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FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR (FS)
•
Las técnicas de fraccionamiento subcelular (FS) fueron
desarrolladas en la década del ‘50, como un resultado del
desarrollo de las ultracentrífugas. Aunque el
fraccionamiento de estructuras subcelulares también puede
llevarse a cabo por otros procedimientos, la
ultracentrifugación sigue siendo la técnica usada en la
mayoría de los casos.
•
Las técnicas de FS fueron instrumentos para el
descubrimiento de varias organelas, particularmente
lisosomas y peroxisomas. Estos descubrimientos resultaron
en el otorgamiento de los premios Nobel a Palade, Porter y
de Duve en 1974.
•
La correlación encontrada respecto a que ciertas
actividades enzimáticas sedimentan con una cinética similar
a la de estructuras diferenciadas que pueden observarse al
microscopio electrónico, fue la base más firme que condujo
al descubrimiento de nuevas organelas.
RELEVANCIA DEL FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR
EN LA INVESTIGACIÓN BIOLÓGICA
•
Un tema importante en la investigación bioquímica es no solo
resolver las reacciones bioquímicas, sino conocer y entender en
que tipo de estructura celular ocurren, y como diferentes procesos
bioquímicos son coordinados en diferentes regiones de la célula.
•
A finales de las décadas del ’80 y ’90, el fraccionamiento
subcelular dejó de ser “popular”. En esos momentos se puso de
moda que las cuestiones biológicas debían ser resueltas sin destruir
la célula, o simplemente debía limitarse la destrucción a la
permeabilización de la membrana celular.
•
Sin embargo, en este nuevo siglo emergió con mucha potencia la
proteómica en general y la proteómica de las organelas en
particular, entonces el fraccionamiento subcelular controlado
comenzó a tomar relevancia nuevamente.
Sistema de endomembranas
La mitocondria y el cloroplasto
Las organelas pueden a su vez sub-fraccionarse
MITOCONDRIA
Pasos a seguir en un fraccionamiento subcelular
1. Aislamiento de células o tejidos. En un primer
momento los estudios de fraccionamiento subcelular se
hicieron con órganos como hígado y riñon. Sin embargo,
el hígado está formado por 4 tipos diferentes de células
(hepatocitos, cél. endoteliales, cel. ‘Kupffer’ y de forma
estrellada). Entonces, para estar seguros del origen de
las actividades que se estudian, primero se tienen que
separar las células, luego las organelas de cada tipo
celular y luego ver con que organela está asociada la
actividad.
2. Homogeneización
3. Separación de Organelas en fracciones
4. Análisis bioquímico
1. Aislamiento de células o tejidos.
2. Homogeneización. La homogeneización es el paso
mas crítico en cada procedimiento. El obejtivo es abrir la
mayoría de las células, pero manteniendo las organelas
lo más intactas posible. Alcanzar el mejor compromiso
entre los dos objetivos resulta en la mejor condición final
que puede lograrse para el experimento
3. Separación de Organelas en fracciones
4. Análisis bioquímico
1. Aislamiento de células o tejidos.
2. Homogeneización.
3. Separación de Organelas en fracciones. La
separación de organelas en fracciones se lleva a cabo
generalmente por centrifugación diferencial, aunque
existen otros métodos (centrifugación en gradientes de
densidad, electroforesis, inmunoprecipitación)
4. Análisis bioquímico
Homogeneizador
Homogeneización. Algunas consideraciones
1.
Células de plantas y animales tienen entre 5 y 100 um de
diámetro. Las bacterias tienen entre 1 y 2 um de largo. El
mycoplasma, clasificado algunas veces como bacteria, tiene
300 nm de diámetro. Un ribosoma de bacteria tiene 20 nm.
2.
La regla general es: Cuanto más grande sea la célula es más
fácil de romper. Menos fuerza es requerida.
3.
La homogeneización se lleva a cabo en general en un buffer
isotónico con sacarosa y a pH neutro. El medio isotónico
evita efectos osmóticos y protege la integridad de las
organelas.
4.
Medio hipotónico. En algunas oportunidades es utilizado para
romper la membrana de las células. Ello conduce al llenado
de la célula, lo cual reduce la fuerza necesaria para su rotura.
Centrifugación Diferencial
Sedimentación durante la centrifugación
Centrifugación en gradiente de densidad
La densidad
depende de
la relación
entre
proteína y
lípidos que
tiene la
muestra.
Distintos tipos de partículas
usadas en los gradientes
Sacarosa: Sustancia permeable a la membrana. El
resultado es que tendrá la misma densidad en la solución
del gradiente del tubo que dentro de la organela.
Percoll: Es un medio de alto peso molecular basado en
particulas de sílica. El medio del gradiente no penetra las
organelas, la cual no alcanza la densidad del medio. Este
tipo de partículas genera un gradiente por si mismo. Dado
el tamaño de las partículas, el gradiente se genera durante
la centrifugación y por lo tanto no debe ser generado
antes de la corrida.
Gradientes lineales
Percoll: Un gradiente que se forma a
si mismo durante la centrifugación
Preparación de un gradiente discontinuo
Tipos de rotores para el proceso de centrifugación
El gradiente es separado y las fracciones son recogidas
por medio de un colector para su análisis bioquímico
Centrifugación isopícnica y zonal
• Centrifugación isopícnica:
se lleva a cabo hasta que cada organela alcanza su propia
densidad en el medio en que es centrifugada.
• Centrifugación zonal:
utiliza la propiedad de que algunas organelas alcanzan su
densidad antes que otras durante la centrifugación en
función de su tamaño y forma. Este es el mismo principio
que la centrifugación diferencial. Después de la
centrifugación, la ubicación de las organelas depende de
un compromiso entre la densidad de las mismas y su
tamaño.
Coeficientes de Sedimentación en unidades Svedberg.
Un Svedberg (S) equivale a 10-13 seg y sirve para medir el tiempo de sedimentación de una proteína o
macromolécula en condiciones normales (depende de su masa). Coef. Sedimentación (S) = Vel.
sedimentación (m.seg) / aceleración (m.seg2). ‘S’ se mide en seg. Un S de 7 x 10-13 seg, se expresa 7S.
ALGUNAS DENSIDADES DE
MACROMOLECULAS
La recuperación de la actividad biológica presente en
una fracción es uno de los mayores desafíos en un
fraccionamiento subcelular
CUIDADOS:
1.
Un órgano consiste de varios tipos de células. Cuando se
homogeneiza un tejido, una actividad enzimática puede
provenir de diferentes tipos de células y esto no se puede
controlar a no ser que se separen los diferentes tipos de
células previamente.
2.
En estudios de secuencias de reacciones que tienen lugar en
una organela, puede ocurrir que uno o más pasos de esa
reacción ocurren en otra organela.
Recordar que uno cree que aisló una organela pero lo único
que tiene es una fracción subcelular que en el mejor de los
casos está muy enriquecida en esa organela. Por lo tanto,
siempre contendrá contaminantes de otras fracciones
subcelulares.
3.
Supongamos que una determinada actividad enzimática está
presente en el extracto soluble (citosólico) luego de separar las
organelas. Sin embargo, las roturas de las organelas pueden
llevar a que actividades enzimáticas solubles en las organelas
estén ahora contaminando la fracción citosólica.
La conversión de colesterol a bilis se lleva a cabo con
actvidades enzimáticas que se encuentran en diferentes
compartimentos subcelulares de un hepatocito
…del tamaño de un ribosoma.
ORGANIZACIÓN DEL MATERIAL
GENÉTICO DE UN VIRUS
ALGUNAS ESTRUCTURAS DE VIRUS
Las estructuras de las cápsides de los virus han sido determinadas por
cristalografía de rayos X y se conocen con una resolución de orden
atómico.
v del
Virus
mosaico
del
i
tabaco
r
Los virus tienen un rango de huéspedes limitado
Formas y Microfotografías de Virus
Virus de la rabia,
ARN (-) ss, >150
especies
Virus de la gripe,
ARN, MUY
PELIGROSO el de la
gripe aviaria H5N1
Muy poco patógeno.
Algunos son
oncolíticos. Se usan
en terapia génica y
anticancer.
Virus de la vacuna
contra la viruela.
DNA ds.
Bacteriofago T4
cabeza
cuello
vaina
cola
Fibras de cola
espiculas
Placa basal
Infección de una Bacteria por un Fago
La realidad es más compleja y fantástica que un
esquema. Fago T4 transfiriendo su DNA
(A) TEM (Microscopía
Electrónica Transmisión) de
un fago T4. La cabeza tiene
el DNA que es inyectado por
medio de la cola en la
bacteria huésped.
(B) Sección de una bacteria con
el T4 adherido a su
superficie. Los elementos
oscuros en el interior de la
bacteria son nuevas cabezas
de T4 en proceso de
ensamblaje. Una vez
maduros, la bacteria explota
y libera los nuevos fagos.
Multiplicación del material genético de un Virus
Ciclos de vida de virus animales
Adquisición de la envoltura vírica.
(A) Micrografía electrónica (TEM) de una célula animal en la que están
gemando 6 partículas virales con su envoltura. (B) Esquema que representa el
ensamblaje de la envoltura y la gemación. La bicapa lipídica que envuelve la
cápside deriva de la MP de la célula huésped. Las proteínas verdes, en cambio,
están codificads por el genoma del virus.
Virus dsDNA
dsDNA,
Herpesvirus
dsDNA,
Viruela y
Varicela
dsDNA,
Hepatitis B
(Hepatitis A es
RNA+)
RETROVIRUS (virus RNA, Ej. HIV)