Programa y resumenes - Instituto de Investigaciones Biológicas

Transcripción

2
COMISIÓN DIRECTIVA DE LA SBBM
Presidente
Estela Castillo
[email protected]
Secretaria
Andrea Medeiros
[email protected]
Tesorero
José Manuel Verdes
[email protected]
Vocales
Miriam Barros
[email protected]
Patricia Berasain
[email protected]
Uruguaysito Benavides
[email protected]
Martin Breijo
[email protected]
Laura Castro
[email protected]
Álvaro Díaz
[email protected]
Gustavo Folle
[email protected]
Gabriela Irazoqui
[email protected]
Pilar Irisarri
[email protected]
Alejandra Kun
[email protected]
Silvia Olivera
[email protected]
Pablo Opezzo
[email protected]
German Pérez
[email protected]
Analía Richeri
[email protected]
Andrés Trostchansky
[email protected]
COMISIÓN ORGANIZADORA DE LAS 6as JORNADAS
Presidenta
E. Castillo
Secretaria
A. Medeiros
Tesorero
J. Verdes
Vocales
M. Barros, P. Berasain, L. Castro, A. Díaz, G. Irazoqui, A. Kun,
S. Olivera, G. Perez, A. Richeri, A. Trostchansky
Apoyo Secretaria M. Bresque
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PROGRAMA COMPLETO 6as JORNADAS SBBM
RESUMEN
Horario
Lunes 9
Horario
Martes 10
8:45 a 9:35
Acreditaciones
9:00 a 11
Simposios VII, VIII y IX
9:35 a 9:45
Apertura de las Jornadas
11:00 a 11:30
Pausa Café
9:45 a 10:35
Conferencia 1: Dr. Moacir Wajner
11:30 a 12:30
P. orales 1, 2, 3 y 4
10:45 a 12:45
Simposios I, II y III
12:30 a 13:30
Tiempo libre
12:45 a 13:45
Tiempo libre
13:30 a 15:30
Posters II
13:45 a 15:45
Posters I
15:30 a 17:30
Simposios X, XI y XII
15:45 a 18:15
Simposios IV, V y VI
17:30 a 18:00
Pausa Café
18:15 a 18:45
Pausa Café
18:00 a 18:45
P. orales 5, 6 y 7
18:45 a 19:35
Conferencia 2: Dr. Rodney Colina
18:45 a 19:35
Conferencia 3: Dr. Jean Bénard
19:35
Cierre y Entrega de Premios
19:45
Brindis
PROGRAMA DESGLOSADO
LUNES 9 DE NOVIEMBRE DE 2009
08:45 – 09:35: ACREDITACIONES
09:35 – 09:45: APERTURA DE LAS JORNADAS
09:45- 10:35: CONFERENCIA I. Salón de Actos-Facultad de Ciencias
BRAIN MITOCHONDRIAL BIOENERGETICS DISRUPTION IN INHERITED DISORDERS OF
INTERMEDIARY METABOLISM: INSIGHTS FROM ANIMAL AND HUMAN STUDIES. Dr. Moacir
Wajner (UFRGS, Brasil).
10:45- 12:45 SIMPOSIOS I, II Y III
SIMPOSIO I: ESTRUCTURA Y DINÁMICA DE MACROMOLÉCULAS.
Moderadores: A. Buschiazzo; S. Pantano
Salón de Seminarios I –Facultad de Ciencias
SIMPOSIO II: PARASITOLOGIA MOLECULAR.
Moderadores: C. Fernández; M. Comini
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Salón de Actos -Instituto Pasteur
SIMPOSIO III: BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE MICROORGANISMOS.
Moderadores: P. Zunino; P. Aguilar; J. Cristina
Salón de Actos –Facultad de Ciencias
12:45- 13:45 ALMUERZO
13:45- 15:45 SESIÓN DE POSTERS 1
15:45- 18:15 SIMPOSIOS IV, V Y VI
SIMPOSIO IV: PEQUEÑOS RNA REGULADORES EN BIOLOGÍA.
Moderadores: A. Cayota; J. Tort
Salón de Actos –Instituto Pasteur
SIMPOSIO V: FUNCIONALIDAD DE PROTEÍNAS
Moderadores: A. Denicola – O. Pristch
SIMPOSIO VI: NEUROBIOLOGÍA
Moderadores: J.R. Sotelo – S .Olivera
Salón de Seminarios I–Facultad de Ciencias
18:15- 18:45 PAUSA CAFÉ
18:45- 19:35 CONFERENCIA II. Salón de Actos-Facultad de Ciencias: REGULACION
TRADUCCIONAL DE LA RESPUESTA INMUNE INNATA. Dr. Rodney Colina (FCiencias-UdelaR).
MARTES 10 DE NOVIEMBRE DE 2009
09:00- 11:00 SIMPOSIOS VII, VIII Y IX
SIMPOSIO VII: BIOTECNOLOGÍA 1.
Moderadores: L. Franco Fraguas; M. Marín
SIMPOSIO VIII: INMUNOLOGÍA.
Moderadores: A. Díaz; P. Oppezzo
SIMPOSIO IX: BIOLOGÍA VEGETAL.
Moderadores: S. Vidal; O. Borsani
11:00- 11:30 PAUSA CAFÉ
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11:30- 12:30 PRESENTACIONES ORALES SELECCIONADAS
Moderadores: Estela Castillo y Andrea Medeiros.
Salón de actos-Facultad de Ciencias
12:30- 13:30 ALMUERZO
13:30- 15:30 SESIÓN DE POSTERS 2
15:30- 17:30 SIMPOSIOS X, XI Y XII
SIMPOSIO X: BIOTECNOLOGÍA 2
Moderadores: G. Grompone; P. Esperón
SIMPOSIO XI: RADICALES LIBRES
Moderadores: Thomson L.; Souza J.M.
SIMPOSIO XII: MICROSCOPIA: UNA VENTANA AL MICROMUNDO
Moderadores: Radmilovich M.; Negreira C.
17:30- 18:00 PAUSA CAFÉ
18:00- 18:45 PRESENTACIONES ORALES SELECCIONADAS
Moderadores: Laura Castro y José Manuel Verdes.
18:45- 19:35 CONFERENCIA III. Salón de Actos-Facultad de Ciencias: IMPACT OF TUMOR
GENETICS IN THE CLINICAL MANAGEMENT OF NEUROBLASTOMA. Dr. Jean Bénard
19:35 CIERRE Y ENTREGA DE PREMIOS
19:45 BRINDIS
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SIMPOSIOS
LUNES 09-11-09
SIMPOSIO I: ESTRUCTURA Y DINÁMICA DE MACROMOLÉCULAS.
Moderadores: A. Buschiazzo; S. Pantano
ESTUDIOS ESTRUCTURALES Y FUNCIONALES DE UNA PEROXIRREDOXINA DE TRYPANOSOMA
CRUZI. Piñeyro, M. D.
ESTUDIO ESTRUCTURAL DEL TERMOSENSOR DESK DE BACILLUS SUBTILIS. Trajtenberg, F.
ESTUDIOS ESTRUCTURALES DE FORMAS NITRADAS DEL CITOCROMO C. Tórtora, V.
ANALISIS DE MICROHETEROGENEIDAD ESTRUCTURAL DE POLISACARIDO CAPSULAR DE
STREPTOCCOCUS PNEUMONIAE SEROTIPO 14. González, H.
DESARROLLO DE UN MODELO SIMPLIFICADO PARA SIMULACIÓN DE ADN. Zeida, A.
CARACTERIZACION FISICOQUIMICA DE
METABOLITOS PRINCIPALES. Pittini, A.
FARMACOS
ANTI-CANCERIGENOS
DEPT(IV)
Y
SIMPOSIO II: PARASITOLOGIA MOLECULAR.
Moderadores: C. Fernández; M. Comini
Salón de Actos -Instituto Pasteur
PROLIFERACIÓN CELULAR DURANTE EL DESARROLLO DE MESOCESTOIDES CORTI (CESTODA).
Koziol, U.
PROTEÍNAS S100 DE FAGOCITOS EN LA RESPUESTA INFLAMATORIA EN LA HIDATIDOSIS. Basika,
T.
EVOLUCIÓN CONVERGENTE DEL SITIO ACTIVO DE LAS CISTEÍNA PROTEASAS DE LA FAMILIA
C1A CON ACTIVIDAD COLAGENASA. Corvo, I.
ANÁLISIS RIBONÓMICO DE LA PROTEÍNA TCRBP19 DE T. CRUZI. Pérez-Díaz, L.
ESTUDIO DE LA O-GLICOSILACIÓN EN TRYPANOSOMA CRUZI. Chiribao, M.L.
EL ADN COMO PROBABLE BLANCO DE ACCIÓN DE COMPUESTOS DE PALADIO Y PLATINO CON
ACTIVIDAD ANTI-TRYPANOSOMA CRUZI. Vieites, M.
SIMPOSIO III: BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE MICROORGANISMOS.
Moderadores: P. Zunino; P. Aguilar; J. Cristina
LEVADURAS PROVENIENTES DE LA ANTÁRTIDA COMO CONTROLADORES BIOLÓGICOS DE P.
EXPANSUM, EN MANZANA. González, B.
EXPRESION DE PROTEINAS ACTIVAS A BAJA TEMPERATURA. Martínez-Rosales, C.
EISOSOMAS Y COMPARTIMENTALIZACIÓN DE LA SEÑALIZACIÓN POR MEDIO DE KINASAS.
Olivera, M.A.
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AVANCES EN LA CARACTERIZACIÓN DE LA INTERACCIÓN
SOLANUM TUBEROSUM. Sanabria, A.
RALSTONIA SOLANACEARUM-
ANÁLISIS DE CUASIESPECIES EN CEPAS URUGUAYAS DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD
INFECCIOSA DE LA BURSA. Benítez, M.J.
EVIDENCIA DE DIVERSIFICACION DE DENV3 GENOTIPO III EN LA REGIÓN SUDAMERICANA.
Recarey, R.
SIMPOSIO IV: PEQUEÑOS RNA REGULADORES EN BIOLOGÍA.
Moderadores: A. Cayota; J. Tort
BIOLOGÍA DE PEQUEÑOS ARN Y SU RELEVANCIA EN BIOMEDICINA. Cayota, A.
PROPIEDADES ESTRUCTURALES Y BIOLÓGICAS DE PROTEINAS ARGONAUTA. Tosar, J.P.
INTERFERENCIA DE ARN Y
TRIPANOSOMÁTIDOS. Comini, M.
MECANISMOS
RELACIONADOS
EN
PROTISTAS:
LOS
SILENCIAMIENTO GÉNICO MEDIADO POR PEQUEÑOS RNA EN PLANTAS. Borsani, O.
ARN PEQUEÑOS EN HELMINTOS: NUEVAS HERRAMIENTAS E INTERROGANTES. Tort, J.
HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICAS Y PREDICCIÓN DE MRNA BLANCOS DE MICRORNAS. Pena, A.
MIR-155 REGULATES THE IMMUNE SYSTEM. Vigorito, E.
SIMPOSIO V: FUNCIONALIDAD DE PROTEÍNAS
Moderadores: A. Denicola – O. Pristch
UTILIZANDO LA FLUORESCENCIA INTRÍNSECA EN ESTUDIOS FUNCIONALES DE PROTEÍNAS: EL
EJEMPLO DE LA PEROXIRREDOXINA DE UNA CISTEÍNA DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.
Hugo, M.
LA TIORREDOXINA-GLUTATIÓN REDUCTASA: UN PAQUETE ENZIMÁTICO EN EL CENTRO DEL
METABOLISMO REDOX DE PLATELMINTOS. Bonilla, M.
REGULACIÓN
DEL
METABOLISMO
EN MICOBACTERIAS. Durán R.
DEL
GLUTAMATO
POR
SER/THR
QUINASAS
DIVERSIDAD FUNCIONAL DE UNA FAMILIA DE INHIBIDORES KUNITZ. Flo, M.
CARACTERIZACIÓN BIOFÍSICA Y ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA DE CÁPSIDE DEL VIRUS DE LA
LEUCEMIA BOVINA. Obal, G.
UNA ISOFORMA DE MARCKS ESPECÍFICA DE NEUROBLASTOS: ESTUDIO DE LA REGIÓN
FOSFORILADA POR CDK5. Zolessi, F.
8
SIMPOSIO VI: NEUROBIOLOGÍA
Moderadores: J.R. Sotelo – S .Olivera
FOSFORILACIÓN DE MARCKS DURANTE LA DIFERENCIACIÓN NEURONAL EN LA RETINA. Toledo,
A.
DESARROLLO POSTNATAL DE UNA RED SENSORIO-MOTORA. Castelló, M.
CARACTERIZACIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA DE LA DEGENERACIÓN CORTICAL CEREBELOSA
OCASIONADA POR INGESTIÓN DE SOLANUM BONARIENSE EN BOVINOS. Verdes, J.M.
PAPEL DE LOS ASTROCITOS EN LAS ENFERMEDADES NEUROMETABÓLICAS. Olivera, S.
ALTERACIONES MITOCONDRIALES EN MODELOS DE ESCLEROSIS LATERAL AMIOTRÓFICA
Cassina, P.
ROL DE LA HORMONA CONCENTRADORA DE MELANINA (MCH) EN EL SUEÑO REM Y LA
DEPRESIÓN. Lagos, P.
EL ÓXIDO NÍTRICO (NO) GENERADO POR FIBRAS PROMOTORAS DELGADAS ES EFECTIVO COMO
NEUROMODULADOR ANTERÓGRADO Fernández Alvarez, A.
SIMPOSIO VII: BIOTECNOLOGÍA 1.
Moderadores: L. Franco Fraguas; M. Marín
DESARROLLO DE UN SISTEMA PARA LA DETERMINACIÓN DE CARGA VIRAL PLASMÁTICA DE HIV1
POR PCR EN TIEMPO REAL. Cota, G.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA AL DESARROLLO DE PRODUCTOS DERIVADOS DE LA MIEL. Vero, S.
BÚSQUEDA, IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ENZIMAS HIDROLÍTICAS EN LA
MICROBIOTA INTESTINAL DE TERMITAS NATIVAS. Senatore, D.
ESTUDIO DE GENEALOGÍA MEDIANTE EL ANÁLISIS DE STR EN OVINOS. Peraza, P.
SIMPOSIO VIII: INMUNOLOGÍA.
Moderadores: A. Díaz; P. Oppezzo
REGULACION DEL SISTEMA INMUNE POR MICROARN-155. Vigorito, E.
SOBREEXPRESIÓN DE AID ASOCIADA A UN PROCESO ACTIVO DE CAMBIO DE CLASE MARCA A LA
SUBPOBLACIÓN PROLIFERANTE EN LA LEUCEMIA LINFOIDE CRÓNICA (LCC). Palacios, F.
IL-17A JUGA UN ROL CENTRAL EN LA PROTECCIÓN A LARGO PLAZO FRENTE A LA INFECCIÓN
AGUDA POR STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE. Rial, A.
ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE BACTERIAS DEL ÁCIDO LÁCTICO SOBRE CÉLULAS DENDRÍTICAS
HUMANAS. Bollatti, M.
EL ANTÍGENO TN DIRIGIDO AL RECEPTOR LECTINA TIPO C MGL EN CÉLULAS DENDRÍTICAS
DERMALES INDUCE UNA RESPUESTA TH2 Y GENERA ALTOS TÍTULOS DE ANTICUERPOS
ESPECÍFICOS. Freire, T.
9
SIMPOSIO IX: BIOLOGÍA VEGETAL.
Moderadores: S. Vidal; O. Borsani
ROL DEL FACTOR TRANSCRIPCIONAL ATBZIP53 EN LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA
DURANTE LA MADURACIÓN DE LA SEMILLA. Alonso, R.
EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE GENES DE PHYSCOMITRELLA PATENS EN RESPUESTA A
ELICITORES DE ERWINIA CAROTOVORA. Alvarez, A.
UTILIZACIÓN DE PHYSCOMITRELLA PATENS PARA EL ESTUDIO DE LA FUNCIÓN DE LAS
OXILIPINAS EN PLANTAS. Machado, A.L.
FLUJO DE TRANSGENES EN MAÍZ ASOCIADO A LA INTERPOLINIZACIÓN ENTRE CULTIVOS
COMERCIALES. Galeano, P.
UTILIZACIÓN DE UN MODELO VEGETAL RESISTENTE A LA DEGRADACIÓN PARA LA
CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE GENES DE RESPUESTA AL ESTRÉS ABIÓTICO EN PLANTAS.
Ruibal, C.
SIMPOSIO X: BIOTECNOLOGÍA 2
Moderadores: G. Grompone; P. Esperón
APLICACIÓN DE MICROARRAYS Y MACROARRAYS DE EXPRESIÓN PARA EVALUACIÓN DE LA
RESPUESTA INMUNE. Marqués, M.
DIAGNÓSTICO DE CBCVD Y CVD-OS (POSPIVIROIDAE) EN PLANTACIONES CITRÍCOLAS MEDIANTE
HIBRIDACIÓN MOLECULAR NO-ISOTÓPICA. Umaña, R.
RELEVAMIENTO DE DIFERENTES PERFILES GENICOS DE BACILLUS LICHENIFORMIS AISLADOS DE
POLVOS LÁCTEOS. González, M.
NF-KB (NUCLEAR FACTOR KAPPA-B): GENERACIÓN Y
REPORTERA DE ORIGEN HUMANO. Tiscornia, I.
CARACTERIZACIÓN DE UNA LÍNEA
INGENIERÍA Y DESARROLLO DE PROTEÍNAS MODULARES RECOMBINANTES, UN NUEVO
ENFOQUE EN TERAPIA GÉNICA. Ganz, J.
SIMPOSIO XI: RADICALES LIBRES
Moderadores: Thomson L.; Souza J.M.
ÁCIDO NITROARAQUIDÓNICO: EL PRIMER INHIBIDOR DE LA ACTIVIDAD PEROXIDASA EN
PROSTAGLANDINA ENDOPERÓXIDO H SINTASA 1 Y 2. Bonilla, L.
PROPIEDADES Y REACTIVIDAD DEL ÁCIDO SULFÉNICO EN LA ALBÚMINA SÉRICA HUMANA.
Turell, L.
QUERCETINA: PROTECCIÓN NEURONAL FRENTE AL ESTRÉS OXIDATIVO POR MECANISMOS
ANTIOXIDANTES INDIRECTOS. Arredondo, F.
FORMACIÓN INTRAFAGOSOMAL DE PEROXINITRITO COMO MECANISMO CITOTÓXICO CONTRA
T.CRUZI. Álvarez, M.N.
10
SIMPOSIO XII: MICROSCOPIA: UNA VENTANA AL MICROMUNDO
Moderadores: Radmilovich M.; Negreira C.
APORTES DE LA MET A LA INVESTIGACIÓN Y PROGRESO DE LA BIOLOGÍA. Casanova, G.
LA MICROSCOPÍA CONFOCAL Y ELECTRÓNICA APLICADAS AL ESTUDIO DEL VÍNCULO
NEUROGLIAL EN EL SISTEMA NERVIOSO PERIFÉRICO. Kun, A.
NEUROGÉNESIS POSTNATAL EN PECES AUSTROLEBIAS: VENTAJAS DE LA MICROSCOPÍA
CONFOCAL FRENTE A LA MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA. Rosillo, J.C.
APLICACIÓN DE LA MICROSCOPÍA CONFOCAL AL ESTUDIO DE LA LIBERACIÓN DE CALCIO EN EL
MÚSCULO ESQUELÉTICO. Brum, G.
APORTES DE LA MICROSCOPÍA DE FUERZA ATÓMICA A LA INVESTIGACIÓN EN BIOLOGÍA,
Rosso, G.
MICROSCOPÍA Y RECONSTRUCCIÓN 3D: UN ABORDAJE MULTIDISCIPLINARIO PARA EL ESTUDIO
DE ESTRUCTURAS COMPLEJAS, Iribarne, L.
ANÁLISIS DE LA POBLACIÓN DE CÉLULAS ESTRIATALES EN UN MODELO DE ACIDEMIA
GLUTÁRICA I, Jiménez, M.
11
PRESENTACIONES ORALES SELECCIONADAS
LUNES 09-11-09
11:30- 12:30 Moderadores: Estela Castillo y Andrea Medeiros.
LA CARACTERIZACIÓN DE BBS7 REVELA UN VÍNCULO ENTRE LA FUNCIÓN CILIAR/CUERPO
BASAL Y LA REGULACIÓN GÉNICA. Gascue, C.
INHIBICIÓN DE LA NADPH OXIDASA POR ÁCIDO NITROARAQUIDÓNICO EN MACRÓFAGOS
ACTIVADOS. González, L.I.
CARACTERIZACIÓN DE LAS HISTONAS H1 DE PHYSCOMITRELLA PATENS. Abreu, C.
ENTEROTOXINA LTB DE E. COLI ALTERA LA FUNCION CARDIACA EN CORAZON AISLADO DE
COBAYO. Costa, C.
MARTES 10-11-09
18:00- 18:45 Moderadores: Laura Castro y José Manuel Verdes.
ESTUDIO DE LA FUNCIÓN DE UN MODIFICADOR DEL SÍNDROME DE BARDET-BIEDL EN LA VÍA DE
SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR MTOR. Cárdenas-Rodríguez, M.
GENOTIPO, FENOTIPO Y NEUROPATOLOGIA EN RATONES TREMBLER-J. Puig, N.
VALOR PRONOSTICO Y DIAGNOSTICO DE ANTICUERPOS ANTI NITROTIROSINA EN ARTRITIS
REUMATOIDEA. Keushkerian, M.
12
POSTERS
AREAS TEMÁTICAS
1
BIOLOGÍA CELULAR
P1-P8
2
BIOLOGÍA MOLECULAR
P9-P29
3
BIOTECNOLOGÍA
P30-P40
4
GENÉTICA, GENÓMICA Y BIOINFORMÁTICA
P41-P55
5
NEUROCIENCIA Y NEUROBIOLOGÍA
P56-P70
6
OTRAS AREAS
P71-P75
7
PARASITOLOGÍA
P76-P83
8
BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE LOS MICROORGANISMOS
P84-P102
9
INMUNOLOGÍA
P103-P108
10
BIOQUÍMICA, BIOFÍSICA Y BIOLOGÍA ESTRUCTURAL
P109-P134
13
BIOLOGÍA CELULAR
P1-P8
P1) LA CARACTERIZACIÓN DE BBS7 REVELA UN VÍNCULO ENTRE LA
FUNCIÓN CILIAR/CUERPO BASAL Y LA REGULACIÓN GÉNICA
GASCUE C, CÁRDENAS-RODRÍGUEZ M, BADANO JL
Laboratorio de Genética Molecular y Humana, Institut Pasteur de Montevideo
Las cilias primarias son organelos especializados que actúan como mecano- y
quimio-sensores y son necesarias para la transducción de un número de vías de
señalización importantes para el desarrollo y mantenimiento de tejidos y órganos.
Por lo tanto no es sorprendente que defectos en la formación, mantenimiento y
función de las cilias puedan resultar en un amplio rango de fenotipos que
caracterizan distintas enfermedades humanas: las ciliopatías. Un ejemplo es el
síndrome de Bardet-Biedl (BBS), un desorden pleiotrópico, genéticamente
heterogéneo, para el cual se han identificado 14 genes hasta el momento. Sin
embargo, a pesar de la disponibilidad de distintas proteínas BBS, se posee muy
poca información acerca de su rol biológico ya sea en el contexto de las cilias
como fuera de ellas. En este trabajo nos enfocamos en la caracterización de BBS7,
demostrando que esta proteína presenta un patrón de localización celular
dinámico, encontrándose en centrosomas, cuerpos basales y axonema ciliar, pero
a su vez siendo capaz de ingresar al núcleo. En este contexto, resulta interesante
que distintas mutaciones en BBS7 presentes en pacientes afectarían esta
capacidad de la proteína de entrar al núcleo celular. A su vez, mostramos que
BBS7 es capaz de interactuar físicamente con RNF2, una proteína nuclear miembro
del grupo Polycomb (PcG), con función en la remodelación de la cromatina y
regulación de la expresión génica. Nuestros datos indican que BBS7 afectaría los
niveles proteicos de RNF2 y en consecuencia la expresión de los genes que RNF2
regula. Por último, mostramos que BBS7 se uniría físicamente al ADN. Los datos
aquí presentados mostrarían que BBS7, y posiblemente otras proteínas de BBS,
podrían estar actuando como un vínculo directo entre las cilias, las distintas vías
de señalización que dependen de ellas, y la regulación génica, efector
fundamental en la transducción de señales.
14
P2) ONDA RÁPIDA DE CALCIO EN HERIDAS DE ENDOTELIO DE CÓRNEA
EN CULTIVO
JUSTET C.1, HERNÁNDEZ J. A.2, CHIFFLET S.1
1
Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, 2Sección Biofísica, Facultad
de Ciencias, UdelaR
En diversos epitelios se ha encontrado que una onda rápida de calcio citosólico
(OC) se desarrolla desde el borde de la herida inmediatamente después de
producida. En el presente trabajo se estudia el mecanismo de generación y
propagación de la OC en endotelio de córnea de bovino en cultivo (BCE).
Las modificaciones intracelulares de la concentración de calcio fueron
determinadas mediante Fluo4-AM. Se utilizaron inhibidores para la liberación de
calcio del retículo endoplásmico (ácido ciclopiazónico, CPA), receptores
purinérgicos (suramina, desensibilización con ATP), uniones gap (heptanol,
octanol) y hemicanales (LaCl3, carbenoxolona). Para evitar la entrada de calcio del
medio extracelular se utilizó una solución libre de calcio con EGTA.
Nuestros resultados muestran que la generación de la OC depende
mayoritariamente del calcio extracelular mientras que su propagación, de la
liberación a partir del retículo endoplásmico. La inhibición de los receptores
purinérgicos inhibe la propagación de la OC pero no su generación. La inhibición de
las uniones gap con heptanol y octanol, y hemicanales de conexinas con LaCl 3
causa una disminución en la duración de la OC pero no altera significativamente la
generación y propagación. La incubación con carbenoxolona (CBX), inhibidor
inespecífico de conexinas y panexinas en hemicanales libres o en uniones gap,
causa la abolición de la propagación de la OC.
En conjunto, estos resultados indican que la propagación de la OC depende de la
liberación de ATP al medio extracelular para su unión parácrina o autócrina a
receptores purinérgicos. Además, sugieren que en la OC en BCE no hay
participación de las uniones gap pero sí de hemicanales libres posiblemente
formados por panexinas.
15
P3) ROL DE LA LAMINA BASAL EN LA CICATRIZACION DE HERIDAS EN
EPITELIOS
CABO, F; EVANS, F. Y CHIFFLET, S.
Depto. de Bioquímica, Facultad de Medicina, UdelaR
El rol de la lámina basal (LB) en la proliferación, diferenciación y migración
epitelial es bien conocido. En un trabajo previo (Grasso et al., Am.J.Phys.
293:C1327, 2007) encontramos que en células de endotelio de córnea de bovino
(BCE), la modalidad de cicatrización adoptada (cordón de actina o migración
lamelipódica) depende de la presencia o ausencia de LB. Aquí estudiamos si la LB
sintetizada por células BCE es también capaz de determinar el modo de
cicatrización de otros tres epitelios en cultivo: endotelio de aorta de bovino
(BAEC), epitelio de córnea de conejo (RCEp) y células MDCK.
La LB se obtuvo mediante dos procedimientos diferentes (tratamiento con Tritón
X-100 0,01% o amoníaco 0,02N). Ambos se evaluaron determinando la presencia de
laminina (IIF) y actina (Faloidina-FITC). La detección de actina en el preparado
indica remoción celular incompleta. En todos los tipos celulares se realizaron tajos
preservando o removiendo la matriz. Luego de una incubación de 4 horas en estufa
de cultivo los preparados se procesaron para la observación de actina.
De los dos procedimientos utilizados para obtener la LB, el amoníaco preserva una
mayor cantidad de laminina y extrae las células más eficientemente. Sin embargo,
esta diferencia no afectó el comportamiento cicatricial de ninguno de los epitelios
estudiados. En todos los casos la modalidad de cicatrización dependió, al igual que
reportáramos para células BCE, de la presencia o ausencia de LB. Es así que las
heridas realizadas en presencia de LB cicatrizaron por reptación lamelipódica,
mientras que las realizadas en su ausencia lo hicieron por cordón de actina. Entre
otros, estos resultados podrían contribuir al diseño de estrategias terapéuticas
para modular las modalidades de cicatrización.
16
P4) DETECCION HISTOQUIMICA DE ROS EN HOJAS DE CEBADA
INFESTADAS CON Cochiobolus sativus
SILVA P1, RODRIGUEZ S1, TORRES C1, GAMBA F2, PRITSCH C1
1
Depto. de Biología Vegetal, 2Departamento de Protección Vegetal, Facultad de
Agronomía, Universidad de la República
La mancha borrosa (MB) causada por Cochliobolus sativus es una importante
enfermedad foliar de la cebada (Hordeum vulgare). C. sativus es un hongo
hemibiotrófico desarrollando en el huésped cebada una fase biotrófica seguida de
una necrotrófica. La generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) como el
H2O2 es una respuesta temprana a la infección que muestra regulación espacio
temporal. Durante la fase biotrófica, la acumulación de H2O2 se localiza en el
apoplasto en zonas limitadas al sitio de contacto con el tubo germinativo y el
apresorio. En la fase necrotrófica, (etapas post penetración), la acumulación de
H2O2 se observa en citoplasma de células epidérmicas, citoplasma de células del
mesófilo y en cloroplastos de células del mesófilo. En contraposición a los
biotrofos, se ha reportado para C. sativus una correlación positiva entre el nivel de
susceptibilidad a MB y la cantidad del ROS H2O2 acumulado en lesiones necróticas
de hojas Parte del H2O2 producido en el apoplasto deriva de la conversión del O 2por reacción espontánea o via SOD. Esto último sugiere que tanto H 2O2 como O2juegan un papel importante durante distintas etapas de la infección fúngica. El
objetivo del presente trabajo es comparar el patrón de reacción oxidativa en
respuesta a la infección de C. sativus de genotipos de cebada resistente y
susceptible a MB.. mediante detección histoquímica de la acumulación de O2- y
H2O2. Hojas infectadas con C. sativus y muestreadas a diferentes tiempos (6hpi a 4
dpi) fueron pre-tratadas con 3,3-diaminobenzidina (DAB) para la detección de
H2O2 y azul de nitrotetrazolio (NBT) para la detección de O2-. Las hifas fueron
visualizadas por tinción con Calcofluor. Los resultados preliminares indican que a
las 18 hdi se encontraron evidencias de acumulación de H 2O2 y O2-. Diferentes
genotipos de cebada manifestaron diferentes patrones de acumulación de ROS.
17
P5) EVIDENCIA DE APOPTOSIS EN TESTÍCULOS DE RATAS NEONATAS
TRATADAS “IN UTERO” CON BETAMETASONA
PEDRANA, G1; CASANOVA, G2; MÖLLER, R3; VIOTTI, H1; SOUZA, E1; BIELLI, A1.
1. Área de Histología – Departamento de Morfología y Desarrollo – Instituto de
Biociencias, Facultad de Veterinaria, Lasplaces 1550 C.P. 11600.
2. Sección Biología Celular y Unidad de Microscopía Electrónica de Transmisión
(MET), Facultad de Ciencias, Iguá 4225 C.P. 11400
3. Área de Anatomía – Departamento de Morfología y Desarrollo – Instituto de
Biociencias Facultad de Veterinaria, Lasplaces 1550 C.P. 11600.
[email protected]
RESUMEN
La administración prenatal de glucocorticoides produce resultados tanto
beneficiosos como adversos. Su administración a mujeres gestantes con riesgo de
parto prematuro induce la maduración tisular, pero también la reducción del peso
corporal al nacer y aparición de patologías a largo plazo. En ratas adultas induce
apoptosis en células de Leydig. El presente trabajo estudió la acción de los
glucocorticoides sobre las células testiculares (Leydig, Sertoli y gonocitos) de ratas
neonatas, cuyas madres fueron inyectadas hacia el final de la gestación (días 17,
18, 19 y 20), con betametasona (dosis: 1 mg/kg). Las crías macho de 1 dpn (grupo
control n= 3; grupo tratado n=3), fueron anestesiadas y perfundidas con
paraformaldehido 4% en buffer fosfato (BF), pH 7.2, y sus testículos disecados y
postfijados con glutaraldehido 2.5% (1hora); y tetróxido de osmio 1% (30 minutos),
siguiéndose el protocolo de rutina para microscopía electrónica de transmisión.
Las secciones semi y ultrafinas, se analizaron mediante microscopía óptica y MET
(JEOL JEM 1010) a 80kV. En los testículos tratados, se observaron células de Sertoli
en apoptosis, con núcleo pequeño y picnótico. Se identificaron gonocitos y células
de Leydig con retracción celular, bordes irregulares, pérdida de morfología
redondeada en núcleo y citoplasma, y mitocondrias agrandadas. Las células de
Leydig presentaron citoplasma electrón lúcido con aspecto lítico con vesículas
densas y organelos distorsionados, con presencia de leucocitos alrededor de las
células apoptóticas. En suma: únicamente se observaron señales de apoptosis en
células de Leydig, Sertoli y gonocitos de aquellos animales tratados "in utero" con
betametasona. Estos resultados sugieren que el tratamiento prenatal con
glucocorticoides promueve la apoptosis a nivel del testículo neonatal, a las dosis
utilizadas.
Palabras clave: apoptosis, testículo, betametasona
18
P6) ESTUDIO DE LA FUNCIÓN DE UN MODIFICADOR DEL SÍNDROME DE
BARDET-BIEDL EN LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR mTOR
CÁRDENAS-RODRÍGUEZ M, NOVAS R, GASCUE C Y BADANO JL.
Laboratorio de Genética Molecular y Humana; Institut Pasteur de Montevideo
El síndrome de Bardet-Biedl (BBS) es un desorden caracterizado por polidactilia,
obesidad, retinitis, retardo mental y malformaciones renales. 14 genes causales
así como modificadores secundarios han sido identificados y el análisis de las
proteínas codificadas indica que cumplirían roles estructurales y/o funcionales en
las cilias. Este trabajo se centra en la caracterización de MGC1203, una proteína
de función desconocida que interactúa y co-localiza con las proteínas BBS en los
cuerpos basales y centrosomas.
Nuestros datos indican que MGC1203 interactúa y colocaliza con SIN1, miembro del
complejo 2 de mTOR (mTORC2), una vía importante en la regulación del
crecimiento y la proliferación celular. A su vez, hemos determinado que MGC1203
interactúa con Rictor, otro miembro de mTORC2, pero no co-inmunoprecipita con
Raptor (miembro de mTORC1) por lo que MGC1203 podría ser específico de
mTORC2. Para entender el significado funcional de esta interacción, estudiamos la
actividad quinasa de mTORC2 frente a cambios en los niveles de MGC1203
midiendo la fosforilación de Akt en Ser473. Nuestros resultados indican que
MGC1203 se comporta como una agonista de esta vía afectando tanto los niveles
de AKT fosforilado como otros marcadores downstream. Para entender el rol de
MGC1203 en mTORC2 estamos estudiando si existen cambios a nivel de los ARN y/o
de las proteínas del complejo, así como posibles alteraciones en la conformación
del complejo cuando se sobre-expresa o se inhibe MGC1203. Interesantemente
nuestros resultados preliminares indican que una disminución de MGC1203
sensibiliza el complejo hacia tratamientos con la droga Rapamicina, sugiriendo
quizás un vínculo estructural entre MGC1203 y mTORC2.
Estos resultados expanden la complejidad de funciones de las cilias en la
transducción de señales e implican a la vía de mTOR en la patogénesis de BBS
brindando información relevante para entender la base celular de los distintos
fenotipos que caracterizan a este síndrome.
19
P7) AKT INHIBE LA FUNCIÓN REPARADORA DEL ADN DE BRCA1 EN
LÍNEAS CELULARES DERIVADAS DE CÁNCER MAMARIO
SAIDJ R1,2, ARTAGAVEYTIA N3, DE DECKER E1,2 Y CALVO F1,2
1
INSERM U716, Institut de génétique moléculaire y 2 Université Paris7, Denis
Diderot, Paris, Francia;3 Departamento Básico de Medicina, Hospital de Clínicas,
Facultad de Medicina, Montevideo, Uruguay
La proteína AKT también conocida como proteína-kinasa B, tiene un rol
preponderante en la vía de señalización mediada por PI3K. Una de las proteínas
blanco de esta vía es BRCA1, fosfoproteína nuclear implicada en el proceso de
reparación del ADN por recombinación homóloga. Estudiamos la implicancia de la
activación de AKT en la función de BRCA1 observando la formación de focos
nucleares de BRCA1 por inmunofluorescencia. Se utilizaron las líneas celulares
MCF-7 (sobrexpresión de AKT activada) y MDA-MB-231 (expresión leve de AKT).
Luego de irradiación (6Gy) se observó la formación de focos nucleares de BRCA1
en las células MDA-MB-231 mientras que la inducción fue muy leve en MCF-7. La
activación de AKT luego de tratamiento de MDA-MB-231 con EGF (20ng/ml)
determinó la pérdida de formación de focos nucleares de BRCA1, la cual fue
revertida luego de tratamiento con un inhibidor de AKT (trifluoroacetate, TFA,
20 M). Por el contrario, el tratamiento de MCF-7 con TFA o LY (inhibidor de PI3K,
30 microM) indujo un aumento de la formación de focos nucleares de BRCA1.
También demostramos que la inhibición de AKT indujo una pérdida rápida de los
focos de gama-H2AX radio-inducidos, evidenciando la habilidad de reparación del
ADN de doble-hebra (efecto máximo luego de 24 hrs de irradiación, 1 Gy). Estos
resultados fueron confirmados en un modelo experimental de rotura doble-hebra
de ADN, observando una mayor eficiencia de reparación por recombinaciónhomóloga con la inhibición de AKT. Estos datos sugieren que la activación de
BRCA1 mediada por AKT determina la pérdida de su función de reparación.
20
P8) PROTECCIÓN FRENTE AL ESTRÉS OXIDATIVO EN POBLACIONES
ESTACIONARIAS
CANDREVA EC, BRACESCO N, BLANC L, NUNES E.
Lab. Radiobiología. Dpto Biofísica. Fac. Medicina.
Distintos tipos de agentes físicos y químicos generadores de estrés oxidativo
actúan a
nivel celular y molecular (ej.: membrana mitocondrial, ADN y
componentes de transducción) determinando acumulación de daños propios del
envejecimiento celular. En eucariotas se ha demostrado la importancia de
sensores del daño genómico, transductores y efectores de reparación de ADN y
de control del ciclo celular que modulan eventos potencialmente letales,
mutagénicos, carcinogénicos y de envejecimiento celular.
Hipótesis: Componentes fenólicos provenientes de productos naturales actúan
sobre elementos de la red reguladora de estabilidad genómica: Mec1/ATR y Rad50
disminuyendo el envejecimiento celular por daño oxidativo.
Se utilizó el modelo Saccharomyces cerevisiae, en fase estacionaria
(compartimientos proliferativos decrecientes) y el radiomimético bleomicina (B),
productor de roturas dobles de ADN (DSB). Muestras aleatorias de las poblaciones
de distintas edades se expusieron a bleomicina en presencia o ausencia del
polifenol rutina (R) o de la infusión de Ilex paraguariensis (Ip). Se estimaron
probabilidades de sobrevida (S), de mutagénesis ( M) y de producción de DSB.
Se verificó protección decreciente frente a B en función de la edad de los cultivos
por R, medida por S y M. Ip produjo una protección significativamente mayor
frente a B con aumento de S y disminución de M independientemente de la edad.
DSB disminuyó significativamente en presencia de Ip. Este efecto fue menor o
ausente para B + R.
Los resultados se interpretan en base a un modelo en red estudiado previamente.
La activación de Mec 1 por R determinaría una inducción de recombinación
homóloga en compartimientos proliferativos. La presencia en Ip de cafeína
(inhibidor de Mec1), de otros componentes fenólicos y cofactores de reparación
activarían el complejo MRX/hMRN y proteínas Ku teloméricas y de unión no
homóloga (NHEJ). Además se producen interrupciones diferenciales de cascadas
redox y activación de elementos SIR de desacetilación de la cromatina.
21
BIOLOGÍA MOLECULAR
P9-P29
P9) EXPRESION GENICA EN HIGADO
SUPLEMENTADAS EN EL POSPARTO
DE
VACAS
DE
CARNE
ASTESSIANO A. L1, QUINTANS G.2, PEREZ-CLARIGET R1, CARRIQUIRY M1
1
Facultad de Agronomía, UdelaR.
Agropecuaria.
2
INIA, Instituto Nacional de Investigación
La suplementación energética, práctica común en sistemas de cría, mejora las
funciones reproductivas, siendo escasa la información sobre su impacto en el
metabolismo hepático. Se realizó un experimento con el objetivo de estudiar el
efecto de la suplementación de corto plazo (aumento de la disponibilidad y
calidad de nutrientes y energía) durante el posparto sobre la expresión hepática
de genes asociados al eje somatotrófico (factor de crecimiento similar a la insulina
tipo I; IGF-I, y sus proteínas de unión -2 y -3; BP2 y BP3) en vacas de carne
primíparas con ternero al pie. Se utilizaron 10 vacas de primera parición
(Aberdeen Angus, Hereford y sus cruzas) divididas en bloques según fecha de parto
y condición corporal al parto. A los 48 días posparto las vacas se asignaron al azar
a dos tratamientos nutricionales: control (campo nativo) y suplementadas (campo
nativo mejorado con Lotus subbiflorous cv Rincón) durante 23 días. Se tomaron
muestras de hígado mediante biopsias hepáticas, se extrajo el ARN total y se
determinó la abundancia de ARNm mediante SYBR-Green RT-PCR en tiempo real,
usando la expresión del gen hipoxantina fosforibosiltransferasa (HPRT) como
control endógeno. La expresión (número de moléculas) de los genes de interés en
relación a la expresión de HPRT se analizó usando el PROC MIXED de SAS. La
abundancia de ARNm de HPRT fue similar (P=0.14) entre tratamientos. La
expresión hepática de IGF-I y BP2 no fue afectada (P>0.022) por los tratamientos.
Sin embargo, la expresión de BP3 fue mayor (P=0.03) en las vacas que pastoreaban
campo natural. Los resultados muestran que la suplementación posparto sin
manejo del amamantamiento, modificó la expresión de genes del eje GH-IGF-I, el
cual es determinante en la partición de nutrientes entre la producción de leche y
las funciones reproductivas.
Palabras clave: expresión génica, eje GH-IGF-I, vacas primíparas.
22
P10) PURIFICACIÓN DE TRANSGLUTAMINASA TISULAR DE GLÓBULOS
ROJOS HUMANOS.
MUÑOZ, F., DEL RÍO, N Y HERNÁNDEZ, ANA.
Cátedra de Inmunología. Facultad de Ciencias. UDELAR.
La Transglutaminasa tisular (TG2) es una enzima ubicua implicada en múltiples
funciones biológicas. Además, la TG2 está implicada en la patogenia de la
Enfermedad celíaca y es el autoantígeno específico de esta enfermedad
autoinmune; la detección de anticuerpos específicos anti-TG2 mediante la
metodología de ELISA es un método ampliamente utilizado en el screening
diagnóstico. Se han utilizado varias fuentes de Transglutaminasa tisular para el
diseño de los kits comerciales de diagnóstico, entre ellos los glóbulos rojos
humanos que expresan constitutivamente TG2 en el citoplasma y otra proteína de
la familia de Transglutaminasas en la membrana plasmática (Banda 4.2).
En el presente trabajo, se diseñó un método rápido de purificación de TG2 basado
en la interacción de la misma con la Fibronectina de plasma humano; en contraste
con los métodos previamente descritos, es posible obviar el paso de eliminación de
la hemoglobina.
Se lisaron glóbulos rojos humanos mediante shock hipotónico en presencia de un
cocktail de inhibidores de proteasas y se incubó la solución resultante luego de la
centrifugación con Fibronectina plasmática humana previamente purificada
inmovilizada en placas de plástico de cultivo celular (10 g/ml), posteriormente
bloqueadas y formoladas. La fracción del lisado de eritrocitos retenida fue eluída
con solución de Urea 8M; el análisis por SDS-PAGE y tinción con plata reveló
bandas consistentes con la TG2.
Se confirmó la reactividad inmunológica específica con la fracción obtenida
mediante un ELISA de captura diseñado con la combinación de un anticuerpo antiTG2 policlonal de captura y un monoclonal (CUB7402) para la detección, utilizando
TG2 comercial de cobayo como control.
En suma, el método reportado permitiría disponer de cantidades suficientes para
ensayos de inmunoblot utilizados en el laboratorio mediante un procedimiento
sencillo y económico.
23
P11) EVALUACIÓN DE LA O-GLICOSILTRANSFERASA ppGalNAc-T11
COMO MARCADOR MOLECULAR DE LEUCEMIA LINFOIDE CRÓNICA
LIBISCH G1, CASÁS M1, CAYOTA A2, OSINAGA E3, ROBELLO C1,4.
1
Unidad de Biología Molecular, 2 Laboratorio de Genómica Funcional, 3Laboratorio
de Glicobiología e Inmunología Tumoral, Instituto Pasteur de Montevideo. 4 Depto.
de Bioquímica, Facultad de Medicina
La Leucemia Linfoide Crónica (LLC) es un desorden propio de los linfocitos B y T, si
bien el 95% es del subtipo B. Se caracteriza por una acumulación progresiva de
linfocitos B monoclonales morfológicamente maduros pero incompetentes
funcionalmente.
Dentro de las alteraciones moleculares más notorias de las células cancerosas, se
encuentra la expresión de antígenos producidos por O-glicosilación incompleta. Las
enzimas que participan en el primer paso de O-glicosilación son las ppGalNAc-Ts
(polypeptide-N-acetil-α-galactosaminiltransferasas).
Dado que existe evidencia importante de la alteración de la expresión de las
ppGalNAc-Ts en diferentes tipos de cáncer, estas enzimas han sido de gran valor
ya que se han utilizado como herramientas diagnósticas y/o pronósticas.
En este trabajo se analizó la expresión a nivel de ARN (mediante RT-PCR y Real
TimePCR) de todas las isoenzimas pertenecientes a la familia de las ppGalNAcTs
conocidas hasta la fecha (15 isoenzimas), tanto en células leucémicas como
normales. Dado que no es posible el cultivo de células de LLC, se estudio también
la expresión de las ppGalNAcTs en líneas tumorales humanas de linfocitos B
(Daudi), y T (Jurkat).
Como resultado hemos encontrado una sobreexpresión de la ppGalNAc-T11 en los
linfocitos B leucémicos en relación a células B normales. La enzima también se
expresa en linfocitos T y células Jurkat, mientras que su expresión es mucho
menor en células Daudi. Mediante el uso de un anticuerpo anti ppGalNAc-T11, y
mediante la técnica de Western Blot, se encontraron los mismos resultados a nivel
de expresión proteica.
Finalmente se produjo una línea estable Daudi capaz de sobreexpresar T11 al ser
inducida con tetraciclina, con el fin de observar cambios en los patrones de
glicosilación debidos a la sobreexpresión de T11.
Los resultados obtenidos hasta el momento muestran a la enzima ppGalNAc-T11
cómo un posible marcador molecular de LLC.
24
P12) EXPRESIÓN GÉNICA MUSCULAR EN TERNEROS: ¿DEPENDE DE LA
ALIMENTACIÓN DE SUS MADRES DURANTE LA GESTACIÓN?
LAPORTA J.1, ASTESSIANO A. L.1, PEREYRA, F1, SCARSI A.1, PEREZ-CLARIGET R1.,
QUINTANS G.2, CARRIQ.UIRY M.1
1
Facultad de Agronomía,
Agropecuaria, INIA.
UdelaR.
2
Instituto
Nacional
de
Investigación
La suplementación de la vaca durante la gestación podría comprometer el
crecimiento potencial del ternero a través de un efecto directo durante la etapa
fetal o indirecto durante la lactancia. Uno de los principales factores mediadores
entre nutrición y crecimiento es el eje hormona de crecimiento-factor de
crecimiento similar a la insulina (GH-IGF). Se evaluó el efecto de la
suplementación de vacas multíparas, durante el último mes preparto, sobre la
expresión muscular en los terneros de genes asociados al crecimiento. Las madres
fueron asignadas a dos tratamientos: control (pastoreo de campo nativo) y
suplementación (campo nativo + 1% del PV de afrechillo de arroz). Al destete se
hicieron biopsias del músculo semitendinoso de 10 terneros machos (n=5 por
tratamiento) cruza (Angus-Hereford). La expresión génica se midió por RT-PCR en
tiempo real usando el gen hipoxantina fosforibosiltransferasa (HPRT) como control
endógeno. La expresión de los genes, en relación a la expresión de HPRT, se
analizó usando el PROC MIXED de SAS. La abundancia de ARNm de HPRT fue similar
(P=0,26) en los dos tratamientos. Terneros hijos de madres no suplementadas
presentaron mayor expresión(P<0,001) de ARNm del receptor de la GH y de la
proteína de unión de IGF-3. Sin embargo, el nivel de IGF-I no se vió afectada por
los tratamientos (P>0,99). Estos resultados muestran que la suplementación de
vacas multíparas de carne en momentos de subnutrición durante la gestación,
modifica la expresión de genes asociados al crecimiento en sus terneros al destete.
Palabras clave: suplementación preparto, expresión génica, eje somatotrófico
25
P13) ANÁLISIS MOLECULAR DEL SÍNDROME DE ESTRÉS PORCINO EN
CERDOS DE RAZAS COMERCIALES EN URUGUAY (PCR-RFLP).
MONTENEGRO,M1; ARTIGAS, R1; CASTRO, G2; GAGLIARDI, M1, MARTÍNEZ, M1;
LLAMBÍ, S1.
1
Área Genética-Departamento de Genética y Mejora Animal-Instituto de
Producción Animal. Facultad de Veterinaria-UdelaR.
2
Área Suinos. Instituto de Producción Animal. Facultad de Veterinaria-UdelaR.
[email protected]
El Síndrome de Estrés Porcino (PSS) es una enfermedad hereditaria causada por
una mutación puntual C→T en el gen Ryr1. Esto provoca una sustitución
aminoacídica (arginina→cisteína) en la proteína receptora de la rianodina, la cual
funciona como canal de calcio en el retículo sarcoplásmico. El PSS provoca la
muerte súbita de los animales así como una disminución en la calidad de la carne,
generando importantes pérdidas económicas en la industria porcina. En este
trabajo se presenta la determinación del genotipo para el PSS mediante la técnica
de PCR-RFLP, en 11 cerdos de razas comerciales (1 Large White, 1 Duroc, 2
híbridos y 7 Landrace) de nuestro País. Se llevó a cabo extracción de ADN a partir
de sangre periférica mediante el uso de un kit de extracción. Para la técnica de
PCR se emplearon un par de cebadores específicos: F-Ryr1 5‟-TCC AGT TTG CCA
CAG GTC CTA CCA-3‟ y R-Ryr2 3‟-ATT CAC CGG AGT GGA GTC TCT GAG-5‟. Para el
análisis por RFLP se utilizaron 10U de la endonucleasa de restricción Alw21I en 10
μL de producto amplificado, incubándose 3 h/37ºC. Para la inactivación de la
enzima se realizó una incubación de 20 minutos/65ºC, y posteriormente se realizo
un tratamiento con proteinasa K durante 1h/37ºC para la desnaturalización de la
enzima. Los productos obtenidos se observan en geles de agarosa al 2% teñidos con
bromuro de etidio y en minigeles de acrilamida al 6% teñidos con nitrato de plata.
El 63.6% de los animales estudiados presentaron genotipo heterocigota Nn
(portadores), 27.3% de los animales presentaron genotipo homocigota recesivo nn
(afectados) y un 9.0% genotipo homocigota dominante NN (normales). Se concluye
la factibilidad de analizar este polimorfismo mediante la técnica de PCR-RFLP. De
destaca que estos son los primeros diagnósticos de esta patología mediante
técnicas moleculares en nuestro País.
26
P14) EXPRESION GENICA EN OVIDUCTO DE OVEJAS: EFECTO DE LA
ESTACION, NUTRICION Y MELATONINA
TALMÓN,M1; VAZQUEZ,MI2; FERREIRA,A1; ABECIA,JA2; FOCADA,F2; CARRIQUIRY, M3,
MEIKLE A1.
1Laboratorio de Técnicas Nucleares, Facultad de Veterinaria, Uruguay.
2Producción Animal, Universidad de Zaragoza, España.
3Facultad de Agronomía, Uruguay.
En este trabajo se determinó la expresión de los transcriptos de los receptores de
estrógeno-α (ERα), progesterona (PR), y del receptor del factor de crecimiento
similar a la insulina tipo-1 (IGF-R1) en oviducto por RT-PCR tiempo real, en ovejas
en anestro y estación reproductiva (n=31) asignadas al azar uno de los cuatro
tratamientos de un arreglo factorial de nutrición (1,5 M vs 0,5 M) y melatonina
(con y sin tratamiento).
La expresión de ARNmERα en oviducto fue menor (P=0,003) en estación
reproductiva que en anestro. La interacción entre la estación, la nutrición y el
tratamiento con melatonina afecto la expresión de ARNmERα (P=0,014). Mientras
que en el anestro no hubo efecto de la subnutrición ni de melatonina en la
expresión de ARNmERα; mientras que en estación reproductiva, la subnutrición
incrementó (P=0,018) la abundancia de ARNmERα. La melatonina redujo la
expresión de ARNmERα en las ovejas sunutridas (P=0,006), pero no en las
controles.
La abundancia de ARNmPR no fue afectada por la estación, la nutrición ni el
tratamiento con melatonina, pero si por la interacción entre nutrición y
melatonina (P=0,035). La subnutricion redujo la expresión del ARNmPR (P=0,019),
y la melatonina tendió a revertir esta situación en animales en anestro (P=0.08).
La melatonina redujo la expresión de ARNmPR (P=0,014) en los animales control.
La expresión de ARNmIGF-1R fue mayor (P<0,004) en anestro que en estación
reproductiva, y en ovejas subnutridas que en ovejas alimentadas a mantenimiento.
En este trabajo se demuestra que la expresión génica oviductal esta afectada por
la subnutricion durante la fase luteal temprana (Día 5) y que este efecto esta
modulado por la estación del año (reproductiva vs anestro). La respuesta oviductal
– en términos de expresión génica- al tratamiento con melatonina es específica
para cada variable y esta afectada por la estación del año y el estado nutricional.
27
P15) IDENTIFICACIÓN DE LAS ISOFORMAS DEL RECEPTOR DE
ESTRÓGENOS BETA (RERIO. INTERACCIÓN
CON LAS VÍAS DE PROLIFERACIÓN ENDÓCRINA Y PARÁCRINA
2
MANRIQUE G, 2ROMÁN E,1HEINZEN S, 2CANCELA P,3ALONSO I,2,4 GARÓFALO E Y
1,2
ARTAGAVEYTIA N (*)
1
Depto. Básico de Medicina y 2Laboratorio de Oncología Básica y Biología
Molecular, Facultad de Medicina; 3Servicio de Curieterapia, Hospital Pereira
Rossell; 4Depto. Bioquímica, Facultad de Veterinaria
En los últimos años se han identificado variantes de “splicing” del gen REdeterminan isoformas de la proteína denominadas RE- -1,2,3,4,5, correspondiendo
la primera a la proteína nativa.
El objetivo de este estudio fue identificar los ARNm de las isoformas de REanalizar su expresión y relación con las vías hormonal y parácrina ErbBs/ERK/AKT.
Los ARNm-RE- -isoformas se analizaron por RT-PCR a partir de tejido tumoral
congelado. La presencia y fosforilación de las proteínas ErbBs,ERK y AKT se
analizaron por western blot.
En estudios previos detectamos la presencia del ARNm-REtumores analizados. En 39 de estos tumores analizamos los ARNm-RE- -isoformas
identificando RErespectivamente. Se encontró una asociación directa entre RE- -1
(p=0,018, n=31), pero no hubo asociación con las variantes 2,4 y 5. Cuando se
consideraron los fenotipos tumorales RE/RP se observó que la presencia de REfue mayor en ausencia de uno o ambos receptores (p=0,002,n=95), en particular en
niveles bajos o ausencia de RP (p=0,026). Asimismo, esa relación inversa con RP
fue más evidente en los tumores REGF+ (p=0,002,n=29) que en los REGF-negativos
(p=NS, n=64). Las isoformas no se asociaron con RE/RP ni REGF. En los tumores RElización
ERK.
En conclusión, se identificaron las variantes del REestando expresadas en la mayoría de los casos independientemente del status del
receptor nativo. Estos resultados sugieren que REparácrina mediada por REGF/ERK.
Financiación: CHLCC, CSIC
28
P16) CARACTERIZACION DE LA PROTEINA FAPB1b DE Danio rerio:
ESTUDIOS DE UNIÓN A LIGANDOS
PUIG N*, LUCÍA CANCLINI*#, Y ADRIANA ESTEVES*.
* Facultad de Ciencias, Montevideo, Uruguay; # Instituto de Investigaciones
Biologicas Clemente Estable, Montevideo Uruguay. [email protected]
La grasa de la dieta constituye la mayor fuente de lípidos y esta constituida
mayoritariamente por triglicéridos que deben ser hidrolizados antes de su
absorción. Los ácidos grasos liberados son absorbidos por el enterocito. Una vez
dentro de la célula, los ácidos grasos son unidos reversiblemente por
transportadores, entre ellos las proteínas de unión a ácidos grasos (FABPs). Las
FABPs pertenecen a una familia multigénica de proteínas, de distribución
filogenética amplia, y que transportan ligandos hidrofóbicos (1).
Los peces son modelos animales muy útiles para el estudio del metabolismo
lipídico de los vertebrados ya que, al igual que en mamíferos, el tercio proximal
del intestino es el mayor sitio de absorción de grasas (2).
En el intestino de Danio rerio se pueden encontrar los ARNm de FABP1b y FABP2,
cuyos patrones de expresión son diferentes sugiriendo diferencias funcionales. A
pesar de los datos relevados hasta el momento nada se sabe acerca del destino de
las proteínas codificadas por estos ARNm dentro del enterocito de Danio rerio. Se
ha propuesto que si bien las distintas proteínas de la familia poseen estructura
tridimensional semejante, cumplirían funciones distintas radicando su
especificidad funcional en el tipo de ligando transportado o los mecanismos de
regulación de su expresión, entre otros posibles factores.
Nos hemos propuesto estudiar el comportamiento cinético frente a los posibles
ligandos de las proteínas en estudio. Para ello hemos clonado ambos genes en
vectores de expresión adecuados, expresado y purificado las proteínas
correspondientes. Comenzando por FABP1b, hemos iniciado estudios de unión a
diferentes ligandos hidrofóbicos por espectrofluorimetría, determinando las
constantes de disociación y preferencias por distintos ácidos grasos.
Estos análisis nos permitirán contribuir a identificar elementos que permitan
diferenciar entre los posibles roles biológicos de FABP1b y FABP2 en la absorción
lipídica, el metabolismo celular, las rutas de transporte y los mecanismos de
adquisición de los ácidos grasos, como una aproximación tendiente a descifrar los
caminos metabólicos de los ácidos grasos dentro del enterocito.
29
P17) ANÁLISIS HIGH RESOLUTION MELT PARA EL GENOTIPADO DE
POLIMORFISMOS DE UNA SOLA BASE
GRIGNOLA, P; TRUJILLO, A; PANDULLI, I; NICOLINI, P Y CARRIQUIRY, M.
Laboratorio de Técnicas Nucleares, Facultad de Veterinaria y Laboratorio de
Biología Molecular y Endocrinología Metabólica, Facultad de Agronomía, UDELAR
El análisis de las curvas de disociación del ADN obtenidas con instrumentos de alta
resolución (HRM) es un método post-PCR simple, rápido y efectivo, recientemente
desarrollado para el genotipado de SNPs. Este método permite, mediante el uso de
un colorante fluorescente, diferenciar, por sus Tm, tanto las variantes alélicas
homocigotas como las heterocigotas, las cuales a su vez se diferencian de las
homocigotas por la forma de la curva de disociación. Se desarrolló la técnica para
dos SNPs (SNP1 G/A y SNP2 C/T) localizados en 2 genes con productos amplificados
de 90 y 142 bp y Tm de 81 y 84 ºC, respectivamente. Muestras de ADN genómico
extraídas de sangre (n = 117 y n= 71 para SNP1 y SNP2, respectivamente) con
concentraciones entre 20-30 ng/ul fueron analizadas para cada SNP en corridas
independientes junto con una curva estándar y los tres genotipos controles en
duplicado (previamente secuenciados). La reacción de PCR-HRM (Rotor Gene™
6000, Corbett) utilizada incluyó colorante SYBR® Green. Se obtuvieron eficiencias
de amplificación > a 0.90, los controles se comportaron de acuerdo a lo esperado
dado el tipo de cambio de base involucrado y la concentración del producto
amplificado fue similar entre las muestras y los controles; siendo estas condiciones
necesarias para el correcto análisis de los datos. Los 3 genotipos de cada SNP
(homocigotos GG, AA y TT, CC y heterocigotos GA y TC) fueron claramente
identificados con niveles de confianza (asignados por el software) superiores a
90%. Muestras que mostraron un nivel de confianza inferior y/o en las que el perfil
de la curva fue diferente a los controles, fueron repetidas (12%). El método fue
exitoso en detectar cambios de bases G/A y C/T en los dos SNP estudiados
resultando un método muy atractivo para el genotipado de alto número de
muestras.
Palabras claves: HRM, genotipado, SNP
30
P18) CARACTERIZACIÓN DE LAS HISTONAS H1 DE PHYSCOMITRELLA
PATENS
ABREU C.A, VIDAL S.B, RAMÓN A.A
a
Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias. bLaboratorio de Biología Molecular
Vegetal, Facultad de Ciencias.
La histona H1, que interactúa con el ADN inter-nucleosomal, ha mostrado tener un
papel importante en la estructura superior de la cromatina. Sin embargo, el rol de
H1 no parece limitarse a una regulación general de la cromatina sino que puede
funcionar de manera específica en la activación o represión de ciertos genes. Por
otra parte, las distintas variantes de H1 parecen tener funciones específicas,
expresándose en forma diferencial durante el desarrollo o frente a determinadas
condiciones de estrés. En plantas superiores, el estudio de las histonas H1
mediante knock-out o silenciamiento ha arrojado resultados diversos, en parte
debido al mecanismo de compensación llevado a cabo por las diferentes variantes.
En este trabajo nos propusimos caracterizar y estudiar la función de las histonas
H1 en P. patens. Este musgo es un modelo vegetal sencillo cuyo genoma
secuenciado codifica un número elevado de genes con homología de secuencia con
genes de plantas superiores. Análisis bioinformáticos revelan en P. patens una
secuencia de ARNm, que codifica una proteína (PpH1) que presenta todas las
características de una histona de tipo H1. Empleando una fusión con la proteína
verde fluorescente se confirmó la localización nuclear de PpH1. Mediante Northern
blot se evaluó el nivel de transcripto en condiciones de estrés abiótico y en
presencia de hormonas, observándose diferencias bajo estrés térmico. Con el
objetivo de estudiar la función de este gen se utilizó una estrategia de
silenciamiento por ARN de interferencia. La línea transformante obtenida, en la
cuál el nivel de PpH1 se redujo un 30%, es más sensible al estrés salino y osmótico
pero no muestra diferencias con el control bajo estrés térmico. También se evaluó
en el espaciamiento nucleosomal, no observándose diferencias. Dado que no fue
posible obtener un alto nivel de silenciamiento del gen PpH1 se generó una
construcción para obtener un transformante knock-out de dicho gen.
31
P19) DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES PARA
IDENTIFICACIÓN DE SUBESPECIES DE Eucalyptus globulus
LA
RICHERO M., BARRACO VEGA M., CERDEIRAS M. P. Y CECCHETTO G.
Laboratorio de Microbiología, IQB, Facultad de Ciencias - Facultad de Química
Las subespecies de Eucalyptus presentan diferentes características a nivel de
rendimiento y calidad de su madera. Por este motivo es importante saber qué
especies se eligen para procesar, tanto desde el punto de vista de los costos de
producción como de la conservación de recursos forestales. La subespecie
E.globulus ssp globulus, una de las más utilizadas, no puede distinguirse por
propiedades fenotípicas en etapas tempranas del crecimiento de la ssp maidenii.
Se plantea entonces el desarrollo de un método de identificación basado en
marcadores moleculares: RAPD, que detecta sitios polimórficos distribuidos por
todo el genoma sin necesidad de conocimiento a nivel de secuencia y SCAR, que se
basa en la amplificación de sitios de secuencia conocida con primers específicos.
Se analizaron 47 iniciadores RAPD obteniendo perfiles complejos que no permiten
identificar de forma sencilla las subespecies de interés debido a la alta
variabilidad intra-subespecie. A partir de estos perfiles RAPD se analizaron y
diseñaron primers para 12 bandas (potenciales
marcadores SCAR) que se
mantenían en una u otra subespecie y 4 bandas presentes en ambas subespecies
(marcadores generales) que serán usados como controles internos en la reacción
de amplificación. Estos marcadores potenciales fueron enfrentados a ADN extraído
de 22 accesiones de la ssp globulus y 24 accesiones de la spp maidenii. Se
descartaron 10 bandas por mostrar reacción cruzada entre subespecies. Dos
bandas, G5EG1 de la ssp globulus y G5EM1 de la spp maidenii, no muestran
reactividad cruzada y son específicos de la subespecie para la que fueron
diseñados. Además estos dos marcadores presentan una buena amplificación
cuando se ensayan conjuntamente con marcadores generales.
32
P20) EXPRESIÓN DE LA HORMONA FOLÍCULO ESTIMULANTE HUMANA
EN LA PLANTA Physcomitrella patens
RUÉTALO N., COTA G., MARÍN M., VIDAL S., SEÑORALE M.
Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias.
La glicoproteína hipofisaria Hormona Folículoestimulante Humana (hFSH) promueve el
crecimiento y maduración de los folículos ováricos y la espermatogénesis, por lo que
tiene gran importancia clínica, siendo utilizada para tratamientos de infertilidad y
procedimientos de fertilización in Vitro. En la clínica se utiliza FSH derivada de orina
de mujeres postmenopáusicas y actualmente también se produce recombinante en
células CHO (Chinese Hamster Ovary).
La FSH presenta una estructura tridimensional compleja. Es un heterodímero con 11
puentes disulfuro y 4 N-glicosilaciones. Estas modificaciones postraduccionales indispensables para su función-, inviabilizan su producción en sistemas de expresión
procariotas. Physcomitrella patens es una planta briofita, que se utiliza como
organismo modelo de estudio, que ha sido propuesto hace poco tiempo como sistema
de expresión de proteínas recombinantes. Representa una alternativa muy atrayente
para producción de proteínas recombinantes debido a la sencillez de su manipulación,
y a que permitiría sintetizar complejos multiproteicos con modificaciones
postraduccionales, a bajo costo y sin patógenos humanos.
Nuestro objetivo es crear una cepa de P.patens que sintetice hFSH y poner a punto el
cultivo líquido de Physcomitrella como sistema de producción de proteínas complejas.
La estrategia experimental se divide en cuatro etapas: construcción de unidades
transcripcionales con promotores vegetales que codifiquen α-FSH y β FSH, inserción
dirigida de éstas a sitios específicos del genoma de P.patens, puesta a punto de
cultivos en medios líquidos y análisis de los productos obtenidos.
Utilizando PCR se generaron fusiones traduccionales de las secuencias codificantes de
α-FSH y β-FSH con un péptido señal de una proteína propia de P. patens, y se clonaron
bajo el control de promotores vegetales, flanqueados por secuencias para realizar
recombinación homóloga en el genoma del musgo. Posteriormente se va a transformar
protoplastos de P. patens con las construcciones ya generadas, seleccionar
transformantes que expresen la proteína y caracterizar los productos obtenidos.
33
P21) BÚSQUEDA DE SEÑALES TRANSCRIPCIONALES EN TRITRYPS
SMIRCICH P.1, CERQUEIRA G.2, FORTEZA D.1, EL-SAYED N.2, GARAT B.1
1
2
Laboratorio de Interacciones Moleculares. Facultad de Ciencias. UdelaR.
Host-Pathogen Genomics Laboratory. Maryland University. Maryland. EEUU.
Los „„Tritryps‟‟ son tres protozoarios relacionados causantes de patologías de alta
prevalencia en humanos. Estos organismos presentan características excepcionales
entre las que se encuentran los mecanismos de expresión génica. En particular, las
ARN polimerasas (ARNP) poseen características exclusivas. La búsqueda de regiones
de inicio transcripcional de los genes codificantes de proteínas ha sido infructuosa.
Dada la organización en policistrones, las regiones de cambio de hebra han sido
implicadas en el inicio transcripcional. Por otra parte, la ARNPI en Trypanosoma
brucei sintetiza los preARNm que codifican para las proteínas VSG y PARP. En
eucariotas, los promotores de ARNPI se caracterizan por presentar elementos
conformacionales conservados aunque no de elementos de secuencia.
Nos proponemos determinar las características estructurales de las regiones de
inicio de las ARNP en tripanosomátidos y establecer un sistema predictivo para estos
sitios de unión. Asimismo planteamos una aproximación experimental en la que
proponemos determinar las secuencias transcritas en exclusividad por cada ARNP.
En este sentido hemos recopilado las secuencias correspondientes a los sitios de
inicio de la ARNPI de aproximadamente 25 eucariotoas (incluyendo las conocidas de
tritryps) y las secuencias correspondientes a todas las regiones de cambio de hebra
de los tritryps. Con estas se construyeron bases de datos de sus características
conformacionales. Los resultados obtenidos están siendo utilizados para el
establecimiento del sistema predictivo que esperamos permita clasificar regiones
del genoma de los parásitos como posibles sitios de unión para estas polimerasas.
Experimentalmente, estamos llevando a cabo ensayos de run-on en presencia de
-amanitina para establecer el transcriptoma de cada polimerasa. Hemos realizado
estos experimentos en formas prociclicas de T. brucei. El análisis por qRT-PCR de la
sub-población de ARNs obtenida, estableció que la metodología consigue separar
ARNs sintetizados de novo aunque las condiciones de inhibición de las ARNP deben
ser ajustadas.
34
P22)
LA
PROTEÍNA
SRSP1
(SPATS1),
ES
EXPRESADA
DIFERENCIALMENTE DURANTE EL DESARROLLO TESTICULAR DE LA
RATA
CAPOANO CA1, KUN A2, GEISINGER A1,3.
Departamentos de Biología Molecular1 y Proteínas y Ácidos Nucleicos (Unidad
Asociada a Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias) 2, IIBCE
Sección Bioquímica/Biología Molecular, Facultad de Ciencias3
El gen Srsp1 fue identificado en nuestro laboratorio, como un gen codificante para
la primera proteína específica de testículo portadora de un largo tramo de serinas.
Aquí se describe el patrón de expresión del gen Srsp1, durante el desarrollo
embrionario y posnatal del testículo de rata, mediante Western blots e
inmunolocalización al microscopio confocal de fluorescencia. Srsp1 se detecta por
primera vez en el embrión a los 18 días post-coito, coincidiendo con el momento en
que los gonocitos adquieren un estado quiescente. La expresión aumenta luego del
nacimiento, alcanzando su máximo nivel a los 21 días pp durante la primera división
meiótica, principalmente en los espermatocitos paquiténicos (profase meiótica
media), y decayendo dramáticamente luego de la primera meiosis, hasta niveles
muy basales en el adulto (40 días), donde no se detectó señal en espermátidas en
elongación ni espermatozoides. Srsp1 se localiza mayormente en el citoplasma,
aunque en los espermatocitos paquiténicos se mapeó también en el interior de los
núcleos. La proteína contiene además una probable señal de localización nuclear de
tipo bipartito.
Tratamientos con fosfatasa alcalina nos permitieron comprobar que la proteína se
fosforila extensivamente (de manera todo o nada), y hemos propuesto que la
función de la misma involucraría la fosforilación del tramo de serinas. Asimismo,
hemos demostrado que la proteína está altamente conservada a lo largo de la
evolución, desde los mamíferos hasta algunos invertebrados, lo que es indicio de
una función importante.
Nuestros resultados sugieren que Srsp1 desempeñaría un importante rol en la
preparación de los cordones seminíferos para la primera onda espermatogénica, y en
el establecimiento y/o avance de la primera división meiótica.
35
P23) EVALUACIÓN DEL PAPEL DE LAS PROTEÍNAS MRE11 Y RAD50 EN
CÁNCER DE MAMA
ECHARTE L1, RODRÍGUEZ CUEVAS S2, HIDALGO A3, QUINTANAR V3, LÓPEZ-CAMARILLO
C1*
1
Universidad Autónoma de la Ciudad de México, Posgrado en Ciencias Genómicas,
México DF. 2Instituto de Enfermedades de la Mama, FUCAM, México DF. 3 Instituto
Nacional de Medicina Genómica, México DF. * Autor corresponsable.
Las proteínas MRE11, RAD50 y NBS1 forman el complejo MRN, actor central en la
reparación de rupturas doble cadena del DNA (DSB), que al no ser reparadas pueden
causar muerte celular o variedad de alteraciones genéticas. Si bien el complejo MRN
es critico para mantener la integridad genómica y la supresión de tumores, aún
queda determinar el impacto que provoca su déficit en la predisposición al cáncer
de mama (CM) y su potencial valor clínico. En este trabajo analizamos la expresión
de MRE11 y RAD50 en biopsias de pacientes con CM, mediante inmunohistoquímicas
en microarreglos de tejidos, observándose una reducción del 24% en MRE11 y 14%
para RAD50.
Debido a la importante disminución de MRE11 en el tejido tumoral de las pacientes,
posteriormente analizamos si la disminución de la expresión de MRE11 inducida
mediante silenciamiento del gen en una línea celular de CM podría aumentar la
respuesta al tratamiento con un agente inductor de DSB. Primero, analizamos la
expresión de MRE11, RAD50 y NBS1 en las líneas celulares de CM (MCF-7, ZR-75-1 y
MDA-MB-231) mediante western blot, observando que presentan un patrón de
expresión diferencial. Posteriormente, silenciamos la expresión del gen MRE11 en
las células MDA-MB-231 mediante la transfección de 2 vectores con diferentes
secuencias blanco dirigidas contra MRE11 (pSilencer-mre11.1 y mre11.2)
advirtiéndose que la viabilidad de las células transfectadas con pSilencer-mre11.2
fue menor (79% vs 63%). Esta diferencia puede deberse al mayor grado de
silenciamiento logrado con pSilencer.mre11.2 (99 vs 51%). Finalmente, evaluamos el
efecto del cisplatino sobre las células transfectadas, no encontrando un aumento en
la sensibilidad al quimioterapéutico. Estos resultados sugieren que MRE11 y RAD50
desempeñan un papel crucial en la patogénesis del CM y que se requieren más
estudios en diversas líneas celulares para establecer si el déficit de MRE11 puede
potenciar el daño inducido por cisplatino.
36
P24) DELECIÓN Y SIGUIMIENTO SUBCELULAR
TRANSPORTADOR DE UREA DE Aspergillus nidulans
DE
UreA,
EL
SANGUINETTI, M, RAMÓN, A.
Sección Bioquımica, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Montevideo,
Uruguay
La urea es uno de los muchos compuestos que Aspergillus nidulans puede utilizar
como fuente de nitrógeno. Este compuesto nitrogenado es uno de los productos de
la degradación de las purinas pero también puede ser incorporado desde el medio
hacia el interior de la célula. Este ingreso puede darse por dos vías diferentes: a
través de un transporte activo mediado por una permeasa específica denominada
UreA, codificada por el gen ureA, que actúa cuando la concentración extracelular de
urea es baja, o mediante un fenómeno de difusión facilitada o pasiva cuando las
concentraciones extracelulares son altas. La transcripción del gen ureA es reprimida
ante la presencia de amonio o L-glutamina (fuentes de nitrógeno preferenciales) en
el medio de cultivo y es activada por el factor AreA ante la ausencia de estas
fuentes preferenciales de nitrógeno.
A partir de una técnica rápida y eficiente asistida por PCR conocida como “DoubleJoint” PCR (DJ-PCR) se construyó un “cassette” génico de reemplazo con el cual
pudimos deletar éxitosamente el gen ureA. Por otra parte, utilizando la misma
técnica, fusionamos el gen ureA a la proteína verde fluorescente (GFP) con el
objetivo de estudiar la localización subcelular de UreA.
Los resultados muestran que en condiciones de inducción de la expresión del gen
ureA, la permeasa se localiza en la membrana de la hifa así como en los septos. En
condiciones de represión, la permeasa es internalizada en lo que parecen ser
vacuolas, revelando la existencia de algún tipo de mecanismo de regulación a nivel
post-traduccional. Mediante ensayos con cicloheximida se reveló que, para la
internalización de la permeasa, es necesaria la síntesis proteíca. Queriendo ahondar
más en el proceso de internalización se realizaron experimentos con sacarosa
(inhibidor de clatrina), donde se observó que la internalización se estaría dando a
través de vesículas revestidas de clatrina.
37
P25) PRODUCCIÓN DE DECTINA-1 RECOMBINANTE PARA LA DETECCIÓN
DE β-GLUCANOS.
TABARES.S, ROSSOTTI.M, GONZÁLEZ-SAPIENZA.G.
Cátedra de Inmunología, Instituto de Higiene, Facultad de Química.
La Dectina-1 es un receptor de la familia de las lectinas del tipo C, que se identifico
inicialmente como un receptor de las células dendríticas que se unía a un ligando
presente en células T; y posteriormente como el principal receptor para los βglucanos. Dichos glucanos son los componentes principales de la pared celular de
organismos del reino fungi y constituyen el principal tipo de “pathogen-associated
molecular patterns” (PAMPs) que han sido identificados en estos organismos. Por su
carácter de PAMPs, los β-glucanos poseen la capacidad de modular el sistema
inmune, mostrando actividades anti-infectivas y anti-tumorales in vivo. Siendo la
Dectina-1 el principal receptor de estos carbohidratos, la misma es responsable de
mediar muchas de las respuestas inducidas por los β-glucanos, y por tanto tiene un
rol central en la inmunidad antifúngica, reconociendo un gran número de especies
de este reino. Dado su rol en el inicio de la inmunidad innata y por tratarse de un
receptor endocítico, la Dectina-1 ha sido promovida como blanco de inmunización,
mediante la conjugación del antígeno de interés a anticuerpos anti-Dectina-1 En el
presente trabajo se clonó el ectodominio de la Dectina-1 en un vector procariota de
expresión y posteriormente se optimizaron las condiciones de purificación de la
Dectina-1 recombinante. Sorteando las dificultades vinculadas a la tendencia a la
precipitación de la proteína renaturalizada, se logró establecer un protocolo de
purificación que permite obtener importantes cantidades de la proteína
recombinante soluble (1 mg a partir de 250 ml de cultivo). Con la Dectina-1
producida se montó un ensayo de ELISA sándwich para la detección de β-glucanos,
que puede tener aplicaciones en el proceso de purificación de estos carbohidratos, y
con el cual se estimó la concentración de β-glucanos presentes en diferentes
extractos de hongos locales.
38
P26) EFECTO DE LA HIPOXIA PERINATAL SEVERA EN LOS NIVELES DE
ARNm Y PROTEÍNAS ESPECÍFICOS
FERNÁNDEZ, C.1, BLASINA F.2,3, SILVERA, F.3, TELLECHEA, S.2,3, VAAMONDE, L.2,3,
BOLIOLI, P.3 , MAÑANA, G.4, GODOY, C.2, DAJAS, F.2, MARTELL, M.3 Y BEDÓ, G.1
1Secc.Genética Evolutiva, Facultad de Ciencias, Montevideo, Uruguay.
2Depto de Neuroquímica, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable,
Montevideo, Uruguay.
3Depto de Neonatología, Área Básica y 4Depto de Anatomía Patológica,
Neuropatología, Hospital de Clínicas, Montevideo, Uruguay.
La asfixia perinatal conlleva generalmente daño hipóxico-isquémico cerebral,
determinando trastornos neurológicos crónicos e incluso la muerte. Por ello es
fundamental contar con un modelo para desarrollar estrategias neuroprotectoras
eficaces. En un modelo de asfixia perinatal, en cerdos recién nacidos, en los que se
han evaluado los cambios hemodinámicos, metabólicos e histológicos a diferentes
tiempos de sobrevida, nos proponemos contribuir con la caracterización molecular.
Hemos constatado previamente que el perfil de proteínas totales obtenido de
muestras de tejido cerebral presenta un patrón similar en animales sometidos a
hipoxia con respecto a los controles. Por otro lado, el ADN genómico y el ARN total
evidenciaron mayor “labilidad” con distinto grado de degradación, entre las 2 y 8
horas tras la hipoxia, mientras que en muestras extraídas a las 12 horas se observó
un patrón indistinguible con respecto a los controles.
En base a estos antecedentes hemos analizado los niveles de expresión de genes
específicos, para definir el perfil de los cambios que ocurren durante esta ventana
temporal, y en un futuro, evaluar los efectos de terapias neuroprotectoras.
Analizamos por PCR en tiempo real los niveles de ARNm. Inicialmente buscamos un
gen que no sea afectado por el tratamiento. El análisis de beta actina, la proteína
ribosomal RPL4 y el ARN 18S indicó que solo el primero evidencia niveles
relativamente estables y fue seleccionado como referencia. Los niveles de
expresión del gen HIG-1 (hipoxia-induced gene) no presentaron cambios
significativos a las diferentes horas, mientras que los del gen HIF-1 (hipoxia-induced
factor) sugieren una inducción a las 4 Hrs. de realizada la hipoxia.
Las proteínas específicas se analizaron en ensayos de western blot. Algunas
proteínas como GFAP y HIG1 no mostraron variaciones significativas. Otras, en
cambio, como la tubulina, se vieron afectadas en sus niveles o en la presencia de
productos de proteólisis.
39
P27) ESTUDIO DEL GEN PRNP (SCRAPIE) EN OVINOS SUFFOLK Y
CORRIEDALE DEL URUGUAY
PERAZA, P 1; RUBIAL, F 1; NEGRIN, N 2; SEGREDO, P 2; PERDOMO, E 3*; EHRLICH, R 1;
MARTÍNEZ DEBAT, C 1
1
UdelaR, Facultad de Ciencias, Sección Bioquímica
Sociedad de Criadores Suffolk del Uruguay
3
UdelaR, Facultad de Veterinaria
*
Fallecido durante la realización del presente trabajo
2
El Scrapie es una enfermedad de etiología priónica que afecta a ovinos y caprinos
siendo clasificada como una de las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles
(EET). Es una enfermedad neurodegenerativa y fatal que afecta el sistema nervioso
central. Su control no es sencillo debido a que el período de incubación es
extremadamente largo (entre 2 y 5 años) sin una sintomatología que la evidencie. A
posteriori comienzan los signos clínicos hasta una eventual muerte del animal en
pocos meses. Estos se caracterizan por ataxia, temblequera, pérdida de peso, pelo y
lana, etc. Para nuestro país, permanece aún como una enfermedad exótica. En el
presente trabajo se realizó el análisis mediante la secuenciación nucleotídica de una
región del gen prnp en 58 ovinos de razas Corriedale y Suffolk. Se partió de muestras
de sangre para obtener un fragmento del exón 2 del gen prnp (cromosoma 13),
mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores específicos. Se
secuenciaron los fragmentos amplificados y se realizó un análisis mediante la
utilización de programas bioinformáticos y estadísticos. Esto permitió analizar los
codones más importantes descritos en la literatura para la determinación de la
enfermedad. Se estudiaron los polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) que dan
características de susceptibilidad o resistencia a esta enfermedad. Estos son el 136,
154, 171, y el 141(Nor98). Los resultados muestran un alto porcentaje (89.5%) de
marcadores de riesgo frecuente y moderado, un 6.9% de riesgo muy bajo y un 3.6%
de alto riesgo. Aunque este tipo de análisis no forma parte de las evaluaciones
genéticas a nivel nacional, nuestros resultados sugieren que se ameritaría un estudio
a mayor escala para conocer el perfil genético de muestras representativas de las
majadas uruguayas.
Este trabajo fue financiado en parte por I.NA.C. (Proyecto “Desarrollo de
Herramientas Moleculares Preventivas de las Encefalopatías Espongiformes
Transmisibles”).
40
P28) ESTUDIO DEL SIALO-TRANSCRIPTOMA DE Haematobia irritans
irritans.
1
PASTRO L., 1CURTO M., 2BREIJO M., 3BOLATTO C. Y 4FERNÁNDEZ C.
1
Laboratorio de Interacciones Moleculares (Facultad de Ciencias), 2Unidad de
Reactivos y Biomodelos de Experimentación (Facultad de Medicina), 3Departamento
de Histología y Embriología (Facultad de Medicina) y 4Cátedra de Inmunología
(Facultad de Química)
La mosca de los cuernos (Haematobia irritans irritans) es un parásito hematófago de
distribución mundial que afecta principalmente al ganado bovino. En condiciones de
altas cargas parasitarias causa importantes pérdidas económicas (producción de
carne y leche) constituyéndose también en un vector para la transmisión de diversas
enfermedades. Actualmente, el control de las infecciones por H. irritans está
basado en el uso de insecticidas los cuales, además de ser nocivos para el medio
ambiente, generan rápidamente resistencia por parte del parásito.
A través del estudio del sialo-transcriptoma de H. irritans se busca identificar
polipéptidos secretados en la saliva capaces de interferir con la hemostasis y los
mecanismos inflamatorios del vertebrado parasitado. Se espera que esta
información permita diseñar y ensayar herramientas para el control inmunológico de
las cargas parasitarias.
A partir de ARNm extraído de glándulas salivales de moscas adultas, se preparó una
biblioteca de ADNc utilizando una metodología de oligo-capping, que permite clonar
copias de transcriptos completos. Los primeros resultados, derivados de unas 80
ESTs generadas a partir de clonas elegidas al azar, indican que el sialotranscriptoma de H. irritans presenta una baja complejidad; en términos generales,
se identificaron secuencias codificantes para todas las clases de proteínas
identificadas recientemente en un estudio proteómico de la saliva de Stomoxis
calcitrans (Wang et al, 2009). Se seleccionaron dos proteínas para su expresión en E.
coli. Estas moléculas poseen alta similitud con presuntos ortólogos de S. calcitrans:
un miembro de la familia HYP16 y el Antígeno 5. Actualmente, se está optimizando
la producción de las correspondientes recombinantes maduras (clonadas sin la
secuencia del péptido señal) expresadas con una extensión de poli-histidina; con
ellas, se realizarán próximamente ensayos de vacunación con la finalidad de ensayar
in vivo su potencial como moléculas inmunoprotectoras.
41
P29) MUTACIONES SINÓNIMAS AFECTAN LA ACTIVIDAD Y
LOCALIZACIÓN CELULAR DEL RECEPTOR DE ESTRÓGENOS ALFA
HUMANO.
FERNÁNDEZ T.1, HORJALES S.1, ALBERTI A.2, ASTRADA S.2, BOLLATI M.2, MARÍN M.1
1
2
Sección bioquímica de la Facultad de Ciencias UDELAR.
Institut Pasteur de Montevideo.
El conocimiento de los mecanismos que determinan cual es la conformación de las
proteínas in vivo es aun limitado. En la célula, el plegamiento de proteínas es un
proceso fundamentalmente co-traduccional y por tanto, cambios en los
componentes de la maquinaria de traducción podrían afectar la conformación de la
misma que está siendo sintetizada. Nuestro objetivo es comprender cómo influye la
cinética de traducción en el plegamiento de proteínas y cuál es el efecto de codones
sinónimos en su secuencia codificante. Tomamos como modelo al receptor de
estrógenos alfa humano (ERα), un factor de transcripción inducible por ligando que
media la actividad de los estrógenos. Cambios en la conformación de ésta proteína
han sido propuestos como reguladores de su actividad biológica.
Resultados previos de nuestro grupo realizados mediante traducción in vitro y
proteólisis limitada, sugieren que los componentes de la maquinaria de traducción
celular pueden modificar las vías de plegamiento del ERα y la abundancia relativa de
diferentes conformaciones del receptor.
En este trabajo, estudiamos la funcionalidad del ERα en células humanas
transfectadas. Se comparó la actividad del receptor sintetizado a partir de la
secuencia salvaje y algunas mutaciones sinónimas ubicadas en la región amino
terminal (mutantes llamados 3P, 5PL y 2PL). Cuando se emplearon células HepG2, la
expresión de los mutantes 5PL y 2PL mostraron menor actividad de transactivación,
a pesar que los niveles de expresión fueron comparables al ERα wt. Por
inmunofluorescencia se analizó la localización subcelular del ERα wt y de sus formas
mutantes y se observaron diferencias en la distribución celular de los mutantes al
salvaje. Nuestros resultados sugieren que el uso de codones sinónimos en células
humanas, puede afectar la funcionalidad de las proteínas, eventualmente alterando
su localización subcelular, y/o su conformación tridimensional.
Financiado por CHLCC, FCE y ANII, Uruguay
42
BIOTECNOLOGÍA
P30-P40
P30)
DESARROLLO
DE
BIOCATALIZADORES
MODIFICADOS
GENETICAMENTE PARA LA CONVERSION DEL GLICEROL EN 1,2PROPANODIOL.
IGLESIAS, C., A SIERRA, W., B MENÉNDEZ, P. B Y RODRÍGUEZ, S. A, B
a
Cátedra de Microbiología, DEPBIO, y bLab. de Biocatálisis y Biotransformaciones,
DEPBIO-DQO, Facultad de Química, Gral. Flores 2124, 11800 Montevideo, Uruguay.
En el ultimo siglo se ha dado un auge en la búsqueda de energías alternativas, en
Uruguay en particular se la ha dado importancia a la producción de biocombustibles,
biodiesel y etanol. El proceso productivo de biodiesel genera como subproducto
Glicerol (1,2,3-propanotriol) en una proporción aproximada a 9:1 medido en peso
(Biodiesel:Glicerol).
Nuestro grupo se ha planteado desarrollar biocatalizadores de utilidad en la
conversión del glicerol a 1,2-propanodiol El 1,2-propanodiol o sus derivados, son
material fundamental en la industria farmacéutica donde la síntesis de drogas en su
forma ópticamente pura es un requisito actualmente indiscutible un ejemplo es (S)Propilen carbonato que es un producto de acción antiviral
Nuestra estrategia se basó en el desarrollo de cepas de S. cerevisiae modificadas
genéticamente para la producción del 1,2-propanodiol. Los sistemas de sobre
expresión enzimática han sido diseñados utilizando como microorganismo receptor
la cepa S. cerevisiae YPH500 ura3–52 lys2–801amber ade2–101ochre trp1–Δ63 his3–
Δ200 leu2–Δ1 transformada con el vector de expresión construido a partir del
plásmido pESC-TRP, este vector esta diseñado para la expresión y el análisis
funcional de dos genes eucariotas en la levadura S. cerevisiae ya que contienen los
promotores GAL1 y GAL10 en orientación contraria lo que da la posibilidad de clonar
y coexpresar dos genes en la misma cepa. Se utilizó este sistema para la expresión
de los genes GRE2 e YPR1 que producen una metilglioxal reductasa y una aldehído
reductasa, con las cuales se propone realizar una ruta metabólica modificada (Fig
1).
OH
OH
OH
Glicerol
Gre2p
O
O NAD(P)H + H+
Metilglioxal
Ypr1p
O
NAD(P) +
HO
OH NAD(P)H + H+
NAD(P) +
Lactaldehído
OH
1,2-Propanodiol
La realización de este trabajo ha implicado amplificación de los genes por PCR y su
clonado en el vector pCR 2.1-TOPO. Se verificó la secuencia de ambos genes,
subclonándolos luego en el vector pESC-TRP con el cual se trasformo la cepa de
expresión.
43
P31) ESTUDIO MOLECULAR DE CITRULINEMIA PARA DIAGNOSTICO
DIFERENCIAL EN UNA TERNERA HOLANDO CON SINTOMATOLOGIA
NERVIOSA.
TRENCHI G¹; KELLY L¹; RIVERO² R; PERAZA P¹.
1-Unidad de Biotecnología Animal INIA Las Brujas.
Ruta 48 Km 10, Rincón del Colorado.
2-DILAVE-Paysandú. Laboratorio Regional Noroeste.
Ruta 3 Km 369.
La citrulinemia bovina es una enfermedad autosómica recesiva observada en la raza
Holstein-Friesian. Afecta al ciclo de la urea debido a la deficiencia de la enzima ASS
(argininosuccinate-synthetase). Provoca un cuadro neurológico letal en terneros a
los pocos días de nacer por la acumulación de amoníaco en el organismo por la falta
de detoxificación del mismo.
Se recibe una muestra de hígado en formaldehído al 10% de una ternera Holando con
signos nerviosos en el la Unidad de Biotecnología Animal de INIA Las Brujas para el
diagnóstico de citrulinemia mediante la técnica de PCR.
Es remitida por DILAVE-Paysandú para realizar parte de un diagnóstico diferencial
que incluye enfermedades infecciosas, tóxicas y hereditarias.
Para la extracción de ADN a partir del tejido fijado en formaldehído se desarrolla
una nueva técnica ya que existe poca información bibliográfica disponible. Se utiliza
un patrón del ISAG diagnosticado como portador de citrulinemia y ADN extraído de
muestras de sangre de vacas Holando del tambo La Estanzuela como controles.
De acuerdo al método descrito por Grupe et al.1996 se logra amplificar un
fragmento de 185 pb que detecta la mutación en el gen que codifica la ASS.
Los fragmentos obtenidos son sometidos a la acción de la enzima de restricción Eco
47I (RFLP) para su digestión y evaluados por electroforesis en gel de agarosa al 4%.
Se obtienen 3 bandas (185-103-82 pb) a partir del control del ISAG confirmando que
es portador del gen mutante y 2 bandas (103-82 pb) en el resto de las muestras
analizadas. En ninguno de los casos se observa un solo fragmento sin cortar de 185
pb (homocigoto y afectado de citrulinemia).
Se concluye que la citrulinemia no es la causa del cuadro nervioso ya que la ternera
no presentaba ninguna alteración en el gen que codifica a la enzima.
44
P32) EXTRACCION DE ADN PARA PCR A PARTIR DE UN TEJIDO FIJADO
EN FORMALDEHIDO
TRENCHI G¹; KELLY L¹; RIVERO R²; PERAZA P¹.
1-Unidad de Biotecnología Animal INIA Las Brujas.
Ruta 48 Km 10, Rincón del Colorado.
2-DILAVE-Paysandú. Laboratorio Regional Noroeste.
Ruta 3 Km 369.
Se decide probar un nuevo protocolo para la extracción de ADN a partir de una
muestra de hígado fijada en formaldehído al 10% debido a la escasa bibliografía
encontrada sobre el tema. El ADN obtenido es utilizado para realizar un diagnóstico
diferencial de citrulinemia mediante la técnica de PCR.
De acuerdo a la publicación de P. García et al 2006 se demostró que el formaldehído
produce entrecruzamientos (cross-linkange) entre los ácidos nucleicos y las
proteínas e hidroliza puentes fosfodiester provocando problemas para obtener ADN
de buena calidad. Además disminuye el rendimiento de la amplificación por PCR
dependiendo del tiempo y temperatura de la fijación. Para la experiencia se
tomaron 0.100 gramos del hígado que se cortaron en pequeños fragmentos.
Posteriormente se lavaron con agua MQ para retirar la mayor cantidad de
formaldehído posible.
Al material se le agregaron 5 ml de buffer de lisis y 25 l de proteinasa K (20 mg/ml)
y se dejó incubando a 37 ºc por 7 días agitando suavemente.
Para mejorar la calidad del ADN extraído y aumentar la eficiencia de amplificación
se utilizó el kit de extracción DNA SORPOclean™ Genomic DNA Extraction Module
(SORPO). Se adicionaron 2 l de RNAsa a la suspensión obtenida para una mejor
digestión proteica.
Al ser evaluado en un gel de agarosa al 0.8% el ADN aparece degradado, en el
nanadrop se obtienen los siguientes valores 357.72 ng/l, 1.69 (260/280), 1.40
(260/230). Se desconoce el tipo de formaldehído utilizado para la fijación. Esto hace
muy difícil determinar el grado de degradación provocado, especialmente si este no
es tamponado.
Se realiza el PCR consiguiéndose el fragmento esperado de 185 pb que detecta la
mutación en el gen que codifica la ASS.
Se concluye que el método de extracción utilizado es adecuado ya que se logró ADN
suficiente para el diagnóstico.
45
P33) ESTUDIO DE LA PRODUCCIÓN DE POLIHIDROXIBUTIRATO POR
Herbaspirillum seropedicae EMPLEANDO DIFERENTES FUENTES DE
CARBONO
MALAN, A.K., CATALÁN, A.I., Y BATISTA, S.
Unidad de Microbiología Molecular-Laboratorio de Ecología Microbiana, Instituto de
Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE)
El polihidroxibutirato (PHB) es un homopolímero de 3-hidroxibutirato producido
como material de reserva por una amplia variedad de microorganismos. Se
sintetizan en condiciones desbalanceadas de crecimiento y exceso de fuente de
carbono. Estos biopolímeros provienen de fuentes renovables, son termoplásticos y
biodegradables, constituyendo un material alternativo a los plásticos petroquímicos.
Sin embargo, su aplicación industrial está limitada por los altos costos de
producción, siendo la fuente de carbono el rubro que contribuye más
significativamente.
Existen varios residuos o subproductos agroindustriales que pueden ser empleados
como sustrato carbonado para la producción de PHAs. La hemicelulosa, uno de los
residuos agroindustriales más abundantes, está compuesta principalmente por
azúcares de 5 carbonos como la xilosa, arabinosa, y en menor proporción de
glucosa.
Herbaspirillum seropedicae es una bacteria diazótrofa, endófita de diversas plantas
incluyendo caña de azúcar, maíz, banana y arroz. Es capaz de crecer y acumular
PHAs en presencia de diversos carbohidratos (glucosa, arabinosa, xilosa) (Catalán et
al., 2007).
El objetivo de este trabajo es estudiar la producción de PHB por H. seropedicae Z69
cultivado en presencia de glucosa, xilosa y arabinosa y/o mezcla de las mismas
como únicas fuentes de carbono. En presencia de glucosa, con una relación molar
C/N de 25 mol.mol-1, la bacteria acumula un 60% de PHB. Al utilizar la mezcla de
xilosa-glucosa-arabinosa, en una proporción porcentual similar a la de la
hemicelulosa de bagazo de caña, produce 8,7 g/l de biomasa con un contenido del
56% de PHB. Estos resultados son comparables a los descritos en la bibliografía para
otros microorganismos (Silva et al., 2004)
Como perspectivas futuras se plantean estudiar la producción de PHB empleando
hidrolizados de hemicelulosa como sustrato carbonado y la optimización de la
misma mediante el análisis de flujos metabólicos asociado a técnicas de ingeniería
genética y posterior ajuste de las condiciones de fermentación.
Catalán et al., 2007 Enzyme and Microbial Technology 40: 1352-1357
Silva et al., 2004 J. Ind. Microbiol. Biotechnol 31: 245-254
46
P34) RECEPTOR DE OXITOCINA EN EL EPITELIO DEL CERVIX CRANEAL
OVINO DURANTE EL CICLO ESTRAL.
GONZALEZ, M. R. Y RODRÍGUEZ PIÑÓN, M.
Área Bioquímica, Departamento de Biología Molecular y Celular, Facultad de
Veterinaria, Montevideo, Uruguay
Se estudió la distribución del Receptor de Oxitocina (ROx) en el epitelio luminal
apical de los pliegues del cervix craneal ovino durante el ciclo estral. Ovejas
Corriedale adultas fueron sacrificadas a los días 1 (n=4), 6 (n=4) o 13 (n=4) del estro
sincronizado (día=0). El ROx se detectó por inmunohistoquímica utilizando un
anticuerpo monoclonal contra hROx (ROTHO PHARMACEUTICAL CO., LTD.). En
campos (40X) de la porción apical de los pliegues del cervix craneal de cada oveja se
tomaron 10 imágenes que fueron procesadas para obtener solamente el epitelio
luminal (Photo Shop 10.0) y segmentadas utilizando dos tonalidades diferentes de
positividad: intensa y leve. Se midió el porcentaje de área ocupada por cada una de
las tonalidades (%intensa y %leve) y su suma (%total) en función del área de epitelio
(Image Pro Express). Los datos fueron analizados por ANOVA y Test de t. El %intensa
fue menor al día 1 respecto al día 13, mientras que el %leve fue mayor al día 1
respecto a los días 6 y 13 (Figura). No se obtuvo diferencia en el %total a lo largo del
ciclo estral (Figura). Independientemente del día del ciclo estral, el %intensa fue
menor que el %leve (21.0 ± 5.1 vs. 34.5 ± 5.5), (p<0.0001). Los resultados muestran
que la distribución de la inmunoseñal del ROx en el epitelio luminal apical de los
pliegues del cervix craneal
ovino varía a lo largo del ciclo
estral.
Figura: Porcentaje de área
positiva (intensa, leve y total)
al ROx (media±sem) en el
epitelio luminal apical de los
pliegues del cervix craneal de
ovejas a los días 1, 6 o 13 (n=4
en cada grupo) de la detección
del estro (día=0). Columnas de
la misma serie con diferentes
letras
difieren
significativamente (P<0.05).
Financiación: CIDEC-Facultad de Veterinaria; ANII-Proyecto FCE_487.
Agradecimientos: Isabel Sartore y Alejandro Bielli.
47
P35) BIOTECNOLOGÍA DE PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS
DÍAZ DELLAVALLE, P.A, DALLA RIZZA, M.A, CABRERA, A.A, ALTIER, N.B, FERREIRA, F.C
A Laboratorio de Proteínas, Unidad de Biotecnología, INIA Las Brujas, Uruguay;
B Protección Vegetal, INIA Las Brujas, Uruguay; cLaboratorio de Carbohidratos y
Glicoconjugados, Instituto de Higiene, Uruguay.
En la era post-genómica e inicio de la proteómica, el hombre busca nuevas
alternativas al uso de pesticidas para el control de fitopatógenos. Dentro de estas
estrategias se incluye el estudio de los sistemas de defensa propios de los
organismos. La inmunidad innata constituye la rama evolutivamente más antigua de
los mecanismos de defensa, ya que se ha observado en organismos diferentes
mecanismos moleculares similares para responder a patógenos. Entre los diversos
componentes de la inmunidad innata, que comprende barreras estructurales y
bioquímicas, en la actualidad ha cobrado gran importancia el estudio de los
Péptidos AntiMicrobianos (PAMs). Hasta la fecha, se han descrito más de 800
posibles tipos de PAMs distribuidos en plantas, invertebrados, vertebrados, hongos y
procariotas, sugiriendo una gran relevancia biológica. Tanto los animales como las
plantas usan estos péptidos para defenderse contra un amplio espectro de
patógenos.
A pesar de los progresos considerables en el estudio de péptidos contenidos en
plantas, se conoce muy poco acerca de PAMs de especies de la flora nativa. El
objetivo del presente estudio es purificar y caracterizar péptidos con actividad
antimicrobiana contenidos en semillas de Amaranthus quitensis, maleza presente en
nuestro país.
El trabajo se está realizando en dos fases: 1) purificación del péptido
antimicrobiano, así como su caracterización bioquímica y elucidación estructural, y,
2) determinación del mecanismo de acción.
Se han realizado etapas de purificación que incluyen técnicas bioquímicas y
cromatográficas. Las diferentes fracciones peptídicas obtenidas han sido evaluadas
mediante bioensayos contra fitopatógenos de relevancia agronómica. Las fracciones
que presentaron porcentajes de inhibición mayor a 50%, están siendo caracterizadas
por espectrometría de masas. Mediante estudios posteriores se espera determinar la
estructura mínima responsable de la actividad antimicrobiana, así como su
mecanismo de acción. Esto permitirá caracterizar nuevas biomoléculas,
constituyendo una alternativa de control de fitopatógenos, área emergente en
nuestro país.
Este trabajo de Tesis de Doctorado en Química se está realizando gracias al apoyo
financiero otorgado por el PEDECIBA Química, Agencia Nacional de Investigación e
Innovación (ANII), e Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria (INIA, Proyecto
BT_04).
48
P36) PROPIEDADES Y APLICACIONES DE LA -GALACTOSIDASA DE
Bacillus circulans INMOVILIZADA EN SOPORTES ACRÍLICOS
TORRES, P. Y BATISTA-VIERA, F.
Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias, Facultad de Química,
Universidad de la República, General Flores 2124, Montevideo, Uruguay.
La -galactosidasa de Bacillus circulans presenta una termoestabilidad superior a las
lactasas de levaduras, posee un pH óptimo de 6.0, coincidente con el pH del
lactosuero, y no requiere cofactores metálicos para su actividad. La inmovilización
de la enzima ofrece ventajas en su aplicación biotecnológica, permite su reuso, y la
separación del catalizador y los productos de reacción.
Los soportes acrílicos epoxi-activados son esferas de polímero acrílico con grupos
epóxido ligados, los cuales participan en la unión covalente de enzimas y otras
proteínas. Este tipo de soportes son muy estables desde el punto de vista químico y
mecánico.
En el presente trabajo se estudiaron algunas de las propiedades y aplicaciones de la
-galactosidasa de B. circulans inmovilizada covalentemente en tres tipos de resinas
acrílicas epoxi-activadas: Eupergit C, Sepabeads EC-EP y Sepabeads EC-HFA. Los
derivados resultaron muy estables en el rango de pH 5.5-7.5. Se determinaron a su
vez las estabilidades térmicas de derivados obtenidos a distinta carga aplicada y a
distintos tiempos de inmovilización para el caso de los tres soportes. La pérdida de
eficiencia catalítica a baja carga y la estabilidad térmica excepcional resultante
podría sugerir unión multipuntual. Para reforzar esta hipótesis, se determinaron las
eficiencias catalíticas y estabilidades térmicas de derivados obtenidos a cargas baja,
media y alta por inmovilización en Eupergit C y posterior tratamiento alcalino postinmovilización, buscando favorecer la unión multipuntual. Los derivados con mayor
termoestabilidad fueron aquellos sometidos a tratamiento alcalino durante más
tiempo, y se observa una reducción concomitante de eficiencias catalíticas.
Los derivados se aplicaron a la hidrólisis de lactosa en batch usando lactosa 4.6% en
buffer y lactosueros ajustados a pH 6.0 como sustrato. Los mayores niveles de
conversión se obtuvieron cuando se utilizaron lactosueros de queso Mozzarella y
derivados enzimáticos en Eupergit C y Sepabeads HFA.
49
P37) DETECCION Y CONFIRMACION DE LOS VIROIDES CITRICOS
PRESENTES EN URUGUAY A PARTIR DE MUESTRAS EXTRAIDAS DE
CAMPO
PAGLIANO, G1, UMAÑA, R1 Y PRITSCH C1.
1
Laboratorio de Biotecnología, Facultad de Agronomía, UdelaR.
Los viroides presentes en las plantaciones citrícolas de Uruguay son CEVd (Citrus
Exocortis Viroids), CBLVd (Citrus Bent Leaf Viroids), HSVd (Hop Stunt Viroids) y
CDVd (Citrus Darwarfing Viroid). En el año 2000 éstos viroides han sido detectados y
caracterizados mediante sPAGE seguido de Northern y/o Dot o Slot blot, mediante
hibridación molecular con sondas específicas marcadas con digoxigenina a partir de
muestras de tejido de planta indicadora Cidro Etrog 861.
En la actualidad se dispone de una nueva metodología desarrollada por Murcia N.,
2008. Con el uso de ésta metodología adaptada a nuestras condiciones se ha podido
confirmar la presencia de los viroides previamente descriptos presentes en nuestro
país (CEVd, CBLVd, HSVd y CDVd) a partir de cortezas de rama de árboles a campo.
La metodología consiste en extracción de ARN (Semancik,1975), PAGE seguido de
Northern, fijación de la membrana con cross linking, hibridación con sondas
marcadas con digoxigenina y autorradiografía con sustrato CSPD. La metodología ha
sido ensayada con éxito para todas las variedades de citrus y en cualquier época del
año y aún a partir de tejidos congelados.
Los resultados reflejan alta especificidad, sensibilidad y rapidez, evitando la etapa
de indexing de plantas indicadoras, donde la expresión de síntomas requiere de 1 a
3 meses bajo condiciones controladas. El límite de detección obtenido se encuentra
entre 4-8mg de tejido infectado. Se confirma que en nuestras plantaciones citrícolas
los viroides presentes antes mencionados aparecen en combinaciones de dos o más
viroides, detectados inicialmente con las técnicas previamente empleadas.
Hoy la ciencia demanda y es una necesidad disponer de métodos moleculares
sensibles, específicos, sencillos, de bajo costo y rápidos para la incorporación en el
Programa de Certificación, Sistemas Cuarentenarios y en el control de los bancos de
germoplasma existentes en nuestro país.
Palabras claves: detección, viroides cítricos, PAGE-Northern, Uruguay.
50
P38) EFECTO DE LA CO-INOCULACION RIZOBIO-Delftia EN EL
DESARROLLO DE TREBOL
BRAÑA,VICTORIA1; MOREL, MARIA1; CASTRO-SOWINSKI, SUSANA1,2.
1
Unidad de Microbiología Molecular, IIBCE.
Ciencias.
2
Sección Bioquímica, Facultad de
Las PGPR son un grupo de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal, entre
las cuáles se encuentran los rizobios (fijadores simbióticos de nitrógeno). Varios
estudios han demostrado que la co-inoculación de leguminosas con rizobios y otras
PGPRs incrementa la velocidad de nodulación, el número de nódulos por raíz y la
fijación de nitrógeno, y por lo tanto, el desarrollo de la planta.
En nuestro laboratorio, se aislaron tres microorganismos del género Delftia, uno de
los cuales (JD2) promueve la infectividad del rizobio comercial Sinorhizobium
meliloti U143 en alfalfa, promoviendo la simbiosis.
El objetivo de este trabajo fue analizar los mecanismos de promoción de
crecimiento vegetal en los 3 aislamientos de Delftia y la capacidad de JD2 para
promover el crecimiento de plantas de trébol, en ensayos de co-inoculación con el
rizobio comercial Rhizobium trifolii U204.
Se evaluó la capacidad de los aislamientos de producir fitohormonas, sideróforos y
proteasas, solubilizar fosfatos, y fijar nitrógeno en vida libre También se evaluó la
capacidad de promoción de crecimiento vegetal de plantas de trébol en ensayos de
inoculación con JD2 y co-inoculación U204- JD2, en condiciones gnotobioticas.
Se encontró que los tres aislamientos son incapaces de solubilizar fosfatos, pero
producen sideróforos, exoproteasas, elevadas cantidades de ácido indol-acético y
crecen en medio Nfb (libre de nitrógeno). JD2 fue capaz de fijar nitrógeno según
ensayos de reducción de acetileno y mostró un efecto promotor de la infectividad de
U204 en trébol (aumento de biomasa aérea y de cinética de nodulación)
Los estudios futuros se focalizarán en la búsqueda de la mejor relación U204-Delftia
capaz de dar el mayor rendimiento vegetal en trébol, con el fin de obtener un
inoculante mixto.
51
P39) LOS ENSAYOS DE EMBRIOTOXICIDAD EN PEZ CEBRA DETECTAN
UNA VARIEDAD DE EFECTOS TERATOGÉNICOS DEL GLIFOSATO
BORTAGARAY, V., CRUCES ARAMBURU, R., DEL PUERTO, G., BARRIOS, L., OJEDA, P.,
SARAVIA, A., RODRÍGUEZ-ITHURRALDE, D.
Laboratorio de Neurociencia Molecular y Núcleo de Biotecnología y Marcadores
Moleculares, Instituto Clemente Estable (IIBCE). E-mail: [email protected]
Creciente evidencia internacional sugiere que los herbicidas a base de glifosato, los
más usados mundialmente, presentan alta toxicidad para formas inmaduras de
anfibios y peces, representando una potencial amenaza para la biodiversidad, la
pesca y la piscicultura, que debe ser detectada y monitoreada. Con ese fin hemos
desarrollado en Danio rerio, tests multiparamétricos de embriotoxicidad en placas
de ELISA de 24 y 96 pocillos, que permiten cientos o incluso miles de ensayos
simultáneos (Ojeda et al. 2007). Expuestos al compuesto a partir de 1-1.5 horas
post-fecundación (1hpf), los embriones experimentaron una mortalidad dependiente
de dosis y tiempo de exposición. A una concentración final (ccf) de glifosato de 12.5
g/ml, no hubo diferencias significativas de mortalidad con controles; fue
significativa a partir de 25 g/ml (23% a 24hpf; 27% a 48hpf; 31.2% a 72hpf). A
24hpf, a ccf de 50 g/ml la mortalidad es 35.4%, a 75 g/ml es 74% y a 150 g/ml
82%. El porcentaje de embriones que eclosionaron a 72 hpf estuvo
significativamente aumentado a ccf de 12,5 g/ml, liberándose al medio, en
consecuencia, formas más inmaduras que los controles. La frecuencia cardíaca
(48hpf) estuvo significativamente disminuida a partir de ccf de 25 g/ml,
verificándose un enlentecimiento circulatorio a 75g/ml. A 50 g/ml apareció
edema cardíaco y retardo en la separación del saco vitelino. A 75g/ml, 100 % de los
embriones presentaron alteraciones del desarrollo tales como: edemas de somites
con disminución de movimientos de flexión, malformación del saco vitelino, edema
cardio-pericárdico, gibas o divisiones de la cola y groseras malformaciones
incompatibles con la sobrevida. En conclusión, es un test de embriotoxicidad rápido,
sensible, reproducible y de bajo costo, que demuestra teratogénesis a rangos de
concentración de glifosato que se reportaban como atóxicos y que se han verificado
en estudios de campo.
Apoyado por PEDECIBA (BIOLOGÍA)
52
P40) OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE CULTIVO
PRODUCCION DE LEVADURA PARA BIOCONTROL EN MANZANAS
PARA
LABADIE, V.; VERO, S.
Cátedra de Microbiología. Departamento de Biociencias. Facultad de Química. Gral
Flores 2124. Montevideo. Uruguay. E-mail: [email protected]
Las enfermedades de postcosecha constituyen una importante causa de pérdidas de
fruta, siendo Penicillium expansum y Botrytis cinerea los principales patógenos
postcosecha de manzana. Como alternativa a la utilización de fungicidas químicos se
han planteado estrategias de control biológico. Se han aislado, identificado y
seleccionado 2 cepas de levaduras antagonistas capaces de biocontrolar
enfermedades poscosecha de manzana lográndose niveles de protección de hasta
90%.
El objetivo del presente trabajo es optimizar las condiciones de producción de los
antagonistas seleccionados a mayor escala en medio líquido.
En primer lugar se determinó temperatura y pH óptimo de crecimiento de cada
biocontrolador. Se estudió mediante auxanograma los sustratos carbonados y
nitrogenados que dichas levaduras asimilan. Para los ajustes de composición del
medio líquido se utilizó glucosa como fuente de carbono y cloruro de amonio como
fuente de nitrógeno y las concentraciones utilizadas son las que se desprenden de la
relación estequeometrica según la composición molecular de la biomasa,
considerando que los microorganismos utilizan un 50 % de la glucosa para energía y
50% para formación de biomasa. Se variaron también las concertaciones de glucosa
manteniendo la proporción estequiometrica determinándose la concentración
mínima inhibitoria. Se probó el agregado de extracto de levadura en diferentes
concentraciones para determinar la incidencia de vitaminas en el crecimiento. A su
vez se estudió la influencia de la agitación en el rendimiento final. Los resultados
mostraron que las fuentes de C y N estaban en exceso, y que el oxígeno disuelto era
el reactivo limitante.
53
GENÉTICA, GENÓMICA Y BIOINFORMÁTICA P41-P55
P41) COMPARACIÓN DE DOS TÉCNICAS MOLECULARES (RT-PCR VS.
PCR-RFLP) PARA DETERMINACIÓN DE ESPECIES DE CÁNIDOS
GONZÁLEZ 1 S., CARLOZZI1 A., COSSE1 M., DUARTE2 J.M. B. & MALDONADO J. E.
3
1
Genética de la Conservación-IIBCE -UA Facultad de Ciencias Av. Italia 3318 11600
Montevideo-Uruguay
2
Núcleo de Pesquisa e Conservação de Cervídeos-Departamento de Zootecnia /
Universidade Estadual Paulista Via de Acesso Paulo Donato Castellane, s/n 14884900, Jaboticabal – SP,Brasil.
3
Center for Conservation and Evolutionary Genetics, National Zoological Park/,
Smithsonian Institution. 3001 Connecticut Ave. NW., Washington, DC 20008 USA
Las técnicas de diagnóstico de especies basadas en marcadores moleculares han
tenido un especial desarrollo en las últimas décadas, permitiendo utilizar ADN
extraído de materiales antiguos y fecas. El número de especies de cánidos es un
indicador ampliamente utilizado para analizar el estado de conservación de las
áreas naturales. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un marcador molecular
eficiente para determinar la presencia y distribución de las especies de cánidos
Neotropicales en el Uruguay. Para ello amplificamos con primers universales, un
fragmento de la región de control mitocondrial (460 pb) en 45 ejemplares de
cánidos de nuestro banco de ADN de referencia. Analizamos los patrones de
variabilidad inter e intraespecífico y diseñamos un juego de primers específico que
amplifica 232 pb, para efectuar PCR-RFLP y discriminar entre las especies de
zorros presentes en el Uruguay. Este fragmento tiene un sitio de corte para la
enzima de restricción Spe I presente sólo en el zorro de monte Cerdocyon thous.
La técnica consiste en: 1) extracción de ADN de fecas; 2) amplificación del
fragmento de ADNmt por PCR; 3) digestión del producto amplificado con la enzima
Spe I; y 4) electroforesis en un gel de agarosa al 3% con la cual se determina la
especie en función del patrón de bandas observado: una banda de 232 pb
corresponde al zorro gris Pseudalopex gymnocercus y dos bandas de 68 y 164 pb en
Cerdocyon thous. El mismo marcador fue empleado utilizando RT-PCR en el canal
de “High Resolution Melting”, utilizando el fluorocromo Eva Green (Qiagen®
HRM™). Esta técnica permitió discriminar amplicones polimórficos teniendo un
nivel de resolución de una mutación. El análisis de las curvas de desnaturalización
(melting) mostró que es posible discriminar entre las especies. Esta última técnica
presenta mayor eficiencia, rapidez y confiabilidad en el diagnóstico taxonómico.
54
P42) POLIMORFISMOS GENETICOS RELACIONADOS CON INSULINORESISTENCIA. ESTUDIO PRELIMINAR
REYES AL1, SOUTO J1, ACOSTA M2, AIRAUDO C2, FERRERO R3, SIMONELLI B2, SOTO
E3, VITARELLA G4, FERNANDEZ J2, JAVIEL G2,4. MIMBACAS A1
1.
2.
3.
4.
Grupo de Genética Humana, Dpto. Genética, IIBCE
Policlínica de Endocrinología Hospital Pasteur MSP
Policlínica descentralizada del CASMU
Servicio de Diabetología del CASMU
El individuo en quien se desarrolla la insulino-resistencia compensa la disminución
de los efectos sobre el metabolismo de la glucosa, aumentando la secreción de
insulina en grado suficiente para regresar el metabolismo de la glucosa a la
normalidad. Este estado de hiperinsulinemia compensada, establece una
interacción crónica con la contribución genética subyacente del individuo. Esta
interacción es la que determina la respuesta fenotípica y los efectos clínicos de la
resistencia a la insulina y la hiperinsulinemia. La insulino-resistencia interactúa
con factores genéticos de cada individuo determinando cuales de los componentes
del síndrome de insulino-resistencia se habrá de manifestar, cuan grave va a ser su
curso y hasta que punto van a acelerarse complicaciones asociadas. En base a
esto, se están estudiando dos de los principales SNP
(Pro/Ala) y IRS-1 (Gly-Arg) relacionados no solo con el desarrollo de este síndrome
sino también con la respuesta a drogas hipoglucemiantes. El objetivo de este
estudio preliminar fue establecer las frecuencias genotípicas de estos
polimorfismos mediante las técnicas de PCR a tiempo final y PCR a tiempo real.
IRS-1 encontrándose las siguientes frecuencias genotípicas: PP 0.85% ; PA 0.15% y
GG 0,53% y GA 0,47% respectivamente.
Estos resultados nos permitirán en una segunda etapa de la investigación
establecer la relación con la historia clínica de cada paciente y la asociación con la
respuesta a drogas hipoglucemiantes y de esa manera contribuir al tratamiento
adecuado para cada pacientes.
55
P43) FRECUENCIAS ALELICAS DE POLIMORFISMOS ASOCIADOS A
EFICIENCIA ALIMENTICIA EN BOVINOS DE CARNE
TRUJILLO, A. I; GRIGNOLA, P; PANDULLI, I; NICOLINI, P; ESPASANDÍN, A;
PEÑAGARICANO, F; CARRIQUIRY, M.
Laboratorio de Técnicas Nucleares, Facultad de Veterinaria y Laboratorio de
Biología Molecular y Endocrinología Metabólica, Facultad de Agronomía, UDELAR.
Los genes NPY y LEPTINA están involucrados en la regulación neuroendócrina del
consumo y en el control del balance energético. Por sus roles fisiológicos, son
considerados genes candidatos para estudiar la eficiencia del animal en el uso del
alimento (eficiencia de alimentación, EA). El objetivo fue estudiar las frecuencias
alélicas de SNPs de los genes NPY y LEPTINA (asociados con EA en ganado cruza en
Canadá) para planificar estudios de asociación entre estos SNPs y EA en la raza
Angus en Uruguay. Se genotiparon 134 terneras, provenientes de 5 cabañas con
una importante contribución génica a la población Angus nacional, para las
variantes A/G del gen NPY (AY491054-666, intrón 2) y las variante C/T del gen
LEPTINA, AF 120500-73 exón2). El ADN genómico fue extraído de sangre entera por
procedimiento “salting out” y la identificación de las variantes alélicas fue
realizada por el método PCR-HRM (High Resolution Melt). Las frecuencias
genotípicas observadas para NPY fueron 62% de homocigotos AA, 28% de
heterocigotos y 10% de homocigotos GG. Para LEPTINA, las frecuencias fueron 20 %
de homocigotos CC, 53% de heterocigotos y 27% de homocigotos TT. Las
distribución de las frecuencias genotípicas fue similar para las diferentes cabañas
(P= 0.31 y P=0.24, NPY y LEPTINA, prueba de 2). Las frecuencias alélicas de A y G
fueron 76 y 24% y las de C y T, 46 y 54%, respectivamente La frecuencia de
animales GG fue inferior a la reportada en ganado cruza en Canadá mientras que
la frecuencia de los CC resultó similar. Estos animales fueron más eficientes bajo
alimentación en confinamiento. Por lo tanto, existirían posibilidades ciertas de
mejorar EA en el Angus nacional. Estudios de asociaciones entre estos SNPs y
medidas de EA en nuestras condiciones pastoriles son fundamentales si se desea
implementar selección asistida por información molecular.
Palabras claves: SNP, NPY, LEPTINA, eficiencia alimenticia, bovinos Angus
56
P44) ESTUDIO IN SILICO DE LOS GENES Y PROTEÍNAS MARCKS DE
VERTEBRADOS
Prieto D, Toledo A, Zolessi FR, Arruti C
Sección Biología Celular, Facultad de Ciencias, Universidad de la República
MARCKS y MRP (MARCKS Related Protein) son proteínas intrínsecamente
desplegadas que modulan la dinámica de actina cortical. El bloqueo de su
expresión causa severos defectos, especialmente en el desarrollo del sistema
nervioso. Ambas son de distribución ubicua, y su expresión está regulada durante
el desarrollo. La estructura de sus genes ha sido estudiada principalmente en el
humano y el ratón, donde se han identificado motivos de regulación de la
expresión en la región upstream del gen, y de sobrevida del mensajero en su 3‟UTR. Las dos proteínas poseen tres regiones conservadas: un dominio amino
terminal de miristilación; una región “MH2”, coincidente con el sitio de splicing
del ARN; y el “dominio efector” o ED, donde se concentran la mayor parte de las
interacciones conocidas.
En este trabajo presentamos un estudio comparativo de las secuencias genómicas y
proteicas de un amplio grupo de vertebrados, así como un análisis de posibles
secuencias regulatorias. En la región upstream de los genes que codifican para
MARCKS encontramos la ausencia de cajas TATA y la presencia de cajas CCAAT,
mientras que en los de MRP encontramos ambas secuencias consenso. En el pez
cebra existen dos genes para cada una de estas proteínas, que presentaron algunas
divergencias tanto en las secuencias reguladoras como en el número de intrones.
Las regiones 3‟-UTR de la mayor parte de los mensajeros presentaron algún tipo de
señales ARE de degradación, aunque con una gran variación en cantidad y
localización. Además, analizamos las secuencias proteicas, realizando
alineamientos de las conocidas hasta el momento y encontrando una enorme
divergencia evolutiva en todas las regiones, excluyendo los tres dominios
conservados. Finalmente, utilizamos varios predictores de desorden en secuencias
proteicas (como FoldIndex, DisEMBL y JUFO) para demostrar que en todas las
proteínas predomina la falta de estructura secundaria.
57
P45) ANALISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA DE POBLACIONES DE
HUEMUL Hippocamelus bisulcus.
GREGORINI E.1, REPETTO L1., VILA A2., & GONZÁLEZ S1.
1
Genética de la Conservación – IIBCE-U. A. Facultad de Ciencias, Av. Italia 3318
Montevideo 11.600 Uruguay
2
Wildlife Conservation Society (WCS) - Jauretche 4763, (8400) Bariloche, Río
Negro, Argentina
El Huemul (Hippocamelus bisulcus, Molina, 1782) es un cérvido endémico de
Argentina y Chile, que habita los bosques andino-patagónicos. La especie ha
sufrido una importante declinación poblacional y ha sido declarada en peligro de
extinción. Para analizar la viabilidad de las poblaciones de esta especie y estimar
el grado de flujo génico es fundamental caracterizarlas con marcadores
moleculares. El objetivo general de este trabajo es analizar la variabilidad
genética de ejemplares de H. bisulcus, utilizando como marcador molecular la
región D-loop del ADN mitocondrial. Se colectaron 41 muestras correspondientes a
tejidos y fecas en tres Parques Nacionales de la región patagónica de Argentina
(Los Alerces, Los Glaciares y Nahuel Huapi) y tres localidades de la Provincia de
Chubut. Los resultados obtenidos al comparar las secuencias génicas de la región
D-loop, evidencian un total de 6 haplotipos para los individuos estudiados. De las 7
secuencias analizadas se encontraron 3 haplotipos (1 del Parque Nacional Los
Glaciares, 1 de Los Alerces y 1 de Chubut). Además se incluyeron en el análisis los
haplotipos de la región de Chillán (Provincia de Ñuble, Chile) y Cochrane
(Provincia de Capitán Prat, Chile). Los resultados preliminares obtenidos con el
número limitado de ejemplares analizados, revelan una subestructuración
poblacional de las poblaciones de Chile y Argentina sugiriendo que no existiría
flujo génico entre ellas.
58
P46) DETECCIÓN DE MUTACIONES ASHKENAZI EN LOS GENES BRCA1 Y
BRCA2 MEDIANTE SECUENCIACIÓN DIRECTA.
GROTIUZ, G.1, SARUTE, N.1, LENS, D.1 Y DELGADO, L.2
1. Laboratorio de Biología Molecular y Citometría de Flujo. Departamento Básico
de Medicina. Facultad de Medicina. UDELAR.
2. Servicio de Oncología Clínica. Hospital de Clínicas. Facultad de Medicina.
UDELAR.
En Uruguay el cáncer de mama es la enfermedad neoplásica de mayor incidencia y
con mayor mortalidad en la mujer. 5-10 % de los casos se desarrollan en el
contexto de una predisposición hereditaria de tipo monogénica y transmisión
autosómica dominante debido a mutaciones de línea germinal en los genes BRCA1
y BRCA2. El riesgo acumulado de desarrollar cáncer de mama/ovario en las
portadoras es muy superior al de la población general, variando entre el 40 y el
85% para cáncer de mama.
BRCA1 y BRCA2 son proteínas nucleares que interactúan con un gran número de
proteínas reguladoras y están involucradas en múltiples procesos celulares
fundamentales, en especial los relacionados con la detección y reparación de
mutaciones.
La detección de mutaciones en estos genes es muy laboriosa y costosa debido a su
gran tamaño y porque se han descrito cientos de mutaciones en cada uno.
Los individuos que tienen un origen judío Ashkenazi tienen mayor riesgo de ser
portadores de mutaciones de línea germinal en BRCA1/2. Se han reportado 3
mutaciones fundadoras que explican la mayoría de los cánceres de mama
desarrollados en un contexto hereditario en este grupo étnico. Dos de estas han
sido detectadas en BRCA1 (185delAG y 5382insC) y una en BRCA2 (6174delT). El
2.5% de las mujeres Ashkenazi son portadoras de una de estas mutaciones.
Este estudio incluyó 8 mujeres de origen judío Ashkenazi con historia familiar de
cáncer de mama/ovario. Se realizó extracción de ADN a partir de linfocitos
obtenidos de sangre periférica. Los exones que pueden contener las mutaciones
heterocigotas 185delAG y 5382insC en BRCA1 y 6174delT en BRCA2 fueron
amplificados por PCR y analizados por secuenciación directa encontrándose una
paciente portadora de la mutación heterocigota 185delAG en BRCA1.
El análisis genético de la predisposición hereditaria al cáncer de mama/ovario en
este grupo étnico es mucho más factible debido al restringido número de
mutaciones encontradas y es mucho más rápido y económico que la búsqueda
exhaustiva en los genes completos.
59
P47) USO DE CODONES EN ENTEROBACTERIACEAE: HACIA
DETECCIÓN DE LOS TRIPLETES ÓPTIMOS ANCESTRALES
LA
BARAIBAR JD, IRIARTE A, ROMERO H, MUSTO H
Laboratorio de Organización y Evolución del Genoma. Depto. de Biología Celular y
Molecular; Facultad de Ciencias.
Una aspecto a destacar en algunas especies procariotas es el sesgo en el uso de
determinados codones, particularmente en genes de alta expresión (GAE). Debido
a que estos tripletes se correlacionan con el ARNt isoaceptor más abundante, el
uso de codones se ha propuesto como la consecuencia de la selección natural
actuando a nivel de la traducción. Estudios comparativos demostraron que los
codones preferidos no son siempre los mismos para diferentes grupos de especies.
La disponibilidad de genomas completamente secuenciados nos brinda la
oportunidad de “rastrear” la influencia de la selección natural en la historia de
determinados grupos y mapear la aparición y desaparición de los tripletes óptimos
en el linaje. Este trabajo intenta desarrollar esta aproximación a partir de: 1)
reconstrucción filogenética en base a genes ortólogos de la familia
Enterobacteriaceae; 2) reconstrucción de codones óptimos en nodos ancestrales.
Se utilizaron métodos bayesianos y máxima parsimonia. Establecimos tres
condiciones para determinar un efecto significativo de la selección sobre la
traducción: (i) las diferencias de expresión en el genoma deben ser el principal
factor determinante de la variabilidad observada a partir del análisis de
correspondencias; (ii) codones óptimos “universales” deben ser significativamente
más abundantes en los GAE que en el resto de los genes; (iii) debe existir una
correlación negativa entre expresión y divergencia sinónima. De acuerdo a
nuestros resultados, la selección natural actuando a nivel de la traducción es al
menos una de las fuerzas evolutivas determinantes del uso de codones en
Enterobacteriaceae. Proponemos 16 codones óptimos en el ancestro común del
grupo: GCU, CGU, AAC, GAC, GGU, GAA, CAC, AUC, CUG, AAA, UUC, UCC, UCU,
ACU, UAC, GUU. El apareamiento perfecto de la mayoría de los codones mayores
con su ARNt isoaceptor (11 de 16), ha sido también explicado como producto del
efecto de la selección natural.
60
P48) IDENTIFICACIÓN Y ORIGEN DE LAS MUTACIONES DE BETA
TALASEMIAS Y HBS EN LA POBLACIÓN URUGUAYA.
DA LUZ J, AVILA A, SANS M.
Departamento de Genética, Facultad de Medicina, UdelaR
La anemia falciforme y las beta-talasemias son anemias producidas por mutaciones
en el gen de la beta globina, las cuales presentan elevadas frecuencias en las
poblaciones europeas y africanas que formaron la actual población del Uruguay.
Actualmente se conocen más de 200 mutaciones distintas de beta talasemias, con
distintas consecuencias clínicas y distintos orígenes geográficos permitiendo inferir
el origen de estas mutaciones en el Uruguay. Aunque la anemia falciforme es
producida por una única mutación, esta se observa principalmente asociada a
cinco haplotipos distintos denominados: Bantú, Benín, Senegal, Camerún y ÁrabeIndio los cuales indican el lugar geográfico donde se encontraron estos
cromosomas y nos permite inferir el origen de estos en nuestra población. En este
trabajo determinamos las mutaciones de beta talasemias en 48 pacientes no
relacionados que presentaban un diagnóstico clínico de beta talasemias,
confirmamos molecularmente la presencia de la mutación de la anemia falciforme
(HbS) en 30 individuos y determinamos por PCR-RFLP los polimorfismos que
determinan los haplotipos asociados a la HbS y a las beta talasemias. Aunque
0
identificamos siete mutaciones distintas de betaCodón 39 (C-T) y
+
IVS-I-110 (G-A) son el 81% del total, 66,7% y 14,5% respectivamente. La
presencia de estas dos mutaciones muestra un origen principalmente europeo
mediterráneo de las beta talasemias en nuestra población, aunque la presencia a
baja frecuencia de otras mutaciones puede indicar un aporte de mutaciones del
Norte de África y Cercano Oriente. El 66,7% de los cromosomas con HbS presentan
el haplotipo Bantú, 23,3% el haplotipo Benín y el 10%, haplotipos atípicos
indicando un origen principalmente centro-africano de la mutación de HbS. La
elevada frecuencia de haplotipos atípicos, no observado en otras poblaciones, abre
perspectivas de investigar los efectos combinados de mezcla racial y
recombinación en la generación de estos nuevos haplotipos.
61
P49) ESTUDIO DE ASOCIACIÓN ENTRE ANCESTRALIDAD Y MELANOMA:
MC1R COMO POSIBLE GEN CANDIDATO
HOCHMANN J1, CAPPETTA M1, PEREZ J, NICOLETTI S 2, LARRE BORGES A 2, ROCHE
L1, DELGADO L3 MARTÍNEZ M 2 BERTONI B1.
1
Departamento de Genética, Facultad de Medicina- UDELAR, MontevideoUruguay. 2 Cátedra de Dermatología; Hospital de Clínicas, Montevideo-Uruguay.
3
Departamento Básico de Medicina, Hospital de Clínicas, Montevideo-Uruguay.
El melanoma es una neoplasia potencialmente letal con una incidencia importante
en las poblaciones europeas siendo considerablemente menor en poblaciones
africanas o amerindias. La población uruguaya tiene una estructura genética
trihíbrida, con aporte europeo, africano y amerindio. Esta característica la
convierte en un blanco adecuado para aplicar metodologías que se basan en
detectar genes de susceptibilidad tomando ventaja del desequilibrio de ligamiento
generado por el mestizaje.
En este trabajo se plantea analizar la asociación de regiones cromosómicas con la
presencia de melanoma esporádico a partir de la detección de un exceso de alelos
de una población ancestral en la muestra de individuos afectados. Por otro lado,
se estudian los factores ambientales involucrados en esta patología y el fototipo
de los individuos afectados.
Se estudió una serie de marcadores informativos de ancestralidad (MIAs)
autosómicos en una muestra de 65 pacientes con melanoma esporádico y se
comparó los resultados con una muestra control de 68 individuos de similares
características de edad y lugar de nacimiento.
De los 5 MIAs analizados, PV92 mostró una asociación significativa con la presencia
de melanoma esporádico. Este marcador se ubica en la región cromosómica
16q23.3, adyacente al locus donde se encuentra el gen MC1R (16q24.3), descripto
como un gen candidato para el desarrollo de la enfermedad. Para confirmar los
resultados, se analizaron 3 posibles mutaciones del gen MC1R, asociadas a
melanoma esporádico, pero ninguna de las tres mostró una asociación con dicha
enfermedad.
Estos resultados indican que la estrategia utilizada, estudios de asociación por
desequilibrio de ligamiento generado por mestizaje, es aplicable a la población
uruguaya.
62
P50) CAENORHABDITIS ELEGANS COMO MODELO DE ESTUDIO DE LA
INCORPORACIÓN DE SELENIO
OTERO L1, MIRANDA-VIZUETE A2, SALINAS G1
1
Cátedra de Inmunología, Facultad de Química, Universidad de la República,
Uruguay
2
Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, Universidad Pablo de Olavide, España
La incorporación de selenocisteína (Sec) a la síntesis ribosomal de proteínas ocurre
por un mecanismo no canónico, donde algunos aspectos de la misma aún no han
sido completamente elucidados en eucariotas. Procuramos entender estos
aspectos utilizando Ceanorhabditis elegans como modelo, ya que dispone de la
maquinaria de incorporación de Sec para la expresión de una única selenoproteína
(tiorredoxina reductasa, TRXR-1) y, a diferencia de lo que ocurre en otros
organismos modelo, los mutantes en la incorporación de Sec son viables. Para
abordar este problema hemos generado una plataforma de una serie de estirpes
mutantes knock out en los genes de interés: selenofosfato sintasa como control,
SecP43 involucrado en el tráfico de complejos supramoleculares y/o en la
metilación de ARNtSec, un gen presuntamente asociado a la incorporación de Sec
de función desconocida (R13A5.9) y en la proteína de unión al elemento SECIS
(SBP2), que permite reconocer el ARNm de selenoproteínas. Mediante sucesivos
retrocruces de la cepa mutante de interés con la cepa silvestre de referencia
Bristol-N2, hemos curado estirpes knock out en estos genes. Las estirpes knock out
en trxr-1 interferidas con ARN que codifica para la glutatión reductasa presentan
fenotipo de arresto larvario. Al realizar este ensayo de ARNi sobre las estirpes
curadas se reprodujo el fenotipo esperado. Por otra parte, encontramos que la
SBP2 anotada en el genoma de C. elegans es significativamente más corta que la
descrita para otros eucariotas; por lo que amplificamos el ARNm full length de la
SBP2 por RT-PCR, confimando la anotacion predicha teóricamente. En suma,
nuestros resultados preliminares sugieren que la R13A5.9 estaría implicada en la
incorporación de Sec, y que la SBP2 no sólo sería funcional sino que, en parte, el
mecanismo por el cual C. elegans incorpora Sec sería diferente al ya descrito.
63
P51) USO DE CODONES EN EL CFTR
ESTRUCTURA PROTEICA
Y SU RELACIÓN CON LA
PIZZO L. *, IRIARTE A. §†, MARÍN M .
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias.
* Instituto de Genética Médica, Hospital Italiano
§
Laboratorio de Evolución y Laboratorio de Organización y Evolución del Genoma.
Facultad de Ciencias.
†
Área Genética. Depto. de Genética y Mejora Animal. Facultad de Veterinaria.
Una mutación sinónima alterará la secuencia nucleotídica pero no la secuencia de
aminoácidos. Sin embargo los tripletes sinónimos no son utilizados con igual
frecuencia: dependiendo del organismo, algunos codones son más utilizados que
otros. Este sesgo en el uso de codones se encuentra determinado por un balance
entre la selección natural, la deriva genética y el sesgo mutacional. Ciertas
sustituciones sinónimas pueden cambiar la especificidad de sustrato de una
enzima, la virulencia viral e incluso niveles de expresión proteica. Estos cambios
pueden asociarse con alteraciones en distintos eventos: la presencia de estructuras
secundarias, interacción con proteínas o la velocidad y fidelidad de la traducción
local.
Con el propósito de comprender el rol de codones poco frecuentes en secuencias
codificantes, se analizó el uso de codones en la proteína Cystic Fibrosis
Transmembrane Conductance Regulator (CFTR). Ésta tiene función de canal de
cloro, pertenece a la familia de transportadores ABC y es expresada en la
membrana apical de células epiteliales. Se caracteriza por ser una proteína multidominio con cinco dominios: dos de unión a nucleótido (NBD), dos transmembrana
(MSD) y uno regulador (R). Estudios del plegamiento de CFTR indican que éste sería
predominantemente co-traduccional, y sólo interacciones entre dominios
transmembrana se presentarían post-traduccionalmente.
El análisis de la conservación de codones raros entre el CFTR de distintos
mamíferos placentados, definidos a partir de la base de datos KazUSA, identificó
un enriquecimiento en codones raros en regiones corriente abajo de los motivos
aminoacídicos Walker A (NBD2) y la secuencia “signature” (NBD1), al igual que en
los bucles intracelulares (ICL). Se propone que estos agrupamientos pueden tener
una potencial implicancia funcional en estas regiones en donde una velocidad
lenta de traducción resultaría fundamental para la correcta inserción en la
membrana y el adecuado plegamiento de los motivos, ambos eventos
imprescindibles para el funcionamiento del canal.
64
P52) DETERMINACIÓN DEL SEXO DE CANIDOS NEOTROPICALES
UTILIZANDO RT- PCR
LETICIA REPETTO1, SUSANA GONZÁLEZ 1, & JESÚS E. MALDONADO 2
1
Genética de la Conservación-IIBCE U. A. Facultad de Ciencias, Av. Italia 3318
Montevideo-Uruguay.
2
Center for Conservation and Evolutionary Genetics, National Zoological Park/,
Smithsonian Institution. 3001 Connecticut Ave. NW., Washington, DC 20008 USA
Los marcadores moleculares son de gran utilidad para aplicar en la identificación
taxonómica, individual y diagnóstico del sexo permitiendo estimar parámetros
demográficos. El objetivo de este trabajo fue implementar un protocolo por RTPCR para sexaje molecular de cánidos neotropicales, analizando los perfiles de las
curvas de “melting”. Los primers empleados fueron ZFX-ZFY que amplifican un
fragmento de 195pb que se encuentra ubicado en un gen que codifica para una
proteína con dedos de zinc en el cromosoma X e Y. Para poder discriminar entre
machos y hembras, posteriormente se realiza una digestión con la enzima Taq I
que contiene en el gen ZFY un sitio de digestión en los machos que permite
visualizar en un gel de agarosa al 3% dos bandas una de 195 pb (ZFX) y otra de 152
pb (ZFY). Los mismos primers fueron empleados utilizando RT-PCR en el canal de
“High Resolution Melting”, empleando un termociclador Corbett 2000™, utilizando
en la reacción el fluorocromo Syto 9. Se sexaron muestras a partir de ADN
extraído de de tejidos y fecas de 23 individuos de las especies: 8 de zorro gris
(Pseudalopex gymnocercus), 6 de zorro de monte (Cerdocyon thous) y 7 de Aguara
guazú (Chrysocyon brachyurus) y 2 del perro doméstico (Canis familiaris). Esta
técnica permitió discriminar amplicones polimórficos teniendo un nivel de
detección de una mutación. Se analizaron los resultados a partir las curvas de
“melting” donde la presencia de un pico se asocia a la hembra y dos picos al
macho. El sexaje molecular empleando RT-PCR demostró ser eficiente, rápido,
tener mayor sensibilidad a bajas concentraciones de ADN molde, así como la
disminución de probabilidades de contaminación y la realización del diagnóstico en
un solo paso de amplificación, ahorrándose la digestión del amplicón y la
verificación por electroforesis.
65
P53) IDENTIFICACIÓN MEDIANTE MARCADORES MOLECULARES DE LA
ENFERMEDAD RENAL POLIQUÍSTICA FELINA (PKD)
MARTÍNEZ M1, LLAMBÍ S1, IRIARTE W1, ARTIGAS R1, MONTENEGRO M1, NICOLINI P2
Laboratorio Área Genética, Facultad de Veterinaria, UdelaR 1. Laboratorio de
Técnicas Nucleares, Facultad de Veterinaria, UdelaR2. Lasplaces 1550.
La enfermedad renal poliquística es una de las principales patologías hereditarias
que afectan a varias especies incluyendo al hombre, siendo reportado a nivel
mundial una alta prevalencia en felinos domésticos, principalmente de raza Persa
y relacionados. Un SNP (C>A, posición 3284, exón 29) del gen PKD1 produce una
proteína defectuosa involucrada en la formación de quistes renales entre otros.
Las herramientas para su identificación a nivel molecular han sido la técnica de
PCR/RFLP y más recientemente el Real time PCR utilizando sondas fluorescentes
(Taqman, FRET).
El presente estudio tiene como objetivos: amplificar el
fragmento de interés de 559 bp (exón 29, gen PKD1) por Real time PCR, analizar
las curvas de amplificación obtenidas y determinar la temperatura de melting (Tm)
del producto, con la finalidad de realizar a futuro el genotipado por Real time
PCR-HRM (High Resolution Melt). A partir de tres muestras (sangre entera y tejido
fetal) de felinos raza Persa y Siamés (uno) se realizó extracción de ADN mediante
la técnica de salting out ó utilización de kit comercial Axygen. La amplificación se
realizó con kit comercial (Quantimix easy SYG- Biotools) que utiliza SYBR Green
como agente intercalante fluorescente, en un equipo de Real time PCR (Rotor
Gene 6000, Corbett) utilizando el programa Three steps with melt. El amplicón fue
chequeado en gel de agarosa al 1.5% y digerido con la enzima de restricción SchI
evaluándose los resultados en minigeles de poliacrilamida al 6%. Una de las
muestras analizadas presentó tres fragmentos de restricción (559, 316 y 243 bp)
correspondientes al estadio portador de la enfermedad. La Tm obtenida en el
análisis de las curvas de amplificación resultó elevada (~ 99ºC),por lo que para
poder efectuar posteriormente un análisis HRM fue necesario rediseñar primers
que flanqueen un región más reducida y que generen un amplicón mas pequeño
con una Tm menor.
66
P54) RIDGEs, LA CROMATINA HIPERACETILADA, EL DAÑO GENÉTICO
INDUCIDO POR RADIACIONES Y LOS GENES DESREGULADOS EN
TUMORES COLOCALIZAN EN REGIONES ESPECÍFICAS DE CROMOSOMAS
HUMANOS
FOLLE GA, LIDDLE P*, LAFON-HUGHES L*, DI TOMASO MV.
Departamento de Genética, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente
Estable (IIBCE).
El análisis del transcriptoma humano ha revelado la existencia de regiones
genómicas de elevada expresión génica (RIDGEs) y regiones de escasa actividad
transcripcional (AntiRIDGEs). Hemos topografiado en idiogramas (850 bandas) y
transcriptomas de cromosomas humanos: a) regiones de histona H4 hiperacetilada
o H4+a 1; b) fracturas inducidas por radiaciones ionizantes 2; c) genes cuya
expresión aumenta o disminuye (10x o más) en tumores de diferentes tejidos; d)
genes que sólo se expresan en tumores pero no en células normales del mismo
tejido 3; e) sitios de inserción de constructos unidos a GFP con alto nivel de
expresión 4. Hemos observado una clara colocalización de regiones H4+a, lesiones
producidas por radiaciones ionizantes, genes desregulados en tumores e inserción
de constructos. Este fenómeno es evidente tanto en cromosomas con varios y/o
extensos RIDGEs (7, 12, 16, 17, 19) como en aquellos que poseen escasos (1-2) o
pequeños RIDGEs (9, 11, 14, 21). A fin de descartar la influencia de la riqueza
génica en las regiones que presentan co-localización de RIDGEs y genes
desregulados, seleccionamos las sub-bandas cromosómicas que concentran genes
desregulados en forma independiente a la densidad génica 3. Las 11 sub-bandas
que concentran genes sobrexpresados mapean en RIDGEs. De las 29 sub-bandas
que concentran genes subexpresados, 20 corresponden a RIDGEs. Estos resultados
sugieren una estrecha relación entre expresión génica, daño genético y
desregulación génica en tumores apoyando nuestra hipótesis 5 de una mayor
sensibilidad de la cromatina activa (RIDGEs, H4+a) al daño genético inducido,
inestabilidad genómica y otros fenómenos asociados a la transformación celular.
1
2
3
4
5
Jeppesen P (1997) Bioessays 19:67-74
Barrios L et al. (1989) Cancer Genet Cytogenet 41:61-70
Aouacheria A et al. (2006) BMC Genomics 7:94-104
Gierman H et al. (2007) Genome Research 17:1286-1295
Folle GA (2008) Mutat Res Rev 658:172-183
* Ambos co-autores contribuyeron igualmente en esta investigación
67
P55) ESTUDIO TOXICOLÓGICO EN APIS MELLIFERA EXPUESTAS A UN
INSECTICIDA ORGANOCLORADO, THIONEX 35
OJEDA, P.1,2; VILLAR, S.2; CARRASCO-LETELIER, L.1
1 Programa de Producción y Sustentabilidad Ambiental. Estación Experimental
“Alberto Boerger”, INIA La Estanzuela, Colonia, Uruguay.
2 Sección Genética, Facultad de Ciencias. Universidad de la República,
En la agricultura moderna, los plaguicidas sintéticos continúan siendo la principal
línea de defensa en la mayoría de los programas de manejo de plagas. El objetivo
expreso de los insecticidas es “matar a las plagas”, sin embargo, estos pueden
tener impactos letales o subletales sobre organismos no blancos y reducir y/o
contaminar las fuentes de alimentos para organismos en niveles tróficos superiores
(Devine & Furlong, 2007).
Los compuestos organoclorados son el grupo de productos fitosanitarios más
exitosos, rentables y de mayor comercialización en el mundo (Kaushik & Kaushik,
2007).
El objetivo del presente estudio fue evaluar la toxicidad aguda por contacto (LD 50)
del insecticida organoclorado Thionex 35 (p.a. Endosulfán) para la subespecie de
abejas presente en la región litoral oeste del país, de acuerdo con la guía
OEPP/EPPO Nº170 (2001). Las dosis tópicas administradas fueron de 1.75, 0.88,
0.44, 0.22 y 0.11µg/abeja. El valor de DL50 determinado para Thionex 35 fue de
1.51µg/abeja a las 48 horas. Este valor es 5 veces menor al reportado por Atkins et
al (1981), lo que sugeriría una mayor sensibilidad a esta formulación de Endosulfán
de la raza de A. mellifera evaluada. Para analizar el impacto mutagénico a dosis
subletales de éste insecticida, se utilizó el ensayo de electroforesis en células
individuales. La evaluación del daño genético mediante éste ensayo fue realizado
sobre células extraídas de la glándula hipofaríngea. Los resultados mostraron una
correlación positiva entre el daño genético provocado por el Endosulfán y los
niveles de exposición por contacto de los individuos, para los parámetros: tail
moment, % de ADN dañado y migración del ADN dañando. Se marca así, el primer
antecedente donde se analiza genotoxicidad en A. mellifera, utilizando una
herramienta molecular para establecer una correlación entre los análisis de
toxicidad aguda y daño genético.
68
NEUROCIENCIA Y NEUROBIOLOGÍA
P56-P70
P56) DAÑO OXIDATIVO EN MITOCONDRIAS DE MÚSCULO
ESQUELÉTICO EN MODELOS ANIMALES DE ESCLEROSIS LATERAL
AMIOTRÓFICA.
AICARDO, A.&, CASSINA, P.
CASSINA, A.&.
&
, BARBEITO, L.¶£, MURPHY M.P.§, RADI R.& AND
&
Facultad de Medicina, Universidad de la Republica, Montevideo, Uruguay;
Instituto Clemente Estable, Montevideo, Uruguay; £Institut Pasteur, Montevideo,
Uruguay, §MRC Dunn Human Nutrition Unit, Hills Road, Cambridge, UK. Email:
[email protected]
¶
La disfunción mitocondrial y el estrés oxidativo contribuyen a la degeneración de
la motoneurona en la esclerosis lateral amiotrófica. Las neuronas motoras inervan
el musculo esquelético y mientras que, alteraciones en la actividad mitocondrial
en el sistema nervioso central han sido descritas, los datos acerca de la disfunción
mitocondrial en el músculo esquelético son escasos y controversiales.
Para evaluar el daño oxidativo y la disfunción mitocondrial en musculo esquelético
de ratas SOD G93A medimos la respiración mitocondrial tanto en mitocondrias
aisladas como en biopsias de músculo esquelético obtenidas de ratas transgénicas
en estadíos tempranos de la enfermedad. También estudiamos por western blot la
presencia de marcadores de estrés oxidativo (4-hydroxynonenal) en mitocondrias
aisladas de músculo esquelético y médula de ratas.
Encontramos que la respiración mitocondrial se vio reducida en músculo
esquelético de ratas SOD G93A
comparados con ratas no transgénicas. El
tratamiento con un antioxidante dirigido a la mitocondria, MitoQ (ubiquinona
unido covalentemente a un catión trifenilfosfonio), 6 mg/kg i/p, 24 hrs. previas a
la eutanasia, restableció la respiración mitocondrial.
Nuestros datos muestran que la mitocondria de músculo esqulético se compromete
en estadíos tempranos de la enfermedad, y que esta disfunción puede ser causada
por el daño oxidativo encontrado.
69
P57) PROLIFERACIÓN DE ASTROCITOS AISLADOS DE MÉDULA ESPINAL
DE RATAS ADULTAS EN UN MODELO DE ELA
CRAGNOLINI A.B. 1, DIAZ AMARILLA P. 2, BARBEITO L.1,2
1. Institut Pasteur de Montevideo.
2. Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable.
Durante la injuria del sistema nervioso o procesos neurodegenerativos, los
astrocitos sufren cambios morfológicos y funcionales denominados astrogliosis,
proceso que también incluye proliferación. Existen pocas evidencias acerca del rol
de la proliferación de los astrocitos en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA),
enfermedad caracterizada por la degeneración de motoneuronas. En modelos
murinos de ELA familiar que expresan mutaciones en la enzima superoxido
dismutasa Cu/Zn (SOD1) se constata daño oxidativo en neuronas y astrocitos. La
mutación SOD1G93A no causa la pérdida de actividad de la enzima, sino una
alteración de la química redox, incluyendo activación de la enzima NADPH oxidasa
(NOX) y aumento de producción de H2O2. En este trabajo evaluamos el perfil
proliferativo de cultivos de astrocitos aislados de médula espinal de ratas adultas
SOD1G93A. Por tener características diferentes de los astrocitos de animales no
transgénicos se les denomina células AbA (de astrocito aberrante). Estas células
mostraron una mayor tasa de proliferación comparada con astrocitos de neonatos,
tanto transgénicos como no transgénicos. La producción de H 2O2 por las células
AbA fue más elevada que astrocitos no transgénicos. Además, los niveles basales
de p-Akt fueron elevados. Exploramos distintos mediadores y vías de señalización
que podrían estar involucrados en la proliferación de estas células, tales como
ATP, NGF, NO, NOX y la vía de las kinasas MEK y Akt. El tratamiento con apocinina,
inhibidor de NOX, así como la inhibición de MEK, causaron disminución de la
proliferación de astrocitos AbA, sin causar muerte celular. Estos datos preliminares
sugieren que el fenotipo proliferativo de astrocitos AbA se asociaría a aumento de
producción de H2O2 y posterior aumento de p-Akt.
70
P58) EVALUACION IN VITRO DEL EFECTO NEUROPROTECTOR DE LA
APOCININA
ISASI E, DIAZ-AMARILLA PJ, BARBEITO L, OLIVERA-BRAVO S.
Departamento de Neurobiología Celular y Molecular (NBCM), Instituto Clemente
Estable (IIBCE), Montevideo, Uruguay.
La capacidad neuroprotectora de la apocinina (4-hidroxi-3-metoxiacetofenona) no
está confirmada. Se han reportado efectos beneficiosos en modelos de Esclerosis
Lateral Amiotrófica (ELA) y de Parkinson1 pero aumentos de estrés oxidativo in
vitro2. La acción mejor descripta de la apocinina es la inhibición del complejo
NADPH oxidasa, considerado el principal productor celular de especies reactivas
de oxígeno al catalizar la conversión de oxígeno en superóxido. NADPH oxidasa se
potencia en astrocitos reactivos3 por lo que su inhibición en astrocitos podría ser
neuroprotectora. Para validar esta hipótesis estamos caracterizando la acción de
la apocinina sobre astrocitos para posteriormente evaluar su efecto neuroprotector
en diferentes modelos de neurodegeneración. Se trataron cultivos primarios de
astrocitos corticales y estriatales de ratas normales o transgénicas del modelo de
ELA SOD1G93A con apocinina (0-3mM, 48h) y posteriormente con ácido glutárico 5
mM, LPS 5 µg/ml y bromodeoxiuridina (BrdU, 1µg/ml). 24h después, se estudió
viabilidad por conteo directo de núcleos marcados con DAPI, tasa de proliferación
evaluando células BrdU+:células totales y cambios morfológicos mediante
contraste de fase e inmunocitoquímica 4. Nuestros resultados muestran que,
respecto de los controles obtenidos y sembrados simultáneamente, la apocinina en
concentraciones menores a 0.5mM no parece afectar la viabilidad ni la tasa de
proliferación; concentraciones mayores a 1.25mM disminuyen la viabilidad hasta
un 30% y la tasa de proliferación al 50%. A concentraciones mayores la mortalidad
no aumenta significativamente, mientras que la tasa de proliferación desciende al
10%. Por tanto, la apocinina afecta la viabilidad y la proliferación de astrocitos en
condiciones normales e injuriantes; lo que podría repercutir en la sobrevida
neuronal.
Financiación: PDT 76/23, PEDECIBA Biología
1
Anantharam et al., 2007. Neurotoxicol 28(5):988-97
Riganti et al., 2006. Toxicol Appl Pharmacol 212(3):179-87
3
Abramov et al., 2005. J Neurosci. (40):9176-84
4
Olivera et al., 2008. Neurobiol Dis. 32(3):528-34
2
71
P59) EL DICLOROACETATO RESTABLECE LA FUNCIÓN MITOCONDRIAL
EN MODELOS DE ESCLEROSIS LATERAL AMIOTRÓFICA
MIQUEL, E.(1), CASSINA, A.(2), MARTÍNEZ-PALMA, L.(1), GANDELMAN, M.(1), BOLATTO,
C.(1), RADI, R.(2), BARBEITO, L.(3), CASSINA, P.(1)
(1)
Depto. de Histología y (2) Depto. de Bioquímica, Facultad de Medicina, UdelaR;
Institut Pasteur de Montevideo.
(3)
La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa fatal
que afecta a las motoneuronas para la que no existen terapias efectivas. Los
hallazgos anatomopatológicos incluyen pérdida de motoneuronas y gliosis en la
médula espinal. Estudios en modelos animales portadores de la enzima SOD1
humana con la mutación G93A (SOD1G93A) han mostrado que los astrocitos SOD1G93A
presentan una actividad mitocondrial disminuida asociada a menor capacidad
trófica para motoneuronas comparados a los astrocitos no transgénicos. El
Dicloroacetato (DCA) es un compuesto que inhibe la enzima piruvato
deshidrogenasa kinasa (PDK), desviando el piruvato hacia la oxidación final de la
glucosa en la mitocondria, y que ha sido utilizado para el tratamiento de
mitocondriopatías hereditarias humanas. En este trabajo hemos investigado los
efectos del DCA en modelos de ELA. En cultivo, el DCA restableció la función
mitocondrial en astrocitos SODG93A, disminuyó su proliferación y redujo su
toxicidad hacia las motoneuronas. La administración sistémica de DCA en el agua
de bebida a ratones SODG93A provocó un retraso en el inicio de síntomas y aumentó
la supervivencia de los animales. En la médula espinal de los ratones transgénicos
tratados con DCA se observó un mayor número de motoneuronas y una disminución
de la gliosis en comparación con los animales tratados con vehículo. Asimismo, el
tratamiento con DCA provocó un restablecimiento del área de las placas
neuromusculares en los ratones SODG93A. En conjunto, estos resultados sugieren
que la disfunción mitocondrial cumple un rol en la ELA, y permiten considerar a la
mitocondria como posible blanco para futuros tratamientos.
72
P60) ACTIVATION OF cAMP-RESPONSIVE ELEMENT BINDING PROTEIN
IS MODULATED IN THE DEVELOPING RAT SUPERIOR COLLICULUS
OLIVEIRA, C. S., DE CORDOVA F.M., LEAL, R. B., ROSSI, F. M.*
Universidade Federal de Santa Catarina, Departamento de Bioquímica,
Florianópolis, SC, Brasil and *Institut Pasteur de Montevideo, Uruguay.
Objectives: The superior colliculus (SC) is an excellent experimental model for
studying plastic processes in the CNS. Recently we have shown that ERK 1/2 and
p38MAPK kinases are activated in the SC in temporal correlation with the period of
retino-collicular plasticity (1). Long-lasting changes in neuronal circuitry require
the pattern of kinase activation to be translated into a pattern of gene expression,
probably through transcription factors activation. A good candidate is the cAMPresponsive element binding protein (CREB), whose activation depends upon ERK1/2
(2). Here, to further characterize the molecular framework required for SC
developmental plasticity, we analyze the expression of CREB during development
and following manipulation of the visual input.
Methods: Antibodies against phospho-CREB, total-CREB and beta-actin (Cell
Signaling, 1:1000) were used for western blot analysis. SC were obtained from
Long-Evans hooded rats at different postnatal ages (P0-P45). Visual deprivation
was performed at P3 or P21, and animals sacrificed one week later.
Results: Our results show that the ratio between the phosphorylated and the total
form of CREB (activation level index) increases in the SC between P4 and P9 (60%
vs. P0, n=4, p<0.05) in temporal correlation with the critical period for retinocollicular plasticity. To test the involvement of CREB on plastic processes we used
the monocular deprivation protocol, known to induce strong plasticity in the young
but not in the adult SC. Preliminary results indicate that CREB is modulated by
deprivation in the young animal but not in the adult.
Conclusions: These results show that CREB is highly regulated during development
and following plasticity-inducing manipulation. Altogether, suggest that the
ERK1/2-CREB signaling pathway may play a fundamental role in directing the
refinement of retino-collicular projections.
References: (1) Oliveira et al., Int.J.Devl.Neurosci. 26: 355, 2008. (2) Cancedda et
al., J.Neurosci. 23: 7012, 2003.
Support: CNPq, FAPESC and FINEP (IBN-Net #01.06.0842-00).
73
P61) BASES MOLECULARES DE LA REGENERACIÓN DE LA MÉDULA
ESPINAL DE LA TORTUGA TRACHEMYS DORBIGNYI
G. GARCÍA-TEJEDOR1, G. LIBISCH2, O. TRUJILLO-CENÓZ1, R.E. RUSSO1, C.
ROBELLO2,3
Neurofisiología Celular y Molecular, Instituto de Investigaciones Biológicas
Clemente Estable1. Unidad de Biología Molecular, Instituto Pasteur Montevideo. 2
Depto. De Bioquímica, Facultad de Medicina3
La tortuga de agua Trachemys dorbignyi presenta la capacidad de reconectar la
médula espinal luego de una sección total. A diferencia de los mamíferos, no se
observa una cicatriz glial que impida el cruce de los axones. Ya a los veinte días
post lesión se distinguen axones cruzando la región lesionada sobre un
“andamiaje” de células BLBP+ (Brain Lipid Binding Protein)(Rehermann et al.,
2009). La comprensión de los mecanismos moleculares responsables de la
regeneración y su análisis funcional, podrían contribuir en un futuro al desarrollo
de terapias génicas para permitir la reconexión de la médula espinal en
mamíferos.
Nuestro grupo demostró (Russo et al., 2008) la existencia de clusters funcionales
de células BLBP+/PAX6+ con capacidad proliferativa acopladas entre sí mediante
conexina43 (Cx43). Posiblemente esta sea la fuente de las células BLBP+ halladas
en la zona de unión. La ausencia de cicatriz glial estaría debida al rol de estas
células BLBP+ que recapitularían la condición embrionaria. ¿Hay cambios en la
expresión de Cx43 luego de la lesión? El PAX6 es un factor de transcripción
regulador de la proliferación y del destino celular. ¿Qué ocurre con su expresión?
¿Aumenta la expresión de BLBP luego de la lesión?
Para responder estas preguntas, se diseñaron oligonucleótidos degenerados a
partir de regiones altamente conservadas de las proteínas de interés (BLBP,
HuC/D, Cx43, PAX6) así como de proteínas control (β-actina, Piruvato Quinasa y
Lactato Deshidrogenasa). Mediante PCR se amplificaron fragmentos que fueron
posteriormente clonados y secuenciados. En base a estas secuencias, se analizaron
los cambios de expresión utilizando PCR en tiempo real con oligonucleótidos
específicos, comparando la médula espinal de tortugas lesionadas a diferentes
tiempos post-lesión y la de tortugas control. Los cambios observados en los niveles
de expresión de estas proteínas sugieren que las mismas podrían tener un rol
esencial en este fenómeno de reconexión.
74
P62) EL ESTRÓGENO DISMINUYE LA CAPACIDAD NEURITOGÉNICA DEL
SUSTRATO UTERINO. PAPEL DE LA GEOMETRÍA DEL COLÁGENO.
MARTÍNEZ G., SILVEIRA P., BIANCHIMANO P., RICHERI A., BRAUER M.M.
Laboratorio de Biología Celular, IIBCE
Las moléculas de la matriz extracelular son esenciales en el guiado de los axones
hacia sus efectores definitivos y participan en los procesos de regeneración y
plasticidad neuronal del adulto. El método de criocultivo permite estudiar la
contribución del sustrato al crecimiento neurítico y consiste en cultivar explantos
neurales sobre cortes de tejidos a congelación. Utilizando como sustrato cortes de
útero de ratas castradas control y tratadas con estrógeno observamos que el
sustrato uterino contribuye a generar el patrón histotípico de inervación simpática
y que el estrógeno disminuye su capacidad de sustentar el crecimiento neurítico.
Utilizando microscopías óptica y electrónica analizamos los componentes del
sustrato uterino que son seguidos por las neuritas en el sistema de criocultivo y
valoramos los cambios morfológicos en la matriz extracelular uterina que pudieran
asociarse con su menor capacidad de sustentar el crecimiento neurítico en
respuesta al estrógeno. In vitro, las neuritas crecían asociadas a la superficie de
las células musculares lisas, siguiendo invariablemente la dirección de su eje
mayor y preferentemente asociadas a la matriz perimuscular de colágeno. In situ,
observamos que el estrógeno promueve una marcada reorganización de esta matriz
de colágeno. En las hembras castradas, el colágeno presentaba una organización
laxa y una orientación paralela al eje mayor de las células musculares. Luego del
tratamiento con estrógeno, el colágeno presentaba una organización más
compacta y una orientación mayormente perpendicular al eje mayor de las células
musculares. En vista de la marcada dependencia del crecimiento neurítico de las
características geométricas del sustrato, es posible que los cambios inducidos por
el estrógeno en la matriz de colágeno impacten negativamente sobre su capacidad
de sustentar el crecimiento neurítico. Financiado por FIRCA-NIH (EEUU).
75
P63) NEUROGÉNESIS POSTNATAL EN EL CEREBRO DE PECES DEL
GÉNERO Austrolebias
ROSILLO J.C.1, FERNÁNDEZ A.1,5 , CASANOVA G.2,3, OLIVERA S.4
1. Neuroanatomía Comparada, IIBCE; 2. Sección Biología Celular, Facultad de
Ciencias (FC); 3.Unidad de Microscopía Electrónica de Transmisión (MET), FC; 4
Neurobiología Celular y Molecular, IIBCE; 5. Unidad Asociada (FC) UDELAR
Montevideo URUGUAY
La neurogénesis postnatal ha sido demostrada en varios grupos de vertebrados,
incluyendo los peces teleósteos. En el cerebro de las Austrolebias, las zonas
proliferativas potencialmente neurogénicas están localizadas a lo largo de la línea
media del eje rostro-caudal. El objetivo de este trabajo fue: identificar, mapear y
cuantificar las principales regiones proliferativas en tres especies del género
Austrolebias: A. affinis, A reicherti y A.charrua. Ejemplares adultos de 8 meses de
edad recibieron una inyección única de 5´-Bromodeoxiuridina (BrdU) 100 mg/kg
ip.; veinticuatro horas después, se anestesiaron y perfundieron con
paraformaldehído 10%. Los cerebros disecados, se cortaron en serie en vibrátomo y
algunas zonas de interés se evaluaron por MET. Las células BrdU+ se detectaron
mediante inmunocitoquímica (anti-BrdU, 1:500) y se cuantificaron en tres
secciones de las cinco regiones proliferativas seleccionadas: bulbo olfatorio,
ventrículos
telencefálicos, tectum óptico, torus longitudinales y cerebelo.
Mediante la reconstrucción 3D, se constató la distribución similar de estas regiones
en las tres especies y el cerebelo mostró el mayor número de células BrdU+.
Respecto al número de células marcadas, estuvieron en concordancia con
variaciones anatómicas entre las especies. A affinis mostró algunas diferencias con
respecto a A. reicherti y A. charrua, cercanas filogenéticamente. Para identificar
la naturaleza neuronal o glial, de células proliferantes se usaron marcadores
(HuC/D) o (S-100/GFAP) respectivamente. El doble marcado HuC/D-BrdU constató
la presencia de nuevas neuronas en zonas ventriculares telencefálicas, tectum
óptico y cerebelo. La población glial es variada en forma y tamaño en las
diferentes zonas cerebrales. La glia radial está presente principalmente en el
tectum y en las franjas ventriculares. La glia particularmente proliferativa se
identificó con el marcador glial temprano S-100. La MET de las regiones
proliferativas evaluadas, mostró heterogeneidad celular con neuronas maduras,
células gliales y células con distinta morfología que podrían indicar diferentes
estadios de diferenciación.
76
P64)
GENOTIPO, FENOTIPO Y NEUROPATOLOGIA EN RATONES
TREMBLER-J.
PUIG N, CANCLINI L, CAL K, ROSSO G, DAMIÁN JP, RUIZ P, FERREIRA A, RODRIGUEZ
H, MESA R, PIZZAROSSA C, PENELA M, VÁZQUEZ C, SOTELO JR, KUN A.
(1)
Departamento de Proteínas y Acidos Nucleicos (DPAN), IIBCE.
DPAN-Unidad Asociada a la Sección Bioquímica de la Facultad de Ciencias,
UdelaR.
(3)
Departamento de Biología Molecular y Celular, Área Bioquímica, Facultad de
Veterinaria, UdelaR.UdelaR.
(4)
Departamento de Biología Molecular y Celular, Área Biofísica. Facultad de
Veterinaria, UdelaR.
(5)
Sección Fisiología y Nutrición, Instituto de Biología, Facultad de Ciencias,
UdelaR.
(6)
Instituto de Neurología, Hospital de Clínicas, Facultad de Medicina, UdelaR.
(2)
En el sistema nervioso periférico (SNP), la interrelación entre células de Schwann
mielinizantes y neuronas,
genera diferentes co-dominios interconectados. La bibliografía
reporta la importancia de la contribución integrada de ambas células en el funcionamiento del
SNP. En las neuropatías hereditarias, esta interrelación se encuentra alterada como
consecuencias de mutaciones génicas en una u otra célula. Los ratones Trembler-J (B6.D2Pmp22 <Tr-J>/J), han sido empleados como modelo animal para el estudio de estas
neuropatías. Poseen una mutación puntual en el gen pmp22 que codifica para la proteína
mielínica PMP22, que impide su inserción en la membrana, afectando la mielinización normal.
Aunque PMP22 ha sido intensamente estudiada, su función biológica es aún incierta. En este
trabajo estudiamos la expresión del gen-pmp22 durante el proceso de mielinización en
condiciones normales y patológicas mediante hibridación in situ e inmunomicroscopía
confocal. Se utlilizó un modelo de mielinización in vitro, desarrollado a partir de ganglios de la
raíz dorsal (GRD) de ratones Trembler J en estado embrionario (E13), de genotipo +/+
(normales) y TrJ/+ (patológicos), con 4 días de mielinización. El genotipo se determinó a
partir del ADN de los embriones mediante PCR-RFLP. Se observaron diferencias entre los
DRG provenientes de ratones +/+ y TrJ/+ en la localización celular tanto del ARNm de la
PMP22 como de la proteína. A su vez los DRG provenientes de ratones TrJ/+ presentaron
una marcada disminución de neurofilamentos fosforilados Estos resultados indicarían, por
primera vez, una influencia de la PMP22 en la cascada de señalización de fosforilación de los
neurofilamentos y por tanto un rol de la misma en el establecimiento del calibre axonal. Se
observó además, una correlación de 100% (Test Exacto de Fischer) entre el genotipo (PCRRFLP) y el fenotipo de los ratones evaluado por el test MSTT, indicando que es posible
inferir el genotipo a partir del fenotipo.
77
P65) VINCULO AXO-GLIAL
PERIFERICAS HUMANAS
EN
NEUROPATÍAS
HEREDITARIAS
KUN A(1,2), SOTELO JR(1), ROSSO G(1), CANCLINI L(1) , VÁZQUEZ C(3), MESA R(3),
PIZZAROSSA C(3), PENELA M(3).
(1)
(2)
Departamento de Proteínas y Acidos Nucleicos (DPAN), IIBCE.
DPAN-Unidad Asociada a la Sección Bioquímica de la Facultad de Ciencias,
Universidad de la República.
(3)
Instituto de Neurología, Hospital de Clínicas, Facultad de Medicina, Universidad
de la República.
El grupo de las neuropatías hereditarias periféricas humanas mas frecuentes,
identificadas generalmente como síndrome de Charcot Marie Tooth (CMT),
abarcan una diversidad de respuestas celulares que involucran a las células de
Schwann (CS) y/o a las neuronas (axones). A pesar de que por su mutación
original se las agrupa en mielinopatias (CMT1) y axonopatías (CMT2), todas
terminan generando axonopatías funcionales. Esto evidencia un complejo vinculo
axo-glial en la resultante fenotípica de la enfermedad.
Hemos estudiado este fenómeno a nivel molecular en nervios surales humanos de
pacientes CMT1 y CMT2. El citoesqueleto glial y axonal (actina, vimentina,
neurofilamentos), observado por inmunomicroscopia confocal, mostró alteraciones
en su distribución y arreglo. Frecuentemente, en mielinopatías, aparecían
brotamientos axonales rodeados de ribosomas gliales. La proteína glial MAG,
reguladora en trans de la actividad axonal (brotamientos, elongación axonal y
fosforilación dependiente de kinasas), mostró una distribución heterogenea y
discontinuada, respecto de su patrón normal. Concomitantemente, la fosforilación
de neurofilamentos mostró una distribución alterada, tanto longitudinalmente
como en el arreglo tridimensional de los heteropolimeros. La actividad
transcripcional fue evaluada en los nervios surales provenientes de biopsias
humanas, mediante la incorporación in vitro de bromouridina. Los ARN
neosintetizados mostraron un arreglo perinuclear y citoplasmático en la CS,
penetrando desde allí, hasta los dominios axonales. La expresión del gen NF-200
(detectado por hibridación in situ), mostró un patrón de distribución similar.
Las Incisuras de Schmidt-Lantermann y los nodos de Ranvier (dominios
citoplasmáticos gliales carentes de mielina compacta), parecen ser los caminos de
trafico para las macromoleculas estudiadas, tanto en condiciones normales como
patológicas. Nuestros resultados indican la existencia de una dinámica de
transferencia macromolecular transcelular, involucrada no solo en los procesos
degenerativos/regenerativos axo-gliales, sino en la regulación mutua de la
expresión génica entre neuronas y glias.
78
P66) OPTIMIZACIÓN DE ALGUNOS ABORDAJES HISTOQUÍMICOS E
INMUNO-HISTOQUÍMICOS PARA ESTUDIAR NEURODEGENERACIÓN
SARLABÓS M, ISASI E, BARBEITO L, OLIVERA BRAVO S.
Departamento de Neurobiología Celular y Molecular (NBCM)-Instituto Clemente
Estable (IIBCE)
Las enfermedades neurodegenerativas presentan manifestaciones clínicas muy
diversas que dependen de la degeneración de distintas células, estructuras o
regiones del SNC. Pese a que la mielina es uno de los blancos directos e indirectos
mas vulnerables1, en los modelos de neurodegeneración del SNC, el estudio de la
mielina se realiza generalmente en forma aislada del resto de las demás
poblaciones celulares. En este trabajo, nos proponemos optimizar diversas
técnicas morfológicas que permitan la evaluación simultánea del estado de la
mielinización y de otras poblaciones celulares en muestras de un mismo origen y
con el mismo procesamiento. Para ello, adaptamos técnicas clásicas de
reconocimiento de mielina (Sudan Black2, Kluver Barrera3), para su realización en
cortes de vibrátomo y su correspondencia con técnicas inmunohistoquímicas y
microscopía confocal4. Empleamos dos modelos animales de neurodegeneración: 1)
animales asintomáticos (90DPN) y sintomáticos (180DPN) del modelo animal de
esclerosis lateral amiotrófica por sobreexpresión de SOD1G93A mutada 5; 2)
animales jóvenes inyectados con altas concentraciones de ácido glutárico como
modelo de enfermedad neurometabólica del desarrollo 4. No fue posible lograr
buenos resultados en flotación para la técnica de Kluver, probablemente porque
originalmente fue desarrollada para material incluido en parafina, cortado en
crióstato y adherido a portaobjetos. En cambio, con la técnica adaptada de Sudan
Black logramos reconocer claramente la mielina, obteniendo una clara
diferenciación del cuerpo calloso y estriado. Se observó una correspondencia clara
entre ésta técnica y la inmunohistoquímica contra proteína asociada a mielina
(MAG). Ambos abordajes, permiten reportar una disminución y fragmentación de
los haces mielinizados en el estriado de animales tratados con ácido glutárico. Por
tanto, concluimos, que la adaptación de técnicas clásicas favorece la
complementariedad metodológica con los abordajes mas avanzados y permite el
mayor conocimiento de los eventos que subyacen la neurodegeneración.
1
Vercellino et al., 2009. J Neuropathol Exp Neurol. 68(5):489-502
Gerrits et al., 1992. J Neurosci Methods. 45(1-2):99-105
3
Geisler et al., 2002. Histochem Cell Biol 117(1):69-79
4
Olivera et al., 2008. Neurobiol Dis 32(3):528-34
5
Cassina et al., 2005. J Neurochem. 93(1):38-46
2
79
P67) OPTIMIZACIÓN DEL PARADIGMA EXPERIMENTAL PARA ESTUDIAR
MODULACIÓN MOLECULAR DE RECEPTORES DE NEUROTRANSMISORES
OLIVERA BRAVO S
Departamento de Neurobiología Celular y Molecular, IIBCE
Los receptores de neurotransmisores (RN) son complejos proteicos de membrana
especializados en el reconocimiento de sus agonistas (neurotransmisores) y en la
transducción de señales corriente abajo. Median la transmisión sináptica y son
blancos terapéuticos relevantes ya que están implicados en diversas condiciones
neurológicas y enfermedades neurodegenerativas de relevancia sociosanitaria
[NatRev 2009, 8:733-750]. Su expresión y funcionalidad están sujetas a una
estricta modulación molecular y celular, cuyo desbalance sería relevante en la
patología del sistema nervioso. El conocimiento de los mecanismos subyacentes a
ésta modulación es difícil de lograr debido al gran número de RN y a sus diferentes
estequiometrías, conformaciones de membrana y mecanismos de transducción.
Dado que el estudio de la funcionalidad y de las relaciones estructura-función con
moduladores de interés farmacológico y/o terapéutico, requiere de preparaciones
enriquecidas en RN, el objetivo de este trabajo fue obtener preparaciones
cerebrales que permitan la evaluación funcional de distintas familias de RN en
condiciones control y frente a moduladores de interés. Para ello, se disecaron
cerebros de ratas SD adultas, homogeneizaron en teflon, centrifugaron
diferencialmente a 1000, 35000 y 60000g, sometieron a gradiente de sacarosa y
posteriormente a choque térmico para obtener membranas sinaptosomales de
cerebro (MSC) enriquecidas en RN predominantemente postsinápticos. Los
resultados de Western Blot permitieron reconocer subunidades constitutivas de
receptores de GABA, glutamato y acetilcolina en las MSC. Los ensayos de binding
[MCN 2003, 23:96-106] y electrofisiológicos [JMN en prensa] indicaron que dichos
RN conservan sus características funcionales prototípicas y son capaces de ser
modulados por sustancias de uso farmacológico y terapéutico donde los RN están
alterados en número y/o función [NeurobiolDis 2006, 23:481-489]. Por tanto, las
MSC parecen ser una preparación adecuada para el estudio de los distintos tipos de
NR y podrían complementar otros abordajes.
Apoyo: Grant-in-aid ISN, PEDECIBA Biología
80
P68) IDENTIFICACIÓN DE
ACTIVIDAD NEUROTÓXICA
UN
FENOTIPO
ASTROCITARIO
CON
DÍAZ-AMARILLA P.1, OLIVERA S.1, TRIAS E.1, MARTINEZ-PALMA L.2, CASSINA P.2,
CRAGNOLINI A.B.3, BARBEITO L.1,3.
1
Instituto Clemente Estable; 2Depto de Histología, Facultad de Medicina; 3Institut
Pasteur Montevideo.
Las células gliales, y en particular los astrocitos, participan en la patogenia de las
enfermedades neurodegenerativas. La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) se
caracteriza por una degeneración de motoneuronas lo que lleva a una parálisis
progresiva. La muerte de motoneuronas espinales es acompañada por astrocitosis
reactiva, caracterizada por hipertrofia, proliferación y aumento de expresión de la
proteína GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein). Estudios previos realizados en un
modelo murino de ELA que expresa la mutación SOD1G93A han mostrado que los
astrocitos ejercen toxicidad sobre motoneuronas en condiciones de co-cultivo. Sin
embargo, aún no se ha estudiado en profundidad las características fenotípicas de
los astrocitos responsables de la muerte neuronal. Con este objetivo hemos
realizado cultivos de médula espinal de ratas SOD1G93A en la fase sintomática de
la enfermedad, en un intento de aislar e identificar astrocitos con capacidad
proliferativa y evaluar su potencial neurotóxico. Como resultado de esta
investigación se pudo establecer un cultivo homogéneo de astrocitos con alta
capacidad proliferativa y resistentes a sucesivos pasajes únicamente a partir de
animales SOD1G93A. Este fenotipo proliferativo no pudo ser obtenido a partir de
animales no transgénicos. Por tener características diferentes a los cultivos
primarios de astrocitos se les denominó células AbA (astrocito aberrante). Las
células AbA fueron caracterizadas como astrocitos mediante la detección de
marcadores como GFAP, Conexina 43 y S100 beta. Evaluados en condiciones de cocultivo con motoneuronas demostraron ser más tóxicos que los cultivos primarios
de astrocitos SOD1G93A. Se concluye que las células AbA podrían representar una
sub-población de astrocitos reactivos que por efecto de la mutación SOD1G93A
adquieren características aberrantes y neurotóxicas.
81
P69) VECTORES LENTIVIRALES: HERRAMIENTAS EFECTIVAS PARA LA
TRANSDUCCIÓN CELULAR.
NEGRO, M.L.1,2 BARBEITO, L.1 PELUFFO, H.1,2
1
Laboratorio de Neurodegeneración, Institut Pasteur de Montevideo.
Departamento de Histología y Embriología, Facultad de Medicina, Universidad de
la República.
2
Los vectores retrovirales derivados de lentivirus han evolucionado en los últimos
años, siendo muy populares en su uso como mecanismos moleculares
especializados para la introducción de transgenes tanto en células replicativas
como quiescentes. Los lentivectores derivados de HIV1 son capaces de mediar la
expresión in vivo a largo plazo en diversos órganos y tejidos. Cuando son
pseudotipados con la proteína G del virus de stomatitis vesicular (VSV-G) son
capaces de transducir un amplio rango de células incluyendo neuronas adultas y
células gliales del sistema nervioso central. Estos vectores poseen la capacidad de
introducir secuencias de gran tamaño, de entre 10 y 12 kb, siendo su expresión
estable debido a la inserción preferencial en sitios activos del genoma.
En el sistema de vectores HIV1, los genes virulentos son eliminados creando un
vector atenuado con muy baja inmunogenicidad. La producción de lentivectores de
3ª generación se realiza cotransfectando células productoras con 4 plasmidos
independientes, empaquetandose únicamente el plásmido que posee el transgen,
creando así virus deficientes en replicación. La utilización de sistemas de
expresión de última generación ha disminuido los problemas de bioseguridad
permitiendo una alta eficiencia de expresión génica.
El uso de lentivectores se extiende a la clínica así como a la investigación básica y
permiten realizar análisis de expresión tanto in vitro como in vivo. Aplicaciones
comunes para los vectores virales incluyen la restauración de genes funcionales en
estudios de terapia génica, silenciamiento de genes mediante la introducción de
siRNA entre otros. Dichos vectores han mostrado un gran potencial neuroprotector
para diversas neuropatologías espinales rescatando motoneuronas en modelos de
esclerosis lateral amiotrófica mediante el silenciamiento de genes involucrados en
la misma.
82
P70) VALIDACIÓN DE UN MODELO DE NEURODEGENERACIÓN:
DESCRIPCIÓN Y PARÁMETROS A EVALUAR
CÓPPOLA, V; SARLABOS, M N; BARBEITO, L; OLIVERA, S
Departamento de Neurobiología Celular y Molecular (NBCM)-Instituto Clemente
Estable (IIBCE)
Las células gliales están afectadas en la mayoría de las enfermedades
neurodegenerativas y dada su relación con las neuronas, podrían condicionar el
comienzo y/o la progresión de la neurodegeneración. Nuestro grupo ha
desarrollado un modelo de acidemia glutárica I (GAI) donde los astrocitos son
primariamente afectados y participarían de la neurotoxicidad retardada
observada1. Como la disfunción astrocitaria podría afectar la mielinización 2 y en
GAI hay alteraciones significativas de la mielina 3, el objetivo de este trabajo es
realizar en nuestro modelo un correlato del patrón de crecimiento, la
mielinización y el desempeño motor durante el desarrollo. Para ello, se inyectaron
ratas Sprague Dawley de 1 día con PBS (controles) o GA 0,75mM. Se determinó
peso semanalmente hasta los 60DPN. A los 7, 14, 21, 30, 45, 60 días, se
sacrificaron controles e inyectados mediante perfusión intracardíaca con PAF 10%.
Se realizó la evaluación morfométrica de los cerebros disecados, luego se cortaron
en vibrátomo para pruebas histológicas e inmunohistoquímicas por flotación. El
comportamiento locomotor se evaluó mediante test footprint4. Los resultados
preliminares indican que, respecto de controles inyectados con PBS, los animales
tratados con GA: a) no presentan diferencias significativas en la correlación pesoedad ni en el desempeño motor grosero; b) el análisis morfométrico del cerebro
muestra una disminución transversal a nivel del estriado; c) existe una pérdida
significativa del área estriatal mielinizada así como alteración de algunas proteínas
relacionadas con la mielina. Las alteraciones observadas en la mielinización
podrían repercutir en la función y sobrevida neuronal. El uso de un modelo de
enfermedad neurometabólica de causa conocida y reproducible donde las células
gliales son primariamente afectadas facilita la comprensión de los mecanismos
subyacentes a la neurodegeneración y abre posibilidades terapéuticas basadas en
las células gliales.
1
Olivera et al., 2008. NeurobiolDis. 32(3):528-34.
2
vanderKnaap et al., 2006. LancetNeurol. 5(5):413-23
3
Koeller et al., 2002. HumMolGenet. 11(4):347-57
4
Pallier et al., 2009. BrainResBull. 78(6):347-55
Financiación: PDT 76/23 y PEDECIBA Biologia.
83
OTRAS AREAS RELACIONADAS
P71-P75
P71) TOXICIDAD AGUDA DE ABEJAS EXPUESTAS A INSECTICIDAS
EMPLEADOS EN CULTIVOS AGRÍCOLAS DEL LITORAL OESTE
CARRASCO-LETELIER, L.1, OJEDA, P.2, RAMALLO, G.3, DÍAZ, S.3 , MENDOZA, Y.3
1 Programa Nacional de Investigación en Producción y Sustentabilidad Ambiental,
INIA, Uruguay; E-mail:[email protected]
2 Prog. Maestría en Ciencias Ambientales, Facultad de Ciencias, UdelaR,
3 Unidad de Apicultura, INIA-La Estanzuela, Colonia, Uruguay.
En el marco del proyecto INIA SA07 “Herramientas para la producción y
sustentabilidad de cuencas de aptitud forestal”, se han desarrollado estudios para
la validación de parámetros e indicadores; para evaluar los cambios en la calidad
ambiental por actividades agropecuarias. En este sentido, el desarrollo y
validación de parámetros internacionales de calidad ambiental con especies
nativas es un objetivo prioritario. Razón por la cual, el estudio de procesos de
contaminación por vía atmosférica con pesticidas en áreas rurales, se ha centrado
en el uso de la abeja como organismo centinela. Estrategia relevante tanto para el
soporte de redes de monitoreo atmosférico, como para la definición de las dosis
más adecuadas en el uso de pesticidas. Actividad que actualmente se basa en
recomendaciones internacionales, derivadas de estudios toxicológicos realizados
en un biotipo de abeja que no es el dominante en Uruguay. Principalmente, debido
al proceso de africanización existente en Uruguay. El cual ha generado biotipos
híbridos de abejas cuya sensibilidad toxicológica a insecticidas es desconocida. El
presente trabajo evaluó, mediante el procedimiento internacional estándar de la
EPPO, la toxicidad aguda de los insecticidas: Clorpirifos, Endosulfan, Imidacloprid,
Cipermetrina, Lamda-Cialotrina y Metoxifenocide. Pesticidas de amplia aplicación
en los cultivos del Litoral Oeste, y que representan el 30% de los insecticidas
importados por Uruguay. Los valores de DL50 resultantes presentaron una
toxicidad tres a cinco veces mayores que los descritos por la literatura
internacional, para un biotipo de abeja representativo del Litoral Oeste del
Uruguay.
Financiamiento:Proyecto INIA SA07, Uruguay.
84
P72) ESTUDIO LA DISRUPCIÓN ENDOCRINA EN CUENCAS AGRICOLAS Y
FORESTALES DEL LITORAL OESTE DEL URUGUAY
CANEDO PUOSO, L.3, EGUREN, G.2, CARRASCO-LETELIER, L.1, RIVAS-RIVERA, N.2
1 Programa Nacional de Investigación en Producción y Sustentabilidad Ambiental,
INIA, Uruguay; E-mail:[email protected]
2 Grupo de Investigación en Quimica Ambiental y Ecotoxicología, Facultad de
Ciencias, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.
3 Universidad de Estocolmo, Suecia.
Entre los nuevos contaminantes ambientales identificados en los últimos veinte
años, se destacan los compuestos químicos con capacidad de perturbar las
funciones normales del sistema endocrino, denominados genéricamente
disruptores endocrinos. En Uruguay, un trabajo cooperativo entre Facultad de
Ciencias (UDELAR), el Canadian River Institute (Universidad de Saint John, Canadá)
y el INIA (proyecto INIA SA07) permitió validar el primer ensayo para evaluar
procesos de disrupción endocrina en el rìo Uruguay. Dada la naturaleza química de
los disruptores endocrinos, estos se encuentran asociados a: emisiones líquidas de
agroindustrias, residuos líquidos urbanos, productos fitosanitarios, y liberación de
fitoestrógenos y ácidos resínicos vinculados a al uso del suelo. En este marco, se
realizó una evaluación del efecto de cambio de uso del suelo en cuencas agrícolas,
basado en el ensayo validado para Uruguay. En el presente trabajo se presentan
los resultados del estudio de procesos de disrupción endocrina en dos cuencas del
Departamento de Río Negro con usos de suelo contrastantes (forestación vs
agricultura). En este bioensayo se expusieron juveniles de Cyprinus carpio a agua,
sedimento y mezclas de agua-sedimento colectados en las cuencas seleccionadas.
En este experimento se evaluaron los biomarcadores: vitelogenina plasmática,
índices hepato- y gonado-somático. Los resultados de este experimento evidencian
una mayor disrupción endocrina en peces expuestos a agua y sedimentos de
cuencas agrícolas que en cuencas forestadas.
Financiamiento:Proyecto INIA SA07, Uruguay.
85
P73)
Couto-PDF-
86
P74) ENVEJECIMIENTO SEXO-ESPECÍFICO Y DAÑO OXIDATIVO EN
COPÉPODOS MARINOS
LAURA RODRÍGUEZ-GRAÑA1, DANILO CALLIARI2, PETER TISELIUS 3, HELEN NILSSON
SKÖLD 3
1
Sección Limnología y 2Sección Oceanología, Facultad de Ciencias, Universidad de
la República, Iguá 4225, C. P. 11400, Montevideo, Uruguay
3
Department of Marine Ecology, University of Gothenburg, Kristineberg 566, SE
450-34, Fiskebäckskil, Sweden
Este estudio analiza los efectos del envejecimiento en Acartia tonsa (Copepoda,
Crustacea); dichos efectos implicaron una disminución en las tasas de ingestión y
reproducción asociados con un incremento en la acumulación de daño oxidativo
(estimado como nivel de proteínas carboniladas). Bajo condiciones experimentales
en laboratorio se determinaron los efectos del envejecimiento en la alimentación
y daño oxidativo discriminado por sexos, y la fecundidad en hembras. También se
determinó el efecto materno sobre la descendencia mediante la estimación del
éxito en la eclosión de huevos y daño oxidativo en las crías producidas por madres
de diferente edad. Los machos manifestaron un mayor daño oxidativo con la edad
respecto a las hembras. La edad de la madre tuvo un efecto en la descendencia y
hembras más viejas presentaron una menor tasa reproductiva y originaron crías
con mayor daño oxidativo. Se exploró el efecto antioxidante de dos tipos de
alimento (microalgas) en las variables mencionadas. Este estudio proporciona una
base empírica para relacionar envejecimiento y expectativa de vida, diferencias
entre sexos y efecto materno en uno de los organismos más abundantes e
importantes en el ambiente acuático, con implicaciones en el campo de la
ecología funcional y evolutiva. Se propone además el uso de este crustáceo como
potencial organismo modelo en estudios de envejecimiento.
87
P75) DIFERENCIAS EN LA DISCRIMINACIÓN ISOTÓPICA DE
LOTUS corniculatus Y TRIFOLIUM repens
13
C ENTRE
BERRIEL V, MORI C Y PERDOMO C.
CATNAS, Facultad de Agronomía, Universidad de la República.
Las plantas integran las señales ambientales en complejas respuestas fisiológicas
que pueden tener incidencia a corto o largo plazo en el consumo de agua y en el
rendimiento del cultivo. Sin embargo ante diferentes estímulos y/o estreses
ambientales las distintas especies no responden de la misma manera. Los
diferentes mecanismos de adaptación pueden estudiarse a través medidas
fisiológicas integradas en el tiempo y cuya significación biológica es más valiosa
que las instantáneas. La discriminación isotópica del 13C (Δ) es un parámetro
fisiológico que integra en el tiempo a otras respuestas como la conductancia
estomática y la tasa fotosintética y además se relaciona a la eficiencia en el uso
del agua del cultivo. En el año 2007 se realizó un estudio en campo donde se
evaluaron diferentes parámetros fisiológicos de las leguminosas Trifolium repens y
Lotus corniculatus sembradas en pasturas mezcla con Festuca arundinacea.
Durante los meses de agosto a noviembre se realizaron cuatro muestreos, que
consistieron en cortes de la parte aérea de las plantas, en cuatro sitios elegidos al
azar. Los resultados mostraron que ambas especies tuvieron diferentes respuestas
fisiológicas que determinaron distintos valores de Δ, concentración de carbono y
producción de materia seca. Los valores de Δ fueron disminuyendo en las dos
especies a medida que avanzó el año; esto puede explicarse en función del cambio
en las condiciones ambientales durante los meses evaluados que provocaron el
cierre estomático y la disminución de la fijación del carbono en la fotosíntesis. L.
corniculatus presentó valores significativamente mayores de Δ que T. repens para
todas las fechas evaluadas, y además la disminución de Δ fue mayor y más
temprana en T. repens. Este estudio confirma la utilidad del parámetro Δ para
detectar diferencias de respuesta entre especies a las condiciones ambientales.
88
PARASITOLOGÍA
P76-P83
P76) PROTEÍNAS INVOLUCRADAS EN LA INTERACCIÓN HOSPEDEROPARASITO. ESTUDIO DE PROTEÍNAS TIPO CRISP EN CESTODOS
PARÁSITOS
COSTÁBILE, A; KOZIOL, U; MARÍN, M; CASTILLO, E.
Sección Bioquímica – Biología Molecular. Facultad de Ciencias. UDELAR
Se ha aislado en nuestro laboratorio una proteína, denominada McCRISP2, que
presenta una señal de excreción/secreción, expresada por distintos estadíos del
cestodo Mesocestoides corti. Presenta similitud aminoacídica significativa con
miembros de la familia de proteínas SCP/TAPS, presentes en muchos organismos.
Estas proteínas se caracterizan por tener un dominio SCP N-terminal y varios
residuos de cisteína en el extremo C-terminal. En el caso de parásitos, en
particular en el nematodo parásito Ancylostoma caninum, la proteína ASP1,
perteneciente a la familia CRISP, (51% de similitud aminoacídica con McCRISP2), se
expresa como producto de excreción/secreción en el estadío larvario infectivo;
además se ha probado que la inmunización de animales de laboratorio con la
proteína recombinante disminuye la carga parasitaria, por lo que se ha propuesto
como un candidato prometedor para el desarrollo de vacunas.
Con el objetivo de dilucidar la función de esta proteína, se clonó y expresó su
secuencia codificante en Escherichia coli. La proteína recombinante fue obtenida
en forma insoluble, fusionada a una cola de histidinas, lo que permite purificarla
mediante cromatografía de afinidad, en condiciones desnaturalizantes. La
obtención de la proteína pura permitirá la producción de anticuerpos específicos
contra la misma, lo que será una herramienta invalorable para estudiar su función
en relación a su posible rol en la interacción hospedero – parásito.
Por otro lado se está intentando obtener la secuencia codificante completa de tres
proteínas tipo CRISP aisladas en forma parcial. Se diseñaron oligonucleóticos
específicos a partir de la secuencia conocida y se está intentando amplificar sus
extremos mediante 5‟ y 3‟ RACE. Se ha obtenido la secuencia 3´para algunas de
ellas. Además se están diseñando cebadores específicos, en base al análisis del
genoma de Echinococcus multilocularis, para clonar proteínas tipo CRISP de
Echinococcus granulosus.
89
P77) CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA DE LA TRIPANOTIÓN SINTETASA
DE TRYPANOSOMA BRUCEI
MEDEIROS, A.1,2, RADI, R1 Y COMINI, M2.
1
Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina. 2Laboratorio de Biologia
Redox de Tripanosomas, Instituto Pasteur.
En los tripanosomátidos, tripanotión (bis-glutationil-espermidina) es el principal
cofactor redox de bajo peso molecular encargado de sostener diversas funciones
celulares. Su síntesis a partir de glutatión y espermidina es catalizada por la
enzima Tripanotión Sintetasa (TryS). La indispensabilidad de TryS y tripanotión
para la sobrevida del tripanosoma africano T. brucei brucei fue demostrada
mediante técnicas de ARN interferencia. Esto, sumado a su ausencia en seres
humanos convierte a la TryS en un interesante blanco terapéutico contra las
tripanosomiasis.
En el presente trabajo hemos profundizado la caracterización biológica de la TryS
utilizando como modelo la forma infectiva de T. brucei brucei, especie patógena
para el ganado y organismo modelo de la tripanosomiasis africana humana.
Empleando técnicas bioquímicas determinamos la localización subcelular, el
patrón de expresión y la concentración intracelular de la TryS durante las distintas
fases del crecimiento del parásito, así como también frente a estrés oxidativo y
ARN interferencia (ARNi).
Los estudios revelaron que la TryS es una proteína relativamente abundante en el
parásito (1-5 µM) que presenta un patrón de expresión constitutivo y se distribuye
mayoritariamente en gránulos citoplasmáticos. A diferencia de lo observado para
triparredoxina y triparredoxina peroxidasa (dos enzimas importantes del sistema
de defensa anti-oxidante del parásito), no se detectó un aumento significativo en
la expresión de TryS en parásitos sometidos a estrés oxidativo (100 μM H202).
Mediante ARNi confirmamos que la concentración intracelular mínima de TryS
necesaria para mantener la viabilidad de los parásitos in vitro debe ser ≥ a 1 µM.
90
P78) PROGRESOS EN LA MANIPULACIÓN GÉNICA EN CESTODOS.
DOMINGUEZ, M. F., KOZIOL, U., DELL´OCA, N., MARIN, M., TORT, P., CASTILLO, E.
Sección Bioquímica –Biología Molecular – Facultad de Ciencias – Universidad de la
República.
Los platelmintos parásitos, representan un grupo muy diverso de organismos
responsables de infecciones tanto en seres humanos como en animales. Debido el
gran impacto sanitario y económico, estos han sido centro de estudios buscando
dilucidar aspectos básicos de su biología, inmunología, y epidemiología.
Uno de ellos E. granulosus presenta una gran importancia clínica y económica
debido a la infección de los huéspedes intermediarios que constituye un problema
muy importante de salud en humanos y es una causa de substanciales pérdidas
económicas en el ganado.
Además de estudiar este parasito nosotros usamos como modelo alternativo M.
corti para el estudio de cestodos.
El objetivo de nuestro trabajo es la implementación de metodologías de
manipulación génica “ knockdown”, que nos permitirá la determinación del rol
de determinados genes que podrá se aplicado a más largo plazo para el estudio del
tratamiento de enfermedades parasitarias.
Las técnicas de “knockdown”, particularmente interferencia mediada por ARN
doble cadena (ARNi) han sido aplicadas con éxito en varias especies de
invertebrados. Estas técnicas permiten el estudio de la función génica sin la
necesidad del desarrollo de transformantes estables, reduciendo el tiempo, el
costo y los riesgos asociados a las manipulaciones genéticas.
Hemos logrado la transfección de moléculas reporteras (Luciferasa) en M. corti
logrando detectar la misma dentro de los organismos electroporados utilizando RTPCR y la detección de la actividad.
Actualmente nos encontramos realizando experimentos de interferencia de ARN
con el uso de moléculas doble cadena. Esto nos permitirá realizar la interferencia
de un mensajero exógeno de Luciferasa para poder aplicar el sistema para la
interferencia de genes endógenos: Crisp y Tropomiosina.
91
P79) GLICANOS DE LA CAPA LAMINAR DE Echinococcus granulosus:
ANÁLISIS COMPARATIVO ENTRE DISTINTOS HOSPEDEROS.
GERARDO LIN1, MAGDALENA PORTELA3, FERNANDO FERREIRA2 Y ALVARO DÍAZ1
1
Cátedra de Inmunología, DEPBIO, Facultad de Química, Udelar.
Laboratorio de Carbohidratos y Glicoconjugados, DQO, Facultad de Química,
Facultad de Ciencias y Facultad de Medicina, Udelar
3
UBYPA, Institut Pasteur Montevideo
2
La larva (hidátide) del cestode E. granulosus está protegida externamente por una
matriz extracelular especializada (capa laminar), que es la única estructura
parasitaria expuesta al hospedero. La capa laminar está compuesta principalmente
por mucinas, cuyos glúcidos hemos mayoritariamente elucidado. Estos son Oglicanos basados en los cores 1 o 2 convencionales, desnudos o decorados con un
repertorio acotado de motivos, que incluyen extensiones lineales con residuos de
galactosa y probables ramificaciones iniciadas con residuos de N-acetilhexosamina.
El trabajo de base se realizó con hidátides de origen bovino, hospedero al cual E.
granulosus no está bien adaptado, por lo que la inflamación frente al parásito no
se resuelve. Por lo tanto, en el presente trabajo se estudia comparativamente el
perfil de glicanos en hidátides provenientes de hospederos más permisivos (como
el ovino), para evaluar la posibilidad de que la predominancia hasta el momento
observada de glicanos cortos (incluyendo los cores desnudos) sea característica del
parásito solamente en el contexto de una reacción inflamatoria sostenida. Se
liberaron por -eliminación reductiva los glicanos de paredes de hidátides de 4
especies de hospederos, y se analizaron por gel filtración. Se encontró una
distribución de tamaños sumamente conservada, predominando en todos los casos
estructuras de 2 o 3 monosacáridos, con cantidades decrecientes de los glicanos
mayores. Los glicanos de hidátides de orígenes bovino y ovino se analizaron
adicionalmente por MALDI-TOF-TOF luego de permetilación, detectándose el
mismo conjunto de estructuras en ambos. Se concluye que la dominancia de Oglicanos pequeños en la capa laminar es intrínseca a la biología del parásito. Sin
embargo, los resultados sugirieron también una mayor abundancia relativa de
aquellos glicanos con mayor número de residuos de N-acetilhexosamina (o sea,
más ramificados) en el hospedero ovino. Se buscará confirmar esta tendencia por
métodos cuantitativos, y evaluar su relevancia en la biología de E. granulosus.
Financiación: CSIC (I+D nº 404, Facultad de Química)
92
P80) CARACTERIZACIÓN DE LA TRIPARREDOXINA PEROXIDASA
CITOSÓLICA DE Trypanosoma cruzi EN CONDICIONES DE OXIDACIÓNREDUCCIÓN.
1,2
GARDNER, M.,
C.
1,3
ARCARI, T.,
1,3
PIÑEYRO, M.D., 2PARODI-TALICE, A.,
1,3
ROBELLO,
1
Unidad de Biología Molecular, Instituto Pasteur Montevideo; 2Sección Genética,
Facultad de Ciencias, UdelaR; 3Departamento de Bioquímica, Facultad de
Medicina, UdelaR
Durante su ciclo de vida, Trypanosoma cruzi invade las células de sus hospederos
vertebrados. Dentro de las células, el parásito está expuesto a especies reactivas
de oxígeno y de nitrógeno, producidas por sus propios procesos de respiración
celular o por mecanismos de defensa del huésped, que pueden resultar letales. Sin
embargo, los tripanosomátidos han desarrollado sistemas de detoxificación
dependientes de tripanotión, que les permiten eliminar dichas especies reactivas.
La Triparredoxina Peroxidasa citosólica de T. cruzi (cTcTXNPx) forma parte de uno
de estos sistemas de enzimas antioxidantes. La cTcTXNPx es una peroxirredoxina
de 2-Cys, con dos residuos de cisteína reactivos esenciales para su actividad
catalítica. En la cTcTXNPx, el grupo sulfhidrilo de la cisteína peroxidática (C P) es
oxidado al reaccionar con H2O2, formándose el derivado ácido sulfénico (Cys-SOH).
La CP puede reaccionar con una segunda molécula de H2O2, formándose un
derivado sulfínico (Cys-SO2H), obteniéndose así una forma inactiva de la enzima.
La inactivación por “sobreoxidación” de las C P de Prx de 2-Cys se ha detectado in
vitro e in vivo en varios tipos celulares. En mamíferos, se ha demostrado que este
proceso es reversible, formando parte de mecanismos de regulación de cascadas
de señalización mediados por H2O2.
En este trabajo caracterizamos, desde un punto de vista proteómico, el estado de
la cTcTXNPx en condiciones de oxidación-reducción. La caracterización
comprendió la expresión y purificación de la proteína cTcTXNPx y formas mutantes
en varios residuos de cisteína. Se caracterizaron los cambios en la movilidad
electroforética de las proteínas, provocados por su oxidación al ser incubadas en
presencia de H2O2, mediante la utilización de técnicas de electroforesis
bidimensional y espectrometría de masa (MS). Por último, se detectó la presencia
de ácido sulfínico (SO2H) mediante análisis por Western Blot utilizando anticuerpos
específicos.
93
P81) ARNs PEQUEÑOS EN FASCIOLA HEPATICA, UNA PRIMER
APROXIMACIÓN.
DELL‟OCA N, GARCIA R, CANCELA M, CAYOTA, TORT J.
En los últimos años una nueva clase de ARNs pequeños no codificantes (ncRNAs)
reguladores ha sido descubierta. Algunos de los rasgos que definen esta población
de ncRNA son tamaño de aproximadamente 20 a 30 nucleótidos y la unión con
proteínas de la familia Argonauta.
Los miembros más representativos de esta familia son micro RNAs (miRNAs), ARNs
pequeños de interferencia (siRNAs) y piwi RNAs (piRNAs). Hoy sabemos que miRNAs
y siRNAs son fuertes reguladores post-trancripcionales de la expresión génica. Los
piRNA y ra-siRNA una subclase de piRNA, se expresan solo en la línea germinal en
distintos organismos donde han sido descritos y actúan como estabilizadores del
genoma de estas células. El universo de ncRNA continua creciendo con nuevos
tipos caracterizados recientemente en plantas y hongos aunque no se conoce bien
su función.
La mayoría de los trabajos sobre ncRNA utilizan se han centrado en vertebrados
(organismos deuterostomados) y en los ecdizosoos modelo, el nematodo C.elegans
y la mosca Drosophila. Poco se sabe de estos mecanismos en el tercer linaje de los
metazoarios, los lofotrocozoos, donde los trabajos que hablan de ncRNA
reguladores se limitan casi exclusivamente a Schistosomas y Planarias.
Siguiendo protocolos establecidos comenzamos a analizar los ARN pequeños
presentes en el trematodo Fasciola hepatica. Generamos 124 ARNs pequeños
distintos de 18 a 32 nucleótidos del estadio juvenil de Fhepatica. El análisis de
estas secuencias puede representar la primera evidencia de ncRNAs en el
trematodo F.hepatica.
Esto resulta de vital importancia para comprender los mecanismos de control de la
expresión génica en este parasito, lo que puede facilitar el desarrollo de la
interferencia de ARN, y de otras herramientas de estudio de la función génica y
eventualmente aportar al control de las parasitosis.
94
P82) AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE GENES TIPO NANOS EN
PLATELMINTOS PARÁSITOS.
BIZZOZERO R. , KOZIOL U. , DOMÍNGUEZ F. , COSTÁBILE A. , CASTILLO E.
Sección Bioquimica – Biología Molecular, Facultad de Ciencias, UDELAR.
Un aspecto de la biología de platelmintos parásitos que es interesante profundizar
es sobre sus células indiferenciadas (neoblastos). Uno de los genes que se expresan
durante la proliferación y diferenciación celular en los neoblastos es el gen nanos.
La expresión de este gen está relacionada con la diferenciación de líneas celulares
germinales en planarias, y probablemente también lo esté en otros platelmintos.
El gen nanos codifica para una proteína de unión al ARN, que contiene un presunto
motivo de dedos de Zinc que exhibe semejanzas con otros genes nanos en
vertebrados e invertebrados. Estudios en diferentes organismos han demostrado la
conservación del rol de la proteína Nanos en el desarrollo y en la diferenciación
celular.
Nos hemos propuesto aislar y caracterizar genes tipo nanos de platelmintos
parásitos y también determinar los posibles patrones de expresión de estos genes
en algunas etapas del desarrollo. Mediante PCR con cebadores degenerados hemos
aislado la secuencia de ADN copia correspondiente al dominio Nanos de unión al
ARN (zf-nanos; Nanos RNA binding domain) de Fasciola Hepática y Mesocestoides
corti. Los fragmentos aislados han sido clonados en vectores procariotas y luego
secuenciados.
Actualmente estamos amplificando por medio de RACE (Rapid Amplification cDNA
Ends) ambos extremos flanqueantes al dominio ya aislado. De este modo,
hallaremos la secuencia completa del gen codificante, para luego clonarla y
secuenciarla. Hemos completado el extremo 3´del cDNA de nanos de M.corti.
También, estamos diseñando sondas específicas para realizar ensayos de
hibridación in situ, y así establecer posibles patrones de expresión en diferentes
estadíos de desarrollo de los parásitos de estudio.
95
P83) EgGST3: UNA NUEVA
Echinococcus granulosus
GLUTATIÓN
S-TRANSFERASA
DE
LA-ROCCA S1., IRIARTE A.2, ARBILDI P.1, FERNÁNDEZ V1.
1
Cátedra de Inmunología, Facultad de Química-Ciencias, UdelaR. 2Laboratorio de
Organización y Evolución del Genoma. Facultad de Ciencias.
Las glutatión transferasas (GSTs) son una superfamilia de proteínas
multifuncionales involucradas en la detoxificación celular de componentes
exógenos y endógenos. Estas enzimas conjugan glutatión a una amplia variedad de
compuestos, algunos potencialmente tóxicos, favoreciendo la inactivación de los
mismos. Existen además, GSTs involucradas en la síntesis de prostaglandinas, en
particular las de clase sigma pueden producir PGD2, que participa en diversos
mecanismos de regulación de la respuesta inmune. De esta forma, las GSTs
adquieren gran relevancia en los helmintos parásitos, ya que constituyen un
importante mecanismo de detoxificación y contribuyen a la evasión de la
respuesta inmune del hospedero. En Echinococcus granulosus hemos caracterizado
molecularmente dos GSTs (EgGSTs): EgGST1 de clase Mu que podría estar
involucrada en la detoxificación de lípidos hidroperoxidados, y recientemente,
EgGST2 con alta homología con las de clase Sigma. En este trabajo se describe el
clonado y secuenciación del gen de una nueva enzima parasitaria, EgGST3. Se
presentan estudios filogenéticos, implementando el método Bayesiano y de
distancias “Neighbor-joining”, que permitieron relacionar a EgGST3 con otras GSTs
de E. granulosus y otros organismos. Asimismo, se incluye un análisis de la
evolución molecular y un estudió de la conservación de residuos aminoacídicos,
que podrían ser relevantes para el entendimiento de su actividad enzimática
actual y pasada. De esta forma, el análisis realizado constituye un punto de
partida en el estudio de EgGST3 y sus posibles roles en la biología del parásito, en
particular, en una infección por el mismo.
96
BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE LOS MICROORGANISMOS
P84-P102
P84) ESTANDARIZACIÓN DE UN ENSAYO MOLECULAR PARA EL
DIAGNÓSTICO DE IBV EN URUGUAY
MARANDINO A, PANZERA Y, HERNÁNDEZ M, HERNÁNDEZ D & PÉREZ R
Sección Genética Evolutiva, Facultad de Ciencias, Universidad de la República
La Bronquitis Infecciosa Aviar es una enfermedad respiratoria aguda que afecta
exclusivamente a aves de corral. El agente causal de esta enfermedad es el virus
de la bronquitis infecciosa (IBV) perteneciente al género Coronavirus de la familia
Coronaviridae. IBV es un virus pleomórfico, con diámetro de 80-120 nm, en cuyo
interior aloja un genoma ARN simple hebra de polaridad positiva de 27,6 kb. El
diagnóstico clínico de la Bronquitis Infecciosa Aviar es dificultoso ya que, por
tratarse de una enfermedad esencialmente respiratoria, suele confundirse con
otras patologías aviares que provocan síntomas similares. El diagnóstico por
aislamiento e identificación del virus con pruebas serológicas utilizadas
tradicionalmente, como la neutralización viral, generalmente es muy laborioso y
poco seguro debido a la alta tasa de cambios antigénicos que posee IBV. Por esta
razón nos encontramos desarrollando, por primera vez en el Uruguay, un método
de diagnóstico molecular para IBV mediante el uso de la técnica de RT-PCR.
Nuestra metodología se basa en la detección de la presencia del genoma viral
mediante la amplificación de un fragmento de 437 pb del gen de la nucleocápside
(N). Inicialmente esta técnica se aplicó en virus obtenidos directamente de viales
de vacunas de IBV comercializadas en Uruguay. Los parámetros del ensayo fueron
ajustados correspondientemente de manera de utilizar el virus vacunal como
control positivo para el diagnóstico de cepas de campo. Recientemente se detecto
la presencia del genoma viral de IBV en muestras provenientes de un lote de aves
con sintomas respiratorios. Actualmente se está aplicando la metodología
estandarizada en nuevas muestras de campo con diagnostico clínico presuntivo de
esta enfermedad
97
P85) ESPECIFICIDAD POR SUSTRATOS OXIDANTES DE LA ALQUIL
HIDROPEROXIDO REDUCTASA E DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
REYES A. M.1,2, HUGO M.1,2, RADI R.1,2 Y TRUJILLO M.1,2
1
Departamento de Bioquímica y 2Centro de Investigaciones Biomédicas en
Radicales Libres, Facultad de Medicina
Mycobacterium tuberculosis, el agente causante de la enfermedad tuberculosis, es
capaz de sobrevivir y proliferar en los fagosomas de macrófagos activados, y sus
mecanismos de defensa antioxidante constituyen un campo de investigación
activo. En nuestro trabajo previo demostramos que la alquil hidroperóxido
reductasa E (AhpE), peroxirredoxina de 1-cisteína de M. tuberculosis, reduce al
peroxinitrito mas rápidamente que al peróxido de hidrogeno (2 x 10 7 y 8 x 104 M-1s1
a pH 7,4 y 25°C, respectivamente). Aquí continuamos investigando la
especificidad de MtAhpE por sustratos oxidantes. El peroximonocarbonato,
formado a través de la reacción de equilibrio lenta entre el peróxido de hidrógeno
y el dióxido de carbono presente en concentraciones mM en sistemas celulares,
oxidó a la enzima rápidamente (4 x 106 M-1s-1). Los hidroperóxidos de tert-butilo y
de cumeno fueron reducidos por la enzima con constantes de velocidad similares
al peróxido de hidrogeno. El hidroperóxido en posición 15 del ácido araquidónico
reaccionó con la enzima con una constante de velocidad de 2 x 10 8 M-1s-1,
reactividad mayor que la descrita para la reducción de hidroperóxidos lipídicos por
la glutatión peroxidasa 4 de mamíferos. Exceptuado a este último, la cinética de
oxidación del tiol peroxidático en MtAhpE por los sustratos estudiados siguió una
tendencia en la que aquellos con menor pK a de grupo saliente (alcóxido)
reaccionaron más rápidamente. Este comportamiento es similar al del glutatión y
el único grupo tiol de la albumina sérica bovina, pero difiere de otros tioles
peroxidáticos previamente reportados. La sobreoxidación de la cisteína
peroxidática de MtAhpE a acido sulfínico por estos peróxidos también fue
estudiada, y la cinética fue paralela aunque 1000 veces mas lenta que la de
oxidación.
98
P86) DIVERSIDAD Y EFICIENCIA SIMBIÓTICA DE RIZOBIOS AISLADOS DE
NÓDULOS DE LOTUS ULIGINOSUS EN URUGUAY
BATISTA L., SÁNCHEZ M., AZZIZ G. Y MONZA J.
Laboratorio de Bioquímica, Dpto. de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía
Leguminosas del género Lotus son utilizadas en Uruguay para el mejoramiento de las pasturas. Lotus
uliginosus, típicamente nodulado Bradyrhizobium sp., interesa por su alta concentración de taninos,
y por la adaptación a suelos ácidos y de baja fertilidad. En este trabajo se evaluó la diversidad y
eficiencia simbiótica de 111 aislados de nódulos de L. uliginosus, colectados de sitos con y sin historia
de inoculación. Usando cebadores ERIC se obtuvieron 75 aislados con perfiles únicos, ninguno igual al
del inoculante comercial. La diversidad por sitio varió entre el 50 y 79%. A los amplificados del gen
16S ARNr de los 75 aislados diferentes se les realizó ARDRA con MspI y HinfI, que permitieron definir 3
ribogrupos, de los que se seleccionaron 14 aislados y se secuenciaron los genes 16S ARNr, atpD y nifH.
El análisis de la secuencia del gen 16S ARNr evidenció que 13 aislados pertenecen al género
Bradyrhizobium, y 1 al género Mesorhizobium. El agrupamiento obtenido a partir de la secuencia del
gen atpD coincidió con el obtenido a partir del gen 16S ARNr. Sin embargo la asignación a nivel de
especie no fue la misma con estos genes housekeeping. El análisis de secuencias del gen nifH mostró
concordancia a nivel de género con los análisis obtenidos con los genes 16S ARNr y atpD. El gen nodC
no pudo ser amplificado como única banda con los cebadores usados, que amplifican ese gen en
Mesorhizobium sp. Los aislados indujeron nódulos en L. uliginosus y 8 de ellos también lo hicieriero en
L. corniculatus. La producción de biomasa con las 6 cepas ensayadas no evidenció ninguna más
eficiente que la usada como inoculante comercial en cada leguminosa. Esta evaluación continúa con
la totalidad de los aislados, por el particular interés que esto tiene.
99
P87) NODULACIÓN DE Parapiptadenia rigida (ANGICO) POR BETA
RIZOBIOS.
MAREQUE,C., TAULÉ,C., AZZIZ,G., SARTORI,L., ZABALETA, M., BATTISTONI,F. Y
FABIANO E.
Laboratorio de Bioquímica y Genómica Microbiana.IIBCE-MEC. Av.Italia 3318
[email protected]
El angico es una leguminosa arbórea nativa con alto potencial para la forestación
debido a sus características maderables, su rápido crecimiento y su contribución a
la recuperación de suelos degradados. La inoculación temprana de las leguminosas
arbóreas con bacterias promotoras del crecimiento:BPC, incrementa la
supervivencia y el rendimiento de las plantas en el campo. Una de las asociaciones
planta-BPC más conocida es la establecida entre leguminosas y bacterias
simbióticas fijadoras de nitrógeno, denominadas rizobios. Como resultado de la
interacción se forman en la planta estructuras simbióticas (nódulos) donde se
alojan los rizobios. Uno de los compuestos responsables de la nodulación son los
factores Nod (codificados por los genes nod) sintetizados por los rizobios. Hasta
hace pocos años se consideraba que los rizobios comprendían solamente Proteobacterias pero recientemente se demostró que también hay rizobios
(Burkholderia y Cupriavidus) pertenecientes a las -Proteobacterias.
El presente trabajo se propone avanzar en el conocimiento de la interacción
leguminosa-rizobio. En particular nos centramos en el estudio de la fisiología de la
nodulación y de la filogenia de los genes nodA y nodC en cepas de Burkholderia y
Cupriavidus presentes en nódulos de angicos en suelos uruguayos.
Se estudió en condiciones gnotobióticas, la cinética de nodulación de angico. Se
evaluó la presencia de los genes nodA y nodC mediante PCR. Los amplicones
obtenidos se secuenciaron en Macrogen y las secuencias se analizaron
bioinformáticamente. Se estudió la filogenia de ambos genes y se comparó con los
datos disponibles sobre la filogenia del gen rRNA 16S. Se determinó también la
capacidad de los microsimbiontes de fijar libremente el N 2 mediante ensayos de
reducción del acetileno.
Financiación: INIA-FPTA (216), PDT-MEC (67/03) y PEDECIBA.
100
P88) PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO DE CULTIVOS DE CAÑA DE
AZÚCAR POR BACTERIAS ENDÓFITAS
1,2 *
TAULÉ, C., 2*BARLOCCO,C., 1*MAREQUE, C., 1PLATERO, R., 3HACKEMBRUCH, F.,
2
SICARDI, M. Y 1BATTISTONI, F.
1
Laboratorio de Bioquímica y Genómica Microbiana, IIBCE-MEC. Av. Italia 3318.
Montevideo 11600.
2
Laboratorio de Microbiología de Suelos. Facultad de Ciencias, UdelaR. Mataojo
2055. Montevideo 11400.
3
Alcoholes Uruguay S.A. Camino Calnú S/N. Bella Unión.
*
igual contribución
En Uruguay, la caña de azúcar se planta con dos objetivos principales: la
producción de azúcar y como materia prima para la producción de
biocombustibles. Actualmente el "Proyecto Sucro-Alcoholero" promueve su
plantación como cultivo estratégico, (ley Nº 18.195) encomendando a ANCAP a
incorporar biodiesel producido en el país con materias primas nacionales.
Uno de los problemas que presenta este cultivo son los altos costos de producción
relacionados a la fertilización química nitrogenada, asi como los problemas
ecológicos relacionados a esta práctica.
Actualmente se está desarrollando una línea de investigación cuya finalidad es
contribuir a la sustentabilidad económica y ambiental del cultivo de caña,
mediante el uso de bacterias promotoras del crecimiento (BPC), particularmente
endófitas-diazótrofas (bacterias fijadoras de nitrógeno). El término endófito
refiere a bacterias que colonizan los tejidos vegetales sin causar daño. El objetivo
del presente trabajo es aislar y caracterizar dichas bacterias, para posteriormente
evaluar su efecto promotor del crecimiento del cultivo caña.
Ensayos de dilución isotópica del 15N se estan llevando a cabo con el fin de conocer
la fijación biológica de nitrógeno (FBN) que realizan naturalmente las variedades
comerciales utilizadas en el país y poder seleccionar aquella que presente la
mayor capacidad de FBN.
Paralelamente se están realizando aislamientos de bacterias endófitas-diazótrofas
a partir de tallos de cañas de las variedades comerciales plantadas. Se pretende
caracterizar e identificar los aislamientos mediante técnicas morfológicas y
moleculares. Resultados preliminares serán presentados
Financiación: INIA-FPTA, ANII
101
P89)
DIAGNÓSTICO
Y
CARACTERIZACIÓN
MOLECULAR
DE
SUBESPECIES DE CAMPYLOBACTER FETUS CIRCULANTES EN GANADO
BOVINO URUGUAYO
IRAOLA, G1; HERNÁNDEZ, M1; CALLEROS, L1; SILVEIRA, S2; CARRETTO, L1; PÉREZ,
R1
1Sección Genética Evolutiva, Facultad de Ciencias, Universidad de la República
2Laboratorio “Miguel C. Rubino”. Dirección de Laboratorios Veterinarios,
Ministerio de Ganadería Agricultura y Pesca.
La campylobacteriosis bovina es una enfermedad infecciosa que provoca
infertilidad crónica y abortos esporádicos en ganado bovino. El agente causante es
la épsilon-proteobacteria Campylobacter fetus. Existen dos subespecies de esta
bacteria, denominadas Campylobacter fetus fetus y Campylobacter fetus
venerealis, que presentan importantes diferencias en la virulencia y en sus
manifestaciones clínicas.
En este trabajo describimos la aplicación de herramientas moleculares para el
diagnóstico y caracterización de las subespecies de C. fetus circulantes en
Uruguay. El objetivo es desarrollar métodos de diagnóstico molecular y generar
información, a nivel de secuencias de ADN, que sea útil en el estudio de la
epidemiología y evolución de este patógeno en nuestro país.
Para la investigación se utilizaron cepas de referencia de ambas subespecies y una
muestra de campo uruguaya aislada en el 2008. Esta muestra fue previamente
tipificada como C. fetus venerealis por métodos bacteriológicos tradicionales
(ensayos de crecimiento en medios selectivos y producción de metabolitos), según
las recomendaciones internacionales de detección de este patógeno.
Se estandarizaron protocolos de PCR en base a primers descritos en la bibliografía
para amplificar fragmentos de los genes para el ARNr 16S, cstA y virB11 específicos
del género Campylobacter, la especie C. fetus y la subespecie C. fetus venerealis
respectivamente. Los productos de PCR fueron secuenciados automáticamente y
las secuencias comparadas con aquellas depositadas en la base de datos del
GenBank. Las cepas de referencia fueron amplificadas por los primers específicos
de género y especie. El primer específico de C. fetus venerealis amplificó solo en
la cepa de referencia correspondiente.
En la cepa de campo se obtuvieron amplificaciones con los tres juegos de primers.
El análisis de nuestras secuencias indicó una alta homología con secuencias de
aislamientos de otras partes del mundo. Nuestros resultados indican la factibilidad
del diagnóstico molecular de este patógeno en bóvidos uruguayos.
102
P90) UNA CASEÍNO-QUINASA (I) SEÑALIZA EL DESTINO DE LOS
TRANSPORTADORES DE AMINOÁCIDOS EN ASPERGILLUS NIDULANS
HARISPE, L.1,2,3; APOSTOLAKI, A1; RINCÓN, A2; PEÑALVA, MA3 Y C. SCAZZOCCHIO1,4.
1
Institut de Génétique et Microbiologie, Université Paris-Sud XI, Francia.2Facultad de
Ciencias, Univ. de la República, Uruguay. 3Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC,
España.4Department of Molecular Microbiology and Infection, Imperial College, Reino Unido.
En este trabajo se establece que una caseíno-quinasa de tipo I (CKI), esencial para el
hongo ascomiceto filamentoso A. nidulans, se encuentra implicada de manera específica
en el tráfico subcelular de las permeasas de aminoácidos. El gen que codifica esta
quinasa, denominado aauZ, fue identificado mediante el aislamiento de dos mutaciones
recesivas, llamadas aauZ102 y aauZ1919, que impiden la utilización de aminoácidos
como fuente de nitrógeno y confieren resistencia a varios análogos tóxicos de
aminoácidos. Se demuestra aquí que ambas mutaciones impiden la utilización de los
aminoácidos prolina, glutamato y glicina como fuente de nitrógeno debido a la
incapacidad de las cepas de transportar estas sustancias a través de la membrana
plasmática. Se analiza el rol de la esta CKI en la distribución subcelular de las permeasas
de aminoácidos mediante la construcción de una fusión génica entre el marco abierto de
lectura de la permeasa AgtA (transportador de aspartato y glutamato) y la proteína
fluorescente verde (GFP) y se establece que ambas mutaciones impiden la expresión de
AgtA:GFP en la membrana plasmática, causando su re-direccionamiento hacia la vía de
los cuerpos multivesiculares. aauZ102 y aauZ1919 son mutaciones puntuales que, en cada
caso, llevan a la sustitución de un único aminoácido. El probable rol de esta quinasa en
la prevención de la endocitosis de una proteína de membrana constituye un desafío al
paradigma actual sobre el rol de las quinasas CKI en los transportadores de membrana
plasmática en hongos ascomicetos, según el cual, la fosforilación de estos
transportadores es necesaria para su internalización endocítica.
103
P91) SECUENCIACIÓN PARCIAL DE 2 GENOMAS DEL VIRUS DE LA
HEPATITIS C EN PACIENTES URUGUAYOS.
CASTELLS M., MORENO P., CAPPETTA M., CRISTINA J., COLINA R.
Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad
de Ciencias, Universidad de la República.
El virus de la Hepatitis C (HCV) es el mayor agente causal de hepatitis no A, no B,
post-transfusionales y parenteralmente adquiridas en todo el mundo. El genoma de
HCV está constituido por una única molécula de ARN de sentido positivo de
aproximadamente 9.7 Kb. Estudios de secuencias nucleotídicas obtenidas de
distintos pacientes y regiones geográficas del mundo han determinado la
existencia de seis genotipos y un número mucho mayor de sub-tipos. Estos
genotipos responden de manera diferente a las terapias antivirales y en la mayoría
de los países occidentales los mas predominantes son los subtipos 1a, 1b y 3a ,
mientras que en Uruguay es el genotipo 1. Actualmente es necesaria la
amplificación de al menos dos regiones del genoma de HCV para la correcta
asignación del genotipo y subtipo. Sin embargo para analizar el grado de
variabilidad genética y los posibles eventos de recombinación a lo largo de todo el
genoma viral, es necesario secuenciarlo en su totalidad.
Con el fin de secuenciar 2 genomas completos de HCV provenientes de pacientes
uruguayos, desarrollamos un protocolo unificado obtenido de los trabajos de Brach
& cols. 2006 y Yao & cols. 2005. Este procedimiento nos permite amplificar el
genoma completo en 6 regiones contiguas utilizando 16 pares de oligonucleotidos
específicos. Se realizó la transcripción reversa con hexámeros al azar, luego la
amplificación por nested PCR de las diferentes regiones, los productos fueron
purificados y finalmente secuenciados en la plataforma del IPMON. Mediante la
implementación de este método se logró la amplificación y secuenciación del 70%
de ambos genomas, los cuales pertenecen al genotipo 1, subtipo 1b. La obtención
de estas secuencias nos permitirá evaluar el grado de evolución de HCV en
Uruguay y la región así como identificar la emergencia de nuevas variantes
genéticas dentro del genotipo 1.
104
P92) ESTUDIO DE BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS AISLADAS DE
SUELO
AGUILAR, M., SOUBES, M. Y PIANZZOLA, M.J.
Cátedra de Microbiología, Facultad de Química.
[email protected]
CC1157. Montevideo, Uruguay.
Las bacterias sulfato reductoras (BSR) constituyen un grupo diverso de bacterias
anaerobias que llevan a cabo la reducción desasimilatoria de compuestos
sulfurados como sulfato, sulfito, tiosulfato, y el propio azufre a sulfhídrico. Varias
industrias incluidas la petrolera y del gas han sido afectadas por su actividad
metabólica y la causa fundamental es la producción de H2S, tóxico y corrosivo.
Dada la importancia ecológica y económica de las BSR nos planteamos el
relevamiento de su presencia en suelos de diferentes características de Uruguay.
El objetivo de nuestro trabajo es determinar el grado de diversidad de estas
bacterias en nuestros suelos y conocer su potencial de biocorrosión. Para ello
colectamos muestras de suelo con diferentes características geológicas, realizando
su estudio desde el punto de vista químico y microbiológico. Si bien el principal
obstáculo para entender su ecología y diversidad es la incapacidad de cultivar
muchos de los microorganismos que provienen de suelos esta dificultad puede ser
salvada mediante el empleo de técnicas moleculares que permiten estudiar los
microorganismos o sus genes, directamente sobre las muestras.
En este trabajo abordamos el estudio de BSR por métodos clásicos y moleculares
en los diferentes suelos estudiados. Se presentan los resultados de los análisis en
muestras de suelo provenientes de diversos puntos de cateo a lo largo de más de
400 km de tuberías de gas. Se optimizaron la detección a partir de
enriquecimientos y a partir de ADN genómico total de suelo a partir de primers
específicos. Paralelamente iniciamos el estudio de biodiversidad de las BSR y se
presentarán los avances obtenidos hasta el momento.
105
P93) ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA DE LOS TRANSPORTADORES
DE PURINAS EN Phanerochaete chrysosporium
BARRACO VEGA M., IBÁÑEZ C. Y CECCHETTO G.
Laboratorio de Microbiología, IQB, Facultad de Ciencias - Facultad de Química
Los basidiomycotas causantes de la podredumbre blanca de la madera se
encuentran en hábitats extremadamente pobres en nitrógeno lo que influye
directamente en la expresión de enzimas ligninolíticas. En este marco se comenzó
a estudiar el rol de las purinas bajo la hipótesis de que estos organismos
cenocíticos enfrentados a condiciones de falta de fuente de nitrógeno deberían
utilizar compuestos nitrogenados alternativos presentes en madera. Se demostró
que Phanerochaete chrysosporium utiliza purinas como fuente de nitrógeno y
posee transportadores específicos.
En el presente trabajo nos planteamos el estudio de la regulación transcripcional
de los genes de transportadores de purinas de P.chrysosporium (phU y phZ)
previamente clonados en el laboratorio.
Debido a que la técnica de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) no era de
rutina en nuestro laboratorio, inicialmente, se hizo la puesta a punto de la misma
mediante el estudio de un sistema similar y conocido: expresión de los
transportadores de purinas de Aspergillus nidulans.
Se diseñaron primers específicos para los genes phU, phZ, phacn y gpd de
P.chrysosporium.
phacn
(β-actina)
y
gpd
(Glyceraldehyde
3-fosfato
deshidrogenada) fueron elegidos como los genes normalizadores requeridos para
la cuantificación relativa. La especificidad de los amplicones se verificó mediante
en análisis de las curvas de melting y secuenciado de los productos. Se determinó
la eficiencia de amplificación de cada par de primers a partir de una curva de Ct
versus concentración de ADNc. El tiempo de inducción se determinó mediante
cinéticas de expresión entre las 2 horas y los 11 días luego del cambio de la fuente
de nitrógeno (shift), observándose el máximo de inducción a las 24 horas.
Agradecemos a ANII (Becas de iniciación y FCE)
106
P94) MICROARRAYS: APLICACIONES AL ESTUDIO DE RALSTONIA
SOLANACEARUM (IIB1) Y DESARROLLO DE MÉTODOS DE DETECCIÓN.
SIRI M.I.1, BOUCHER C.2, PIANZZOLA M.J.1
1
Cátedra de Microbiología, Facultad de Química, DEPBIO, UdelaR, Montevideo,
Uruguay; 2Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes, INRA, Toulouse,
Francia.
Ralstonia solanacearum es el agente causal del marchitamiento bacteriano,
enfermedad que afecta a más de 200 especies vegetales. Este amplio rango de
hospederos se ve reflejado por su gran diversidad a nivel infraespecífico. La
clasificación actual establece la existencia de cuatro filotipos, los cuales se
subdividen en varios secuevares. En particular, las cepas pertenecientes al filotipo
II, secuevar 1 (IIB1) son las que afectan al cultivo de papa, ocasionando
importantes pérdidas económicas en todo el mundo. En este trabajo se presentan
los resultados de un estudio de hibridación genómica comparativa sobre una
colección uruguaya de cepas de R. solanacearum IIB1. Para ello, se utilizó un chip
de microarrays construido a partir de la secuencia genómica de tres cepas de R.
solanacearum pertenecientes a distintos filotipos. Esta tecnología permite realizar
comparaciones genómicas a gran escala estableciendo el repertorio de genes
presentes en cada cepa analizada, evidenciando diferencias genéticas entre cepas
de distinto tipo. Los resultados obtenidos se utilizaron con dos enfoques
diferentes. Por un lado, se generó una lista de 70 genes y 15 secuencias
intergénicas presentes exclusivamente en cepas de R. solanacearum IIB1 que luego
fueron validados por PCR. Estas secuencias constituyen blancos ideales para el
desarrollo de métodos de detección más sensibles y específicos que contribuyan a
un mejor control de su diseminación. Por otro lado, los resultados generados se
contrastaron con los datos de agresividad, generando una lista de genes candidatos
de patogenia presentes en las cepas con mayor agresividad y ausentes en cepas
poco agresivas. En esta lista se destacan varios genes que podrían estar
involucrados en la interacción con el hospedero y explicar las diferencias de
agresividad observadas. Estos determinantes genéticos serán validados y se
emprenderá un análisis funcional de forma de profundizar en el conocimiento
sobre los mecanismos de virulencia de este importante patógeno.
107
P95) ESTRATEGIAS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE
FUSARIUM EN TRIGO
UMPIÉRREZ, M.A;GARMENDIA, G.A; RUFO, C.B; RODRÍGUEZ, A.C; PEREYRA, S.;D
VERO, S.A
a
Cátedra de Microbiología-DEPBIO, Facultad de Química; bÁrea Alimentos, cÁrea
Análisis Químicos, Polo Tecnológico de Pando-Facultad de Química; d INIA La
Estanzuela. e-mail:[email protected]
La fusariosis es una de las enfermedades más destructivas y la que causa, a nivel
mundial, mayores pérdidas económicas en trigo, cebada y otros granos. Nuestro
país no ha sido la excepción a este problema, registrándose en la década pasada
brotes moderados o severos de la misma. El principal agente etiológico de esta
enfermedad, a nivel mundial, es el Fusarium gramineraum. Dentro de esta especie
se han reconocido 13 linajes diferentes, los cuales según O´Donnell et al. (2004) y
Starkey et al. (2007) son filogenéticamente diferentes y deben ser considerados
como especies diferentes. Los hongos pertenecientes a este grupo producen
tricotecenos del tipo B y se pueden agrupar en tres quimiotipos diferentes:
quimiotipo NIV, aquellos que producen nivalenol y derivados acetilados,
quimiotipo 3ADON, aquellos que producen deoxynivalenol y 3-acetildeoxynivalenol y quimiotipo 15ADON, aquellos que producen deoxynivalenol y 15acetil-deoxynivalenol.
El presente trabajo estudia la diversidad de hongos causantes de la fusariosis de la
espiga de trigo en Uruguay, buscando determinar la correlación con el nivel de
micotoxinas presentes en los granos. A partir de granos contaminados de la
cosecha 2008 de distintos puntos del país, se aislaron cepas de Fusarium que
fueron identificadas a nivel de especie realizando la amplificación y secuenciación
de la región del Factor de Elongación de la traducción 1 alfa (Tef 1-alfa). Sumado
a esto y con el fin de disminuir costos y tiempo de análisis, se diseñó una técnica
de RFLP de dicha región y un método de RAPD que permite determinar perfiles
diferentes para cada especie. Asimismo, se puso a punto un método para la
determinación de micotoxinas (deoxynivalenol, nivalenol, 15acetildeoxynivalenol y
3acetildeoxynivalenol) en granos contaminados, por cromatografía líquida
acoplada a un espectrómetro de masa como detector.
108
P96) EVIDENCIA DE RECOMBINACIÓN EN POBLACIONES NATURALES
DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C (VHC).
MORENO P, ALVAREZ M, LOPEZ L, MORATORIO G, COLINA R, CRISTINA J.
Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad
de Ciencias, UdelaR.
Los eventos de recombinación, el alto grado de mutaciones y la dinámica de
cuasiespecies le confieren a los virus de ARN una gran adaptabilidad lo cual
represente uno de los mayores obstáculos para la prevención y control de las
enfermedades causadas por estos virus. Han sido descritos eventos tanto de
recombinación inter como intragenotípica en poblaciones naturales de VHC
pertenecientes a diferentes regiones geográficas como Rusia (2k/1b), Perú
(1a/1b), Vietnam (2/6), Filipinas (2b/1b), Francia (2/5), Uzbekistan (2k/1b),
Japón (1a/1c) e Irlanda. Viendo la importancia que tiene la recombinación en la
evolución de los virus de ARN, es fundamental determinar el rol que tiene la
recombinación en la evolución de VHC tanto en pacientes crónicos como en
poblaciones de cuasiespecies cuando los pacientes son sometidos a terapia
antiviral. Con el fin de realizar estos estudios se analizaron por un lado 10 cepas
de VHC provenientes de pacientes crónicos y por otro lado secuencias de
poblaciones de cuasiespecies del gen NS5A de VHC provenientes de pacientes
sometidos a terapia antiviral. Los estudios de recombinación se llevaron a cabo
utilizando los programas GARD y Simplot. Se utilizó el programa LARD para
determinar si el modelo de recombinación tenia mejor soporte estadístico que el
modelo de no recombinación. Los resultados de este trabajo muestran la presencia
de una cepa de VHC recombinante 1b/1a circulante en un paciente crónico y la
presencia de un recombinante intrapaciente circulando en un paciente sometido a
terapia antiviral. Estos resultados junto con nuevos estudios realizados
recientemente a nivel de recombinación intrapaciente sugieren que los eventos de
recombinación en VHC, hasta ahora subestimados, deben ser considerados como
un mecanismo potencialmente importante en la generación de diversidad genética
con importante implicancias en el desarrollo de vacunas y terapias antivirales
efectivas.
109
P97) IYSV EN URUGUAY: AMENZA EMERGENTE PARA LA PRODUCCION
DE CEBOLLA
ACHIGAR R. GALVÁN G. PIANZZOLA M.J.
Cátedra de Microbiología, Departamento de Biociencias Facultad de Química,
UdelaR.
Iris Yellow Spot Virus (IYSV) es un miembro del género Tospovirus (familia
Bunyaviridae), virus fitopatógenos transmitidos por trips. Es el causante de alrededor
de cien millones de dólares al año en pérdidas para los productores de semillas de
cebolla únicamente en el oeste de E.E.U.U. En el año 2005 fueron observadas por
primera vez plantas con síntomas característicos en nuestro país, cuya presencia fue
confirmada en 2006 por pruebas serológicas. Con el objetivo de validar este
resultado nos enfocamos en optimizar las técnicas de detección mediante RT – PCR y
Real Time – PCR a partir de muestras sintomáticas recolectadas en el año 2007.
Además, a los efectos sanitarios es fundamental contar con una técnica sensible que
nos permita detectar la presencia precoz del virus y el estudio de la dispersión del
IYSV en cultivos comerciales. Luego procederemos al análisis de muestras de cebolla
recolectadas este año y de plantas autóctonas con el fin de determinar un posible
reservorio.
Paralelamente nos enfocaremos al análisis filogenético tanto del género como de la
especie, con el fin de obtener una filogenia más completa y robusta que las hasta
ahora publicadas y determinar el posible origen de la cepa nacional.
Hemos optimizado la detección del virus mediante RT – PCR con primers específicos
obtenidos a partir de la bibliografía, los cuales amplifican un fragmento del gen N
(nucleocápside viral).
En lo que respecta al análisis filogenético, tenemos resultados preliminares que
apoyan la hipótesis de la existencia de tres grandes clados. Los mismos poseen la
característica distintiva de tener como vector de transmisión géneros diferentes de
trips. Además el clado más cercano a la raíz de nuestro árbol preliminar, ha
reportado su presencia hasta el momento únicamente en Asia, lo que podría dar
indicios del posible origen del género.
110
P98) ESTRÉS OSMÓTICO Y LUMÍNICO SOBRE Calothrix sp; UNA
CIANOBACTERIA AISLADA DE ARROZALES URUGUAYOS.
DOLDÁN, S; PÉREZ, G; BORSANI, O. E IRISARRI, P.
Laboratorio de Bioquímica, Depto. de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía.
Las cianobacterias evolucionaron hace tres billones de años, por lo que han
sobrevivido a diversos tipos de estrés ambientales como temperaturas extremas,
salinidad, sequía, estrés osmótico y lumínico. Su amplia distribución denota una
gran habilidad para adaptarse a hábitats muy diversos.
Además de su importante contribución a la producción fotosintética de biomasa,
algunas cianobacterias son capaces de fijar nitrógeno atmosférico, siendo así una
importante fuente de nitrógeno para ecosistemas acuáticos y terrestres.
El potencial agronómico de las cianobacterias como biofertilizantes de arrozales
ha sido ampliamente estudiado. Sin embargo, la viabilidad y potencial fijador de
nitrógeno de estos microorganismos son afectados por diversos factores de estrés.
Los niveles de radiación UV-B que alcanzan la superficie de la tierra han
aumentado considerablemente en los últimos años. Esta radiación posee un gran
potencial de daño a nivel celular por su efecto directo sobre proteínas y ADN, e
indirecto al generar especies reactivas del oxígeno.
Las condiciones de estrés individuales son objeto de muchas investigaciones, sin
embargo, en el campo las cianobacterias están expuestas a la combinación de
diferentes estreses. La falta de sobrevivencia del inoculante en el campo puede
deberse a la suma de incidencia de luz UV, sequía y otros factores de estrés.
El objetivo del presente trabajo fue estudiar los efectos de la luz ultravioleta en
conjunto con estrés osmótico sobre algunos parámetros bioquímicos en Calothrix
sp. Entre los resultados obtenidos hasta el momento cabe destacar la disminución
de la relación Fv/Fm al aumentar el tiempo de exposición a ambos factores de
estrés, siendo este resultado un indicador de daño en el aparato fotosintético.
También se cuantificó la peroxidación de lípidos usando el método de TBARS. Se
estudiaron algunas de las respuestas frente a estrés como actividad de enzimas
antioxidantes, acumulación de prolina y de compuestos del tipo de las
micosporinas.
111
P99) EFECTO DE CODONES SINÓNIMOS EN LA FUNCIONALIDAD Y
LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DE UNA PROTEÍNA DE MEMBRANA DE
ASPERGILLUS NIDULANS
SIGNORELLI S, SANGUINETTI M, MARIN M Y RAMÓN A.
Sección Bioquímica, Depto. de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias
Los mecanismos moleculares que gobiernan el plegamiento de una proteína aún no
se comprenden en su totalidad. Entre éstos, se propone que el uso de codones
rápidos o lentos podría modular la velocidad de traducción de un ARNm y así
favorecer determinadas interacciones en la cadena polipeptídica naciente,
determinando su conformación final. Como una aproximación para contribuir a
elucidar este fenómeno, proponemos utilizar Aspergillus nidulans como sistema
eucariota en el que se puede estudiar fácilmente in vivo el efecto de mutaciones
sinónimas en la funcionalidad de una proteína de membrana, UreA, el
transportador específico de urea en este organismo.
Se estudió la secuencia de ureA determinando el uso de codones en la misma, así
como la estructura secundaria y las regiones transmembrana predichas
bioinformáticamente en la proteína UreA. Se predice una secuencia de anclaje a la
membrana con un alto contenido de codones rápidos, así como “clusters” de
codones rápidos o lentos en otros dominios de la proteína, algunos conservados en
los homólogos putativos de UreA en otras 7 especies de Aspergillus. Estamos
llevando a cabo la sustitución de estos codones por sus sinónimos de tipo contrario
y la fusión de las proteínas mutadas con la GFP para estudiar el efecto de las
mismas sobre la estructura de la proteína, su funcionalidad y su destino dentro de
la célula.
112
P100) DIVERSIDAD MOLECULAR DE LA COMUNIDAD DIAZÓTROFA EN
SUELOS AGRÍCOLAS
HAGHJOU,T1; BAJSA,N1,2; AZZIZ,G1; ARIAS,A1.
1
Laboratorio de Ecología Microbiana, Instituto de Investigaciones Biológicas
Clemente Estable (IIBCE). Av. Italia 3318. CP 11600. Montevideo, Uruguay. Unidad
Asociada a Facultad de Ciencias, UdelaR.2 Sección Bioquímica. Facultad de
Ciencias, UdelaR. Iguá 4225. CP 11400. Montevideo, Uruguay.
La diversidad microbiana en el suelo es de gran importancia para una agricultura
sustentable. Las prácticas agrícolas pueden afectar la estructura de las
comunidades microbianas y por lo tanto las funciones de las mismas. La rotación
de cultivos es una práctica agrícola sustentable y ha sido incorporada por los
productores en Uruguay. Sin embargo, se desconoce su impacto sobre las
comunidades microbianas del suelo. Las bacterias diazótrofas cumplen una función
económica y ambientalmente importante, ya que el nitrógeno atmosférico debe
ser reducido para poder ser asimilado por las plantas. El objetivo de este trabajo
fue evaluar el impacto de diferentes sistemas de rotaciones sobre la diversidad de
la comunidad diazótrofa. A partir del ADN extraído del suelo de las estaciones
experimentales INIA-La Estanzuela e INIA-Treinta y Tres, se amplificó un
fragmento del gen nifH por PCR nested y posteriormente se analizó la estructura
de la comunidad mediante la técnica molecular DGGE (electroforesis en gel con
gradiente desnaturalizante). Asimismo se determinó la abundancia de esta
comunidad y de heterótrofas totales por la técnica de recuento en placas. En el
ensayo de La Estanzuela se detectó un cambio en la estructura de la comunidad
diazótrofa en el tratamiento de agricultura continua respecto a los tratamientos
de rotación con pasturas, y en el tratamiento de agricultura continua con
fertilizantes la estructura de la comunidad resultó más similar a alguna de las
rotaciones. En el ensayo de Treinta y Tres, la estructura de la comunidad no se
relacionó con el tratamiento agrícola. Respecto al análisis de la abundancia de las
bacterias diazótrofas y heterórofas totales, se observó que en ambas estaciones
experimentales, la introducción de pasturas resultó en un aumento en el número
de ambos grupos funcionales respecto a la agricultura continua de cultivos de
grano.
113
P101)
CARACTERIZACIÓN
DE
COMUNIDADES
MICROBIANAS
TERRESTRES DE LA ISLA REY JORGE (PENÍNSULA FILDES- ANTÁRTIDA
MARÍTIMA)
ANTELO, V.1 Y BATISTA, S.1
1
Unidad Microbiología Molecular, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente
Estable. Av. Italia 3318. Montevideo, CP11600. Uruguay. [email protected]
Palabras claves: bacteria, antibiótico, gasoil.
Estudiamos las comunidades microbianas terrestres que se desarrollan durante el
período estival en la península Fildes (Isla Rey Jorge). Se trabaja con muestras
colectadas en áreas bajo evidente influencia humana, animal y otras en zonas
presuntamente prístinas. Se generó una colección de organismos aislados y se
efectuó un estudio de perfiles de crecimiento al ser cultivados en dos condiciones
ambientales definidas: presencia de antibióticos y gasoil.
Los aislamientos capaces de crecer en medio LB a 5ºC y 24ºC, fueron cultivados en
ese mismo medio para establecer un perfil de resistencia a antibióticos a
diferentes concentraciones (Ampicilina, Kanamicina, Streptomicina y Ácido
Nalidíxico). Mediante el análisis de secuencia de parte del gen 16S ARNr, se
identificó primariamente algunos aislamientos especialmente resistentes como
Bacillus thuringiensis, Stenotrophomonas sp., Pseudomonas fluorescens.
Las muestras extraídas en suelos cerca de los tanques de depósito de combustible
y la costa frente al pasaje Drake, fueron utilizadas para inocular matraces con
medio salino-gasoil 0.2%.. Estos matraces se incubaron a 5 y 24ºC con agitación.
Las suspensiones se subcultivaron en el mismo medio cada 5 días, y las mismas
fueron utilizadas para generar un conjunto de aislamientos puros capaces de
crecer en esas mismas condiciones. Se identificó primariamente estos organismos
como Pseudomonas putida y Pseudomonas migulae. Actualmente estamos
intentando determinar el perfil de degradación del gasoil por las dos comunidades
y los aislamientos cultivados.
Este trabajo se enmarca en la identificación de elementos de transferencia
horizontal (TH) como los integrones, y su asociación con mecanismos de
resistencia a condiciones ambientales adversas. Se purificó el ADN ambiental de
las muestras colectadas y se lo utilizó como templado en reacciones de PCR
dirigidas a amplificar genes integrasa Clase I y genes cassette asociados.
FINANCIACIÓN: IAU, ANII, PEDECIBA.
114
P102) DETECCION Y CONFIRMACION DE LOS VIROIDES CITRICOS
PRESENTES EN URUGUAY A PARTIR DE MUESTRAS EXTRAIDAS DE
CAMPO
PAGLIANO, G1, UMAÑA, R1 Y PRITSCH C1.
1
Laboratorio de Biotecnología, Facultad de Agronomía, UdelaR.
Los viroides presentes en las plantaciones citrícolas de Uruguay son CEVd (Citrus
Exocortis Viroids), CBLVd (Citrus Bent Leaf Viroids), HSVd (Hop Stunt Viroids) y
CDVd (Citrus Darwarfing Viroid). En el año 2000 éstos viroides han sido detectados
y caracterizados mediante sPAGE seguido de Northern y/o Dot o Slot blot,
mediante hibridación molecular con sondas específicas marcadas con digoxigenina
a partir de muestras de tejido de planta indicadora Cidro Etrog 861.
En la actualidad se dispone de una nueva metodología desarrollada por Murcia N.,
2008. Con el uso de ésta metodología adaptada a nuestras condiciones se ha
podido confirmar la presencia de los viroides previamente descriptos presentes en
nuestro país (CEVd, CBLVd, HSVd y CDVd) a partir de cortezas de rama de árboles
a campo. La metodología consiste en extracción de ARN (Semancik,1975), PAGE
seguido de Northern, fijación de la membrana con cross linking, hibridación con
sondas marcadas con digoxigenina y autorradiografía con sustrato CSPD. La
metodología ha sido ensayada con éxito para todas las variedades de citrus y en
cualquier época del año y aún a partir de tejidos congelados.
Los resultados reflejan alta especificidad, sensibilidad y rapidez, evitando la etapa
de indexing de plantas indicadoras, donde la expresión de síntomas requiere de 1 a
3 meses bajo condiciones controladas. El límite de detección obtenido se
encuentra entre 4-8mg de tejido infectado. Se confirma que en nuestras
plantaciones citrícolas los viroides presentes antes mencionados aparecen en
combinaciones de dos o más viroides, detectados inicialmente con las técnicas
previamente empleadas.
Hoy la ciencia demanda y es una necesidad disponer de métodos moleculares
sensibles, específicos, sencillos, de bajo costo y rápidos para la incorporación en
el Programa de Certificación, Sistemas Cuarentenarios y en el control de los
bancos de germoplasma existentes en nuestro país.
Palabras claves: detección, viroides cítricos, PAGE-Northern, Uruguay.
115
INMUNOLOGÍA
P103-P108
P103) PRIMERA ESTRUCTURA CRISTALOGRÁFICA DE UNA IGA1
HUMANA.
CORREA A, TRAJTENBERG F, OBAL G, PRITSCH O, OPPEZZO P, BUSCHIAZZO A.
Institut Pasteur de Montevideo, Unidad de Biología Estructural, Montevideo,
Uruguay
El conocimiento de las estructuras tridimensionales de las inmunoglobulinas ha
generado información esencial sobre el reconocimiento antigénico. A pesar de
contar con cerca de 300 estructuras de fragmentos Fab de IgG humanos, al
presente solo hay una estructura cristalográfica de un Fab de IgA de ratón (PDB
2FBJ). La mayor dificultad en la obtención de estructuras cristalográficas de IgA1
humana se debe a la presencia de varios sitios O-glicosilados en la región bisagra.
Este patrón de glicosilación es heterogéneo, dificultando la purificación y
posterior cristalización. Es bien sabido que el tener una muestra homogénea es
uno de los requerimientos más importantes para la obtención de cristales de
buena calidad. Para superar este obstáculo se produjeron fragmentos Fab
cortando con la proteasa recombinante de Clostridium ramosum, la cual corta
específicamente la IgA1 humana en el extremo amino terminal de la región
bisagra, liberando así fragmentos Fab sin sitios de glicosilación. En este trabajo
se utilizó una IgA1 monoclonal purificada del suero de un paciente con linfoma
inmunocítico, lo que permitió la obtención de las cantidades necesarias de una
IgA1 nativa para los distintos ensayos de cristalogénesis. Con esta metodología se
lograron resolver dos estructuras cristalográficas diferentes a alta resolución (1.5
y 2.3 Å), reportándose así la primera estructura cristalográfica de un fragmento
Fab de la IgA1 humana. Además nuestro trabajo muestra una herramienta de
gran utilidad para estudios posteriores en el área inmunológica.
116
P104) PRODUCCIÓN DE ANTIGENO PARA EL DIAGNÓSTICO DE
LEUCOSIS BOVINA ENZOÓTICA.
FURTADO, A.; ALGORTA, A.; ALVAREZ, J.; DE BRUM, L.; PUENTES, R
Área de Inmunología – Facultad de Veterinaria – Universidad de la Republica –
URUGUAY.
Leucosis Bovina Enzoótica (BLV) es una enfermedad causada por un Retrovirus,
con alta repercusión en la producción lechera de nuestro país. Las
manifestaciones clínicas son caracterizadas por linfosarcomas (neoplasias
malignas) y linfocitosis persistente. Sin embargo, solamente el 5% de los
animales infectados, evolucionan hacia la formación neoplásica, siendo el
restante asintomático, pudiendo contagiar la enfermedad a otros animales. Esto
hace que la vigilancia epidemiológica a partir de la detección de anticuerpos
específicos contra BLV, sea una herramienta fundamental en el control de la
enfermedad. La Inmunodifusión en gel agar (IDGA) es una de las técnicas
serológicas más utilizadas a nivel mundial y es una de las recomendadas por la
Organización Internacional de Epizootias (OIE) para el diagnóstico de esta
enfermedad. El objetivo de este trabajo fue la producción de antígeno de
Leucosis Bovina, para su utilización en la técnica de IDGA. Para esto, se propago
el virus utilizando la línea celular FLK y se precipitó con Sulfato de Amonio las
proteínas virales. Luego el antígeno fue enfrentando a un panel de 50 sueros
bovinos, comparando los resultados con un Kit de IDGA comercial de la Facultad
de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de La Plata - Argentina. Los
resultados demostraron una concordancia de 94% entre ambas técnicas. En este
momento se están procesando más sueros de bovinos elegidos al azar, con el fin
de validar la técnica y posibilitar su utilización en el diagnóstico de Leucosis
Bovina Enzoótica en el Uruguay.
117
P105) TERAPIA GÉNICA DEL CARCINOMA HEPATOCELULAR Y
DIAGNÓSTICO DE TUMORES HEPÁTICOS CON MICRO-PET
ZABALA M.1, LASARTE J.J1, PEÑUELAS I.2, PERRET C.3, PRIETO J.1,4, KRAMER M.G1
1
División de Hepatología y Terapia Génica, Centro de Investigación Médica
Aplicada (CIMA), Pamplona, España. 2Departamento de Medicina Nuclear y
4
Medicina Interna, Clínica Universitaria de Navarra, España. 3Institut Cochin,
Institut de la Santé et de la Recherche Medicale, París, Francia.
El carcinoma hepatocelular (HCC) se encuentra entre las cinco principales causas
de muerte por cáncer en el mundo. Dado que los tratamientos curativos son
aplicables a un número muy limitado de pacientes es necesario desarrollar
nuevas terapias y técnicas para la detección precoz de esta enfermedad. La
interleuquina 12 (IL-12) posee un potente efecto antitumoral aunque puede ser
tóxica si se administra de forma sistémica. En este trabajo evaluamos una
estrategia de terapia génica con IL-12 en un modelo murino de HCC. Empleamos
ratones transgénicos que sobre-expresan el oncogen c-myc en el hígado (L-PK/cmyc) y desarrollan tumores hepáticos con características similares a HCCs
aislados de pacientes. A un grupo de ratones se le administró un vector
conteniendo un sistema que permite inducir la expresión de IL-12 con doxiciclina
de forma específica de hígado. Al cabo de varias rondas de inducción de IL-12
observamos una clara inhibición del crecimiento tumoral en 40% de los animales
tratados. La respuesta al tratamiento no se vio correlacionada con los niveles de
IL-12 e IFNapoptóticos o de estimulación de proliferación en los tumores. Sin embargo,
observamos un mayor número de linfocitos T reguladores y un aumento de
moléculas inmunosupresoras en HCCs extraídos de animales no respondedores.
Con el fin de detectar HCC ensayamos distintos trazadores usando un Philips
Mosaic microPET scanner. El análisis combinado de las medidas con 18FDG y 11CColina permitió visualizar 78% de las lesiones tumorales en ratones L-PK/c-myc.
Concluimos que la terapia génica basada en la expresión intrahepática de IL-12
es parcialmente efectiva en un modelo murino de HCC, puesto que la respuesta
antitumoral puede verse afectada por mecanismos inmunosupresores. El análisis
combinado de imágenes obtenidas con 18FDG y 11C-Colina podría utilizarse como
herramienta para incrementar el diagnóstico de HCC en pacientes.
118
P106) REDES DE ACTIVACIÓN E INHIBICIÓN CELULAR EN EL SISTEMA
INMUNE: ESTRUCTURA VERSUS FUNCIÓN.
GIBERT, J.P.1; MASNER, M.; MONIN, L.2 & CABANA, A.3
1
: Sección Paleontología, Facultad de Ciencias, UdelaR
: Departamento de Inmunobiología, Facultad de Medicina, UdelaR
3
: Sección Biofísica, Facultad de Ciencias, UdelaR
2
El estudio del sistema inmune se ha focalizado tradicionalmente en los
mecanismos moleculares y celulares que llevan a la activación de las distintas
vías de respuesta. A pesar de la valiosa información obtenida de este modo, aún
queda mucho por hacer para comprender su funcionamiento como un todo. El
estudio de sistemas altamente complejos como el sistema inmune, requiere pues
de aproximaciones multidisciplinarias que permitan obtener resultados
holísticos. Así fue que en un trabajo anterior se compiló y analizó la red de
interacciones documentadas del sistema inmune. Los nodos fueron definidos
como poblaciones celulares que participan en la respuesta inmune; las aristas
como interacciones directas (dependientes de contacto) e indirectas (mediadas
por citoquinas). En este trabajo, se analizaron dos subredes de la red inicial. La
primera solo considera las interacciones que llevan a la activación de las
poblaciones celulares. La segunda de ellas solo considera las interacciones de
tipo inhibitorio. Se estudiaron aquellas propiedades estructurales que permiten
echar luz sobre los procesos biológicos subyacentes a la estructura y evolución de
la red (en este caso: conectancia, coeficiente de clustering, distribución del
grado y análisis de clusters). La red de interacciones positivas posee una
distribución del grado lineal, tal como la exhibida por la red original. Esto es
importante porque manifiesta la presencia de nodos altamente conectados. El
análisis de clusters reveló grupos bien definidos en la red de activación. Éstos
contienen poblaciones celulares que actúan en respuestas de activación
específicas (e.g. tipo 1 y 2). La red de inhibición también mostró este
comportamiento, aunque de manera menos marcada. La estructura de ambas
redes muestra pues un compromiso entre la especificidad de las vías de
respuesta y la redundancia del cableado, así como una clara jerarquización tanto
en la activación del sistema inmune como en su inhibición.
119
P107) PROTEÍNAS S100 DE FAGOCITOS
INFLAMATORIA EN LA HIDATIDOSIS
EN
LA
RESPUESTA
BASIKA T1, MUÑOZ N1, CASARAVILLA C1, IRIGOÍN I1, DURÁN D2, BONILLA M1,
SALINAS S1, PACHECO JP3, ROTH J4 & DÍAZ A1
1. Cátedra de Inmunología, DEPBIO, Facultad de Química, UdelaR. 2. UBYPA.
Instituto Pasteur Montevideo. 3. Departamento de Patología. Facultad de
Veterinaria. UdelaR. 4. Institute of Immunology, University of Münster,
Alemania.
Las proteínas S100 específicas de fagocitos (S100A8, S100A9 y S100A12) tienen
papeles importantes pero mal comprendidos en procesos inflamatorios. La
infección por la larva de Echinococcus granulosus (hidatidosis) normalmente
cursa con control de la inflamación del hospedero. Sin embargo, esto admite
excepciones, de las cuales la más extrema es la infección de bovinos por la cepa
más extendida (ovina) del parásito. En este sistema se desarrolla una respuesta
granulomatosa, cuyos productos de secreción se suelen encontrar asociados con
la pared de la hidátide. A partir de una observación inicial de presencia de
S100A8 y S100A9 en hidátides de infecciones experimentales en ratón, quisimos
profundizar en la expresión de proteínas de esta familia en respuesta a la
hidátide en hospederos naturales, incluyendo el bovino. Encontramos que en
extractos de paredes quísticas de infecciones bovinas, una banda proteica
dominante corresponde a S100A12. La identificación proteómica fue confirmada
por inmunoblot, usando un anticuerpo generado contra la S100A12 bovina, que
fue expresada en forma recombinante. En un panel de muestras bovinas, la
S100A12 se encontró consistentemente, en abundancias que correlacionaron con
el grado de inflamación, determinado histológicamente. Entre las células de la
reacción del hospedero, la S100A12 se localizó, por inmunohistoquímica,
principalmente en los macrófagos epitelioides que forman la primera capa
celular adyacente a la pared quística y, en menor medida, en fibroblastos
activados. Los macrófagos epitelioides también mostraron inmunoreactividad
para S100A9; sin embargo, ni S100A9 ni S100A8 fueron detectadas a nivel
proteómico, sugiriendo que sus niveles de expresión deben ser menores que el de
S100A12. Nuestros resultados, en conjunto con publicaciones recientes, sugieren
que la S100A12 puede ser altamente expresada por macrófagos epitelioides,
tanto en contextos Th1 (sarcoidosis, tuberculosis) como en contextos sesgados
hacia Th2 (infección por un helminto).
Financiacion: PDT 54/078
120
P108) VALOR PRONOSTICO Y DIAGNOSTICO DE ANTICUERPOS ANTI
NITROTIROSINA EN ARTRITIS REUMATOIDEA
KEUSHKERIAN, M.1; CELANO, L. 1; SOSA, D.2; NAVILIAT, M. 2; Y THOMSON, L.1
1
Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias y 2 Instituto de
Reumatología de la Facultad de Medicina, Universidad de la República.
La artritis reumatoidea es una patología sistémica, crónica y de naturaleza
inflamatoria, en la que se encuentran involucradas especies oxidantes y
nitrantes. Nuestro objetivo es demostrar y caracterizar la capacidad de neoepitopos proteicos nitrados, previamente descritos en la sinovitis artrítica, de
desencadenar una respuesta autoinmune. Con este fin se obtuvo el suero de
pacientes portadores de Artritis Reumatoidea del Instituto Nacional de
Reumatología, y las correspondientes historias clínicas, radiología y pruebas
básicas de laboratorio clínico (factor reumatoideo, VES, hemograma,
proteinograma, etc.). El título de anticuerpos anti-nitrotirosina en el plasma de
los pacientes (0.52, n=34) fue significativamente (p0.001) superior al
encontrado en controles sanos (0.34, n=15). Con el fin de determinar el isotipo
de las inmunoglobulinas reactivas contra nitrotirosina en el plasma de los
pacientes artríticos se utilizó una columna de afinidad. Con las fracciones
obtenidas se realizó una electroforesis empleando SDS-PAGE al 10 %. El gel fue
luego revelado mediante tinción con nitrato de plata, obteniéndose en la
primera fracción unida a la columna dos bandas bien definidas correspondientes
al peso molecular de las cadenas pesadas de IgG e IgM (51 y 72 kDa,
respectivamente). Otro gel sembrado de la misma manera fue utilizado para el
ensayo de Western Blot mediante el cual se evidenció la presencia de IgG e IgM
en las bandas aisladas. Para determinar la capacidad antioxidante de las
muestras de plasma se realizaron ensayos de FRAP (Ferric Reducing Antioxidant
Power Assay).
121
BIOQUÍMICA, BIOFÍSICA Y BIOLOGÍA ESTRUCTURAL
P109-P134
P109) ESTUDIO DE ALGUNOS FENÓMENOS IÓNICOS DURANTE LA
CICATRIZACIÓN DE HERIDAS EN ENDOTELIO VASCULAR
EVANS, F. 1, HERNÁNDEZ, J.A.2, CHIFFLET, S.1
1
Depto. Bioquímica, Fac. Medicina, 2S. Biofísica, Fac. Ciencias, UdelaR
La cicatrización de heridas constituye un proceso complejo aún incompletamente
comprendido. Nuestro laboratorio encontró que durante la cicatrización de heridas
en endotelio de córnea de bovino en cultivo ocurre una despolarización del
potencial de membrana plasmática (PMP) a nivel de las células del borde de la
herida, consecuencia del incremento del sodio intracelular ([Na +]i). Esta es, a su
vez determinada por un aumento en la expresión del canal de sodio epitelial
(ENaC) y su inhibición retrasa de manera importante la cicatrización (Chifflet et
al, Am.J.Physiol.288:C1429,2005). Resultados análogos se encontraron en MDCK y
en epitelio de córnea de conejo en cultivo. El objetivo del presente trabajo fue
establecer si la respuesta cicatrizal de células de endotelio de aorta bovino (BAEC)
presenta fenómenos iónicos similares.
Los estudios de cicatrización se hicieron sobre monocapas confluentes de BAEC
realizando heridas empleando una aguja de jeringa. Los cambios en el PMP y en la
[Na+]i se determinaron utilizando las sondas fluorescentes oxonol V y CoroNa
Green, respectivamente. La expresión del ENaC se estudió mediante
inmunofluorescencia y la inhibición de este canal se realizó con fenamil. Durante
la cicatrización de BAEC no se encontraron cambios en el PMP a nivel de las células
del borde de la herida ni se constató un aumento de la [Na +]i o de la expresión de
ENaC. Sin embargo, la inhibición del ENaC disminuyó la velocidad de cicatrización
de BAEC. El hecho de que las células de endotelio vascular no presenten los
mecanismos iónicos de los epitelios mencionados anteriormente suscita la
investigación de otros fenómenos iónicos involucrados en su proceso cicatrizal.
122
P110) DETECCIÓN ELECTROQUÍMICA DE SECUENCIAS ESPECÍFICAS DE
ADN: DOS MÉTODOS DIRECTOS EN UN ÚNICO SENSOR.
TOSAR, J.P.; KEEL, K.; LAÍZ, J.
Unidad de Bioquímica Analítica. Centro de Investigaciones Nucleares
(CIN). Facultad de Ciencias, Universidad de la República.
Los genosensores de base electroquímica permiten una detección rápida y sensible
de secuencias específicas de ácidos nucleicos en muestras biológicas. A diferencia
de las técnicas actuales de biología molecular, su uso es compatible con la
fabricación de dispositivos automatizables para uso de campo. Esto permitiría,
por ejemplo, la detección de una amplia gama de agentes infecciosos en el propio
punto de atención del paciente, obteniéndose resultados al instante sin la
necesidad del envío de muestras al laboratorio. Sin embargo, este campo se
encuentra aún en estado incipiente. En el presente trabajo (1) se inmovilizaron
secuencias específicas de ADN a electrodos de oro/polipirrol. La detección de
secuencias complementarias se realizó amperométricamente mediante dos
métodos distintos e independientes. Se demostró que la inyección en la celda de
trabajo de secuencias de ADN complementarias a los oligonucleótidos
inmovilizados produce –en determinadas condiciones experimentales- un aumento
de la corriente eléctrica en el tiempo, debido a la oxidación de los nucleótidos de
guanina presentes en las secuencias inyectadas. Asimismo, la hibridación también
puede detectarse por voltamperometría cíclica, monitoreando cambios en los
picos de oxidación y reducción del polipirrol. Con este último método, se han
podido detectar secuencias específicas en una concentración de 53pM, frente a un
exceso de 2000x de secuencias no complementarias. Ambos métodos son directos;
las señales eléctricas en cuestión son producidas como consecuencia de la propia
reacción de bioreconocimiento, por lo cual no se requiere la adición de reactivos
indicadores de ningún tipo. Este aspecto, sumado al hecho de que pueden
combinarse dos métodos independientes de detección en un mismo dispositivo,
hace de esta una aproximación prometedora para el diseño futuro de genosensores
aplicables a uso de campo. El esfuerzo actual se centra en evaluar la performance
del biosensor en matrices biológicas complejas.
1)
J.P. Tosar, K. Keel, J. Laíz, Biosensors and Bioelectronics 24 (2009) 3036304
123
P111) EXPOSICION AGUDA DE CORAZON AISLADO A PLOMO,
PROVOCA FALLAS EN RITMO Y CONTRACCION CARDIACAS.
ROMPANI, J; SCHMIDT, A; COTA, C ; FERREIRA, J, BRUM, G Y FERREIRA G.
Laboratorio de Canales Iónicos. Departamento de Biofísica. Facultad de Medicina.
Universidad de la República.
El Plomo es un metal pesado capaz de producir intoxicación aguda o crónica en
humanos, ante la exposición aguda o crónica al mismo. Siendo no biodegradable,
las fuentes de contaminación se encuentran en un delicado equilibrio entre seres
vivos, agua, tierra, aire y alimentos. Es resultado de actividades industriales
humanas (naftas y aditivos, pinturas, baterías, etc) y como tal se registra un
aumento de casos a nivel internacional, en zonas de alto riesgo de exposición. Una
vez en el organismo, el Plomo penetra a distintas células, donde ejerce su acción
tóxica afectando sobre todo residuos de S, N y O a nivel de aminoácidos de
proteínas. En otros trabajos previos, hemos mostrado que los canales iónicos
constituyen una vía de entrada fundamental del Plomo a la célula (Rompani y col,
2007a,b). Como consecuencia se ve alterada la función cardíaca. Concentraciones
crecientes de plomo producen alteraciones de la contracción y ritmo cardíacos. A
bajas concentraciones de Plomo (10 a 50 uM), se altera el ritmo cardíaco
aumentando la frecuencia de extrasístoles ventriculares y alternancia de la
contracción. A concentraciones mayores (25 a 100 uM), es posible observar una
marcada disminución de la amplitud de la contracción junto con un aumento de la
tensión basal cardíaca. Los efectos fueron reversibles solamente a bajas
concentraciones.
Sorprendentemente, en condiciones de ausencia de Calcio extracelular,
concentraciones de Plomo 500 uM o mayores, son capaces de sustituir al Calcio y
provocar contracciones cardíacas alteradas en amplitud y duración, respecto a las
observadas en Calcio. La aplicación previa de DHP 1 uM, disminuye enormemente
este efecto sugiriendo un rol de los canales de Calcio L en la entrada de Plomo a la
célula. Estos resultados muestran efectos insospechados del Plomo a nivel
cardíaco. Futuras investigaciones aclararán mecanismos de producción de estas
alteraciones con trascendencia en Salud Pública.
124
P112) CAMBIOS EN NIVELES ENZIMÁTICOS BASALES DURANTE EL
CICLO DE CULTIVO DE CEBOLLA (Allium cepa L.)
GALEANO P1,2, GALVÁN GA2, FRANCO FRAGUAS L1
1
Cátedra de Bioquímica, DEPBIO, Facultad de Química, UdelaR.
Centro Regional Sur, Departamento de Producción Vegetal, Facultad de
Agronomía, UdelaR.
e-mail: [email protected]
2
Nuestro grupo ha reportado la participación de peroxidasas, glucanasas y
quitinasas en respuestas de defensa a patógenos fúngicos en cebolla. Estas
enzimas aumentaron su actividad en plantas expuestas a algunos patógenos. La
bibliografía describe resistencia en cebolla frente a Fusarium oxysporum asociada
a la edad, siendo mas susceptible en el estado de plántula y en el final del ciclo de
cultivo y más resistente durante la fase intermedia de crecimiento foliar. El
conocimiento de los niveles enzimáticos basales en las distintas etapas permitiría
inferir el rol de las enzimas en la resistencia asociada a la edad.
En este trabajo se estudió la variación durante el ciclo del cultivo en las
actividades basales de peroxidasas, β-1,3-glucanasas y quitinasas en distintos
órganos de cuatro variedades de cebolla. La actividad peroxidásica fue mayor en
raíces que en el resto de la planta en todas las edades, con cambios asociados a
variaciones en factores ambientales más que a la edad. La actividad peroxidásica
en hojas y falso tallo tendió a ser menor en plantas más adultas. El perfil de
isoperoxidasas fue diferente para cada órgano, se modificó conforme la planta se
desarrolló, y mostró escaso polimorfismo entre las cuatro variedades. La actividad
β-1,3-glucanasa fue mayor en raíces con valores máximos al estado de plántula. En
hojas la actividad aumentó con el desarrollo de las plantas, y en falso tallo fue
siempre mínima, aproximándose a cero al final del ciclo. La actividad quitinasa en
raíces y hojas fue similar, aumentando con la edad de la planta. En el falso tallo
esta actividad disminuyó con la edad, excepto en la variedad INIA Colorada que
mostró los mayores niveles al final del ciclo. En síntesis, estas enzimas varían para
distintos estados de desarrollo de la planta, y podrían participar en la resistencia
asociada a la edad.
Financiación: Proyecto INIA-FPTA Nº 250.
125
P113) EFECTO DE LA MELATONINA SOBRE LA EXPRESIÓN
ENDOMETRIAL DEL RECEPTOR DE PROGESTERONA EN OVEJAS
SUBNUTRIDAS
FERNÁNDEZ- FOREN A.1; VÁZQUEZ M.I. 2; GIMÉNEZ M.1; SARTORE I.1; ABECIA J.A.2;
FORCADA F.2; MEIKLE A.1
1
Laboratorio de Técnicas Nucleares, Facultad de Veterinaria. 2Producción Animal,
Universidad de Zaragoza, España
Se ha documentado que los tratamientos con melatonina (MEL) exógena son un
método efectivo para inducir la ciclicidad y aumentar la fertilidad, y contrarresta
los efectos de la subnutrición. Se estudió el efecto del tratamiento con MEL sobre
la expresión del receptor de progesterona –hormona de la preñez- (RP) en el
endometrio de ovejas post parto, alimentadas con una dieta 1,5xM (C) o 0,5xM (B)
veces sus necesidades de mantenimiento y tratadas (+MEL) o no (-MEL) con MEL
durante la estación reproductiva y el anestro estacional. Se estudió la intensidad
de tinción en epitelio luminal (EL), estroma superficial (ES) y profundo (EP),
epitelio glandular superficial (EGS) y profundo (EGP). La estación afectó el
contenido de receptores (P<0.05): en la mayor parte de los tipos celulares, las
ovejas en estación reproductiva tuvieron más RP. Se encontró mayor contenido de
RP en ES y EGP en las subnutridas respecto de dieta de mantenimiento durante el
anestro. El tratamiento con MEL disminuyó o tendió a disminuir los RP en ovejas
subnutridas en todos los tipos celulares menos en EL en ovejas en anestro;
mientras que aumentó los RP en EGP en ovejas controles. Por otro lado, se observó
un aumento de RP en EGP en ovejas subnutridas en estación reproductiva. En este
estudio se demostró que los tratamientos con MEL afectan la expresión de RP en
una forma dependiente a la estación y al estado nutricional; sugiriendo que la MEL
exógena interactúa con los mecanismos de señalización de la melatonina
endógena. Como la sensibilidad endometrial a la progesterona esta en la base de
los mecanismos de crecimiento embrionario y manutención de la gestación y estos
a su vez fueron afectados por la MEL, este podría ser uno de los mecanismos
implícitos en la mejora de la fertilidad observada con tratamiento de esta
hormona.
126
P114) EXTRACCION Y PURIFICACION DE POLIFENOL OXIDASA DE
MANZANA: UNA ETAPA HACIA EL CONTROL DEL PARDEAMIENTO
ENZIMATICO.
PERALTA, G*.; GIOIA, L*.;MANTA, C.; OVSEJEVI, K.
Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias, Facultad de Química,
UDELAR
Uno de los procesos que afecta severamente la conservación de frutas y vegetales
es el “pardeamiento enzimático”. La enzima responsable del mismo es la
polifenol oxidasa, PPO, (EC1.14.18.1), una metaloproteína, con dos Cu(II) en su
sitio activo. Siendo una enzima citoplasmática y sus sustratos (compuestos
fenólicos) estar en vacuolas dicho “pardeamiento” solo ocurre cuando el tejido
vegetal es dañado (por golpes, compresión, abrasión o cortes). Así, la enzima
entra en contacto con sus sustratos y en presencia de oxígeno, utilizando al cobre
como grupo prostético, inicia la oxidación de los mismos, transformando los ofenoles en quinonas. Estas quinonas rápidamente se polimerizan a melaninas
dando el color marrón característico, causando la pérdida de valor nutricional,
aromas, textura y presentación, llevando al rechazo del producto por parte del
consumidor.
El control del “pardeamiento enzimático” se centra principalmente en la
inhibición de la PPO, la cual puede alcanzarse por diversos caminos: captura de
sus sustratos, reducción de los iones Cu(II), o combinación de ambas estrategias.
Para dilucidar el mecanismo por el cual se logra controlar la actividad catalítica de
la PPO es necesario su aislamiento y purificación. En el caso particular de la PPO
de manzana, su condición de termosensible, dificulta notoriamente su extracción y
purificación.
En el presente trabajo se reporta la optimización de un protocolo de aislamiento y
purificación de PPO de Manzana Red Delicious. Se evaluó la influencia del pH,
fuerza iónica y composición del buffer, así como la importancia del Triton X-100,
en el proceso de extracción. Combinando diferentes técnicas de purificación de
proteínas (fraccionamiento salino, diálisis, cromatografía de intercambio iónico y
cromatografía hidrofóbica) se logró un alto grado de purificación de la enzima con
respecto al extracto original. Dicha purificación será relevante para posteriores
estudios espectrales que permitan evaluar el mecanismo de inhibición de esta
enzima.
* El orden de los presentadores es indistinto
127
P115) GENERACION DE SIALO-ISOFORMAS DE LACTOFERRINA BOVINA
MEDIANTE ESTRATEGIAS QUIMICA Y ENZIMATICA.
BUSTAMANTE, M. J., FRANCO FRAGUAS, L.
Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias. Facultad de Química. Av.
Gral. Flores 2124, Montevideo, Uruguay.
e-mail: [email protected]
Las glicoproteínas existen como isoformas generadas por microheterogeneidad
siendo la más común debida a variaciones en la estructura de sus oligosacáridos.
Las glicoproteínas animales contienen en sus oligosacáridos, diferentes ácidos
sialicos y se ha reportado que el contenido de los mismos juega un papel
importante en el reconocimiento celular. Se observa que durante el desarrollo de
enfermedades hepáticas hay reducción en la sialilación de ciertas glicoproteínas y
durante ciertos cánceres aumentan la sialilación y la fucosilación.
La Lactoferrina (LF) es una glicoproteína de la familia de las transferrinas, con
capacidad de unión al hierro, presente en la leche y otros fluidos corporales.
Numerosos reportes indican que presenta actividad antimicrobiana in vitro sobre
un amplio espectro de agentes patógenos. En estudios in vivo parece actuar como
modulador de la inflamación y de la respuesta inmune.
En este trabajo se estudió la modificación del grado de sialilación de LF bovina
comercial mediante estrategias química y enzimática, de liberación de ácido
siálico. La LF fue re-cromatografiada mediante intercambio iónico, se realizó la
desialilación completa mediante método químico y desialilación parcial con
neuraminidasa de C. perfringens, la cual fue inmovilizada en soporte tipo agarosa.
El ácido siálico liberado fue cuantificado mediante reacción de reductores y las
diferentes subpoblaciones de lactoferrina generadas, se analizaron mediante
isoelectroenfoque. También se utilizaron como haptenos en ensayos de inhibición
de hemoaglutinación (HAG) usando una lectina fúngica. Se observaron
modificaciones en el patrón de bandas de pI debidas a la desialilación y en los
ensayos de inhibición de HAG, la asialo-lactoferrina perdió su capacidad de
interacción con la lectina utilizada, mientras que las isoformas parcialmente
sialiladas mantuvieron su capacidad inhibitoria aunque con diferente intensidad.
Las estrategias de desialilación utilizadas permitieron generar diferentes
subpoblaciones de lactoferrina, las cuales serán evaluadas mediante estudios in
vitro, frente a diferentes microorganismos.
Financiamiento: ANII, PEDECIBA-QUIMICA.
128
P116) ESTUDIO DE LA INHIBICIÓN DE TRIPSINA CON LA PROTEÍNA
KUNITZ EgKU-7
PELLIZZA, L.1 , FLÓ, M.1, 2, MARGENAT, M.1 , SALINAS, G.1 , ALVAREZ, B.2,
FERNÁNDEZ, C.1
1
Cátedra de Inmunología – Facultad de Química y 2Laboratorio de Enzimología Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Uruguay
EgKU-7 pertenece a una familia de proteínas del tipo Kunitz de Echinococcus
granulosus (EgKU-1 – EgKU-8) que participarían en la interacción del parásito con
su hospedero definitivo. Presenta un residuo Arg en su sitio antiproteasa, lo que
indica que sería un inhibidor de tripsina. En este trabajo, se describe su
producción como recombinante y el ensayo de condiciones que permiten reducir la
formación de agregados insolubles a fin de obtener una mayor concentración de la
proteína soluble y activa. Además, se presenta el resultado de estudios cinéticos
que revelan su capacidad de inhibir tripsina con alta afinidad.
Se clonó la secuencia codificante para EgKU-7 maduro (sin la secuencia del péptido
señal) en el vector pET 28a (+), y se utilizaron células E.coli BL21 para la
expresión. La presencia de una extensión N-terminal de poli-histidina permitió
purificar la recombinante por afinidad a una matriz de niquel-NTA-agarosa. Pese a
que la mayor parte de EgKU-7 se recuperó en la fracción insoluble del lisado
bacteriano, probablemente como cuerpos de inclusión, la modificación de algunas
condiciones físicas, como densidad celular a la cual se induce la expresión y
duración de la misma, permitieron mejorar el rendimiento de proteína soluble. Se
observó un aumento de la concentracción de EgKU-7 en la fracción soluble cuando
la expresión se indujo tempranamente (A600 = 0.2 - 0.3) y durante tiempos cortos
(2 – 3 hs).
Los resultados de los ensayos cinéticos mostraron que EgKU-7 es un excelente
inhibidor de tripsina de alta afinidad (Ki en el orden pM). Además, mediante el
estudio de los cursos temporales de la inhibición, se evidenció que la formación
del complejo enzima-inhibidor involucraría sólo un equilibrio, a diferencia de otros
inhibidores Kunitz que involucran dos.
129
P117)
SINGULARIDADES
DEL
COMPUESTO
ANTITUMORAL
OXALIPLATINO EVIDENCIADAS POR COMPARACIÓN DE POTENCIALES
ELECTROSTÁTICOS 3D.
MERLINO, A.1; MARÍN, R.2; DANS, P.1; DAZA, E.2; COITIÑO, E.L.1
1Laboratorio de Química Teórica y Computacional, Instituto de Química Biológica,
Facultad de Ciencias, UdelaR, Montevideo- Uruguay.
2Grupo de Química Teórica, Universidad Nacional de Colombia, Bogótá D.C.,
Colombia.
En los últimas décadas se ha realizado un gran esfuerzo en el desarrollo de nuevas
entidades conteniendo Pt/Pd con el fin de mejorar los problemas de solubilidad,
toxicidad y resistencia asociados al Cisplatino, un fármaco ampliamente utilizado
en el tratamiento de distintos tipos de tumores sólidos. Si bien en este contexto
han surgido compuestos que presentan menor toxicidad (Carboplatino) o resultan
efectivos en células resistentes al Cisplatino (Oxaliplatino) [1] aun no están claras
las características estereoelectrónicas que causan esas diferencias en el perfil
farmacológico de dichos compuestos.
Teniendo en cuenta lo anterior en nuestro grupo de trabajo hemos realizado una
serie de estudios teóricos a fin de encontrar patrones estructurales que permitan
predecir la actividad antitumoral de complejos de Pt/Pt, lo cual resulta
fundamental para el diseño racional de nuevos compuestos más selectivos y
efectivos [2].
En el presente trabajo, el potencial electrostático molecular 3D calculado a nivel
DFT (PCM-B3LYP/LANL2DZ/6-31G*) de 35 complejos de Pt/Pd fue comparado
mediante el uso del método TARIS (Tree Analysis and Representation of
Isopotential Surfaces) [3]. Este método ha permitido clasificar los compuestos
teniendo en cuenta la similitud del potencial de cada molécula en base a
superficies isopotenciales moleculares negativas (NMIS). El análisis realizado
muestra que el Oxaliplatino presenta un potencial electrostático que es
claramente diferente al de las otras moléculas estudiadas. Lo anterior concuerda
con la idea de que estos fármacos utilizan distintos transportadores para ingresar a
la célula lo cual podría explicar la variación en el espectro de acción frente a
distintos tipos de tumores.
[1] Rixie, O.; Ortuzar, W.; Álvarez, M.; Parker, R.; Reed, E.; Paull, K.; Fojo, T.
Biochem. Pharmacol.
1996, 52, 1855.
[2] Dans, P.D.; Coitiño, E.L. J. Chem. Inf. Model. 2009, 49, 1407.
[3] Marín, R.M.; Aguirre, N.F.; Daza, E.E. J. Chem. Inf. Model. 2008, 48, 109
130
P118) ALOSTERISMO EN LA ALBUMINA SÉRICA HUMANA SEGÚN
ESTUDIOS DE DIFRACCIÓN DE RAYOS X
BOTTI, H.; BONILLA, L.; TRAJTENBERG, F.; FERRER-SUETA, G.; BUSCHIAZZO, A.;
RADI, R.
Institut Pasteur de Montevideo, Unidad de Cristalografía de Proteínas y
Centro de Investigaciones Biomédicas en Radicales Libres, Facultad de Medicina,
UdelaR
Cambios conformacionales y dinámicos se conjugan para explicar la señalización
intramolecular. Son pocos los mecanismos alostéricos bien comprendidos a
resolución atómica/casi atómica. Los modelos estructurales cristalográficos por
difracción de rayos X brindan información estructural detallada de
macromoléculas, incluyendo información sobre la movilidad atómica. Sin embargo,
la dinámica de proteínas es mayormente estudiada en casos favorables por
resonancia magnética nuclear (RMN). La albúmina sérica humana (HSA) cumple
diversas funciones, entre ellas la regulación del balance redox del plasma,
principalmente a través de su unico tiol libre (Cys34). También transporta iones,
biomoléculas, xenobióticos y drogas. Nosotros estudiamos por métodos biofísicos
en solución y en cristales el mecanismo alostérico que vincula a distancia el sitio
de unión a fármacos de Sudlow I y el sitio del tiol de la HSA. La oxidación de la
Cys34 y la unión de Ca2+ (modulador alostérico conocido) no parecen afectar en
gran medida la conformación proteica, ya que no se observan cambios de FRET
Trp214-Prodan atribuibles a cambios en la distancia dador-aceptor, aunque se
observan cambios en constantes de afinidad y en los rendimientos cuánticos de la
sonda unida. Esto está de acuerdo con el análisis del espacio conformacional de la
HSA según estudios cristalográficos, que muestra que el dominio II es rígido. Se
realizaron ensayos cristalogénicos manuales y robóticos sobre isoformas oxidadas
sin éxito hasta el momento. De los estudios cristalográficos a T criogénica sobre la
isoforma reducida obtuvimos un nuevo modelo, el que permite definir mejor los
cambios dinámicos que ocurren en la proteína por unión de fármacos al sitio de
Sudlow I. En conjunto con modelos cristalográficos previos, hemos podido
identificar componentes del mecanismo alostérico en estudio. Los estudios
cristalográficos de las isoformas oxidadas se continuarán sobre formas truncadas
de la proteína, particularmente dominios I y II, y dominio I aislado.
131
P119) ESTUDIO DE LOS MECANISMOS DE NITRACIÓN CITOCROMO C
USANDO PROTEÍNAS MUTANTES EN TIROSINAS.
SCANDROGLIO. F1; TÓRTORA. V1; BONILLA. L1; MARÍN. M2; RADI. R1 AND CASTRO.
L1.
1
Facultad de Medicina y
2
Facultad de Ciencias, Universidad de la República,
El citocromo c (citc) es una hemoproteína mitocondrial que participa en la
transferencia de electrones a través de la cadena respiratoria y en la apoptosis, al
liberarse desde la mitocondria al citosol llevando a la activación del apoptosoma al
unirse a APAF-1 junto con dATP y procaspasa 9.
En la mitocondria, el citc está unido a la membrana mitocondrial interna mediante
interacciones electrostáticas, además, un 15% aproximadamente, se encuentra
fuertemente unido a la cardiolipina, por interacciones electrostáticas,
hidrofóbicas y puentes de hidrógeno. La unión a la cardiolipina determina un un
cambio conformacional del citc que produce un significativo aumento en su
actividad peroxidasa. Hemos mostrado que la nitración también determina una
ganancia en la actividad peroxidásica del citc.
El citc presenta 4 residuos de tirosinas altamente conservados (dos adyacentes al
hemo Y48, Y67 y dos expuestas al solvente, Y74, Y97). Por mutagénesis dirigida se
realizaron simples mutantes en tirosina por fenilalanina del ctic de corazón de
caballo con el fin de determinar el rol de las Y en la nitración medida por
derivados del .NO. Las proteínas mutantes (Y97F, Y74F, Y67F, Y48F) fueron
expresadas en E coli BL21Star, purificadas y expuestas a peroxinitrito, H2O2 y NO-2
,H2O2 y .NO; y analizadas por western blot anti-citc y anti-nitrotirosina.
Los simples mutantes presentaron una menor nitración por peroxinitrito
comparado con la WT; y las Y48F y la Y67F exhibieron menor formación de
agregados proteicos. El H2O2 induce menos polimerización en las Y48F y Y67F que
la WT, Y74F y Y97F. En presencia de H2O2 y NO2- la polimerización disminuye y se
vuelve evidente la formación de nitrotirosina.
Proponemos que las tirosinas más internas son esenciales en promover la
transferencia electrónica desde, o hacia, el hemo a la proteína y hacia la
cardiolipina durante su peroxidación y la nitración puede alterar esta vía.
132
P120) IMPLEMENTACION DE METODOS PARA LA CRISTALIZACION
DIFRACCION DE RAYOS X DE MACROMOLECULAS BIOLOGICAS
Y
LARRIEUX, N; TRAJTENBERG, F; BOTTI, H Y BUSCHIAZZO, A.
I
nstitut Pasteur de Montevideo, Unidad de Cristalografía de Proteínas
La cristalografía de rayos X es la aproximación experimental más poderosa para determinar las
estructuras tridimensionales de macromoléculas biológicas. El objetivo de la Unidad de Cristalografía
de Proteínas del IPMont es el de proveer infraestructura y soporte en conocimiento técnico, para
permitir a investigadores locales y regionales realizar estudios estructurales de relevancia científica.
Para ello se han adquirido e instalado instrumentos estado del arte, en las áreas de cristalización,
difracción de rayos X y determinación / refinamiento de estructuras 3D. La Unidad comenzó a
funcionar en 2007, y fue incorporando personal técnico y científico en forma escalonada, asociada a
la instalación de equipamiento. Aquí presentamos el progreso en la implementación de técnicas en el
área de cristalogénesis de macromoléculas biológicas, con énfasis en las aproximaciones que han sido
puestas a punto y que nos han permitido cristalizar 20 proteínas diferentes. El setup elegido para
llevar adelante experimentos de difracción de rayos X sobre cristales únicos, ha hecho posible
colectar más de 100 juegos de datos, habiéndose determinado y refinado 31 estructuras, de las cuales
13 ya se han depositado en la base de datos PDB. Se presentarán algunas cifras de interés sobre
características y uso de la muestra inicial en cristalización, máxima resolución obtenida y tamaño de
las proteínas resueltas. Hasta el momento sólo se han procesado proteínas solubles. Un objetivo
importante es el entrenamiento de nuestro personal en el estudio cristalográfico de proteínas de
membrana. En términos de equipamiento, resta la incorporación de un segundo robot para el área de
cristalogénesis. En el área computacional podemos ahora trabajar con mapas de densidad obtenidos
por microscopía electrónica, tanto para fasear nuevas estructuras incógnita, como para ajustar
proteínas resueltas por rayos X dentro de la envoltura de microscopía. Actualmente estamos así
mismo incorporando métodos complementarios para simular interacciones por docking.
133
P121) IMPLEMENTACION DE METODOS PARA LA CRISTALIZACION Y
DIFRACCION DE RAYOS X DE MACROMOLECULAS BIOLOGICAS
LARRIEUX, N; TRAJTENBERG, F; BOTTI, H Y BUSCHIAZZO, A.
Institut Pasteur de Montevideo, Unidad de Cristalografía de Proteínas
La cristalografía de rayos X es la aproximación experimental más poderosa para
determinar las estructuras tridimensionales de macromoléculas biológicas. El
objetivo de la Unidad de Cristalografía de Proteínas del IPMont es el de proveer
infraestructura y soporte en conocimiento técnico, para permitir a investigadores
locales y regionales realizar estudios estructurales de relevancia científica. Para
ello se han adquirido e instalado instrumentos estado del arte, en las áreas de
cristalización, difracción de rayos X y determinación / refinamiento de estructuras
3D. La Unidad comenzó a funcionar en 2007, y fue incorporando personal técnico y
científico en forma escalonada, asociada a la instalación de equipamiento. Aquí
presentamos el progreso en la implementación de técnicas en el área de
cristalogénesis de macromoléculas biológicas, con énfasis en las aproximaciones
que han sido puestas a punto y que nos han permitido cristalizar 20 proteínas
diferentes. El setup elegido para llevar adelante experimentos de difracción de
rayos X sobre cristales únicos, ha hecho posible colectar más de 100 juegos de
datos, habiéndose determinado y refinado 31 estructuras, de las cuales 13 ya se
han depositado en la base de datos PDB. Se presentarán algunas cifras de interés
sobre características y uso de la muestra inicial en cristalización, máxima
resolución obtenida y tamaño de las proteínas resueltas. Hasta el momento sólo se
han procesado proteínas solubles. Un objetivo importante es el entrenamiento de
nuestro personal en el estudio cristalográfico de proteínas de membrana. En
términos de equipamiento, resta la incorporación de un segundo robot para el área
de cristalogénesis. En el área computacional podemos ahora trabajar con mapas
de densidad obtenidos por microscopía electrónica, tanto para fasear nuevas
estructuras incógnita, como para ajustar proteínas resueltas por rayos X dentro de
la envoltura de microscopía. Actualmente estamos así mismo incorporando
métodos complementarios para simular interacciones por docking.
134
P122) SERIN/TREONIN QUINASAS DE Leishmania: UN ESTUDIO
ESTRUCTURAL
HORJALES S. & BUSCHIAZZO A.
Unidad de Cristalografía de Proteínas- Institut Pasteur de Montevideo
Las Ser/Thr proteín quinasas (STPQs) son moléculas ubicuas que participan en la
transducción de señales en pro y eucariotas. Son enzimas que presentan al menos
2 conformaciones tridimensionales extremas: el estado activado y el inactivo,
actuando asi como “interruptores moleculares”. Pretendemos comprender cómo
esta flexibilidad está asociada a su función al nivel molecular, con particular foco
en los cambios conformacionales asociados a los ciclos catalítico y regulatorio. Nos
centraremos en el estudio estructural de MAP ('mitogen activated protein')
quinasas de Leishmania, que forman parte de cascadas de fosforilación, disparadas
por estímulos extracelulares. El estudio cristalográfico de MPK10 y MPK7 de
Leishmania major resulta de interés, tanto por los correlatos fenotípicos asociados
a la enfermedad (son MAPQs asociadas a virulencia y/o diferenciación de estadio
durante el ciclo de vida), como a particularidades en sus secuencias que las
diferencian de MAPQs humanas (por ende, blancos terapéuticos potenciales). MPK7
por ejemplo, posee dos inserciones en sitios clave de la molécula: el sitio de unión
al ATP y el bucle de activación. Para realizar estudios cristalográficos de estas dos
MAPQs, hemos expresado MPK7 y MPK10 recombinantes en Escherichia coli. MPK7
se encuentra en la fracción insoluble, obstáculo que necesariamente debemos
franquear para progresar hacia estudios estructurales. Una batería de variantes
fue utilizada hasta el momento para mejorar la expresión, sin éxito. Ahora
estamos enfocados en usar Leishmania y Drosophila como huéspedes de expresión
alternativos. MPK10 se expresó en forma soluble, con buen rendimiento,
permitiendo su purificación a homogeneidad. Se rastrearon condiciones de
cristalización, identificando varias condiciones iniciales. Estos cristales están
siendo optimizados. Los cristales iniciales difractan hasta 3 angstroms y crecieron
en el grupo de espacio tetragonal P43212 (o P41212, ambigüedad que se resolverá
en la determinación), lo cual permite prever la obtención de la primer estructura
3D de una MAP quinasa de tripanosomátidos próximamente.
135
P123) CHARACTERIZATION OF A POTENTIAL SUBSTRATE-TRAPPING
MUTANT OF THE TYROSINE PHOSPHATASE PtpA FROM
Mycobacterium tuberculosis.
PURIFICAÇÃO M.A, RAZZERA G.B, OBAL G.C, FERREIRA A.M.D, DURÁN R C, LIMA AC,
HERNÁN TERENZI H.A Y VILLARINO A.A
a
Laboratório de Expressão Gênica, Departamento de Bioquímica, Universidade
Federal de Santa Catarina, 88040-900, Florianópolis, SC, Brazil
b
National Center for Nuclear Magnetic Resonance Jiri Jonas, CNRMN, UFRJ, Brazil.
c
Institut Pasteur de Montevideo, Unidad de Biofísica de Proteínas y
Unidad Tecnológica de Bioquímica y Proteómica Analíticas, Montevideo, Uruguay.
d
Cátedra de Inmunología, Facultad de Ciencias, Instituto de Higiene, Montevideo,
Uruguay.
Several bacterial phosphatases can contribute to pathogen intracellular survival by
modifying the phosphorylation/dephosphorylation equilibrium in their host. The M.
tuberculosis tyrosine phosphatase PtpA has been shown to participate in
pathogenicity. However, which are all the PtpA targets is unknown. The best way
to identify PTP targets is the substrate-trapping method, based on the generation
of a mutated enzyme that retains the ability to bind substrates, but is either
unable or severely impaired in carrying out dephosphorylation, allowing the
isolation of the PTP-substrate complex. The mutated residues are involved in the
conserved catalytic mechanism of phospho-mono-ester hydrolysis of the PTP
enzyme family. In the present study, we report the generation of the M.
tuberculosis PtpA D126A mutant and the effect of this mutation on its kinetic
properties and structure and propose a new strategy to purify the putative isolated
substrates. We obtained in a good yield a pure and homogeneous PtpA D126A
mutant that potentially presents all the features for a good substrate-trapping
mutant: (i) it is barely active (lower kcat than wild-type enzyme), (ii) it binds
efficiently its substrate (Km similar to wild-type), and (iii) it presents no
substantial conformational changes. In fact, preliminary results obtained by a
combination of the substrate-trapping mutant and the Surface Plasmon Resonance
method showed an hydrophobic protein-protein interaction involving the active
site of PtpA with a potential substrate present in a whole soluble protein extract
of macrophages. Thus, we conclude that the PtpA D126A mutant prepared in this
study can be potentially used to characterize physiological substrates and
contribute to determine the signaling pathway in which M. tuberculosis PtpA is
involved, by in vitro-pull down approaches and further crystallographic studies of
enzyme/substrate complexes.
136
P124) CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA PRELIMINAR DE LA
GLUTARREDOXINA MONOTIÓLICA 1 DE TRYPANOSOMA BRUCEI
BRUCEI
MANTA B1, KRAUTH-SIEGEL L2, COMINI M1
1. Grupo de Biología Redox de los Tripanosomas, Institut Pasteur Montevideo,
Uruguay. 2. Biochemistry Center, Heidelberg University, Germany.
Las glutarredoxinas monotiólicas (1-C-Grx) son proteínas ubicuas a organismos de
diferentes Géneros. Ellas pertenecen a la superfamilia de las tiorredoxinas y se
diferencian de las glutarredoxinas clásicas (sitio activo CPXC) por poseer un único
residuo de cisteína en su sitio activo (CXXS). A diferencia de aquellas, las 1-C-Grxs
carecen de actividad oxidoreductasa tiol-disulfuro y su rol fisiológico parece tener
relación con la capacidad de las mismas para ensamblar en su estructura centros
ferrosulfurados. En Trypanosoma brucei brucei (Tb), un organismo modelo de la
tripanosomiasis Africana, se ha reportado la presencia de tres 1-C-Grxs, siendo al
momento la 1-C-Grx1 la mejor estudiada de ellas. La 1-C-Grx1 de T. brucei es una
proteína homodimérica que en su holoforma secuestra un centro ferrosulfurado
empleando glutatión como cofactor y cumple un rol indispensable en el
mitocondrio de este parásito. Ahora hemos iniciado estudios tendientes a
completar la caracterización bioquímica y biofísica de la 1-C-Grx1 de T. brucei.
Los resultados obtenidos al momento indican que: i) la dimerización no-covalente
de 1-C-Grx1 es mediada por una extensión N-terminal solo conservada en ortólogos
de otros tripanosomátidos, ii) la cisteína del sitio activo participa en la
coordinación del centro ferrosulfurado, tal como ocurre con 1-C-Grxs de otros
organismos, iii) el tratamiento con oxidantes y reductores no induce cambios
notorios en el espectro de fluorescencia de una región de unión no covalente a
glutatión, iv) la magnitud de los cambios conformacionales en la estructura de la
apoproteína dependen del oxidante empleado.
137
P125) DETERMINACIÓN DE pKa Y NUCLEOFILIA DE TIOLES DE BAJO
PESO MOLECULAR EN COMPARACIÓN CON TIOLES PROTEICOS.
SARDI, F1., MANTA, B2. Y FERRER-SUETA, G1.
1
Laboratorio de Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias.
Instituto Pasteur Montevideo.
2
El grupo tiol (RSH) es uno de los grupos más versátiles en bioquímica, participa en
la estabilización de estructuras terciarias de proteínas mediante la formación de
disulfuros, catálisis enzimática, entre otras.
La gran mayoría de los tioles biológicos son derivados del aminoácido cisteína, y
sus reacciones comienzan con el ataque nucleofílico del tiolato sobre la molécula
blanco. Siendo la nucleofilia del tiolato una característica extraordinaria, fue la
considerada a estudiar. Las determinaciones de pK a de tioles mediante la
reactividad diferencial entre tiol y tiolato proporcionan una forma de medir la
nucleofilia.
De esta manera, hemos estudiado las constantes de acidez de diferentes tioles de
bajo peso molecular por medio de la reacción de alquilación con
monobromobimano (mBBr), y con la posterior construcción de una escala
nucleofílica, la cual consiste en correlacionar constantes de velocidad de una
reacción con la acidez del tiol. Con los valores de constantes de velocidad para las
reacciones con mBBr y los pKas obtenidos hemos construido correlaciones de
Bronsted, a partir de la cual se puede comprender la relación entre la acidez y la
nucleofilia, y utilizar como marco de referencia para la ubicación de cisteínas
proteicas que caen en la ubicación esperada por la correlación y aquellas que
tienen su pKa o nucleofilia alterada por el entorno proteico.
Hemos escogido el sistema de la enzima Sulfirredoxina humana (hSrx) en
presencia de ATP y Mg2+, determinando los pKa del tiol proteico por medio de la
reacción de alquilación con mBBr. Nos hemos planteado hipótesis acerca de
posibles factores adicionales que contribuyen en las reacciones catalizadas por la
proteína.
138
126) REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD QUINASA DE PknG EN
Mycobacterium tuberculosis
GIL, M., BATTHYÁNY, C., DURÁN, R., CERVEÑANSKY, C.
Unidad de Bioquímica y Proteómica Analíticas, Institut Pasteur de
Montevideo/Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, Mataojo
2020, Uruguay.
La fosforilación reversible de proteínas constituye la base de un lenguaje universal
utilizado tanto por organismos eucariotas como procariotas para la transmisión de
información en respuesta a estímulos. En bacterias, la señalización recae
fundamentalmente sobre sistemas de dos componentes constituidos por una
quinasa de histidina (sensor) y un regulador de respuesta. La secuenciación del
genoma de Mycobacterium tuberculosis reveló la importancia de sistemas de
fosforilación en serinas y treoninas típicamente eucariotas (STPK), dicho genoma
codifica para once STPK (pknA a pknL) y una fosfoserina/treonina fosfatasa (pstP).
Nuestro interés se centra en la caracterización de PknG, quinasa citosólica que
participaría en la regulación de los niveles intracelulares de glutamina/glutamato
e intervendría en la supervivencia del bacilo dentro del macrófago inhibiendo la
fusión del fagosoma y el lisosoma. Además del dominio catalítico quinasa, PknG
posee dominios N- y C- terminales con roles poco estudiados. El extremo aminoterminal presenta un motivo rubredoxina, caracterizado por la presencia de un
hierro coordinado a cuatro residuos de cisteínas y que en muchas bacterias
anaerobias participa en la transferencia de electrones. En este trabajo nos
propusimos ahondar en la regulación de la actividad quinasa de PknG por el
dominio rubredoxina. PknG de M. tuberculosis se expresó como proteína
recombinante en E. coli, la purificación se realizó en dos etapas: cromatografía de
afinidad por metales inmovilizados y cromatografía de exclusión molecular. Por
espectrometría de masa MALDI-TOF se corroboró la identidad de la proteína
purificada. Además, se confirmó que la enzima purificada era activa y por tanto
capaz de transferir grupos fosfato. Posteriormente, estudiamos la relevancia del
estado de oxidación del hierro coordinado a las cisteínas del dominio rubredoxina y
el efecto de la modificación química de dichas cisteínas sobre la actividad
catalítica de PknG.
139
P127) ESTRUCTURA OLIGOMÉRICA Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA REDOXDEPENDIENTE DE LA GLUCOSA-6-FOSFATO DESHIDROGENASA DE
Trypanosoma cruzi
ORTÍZ C., MEDEIROS A., COMINI M.
Laboratorio de Biología Redox de los Tripanosomas, Institut Pasteur de
Montevideo.
La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) cataliza la primera reacción y etapa
limitante de la vía de las pentosas fosfatos, una ruta metabólica que genera
NADPH además de otros metabolitos importantes (por ej. ribosa-5-fosfato y
productos intermediarios de la glicólisis). Estudios recientes demostraron que la
G6PDH de Trypanosoma cruzi (TcG6PDH) cumpliría un rol importante en el
mecanismo de defensa antioxidante del parásito y sugirieron que la actividad de la
misma sería blanco de regulación redox (Igoillo-Esteve y Cazzulo, 2006). Nuestro
objetivo es determinar si existe un mecanismo de retroalimentación redoxdependiente que regule la actividad de la TcG6PDH en función de la demanda de
poder reductor del parásito, tal como es el caso de G6PDHs de organismos
fotosintéticos. Aquí se reportan los resultados preliminares obtenidos en pos de
ese objetivo.
En una primera instancia, se procedió a optimizar el protocolo de expresión y
purificación de la forma recombinante corta (TcG6PDHc, 518 aminoácidos) y larga
(TcG6PDHL, 555 aminoácidos) de la enzima. Los estudios de cromatografía de
exclusión molecular revelaron que ambas proteínas forman tetrámeros nocovalentes cuya conformación no es alterada por el agregado de agentes
reductores y/o coenzima. La oxidación, espontánea o inducida, de la TcG6PDHL
condujo a la formación de enlace(s) disulfuro(s) intermoleculares entre dos
subunidades del tetrámero. Dicho fenómeno fue revertido por reductores e
involucraría a cisteínas de la extensión N-terminal, ausentes en la secuencia de la
TcG6PDHc. La actividad de la G6PDHL fue evaluada en presencia de distintas
relaciones fisiológicas de pares redox (glutatión y tripanotión reducido y oxidado),
observándose que las diferentes duplas tiol/disulfuro afectaron de manera
moderada y específica la actividad de la enzima. Metales divalentes (Zn 2+, Cu2+,
Fe2+, Co2+ y Ni2+) provocaron distintos grados de inactivación de la TcG6PDHL
sugiriendo la formación de un complejo enzima-metal y/o la oxidación de grupos
funcionales (Cys o His) de la proteína.
140
P128) INHIBICION DE LA ACTIVIDAD COAGULANTE DEL VENENO
“BOTHROPICO” POR PARTE DEL PLASMA DE RHINOCEROPHIS
ALTERNATUS.
MORAIS V. & CARREIRA S.
Instituto de Higiene.
En Uruguay, existen unos 65 accidentes ofídicos al año causados por dos especies,
Bothropoides pubescens y Rhinocerophis alternatus. El único tratamiento eficaz
hasta el momento es la administración de suero antiofídico específico. No
obstante, se conoce hace tiempo la capacidad de resistencia de ciertos animales
como la comadreja (Philander opossum), la zarigüeya (Didelphys marsupialis) e
incluso otros ofidios (Bothropoides, Bothrops y Rhinocerophis) a ciertas toxinas del
veneno. Generalmente ésta resistencia viene dada por inhibidores de enzimas
específicas del veneno tales como inhibidores de fosfolipasas, metalo y serino
proteasas. En este trabajo preliminar determinamos si existe capacidad inhibitoria
del plasma sanguíneo de R. alternatus frente al veneno de B. pubescens. Para ello
ensayamos frente a uno de los efectos tóxicos principales del veneno como es el
potencial coagulante. Los resultados indican una inhibición importante del
potencial de coagulación del veneno cuando se le aplica plasma ofídico. Si bien el
potencial inhibitorio es evidente en el ensayo, no sería suficiente como para
neutralizar una inyección directa de veneno por parte de otro ejemplar por lo que
se supone que esta propiedad neutralizante defendería el plasma de la serpiente
de pequeñas cantidades de veneno propio, o de otro ofidio, que accidentalmente
pudiesen ingresar en el organismo en las actividades normales. La identificación
futura de este componente inhibitorio no solo tiene importancia en lo que refiere
al tratamiento del accidente ofídico, sino también en lo relacionado al desarrollo
de nuevos fármacos en el área hemostática, debido a la relación entre este tipo de
toxinas y la cascada de coagulación.
141
P129) NITROALQUENOS DE SÍNTESIS COMO ATRAPADORES DE
ESPECIES OXIDANTES
PROLO C1,2, CELANO L1, FRACHE R3, GONZÁLEZ M3, ÁLVAREZ M N2, THOMSON L1.
1
Laboratorio de Enzimología, Facultad de Ciencias. 2Centro de Investigaciones
Biomédicas en Radicales Libres, Departamento de Bioquímica, Facultad de
Medicina. 3Laboratorio de Química Orgánica, Facultad de Ciencias.
Durante los procesos inflamatorios existe una producción excesiva de especies
reactivas del oxígeno y nitrógeno por parte de las células fagocíticas, generando
daño oxidativo sobre proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. La activación de las
células fagocíticas conlleva la inducción de la enzima óxido nítrico sintasa,
responsable de la producción de óxido nítrico ( •NO) y el ensamblaje de la enzima
NADPH oxidasa, generando superóxido (O2•-). El •NO y O2•- reaccionan para formar
peroxinitrito (ONOO-), molécula con mayor poder oxidante que ambos precursores,
responsable en parte del daño nitro-oxidativo en células cercanas. Por esta razón
existe una búsqueda constante de agentes antioxidantes con aplicaciones
terapéuticas y con este fin estudiamos las propiedades antioxidantes de dos
nitroalquenos de síntesis: el (1Z)-1-dimetilamino-4-(2-nitro-1-propenil)benceno y
(E)-5-(2-nitro-1-propenil)-3a7a-dihidrobenzo[d][1,3]dioxol
(02
y
03,
respectivamente) en un modelo de macrófagos. En macrófagos activados, la
oxidación de la dihidrorodamina mediada por radicales derivados de ONOO -, fue
fuertemente inhibida por la presencia de 5μM de los nitroalquenos 02 (90%) y 03
(64%). Evaluamos la capacidad de atrapar •NO y O2•- usando ensayos in vitro e in
vivo que detectan estas especies, observando que no se inhibe la detección de •NO
por oxihemoglobina, ni la reducción de citocromo c por O2•-. Por otra parte, se
analizó el efecto de los compuestos sobre la viabilidad celular usando un ensayo de
exclusión de ioduro de propidio por citometría de flujo y otro de poder reductor
intracelular (MTT). El compuesto 03 resultó tóxico para las células (20% de células
viables a las 24 horas de exposición a 10μM de compuesto), mientras que el 02 no
afectó la viabilidad luego de 48 horas de exposición. Por tanto el compuesto 02 no
es tóxico para las células y es capaz de atrapar radicales derivados del ONOO siendo un buen candidato para continuar su evaluación como protector en
procesos inflamatorios.
142
P130) LA ACONITASA MITOCONDRIAL: ¿BLANCO PREFERENCIAL DE
ESPECIES OXIDANTES Ó UN SENSOR REDOX?
SCANDROGLIO, F.; TÓRTORA, V; CASTRO, L.
Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad de la República.
La mitocondria, organelo de control bioenergético, constituye además un sitio de
formación de especies oxidantes derivadas del oxígeno y del óxido nítrico que
median reacciones de oxidación de biomoléculas, que cumplen roles señalizadores
o determinan alteraciones estructurales y funcionales mediando la disfunción
mitocondrial.
El radical superóxido y especies derivadas de su reacción con óxido nítrico
(peroxinitrito y radical carbonato) reaccionan rápidamente con el centro Fe-S de
la aconitasa mitocondrial, determinando la inhibición de esta enzima del ciclo de
Krebs. La presencia de la aconitasa oxidada y nitrada en diversos modelos animales
de sepsis, inflamación, envejecimiento y diabetes la revelan como un blanco
preferencial de especies oxidantes in vivo.
Este proyecto busca determinar el umbral de inhibición de la aconitasa de
distintos tejidos de rata y en diversos tipos celulares con diferentes perfiles
metabólicos. Esto permitirá definir el coeficiente de control de flujo de la
aconitasa sobre el ciclo de Krebs y la respiración celular, para determinar si la
inactivación de la aconitasa puede ser un mecanismo de control del estrés
oxidativo.
En este trabajo realizamos: a)Estudios de consumo de oxigeno citrato dependiente
de mitocondrias aisladas de los diferentes parénquimas, para evaluar el
metabolismo mitocondrial (ciclo de Krebs, cadena respiratoria y fosforilación
oxidativa) a partir de la actividad aconitasa; y b)medidas de la actividad aconitasa
en fracciones enriquecidas en matriz mitocondrial.
El umbral funcional de la enzima fue determinado usando fluorocitrato (inhibidor
competitivo). La actividad aconitasa en riñón fue de 117 ± 15 mU/mg y 30 ± 5
mU/mg en hígado; la titulación con fluorocitrato resultó en un IC50 de 20 µM en
riñón y 35 µM en hígado.
Nuestros resultados preliminares nos permiten observar que hay
diferencia significativa del umbral funcional de la aconitasa en los
diferentes órganos, lo cual puede traducirse en la diferente
sensibilidad tisular al estrés oxidativo.
143
P131) FORMACIÓN DE .NO Y O2.- EN CÉLULAS ENDOTELIALES:
EFECTO SOBRE BLANCOS CELULARES
SUBELZÚ, N., ROMERO, N Y RADI, R.
Departamento de Bioquímica y Centro de Investigaciones Biomédicas en Radicales
Libres, Facultad de Medicina, UDELAR.
El oxido nítrico (.NO) es producido en las células endoteliales a partir de Larginina, O2 y NADPH, reacción catalizada por la enzima eNOS, y difunde a las
células musculares adyacentes, induciendo vasorelajación y aumento del flujo
sanguíneo. Algunas fisiopatologías como diabetes e hipertensión, se asocian al
aumento de formación vascular de radical superoxido (O 2.-), el cual reacciona con
.
NO produciendo peroxinitrito y disminuyendo la biodisponibilidad de .NO. Las
fuentes de O2.- vasculares incluyen NADPH oxidasas, cadena de transporte
mitocondrial y la eNOS desacoplada. El peroxinitrito puede reaccionar con
diferentes blancos celulares como residuos de tirosina proteicos, formando 3nitrotirosina lo que provoca pérdida o ganancia de función de la proteína nitrada.
Un posible blanco celular es la eNOS, la cual se oxida por peroxinitrito
disminuyendo la formación de .NO, convirtiéndose en una fuente de O2.- y
peroxinitrito. La MnSOD, enzima mitocondrial responsable de la descomposición de
O2.-, es también nitrada e inactivada por peroxinitrito.
Evaluamos la formación de .NO en cultivos de células endoteliales de aorta bovina
(BAEC) utilizando diferentes concentraciones de ionomicina y del ionóforo de
calcio A23187 mediante fluorescencia de la sonda DAF-FM. Para el radical O2.- se
indujo su producción mitocondrial con antimicina, inhibidor de la cadena
respiratoria y DMNQ, un reciclador redox que produce O2.- utilizando equivalentes
de reducción intracelulares. La detección se realizó con la sonda fluorescente
Amplex Red. La formación celular de peroxinitrito se analizó usando la sonda
fluorescente dihidrorodamina, la cual reacciona con radicales derivados de
peroxinitrito. El efecto de la formación de peroxinitrito sobre blancos celulares se
estudio con las enzimas MnSOD y eNOS. Los trabajos realizados permitieron
optimizar las condiciones para la formación endógena de .NO y O2.- comprobándose
el desacoplamiento de la enzima eNOS y la nitración e inactivación de la MnSOD en
condiciones de formación simultánea de .ambos radicales.
144
P132) PORFIRINAS DE MANGANESO COMO PROTECTORAS DEL DAÑO
MEDIADO POR PEROXINITRITO EN MITOCONDRIAS
VALEZ, V.; CASSINA, A.; FERRER-SUETA, G.; RADI, R.
Centro de Investigaciones Biomédicas en Radicales Libres, Departamento de
Bioquímica, Facultad de Medicina.
Laboratorio de Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias.
La mitocondria es el principal sitio de formación de especies reactivas del oxígeno
y del nitrógeno, que pueden derivar en disfunción mitocondrial y señalización para
la muerte apoptótica. Uno de los oxidantes más importantes formados es el
peroxinitrito (ONOO-), que puede oxidar y nitrar proteínas alterando su función.
Las porfirinas sintéticas metálicas son capaces de catalizar una gran cantidad de
reacciones redox y han sido ampliamente usadas como superóxido dismutasas y
como catalizadores de la descomposición de ONOO-, el metal de transición puede
existir bajo 4 estados de oxidación (del II al V). Trabajos previos en nuestro
laboratorio mostraron que las porfirinas en estado III pueden catalizar la reducción
de ONOO- produciendo Mn (IV) y radical .NO2. Este proceso puede ser reciclado por
algunos reductores comunes como ascorbato y urato. Además, datos más recientes
mostraron que el Mn (II) puede también reducir al ONOO- pero produce Mn (IV) y
NO2-, especie menos oxidante que el .NO2. El ciclo redox entre el Mn (II)/ Mn (IV)
puede ser llevado a cabo por flavoenzimas aisladas, debido a su potencial de
reducción, como la glucosa oxidasa o la xantino oxidasa, aunque también lo
pueden hacer las flavoenzimas de la cadena respiratoria como el complejo II o
succinato deshidrogenasa (Ferrer-Sueta, G., et al (2006) Free Radic Biol Med
41(3), 503-512).
En este trabajo se muestra que las porfirinas se pueden incorporar a mitocondrias
aisladas, que también pueden ser reducidas por el complejo I (NADH
deshidrogenasa) y que esto puede suceder a un nivel de oxígeno fisiológico en las
mitocondrias. Por otra parte, se muestra que dicha reducción permite un ciclo
redox entre Mn (II) / Mn (IV) que protege al complejo I y II del daño mediado por
ONOO-. Se observa también protección de la nitración mediada por los productos
de descomposición del peroxinitrito.
145
P133) EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE PROPÓLEOS
URUGUAYOS
SILVA, V. 1,3, GENTA, G.1,3, MÖLLER, M. 1,3, ROMERO, N.2,3, FIERRO, W.1, DENICOLA,
A.1,3.
1
Lab. Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias, 2 Departamento de
Bioquímica, Facultad de Medicina, y 3Center for Free Radical and Biomedical
Research, Universidad de la República
El propóleos es un producto natural elaborado por las abejas a partir de material
colectado de diferentes plantas y de su propio metabolismo. Este producto ha
probado tener importantes propiedades biológicas entre las que se destacan
antiinflamatoria, antitumoral, antiséptica y antioxidante. La bioactividad del
propóleos se relaciona con la calidad y el contenido de los polifenoles en general y
de los flavonoides en particular, cuya proporción varía según el origen geográfico,
botánico y según el método y tiempo de recolección del mismo. Dado que el
mercado internacional de este producto se encuentra en amplio crecimiento, es
importante estudiar la composición y propiedades de propóleos de diferentes
regiones, y encontrar parámetros de estandarización química y/o biológica.
En este trabajo estudiamos las propiedades antioxidantes de los propóleos
uruguayos provenientes de diferentes regiones del país. Se realizó la
caracterización organoléptica y fisicoquímica de las muestras y se prepararon
extractos etanólicos de las mismas. Se determinó el contenido total de polifenoles
y flavonoides, y la capacidad antioxidante de los extractos etanólicos de propóleos
fue evaluada in vitro mediante diferentes aproximaciones. Todos los propóleos
analizados mostraron capacidad de inhibir la oxidación de la lipoproteína
proaterogénica LDL, la formación de nitrotirosina y una importante capacidad
secuestradora de radicales peroxilo, evaluada por el método ORAC. Los extractos
etanólicos de propóleos con mayor capacidad antioxidante fueron aquellos con
mayor contenido en polifenoles y flavonoides. Por otro lado se estudió también el
efecto de los extractos en la inducción de la expresión de la óxido nítrico sintasa
endotelial (eNOS).
En este trabajo demostramos que los propóleos uruguayos son potentes
antioxidantes naturales, con valores ORAC significativamente mayores que otros
productos naturales, con gran capacidad de inhibir la oxidación tanto de lípidos
como de proteínas y también inducir la expresión de la eNOS.
146
P134) INHIBICIÓN DE LA NADPH OXIDASA
NITROARAQUIDÓNICO EN MACRÓFAGOS ACTIVADOS
POR
ÁCIDO
GONZÁLEZ, L.I, ÁLVAREZ, M.N., RUBBO, H. Y TROSTCHANSKY, A.
Centro de Investigaciones Biomédicas en Radicales Libres, Departamento de
Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad de la República, Montevideo,
Uruguay.
La NADPH oxidasa (NOX2) cataliza la producción de anión superóxido (O 2● -) hacia
el espacio extracelular a partir de oxígeno y NADPH. Está compuesta por el
flavocitocromo b558 inserto en membrana, tres subunidades citosólicas y GTPasaRac2. La activación de la enzima involucra la fosforilación de un componente
citosólico (p47phox), desencadenando la migración de los las subunidades
citosólicas hacia la membrana y el ensamblaje de la enzima. La sobreproducción
de O2●- puede conducir a la formación de fuertes oxidantes, por lo que la
modulación de la actividad y/o ensamblaje de la NOX2 podría evitar efectos
tóxicos provocados por radicales libres. Hemos demostrado previamente que los
nitrolípidos, en particular el nitroaraquidonato (AANO 2), ejercen acciones antiinflamatorias como ser la inducción de la expresión de la hemooxigenasa-1, la
inhibición de la inducción de la óxido nítrico sintasa 2 (NOS2) y de la secreción de
citoquinas pro-inflamatorias por macrófagos activados. Nuestra hipótesis es que
otras respuestas efectoras en macrófagos pueden ser moduladas por AANO 2 en
particular el ensamblaje y/o actividad de NOX2. Al incubar macrófagos con
AANO2, previo a su activación con PMA o zymosán opsonizado, se observó una
inhibición de la actividad NOX2 (IC50 = 10µM AANO2), medida por
quimioluminiscencia del luminol y fluorescencia del Amplex Red. Además, se
observó una disminución de la migración de p47phox a la membrana por Western
blot. Como los nitroalquenos son potentes electrófilos, especulamos que un posible
mecanismo de inhibición de NOX2 por AANO2 podría implicar la formación de un
aducto entre el AANO2 y residuos críticos de cisteína o histidina, impidiendo la
formación del complejo activo de la enzima. Estos resultados nos permitirán
avanzar en elucidar los mecanismos implicados en la inhibición de NOX2 por AANO 2
y sus consecuencias en las respuestas inflamatorias.
147
ADDENDUM
Biología Molecular
METODO ALTERNATIVO DE EXTRACCION DE ADN PARA EL ESTUDIO DE
GENOTIPOS
PANDULLI, I; TRUJILLO, A GRIGNOLA P; GOMES DE FREITAS, S; LLAMBÍ, S Y NICOLINI,
P.
Laboratorio de Técnicas Nucleares, Facultad de Veterinaria y Laboratorio de Biología
Molecular y Endocrinología Metabólica, Facultad de Agronomía, UDELAR.
La extracción de ADN se puede realizar de distintas muestras biológicas y con
distintos procedimientos de extracción. La correcta toma de muestras, el tipo de
tejido y la elección del protocolo de extracción de ADN son puntos críticos para
estudios basados en PCR. El primer objetivo del presente estudio consistió en
estandarizar una técnica de extracción de ADN a partir de pelo bovino, por ser un
método no invasivo, de fácil obtención y almacenamiento. La extracción se realizó
con Chelex (resina quelante de cationes), que es simple, reproducible, económico y
rápido. En segundo lugar, se comparó dicha técnica con la de extracción de ADN de
sangre bovina (n=28) por método salting out para validar la eficacia del primer
método para genotipado de SNPs por High Resolution Melting (HRM). Se extrajo ADN
con el método salting out a partir de sangre y con Chelex a partir de pelo. Se realizó
la lectura de ADN a 260 nm y se evaluó la relación de absorbancia 260nm/280nm
para determinar la concentración y pureza del ADN, respectivamente. Ambos valores
fueron menores para las muestras de pelo respecto a las obtenidas para muestras de
sangre (50-70 vs 350ng/µl, 1,7-2,1 vs 1,9), pero adecuadas para estudios posteriores
de genotipado. Este se realizó mediante la técnica HRM, que es un método de
análisis de curvas de disociación que se realiza inmediatamente después de la
amplificación por PCR en tiempo real y para el cual es necesaria una buena calidad
de ADN. Se obtuvieron un 75 % genotipos concordantes con los obtenidos para
sangre, aunque los valores de eficiencia y confianza resultaron menores (0,70 y ≥75%
respectivamente). En el 25% restante de las muestras, donde no hubo concordancia,
el análisis de confianza y el perfil visual indicaron la necesidad de repetir el
genotipado. Se concluye que la extracción de ADN a partir de pelo bovino con Chelex
es un método promisorio para discriminar genotipos por HRM requiriéndose futuros
trabajos con mayor número de muestras y mejorar las condiciones de amplificación.
Palabras claves: Pelo, SNP, HRM.
148
PURIFICACIÓN DE PROTEINAS DE UNIÓN A (TG/CA)n EN Trypanosoma
cruzi
GUGGERI, L. 1#, PASTRO, L.1#, DUHAGON, M. A.1, SMIRCICH, P.1, DALLAGIOVANNA,
B.2, WILLIAMS, N.3 Y GARAT, B.1
1
Laboratorio de Interacciones Moleculares. Facultad de Ciencias, Montevideo,
Instituto de Biología Molecular de Paraná. Brasil.
3
Department of Microbiology and Immunology. University at Buffalo USA.
#
contribuyeron igualmente a este trabajo
2
El protozoario parásito Trypanosoma cruzi es el agente etiológico de la
Trypanosomiasis Americana, que afecta a millones de personas en América Latina.
La biología molecular en tripanosomátidos presenta peculiaridades.
Los genomas eucariotas contienen un gran número de secuencias repetidas en
tándem que han sido vinculadas a diferentes procesos fisiológicos. Los repetidos de
dinucleótidos son particularmente abundantes en el genoma de T. cruzi.
En este trabajo, se busca profundizar en el rol de los elementos (TG/CA)n en la
regulación de la expresión génica en Trypanosoma cruzi. Nuestro grupo ha
propuesto que las secuencias (TG/CA)n constituyen una señal de regulación en este
parásito (Duhagon y col., 2003). Una de las aproximaciones elegidas para estudiar la
funcionalidad de estos repetidos, consiste en el análisis bioinformático de la
expresión y la función biológica de los genes que contienen estos elementos en cis.
A su vez, nos planteamos la identificación de los elementos que actúan en trans
mediante cromatografías de afinidad y análisis por espectrometría de masas
previamente utilizadas en el laboratorio para la caracterización de una proteína de
unión a los repetidos TG (Tc38). Actualmente, estamos estudiando las interacciones
de las proteínas purificadas y las secuencias repetidas a través de ensayos de
cambio de movilidad electroforética (EMSA). Resultados preliminares indican que
existen al menos tres complejos diferentes para cada repetido. Los complejos
formados no son desplazados por un anticuerpo específico para Tc38, lo cual
indicaría la existencia de otras proteínas que interaccionan con estos elementos.
149
Bioquimica , Biofisica y Biologia Estructural
ENTEROTOXINA LTB DE E.Coli ALTERA LA FUNCION CARDIACA EN
CORAZON AISLADO DE COBAYO.
COTA, C *; ROMPANI, J *, GARCIA, S *; FONTES, J; CHERONI, C, TORRES, H;
SCHMIDT, A; PUGLISI, J # Y FERREIRA, G.
* contribución equivalente. # Dept. Pharmacology.
Univ. California Davis. USA. Laboratorio de Canales Iónicos. Departamento de
Biofísica. Facultad de Medicina. Universidad de la República.
E.Coli, produce enterotoxinas resistentes (ST) o lábiles (LT) al calor, que se
clasifican en A y B. Estas toxinas guardan una homología bastante alta con sus
símiles producidos por Vibrio Cholerae. Clásicamente, se han atribuido losefectos
celulares y patológicos producidos por estas toxinas, a la fracción A de las mismas,
atribuyéndose a la fracción B un rol de transportador del tipo A. Recientemente, se
ha descrito que la fracción B es capaz de unirse a receptores de gangliósidos de
membranas celulares como GM1 (Marengo, 1998). Los cardiomiocitos tienen
abundantes receptores de gangliósidos, variables de acuerdo al tipo y estado
celular, acumulados en ciertas regiones, balsas lipídicas de membrana. Teniendo en
cuenta estos antecedentes y que la activación de GM1 puede producir una
alteración de los niveles de Calcio intracelular, se expusieron corazón y células
aisladas de cobayo a distintas concentraciones de la fracción LTB purificada. Los
resultados muestran que en corazón aislado, con aumento de la dosis de exposición
a LTB se produce: i) Un patrón de contracción alternada, donde el nivel intermedio
de tensión va disminuyendo cada vez menos, produciéndose finalmente varias
contracciones con niveles de tensión sostenidos ii) Un aumento y posterior
disminución de la frecuencia cardíaca iii) Alteraciones del electrograma de
superficie consistentes pero menos dramáticos que los efectos observados en
tensión. Todos los efectos son reversibles y capaces de ser lavados a concetraciones
bajas. La curva dosis-respuesta de ajuste por ec de Hill, muestra una dosis media de
0.2ug/ml, prácticamente igual que la de unión de GM1 a LTB in vitro. Un modelo de
corazón virtual, suponiendo alteraciones en manejo de Calcio intracelular,
reproduce lo observado. Los resultados obtenidos en corazón aislado fueron
consistentes con los de células aisladas e indican que LTB per se, es capaz de
producir alteraciones dramáticas de la función cardíaca.
150
ALTERACIONES EN VIABILIDAD Y MOTILIDAD DE ESPERMATOZOIDES
HUMANOS ANTE EXPOSICION AGUDA A PLOMO.
FERREIRA, G *; TREVIÑO, C; OCAMPO, Y; DE BLAS, G; ORTA, G; GUERRERO, A,
MARTINEZ, P; BALDERAS, E Y DARSZON, A.
* Laboratorio de Canales Iónicos. Departamento de
Biofísica. Facultad de Medicina. Universidad de la República. URUGUAY
Departamento de Genetica del Desarrollo y Fisiologia Molecular. Instituto de
Biotecnologia. UNAM. MEXICO.
El espermatozoide humano, para tener éxito en su función de fecundación,
necesita de una serie de cambios adecuados que habitualmente tienen lugar en un
ambiente propicio, en el tracto genital femenino. Debido a sus características
fisiológicas y genético-moleculares, estas células son bastante sensibles a agentes
tóxicos y farmacológicos. Ha sido reportado que la intoxicación por metales
pesados origina en individuos afectados, graves trastornos de fertilidad. Los
espermatozoides maduros cuentan con un gran número de canales y
transportadores, algunos específicos y otros comunes con células de músculo
cardíaco. Dados estos antecedentes y teniendo en cuenta nuestros reportes
anteriores (Rompani y col, 2007a,b), decidimos estudiar como la exposición aguda
al Plomo origina estas fallas en fertilidad, valorando trastornos funcionales en
motilidad, viabilidad y vías de entrada de Plomo al espermatozoide. Respecto a la
letalidad, valorada mediante tincion por eosina, para un indice de letalidad
maxima o final de 100%, el Kd observado fue de 121uM y la cinetica´ ante 100uM
de Plomo, mostro un T1/2 de 1.44 hs. Respecto a los parámetros de motilidad
medidos por Computer Assisted Sperm Analysis, disminuyeron la frecuencia de
batido, la amplitud de desplazamiento lateral, la velocidad de desplazamiento y
porcentaje de hiperactivacion con Kds entre 90 y 400 uM. En contraste, aumento el
% de velocidad lineal de traslación, con Kd de aprox 70 uM. Estos cambios se
produjeron durante las primeras dos horas de exposición a Plomo. Bay K 8644
250nM aumenta y DHP 1uM disminuye parcialmente los efectos observados. Ante la
carga de espermatozoides con pigmentos fluorescentes sensibles a metales pesados
se observaron efectos consistentes, existiendo abolición total de la entrada de
Plomo ante la aplicación de Gd 1uM. Estos datos sugieren que la entrada de Plomo
al espermatozoide ocurre tanto por canales de Calcio L como por otros canales
permeables a Calcio (Trp).
151
MODELOS DE COMPLEJIDAD CRECIENTE PARA LA FORMACIÓN DE
RADICALES ETANOLAMINILO EN EL SITIO ACTIVO DEL SITEMA
EAL/COENZIMAB12.
SIGNORELLI, S.; BONANATA J.; COITIÑO, E. L.
Laboratorio de Química Teórica y Computacional, Instituto de Química Biológica,
Facultad de Ciencias, Universidad de la República.
Etanolamina amonio liasa (EAL) es un enzima presente en bacterias entéricas que
cataliza la conversión de etabolamina en amonio y acetaldehído, en presencia de
adenosilcobalamina (AdoCbl, una coenzima B 12).1 El mecanismo global de reacción
más aceptado incluye: (a) formación de radicales 5-desoxiadenosilo (Ado·) por
homólisis del enlace Co-C en AdoCbl; (b) activación del sustrato por abstracción de
H en C1 por Ado·.; (c) migración 1,2 de –NH2 en el radical sustrato; (d) regeneración
de Ado· y su recombinación (e) eliminación de NH3 formando acetaldehído.1-3
Los primeros pasos vienen siendo objeto de numerosos estudio experimental, siendo
además modelados a nivel ab-initio y DFT con distintas representaciones del entorno
proteico, intentando explicar la cinética observada mediante protonación parcial
por His o por catálisis “push-pull” asistida por dos aminoácidos del enzima.2b-c,3b-c En
éstos modelos se recortó drasticamente el sistema reaccionante y su entorno,
principalmente debido al desconocimiento de la estructura 3D de la EAL, en parte
elucidada más recientemente.
Nuestro grupo viene investigando los efectos del entorno sobre el mecansimo
detallado y cinética de b y c con el modelo continuo PCM-IEF (que no requiere
detallar su naturaleza discreta), contrastando los resultados así obtenidos con
aquellos publicados por los grupos de Scahwart2 y Radom3 quienes modelaron en fase
gaseosa al sustrato y recortes del radical Ado · y de los aminoácidos asistentes. Aquí
examinaremos a nivel B3LYP/6-31G(d,p) qué influencia tiene cambiar la descripción
molecular del paso b (particularmente atractivo por experimentar efecto túnel) en
una progresión de modelos moleculares de complejidad creciente para reactivos,
productos, complejos intermediarios y estado de transición de la transformación,
caracterizados sin/con protonación. Conjugando este conocimiento con el de la
estructura 3D de la EAL proponemos cuáles serían los residuos participantes en caso
de ocurrir asistencia por protonación parcial simple o de tipo push-pull.
[1] a) Chemistry and Biochemestry of B12, R. Banerjee (ed.), 1999; b) T. Toraya,
Chem. Rev. 2003 101, 2095-2127.
[2] a) M. Semijaljac, H.Schwartz, Chem. Eur. J. 2004 10, 2781-2788; b) 2003 J. Org.
Chem. 68, 6967-6983; 2002 J. Am. Chem. Soc. 124, 8974-8983.
[3] a) G. M. Sandala, D. M. Smith, L. Radom, J. Am. Chem. Soc. 2005 127, 88568864; b) S. D. wetmore, D. M. Smith, J. T. Bennett, L. Radom, J. Am. Chem. Soc.
2002 124, 14054-14065.
[4] Joint Center for Structural Genomics, 2007 (no publicado; depositado en RCSB
PDB Databank, código 2qez).
152
Bioquimica y Biologia Molecular de Microorganismos.
EXPRESIÓN
DE
ENZIMAS
MANGANESO
DEPENDIENTES
DE
Phanerochaete chrysosporium EN FUNCIÓN DE
CONDICIONES DE
CULTIVO.
IBÁÑEZ C.1, BARRACO M.2, CERDEIRAS M.2 Y CECCHETTO G.3
1
Unidad Académica de Gestión Tecnológica, Facultad de Química; 2 Microbiología,
Facultad de Ciencias; 3 Cátedra de Microbiología, Facultad de Química, Universidad
de la República. Montevideo Uruguay
Uno de los más importantes agentes bióticos causantes del deterioro de la madera
son los hongos de la podredumbre blanca. Estos basidiomycetes se caracterizan por
poseer un sistema enzimático capaz de degradar los tres componentes
constitutivos de la madera, la celulosa, hemicelulosa y la lignina. En particular, su
sistema ligninolítico está formado por cuatro enzimas: una lacasa (Lac) y tres
peroxidasas con distintos potenciales de oxidación, pertenecientes al metabolismo
secundario, manganeso peroxidasa (MnP), lignino peroxidasa (LiP) y peroxidasa
versátil (VP).
Este trabajo forma parte de una investigación en curso que estudia la aplicación de
una solución rica en Zn y Mn, obtenida de un proceso de reciclado, como
preservante para madera. Se va a analizar el efecto de los mencionados metales
sobre la expresión enzimática de las MnP empleando PCR en tiempo real, iniciando
el análisis con el Phanerochaete chrysosporium, microrganismo modelo, cuya
producción enzimática depende fuertemente de las condiciones de cultivo. El
primer paso que se presenta es la realización de cinéticas de expresión de cultivos
en medios de diferente composición y diferentes condiciones de incubación, con el
objetivo de determinar las condiciones y los tiempos de mayor expresión de los
genes mnp y de la actividad enzimática respectiva en los que posteriormente se
analizará el efecto de los metales. Se compara el efecto de un medio rico (RB) con
medios en las denominadas condiciones ligninolíticas, carencia de carbono (CLB) o
de nitrógeno (NLB), las temperaturas de cultivo son 28°C y 37°C.
La actividad enzimática se determina espectrofotometricamente. La expresión
génica por PCR cuantitativa en tiempo real, empleando como gen de referencia el
de la gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa (Gpd). Los resultados de estos
ensayos se vinculan con las determinaciones de actividad enzimática realizadas
sobre las mismas condiciones de cultivo.
153
Parasitología Molecular
ANÁLISIS DE PROTEÍNAS DE TEGUMENTO DE FASCIOLA HEPATICA
INVOLUCRADAS EN LA RESPUESTA DEL HOSPEDADOR OVINO
BASIKA, T.1,2, BERNAL, D.3, VALERO, L.4, SÁNCHEZ DEL PINO, M.M.4, ACOSTA, D1.,
CARMONA, C.1 & MARCILLA, A.2
1
Unidad de Biología Parasitaria, Instituto de Higiene, UdelaR, Montevideo,
Uruguay; +5982 4801597; [email protected]; 2Departamento de Biología
Celular y Parasitología, Facultat de Farmacia, Universitat de Valencia (Valencia,
España), 3Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias
Biológicas, Universitat de Valencia (Valencia, España); 4Servicio de Proteómica,
Centro de Investigación “Príncipe Felipe” (Valencia, España);
Con el objetivo de identificar las proteínas de tegumento de Fasciola hepatica
involucradas en la respuesta del hospedador ovino se han analizado por técnicas de
proteómica (electroforesis en geles bidimensionales, espectrometría de masas e
inmunodetección con sueros de ovinos infectados experimentalmente) los
materiales liberados del parásito mediante tratamiento con deoxicolato sódico.
Se han realizado ensayos utilizando tiras de gradiente de pH inmovilizado (IPG) de
3-10 y de pH 5-8. Los resultados obtenidos muestran que las proteínas del
tegumento fueron resueltas en aproximadamente 16 manchas con pI comprendidos
entre 5.7 y 7.7 y con pesos moleculares (PM) comprendidos entre 20 y 77 kDa.
Comparativamente, en extractos totales del parásito las proteínas mayoritarias
fueron resueltas en aproximadamente 19 manchas con pI entre 5.4 y 7.7, y con PM
entre 19 y 86 kDa.
El análisis por inmunoblot ha detectado varias manchas inmunogénicas detectadas
por los sueros de ovejas infectadas experimentalmente con F. hepatica
(procedentes de Uruguay), que han sido cortadas y enviadas para su identificación
por espectrometría de masas.
Estudio financiado por Vicerrectorado de Relaciones Institucionales y Cooperación
de la Universitat de València-Estudi General – Fundació General de la Universitat
de València y PROMETEO/2009/081 de la Generalitat Valenciana (Valencia,
España).
154
AUSPICIANTES
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156

Programa y resumenes - Instituto de Investigaciones Biológicas

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