50 °C, que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin
sentir un calor excesivo.
3.
Cerca del mechero, etiquetar 3 cajas con AN, 3 cajas con PDA y 3 con MM. Los medios de cultivo se vacían en las
cajas de Petri (aproximadamente 25-30 mL) en zona aséptica cerca del mechero o en campana de flujo laminar.
4.
Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 30 minutos) y posteriormente envolver las cajas cuidadosamente con papel estraza o acomodarlas en forma invertida en bolsa de plástico limpias.
5.
Guardarlas en refrigeración hasta 24 horas antes de utilizarlas.
115
manual de prácticas del LABORATORIO PE «ICIlCIBiOLCIGÍJI S E Ü I A L
Prueba de esterilidad de materiales
1.
Colocar los tubos con agar inclinado y las cajas de Petri en forma invertida en una estufa de incubación
ajustada a 30 °C durante 24-48 horas.
2.
Revisar los tubos y cajas de Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparición de turbidez,
nata superficial y/o depósito de material en el fondo de los tubos con medio líquido; así como la formación
de colonias microbianas en la superficie de medios sólidos.
3.
Si no hay contaminación de los medios, se abrirá una de las cajas de Petri de cada medio durante 1 minuto
en el laboratorio o zonas accesorias al mismo y se etiquetará como"al aire".
4.
La otra caja de cada medio de cultivo se abre durante 30 segundos cerca del mechero y se etiquetará "en
área aséptica".
5.
La tercer caja se conservará sin abrir y se etiqueta como "control".
(0
CQ
0
Resultados
A.
Hacer la descripción morfológica de las colonias obtenidas en las cajas con diferentes medios de cultivo
(AN, PDA y MM) y con los distintos tratamientos en relación a la caja control.
B.
Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento, (++) crecimiento
regular y (+++) crecimiento abundante.
C.
Discuta los resultados y determine si la esterilización en el autoclave y horno fue adecuada, así como el
manejo de los materiales.
Cuadro 1
Descripción morfológica de microorganismos en cajas de Petri con diferentes medios de cultivo.
MEDIO
DE CULTIVO
Abierta al aire
Abierta en área
aséptica
Control
a
t
AGAR
NUTRITIVO
A
a
«
MÍNIMO
DE SALES
PAPA DEXTROSA
AGAR
Cuestionario
1)
¿Cuáles son los métodos de esterilización más utilizados en Microbiología? ¿En que tipo de materiales se
aplica cada uno?
2)
Explique cuáles son las diferencias entre los procesos de esterilización, desinfección y asepsia. ¿Cómo se
relacionan estos procedimientos con la pasteurización?
17
•
o
o
Preparación, fijación y
coloración simple de frotis
Objetivos
Introducción
Que el alumno aprenda las técnicas
de preparación de frotis, de fijación
y coloración más utilizadas en el estudio microscópico de cultivos
bacterianos, obtenidos de medios
sólidos y líquidos. Que identifique las
principales formas bacterianas y la
importancia de las tinciones simples
en la caracterización morfológica de
estos microorganismos.
Debido al pequeño tamaño de la mayoría de los microorganismos, se
requiere de un microscopio óptico, ya sea de campo claro o de campo
oscuro para hacer la descripción morfológica de éstos. El microscopio de
uso más común es el de campo claro, en el que la observación de células
vivas es limitada debido a que las células son incoloras y permiten el paso
de una gran cantidad de luz.
o
•o
o
I
La observación de frotis teñidos es más recomendable. El frotis se prepara
haciendo una extensión de los microorganismos sobre una superfia
cie transparente, en la cuál se fijan y tiñen los microorganismos. o
•o
De acuerdo al número de soluciones colorantes y a los objetivos de
estudio se pueden realizar diferentes tipos de tinciones como son:
simple, diferencial, negativa y selectiva.
Los frotis de cultivos líquidos se deberán fijar con alcohol para evitar residuos del medio, que al quemarse darán interferencias en las observaciones y los de colonias de medios sólidos se fijan generalmente
con calor. Después de la fijación, los frotis son teñidos con diferentes colorantes sintéticos derivados de anilina.
Los colorantes más utilizados son sales formadas por iones coloridos cargados conocidos como cromóforos. Por ejemplo:
Cloruro de Azul de metileno
Azul de metileno* +
(Cromoforo)
ci-
Si el cromoforo es un ion positivo el colorante es de tipo básico, pero si la
carga es negativa será de tipo ácido. La mayoría de las bacterias son
teñidas por colorantes básicos, que permean la pared celular y se
adhieren por enlaces iónicos débiles a moléculas con cargas negativas de la célula bacteriana. La tinción de las bacterias con azul de
metileno, es un ejemplo de tinción simple que facilita la observación de forma, tamaño y arreglo de las células.
21
Materiales
1 Probeta de 100 mL
1 Vaso de precipitados de 100 mL
1 mechero
1 asa de siembra
5 Portaobjetos
Piceta con agua destilada
Microscopio compuesto de campo claro
Azul de metileno alcalino (Anexo 1.2)
Alcohol etílico al 70% (Anexo 1.7)
Fenol al 2% (Anexo 1.9)
Aceite de inmersión
(0
CQ
o
Procedimiento
El profesor proporcionará a los alumnos cultivos líquidos y sólidos de: Escherichla col¡, Streptococcus sp.,
Staphylococcus sp., Badllus subtilis, Klebsi'ella sp. y Pseudomonas fluorescens. El estudiante preparará frotis de
cada cepa obtenida de cultivo sólido y otros de cultivo líquido, los cuales fijará y teñirá con azul de metileno.
El profesor explicará los principios de manejo del microscopio y la forma de ajustar la iluminación.
Preparación de frotis
1.
Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos (Figura 1).
2.
Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo.
3.
Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. Después
acercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapón y flamear rápidamente la boca del mismo. Introducir
el asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra.
4.
Para el caso de cultivos líquidos, colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente en
un área circular de 2 cm. de diámetro aproximadamente y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotis
al aire y repetir los procedimientos 3 y 4 por 2-3 veces más.
5.
Si el cultivo es de medio sólido, previamente se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua
destilada en la que se mezcla una pequeña muestra del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del
paso 3. Extenderla suavemente y dejar secar al aire.
Fijación del frotis
1.
Fijar los frotis de cultivos líquidos con dos gotas de metanol o etanol absoluto y dejar secar al aire (hacer esto
en zonas alejadas al mechero).
22
2.
Los frotis de cultivos sólidos, completamente secos se fijarán con calor. Para esto se pasaiá el frotis rápidamente 2-3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero.
3.
Palpar la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano izquierda para enfriar y comprobar que no
hubo sobrecalentamiento.
Tinción simple
|
1.
Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto.
2.
Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda de la piceta con agua
destilada.
i
a
o
•o
3.
Dejar secaral aire
Marcar el área por debajo del portaobjeto
CULTIVO SÓLIDO
Coloque 1 o 2 gotas de agua
Con asa estéril tomar una
muestra de la colonia y
mezclarla con el agua
Dejar secar al aire
Pasar rápidamente sobre la
flama del mechero
CULTIVO LIQUIDO
Colocar 1 o 2 asadas de medio de
cultivo con asa estéril
Distribuir en la zona marcada
Dejar secar al aire. Repetir los
procedimientos anteriores dos veces
Fijar con 2 gotas de alcohol, y
dejar secar al aire
Figura 1. Preparación y fijación de frotis bacterianos a partir de cultivos sólidos y líquidos
Observación al microscopio
1.
Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.
2.
Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observación, siguiendo las indicaciones del profesor.
3.
Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de 40X. Para la observación con el objetivo de 100X, colocar previamente una pequeña gota
de aceite de inmersión sobre la preparación.
4.
Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de
aceite y evitar incrustaciones que dañan estos sistemas.
Resultados
A.
Reportar las observaciones de forma, agrupación y tamaño relativo de cada uno de los microorganismos en
el cuadro de resultados.
B.
Comparar sus observaciones con las reportadas en la literatura.
24
Cuadro 2
Observaciones microscópicas de frotis de cultivos bacterianos
Escherichla coll
Streptococcus sp.
Cultivo: Líquido
0)
(0
t(0
Aumento total:
a
Forma: (cocos, bacilos, etc.)
Agolpamiento de las células
(solos, pares, cadenas, etc.)
Tamaño:
Cultivo: Sólido
Aumento total:
Forma: (cocos, bacilos, etc.
Agrupamiento de las células
(solos, pares, cadenas, etc.)
Tamaño:
Cuestionario
1.
Investigue cuáles son las estruauras celulares o moléculas responsables de la tinción simple realizada. De
ejemplos de otros colorantes que podrían utilizarse.
2.
¿Por qué se recomienda fijar los frotis de cultivos líquidos con alcohol y no con calor? ¿Por qué se deben
poner varias veces muestras del cultivo líquido y sólo una muestra de cultivos sólidos al preparar los frotis?
25
3.
¿Cuáles son las principales precauciones de manejo del microscopio y por qué se debe utilizar el aceite de
inmersión al hacer el estudio microscópico de bacterias?
4.
¿Cuáles son las desventajas o limitaciones de la tinción simple?
5.
¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la preparación de frotis?
6.
Bibliografía consultada
a
o
Referencias bibliográficas
• Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Practicas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México.
• johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings Publishing
Company, Inc. USA.
• Practical Handbookof Microbiology. William MO'Leary, Cornell Medical College, New York, New York, USA.
CRC Press, 1989.
• Holt, J. G., N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
z
'
-
s
Í
'
, -'-
\ 0
Tinción diferencial de Gram y
tinciones selectivas
introducción
Objetivos
Que el estudiante clasifique algunas
especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas de acuerdo a la
tinción de Gram. Que observe estructuras bacterianas especiales, como las
endosporas y cápsulas con tinciones
selectivas. Que comprenda la importancia que tienen estas tinciones para
la caracterización e identificación de
las bacterias.
La tinción propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es una
de las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y
Gram negativas. El método se fundamenta en el hecho de que el colorante primario (cristal violeta) tiñe por igual a todas las bacterias, pero la
combinación con el colorante es más permanente en los gram positivos.
Para establecer la diferenciación en estos dos grupos, se aplica un disolvente del colorante primario que no tiene efecto sobre el grupo de
microorganismos que lo retienen firmemente, pero lo elimina de
aquellos que no son capaces de retenerlo, quedando por lo tanto
completamente decolorados. En estas circunstancias, sería muy difícil su observación por lo que es preciso tratarlos con otro colorante
llamado secundario, como la safranina. Este colorante no modifica
el color de los microorganismos que habían retenido el color primario, pero tiñe a los microorganismos decolorados.
Estas diferencias de tinción de las bacterias se explican por cambios en la
composición química y estructura de las paredes celulares, que facilitan la retención o eliminación del colorante primario después del
proceso de decoloración.
Otras tinciones que permiten obtener mayor información son la negativa
y la selectiva. La tinción negativa facilita las observaciones de la
morfología y tamaño de las bacterias sin alteración por efecto del
calor así como de estructuras especiales, como la cápsula de algunas especies bacterianas. La cápsula también llamada glicocálix es
una estructura externa a la célula, formada de polisacáridos o
polipéptidos, que confiere protección a las bacterias contra la desecación y la fagocitosis.
La extensión sobre un portaobjetos en forma de capa fina de una mezcla
de las bacterias con tinta china o nigrosina, permite observar en el
microscopio estructuras especiales como son las cápsulas, que aparecen como una zona clara que rodea la célula bacteriana en un
fondo obscuro.
Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas como
las endosporas de Bacillus y Clostridium, bacterias en las que su
presencia, forma y localización son importantes criterios de clasificación taxonómica.
Además, debido a la resistencia al calor de las endosporas y a que algunas
especies son microorganismos patógenos de gran toxicidad, su detección en microbiología alimentaria y médica adquiere gran interés.
arabio m:
Materiales
1 Probeta de 100 mL
1 Parrilla de calentamiento
1 Mechero
5 Portaobjetos
1 Piceta con agua destilada
Cristal violeta (Anexo 1.3)
Safranina (Anexo 1.8)
Lugol (Anexo 1.5)
Solución de alcohol-acetona (Anexo 1.6)
Verde de malaquita (Anexo 1.4)
Tinta china
Fenol 2% (Anexo 1.9)
Microscopio compuesto de campo claro
en
Procedimiento
El profesor proporcionará a los alumnos cultivos líquidos y sólidos de: Escherichia coll, Streptococcus sp.,
Staphylococcus sp., Badllus subtills y Klebsiella sp.
El estudiante preparará frotis de cultivo sólido y de cultivo líquido de cada microorganismo y aplicará la tinción
de Gram.
También realizará la tinción seieaiva de endosporas en un frotis fijado al calor de Badllus subtilis y la tinción
negativa en cultivos de K/ebsfef/a sp.
Tinción diferencial de Gram
a)
Cubrir el frotis con 2 gotas de cristal violeta durante 30 segundos a 1 minuto
b)
Lavar cuidadosamente el frotis con agua de la llave o destilada para eliminar el exceso de colorante
c)
Sacudir un poco y sin dejar secar cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 segundos.
d)
Lavar cuidadosamente el frotis con agua.
e)
Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante dejando que escurra hasta que no fluya más
tintura.
f)
Inmediatamente lavar con agua.
g)
Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos.
h)
Lavar nuevamente con agua, eliminar cuidadosamente el exceso de agua con una toalla de papel y dejar
secar al aire.
i
Tinción selectiva de endosporas
a)
Colocar un pequeño trozo de papel filtro sobre el frotis de Bacillus subtilk (Figura 2).
b)
Agregar verde de malaquita sobre el papel filtro de tal manera que cubra toda la preparación.
c)
Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitados con agua en ebullición.
d)
Dejar durante 5 minutos evitando que se seque el colorante (agregar un poco más sí es necesario) y eliminar
el colorante con agua destilada.
e)
t
a
Cubrir con safranina durante 30 segundos.
"O
f)
Lavar nuevamente y dejar secar al aire.
(a)
(b)
(e)
Figura 2. Tinción selectiva de endosporas bacterianas
Tinción negativa para observación de cápsulas
a)
b)
Colocar una pequeña gota de tinta china en el extremo de un portaobjetos; colocar junto una gota del I
cultivo líquido de Klebsiella sp. (Figura 3). Si se trata de un cultivo sólido, hacer una suspensión del microorganismo en una gota de agua destilada y mezclar cuidadosamente con la tinta china.
Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjeto perpendicular en ángulo de
45° sobre la muestra.
31
c)
Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa fina de la mezcla.
d)
Dejar secar al aire.
(a)
10
a
o
(d)
Figura 3. Técnica de tinción negativa
Observaciones al microscopio
1.
Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.
2.
Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de 40X. Para observar con el objetivo de 100X colocar previamente una pequeña gota de
aceite de inmersión sobre la preparación.
3.
Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso
de aceite y evitar incrustaciones que dañan a estos sistemas.
Resultados
A.
Reportar las observaciones de forma, agrupación, color y tamaño relativo tal como se indica en el Cuadro 3
de resultados. Hacer los dibujos de la morfología de cada uno de los microorganismos y colorearlos.
B.
Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura.
32
Cuadro 3
Descripción microscópica de cultivos baaerianos
Descripción del cultivo: (líquido
o sólido, edad del cultivo, etc.)
•o
I
o
cu
Aumento total:
t
ti
Forma: cocos, bacilos
Agolpamiento de las células
a
•o
Tamaño:
Reacción de Gram
TINCIÓN DE ENDOSPORAS
Badllus subtills
Streptococcus sp
Klebsiellasp.
Streptococcus sp
Aumento total:
Forma: cocos, bacilos
Agrupamiento de las células
Tamaño:
TINCIÓN DE CÁPSULA
Aumento total:
Cuestionario
1.
Explique en forma completa la teoría que explica la tinción de Gram. Investigue otros dos ejemplos de
tinción diferencial.
33
2.
¿Cuáles son las fuentes de error más comunes en la tinción de Gram?
3.
¿Explique que reacción de Gram darán los cultivos de levaduras? ¿Estos resultados tendrán la misma importancia que para las bacterias? ¿Por qué?
4.
Explique el fundamento de la tinción de endosporas. ¿Por qué se debe calentar la preparación? ¿Que dificultades se tendrían si no se adiciona la safranina al final de la tinción?
5.
Explique el fundamento de la tinción negativa realizada en la práctica.¿Qué tipo de información se obtiene?
Investigue otra técnica de tinción selectiva que permita observar estas estructuras bacterianas.
6.
• Johnson T.R. and C L. Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings Publishing
Company, Inc. EEUUA.
• Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana.
México.
• Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition) Edited by Francés
Pouch Downes and Keith Ito, 2001.
• Practical Hahdt^ic of Microbiology. William M O'Leary, Cornell Medical College, New York, New York,
USA. CRC Press, 1989.
• Holt, J. G., N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative
j
^ í - w'íV
^
Métodos de cultivo y
aislamiento de bacterias
Objetivos
Que el alumno conozca las diferentes técnicas de aislamiento en medios de cultivo sólido para la obtención de cultivos puros de bacterias,
Que el estudiante prepare medios de
cultivo de uso general, diferenciales
y selectivos para el cultivo de diferentes especies bacterianas.
Introducción
Las bacterias deben ser cultivadas en medios de cultivo de laboratorio
para caracterizar su crecimiento, hacer su identificación y determinar sus
actividades metabólicas. Un medio de cultivo es una solución acuosa de
diferentes compuestos que contiene todos los elementos indispensables
que requieren los microorganismos para crecer,
•o
i
i
Generalmente las bacterias son inoculadas o introducidas en medios líquidos
(caldos) o solidificados con agar para su propagación y/o conservación, así como para estudiar sus características de crecimiento. Es importante recordar que la inoculación de los microorganismos en los
medios de cultivo, siempre debelan realizarse en zona aséptica (cerca
del mechero o en campana de flujo laminar), condiciones que limitan
•o
la presencia de microorganismos indeseables o contaminantes.
8.
Las técnicas de aislamiento, permiten la obtención de microorganismos a
partir de muestras complejas (suelo, agua, alimentos, etc.) en las
que hay una gran diversidad microbiana, así como para comprobar
la pureza de los cultivos obtenidos. Los cultivos puros están formados por un solo tipo de microorganismo; y son indispensables para
conocer las características morfológicas, propiedades de tinción,
actividad bioquímica, patogeniddad, sensibilidad a antibióticos e
identificación de las especies microbianas.
El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por métodos de
dilución, en medios sólidos por estría en placa o en medios líquidos. En el primer caso se considera que cada célula bacteriana que
se separa daiá origen a una población que formará una colonia característica, visible a simple vista.
La limitación principal de estas técnicas de dilución, es que no es práctica
para el aislamiento a partir de mezclas donde el microorganismo de
interés se encuentra en pequeñas cantidades, donde solamente se
obtendrán las bacterias dominantes.
Para favorecer el aislamiento de cultivos de baja densidad, se aplican métodos de cultivo especiales, en los que se utilizan medios que contienen nutrientes especiales, antibióticos, altas concentraciones de
sales y/o condiciones de pH, luz o temperatura para favorecer el
crecimiento del microorganismo de interés y se conocen como selectivos o de enriquecimiento.
En ocasiones se pueden agregar a los medios de cultivo otros componentes como: sangre, colorantes, indicadores, etc. para distinguir especies bacterianas diferentes por la forma en que metabolizan los
sustratos que se manifiesta por cambios en la apariencia o modificación del pH del medio de cultivo. Estos medios se conocen como
medios diferenciales y son de gran utilidad para la caracterización e
identificación de especies bacterianas.
manual de prácticas del LABORATORIO ÍJ£ MICROBIOLOGÍA GENERAL
_t
Materiales
3 cajas de Petri con Agar nutritivo (Anexo 2.2)
2 cajas de Petri con Agar de eosina azul de metileno EMB
(Anexo 2.3)
2 cajas de Petri con Agar para Estafilococos 110 (Anexo
2.5)
2 cajas de Petri con Medio Mínimo de sales (Anexo 2.3)
1 tubo con agua destilada estéril
2 tubos con Caldo Nutritivo (Ver Anexo 2.1)
4 tubos con Agar Nutritivo (Ver Anexo 2.2)
1 Mechero
tú
1 Asa d e inoculación
1 Parrilla d e agitación
1 Autoclave
0
Procedimiento
El profesor proporcionará cultivos puros de Bacillussubtilis, Escherichia colí, Staphylococcusaureus, Pseudomonas
fluorescens, Klebslella sp. y Streptococcus sp.
También les proporcionará una muestra problema por equipo (con dos microorganismos diferentes) en la que
practicarán la técnica de aislamiento por estría cruzada.
Técnica de estría cruzada
a)
En la parte posterior y exterior de la caja, dividirla en cuatro cuadrantes. Tomar una muestra con el asa
previamente flameada y fría, inocular la muestra haciendo 4-5 estrías simples muy juntas de lado a lado
sobre el primer cuadrante de la caja, cerrar la caja (Figura 4).
b)
Flamear el asa de inoculación y hacer girar la caja de Petri un cuarto de vuelta. Abrir nuevamente la caja y
enfriar el asa de siembra tocando la superficie del medio lejos de la zona de estrías recién hechas.
c)
Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estrías y hacer un segundo grupo de estrías
en el segundo cuadrante como en el caso anterior.
d)
Repetir el procedimiento 4 y 5 en el tercer cuadrante y al efectuar la siembra en el último cuadrante, no se
deberá flamear el asa de siembra y se hará una estría más abierta (simple).
Siembra en tubos con caldo y agar nutritivo
1.
Sembrar un cultivo puro diferente en cada uno de los dos tubos con caldo Nutritivo y en tubos con agar
nutritivo inclinado.
2.
Sembrar con el asa extendida los mismos cultivos puros en otros dos tubos con agar nutritivo solidificado en
forma recta (Figura 5).
.
•o
o
I
cu
a
0)
Figura 4. Aislamiento de bacterias por estría cruzada en placa
(a)
(b)
Figura 5. Siembra de medios con agar por estría simple (a) en tubos inclinados y por picadura
(b) en tubos solidificados en forma recta.
Siembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivos
1.
Dividir en tres partes, una caja de Petri con EMB Agar, otra con Agar 110 y una de MM. Sembrar en cada parte
un cultivo puro diferente por estría simple.
2.
En otra serie de tres cajas con cada uno de los medios antes descritos, sembrar por estría cruzada la muestra
problema.
39
Condiciones de incubación
1.
Incubar las cajas en forma invertida a 35°C durante 24 horas. De las cajas inoculadas por estría cruzada,
seleccionar la colonia más aislada (generalmente del cuarto cuadrante). Transferir una pequeña muestra de
esta colonia a tubos inclinados con agar nutritivo.
2.
Incubar los tubos a 35°C durante 24-48 horas. Observar la aparición de colonias y reportar la forma en que
se distribuyen a lo largo del tubo.
Resultados
A.
Recopilar la información de la caracterización colonial de cada cepa en los cuadros 4 y 5.
B.
De acuerdo a sus observaciones identifique las especies presentes en la muestra problema.
ce
0
40
Cuadro 4
Morfología colonial de cultivos bacterianos
Escherichla col i
Streptococcus sp
MUESTRA PROBLEMA
Aislamiento por Estría
cruzada
Forma:
Color:
Tamaño (mm):
Borde-.
Superficie:
Aspecto:
Elevación:
Luz transmitida:
Luz reflejada:
Consistencia:
o
(0
a
•o
MEDKDEMB
Siembra en medios
selectivos y diferenciales:
MEDÍ 0 1 1 0
MEDIO fMÍNIMO
(íj
Microorganismo 1:
Forma:
Color:
Tamaño (mm):
Elevación:
Luz transmitida:
Luz reflejada:
Consistencia:
Nota: La descripción colonial puede hacerse considerando los siguientes criterios
Forma: circular, irregular, filamentosa o rizoide
Borde: entero, lobulado, aserrado
Superficie: lisa o rugosa
Aspecto de la colonia: húmeda, seca, butirosa
Elevación: convexa, plana, hundida
Luz transmitida: translúcida, opaca
Luz reflejada: brillante, mate
Consistencia: dura, blanda, mucoide
41
Cuadro 5
Descripción morfológica de cultivos puros en tubos de cultivo
Tubos inclinados de
Agar Nutritivo
w
\y
w
w
Crecimiento: arborescente,
filiforme, rizoide, disperso,
puntiforme
Color:
ultivo en tubo de
Caldo Nutritivo
Crecimiento: superficie
como película, como sedimento, turbidez en todo
el tubo
Color:
r~\
Tubos rectos de
Agar Nutritivo
Crecimiento: en forma de
película superficial, a lo
largo de la picadura,
solo en el fondo
Color:
i-
Cuestionario
O
1.
¿Que es el agar y de donde se obtiene? ¿Cuáles son los nutrimentos que proporciona a los microorganismos?
|
o
II
2.
¿Cuál es la composición química de los medios EMB, 110 y MM? ¿Cuáles son los componentes o propiedades
responsables de su función como medios selectivos o diferencíales?
3.
¿Porque el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de bacterias? Proponga algunas sustancias que se le agregarían para hacerlo selectivo para bacterias Gram negativas?
4.
¿Cuál es la información que se obtiene de las siembras de cultivos barterianos en tubos con agar inclinado
y en tubos con agar solidificado en forma recta?
5.
manual de prácticas del LABORATORIO PE MlCRClBiCiLClGJA GEliERAL
_k
• Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México.
• Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition). Edited by Francés
Pouch Downes and Keith Ito, 200.
• Practical Handbook of Microbiólogo CRC Press, 1989. William M O'Leary, Cornell Medical College, New
York, New York, USA.
• Bergey's Manual of Determinative Barteriology. 9th edition, The Williams and Wiikins Co., Baltimore, USA.
• Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA),
American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.
Ed. (1991).
Métodos de cultivo y
descripción morfológica de hongos
Objetivos
introducción
Que el alumno aprenda las técnicas
de cultivo y manipulación de diferentes tipos de hongos. Que el estudiante conozca las principales características morfológicas (macroscópica y
microscópicas) de los hongos.
Los hongos son organismos eucarióticos y de mayor tamaño que las bacterias, se distinguen de otros eucariotes como los animales por ser inmóviles y de las algas y plantas por carecer de pigmentos fotosintéticos.
Son de nutrición heterótrofa, es decir dependen de nutrientes orgánicos
que son solubilizados por sistemas enzimáticos específicos y son 5
absorbidos a través de su pared celular y membrana plasmática.
Estos organismos pueden ser unicelulares (levaduras) o multicelulares (filamentosos), sin embargo, también existen hongos (0
dimórficos principalmente patógenos que se presentan en las dos £
a
formas alternativamente, dependiendo de condiciones ambienta- o
"O
les como la temperatura.
Las levaduras son células de forma esférica u oval, ampliamente distribuidas en la naturaleza; frecuentemente se encuentran formando una
cubierta polvosa fina sobre frutos y hojas. Las levaduras se reproducen asexualmente por gemación, un proceso por el cuál brota una
protuberancia o yema de la célula madre que posteriormente se
separa como célula individual.
El cuerpo o estructura vegetativa característica de los hongos filamentosos
(mohos) se denomina talo, generalmente constituido de hifas
ramificadas que forman el micelio. Las hifas de algunos hongos
presentan tabiques transversales o septos, aunque en el caso de los
Zygomycetes las hifas no presentan estos septos y se les conoce
como hifas cenocíticas.
El principal mecanismo de reproducción de los hongos es asexual, por
fragmentación de hifas vegetativas o por la producción de abundantes esporas en conidióforos y esporangióforos formados en hifas
aéreas llamadas hifas reproductivas. Sin embargo, la descripción
de las estructuras de reproducción sexual es el principal criterio de
clasificación, por el que pueden ser ubicados en tres subdivisiones
o phylum: Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota.
Se estima que puede haber 1.5 millones de especies de hongos, de las
cuáles se han descrito más de 250 000 y de éstas solo se conocen
150 especies patógenas para el hombre y otras tantas para plantas y
animales. Es de gran importancia conocerlos, por los beneficios
que proporcionan al hombre, ya que como se mencionó la mayoría
son saprobios (utilizan materia orgánica muerta), por lo que tienen
una gran capacidad de reciclar materiales orgánicos de diferentes
tipos, de tal forma que se pueden utilizar como agentes de
biodegradación de compuestos recalcitrantes en procesos de
biorremediación.
47
Desde la antigüedad, estos microorganismos se han utilizado en procesos de producción de diferentes alimentos
como: vino, cerveza, pan y queso entre otros. También se ha reportado que en la naturaleza hay diversas
especies que funcionan como importantes agentes de control biológico de insectos (bioinsecticidas) y que
pueden mejorar la nutrición y permanencia de la mayoría de las plantas (micorrizas).
Materiales
4 Cajas de Petri con 25 mL de PDA (Anexo 2.6 )
4 Cajas de Petri con 25 mL de medio Czapek-Dox (Anexo
2.8)
3 Tubos de cultivo inclinados con 7 mL de PDA
2 matraces Erlenmeyer de 250 mL
1 Probeta de 100 mL
1 Mechero Fisher
5 Portaobjetos y cubreobjetos
1 Aguja de disección
1 Asa de siembra
Cinta adhesiva transparente
Microscopio óptico de campo claro
Autoclave
Incubadora a 30 °C
Azul de lactofenol (Anexo 1.1 )
m
0
Procedimiento
El profesor proporcionará a los alumnos tubos de cultivo con Aspergillus niger, PenicHHum chrysogenum, Rhizopus
oliQosporus, Trlchoderma viridey de la levadura Saccharomycescerevislae.
El estudiante inoculará cada una de las cepas en cajas de Petri con dos medios de cultivo: a) Czapek-Dox Agar, a
base de sales minerales y sacarosa y b) Papa Dextrosa Agar, que es un medio complejo.
Hará la descripción macroscópica de cada especie en los dos medios de cultivo y la observación microscópica la
realizará aplicando la técnica de cinta Scotch con azul de lactofenol.
Siembra de hongos
1.
Para sembrar los hongos filamentosos, se deberá separar una parte de micelio de los tubos de cultivo con
aguja de disección, previamente calentada en la flama del mechero y enfriada.
2.
Colocar el micelio en el centro de una caja de Petri con PDA y de la misma manera inocular la caja con medio
de Czapek-Dox.
3.
Las levaduras se inocularán por estría cruzada sobre la superficie de las cajas, en forma similar a la inoculación de bacterias.
4.
Colocar las cajas envueltas en papel o en bolsa de plástico en forma invertida dentro de una incubadora a
28-30 °C durante 3-5 días.
48
Descripción macroscópica de levaduras y mohos
1.
Hacer la descripción de la forma, tamaño, aspecto, textura y color de las colonias de Saccharomyces cerevisiae.
2.
En los cultivos de mohos describir la forma, tamaño y el tipo de colonia, así como las características del
micelio (algodonoso, aterciopelado, velloso, aéreo o pegado al medio) el color del micelio, el color de
esporas, cambios en el medio de cultivo, etc.
Descripción microscópica de levaduras
t
1.
De las colonias de levaduras preparar un frotis fijado al calor y teñirlo con azul de metileno.
i
•o
2.
Hacer observaciones al microscopio con objetivo de 40X y 100X.
Descripción microscópica de mohos en montaje con cinta adhesiva
1.
Se corta una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente tomándola únicamente por los extremos.
2.
Cerca del mechero se abre la caja y se presiona ligeramente la cinta transparente sobre la periferia de la
colonia.
3.
Colocar la cinta con la muestra adherida sobre una gota de azul de lactofenol, previamente colocada en el
centro de un portaobjetos. La cinta funcionará como cubreobjetos por lo que se deberá aplanar lo mejor
posible, evitando la formación de burbujas y sin alterar demasiado las estructuras.
4.
Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer las observaciones en el microscopio con los objetivos de 10X y
40X.
5.
Localizar en las preparaciones hifas, estructuras especiales como conidióforos, conidias, esporangióforos,
esporangios y rizoides. Determine si las hifas presentan septos o no.
Resultados
A.
Reportar sus observaciones en el Cuadro 6. Hacer los dibujos de las observaciones morfológicas de cada
uno de los microorganismos y colorearlos.
B.
Comparar las observaciones realizadas con los esquemas de la Figura 6.
C.
Investigar en la literatura como se clasifican los hongos estudiados en la práctica.
49
m a n u a l
d e p r á c t i c a s
del
:
: -. ,-*: v i . ' > : ; -*Z M ^ ; ; • * * ? ; ; < ; * : y ^ v . ; » , ?
--,v.::'-í"<t f *
conidias
conidias
conidióforo
10 ^m
10 \im
10 \im
Aspergillus flavus
(O
m
o
porangiosporas
Aspergillus niger
esporangióforo
conidióforos
100
25 Jim
conidias O
•
10
Rhizopus oligosporus
Penicillium roqueforti
®
Saccharomyces cerevisiae
conidióforos
conidias
conidióforos
conidias
OOOOooo
oooooo
10 ¿un
Trichoderma viride
OOOOOO
10
Penicillium chrysogenum
Figura 6. Descripción microscópica de estructuras de reproducción asexual de algunas especies de hongos.
Cuadro 6
Descripción morfológica de hongos
liliillilltllillliilllliiilliilliii
Descripción macroscópica
en PDA
;olor y tamaño:
•o
o
i
Aspecto:
Textura:
Descripción microscópica:
Aumento total:
Micelio con o sin septos
Tamaño:
Estructuras de reproducción
Tamaño:
Clasificación (phylum):
Descripción macroscópica
en medio Czapek-Dox:
Color y tamaño:
Aspecto:
Textura:
Descripción microscópica:
Aumento total:
Micelio con o sin septos
Tcmaño:
Estructura de reproducción
Tamaño:
Tipo de esporas
Tamaño:
51
Cuestionario
1.
¿Cuáles son las principales estructuras caraaerísticas de levaduras y mohos?
2.
Elaborar un cuadro comparativo de caraaerísticas morfológicas, nutridonales y sensibilidad a antibióticos de
hongos y baaerias. Mencione las diferencias que hay entre las esporas de hongos y las endosporas baaerianas.
3.
Mencione los criterios de clasificación de hongos filamentosos y levaduras.
4.
Describir brevemente tres problemáticas concretas para el hombre causadas por hongos y tres ejemplos de
utilización benéfica.
5.
• Hudson B.T. and L Sherwood. 1997. Explorations in Microbiology. Prentice-Hall, New Jersey. USA.
• Herrera, T., Ulloa, M. 1990. El Reino de los Hongos. Micología Básica y Aplicada. Fondo de Cultura Económica, UNAM. México.
México.
52
¿fe*
Pruebas de diferenciación bioquímica
Objetivos
Que el alumno realice algunas pruebas bioquímicas en medios de cultivo
con sustratos específicos que permitirán demostrar actividades metabólicas
de bacterias y levaduras. Que el estudiante comprenda la importancia de las
pruebas bioquímicas para la caracterización e identificación de estos
microorganismos.
introducción
El metabolismo, es toda la serie de reacciones que ocurren en los
seres vivos. Éstas reacciones incluyen procesos de obtención de energía como son: la descomposición de moléculas orgánicas en los
quimiótrofos (catabolismo) o la captación de luz para el caso de los
fotótrofos, así como de síntesis de material celular a partir de nutrientes
escenciales (anabolismo). Todas las reacciones metabólicas, son
catalizados por enzimas que en su mayoría funcionan dentro de la
célula por lo que se conocen como endoenzimas, hay también
exoenzimas principalmente hidrolíticas que son liberadas por la célut
la para catalizar reacciones fuera de ésta.
(0
a
En el laboratorio, es posible conocer las características metabólicas de los
•o
microorganismos, inoculándolos en diferentes medios de cultivo, con
sustratos que pueden utilizar como fuente de energía, fuente de carbono y de otros nutrientes escenciales para su crecimiento.
La mayoría de microorganismos, utilizan la glucosa como fuente de carbono y energía. Al entrar a la célula, la glucosa será oxidada en
forma incompleta (fermentación) o completa (respiración) dependiendo de la presencia de oxígeno y de las capacidades enzimáticas
de los microorganismos.
En la fermentación, los microorganismos obtienen 1-2 ATP/mol de glucosa y liberan ácidos orgánicos u otras pequeñas moléculas orgánicas
como productos metabólicos; mientras que las bacterias y levaduras de catabolismo respiratorio obtienen mayor cantidad (36-38 ATP/
mol de glucosa), CO2 y agua. Algunas especies microbianas pueden
ser de tipo respiratorio o fermentativo de acuerdo a las condiciones
de oxigenación.
Se han propuesto numerosas pruebas bioquímicas en medios de cultivo
con indicadores de pH, para detectar la producción de ácido o álcali; con inhibidores selectivos como bilis, cianuro, colorantes,
sulfuros, etc., que facilitan la determinación de diferentes actividades metabólicas como son: la capacidad para fermentar carbohidratos
(glucosa, lactosa, sacarosa), catabolizar aminoácidos y urea, la producción de enzimas específicas de tipo endo o exo como oxidasas,
reductasas, amilasas, lipasas, etc.
Como se ha observado en las prácticas anteriores, algunas bacterias y
levaduras tienen características coloniales y microscópicas muy similares, lo que no permite decidir si dos cultivos bacterianos o de
levaduras morfológicamente similares pertenecen a una misma
especie. Con algunas pruebas bioquímicas es posible su diferenciación e incluso su identificación, cuando el número de pruebas
es suficientemente amplio.
55
Materiales
1 Gradilla
1 Parrilla de agitación
1 Probeta de 100 mL.
3 Matraces Erlenmeyer de 250 mL
3 Vasos de precipitados de 250 mL.
1 Mechero
1 Asa de siembra
2 cajas con agar almidón (AA) (Anexo 2.13 )
2 tubos con campana de Durham y 5 mL de cada uno de
los siguientes medios: glucosa-rojo de fenol lactosa-rojo
de fenol, sacarosa-rojo de fenol y manitol-rojo de fenol
(Anexo 2.9 ).
2 tubos con 7 mL de medio SIM (Sulfuro, Indol, Motilidad)
(Anexo 2.11)
2 tubos con 7 mL de medio TSI (triple azúcar hierro)
solidificados en forma inclinada (Anexo 2.15)
2 tubos con 7 mL medio de citrato de Simmons solidificados
en forma inclinada (Anexo 2.10 )
2 tubos con 7 mL de caldo urea (Anexo 2.11)
2 tubos con 7 mL de leche tornasolada (Anexo 2.14)
2 tubos con 7 mL de agar gelatina solidificados en forma
recta (Anexo 2.15 )
2 tubos con 7 mL de agar nutritivo blando solidificados en
forma recta (Anexo 2.17 ).
Peróxido de hidrógeno 30 %
ácido tricloroacético al 5% (Anexo 1).
fl
0
Procedimiento
El profesor proporcionará cultivos puros de Bacillussubtllis, Escherichia col!, Pseudomonas fluorescens, Klebslella
sp. y Saccharomyces cerevislae. A cada uno de los equipos, les corresponderá también un cultivo problema.
Todos los tubos y cajas deberán etiquetarse e inocularse de acuerdo a las siguientes instrucciones.
Técnica de Inoculación en cajas de Petri
1.
Dividir en tres secciones por la parte de atrás las cajas con agar-almidón.
2.
En una de las cajas inocular por estría simple tres cepas diferentes.
3.
En la segunda caja inocular en dos secciones la muestra problema y dejar una sección sin inocular.
4.
Incubar las cajas en forma invertida a 35°C durante 24-48 horas.
56
Técnicas de inoculación en tubos
1.
Los tubos de glucosa, lactosa, sacarosa y manitol rojo de fenol, caldo urea y leche tornasolada se inocularán
mezclando una asada de cada uno de los microorganismos.
2.
Los tubos con agar TSI se inocularán por estría simple en la superficie y por picadura hasta el fondo del tubo
(Figura 5).
3.
Los tubos con gelatina nutritiva y agar nutritivo blando se inocularán por picadura (con el asa recta)
4.
Incubar los tubos a 35°C durante 24-48 horas.
Evaluación de actividades metabólicas
1.
Determinar la actividad de amiiasas en las cajas de agar almidón por el crecimiento y aparición de zonas
claras alrededor de las colonias. Si no es posible observarlas a simple vista, agregar unas gotas de lugol a las
cajas y observar la aparición de zonas claras sobre el medio que se coloreará de azul como indicativo de
prueba (+). Comparar los resultados con la zona de la caja que se dejó sin inocular.
2.
En un portaobjetos hacer una suspensión en una gota de agua de las colonias obtenidas en cajas de agaralmidón y agregar unas gotas de peróxido de hidrógeno al 30%. Observar la formación de burbujas que
significan una prueba de catalasa (+).
3.
Todas las pruebas en tubo deberán interpretarse en comparación con tubos control, que contienen los
mismos medios de cultivo pero sin inocular
4.
En los tubos de agar gelatina, observar la licuefacción del medio y agregar unas gotas de solución de TCA
(ácido tricloroacético) al 5%, observar la aparición de zonas claras o nubosidad en el medio.
5.
En los tubos con medios de glucosa, lactosa, sacarosa y manitol rojo de fenol, hacer observaciones a las 24
y 48 horas de incubación. Determinar si hay crecimiento, cambios en el color del indicador y producción de
gas en la campana de Durham
Resultados
A.
Reportar los resultados en el Cuadro 7. de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-), crece un
poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++). Actividad sobre sustratos (+) o negativa (-)
B.
Investigar los resultados bibliográficos de cada una de las cepas y compararlos con los obtenidos en la
práctica
C.
Investigar las reacciones enzimáticas y de color realizadas para la evaluación de actividades metabólicas
D.
De acuerdo a sus observaciones proponga el nombre de la especie que corresponde a su microorganismo
problema.
57
M
MI
Cuadro 7
Resultados de pruebas de diferenciación bioquímica
MEDIO DE CULTIVO
Escherichla cotí
Saccharomyces
cerevislae
CULTIVO PROBLEMA
Agar Almidón
Crecimiento:
Color del medio con el
ugol:
Hidrólisis de almidón:
Prueba de catalasa:
Aparición de burbujas al
agregar peróxido de
hidrógeno:
Reacción de catalasa:
Gelatina Nutritiva:
Crecimiento:
Licuefacción del medio:
Formación de nubosidad
al agregar TCA al 5%:
Hidrólisis de gelatina:
Agar Nutritivo Blando:
r\
Crecimiento: superficial,
en la parte media,
en el fondo:
Crecimiento en la picadura
Movilidad:
58
Caldo rojo de fenol
r\ r\ r\ r\ r\ r\
Gluc
1011011
Lac
Sac Man
r\ r\ r\
9
TI
|
a
Gluc
Lac
Sac Man
Gluc
Lac
Sac Man
Crecimiento:
Color del medio:
Ácido:
Gas:
Leche tornasolada
(Litmus Milk)
ÁddO:
Álcali:
Sin cambio:
Reducción:
Peptonización:
Coagulación:
Gas:
Caldo Urea
Crecimiento:
Color:
Hidrólisis de urea:
59
Medio TSI
€
«i
í
í
Crecimiento:
Cambio de color:
Producción de H2s:
m
o
Producción de gas:
Fermentación del azúcar:
Medio de citrato de
Simmons
r\
Crecimiento:
Cambio de color:
Utilización de citrato:
Cuestionario
1.
¿Cuáles son las rutas bioquímicas de obtención de energía de las bacterias respiradoras aerobias, las de
respiración anaerobia, las fermentadoras, y las anaerobias estrictas?.¿Cuál de éstas es más eficiente?
¿Porque?
2.
Describa brevemente las actividades enzimáticas que se identificaron en cada uno de los medios de cultivo
utilizados en la práctica. ¿Cuál es la reacción bioquímica que cataliza cada una? ¿Cuáles son exoenzimas y
cuáles son endoenzimas?
!
0)
t
ti
a
o>
•o
3.
¿Explique por qué los tubos de fermentación de azúcares deben evaluarse a las 24 y 48 horas? ¿Qué resultados se observarían en los tubos en el caso de que un microorganismo metabolizara oxidativamente la
glucosa?
4.
¿Explique por qué se busca la presencia de precipitados de sulfuros en el fondo del tubo de TSI y no en la
superficie?
5.
manual de prácticas del LABORATORIO PE f¥li€il€>B¡€IL0CI¡Á GENERAL
• McFaddin, J.F., J Mac Faddin. 2000. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 3rd ed.,
Lippicont, Williams & Wilkins.
• Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition) Edited by Francés
Pouch Downes and Keith Ito, 2001
• Practical Handbook of Microbiology. William O'Leary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press,
1989.
• Bergey's Manual of Determinative Bacteriólogo 9th edition, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
• Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA),
American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.
Ed. (1991).
Métodos de cuantificación
de microorganismos
introducción
objetivos
Que el alumno conozca algunas de
las técnicas de cuantificación directa e indirecta de microorganismos
más utilizadas. Que compare las ventajas y desventajas de cada una en
función de la información que se obtiene, del tiempo invertido y de los
recursos necesarios.
Existen diferentes métodos para cuantificar el número o peso (biomasa)
de células microbianas en un cultivo; los métodos pueden ser directos e
indirectos. Entre los directos se pueden mencionar a la determinación de
peso seco y el recuento de células en cámara de Neubauer.
La determinación de peso seco es un método de cuantificación muy utilizado en cultivos de gran densidad, sobre todo para hongos y levaduras. Como los cultivos se someten a varios procesos (filtración,
lavado, secado) se pueden causar pérdidas importantes de biomasa
y errores en la cuantificación.
a
El método de cuenta direaa en cámara tiene la ventaja de ser muy rápido y •o
económico, aun que no se pueden distinguir las células viables y no
viables. Se puede calcular el número de microorganismos en una muestra a partir del volumen de la cámara y de las diluciones de la muestra
que sean necesarias. Sin embargo, tiene el inconveniente de que la
observación y cuantificación se dificultan en células muy pequeñas (15/¿m) o en poblaciones de baja densidad debido al pequeño volumen
de muestra que se utiliza (0.1-0.2 mm3).
Entre los método indirectos, uno de los más utilizados es la medición de
laturbidez de los cultivos en un espectrofotómetro, que es relativamente rápida y que se basa en la capacidad de las células
microbianas de dispersar la luz que incide sobre éstas. Como el
tamaño de las células en una población es casi constante, el grado
de dispersión es proporcional a la concentración de células presentes pero no se puede diferenciar la turbidez dada por células
viables o no viables.
La forma de cuantificar células viables más utilizada en Microbiología, es
la de hacer diluciones y cuenta en placa con medios de cultivo específicos para la población de interés. Esta técnica se basa en la
suposición de que cada bacteria incluida en un medio de agar o en
su superficie se multiplicará y producirá una colonia visible, en consecuencia el número de colonias que se observarán a simple vista
será igual al número de bacterias viables o unidades formadoras de
colonias (UFO inoculadas en el agar multiplicadas por la dilución.
Esta técnica aplicada en muestras complejas, dará una estimación aproximada del número total de microorganismos, dependiendo del medio de cultivo utilizado, ya que no hay un medio y condiciones de
incubación que favorezcan el crecimiento de todos los
microorganismos. También pueden presentarse problemas relacionados con falta de homogeneidad de las diluciones y en la inoculación de las muestras, por lo que se pueden obtener bajos valores si
es que las células no se separan bien y valores elevados si la toma
de las muestras se hacen del fondo del tubo donde se han concentrado por gravedad los microorganismos.
65
m a n u a l d e p r á c t i c a s del
Materiales
6 cajas de Petri con agar nutritivo (Anexo 2.2 )
10 Pipetas de 1-2 ml_ estériles
10 Tubos con 9 mL de ssi (solución salina isotónica= 0.89%
NaCI)
1 matraz Erlenmeyer de 125 mL con 99 mL de ssi
Vasos de precipitados
1 Parrilla de agitación
1 espectrofotómetro
1 cámara de Neubauer
I pipeta Pasteur
Fenol al 2% (Anexo 1.9)
1 Varilla de vidrio doblada en L
1 Microscopio compuesto
Safranina (Anexo 1.8)
w
g
Procedimiento
El profesor proporcionará un cultivo de Saccharomyces cerevisiae y Escherichla colL
El alumno medirá la turbidez de los cultivos en un espectrofotómetro (Spectronic 20); cuantificarán el número de
células totales, por cuenta direaa en cámara de Neubauer y determinará el número de unidades formadoras
de colonias (UFO por dilución y siembra en placa.
Técnica turbidimétrica
1.
Encender el aparato y dejar que el instrumento se caliente por 15 minutos.
2.
Ajustar el aparato a la longitud de onda (520 nm)
3.
Calibrar el instrumento a 0% de transmitancia con el botón izquierdo. Para leer en la escala, observar la
aguja a nivel de los ojos y tomar el dato donde la aguja coincida sobre su reflejo en el espejo.
4.
Colocar una celda con medio de cultivo estéril como testigo (sin inocular) y calibrar el instrumento a 100% de
transmitancia.
5.
Para medir la turbidez de una muestra, vaciarla en otra celda, limpiar perfectamente con papel suave y
medir el valor de %T.
6.
Calcule la absorbancia de la fórmula A= -log (%T/100)
7.
En caso de disponer de un aparato digital ajustar la mediciones a absorbancia (D.O.).
66
Técnica de cuenta directa en
cámara de Neubauer
1.
Se coloca 1 mL de la muestra en un tubo de ensaye. Cuando se trata de cuantificar muestras muy concentradas (D.O > 1.5) será necesario preparar diluciones de la misma con solución salina isotónica. Agregar 0.5 mL
de solución de fenol al 2% y dos gotas de safranina. Mezclar y dejar en reposo durante 5-10 minutos.
o
2.
3.
Lavar cuidadosamente la cámara de Neubauer sin frotar la zona brillante del centro y el portaobjetos. Secar
con papel suave. Colocar el portaobjetos sobre la zona central limitada por dos excavaciones laterales,
donde se aprecian una zona cuadriculada a simple vista.
Homogeneizar perfectamente la muestra en un vórtex, tomar inmediatamente una muestra con una pipeta
Pasteur de punta fina y depositar una gota entre la cámara y el cubreobjetos por el borde de la cámara. Dejar
que la muestra se distribuya por capilaridad, evitando el exceso que dificultará la evaluación precisa de la
población microbiana.
4.
Dejar reposar durante 5 minutos, colocar la cámara en la platina del microscopio y localizar con el objetivo
seco débil (10X) la zona cuadriculada que se muestra en la Figura 7.
5.
Localizar el cuadro central grande (C1) que miden 1.0 mm por lado, que se encuentra dividido en 5X5
cuadros pequeños (C2) limitados por triple línea que miden 0.2mm por lado. Estos cuadros pequeños a su
vez se encuentran divididos en 16 cuadros mas pequeños (C3) de 0.05 mm de lado.
6.
Hacer la cuantificación de células con el objetivo seco fuerte (40X), contando el número de células que se
localicen en el cuadro C1, los cuadros de menor tamaño C2 sirven de guía para el cómputo. Se empieza a
contar desde la parte superior de los cuadros C2 y se continúa hasta la base. Si las células tocan los límites de
los cuadros C2; deberán contarse solamente aquellas que toquen la parte superior y el lado derecho del
cuadro. Si las células tocan la parte inferior o el lado derecho no se cuentan. Este método reduce las
posibilidades de contar la misma célula dos veces.
7.
Cuente hasta cerca de 200 a 250 células antes de determinar el número de células por mL En el proceso de
contar se pueden presentar tres situaciones diferentes que a continuación se explican:
I
8.
4)
a. Si hay de 200 a 250 células por cuadro grande (C1), multiplicar directamente X 104 para reportar el
número de células por mL.
b- Con menos de 200 células por cuadro grande (C1), será necesario contar algunos de los cuadros de las
esquinas (miden 1x1 mm de lado y divididos en 4X4). De esta manera se cuantificarán más de 200 células.
Después dividir el número total de células entre el número de cuadros empleados y sacar el valor promedio
por cuadro grande. Después multiplicar este valor por X 104 para reportar el número de células por mL.
c. En el caso de que se observen más de 200 células por cuadro grande (C1), se deberán contar las células de
los cuadros de menor tamaño (C2) hasta contar cerca de 200 células. Dividir este valor entre el número de
cuadros usados para la cuenta para sacar el valor promedio por cuadro C2. Multiplicar este valor promedio
por 25 para obtener el número de células aproximado en un cuadro grande (C1) y después multiplicar X104
para reportar el número de células por mL.
67
manual d eprácticas del
' ' - -.*;.:*
" < < rr ><-. Í ' ^ ' V . '«/«;«: \ *C --'. -\ '*:. -•'•«' :' **< \.
8.
El factor de 104 por el cuál se debe multiplicar el número de células por cuadro grande (C1) es porque este
cuadrado contiene un volumen de 0.1 mm 3 (mide 1mm por lado y la cámara tiene una profundidad de 0.1
mm).
# células/cuadro C1 (25cuadros C2) = # células/ 0.1 mm 3 X 104 = # células/mL
9.
En el caso de que el # de células sea muy grande, la suspensión deberá diluirse y se hará la corrección como
sigue:
# células/mL en la muestra diluida X (factor de dilución) = # células/ mL en la suspensión original.
(O
CQ
—
ü
1 mm
m
1 m
1 mm
1 mnri
0.2 mrri
::::::::i:E2
Cuadro 2 (40X)
Cuadro 1 (10X)
Figura 7. Cuenta en cámara de Neubauer
Técnica de dilución y siembra en placa
1.
Hacer diluciones decimales del cultivo de 105 hasta 10"9 en condiciones estériles (Figura 8). Se colocarán en
cajas de Petri con agar nutritivo por duplicado 0.1 mL de las últimas tres diluciones.
2.
Distribuir cuidadosamente el inoculo en toda la caja con ayuda de una varilla de vidrio doblada en "L"
previamente esterilizada a la flama del mechero y enfriada.
3.
Dejar absorber el líquido durante 10 minutos
4.
Incubar las cajas en forma invertida a 35°C durante 24-48 horas para bacterias y levaduras y de 5-7 días para
hongos filamentosos.
5.
Hacer la cuenta de las colonias de las placas, seleccionando la dilución donde el número de colonias sea
entre 30 y 300.
68
6.
Si la inoculación fue por duplicado o triplicado, se calcula el número promedio de colonias por dilución y
este número se multiplicará por el inverso de la dilución XI0 (por ajuste de volumen inoculado) para obtener la número total de unidades formadoras de colonias (UFC)/mL en la muestra original.
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
0)
1 mL
£
(6
a
•o
Cultivo bacteriano
10-3
io- 4
io- 5
io- 6
io- 7
O.lmL
XO.lmL
Figura 8. Técnica de dilución y cuenta en placa
Resultados
A.
Reportar los resultados de cuantificación de los cultivos, aplicando las técnicas descritas. Indicar los cálculos hechos para cada metodología.
B.
Recopilar sus resultados en el Cuadro 8 incluyendo los de los otros equipos, indicando la muestra analizada
por cada equipo. Discutir en cada caso cuáles fueron las ventajas y desventajas de las metodologías de
cuantificación.
69
Cuadro 8
Cuantificación de microorganismos por técnicas directas e indirectas
MICROORGANISMO
Turbidez (D.O.)
Cuenta en cámara de Neubauer
(# células totales/mL)
Cuenta viable en placa
(# UFC/mL)
Escherichia colí
(0
a
o
Saccharomyces
cerevisiae
Cuestionario
1.
Compare el método de dilución en placa con el método de cuenta direaa en cámara de Neubauer para la
cuantificación de microorganismos. ¿En que casos conviene usar cada uno?
2.
Explique cuáles son las ventajas y desventajas del método turbidimétrico de cuantificación de células.
70
3.
Mencione dos aplicaciones concretas en las que se utilicen cada una de las técnicas de cuantificación
realizadas.
1
(0
£
ti
a
•o
4.
Algunos autores sugieren la medición de actividad biológica y la determinación de constituyentes celulares
para la cuantificación de poblaciones microbianas. Comente sus ventajas y desventajas.
5.
71
Wistreich, G.A. and M.D. Lechtman. 1983. Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México.
• Johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings Publishing
Company, Inc. USA.
• Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1998. Brock Biología de los Microorganismos. Octava Edición.
Prentice Hall. España.
cú
ü
• Prescott L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana.
México.
72
I " O»
ai*
Efeao del pH y la temperatura en
el crecimiento microbiano
introducción
Objetivos
Que el estudiante conozca el efecto
del pH y la temperatura como parámetros de control del crecimiento microbiano. Que el alumno comprenda la
importancia de estos factores físicoquímicos en la selección de poblaciones microbianas en los diferentes
ambientes en que se encuentran y
los mecanismos de adaptación a nivel celular y metabólicos que han
desarrollado.
Los microorganismos están continuamente afectados por su ambiente, ya
que éste ejerce una influencia profunda en su desarrollo al igual que
sobre las demás formas de vida. Los factores del medio se pueden clasificar en tres grupos:
a).- Físicos.- temperatura, presiones externas, humedad.
b).- Químicos.- pH, disponibilidad de nutrimentos, presencia de productos tóxicos.
0)
(6
t
ti
c).-
a
Biológicos.- las interacciones microbianas entre las especies 0)
"O
coexistentes.
Algunos microorganismos están especialmente adaptados a los habitat
extremos, donde otros no pueden sobrevivir y que incluso tienen
propiedades fisiológicas que restringen su crecimiento a tales sitios. En otros habitat menos rigurosos, las fuentes de nutrimentos y
las interacciones entre poblaciones adquieren mayor importancia
en la selección de las poblaciones que se encontrarán.
Los factores ambientales que se controlan en condiciones de laboratorio
con mayor frecuencia, además de los nutrimentales son los
fisicoquímicos como: la temperatura y pH.
Todos los organismos tienen una temperatura óptima de crecimiento que
los caracteriza; en la cual muestran las tasas más elevadas de crecimiento. También hay límites de temperatura, la temperatura mínima en las que son metabólicamente inactivos y una temperatura
arriba de la cuál el crecimiento ya no es posible llamada temperatura máxima.
De acuerdo a su temperatura óptima de crecimiento, los microorganismos
se dividen en psicrófilos (<0°C-20°C), mesófilos (20-40°C), termófilos
(40-80°C) e hipertermófilos (80-110°C). La mayoría de hipertermófilos son arqueas como Methanococcus ¡Qneus. Las diferencias entre la temperatura óptima de crecimiento y los intervalos de
temperatura entre los cuales es posible el crecimiento de bacterias
y arqueas determinan la separación espacial en la naturaleza de
estos dominios de microorganismos.
La concentración de iones hidrógeno del medio afecta directamente a
los microorganismos y enzimas, e influye también en la disociación y solubilidad de moléculas que requieren. Sin embargo, algunos microorganismos se han adaptado a diferentes condiciones de
acidez o alcalinidad, como Sulfolobusy Thiobacillus que crecen a
pH tan ácido como 1 - 2 oxidando minerales de sulfuro para producir ácido sulfúrico y son llamado acidófilos.
75
Otros microorganismos se desarrollan en los habitat naturalmente alcalinos como lagos salados y desiertos donde los valores de pH 10 son comunes, estos alcalófilos incluyen especies de Rhizoblum, Bacillusy algunas
bacterias entéricas y cianobacterias. En general los hongos son más tolerantes a la acidez que las bacterias.
Cada microorganismo tiene un rango de temperatura y pH en el cual pueden crecer, de tal manera que al
modificarse estos factores se pueden alterar la velocidad de crecimiento y causar la muerte de lo mismos,
por lo que se pueden utilizar como factores de control del crecimiento microbiano.
Materiales
2 Cajas d e Petri con m e d i o d e Papa Dextrosa Agar (Anexo
2.6) ajustado a p H 7.0
2 Cajas d e Petri con m e d i o d e Papa Dextrosa Agar ajustado a pH 5.0
2 Cajas de Petri con medio de Papa Dextrosa Agar ajustado a pH 9.0
22 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación (Bioxon) ajustado a pH 7.0 sin amortiguar (Anexo 2.19)
4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH
5.0 sin amortiguar
9.0 sin amortiguador
7.0 con amortiguador (Anexos 1.1, 2.19)
5.0 con amortiguador
9.0 con amortiguador
1 Asa de inoculación
3 pipetas de 1.0 mL. estériles
1 mechero Fisher
Espectrofotómetro
Microscopio estereoscópico
Soluciones amortiguadoras de pH 4, 7 y 10
fió
0
Procedimiento
El profesor proporcionará cultivos líquidos de: Escheñchia coli, Pseudomonas fluorescensy Lactobacii/ussp., una
suspensión de esporas de Aspergillus nigery Penicillium roqueforti. Cada uno de los tubos y cajas deberán
etiquetarse con el nombre del microorganismo que se inoculará.
Efecto de la Temperatura
1.
En tres cajas de Petri con PDA divididas en dos secciones, inocular 0.1 mL. de la suspensión de esporas de
hongos en cada sección.
2.
Incubar una caja de Petri a 15°C, otra a 30°C y la última a 45°C en forma invertida durante 72 horas y hacer
las observaciones macroscópicas.
76
3.
Incubar nuevamente las cajas y realizar observaciones en microscopio estereoscópico después de una semana.
4.
En seis tubos de caldo microinoculación ajustado a pH 7.0, inocular dos con cada una de las cepas bacterianas.
5.
Incubar dos tubos en estufa a 15°C, otros dos a 30°C y los dos últimos a 45°C durante 24-48 horas. Medir la D.O.
Efecto del pH
1.
2.
Preparar tres series de cuatro tubos de caldo de microinoculación ajustados a 3 diferentes valores de pH
(5.0, 7.0 y 9.0) con solución de HC11.0 M o NaOH 1.0 M.
Preparar otra serie de cuatro tubos ajustados a los mismos valores de pH del punto anterior pero utilizando
soluciones amortiguadoras tal como se indica en la Tabla del Anexo 1.10.
3.
Inocular 0.1 ml_. de cada una de las cepas bacterianas en la serie de seis tubos de caldo microinoculación
ajustados a diferentes pH con amortiguador y sin amortiguador, dejando uno sin inocular como testigo.
4.
Incubar los tubos a 35 °C durante 24-48 horas y medir la D.O.
5.
Inocular tres cajas de Petri con medio PDA ajustado a tres pH diferentes con cada una de las cepas de
hongos.
6.
Incubar las cajas de Petri a 30 °C durante 72-96 horas y hacer observaciones macroscópicas.
7.
Después de una semana observar las cajas en microscopio estereoscópico.
i
a
•o
Resultados
A.
Reportar los resultados en los cuadros 8, 9 y 10 de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-),
crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++).
B.
Comparar sus resultados con los reportados en la bibliografía de cada una de las cepas.
77
m a n u a l d e p r á c t i c a s d e l . v>
-
v<;\ -: 1 ; ^ > 1 ^ ' ! ' ' S ^ ' n u ' , : ^ ; : < ? '
•'::;.^':,''iv>.
Cuadro 9
Efecto de la temperatura de cultivo en el crecimiento microbiano
TEMPERATURA
PAPA DEXTROSA AGAR
15°C
30°C
45°C
Aspergí I Ius níger
Morfología de la colonia
a las 72 horas
Morfología microscópica
a la semana
a
o
Penidllium roquefortí
a las 72 horas
a la semana
CALDO
.
MICROINOCULACIÓN
Escherlchla col i
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbancia (D.O.)
Pseudomonas
fluorescens
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbancia (D.O.)
Lactobadllus sp.
A
r\
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbancia (D.O.)
78
Cuadro 10
Efecto del pH de cultivo en el crecimiento microbiano
PAPA DEXTROSA AGAR
¡111
lili
Aspergí/fus n/ger
a las 72 horas
I
a la semana
I
ff
Penidlllum roquefortl
a las 72 horas
a la semana
Sin amortiguador
Con amortiguador
CAtDO
.
MICROINOCULACIÓN
PH5.0
PH7.0
PH9.0
PH5.0
PH7.0
PH9.0
Escherichia col!
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbanda(D.O.;
Pseudomonas
fíuorescens
r\
r\
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbancia(D.O.)
Lactobadllus sp.
i
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbanda(D.O.)
79
Cuestionario
1.
¿Cuáles son las temperaturas cardinales y como se clasifican los microorganismos de acuerdo a su temperatura óptima de crecimiento?
2.
¿Como influyó el pH en el crecimiento de hongos y baaerias? ¿Que diferencias se observaron en los medios
de cultivo amortiguados y sin amortiguar?
3.
Explique brevemente cuáles son los mecanismos celulares que los microorganismos termófilos extremos y
psicrófilos han desarrollado para adaptarse a condiciones extremas de temperatura y pH.
4.
Explique cuál es la relación que existe entre condiciones óptimas de crecimiento en el laboratorio y las
condiciones del habitat de origen de las poblaciones microbianas.
5.
(0
ffl
•Harrigan, W.F. Laboratory Methods in Food Microbiology. 1998. Academic Press. 3a. Edition.
• Jay, J.M.1994. Microbiología Moderna de los Alimentos. Tercera Edición. Editorial Acribia, Zaragoza, España.
• Holt, J. C , N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative
Bacteriólogo 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
80
Efecto de la actividad de agua
en el crecimiento microbiano
Objetivos
Que el estudiante conozca las respuestas de crecimiento de diferentes cultivos microbianos, frente al
estrés osmótico causado por la adición de azúcares, la adición de NaCI
y la desecación. Que el alumno comprenda el efecto de estos factores
sobre la actividad de agua y los mecanismos de adaptación que han desarrollado los microorganismos.
introducción
El agua líquida es esencial para todos los procesos bioquímicos. Para los
microorganismos, un factor crítico es la disponibilidad de agua líquida
más que la cantidad total de agua presente en el ambiente. El total de
agua realmente disponible para uso microbiano se expresa como la actividad de agua (aw).
Los efectos de las altas concentraciones de solutos sobre los microorganismos pueden deberse a los solutos mismos o a los efectos del
soluto sobre la aw. Cada vez que se disuelven sustancias en el agua
pura se disminuye la cantidad de agua disponible o agua libre. La
actividad de agua en términos termodinámicos proporciona una
medida de agua libre y es definida por la ecuación
a-
Po
nt +n2
Donde P- la presión de vapor de la solución y Po es la presión de vapor
del agua pura, n1 y n2 son el número de moles de soluto y solvente
respectivamente. Así, si la concentración de soluto aumenta la aw
disminuye, para agua pura la aw es igual a 1.0.
La mayoría de microorganismos solo toleran pequeños disminuciones en
la aw y al igual que con otros factores ambientales, hay notables
excepciones de microorganismos que toleran o incluso requieren
actividades de agua reducidas como: las bacterias halofílicas, hongos xerofíticos y las levaduras osmófilas. Las bacterias halófilas que
viven en ambientes salinos son las que mejor toleran la disminución de la aw independientemente del soluto utilizado para reducirla, mientras que en las otras la tolerancia varía en función del soluto
que se utiliza para disminuirla.
Estas propiedades de disminución de la aw en soluciones es la base de
algunos sistemas de conservación de alimentos, por ejemplo: el
salado del pescado o en la adición de elevadas concentraciones de
azúcares en mermeladas.
manual de prácticas del tjmcmKtomo
PE f¥t¡Clt€IB¡0L€lGÍA SEüEff AL
.
Materiales
1 asa de inoculación
1 Espectrofotómetro
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 10% de sacarosa (p/v)
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 30% sacarosa
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 60% de sacarosa
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 1 % NaCI (p/v)
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 5 % NaCI
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 10 % de NaCI
6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 10% sacarosa
6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 30% sacarosa
6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 60% de
S
sacarosa
6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 1 % NaCI
36 tubos de ensayo vacíos y estériles
5 pipetas de 1mL estériles
Procedimiento
El profesor proporcionará cultivos líquidos de bacterias: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Pseuc/omonas sp. y hongos: Saccharomyces rouxii, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum. En series de tres
cajas de Petri y 6 tubos de cada medio se inocularán por equipo tres de los microorganismos.
Efecto de la presión osmótica y
actividad de agua (aw) en hongos y bacterias
1.
Inocular en el centro de las cajas de Petri, con una gota de cada una de las cepas de hongos.
2.
Inocular con 0.1 mL de cultivo de dos de las cepas de bacterias en dos tubos de ensaye con 7mL de cada uno
de los medios.
3.
Incubar las cajas en forma invertida a 30°C y los tubos de caldo a 35°C durante 48 horas y hacer las observaciones. Incubar nuevamente y a la semana realizar observaciones de la morfología de los cultivos en cajas y
en tubos medir la turbidez de los cultivos en caldo nutritivo a las 24-48 horas.
Efecto de la desecación
1.
En series de seis tubos de ensayo vacíos y estériles, con una pipeta estéril, colocar una gota de una suspensión de cada uno de los siguientes cultivos bacterianos: Bacillus subtilis, Escherichia co/iy en un tercer tubo
una gota de una suspensión de esporas de Aspergillus niger
2.
Cerrar los tubos y dejarlos a la temperatura ambiente durante una semana
3.
En dos tubos de cada cultivo agregar 3 mL de caldo nutritivo estéril.
84
4.
Incubar los tubos a 35 °C durante 24-48 horas.
5.
Observar si hay crecimiento o no.
6.
Repetir la instrucciones de los puntos 3-5, después de dos y tres semanas en los tubos restantes.
Resultados
A.
Reportar los resultados en los Cuadros 11-13. de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-),
crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++).
B.
Medir la absorbancia de los tubos de cultivo en un espectrofotómetro.
C.
Investigar los resultados bibliográficos de cada una de las cepas y compararlos con los obtenidos en la •o
práctica
a
o
Cuadro 11
Efecto de la presión osmótica y aaividad de agua en el crecimiento de baaerias
0.990)
CEPA
Sacarosa
10%
0.940)
= 0.970)
NaC11%
Sacarosa
30%
A
Staphylococcus sp.
Nací 5%
A
Sacarosa
60%
r\
NaCI 10%
A
Crecimiento a las
24 horas
Densidad óptica:
Escherichia coli
r\
A
Crecimiento a las
24 horas
Densidad óptica:
Baclllus subtílis
A
r\
Crecimiento a las
24 horas
Densidad óptica:
85
Cuadro 12
Efecto de la presión osmótica y actividad de agua en el crecimientos de hongos
(aw = 0.990)
CEPA
Sacarosa
10%
Nací 1 %
( ^ = 0.970)
Sacarosa
30%
Nací 5%
( ^ = 0.940)
Sacarosa
60%
NaC110%
Sacharomyces
rouxll
m
o
a las 72 horas:
después de una semana:
AspergíIIus nlger
a las 72 horas:
Penlcllllum
chrysogenum
a las 72 horas:
86
Cuadro 13
Efeao de la desecación en la recuperación de cepas microbianas de bacterias y hongos
.1
r\
!
Escheríchla col!
/
SEMANA
>
•
•
•
**
1
i.;.
:
<J
1
/->
KJ
0)
I
I
depósito:
Absorbanda (D.O.):
Badilus subtilis
r\ r\
r\ /^\
<J
\J
depósito:
Absorbanda (D.O.):
AspergíIIus nlger
r\ r\
r\
r\
r\
<J
U
Crecimiento: superficial
depósito:
Absorbanda (D.O.):
Cuestionarlo
1.
Definir brevemente los términos: osmófilo, halófilo, xerófito.
manual de prácticas del LABOItJITOlIlCI OE ¡VfiCHOBiOLd&iA
2.
¿Cuáles son las hipótesis que tratan de explicar la osmofilia y la halofilia de poblaciones microbianas?
3.
Explique ¿cuál es la importancia de controlar la artividad de agua en procesos de conservación de alimentos? ¿Que es la plasmoptisis? ¿Que es la plasmólisis?
4.
¿Que relación hay entre la aw y la humedad relativa ?
5.
¿Como se explica la mayor tolerancia de los hongos a valores de aw reducidos que en bacterias?
6.
0)
o
• Johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings Publishing
Company, Inc. USA.
• Wistreich, G.A. and M.D. Lechtman. 1983. Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México.
México.
88
1O
O
O
^
Curva de crecimiento bacteriano
introducción
Objetivos
Que el estudiante conozca las fases
de una curva de crecimiento en un
cultivo en lote de Escherichla colL
Que el alumno aprenda a calcular
parámetros cinéticos (/*, td) característicos de las especies bacterianas.
ú
El crecimiento y la viabilidad de los microorganismos está determinada
por factores nutricionales y ambientales, y en condiciones de laboratorio
óptimas, es posible predecir una curva de crecimiento característica de
cada especie microbiana.
•o
Cuando una bacteria es inoculada a un medio de cultivo líquido fresco,
experimentará un periodo de adaptación al medio y condiciones
de cultivo y posteriormente se dividirá en forma exponencial, dando lugar a una curva de tipo sigmoidal que se acostumbra dividir
en 4 partes:
ti
t
es
a
o
•o
3
o
u
B
Oí
3
tiempo
A) fase de retardo, de adaptación o fase lag, B) fase de crecimiento
exponencial o fase log, C) fase estacionaria y D) fase de declinación o muerte. La forma de cada porción de la curva y el tiempo de
duración de cada fase dependerá de: la especie de microorganismo, la preparación del inoculo, la composición química del medio
de cultivo y las condiciones ambientales de incubación.
Durante la fase de adaptación no hay división celular, la célula está sintetizando nuevos componentes, durante la fase exponencial los
microorganismos que se dividen por fisión binaria lo hacen a intervalos regulares, finalmente el crecimiento de la población disminuye y la curva se vuelve horizontal debido al agotamiento de
nutrimentos o la acumulación de productos residuales tóxicos hasta que la población disminuye.
En general las bacterias crecen con mayor rapidez que los
microorganismos eucarióticos y los eucarióticos pequeños se desarrolla más rápidamente que los grandes.
El metabolismo energético también influye sobre la velocidad de crecimiento, debido a la ganancia energética que se obtiene de cada vía
91
manual de prácticas del I
O£
catabólica de obtención de energía. Así, los microorganismos fermentadores crecerán mas lentamente que
los respiradores.
Materiales
1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio
líquido (Anexo 2.18)
2 Matraces Erlenmeyer de 125 mL con 99 mL de solución
salina isotónica estéril
6 Pipetas de 10 mL estériles
16 Pipetas de 1 mL estériles
1 Potenciómetro
1 Mechero Fisher
1 Espectrofotómetro y celdas
1 Gradilla
16 Tubos con 9 mi de solución salina isotónica estéril
1 Varilla doblada en "L"
12 Cajas de Petri con Agar Nutritivo (Anexo 2.2)
Procedimiento
El profesor inoculará Escherichia co/fen un matraz Erlenmeyer con medio líquido complejo 12 horas antes de
iniciar la práctica, que se utilizará como inoculo para los cultivos en matraces Erlenmeyer con diferente concentración de glucosa.
Los estudiantes cuantificarán el crecimiento periódicamente durante 6 horas de incubación. Se aplicarán los métodos turbidimétrico y el de diluciones y siembra en placa (práctica* 7) para cuantificar el crecimiento bacteriano.
Inoculación e incubación del cultivo
1.
Inocular en condiciones estériles un matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio de cultivo complejo
con 10 mL de un cultivo de Escherichia coli
2.
Homogeneizar cuidadosamente agitando el matraz e inmediatamente tomar una muestra de 5 mL con una
pipeta estéril y vaciarla en una celda del espectrofotómetro. Esta muestra corresponderá al tiempo cero
(t=0). De la misma manera se tomarán muestras a las 0.5, 1, 2, 3 y 4 horas. Para el tiempo de 6 horas de
incubación se tomarán 6 mL
3.
Colocar el cultivo en incubadora con agitación (150 rpm) a 35°C
Tratamiento de las muestras
1.
Determinar la turbidez de las muestras en un espectrofotómetro a 560 nm. Leer el valor de la densidad
óptica (Figura 9).
92
2.
En la muestra de 6 horas además de evaluar la turbidez, se deberá poner 1 mL del cultivo en un matraz
Erlenmeyer con 99 mL de solución salina isotónica (ssi) estéril. Del matraz con la muestra diluida, hacer una
serie de diluciones en tubos con 9 mL de ssi estéril, hasta 108. Cuidando de homogeneizar las muestras
cada vez que se haga una nueva dilución.
3.
Enseguida inocular 0.1 mL de las últimas tres diluciones en dos cajas de Petri con agar nutritivo y distribuir
la muestra con una varilla de vidrio doblada en "L".
4.
Dejar que se absorba el líquido en las cajas y posteriormente incubarlas en forma invertida durante 24-48
horas.
5.
Cuantificar el número de UFC/mL de Escherichia colL
t(0
a
o
•o
10 mL
055
(5)
(6)
Figura 9. Tratamiento de muestras para medición del crecimiento microbiano y elaboración de una curva de crecimiento.
93
Resultados
A.
Se registran los resultados de cuantificación del crecimiento de Escherichla co/ien el Cuadro 14.
B.
El alumno reportará también en forma gráfica la relación entre dos variables, la variable independiente
siempre será el tiempo que se colocará en el eje X, para cada concentración de glucosa
a. Una gráfica de D.O. contra el tiempo
b. En la gráfica a) identificar las fases de crecimiento y duración
ü
c. Determinar la tasa de crecimiento promedio (k) de la fórmula k=( log N- log No)/ log 2 (t), donde No=# de
UFC al tiempo "0" y N = # de UFC al final del experimento
d. Calcular la tasa de crecimiento especifica ( JU ) de la fórmula fi = In2 (k) con este valor determinar el tiempo
de generación de Escherichia co/í con la relación td= In2/fi
Cuadro 14
Resultados de mediciones del crecimiento de Escherichia coll en un
cultivo por lote con diferentes concentraciones de glucosa
Tiempo de muestreo (h)
Turbidez (D.O.)
UFC/mL
0
0.5
1
2
3
4
6
94
Cuestionario
1.
¿Cómo se define el crecimiento en Microbiología y cuáles son los eventos a nivel celular que ocurren en
cada una de las etapas de crecimiento?
!
a
2.
¿Qué condiciones ambientales y nutrimentales causarán una disminución o eliminación de la fase lag en la
curva de crecimiento. ¿Que condiciones la incrementaría?
3.
¿Cómo se define el tiempo de duplicación? ¿Cómo se relaciona con la tasa de crecimiento específica
4.
95
• Larpent-Gourgaud, M., J.P. Larpent, B. Boissonnet. (1988). Travaux pratiques et diriges de Microbiologie.
Société Marocaine des Editeurs Réunis. Rabat, Maroc.
México.
a
o
96
o
o
Brooks, G.F., ButelJ.S., Morse, S.A. 1999. Microbiología médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Editorial
el Manual Moderno. 16a. Edición.
Harrigan, W.F. Laboratory Methods in Food Microbiology. 1998. Academic Press. 3a. Edition.
Jay, J.M.1994. Microbiología Moderna de los Alimentos. Tercera Edición. Editorial Acribia, Zaragoza,
España.
|
£
ti
a
•o
Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1998. Brock Biología de los Microorganismos. Octava Edición.
Larpent-Gourgaud, M., J.P. Larpent., B. Boissonnet. (1988). Travaux pratiques et diriges de Microbiologie.
Société Marocaine des Editeurs Réunis. Rabat, Maroc.
Manual de Medios de Cultivo. Bioxon.
Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana.
México.
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods 2001 (4th Edition) Edited by
Francés Pouch Downes and Keith Ito. American Public Health Assosiation.
Practical Handbook of Microbiology. 1989 William M O'Leary (Ed), Cornell Medical College, New York,
New York, USA. CRC Press.
Holt, J. G., N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative
Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated
(APHA), American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and
Wastewater. Ed. (1991).
99
/ ^ K / f - u v ^ Y ;-:
i-;-;:".
'
"
;",:'
'*
100
0
'J$fF*F
0
Preparación de soluciones
y colorantes
1.
Azul de lactofenol
Disolver cuidadosamente 10 g de fenol (cristales)
en 20 ml_ de agua destilada, agregar 20 g de ácido láctico y 40 g de glicerol. Posteriormente disolver 0.05 g de azul de metilo.
2.
Verde de malaquita
Disolver 5.0 g del colorante verde de malaquita
en 100 mL de agua destilada.
5.
Solución de lugol
En un matraz aforado de 50 mL, disolver 0.333 de
yoduro de potasio en 20 mL de agua destilada y
enseguida agregar lentamente 0.166 g de yodo,
mezclar completamente y aforar con agua destilada.
6.
Solución decolorante alcohol-acetona
Colocar en una probeta de 50 mL, 30 mL de alcohol etílico y 20 mL de acetona, mezclar perfectamente.
7.
Alcohol al 70%
8.
Safranina
En un matraz aforado de 50 mL colocar 5 mL de
alcohol etilico y disolver 0.125 g de safranina. Aforar con agua destilada
9.
Solución de Fenol al 2%
En un matraz aforado de 100 mL colocar 2.0 g de
fenol cristales y disolver con un poco de agua poco
a poco, después aforar con agua destilada.
Azul de metileno alcalino
Disolver 0.3 g de azul de metileno en 30 mL de
alcohol etílico al 95% y mezclarlo con 100 mL de
solución de hidróxido de potasio al 0.01%
3.
4.
Cristal violeta
Este colorante se prepara en dos partes,
a. Solución a: en un vaso de precipitados de 50
mL colocar 10 mL de alcohol etílico y disolver
1 g de cristal violeta. Solución b: en otro vaso
se disuelven 0.4 g de oxalato de amonio en
40 mL de agua destilada.
b. Mezclar cuidadosamente las soluciones a)
y b)
c. Guardar la mezcla en un frasco ámbar en
obscuridad durante 24 hrs. Filtrar en papel
Whatman No. 1 antes de utilizarlo.
10. Soluciones amortiguadoras para controlar el pH de medios de cultivo
PH
2.8
3.6
4.4
5.2
6.0
6.8
7.6
8.4
9.2
10
K2HPO4
0.2 M (mL)
0.3
0.6
0.9
1.1
1.3
1.5
1.9
-
Ácido Cítrico
0.1 M (mL)
Ácido Bórico
0.2 M (mL)
1.7
1.4
1.1
0.9
0.7
0.5
0.1
-
1.7
1.3
1.0
NaOH
0.2 M (mL)
0.3
0.7
1.0
Caldo Nutritivo
(mL)
8.0
8.0
8.0
8.0
8.0
8.0
8.0
8.0
8.0
8.0
103
104
:\.k
o
o
*
**0
Preparación de medios de cultivo
1.
Caldo nutritivo (CN). Es un medio líquido complejo de uso general para el cultivo de bacterias
ingredientes
Peptona de caseína
NaCI
Extracto de carne
PH
<g/L)
5.0
8.0
3.0
6.5-7.0
a.
b.
c.
d.
Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado
Ajustar el pH
Distribuir en tubos de ensaye con tapón de rosca
Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos
2.
Agar nutritivo (AN). Es un medio sólido complejo de uso general para el cultivo de bacterias exigentes
ingredientes
Peptona de caseína
NaCI
Extracto de carne
Agar
PH
a.
b.
c.
d.
e.
(g/t)
5.0
8.0
3.0
15.0
6.5-7.0
Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado, menos el agar.
Ajustar el pH
Agregar el agar y calentar a ebullición durante 1 minuto
Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas.
3.Medio Mínimo de Sales (MM). Es un medio químicamente definido de uso general para el cultivo de bacterias
poco exigentes.
ingredientes (g/L)
Glucosa"
(NH4)2SO4
MgSO4«7H2O
K2HPO4
FeSO4-7H2O
DH
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
Medio 1.
10.0
5.0
2.0
2.0
0.1
6.5-7.0
Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado, excepto la glucosa.
La glucosa debeiá disolverse en recipiente separado de las sales.
Ajustar el pH en el medio de sales.
Agregar el agar (15 g/L) y calentar a ebullición durante 1 minuto.
Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos las dos soluciones.
Dejar enfriar a 40°C y cerca del mechero mezclar las soluciones.
107
manual de prácticas del \ - ".": \¿ ¿ ?í Va\O :*T:
4.
Agar de Eosina azul de metileno (EMB-agar). Es un medio de cultivo comercial utilizado para identificación y diferenciación de enterobacterias.
Ingredientes
Peptona de gelatina
Lactosa
Sacarosa
K2HPO4
Eosina
Azul de metileno
Agar
<g/L)
10.0
5.0
5.0
2.0
0.4
0.065
13.5
(0
ca
a.
b.
c.
d.
Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco.
Calentar a ebullición durante 1 minuto
5.
Agar para Estafilococos No. 110. Es un medio selectivo comercial para el aislamiento e identificación de
estafilococos.
ingredientes
Extracto de levadura
Peptona de caseína
Gelatina
Lactosa
D-Manitol
NaCI
K2HPO4
Agar
pH final
a.
b.
c.
d.
6.
Papa-Dextrosa Agar (PDA). Es un medio sólido complejo comercial de uso general para el cultivo de hongos.
Ingredientes
Glucosa
Extracto de papa
Agar
PH
a.
b.
c.
d.
e.
(g/L)
2.5
10.0
30.0
2.0
10.0
75.0
5.0
15.0
7.0
(g/L)
20.0
4.0
15.0
5.6
Ajustar el pH
7.
Papa Dextrosa Agar rosa de bengala Es un medio sólido complejo de uso general para el aislamiento de
hongos
Ingredientes
Glucosa
Extracto de papa
Rosa de bengala
Agar
pH
(g/L)
20.0
4.0
0.03
15.0
5.6
a.
b.
c.
d.
e.
Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado, menos el agar
Ajustar el pH
8.
Czapek-Dox Agar (CDA) Es un medio de sales, de uso general para el cultivo de hongos poco exigentes.
Ingredientes
Sacarosa
NaNO3
KH2PO4
MaSO4-7H2O
KCI
FeSO4-7H2O
Agar
PH
9.
Caldo rojo de fenol Es un medio con diferentes azucares (glucosa, sacarosa, manitol) para pruebas de
fermentación
Ingredientes
(g/L)
Azúcar
20.0
a.
b.
c.
d.
e.
•o
30.0
2.0
1.0
0.5
0.5
0.01
15.0
5.6
Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado. Ajustar el pH
Rojo de fenol
pH final
a
<g/u
a.
b.
c.
d.
KH 2 PO 4
K 2 HPO 4
(0
9.1
9.5
0.1
0.01
6.8-7
Disolver cuidadosamente las sustancias
Ajustar el pH
Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca
Colocar un tubo de Durham invertido
109
10.
Ingredientes
Citrato de Sodio
K2HPO4
NH4H2PO4
MgSCy7H 2 O
NaCI
FeSCy 7H2O
Agar
Azul de bromotimol
PH
(0
CQ
0
Medio citrato de Simmons Agar. Medio complejo de prueba de utilización de citrato en enterobacterias
a.
b.
c.
d.
e.
f.
(g/U
2.0
1.0
1.0
0.2
5.0
0.01
15.0
0.08
7.0
Ajustar el pH
Calentar a ebullición durante 1 minuto.
Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca.
Dejar solidificar el medio en forma inclinada.
11. Caldo urea. Se emplea para la identificación de bacterias, particularmente para diferenciar los miembros del
género Proteus de Salmonella yShlgella
Ingredientes
Urea
KH2PO4
K2HPO4
Rojo de fenol
pH final
a.
b.
c.
<g/U
20.0
9.1
9.5
0.1
0.01
6.8
Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
12. Medio SIM. Medio semisóiido usado rutinariamente en la diferenciación e identificación de cultivos de
Enterobacterias y que detecta la producción de sulfuras, indol y movilidad de las mismas.
Ingredientes
Peptona de caseína
Peptona de carne
Sulfato de hierro y amonio
Tiosulfato de sodio
Agar
pH final
a.
b.
c.
(g/L)
20.0
6.1
0.2
0.2
3.5
7.3
110
13. Agar almidón. Para determinar actividad amilolítica
ingredientes
(g/U
Almidón
Peptona de caseína
NaCI
Extracto de carne
Agar
pH
10.0
5.0
8.0
3.0
15.0
6.5-7.0
ti
a.
b.
c.
d.
t
Ajustar el pH
(8
a
o
T3
14. Medio de leche con tornasol. Medio comercial para diferenciar microorganismos sobre la base de sus
múltiples reacciones metabólicas en un medio lácteo
ingredientes
(g/L)
Leche descremada deshidratada 100
Polvo de tornasol
0.75
a.
b.
c.
15. Agar de hierro y triple azúcar TSI. Medio comercial para identificar y diferenciar enterobacterias. Se basa
en la formación de sulfuros y fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa.
ingredientes
Mezcla de peptonas
NaCI
Lactosa
Sacarosa
Dextrosa
Sulfato de amonio férrico
Tiosulfato de sodio
Rojo fenol
Agar
pH final
a.
b.
c.
d.
e.
(g/L)
20.0
5.0
10.0
10.0
1.0
0.2
0.2
0.025
13.0
7.3
Dejar solidificar el medio en forma inclinada.
111
16. Medio de gelatina. Medio comercial para determinar actividad de proteasas
Ingredientes
Peptona de gelatina
Extracto de carne de res
Gelatina
pH final
(g/U
5.0
3.0
120.0
6.8
a.
b.
c.
17.
Medio de agar nutritivo blando.- Es un medio semisóiido complejo de uso general para determinar movilidad de bacterias
QQ
Ingredientes
Peptona de caseína
NaCI
Extracto de carne
Agar
PH
a.
b.
c.
d.
e.
(0/L)
5.0
8.0
3.0
3.5
6.5-7.0
Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado
Ajustar el pH
Distribuir en tubos de ensaye con tapón de rosca
18. Medio de cultivo complejo. Para la curva de crecimiento microbiano probando diferentes concentraciones
de sustrato carbonado. (1-20 g/L)
Ingredientes
Glucosa
Peptona de caseína
K2HPO4
PH
a.
b.
c.
d.
(g/L)
10.0
2.0
0.5
0.5
6.5
Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado.
Agregar la cantidad de glucosa correspondiente
Ajustar el pH
112
19.
Caldo microinoculación. Medio comercial para cultivar y preparar inóculos de Lactobacilos y otros
microorganismos utilizados en ensayos microbiológicos.
ingredientes
Mezcla de peptonas
Dextrosa
KH2PO4
Polisorbato 80
PH
a.
b.
c.
<g/U
20.0
5.0
10.0
2.0
0.1
6.5
Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado.
Ajustar el pH
•o
o
{
w
o
113
*>
>
,
114
• ;; •
-
Atlas de pruebas bioquímicas
116
CITRATO DE SIMMONS
USINA DESCARBOXILASA
a: negativo, b: y c: positiva
a: negativo, b:, c: y d: positiva
TRIPLE A Z Ú C A R H I E R R O
a: negativo, b: ácido/ácido
c: ácido/alcalino con gas
PRODUCCIÓN DE GAS EN CAMPANA DE DURHAM
SULFURO INDOL MOHLIDAD
a: negativo, b: positivo con gas, c: positivo sin gas
a: sin inocular, b: microorganismo no móvil,
c: microorganismo móvil
LECHE TORNASOLADA
a: negativo, b:, c: y d: positiva
AISLAMIENTO DE Rhodotorula
sp.
Manual de prácticas del Laboratorio de Microbiología General, se terminó de imprimir
en el mes de junio de 2004 en la Sección de Talleres Gráficos del Departamento de Publicaciones de Rectoría General de la Universidad Autónoma Metropolitana. Se tiraron 1000 ejempiares sobre papel gráfico bond de 60 kgs., en tipos Castle de 11 y 13 pts., en interiores y de
32 y 17 pts., para portada. Diagramación, formación y portada, diseñados por D.G. Liliana
Hidalgo Sánchez de Tagle, de la Sección de Textos y Formación del mismo Departamento.
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N.E. 0534
$17.00
101412
9 789703
Manual de prac.
lab de
microbiología general,
publicaciones CBS
UAM-Iztapalapa Librería

manual de practicas de laboratorio de microbiologia general

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