ENFERMEDADES DE OVEJAS Y CABRAS EN LA LISTA B

Transcripción

SECCION 2.4.
ENFERMEDADES DE OVEJAS Y CABRAS EN LA
LISTA B
CAPÍTULO 2.4.1.
EPIDIDIMITIS OVINA
(Brucella ovis)
RESUMEN
Brucella ovis produce una enfermedad clínica o subclínica en el ganado ovino que se caracteriza
por lesiones genitales en los carneros y placentitis en las ovejas. Por consiguiente, las
consecuencias principales de la enfermedad son una disminución de la fertilidad en los carneros,
abortos poco frecuentes en las ovejas, y una subida de la mortalidad perinatal. La enfermedad se
ha descrito en Argentina, Australia, Brasil, Canadá, Chile, Francia, Alemania, Hungría, México,
Nueva Zelanda, Perú, Rumanía, Rusia, República Eslovaca, Africa del Sur, España, Estados
Unidos de América y Uruguay, aunque probablemente se presenta en la mayoría de los países que
crían ovejas.
Identificación del agente: La existencia de lesiones clínicas (epididimitis unilateral u,
ocasionalmente, bilateral) en los carneros puede ser indicativa de la existencia de la infección,
aunque son necesarios estudios de laboratorio para confirmar el diagnóstico. La confirmación de
laboratorio puede basarse en métodos directos o indirectos. El diagnóstico directo se realiza por
medio del aislamiento bacteriológico en medios selectivos adecuados para B. ovis a partir de
muestras de semen o tejidos de los carneros, o flujos vaginales y leche de las ovejas. Se están
desarrollando métodos de biología molecular, como la reacción en cadena de la polimerasa y la
electroforesis de campo pulsado. Sin embargo, para el diagnóstico de rutina se prefiere el
diagnóstico indirecto basado en pruebas serológicas.
Pruebas serológicas: Se pueden utilizar la técnica de fijación de complemento (TFC), la prueba
de inmunodifusión en gel de agarosa (IGDA), y el enzimoinmunoensayo (ELISA), empleando
antígenos de superficie solubles obtenidos a partir de B. ovis. Se están probando en ensayos de
campo algunos ELISAS que utilizan proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales. La
sensibilidad de las pruebas IGDA y ELISA es parecida y a veces la del ELISA es mayor que la de
la TFC. En cuestión de sensibilidad, una combinación de las técnicas IGDA y ELISA parece ofrecer
los mejores resultados. Sin embargo, respecto al coste y la simplicidad, la prueba IGDA es el
ensayo más factible para el diagnóstico de B. ovis. No obdstante, el ensayo obligatorio para el
comercio internacional continúa siendo el TFC.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Los cultivos del inóculo para la
producción de antígeno o vacuna deben obtenerse a partir de laboratorios reconocidos
internacionalmente. Para la prevención de la infección de los carneros por B. ovis, puede utilizarse
de manera segura y efectiva una dosis única estándar de vacuna viva de B. melitensis Rev. 1 (109
unidades formadoras de colonias) administrada subcutáneamente o en la conjuntiva. Esta cepa de
vacuna debe cumplir los estandares mínimos de calidad: una concentración adecuada, ausencia
de disociación, adecuada virulencia residual e inmunogenicidad, y ausencia de agentes externos
(ver el Capítulo 2. 4. 2. Brucelosis caprina y ovina [excluyendo la infección por B. ovis]).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.4.1. — Epididimitis ovina (Brucella ovis)
A. INTRODUCCIÓN
Brucella ovis causa una infección genital en el ganado ovino que se manifiesta por epididimitis, abortos poco
frecuentes y aumento en la mortalidad de los corderos. La transmisión pasiva a través de la oveja parece ser una
vía de infección frecuente, aunque también lo es la transmisión de carnero a carnero 1. (2). Las ovejas
pueden excretar B. ovis en los flujos vaginales y la leche, y por lo tanto, la transmisión oveja-carnero y oveja
lactante-carnero también pueden ser mecanismos determinantes de la infección.
La demostración de la existencia de lesiones genitales (epididimitis unilateral u, ocasionalmente, bilateral)
mediante palpación de los testículos de los carneros puede ser un indicio de la presencia de esta infección en un
rebaño. Sin embargo, este diagnóstico clínico no es suficientemente sensible porque solamente un 50% de los
carneros infectados con B. bovis presentan epididimitis (2). Es más, el diagnóstico clínico es extremadamente
inespecífico debido a la existencia de muchas otras bacterias que causan epididimitis clínica. Los
microorganismos que más frecuentemente causan epididimitis en los carneros incluyen Actinobacillus seminis, A.
actinomycetencomitans, Histophilus ovis, Haemophilus spp., Corynebacterium pseudotuberculosis ovis, B.
melitensis y Chlamydophila abortus (antiguamente Chlamydia psittaci) (4, 5, 8, 10, 12, 22, 28, 31). Debe hacerse
hincapié en que muchas lesiones epididimales palpables en los carneros son granulomas espermáticos estériles
provocados por un trauma.
Aunque el ganado vacuno, las cabras y los ciervos han demostrado ser susceptibles a B. ovis en experimentos
de transmisión artificial, los casos naturales solamente se han descrito en ciervos (19). Hasta la fecha no se han
descrito casos en humanos, y B. ovis se considera no-zoonósico. Sin embargo en las áreas donde la infección
por B. melitensis coexiste con B. ovis, es necesario un cuidado especial cuando se manejan las muestras, las
cuales deberían transportarse al laboratorio en contenedores herméticos.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
a)
Recogida de muestras
Las muestras más valiosas para el aislamiento de B. ovis a partir de animales vivos son el semen, frotis
vaginales y la leche. Para la recogida de frotis vaginales y leche, ver las instrucciones que se dan en el
Capítulo 2.4.2. La brucelosis caprina y ovina (excluyendo la infección por B. ovis). El semen (fluidos
genitales) se puede recoger fácilmente en frotis tomados de la cavidad prepucial después de la electroeyaculación. Si no existe un electro-eyaculador disponible, los frotis pueden ser recogidos a partir de la
vagina de ovejas libres de brucelosis inmediatamente después del apareamiento natural.
Para el aislamiento de B. ovis después de la necropsia, los órganos preferidos en cuanto a la probabilidad
de aislamiento son el epididimo, la vesícula seminal, las ampollas de los conductos deferentes y los nódulos
linfáticos inguinales en los carneros, y el útero y los nódulos linfáticos ilíacos y supramamarios en las
ovejas. Sin embargo, para obtener una sensibilidad máxima, se debe realizar una búsqueda completa que
incluya otros órganos y nódulos linfáticos (del bazo, craneales, escapulares, prefemorales y testiculares).
También se deben examinar los corderos muertos y las placentas. Los sitios preferidos para el aislamiento
a partir de corderos abortados o nacidos muertos son el contenido abomasal y el pulmón.
Las muestras para el cultivo deben refrigerarse y transportarse al laboratorio para ser cultivadas lo antes
posible después de la recogida. El organismo permanece viable durante al menos 72 horas a temperatura
ambiente, y la supervivencia se mejora a 4 °C o, preferiblemente, mediante congelación de las muestras de
tejido.
b)
Métodos de tinción
Los frotis vaginales o de semen se pueden examinar siguiendo la tinción por el método de Stamp (1, 7) (ver
Capítulo 2.4.2.), y los cocobacilos característicos deben ser visibles en muchos de los animales infectados
1
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En los sistemas de producción semiextensivos (más frecuentes en los países de la Europa Mediterránea) los carneros
normalmente se alojan juntos. La transmisión directa de carnero a carnero durante los periodos de ausencia de
reproducción es bastante frecuente y se ha sugerido que tiene lugar mediante varias vías, incluyendo la mucosa rectal.
Sin embargo, la mayoría de las infecciones de carnero a carnero se producen a través de la vía oral. Los carneros
estabulados establecen jerarquías (combates cabeza contra cabeza), y es frecuente que los carneros “dominados”,
después de ser “montados” por los carneros dominantes, laman el prepucio de los carneros dominantes como un acto de
sumisión. Si estos carneros dominantes están infectados, la probabilidad de tener B. ovis en el prepucio (secreción en el
semen) es muy alta.
(29). El exámen de frotis de tejidos sospechosos teñidos por el método de Stamp (tracto genital de carnero,
nódulos linfáticos inguinales, placentas, y contenido abomasal y pulmón de los fetos) puede también
permitir un diagnóstico presuntivo rápido.
Sin embargo, también en tales muestras pueden estar presentes otras bacterias con morfología o
características tintoriales similares (B. melitensis, Coxiella burnetii y Chlamydophila abortus), haciendo difícil
el diagnóstico para el personal con poca experiencia. Los resultados microscópicos siempre deben
confirmarse mediante el cultivo del microorganismo.
c)
Cultivo
El mejor método directo de diagnóstico es el aislamiento bacteriológico en medios de cultivo adecuados. las
muestras de semen, frotis vaginales, o leche se pueden extender directamente en placas con el medio de
cultivo adecuado e incubarse a 37 °C en una atmósfera con CO2 al 5-10%. Los tejidos deben macerarse y
homogenizarse antes de sembrarlos en una pequeña cantidad de solución salina o tampón fosfato estéril
(PBS) con un homogenizador o una licuadora.
El crecimiento aparece después de 3-4 días, pero los cultivos no deben descartarse como negativos hasta
que han transcurrido 7 días. Las colonias de B. ovis se hacen visibles (0.5-2.5 mm) después de 3-4 días de
incubación, y son rugosas, redondeadas, brillantes y convexas.
Brucella ovis puede ser aislada en medios no selectivos, tales como el agar-sangre base enriquecido con
suero ovino o bovino estéril al 10%, o en medio de agar-sangre con sangre ovina estéril al 5-10%. Sin
embargo, el inóculo frecuentemente contiene otras bacterias que a menudo enmascaran el crecimiento de
B. ovis. Por consiguiente, puede preferirse el uso de medios selectivos. Se han descrito varios medios
selectivos para B. ovis. Se recomienda el medio modificado de Thayer-Martin (3, 13). Brevemente, puede
prepararse con medio base GC (38 g/litro; Biolife Laboratories, Milan, Italia) suplementado con hemoglobina
(10 g/litro; Difco) y metanosulfonato de colistina (7,5 mg/litro), vancomicina (3 mg/litro), nitrofurantoina (10
mg/litro), nistatina (100.000 Unidades Internacionales [UI]/litro = 17,7 mg) y anfotericina B (2,5 mg/litro)
(todos los productos de Signa Chemical, St Louis, Estados Unidos de América . Las soluciones de trabajo
se preparan como sigue:
Solución A: añadir 500 ml de agua destilada al medio base GC, calentar la mezcla cuidadosamente hasta
ebullición mientras se agita continuamente y autoclavar a 120 °C durante 10 minutos.
Solución B: resuspender la hemoglobina en 500 ml de agua destilada, añadiendo el agua lentamente para
evitar grumos. Una vez disuelta, añadir una barilla magnética y autoclavar a 120 °C durante 20 minutos.
Solución de antibiótico (preparada en el día): la colistina, nistatina y vancomicina se resuspenden en una
mezcla de metanol/agua (1/1); la nitrofurantoina se resuspende en 1 ml de una solución estéril de NaOH 0,1
M. Para la anfotericina B, se recomienda preparar una solución de base de 10 mg/ml de anfotericina B con
10 mg disueltos en 1 ml de dimetil sulfóxido estéril (C2H6OS, para análisis; ACS) y añadidos después a 9 ml
de PBS (10 mM , pH 7,2 ). Cualquier solución de stock que sobre puede almacenarse varios días a 4 °C.
Todas las soluciones de antibióticos deben filtrarse a través de filtros de 0,22 µm antes de añadirse al
medio de cultivo.
Una vez autoclavados, estabilizar la temperatura de ambas soluciones (45-50 °C) con agitación continua.
Mezclar ambas soluciones (añadiendo A sobre B), evitando la formación de burbujas. Añadir las soluciones
de antibióticos mientras se agita continuamente y con cuidado. Repartir en placas estériles.
Una vez preparadas, las placas no deben almacenarse durante largos periodos de tiempo, y siempre se
recomienda el medio recién preparado. Este medio también es adecuado para el aislamiento de B.
melitensis (ver Capítulo 2.4.2).
Todos los medios de cultivo deberían someterse a un control de calidad con la cepa de referencia para
asegurar que permiten su crecimiento.
Otra combinación de antibiótico adecuada, aunque menos efectiva, es: vancomicina (3 mg/litro); colistina
(7,5 mg/litro); nistatina (12.500 UI/litro); y nitrofurantoina (10 mg/litro).
d)
Identificación y tipificación
Las colonias de Brucella ovis son no-hemolíticas. Son circulares, convexas, tienen bordes enteros, son
siempre de tipo rugoso cuando se obervan con iluminación indirecta, y son positivas en la prueba de la
acriflavina (1, 7). Brucella ovis carece de actividad ureasa, no reduce el nitrato a nitrito, es catalasa positivo
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y oxidasa negativo, no produce H2S y, aunque no crece en presencia de violeta de metilo, generalmente
crece en presencia de concentraciones estándar de fuchsina básica y tionina. Los cultivos no se lisan por la
dilución corriente de prueba (RTD), o 104 RTD, de los fagos de Brucella de los grupos Tbilissi (Tb),
Weybridge (Wb) e Izatnagar (Iz), mientras que se lisan por el fago R/C (1, 7). La mayoría de los laboratorios
no se encuentran equipados para una identificación completa, y es necesario un programa práctico para la
identificación presuntiva. La mayoría de los aislados de B. ovis pueden identificarse correctamente por sus
características de crecimiento, la observación directa empleando luz reflejada indirecta, la tinción de Gram o
Stamp, y las pruebas de la catalasa, oxidasa, ureasa y acriflavina. Sin embargo, la identificación definitiva
debe ser llevada a cabo por laboratorios de referencia con experiencia en identificación y tipificación de
Brucella. Un método de electroforesis en gel de campo pulsado puede distinguir B. ovis de otras especies
de Brucella (7). Además, B. ovis se puede distinguir de otras especies de Brucella por medio de los
patrones de polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción mediante reacción en cadena de la
polimerasa (PCR RFLP), para los genes omp2a, omp2b, omp25 y omp31, que codifican las proteínas
fundamentales de la membrana externa de todas las especies de Brucella (27).
2.
Pruebas serológicas
Los ensayos más eficaces y utilizados son la prueba de fijación de complemento (TFC), la prueba de doble
inmunodifusión en gel de agarosa (IGDA) y el enzimoinmunoensayo indirecto (ELISA). Varios países han
adoptado varias técnicas diagnósticas estándar para B. ovis, pero la única prueba prescrita por la OIE y la Unión
Europea para el comercio internacional es la TFC. Sin embargo, se ha demostrado que el ensayo IGDA muestra
una sensibilidad parecida a la de la TFC, y es una prueba más simple de realizar. Aunque se carece de
estandarización, numerosos estudios independientes han mostrado que el ELISA es más sensible que los
ensayos TFC o IGDA.
•
Antígenos
Cuando las células rugosas de Brucella se extraen con solución salina mediante calor (método salino
caliente, HS), se consiguen extractos antigénicos solubles en agua, cuyo componente mayoritario precipita
con sueros frente a Brucella rugosas (9, 18). Por esta razón los extractos HS han sido mencionados como
el “antígeno específico rugoso” o, cuando se obtienen a partir de B. ovis, como el “antígeno específico de B.
ovis”. Sin embargo, la caracterización química de los extractos HS de B. ovis ha puesto de manifiesto que
éstos se encuentran enriquecidos con lipopolisacárido rugoso (R-LPS), con proteínas de la membrana
externa del grupo 3, y con otros componentes de la membrana externa (20). Por tanto, los extractos HS
contienen determinantes de LPS específicos para B. ovis, pero también componentes antigénicos
adicionales, algunos de ellos compartidos con B. melitensis y otras Brucella rugosas o lisas (23). Tales
componentes son responsables de la reactividad cruzada que se observa a veces con el método HS en
sueros de ovejas infectados con B. melitensis o vacunadas con Rev. 1 (20). Debido a su solubilidad en
agua y alto contenido en epitopos relevantes de la superficie celular, el extracto HS es el mejor antígeno de
diagnóstico, y ha sido muy utilizado para el diagnóstico serológico de la infección por B. ovis.
Brucella ovis REO 198, una cepa CO2 y suero-independiente, está recomendada como la fuente de
antígenos HS para ser utilizados en las técnicas serológicas. Esta cepa se puede obtener del INRA2. Los
medios sólidos descritos en la Sección B.1.c. son adecuados para el crecimiento de B. ovis REO 198. El
antígeno HS se prepara como sigue:
2
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i)
Crecer exponencialmente una cepa adecuada de B. ovis, preferiblemente aeróbica y no suero
dependiente, por ejemplo REO 198, de una de las siguientes formas: durante 48 horas en matraces
con caldo tripticasa-soja en un incubador orbital a 37°C y 150 rpm; o en botellas de Roux o agar
tripticasa-soja u otro medio adecuado, con un 5% de suero añadido (no necesario cuando se utiliza la
cepa REO 198); o en un fermentador de producción como se ha descrito para B. abortus, pero con la
adición al medio de suero al 5% (no necesario cuando se utiliza la cepa REO 198).
ii)
Las células se lavan dos veces y se resuspenden en solución salina al 0.85% (12 g de células secas o
30 g de células concentradas húmedas en 150 ml).
iii)
La suspensión celular se autoclava a 120°C durante 25-30 minutos.
iv)
Después de enfriar, la suspensión se centrifuga (15.000 g, 4°C, 15 minutos) y el líquido sobrenadante
se filtra y dializa frente a agua destilada (3 x 100 volúmenes) a 4°C durante al menos 2 días.
v)
El líquido dializado se ultracentrifuga (100.000 g, 4°C, 6-8 horas) y el sedimento se resuspende en un
pequeño volumen de agua destilada y se liofiliza.
Institut national de la recherche agronomique (INRA) Laboratorie de Pathologie Infectieuse et Immunologie, 37380
Nouzilly, France
El HS se resuspende entonces bien en agua destilada (para su uso en la prueba IGDA), tampón salino
veronal (para su uso en la TFC), o tampón carbonato/bicarbonato o PBS (para su uso en el ELISA), y se
titula frente a un conjunto adecuado de sueros positivos y negativos.
El HS resuspendido se mantiene a 4°C con fenol al 0,5% como conservante (solamente para el uso en la
prueba IGDA) o liofilizado. Se debe evitar la congelación y descongelación (9). El antígeno TFC debe
estandarizarse frente al Suero Estándar Internacional anti-B. ovis3.
a)
Prueba de fijación de complemento (la prueba prescrita para el comercio internacional)
No existe un método estandarizado para la TFC, pero es mejor realizar la técnica por el método de
microtitulación. Algunas trabajos indican que la fijación fría es más sensible que la fijación caliente (6, 21,
24), pero es menos específica. Las reacciones anticomplementarias, frecuentes con suero de oveja, son,
sin embargo, más frecuentes con la fijación fría.
Se han propuesto varios métodos para la TFC utilizando diferentes concentraciones de hematíes de oveja
(SRCBCs) (se recomienda normalmente una suspensión al 2-3%), sensibilizadas con un volumen igual de
suero de conejo anti-SRBC diluido para contener varias veces (generalmente de dos a cinco veces) la
concentración mínima necesaria para producir un 100% de lisis de los SRBCs en presencia de una solución
titulada de complemento de cobaya. Esta última se titula independientemente (en presencia o ausencia de
antígeno según el método), para determinar la cantidad de complemento necesario para producir bien un
50% o un 100% de lisis de SRBCs sensibilizados en una unidad de volumen de una suspensión
estandarizada; se definen como la unidad hemolítica 50% o 100% del complemento (C´H50 o C´H100),
respectivamente. Generalmente se recomienda titular el complemento antes de cada grupo de ensayos y se
prefiere un macrométodo para la determinación óptima del C´H50. Por lo general, en la prueba se utilizan
1,25-2 C´H100 o 5-6 C´H50.
El tampón salino con barbital (veronal) (VBS) es el diluyente estándar para la TFC. Se prepara a partir de
comprimidos disponibles comercialmente, de lo contrario se puede preparar de acuerdo con la fórmula
descrita en otro lugar (ver el Capítulo 2.3.1. Brucelosis bovina). El suero de ensayo debe inactivarse durante
30 minutos en un baño de agua a 60-63°C, y diluirse (diluciones dobles) en VBS. La solución de base del
antígeno HS (2,5-20 mg/ml en VBS) se diluye en VBS como se determinó previamente mediante titulación
(titulación en sistema de doble entrada). Normalmente sólo se prueba una dilución de suero (generalmente
la 1/10).
Utilizando placas de microtitulación estándar de 96 pocillos con fondo redondo (en U), la técnica se realiza
normalmente como sigue:
i)
Se colocan 25 µl de suero problema inactivado en los pocillos de la primera y segunda filas. Se
añaden volúmenes de 25 µl de tampón TFC en todos los pocillos excepto los de la primera fila. Se
preparan diluciones seriadas dobles transfiriendo volúmenes de suero de 25 µl de la segunda fila en
adelante.
ii)
Se añaden en cada pocillo volúmenes de 25 µl de antígeno diluido hasta la concentración de trabajo y
25 µl de complemento diluido hasta el número de unidades necesarias.
iii)
Se preparan pocillos control que contienen 75 µl en cada caso de sólo diluyente, suero + complemento
+ diluyente, antígeno + complemento + diluyente, y complemento + diluyente. Cada vez que se realiza
la TFC se incluirá un suero control que de una reacción positiva mínima para verificar la sensibilidad
de la prueba.
iv)
Las placas se incuban a 37°C durante 30 minutos, o a 4°C durante toda la noche, y se añade en cada
pocillo un volumen (25 o 50 µl, dependiendo de la técnica) de SRBCs sensibilizados. Las placas se
reincuban a 37°C durante 30 minutos.
v)
Se leen los resultados después de haber centrifugado las placas a 1.000 g durante 10 minutos a 4°C,
o dejarlas reposar a 4 °C durante 2-3 horas para permitir depositarse a las células no lisadas. El grado
de hemólisis se compara con estándares correspondientes a 0, 25, 50, 75 y 100 % de lisis. El título del
suero problema es la dilución más alta a la cual hay un 50% o menos de hemolisis.
•
Estandarización de los resultados de la prueba de fijación del complemento.
Existe un sistema de unidades basado en el Estándar Internacional para el Suero anti-Brucella ovis
(Estándar Internacional 1985 [ ver nota al pie 2]). Este suero contiene 1.000 Ul/ml. Si este suero se
prueba con un método determinado y da, por ejemplo, un título de 2.000, entonces el factor para un
3
A la venta en el OIE Reference Laboratory for Brucellosis, VLA Weybridge, Addlestone, Surrey KT 15 3NB, United
Kingdom.
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suero desconocido probado mediante ese método se puede hallar a partir de la fórmula: 1.000/200 x
título del suero de ensayo = número de ICFTU (unidades internacionales TFC) de anticuerpo en el
suero de ensayo por ml. Es recomendable que cualquier país que utilice la TFC a escala nacional
obtuviera un acuerdo entre los distintos laboratorios que realizan la prueba mediante el mismo
método, para garantizar la obtención del mismo nivel de sensibilidad y especificidad frente a un
conjunto adecuado de sueros procedentes de ovejas con aislamientos positivos de B. ovis, y de ovejas
libres de Brucella. Los resultados deberían expresarse siempre en ICFTU, calculados con relación a
aquellos obtenidos en una titulación en paralelo con un suero estándar, que a su vez puede calibrarse
frente al Estándar Internacional.
Interpretación de los resultados: generalmente los sueros que dan un título equivalente a 50 ICFTU/ml
o más se consideran positivos en la UE.
b)
Prueba de inmunodifusión en gel de agarosa
La prueba IGDA (2) utiliza los siguientes reactivos: Agar Noble o agarosa de alta calidad, cloruro sódico
(NaCl), y tampón borato (preparado con ácido bórico [12,4 g]; cloruro potásico [14,5 g]; agua destilada
[1.600 ml]; ajustado a pH 8,3 con una solución de NaOH 0,2 M, y llevado hasta 2.000 ml con agua
destilada).
Para preparar los geles, disolver 1g de agarosa (o agar Noble), 10 g de NaCl en 100 ml de tampón borato
hirviendo mientras se agita continuamente. Cubrir los portaobjetos, colocados sobre una superficie plana,
con la cantidad necesaria del gel fundido para formar un lecho de 2,5 mm de profundidad
(aproximadamente 3,5 ml para los portaobjetos estándar). Después de que el gel ha solidificado (15-20
minutos), se recortan los pocillos utilizando un punzón para geles. Los pocillos deberán ser de 3 mm de
diámetro y separados 3 mm, y estar dispuestos según un patrón hexagonal alrededor de un pocillo central
que también tiene 3 mm de diámetro. La técnica se puede adaptar a placas de Petri u otros moldes.
Los sueros a examinar se colocan en pocillos alternativos separados por un suero positivo control (infección
demostrada mediante bacteriología), con el antígeno a su concentración óptima en el pocillo central. Los
resultados se leen después de una incubación durante 24 y 48 horas a temperatura ambiente en una
cámara húmeda. Una reacción positiva se manifiesta por la presencia de una línea claramente definida de
precipitado entre el pocillo central y los pocillos de los sueros problema que muestra una identidad total o
parcial con la de los controles positivos. También pueden aparecer líneas de precipitado que no dan una
identidad total y pueden corresponder a componentes antigénicos minoritarios de los extractos HS (los
anticuerpos frente a estos componentes pueden ser también frecuentes en las infecciones debidas a B.
melitensis). Estas reacciones también deben considerarse positivas. Antes de una lectura definitiva, es
importante lavar los portas durante 1 hora en una solución en agua de citrato sódico al 5% para limpiar
líneas de precipitación inespecíficas.
El antígeno usado en la prueba IGDA es el HS (2,5-20 mg/ml) diluido en agua destilada, y que contiene
como conservante fenol al 0,5% (este antígeno conservado se puede almacenar durante al menos 1 mes a
4 °C). Las diluciones del antígeno se prueban con un conjunto de 20-30 sueros de carneros infectados
naturalmente con B. ovis y con un conjunto de sueros de ovejas libres de Brucella. La concentración óptima
de antígeno es aquella que da la línea de precipitación más clara con todos los sueros de los carneros
infectados con B. ovis siendo negativo con los sueros de las ovejas libres de Brucella.
c)
Enzimoinmunoensayo
Se han propuesto diversas variaciones de este ensayo. La prueba que se describe aquí es un ELISA
indirecto que utiliza ABTS (2,2´-azino-bis-[ácido 3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico]) como cromógeno, aunque
son también adecuados otros procedimientos. Los ensayos se realizan en placas de ELISA de 96 pocillos
de fondo plano. Las diluciones de los reactivos y el suero se preparan en PBS, pH 7.2, mediante la adición
de Twenn 20 al 0,05% (PBST). Las diluciones del antígeno se preparan en un tampón
carbonato/bicarbonato, pH 9,6, o alternativamente en PBS. pH 7.2. Las placas se lavan después de cubrir
con el antígeno y normalmente entre incubaciones con PBST, cuando sea necesario. El antígeno (HS) y el
conjugado se titulan mediante el sistema de doble entrada, y se seleccionan las diluciones que
proporcionan la mejor relación entre los sueros positivos y negativos. Los anticuerpos secundarios (IgG anti
ovina [cadenas H+L]) por lo general se conjugan a peroxidasa de rábano (HRPO), aunque se pueden usar
otros enzimas o conjugados (tales como la proteína G). Se ha encontrado un anticuerpo monoclonal frente
a IgG1 bovina conjugada con HRPO que es adecuado para su uso en el ELISA (26). Si se usa un
conjugado a peroxidasa, el cromógeno, normalmente ABTS, se diluye en un tampón de substrato
(compuesto de ácido cítrico y citrato sódico, pH 4). Se añade el substrato, peróxido de hidrógeno (H2O2), al
tampón de substrato y se incuban las placas durante 15-60 minutos a temperatura ambiente. La reacción se
puede detener con azida sódica 1 mM, y el cambio de color se lee a 405-414 nm (para más detalles ver el
Capítulo 2.3.1.).
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El antígeno usado en el ELISA es el HS en la solución de base a 1 mg/ml en tampón de cobertura, titulada
en un sistema de doble entrada con diferentes concentraciones de antígeno, conjugado y sustrato, frente a
un suero estándar o frente a diluciones de un conjunto de sueros procedentes de ovejas con aislamientos
positivos de B. ovis, y de ovejas libres de Brucella, para determinar la dilución más sensible y específica
(por lo general 5–10 µg/ml).
•
Procedimiento del ensayo
i)
Las placas de microensayo de calidad de cultivo celular se antigenan mediante la adición en cada
pocillo de 100 µl de una dilución de un antígeno predeterminado en tampón carbonato, pH 9,6. Las
placas se incuban durante 2 horas a 37°C. Alternativamente, el antigenado puede llevarse a cabo
también durante toda la noche a 4°C con 100 µl de la dilución del antígeno correspondiente en PBS,
pH 7.2. Las placas se lavan después cuatro veces para eliminar el antígeno no unido, y se secan
golpeando fuertemente boca abajo sobre un papel absorbente. Las placas antigenadas se pueden
utilizar inmediatamente o secarse y almacenarse a 4°C (la estabilidad en estas condiciones es
aceptable durante al menos un mes).
ii)
Sueros: Diluir las muestras de suero problema y los controles positivo y negativo al 1/200 añadiendo
un mínimo de 10 µll de suero a 2 ml de PBST. Esta dilución de suero es normalmente la óptima
cuando se utilizan conjugados monoclonales y policlonales. Sin embargo, cuando se utiliza el
conjugado de proteína G-peroxidasa, ladilución óptima es la 1/50 (14). Añadir por duplicado
volúmenes de 100 µl de suero por pocillo a las placas de microtitulación. Las placas se tapan, se
incuban a 37°C durante 1 hora y se lavan tres veces con el tampón de lavado PBST.
iii)
Conjugado: El conjugado titulado se diluye en PBST, se añade en los pocillos (100 µl) y la placa se
tapa y se incuba durante 1 hora 37°C. Después de la incubación las placas se lavan de nuevo tres
veces con PBST.
iv)
Substrato: Se añade a las placas la solución de ABST en tampón de substrato (100 µl/pocillo) y las
placas se incuban durante 15-60 minutos a temperatura ambiente con agitación continuada.
v)
Lectura e interpretación de los resultados: La absorbancia se lee automáticamente en un
espectrofotómetro a 405-414 nm. Los valores de absorbancia se pueden expresar como porcentajes
de la absorbancia media del control positivo, o preferiblemente transformarse en unidades ELISA
calculadas bien manualmente, o utilizando un ordenador y un programa de aproximación de curva a
partir de una curva estándar construida con los resultados de las series de las diluciones control
positivas. El umbral debe calcularse probando un grupo suficientemente grande de sueros de oveja
libres de Brucella, y la sensibilidad del ensayo ser evaluada en un grupo suficiente de sueros de
animales infectados con B. ovis.
Varios estudios comparativos han mostrado que el ensayo ELISA presenta mejor sensibilidad que la prueba
IGDA o la TFC (16, 21, 25, 32, 33). La combinación del ensayo IGDA y ELISA proporciona una sensibilidad
óptima, debido a la existencia de algunos sueros ELISA-negativos y IGDA-positivos (16). Sin embargo, la
combinación de las pruebas CF y ELISA o CF y IGDA no mejora la sensibilidad del ELISA (16). Además, la
TFC tiene otras importantes desventajas como la complejidad, la inactivación obligatoria del suero, la
actividad anticomplementaria de algunos sueros, la dificultad de realizarlo con suero hemolisado, y los
fenómenos de prozona. Debido a su sensibilidad, simplicidad y fácil interpretación, el ensayo IGDA es muy
factible para el diagnóstico de rutina en laboratorios no especializados.
Se sabe poco sobre la existencia de resultados falsos positivos en los ensayos serológicos B. ovis como
consecuencia de infecciones debidas a bacterias que muestran epitopos de reacción cruzada con B. ovis.
Se ha descrito que el agente del pedero ovino (Dichelobacter nodosus) presenta reacciones cruzadas con
B. ovis (30), pero el alcance y las consecuencias prácticas de esta reactividad cruzada en de diagnóstico de
B. ovis se desconocen.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
La vacunación es probablemente el método más económico y práctico para el control a medio plazo de B. ovis
en áreas con una alta incidencia de la infección. Para un control a largo plazo, se bebería tener en consideración
el efecto de la vacunación sobre el diagnóstico serológico, y deben implementarse programas de acreditación de
ausencia de B. ovis. La cepa viva de B. melitensis Rev. 1 (ver Capítulo 2.4.2) es probablemente la mejor vacuna
disponible para la profilaxis de la infección por B. ovis (2). Una sola dosis estándar (109 unidades formadoras de
colonias) de Rv. 1 administrada subcutáneamente (en un volumen de 1 ml), o en la conjuntiva (en un volumen de
25-30 µl) a carneros de 3-5 meses de edad confiere una inmunidad adecuada frente a B. ovis. La vacunación en
la conjuntiva tiene la ventaja de minimizar la intensidad y duración a largo plazo de la respuesta serológica
provocada por la vacunación subcutánea, mejorando de ese modo la especificidad de las pruebas serológicas
(2). Cuando se usa en animales jóvenes, la vacuna Rev. 1 es suficientemente inocua y los efectos secundarios
641
parecen ser poco frecuentes. Sin embargo, existe una información limitada con respecto a la inocuidad de la
vacuna Rev. 1 cuando se utiliza en carneros adultos. Un estudio encontró que la vacunación subcutánea o
conjuntival de carneros de 13 meses no produjo efectos secundarios indeseables, y protegió a los carneros
frente a B. ovis, aunque el número de animales en este estudio fue limitado (15). Este descubrimiento debería
reinvestigarse usando un número mayor de carneros, ya que en países con cría extensiva y altos niveles de
incidencia sería aconsejable vacunar tanto a carneros jóvenes como adultos sanos. Sin embargo, la vacuna de
B. melitensis Rev.1 no debería utilizarse en países afectados por B. ovis pero libres de B. melitensis, y deberían
usarse otras vacunas que no causan una respuesta serológica. En la ovejas, la vacuna viva de B. abortus RB51
no ha desmostrado tener éxito frente a B. ovis (11) y actualmente no se encuentran disponibles vacunas
alternativas.
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* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Epididimitis ovina (Brucella ovis) (ver Cuadro en la parte
3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada:
www.oie.int)
643

ENFERMEDADES DE OVEJAS Y CABRAS EN LA LISTA B

Transcripción

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Ficha tecnica