ricardo andrés campos soto

Transcripción

UNIVERSIDAD DE CHILE
Campus Sur
Instituto de
Nutrición y
Tecnología de
los Alimentos
Facultad de
Ciencias
Agronómicas
Facultad de
Ciencias
Forestales
Facultad de
Ciencias
Veterinarias y
Pecuarias
PROGRAMA DE DOCTORADO
EN CIENCIAS SILVOAGROPECUARIAS Y VETERINARIAS
“GENOTIPIFICACIÓN DE Trypanosoma cruzi EN LOS
VECTORES SILVESTRES DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS
EN CHILE (Mepraia spinolai y Mepraia gajardoi) Y
CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE ESTOS VECTORES”
RICARDO ANDRÉS CAMPOS SOTO
Tesis para optar al Grado Académico de
Doctor en Ciencias Silvoagropecuarias y
Veterinarias
PROFESOR GUÍA: ALDO SOLARI ILLESCAS
PROFESOR COGUÍA: CAREZZA BOTTO MAHAN
SANTIAGO, CHILE
2012
PROGRAMA DE DOCTORADO
EN CIENCIAS SILVOAGROPECUARIAS Y VETERINARIAS
“GENOTIPIFICACIÓN DE Trypanosoma cruzi EN LOS
VECTORES SILVESTRES DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS
EN CHILE (Mepraia spinolai y Mepraia gajardoi) Y
CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE ESTOS VECTORES”
RICARDO ANDRÉS CAMPOS SOTO
Tesis para optar al Grado Académico de
Doctor en Ciencias Silvoagropecuarias y
Veterinarias
COMITÉ DE TESIS
Calificación
Aldo Solari Illescas
Carezza Botto-Mahan
Pedro Cattan Ayala
Norbel Galanti Garrone
Daniel Frías Lasserre
Julio Larenas Herrera
Financiamiento proyecto FONDECYT Nº 1085154
Número de registro
SANTIAGO, CHILE
2012
Firma
“La inmortalidad está en los genes la descendencia, la evolución y en el pensamiento que
trasciende a generar una vida mejor”
Ricardo Campos
Agradecimientos
Agradecimientos a mis profesores tutores Aldo Solari y Carezza Botto a la comisión de revisión
Pedro Cattan, Norvel Galanti y Daniel Frías. A los alumnos Iván Córdova, Marco Arenas por su
gran ayuda en las actividades de terreno así como a Ángel Moreno, Bernardo Arriaza, Jorge
González, Sandro Navia y a todas las personas que colaboraron y me sacaron de apuros en estas
arduas labores. Ximena Coronado por su gran ayuda de laboratorio, Nicanor Villarroel. Fernando
Torres, Marco Méndez y Nicolás Jaramillo por su ayuda académica. A la beca de Doctorado
CONICYT, FONDECYT 1085184, 11090086 y PSD-66 y a todas las personas que de alguna
manera colaboraron para hacer posible este trabajo.
Muchas gracias.
Dedicado a mis padres Hugo y Ana
RESUMEN
Trypanosoma cruzi es un protozoo flagelado muy ancestral con una gran variabilidad genética, es
el agente etiológico de la enfermedad de Chagas, considerada una importante zoonosis de
América. Este parásito es transmitido principalmente por más de cien especies de triatominos
hematófagos. Mepraia spinolai y Mepraia gajardoi son triatominos endémicos de Chile que
cumplen un importante papel en la transmisión de T. cruzi en el ciclo silvestre, sin embargo su
distribución entre hábitat silvestre y peridoméstico así como su conducta de alimentación
oportunista los hacen potenciales vectores para el hombre. Estos vectores silvestres se distribuyen
en zonas costeras y el interior de los valles siendo M. gajardoi la especie que habita zonas
netamente costera del norte (18º 30` y 26º 30` S) mientras que M. spinolai se puede encontrar
tanto en la costa como el interior entre las regiones de Atacama y Metropolitana (26° 30` y 34º
20` S), existiendo un conflicto taxonómico en las zonas geográficas limítrofes de distribución
(24° 36' y 26° 51' S). Con el fin de detectar y genotipificar T. cruzi en los vectores silvestres, se
realizaron capturas en zonas costeras y el interior abarcando todo el rango de distribución del
género Mepraia. Utilizando la reacción de la polimerasa en cadena (PCR) se encontró un menor
porcentaje de infección de T. cruzi en los insectos que habitan zonas geográficas costeras, lo que
puede ser explicado por el tipo de alimentación que es escasa en hospederos mamíferos, que
actúan como reservorios del parásito. Las pruebas de hibridación con sonda no revelan una
estructura geográfica de los genotipos de T. cruzi. Para determinar la estructura filogeográfica
una fracción de los insectos capturados se ocuparon para obtener secuencias de los genes
mitocondriales Citocromo b y la subunidad I de la Citocromo Oxidasa. La relación filogenética
entre los haplotipos mostró tres grupos monofiléticos de los cuales dos de ellos coinciden con las
dos especies descritas y un tercer grupo corresponde a insectos provenientes de zonas limítrofes
en la distribución de estos dos grupos, las relaciones de ancestralidad de estos linajes no esta
resuelta. Estos linajes también se confirman con los análisis de la morfometría alar que revela dos
conformaciones alares diferentes y un nuevo fenotipo descrito en la zona de intersección. Los
análisis de varianza molecular indican una alta estructuración poblacional y la red de haplotipos
muestra una relación estrecha de la filogenia con el lugar de procedencia geográfica muestreado.
La posible existencia de hibridación y otras hipótesis serán discutidas.
Palabras Claves: Trypanosoma cruzi, Filogeografia, Mepraia spinolai, Mepraia gajardoi.
ABSTRACT
Trypanosoma cruzi is a very ancient flagellate protozoan with a high genetic variability, is the
etiologic agent of Chagas disease, considered a major zoonosis in America. This parasite is
transmitted primarily by more than one hundred hematophagous triatomine species. Mepraia
spinolai and Mepraia gajardoi are the triatomine endemic of Chile that play important roles in
the transmission of T. cruzi in the wild cycle. However, their distribution between peridomestic
and sylvatic habitat and opportunistic feeding behavior make them potential vectors for humans.
These wild vectors are distributed in coastal and inland valleys being M. gajardoi the species that
inhabits the coastal zones of northern (18º 30' y 26º 30' S), while M. spinolai can be found both
on the coast and the interior between the Region de Atacama and Metropolitana regions (26° 30`
y 34º 20` S) however, there is a taxonomic conflict in the boundary zones of the geographical
distribution of these sister species (24° 36' y 26° 51' S). In order to detect and genotype T. cruzi
in the sylvatic vectors, captures were made in coastal areas and inland covering the entire range
of Mepraia genus distribution. Results from the polymerase chain reaction (PCR) showed a lower
percentage of T. cruzi infection in insects that inhabit coastal areas, which can be explained by
the type of blood meal that is low in mammalian hosts which act as reservoirs of the parasite. The
hybridization tests do not reveal a geographic structure of T. cruzi genotypes. To determine the
phylogeographic structure, a subset of the captured insects was used to obtain mitochondrial
Cytochrome b and subunit I Cytochrome Oxidase gene sequences. The phylogenetic relationships
among haplotypes showed three monophyletic groups, two of them coincide with the two
described species and a third group corresponds to insects from neighboring areas in the
distribution of these two groups, however, ancestral
relationships of these lineages is not
resolved. These lineages are also confirmed by morphometric analyses that reveals two different
wing conformations different and a new phenotype described in the intersection area. Analysis of
molecular variance (AMOVA) indicated a high population structure, and haplotype network
shows a close relationship of the phylogeny with the place of geographic origin sampled. The
potential existence of hybridization and other assumptions is discussed.
Keywords: Trypanosoma cruzi, Phylogeography, Mepraia spinolai, Mepraia gajardoi.
2
INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Chagas es una de las zoonosis más importantes en áreas tropicales y
subtropicales de América con aproximadamente 200.000 casos por año (WHO, 2002). En Chile
esta enfermedad ha sido detectada en áreas rurales y suburbanas entre los paralelos 18º30’ y
34º16’ S. correspondiente a zonas áridas y semiáridas, existiendo aproximadamente 142.000
personas infectadas y más de 1.000.000 en riesgo de infección (OPS/OMS, 2003). El agente
etiológico de esta enfermedad es el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi, capaz de infectar al
ser humano, mamíferos domésticos, sinantrópicos y silvestres siendo las aves refractarias a la
infección (Nery-Guimaraes y Lage, 1972; Kierszenbaum et al., 1976). Esta enfermedad es
transmitida principalmente por más de cien especies de Triatominos, pudiendo ser adquirida
también por vía transfusional, transplacentaria, transplante de órganos, oral y lactogénica. (Apt y
Reyes, 1990; Schofield, 1994). Mepraia spinolai y Mepraia gajardoi son vectores que cumplen
un importante papel en la transmisión de T. cruzi en el ciclo silvestre de Chile. Sin embargo, su
distribución entre hábitat silvestre y peridoméstico, sus conductas de alimentación oportunista así
como el asentamiento humano en zonas de riesgo los hacen potenciales vectores para el hombre.
Estos vectores silvestres se distribuyen en zonas costeras y el interior de los valles siendo M.
gajardoi la especie que habita zonas netamente costera del norte grande (18º 30` y 26º 30` S)
mientras que M. spinolai se puede encontrar tanto en la costa como el interior entre las regiones
de Atacama y Metropolitana (26° 30' y 34º 20' S) (Frias et al., 1998), existiendo un conflicto
taxonómico en las zonas geográficas limítrofes de distribución (24° 36' y 26° 51' S). Utilizando
como método diagnóstico la reacción de la polimerasa en cadena (PCR) se detectó la infección
por T. cruzi en estos vectores silvestres capturados en zonas costeras y en el interior de los valles
abarcando todo el rango de distribución del género Mepraia y mediante pruebas de hibridación
con sondas se genotipificó al parásito en los vectores infectados.
La caracterización genética molecular y morfométrica de los vectores nos permite aclarar las
relaciones taxonómicas y junto con los eventos geológicos pasados interpretar aspectos de su
estructura filogeográfica e historia evolutiva. De esta manera una fracción de los insectos
capturados se utilizaron para obtener secuencias de los genes mitocondriales Citocromo b (Cyt b)
y la subunidad I de la Citocromo Oxidasa (COI), además de analizar la variación de la
conformación de sus alas a través de la morfometría geométrica.
3
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1.- Trypanosoma cruzi y el DNA kinetoplastidico
Trypanosoma cruzi es un protozoo flagelado del orden Kinetoplastida, orden caracterizado por
poseer una gran mitocondria (kinetoplasto). Análisis filogenéticos basados en una serie de
marcadores nucleares y mitocondriales indican que el género Trypanosoma es monofilético (Lake
et al. 1988; Stevens et al. 2001). Como todos los trypanosomas son parásitos la hipótesis de
monofilia sugiere que un parásito ancestral originó a los trypanosomas mamíferos de África,
América y Australia. Por consiguiente este ancestro se habría desarrollado antes de la división de
los continentes durante la era mesozoica hace aproximadamente 230 millones de años (ma)
(Schofield, 2000; Stevens et al. 2001). El clado cruzi se habría originado antes de la separación
del supercontinente del sur (Gondwana) durante la era cenozoica y las primeras formas de T.
cruzi habrían estado asociadas con marsupiales de la familia Didelphidae (zarigüeyas) en el
momento en que se separó Sudamérica de Gondwana hace unos 40 ma. En estos mamíferos de
gran antigüedad en América no se han detectado graves patologías, posiblemente y dado que han
tenido una larga asociación con T. cruzi habrían coevolucionado permitiendo atenuar los niveles
de virulencia. (Schofield, 2000; Stevens et al. 2001).
El DNA kinetoplastídico de T. cruzi representa cerca del 20% del DNA total. Está formado por
minicírculos (1.4 kb) y maxicírculos (16.0 kb) de DNA encadenados formando una compleja red
compacta (Riou y Pautrizel, 1969). Existen al menos 50 copias idénticas de maxicírculos que son
similares al DNA mitocondrial de los eucariontes superiores y codifican RNAs ribosomales y
proteínas involucradas en la generación de ATP en la mitocondria (Simpson, 1987). Los
minicírculos, en cambio, existen en un número variable entre 3.000 y 30.000 copias/parásito,
existiendo heterogeneidad de secuencia entre los minicírculos de cada clón de T. cruzi. La
función de estos minicírculos es la de codificar transcritos llamados RNA guías, los cuales
dirigen la modificación postranscripcional de los mRNA mitocondriales, fenómeno llamado
“editing” (Sturn y Simpson, 1990). Cada minicírculo presenta cuatro regiones de secuencia
altamente conservada, las cuales están regularmente distribuidas cada 90º entre sí y con un
tamaño cercano a las 120 pb, y representan los orígenes de la replicación de los minicírculos
(Kitchin et al., 1985). También cada minicírculo contiene cuatro regiones hipervariables con una
secuencia de tamaño cercano a 250 pb, codificantes para los RNA guías las cuales están entre las
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regiones conservadas. En todos los minicírculos secuenciados de las distintas especies de
tripanosomátidos, se ha observado en la región conservada la existencia de tres bloques
denominados bloques de secuencia conservada: BSC-1 (5¨ -AGGGGCGTTC-3¨), BSC-2 (5¨ CCCCGTAC-3¨) y BSC-3
(5¨-GGGGTTGGTGTA-3¨); los cuales son uniformes en sus
secuencias, ordenamiento y distancia entre ellos (Ray, 1989; Sheline y Ray, 1989).
2.- Ciclo biológico
T. cruzi presenta distintos estados morfológicos según el hospedero en que se encuentre,
describiéndose las siguientes formas: 1.- Tripomastigote: de aspecto fusiforme, alargado y un
flagelo en el extremo anterior; se encuentra en la sangre de mamíferos y en el intestino posterior
de triatominos; es la forma infectante para mamíferos y triatominos, pero no se multiplica; 2.Epimastigote: de aspecto ovalado con un flagelo en el extremo anterior; se encuentra en el
intestino medio de los triatominos donde se multiplica; 3.- Amastigote: forma ovalada con un
flagelo no emergente; y es la forma proliferativa del parásito en las células de los hospederos
vertebrados (Atias, 1998).
Los triatominos se infectan al ingerir sangre de mamíferos infectados con tripomastigotes, los
cuales pasan al lumen del intestino medio donde se multiplica como epimastigotes. Después de
15 a 30 días los epimastigotes migran a la pared del intestino posterior, para transformarse en
tripomastigotes metacíclicos. Posteriormente, el triatomino al picar emite heces con
tripomastigotes que al atravesar la piel por el sitio de picadura o vía mucosa infectan al mamífero.
Una vez en la sangre de éste, los tripomastigotes penetran en células de diferentes tejidos y se
multiplican como amastigotes hasta destruir la célula liberando los parásitos a circulación y
penetrando en otras células. El ciclo se completa cuando triatominos no infectados ingieren
sangre de mamíferos infectados con tripomastigotes (Schofield, 1994; Atias, 1998).
3.- Genotipos de T. cruzi
Los primeros estudios de genética de poblaciones en T. cruzi determinaron que este tiene una
estructura clonal (Tibayrenc et al., 1986). Sin embargo, hoy en día existen nuevos estudios
basados en secuenciación de diversos loci nucleares como mitocondriales que postulan que T.
cruzi tiene la capacidad de intercambiar segmentos de DNA, esto por el descubrimiento de
genotipos con características híbridas sin embargo estos eventos ocurren de forma excepcional en
5
las poblaciones naturales de T. cruzi y como consecuencia de esta limitada recombinación
genética los linajes de T. cruzi se mantienen estables en el espacio y tiempo (Machado y Ayala,
2002; Westenberger et al., 2005).
Con estudios isoenzimáticos de patrones electroforéticos se pudo demostrar la existencia de tres
grupos de parásitos que fueron llamados zimodemos Z1, Z2, y Z3. Estudios epidemiológicos
demostraron que Z1 y Z3 están principalmente asociados al ciclo silvestre, en tanto que Z2 con el
ciclo doméstico (Miles et al., 1978). Otra clasificación basada en estudios filogenéticos distingue
a dos grandes linajes divergentes llamados T. cruzi I (TcI) y T. cruzi II (TcII), a su vez el segundo
linaje puede ser dividido en cinco subdivisiones TcIIa, TcIIb, TcIIc, TcIId y TcIIe. Z1
corresponde a TcI, mientras que Z2 y Z3 corresponden a los sublinajes TcIIb y TcIIa,
respectivamente. Los sublinajes TcIIa, TcIIc, TcIId y TcIIe se consideran híbridos generados por
fenómenos de recombinación (Brisse et al., 2001; Westernberger et al., 2005; Freitas et al., 2006).
Se puede decir entonces que TcI y TcIIb son los genotipos más ancestrales, mientras que los
híbridos los más recientes. La nueva clasificación reconoce seis linajes T. cruzi I-IV (Zingales et
al., 2009), siendo TcI, TcII, TcV y TcVI los genotipos encontrados frecuentemente en Chile
(Solari et al., 2001).
4.- Taxonomía y antigüedad de los vectores
Los vectores de la enfermedad de Chagas pertenecen al orden Hemíptera, familia Reduviidae,
subfamilia Triatominae. La familia Reduviidae es muy ancestral, con registros de fósiles que
sugieren que las primeras formas depredadoras pueden haber derivado de hemípteros fitófagos
durante el Periodo Pérmico - Triásico hace 230 ma (Evans, 1956). Estos especimenes fueron
anteriores a los hematófagos, ya que los mamíferos y aves más antiguas aparecen recién en el
periodo Jurásico, 50 ma más tarde. La hematofagia deriva de un hábito depredador tal vez de
insectos que depredaban invertebrados que vivían en nidos o madrigueras, seguido de un hábito
hematófago facultativo sobre los vertebrados que habitaban estas madrigueras. Una prueba de
esto se sustenta por el comportamiento de canibalismo que tienen algunas especies de triatominos
y que puede ser visto como un hábito ancestral transitorio entre la depredación y la hematofagia
(Ryckman, 1951). De hecho, existen sorprendentes similitudes morfológicas entre algunos
Reduviidae depredadores y Triatominae hematófagos que incluso han sido erróneamente
clasificados (Lent, 1982). Algunos Triatominae no han desarrollado eficientes adaptaciones
6
fisiológicas, salivales y de su aparato bucal, debido a esto la picadura suele ser bastante dolorosa
incluso se han reportado casos humanos de shock anafiláctico. Todas estas observaciones
sugieren que la conducta de hematofagia se ha desarrollado recientemente en la subfamilia,
existiendo una aparente paradoja al considerar que el parásito circulaba por sangre de mamíferos
marsupiales hace 40 ma atrás (Schofield, 2000; Stevens et al., 2001).
En la actualidad, existen más de 6.000 especies de redúvidos distribuidos en todo el mundo
(Maldonado Capriles, 1990). La mayoría de los géneros de la subfamilia Triatominae están en
América y sólo un pequeño número en África y Asia (Schofield, 2000). Existen descritas en
América 116 especies, las cuales se agrupan en 14 géneros. Estas habitan áreas principalmente
silvestres en asociación estrecha con sus hospederos vertebrados, aunque hay algunas que se
acercan al ambiente peridoméstico y otras que pudieron colonizar las viviendas humanas. Los
géneros epidemiológicamente más importantes en América son Rhodnius, Panstrongylus y
Triatoma (Schofield, 1994).
En Chile existen tres especies de Triatominos: Triatoma infestans, Klug 1834; Mepraia spinolai
Porter 1934 y la recientemente descrita Mepraia gajardoi Frias 1998 (Frías y Atria, 1998; Frías
et al., 1998). T. infestans corresponde a la especie doméstica mientras que M. spinolai y M.
gajardoi corresponden a especies silvestres endémicas de Chile. El género Mepraia fue descrito
por Mazza (Mazza et al., 1940) y revalidado por Lent (Lent et al., 1994) quienes lo describieron
como un género monotípico constituido sólo por Mepraia spinolai. Lent y Wygodzinsky (1979)
describieron al complejo spinolai integrado por Triatoma eratyrusiformis Del Ponte 1929,
Triatoma breyeri Del Ponte 1929 y Triatoma (Mepraia) spinolai, como un grupo de especies
taxonómica y geográficamente aislado que habita regiones semiáridas de América del Sur. T.
eratyrusiformis y T. breyeri están separadas geográficamente de M. spinolai por la Cordillera de
los Andes (Lent y Wygodzinsky, 1979). De esta manera las especies de este complejo
provendrían de una población ancestral común que se separó con el surgimiento de la cordillera
de los andes durante el mioceno en la era geológica terciaria hace 20 a 25 ma (Moreno et al.,
2006; Frías, 2010). Posteriormente, otro estudio basándose en un análisis filogenético a través de
secuencias de DNA mitocondrial de RNA ribosomal 16S de 57 especies de triatominos
propusieron la inclusión de T. eratyrusiformis y T. breyeri en el género Mepraia (Hypsa et al.,
2002). Sin embargo, esta sugerencia difiere de la realizada en otro estudio mediante análisis de
caracteres morfológicos, distribución de vectores y conductas de alimentación que mantienen a T.
7
eratyrusiformis y T. breyeri en el género Triatoma (Carcavallo et al., 2000). Algunos autores
sugieren que mientras no se esclarezcan las relaciones de todos los integrantes del complejo
spinolai, el género Mepraia se excluye de la clasificación y sus especies quedan incluidas en el
género Triatoma (Schofield y Galvao, 2009).
5.- Características de los vectores silvestres de Chile
5.1.- Mepraia spinolai
M. spinolai se distribuye entre los paralelos 26º y 34º S desde los valles y las zonas costeras y el
interior hasta los 3000 m de altura (Frías y Atria, 1998; Frías et al., 1998). Ha sido encontrada
entre piedras, en grietas de rocas, en sitios de descanso de diferentes mamíferos como zorros,
conejos, liebres, vizcachas y otros roedores, y marsupiales. En el peridomicilio, se ha encontrado
en corrales de animales domésticos (Lent y Wygodzinsky, 1979), y también existen algunos
antecedentes que indican a esta especie como colonizadora de viviendas rurales (Schenone et al.,
1995). Desde el punto de vista de la alimentación, se considera a esta especie como un
depredador oportunista que se alimenta principalmente del hospedero más abundante o del que
esté presente incluyendo al ser humano (Canals et al., 2000; Molina et al., 2004). Los primeros
cálculos del índice tripano-triatomino en M. spinolai se realizaron por observación microscópica
(Apt y Reyes, 1990; Ordenes et al., 1996), técnica específica pero poco sensible al compararla
con técnicas moleculares como la PCR. A través de esta última, se detectó que la infección en M.
spinolai y T. infestans puede llegar a un 50% en áreas endémicas de la Región de Coquimbo y Til
Til, Región Metropolitana (Botto-Mahan et al., 2005; Bacigalupo et al., 2006).
5.2.- Mepraia gajardoi
Antiguamente se creía que todas las vinchucas de la zona costera pertenecían a la especie M.
spinolai, pero estudios morfométricos y citogenéticos de ejemplares costeros capturados en las
Regiones de Arica y Antofagasta dieron cuenta que estos pertenecían a otra especie que se
denominó M. gajardoi distribuida entre los paralelos 18º y 26º S (Frías y Atria, 1998; Frías et al.,
1998; Pérez et al., 2004). Frías y colaboradores (1998) describen a M. gajardoi sobre la base de
que en las zonas costeras del norte grande no existen machos micrópteros (sin alas), siendo todos
braquípteros (alas que no sobrepasan la longitud del abdomen), mientras que en las zonas en que
se distribuye M. spinolai los machos pueden ser micrópteros, braquípteros y macrópteros (alas
8
que sobrepasan el largo del abdomen). Frías y Atria (1998) proponen que estas características se
deben a las diferencias en los cromosomas sexuales de estas especies, ya que M. gajardoi tiene
un sexo cromosomal de X1 X2 Y con un gran cromosoma Y que al sufrir eventos de ruptura
facilitado por la característica que presenta esta familia de poseer cromosomas holocéntricos,
pudo formar dos nuevos cromosomas Y1 y Y2, siendo el Y1 el que porta el gen para las alas (Frías
y Atria, 1998). De esto también se deduce que M. gajardoi sería un vector más ancestral, y que la
distribución de esta especie hacia el sur y el interior provocó este tipo de especiación parapátrica
originando a M. spinolai. Sin embargo, otro estudio propone que en M. spinolai los neo
cromosomas Y son cromosomas supernumerarios o cromosomas B, los cuales se encuentran en
hembras y machos micrópteros con distinto fenotipo alar sugiriendo que estos elementos no
tienen relación con el fenotipo alar (Calleros et al., 2010).
Estudios de detección de T. cruzi a través de métodos moleculares en M. gajardoi indican que
también amplifica a T. cruzi (Botto-Mahan et al., 2008), describiéndose un ciclo costero silvestre
de la infección Chagásica.
6.- Capacidad de amplificación de T. cruzi en T. infestans y M. spinolai
Con respecto de la eficiencia vectorial, estudios han demostrado que T. infestans tiene una mayor
eficiencia vectorial que M. spinolai. Esto último se infiere por el hecho que M. spinolai tiene un
mayor lapso de tiempo entre la alimentación y la defecación en comparación con T. infestans,
situación que disminuye la probabilidad de transmitir a T. cruzi (Canals et al., 1999). Sin
embargo, recientes estudios revelan que cohortes de M. spinolai positivas a T. cruzi cambian sus
patrones de comportamiento, disminuyendo el tiempo entre alimentación y defecación, con lo
cual se aumenta la transmisibilidad del parásito (Botto-Mahan et al., 2006). Otros estudios
realizados en regiones endémicas de Brasil en relación a la susceptibilidad que tienen diferentes
triatominos a la infección con T. cruzi, revelaron que T. infestans tiene una baja eficiencia
vectorial en comparación con otras especies (Alejandre et al., 1993; De Carvalho et al., 1997).
Por otro lado, se ha demostrado que T. infestans no transmite los diferentes genotipos de T. cruzi
con la misma eficiencia, encontrándose algunos de baja transmisibilidad (Nirschl et al., 1994; De
Lana et al., 1998; Da Silveira et al., 2000). Similares resultados se obtuvieron al comparar por
xenodiagnóstico en roedores la susceptibilidad a la infección de los diferentes genotipos de T.
cruzi circulantes de Chile entre T. infestans y M. spinolai, demostrando que M. spinolai es capaz
9
de detectar más positivos. Esto último se comprobó con ensayos de hibridación con sondas que
revelaron que M. spinolai es capaz de propagar más genotipos de T. cruzi y a su vez combinarlos
en un mismo insecto (Campos et al., 2007a; Campos et al., 2007b). Estos estudios revelan la
importancia que pueden desempeñar los vectores silvestres en la transmisión de la enfermedad de
Chagas, infiriendo que M. spinolai ha tenido un mayor tiempo para coevolucionar con T. cruzi en
el ciclo silvestre respecto de T. infestans (Briones et al., 1999). De esta forma, el vector silvestre
podría propagar mayor cantidad y más eficientemente los genotipos de T. cruzi en Chile.
7.- Problemática de los vectores silvestres
Las adecuadas campañas de saneamiento en contra de T. infestans han disminuido la población
de este insecto vector (Lorca et al., 2001). Surge entonces el problema de los vectores silvestres y
el papel que pueden desempeñar éstos en la epidemiología de la enfermedad de Chagas, debido a
que la probabilidad de encontrar al vector doméstico y silvestre en el mismo hábitat es muy baja.
De este modo, se puede inferir que los vectores silvestres podrían eventualmente colonizar el
ambiente doméstico al erradicar localmente a T. infestans (Frías et al., 1995). Situación que ya ha
ocurrido en otras zonas endémicas de América con Triatoma sordida Stál 1859 y Triatoma
guasayana Wygodzinsky y Abalos 1949 (Gorla et al., 1993). Sin embargo, en Chile se ha
reportado el caso contrario, es decir, se han descubierto focos silvestres de T. infestans
coexistiendo con M. spinolai asociados a bromeliáceas en áreas de Til Til y Calera de Tango,
Región Metropolitana (Bacigalupo et al., 2006). Situación que también ha ocurrido en Argentina
con T. guasayana (Vezzani et al., 2001). Por otro lado, el asentamiento humano en zonas con un
alto índice tripano-triatomino es considerado otro factor de riesgo. Esto hoy se puede observar en
zonas de Til Til, Colina y Calera de Tango. En las playas rocosas del norte de Chile, se ha
detectado un creciente grupo de recolectores de algas y pescadores que junto con sus mascotas
caninas se convierten en otra fuente de alimento para M. gajardoi. Sin lugar a duda, los vectores
silvestres deben cumplir un importante papel en la epidemiología de la enfermedad de Chagas en
Chile. Por esto, es necesario realizar estudios rigurosos acerca de la distribución de los vectores
silvestres en las zonas de riesgo, evidenciar parámetros de variabilidad genética y aspectos de la
estructuración filogeográfica de este género, calcular porcentajes de infección e identificar los
genotipos de T. cruzi que son transmitidos por estos triatominos endémicos.
10
Con respecto a la distribución de los vectores silvestres, existen zonas geográficas donde ambos
vectores podrían estar coexistiendo, existiendo en estas zonas un conflicto taxonómico, esto es
sustentado por un reciente estudio que revela que los insectos provenientes de estas zonas
limítrofes (Región de Antofagasta) se agrupan con la línea evolutiva de M. spinolai a través de
marcadores nucleares pero con marcadores mitocondriales estos ejemplares se agrupan con la
línea de M. gajardoi, sugiriendo que esta incongruencia entre ambos marcadores es el resultado
de introgresión debido a pasados eventos de hibridación o la retención de polimorfismos
ancestrales (Calleros et al., 2010). La hipótesis más reciente señala a través de caracteres
morfológicos y de cariotipos que en estas zonas se distribuye otra especie denominada M.
parapatrica (Frías, 2010). Dada esta situación, el problema que surge es cómo identificar estas
especies en sus estados ninfales, ya que estos tienen una gran similitud de su morfología externa
y son los que mayoritariamente se encuentran al momento de realizar la recolección de
ejemplares. Entonces al calcular los porcentajes de infección en estos lugares se pueden estar
atribuyendo porcentajes a ejemplares que no son de la especie determinada.
Como estos vectores habitan diversos tipos de hábitat, y tomando en cuenta que la evolución
conjunta entre parásito y vector en ecosistemas geográficamente distintos genera patrones de
diversificación, entonces en las zonas geográficas distintas como las costeras surgen las
siguientes interrogantes: ¿Qué porcentajes de infección existen? ¿Cuáles son los genotipos de T.
cruzi más representados? ¿Existirán genotipos de T. cruzi no descritos circulando en estas zonas
silvestres no estudiadas? ¿Existirá un patrón geográfico en los genotipos de T. cruzi? Y con
respecto a los vectores ¿Qué tan diferenciadas y estructuradas están sus poblaciones? ¿Cuales son
sus orígenes? ¿Existe coestructuración parásito-vector?
Todos estos problemas se pueden hoy en día abordar con metodologías modernas de
investigación que incluyen la morfometría geométrica, biología molecular y filogeografía.
8.- Caracterización de los vectores con marcadores moleculares
8.1.- Generalidades en Triatominae
Los métodos moleculares de caracterización se basan en la secuenciación de regiones del DNA.
Estas técnicas ocupan diversos marcadores moleculares, con diferentes grados de conservación
de sus secuencias las cuales son amplificadas a través de PCR secuenciadas y alineadas con el
objeto de encontrar homología usando programas específicos. Uno de los marcadores más
11
utilizado son las secuencias de DNA mitocondrial (mtDNA). Dentro de los genes codificantes del
genoma mitocondrial están los que codifican para dos subunidades ribosomales (12S y 16S),
RNA de transferencia y genes que codifican para proteínas de la membrana interna de la
mitocondria. Entre estos últimos están los genes que codifican para las tres citocromo oxidasas
(COI, COII y COIII) y el del citocromo b (Cyt b), muy utilizados en estudios filogenéticos de
diversos organismos (Dotson y Beard, 2001). En triatominos estos marcadores han permitido
realizar análisis filogenéticos, llevando a proponer nuevas hipótesis acerca de los diferentes
complejos que conforman esta subfamilia, como por ejemplo la hipótesis sobre la inclusión del
complejo spinolai en el género Mepraia y la inclusión de Triatoma costalimai Verano y Galvao
1959 y Triatoma guazu Lent y Wygodzinsky 1979 en el complejo infestans (Hypsa et al., 2002;
Sainz et al., 2004). También se han usado estas secuencias para inferir el origen evolutivo de la
subfamilia Triatominae, siendo la hipótesis de la polifilia la más aceptada actualmente (de Paula
et al., 2005). Las secuencias que codifican para el Cyt b y COI también han sido ocupadas en
triatominos para esclarecer la relación entre las especies del complejo infestans y phylosoma
(Sainz et al., 2004; Pfeiler et al., 2006), situación que deja abierta la posibilidad de ocupar estos
marcadores para poder dilucidar las relaciones del complejo spinolai y confirmar la hipótesis de
Hypsa et al., (2002) de incluir a T. eratyrusiformis y T. breyeri en el género Mepraia.
8.2.- La variabilidad genética
La variedad genética de una especie es fundamental para mantener sus expectativas evolutivas y
representa la base que asegura su reproducción, resistencia a enfermedades y su capacidad de
adaptación a los cambios ambientales. Sin variabilidad genética no hay potencial evolutivo y la
población esta destinada a la extinción (Frankham, 1995; Hedrick, 2001). Los modernos análisis
de secuencias de genes, tanto mitocondriales como nucleares, permiten obtener claros patrones de
variabilidad genética intrapoblacional así como comparaciones de dichos parámetros entre
poblaciones. Alguno de estos parámetros son: el número de sitios polimórficos (S), el número de
haplotipos (h) que para el caso de marcadores moleculares esta definido como el número de
secuencias diferentes, la diversidad haplotípica (Hd) que se interpreta como la probabilidad de
que dos haplotipos tomados al azar en una población sean diferentes (Nei, 1987), el número
promedio de diferencias entre dos secuencias (k) (Tajima, 1983) y la diversidad nucleotídica (Π)
12
que se define por el número promedio de diferencias entre dos secuencias pero por sitio (Nei,
1987).
8.3.- Filogeografía y estructura poblacional
El término “filogeografía” se refiere al estudio de los principios y procesos que determinan la
distribución geográfica de los linajes genealógicos, especialmente dentro y entre especies
cercanamente emparentadas (Avise et al., 1987). Los análisis filogeográficos consisten en
“sobreponer” al espacio geográfico filogenias de linajes moleculares para buscar patrones que
permitan inferir los procesos históricos y demográficos que les dieron lugar. Una de las
aplicaciones más amplias de los estudios filogeográficos ha sido el poder determinar el grado de
estructuración poblacional de las especies a lo largo de su área de distribución, así como descifrar
cuáles han sido los procesos que han determinado dicha distribución (Vázquez et al., 2009). La
diferenciación entre las poblaciones es a menudo la consecuencia de una restricción en el flujo
génico entre ellas, de manera que los diferentes grupos poblacionales se aíslan parcial o
totalmente permitiendo la acumulación de diferencias genéticas ya sea por mutación, deriva
génica o selección (Slatkin, 1994). Por lo tanto el flujo génico es un importante componente de la
estructura poblacional, ya que sus patrones y niveles determinan hasta qué grado cada población
de una especie es una unidad evolutiva independiente (Slatkin, 1994).
Entre los métodos de análisis de la filogeografía se encuentra la realización de árboles
filogenéticos de haplotipos (árbol de genes) que describen los principales grupos o líneas
evolutivas que servirán de base para la interpretación y la realización de los análisis siguientes.
Otra manera de ver las relaciones entre haplotipos es a través de “redes de haplotipos”; estas
redes se construyen minimizando el número de cambios mutacionales entre haplotipos que
usualmente están separados por más de un paso mutacional (Vázquez et al., 2009).
Hasta el momento no existen estudios que describan la estructura poblacional y los modelos de
flujo génico que podrían estar actuando en el género Mepraia. El único estudio con marcadores
moleculares (Calleros et al., 2010) carece de índices de variabilidad genética, estructura
poblacional y no esta diseñado con un enfoque molecular filogeográfico sin embargo lo
importante de este estudio es que los hallazgos que aporta se deducen a través de marcadores
nucleares y mitocondriales. Los estudios filogeográficos pueden proporcionar importante
información acerca de la estructura poblacional, identificar unidades evolutivas, resolver
13
problemas taxonómicos así como poder inferir los procesos demográficos por los cuales ha
atravesado la población pudiendo estos servir como apoyo a la historia evolutiva de este género,
incluso esta información puede ser de gran ayuda para campañas de control de vectores.
9.- Caracterización de los vectores por morfometría geométrica
La morfometría geométrica es una técnica moderna que analiza la variación de la conformación
morfológica capturando la mayor cantidad de información biológica posible de una estructura
anatómica. Esta técnica se ha aplicado en la subfamilia Triatominae con fines taxonómicos
(Matías et al., 2001; Villegas et al., 2002), para distinguir diferencias entre ejemplares silvestres y
criados en el laboratorio (Jaramillo et al., 2002), para distinguir variaciones geográficas y
cromática en poblaciones de T. infestans (Gumiel et al., 2003), para definir la estructuración
espacial de las poblaciones de T. infestans en una más fina escala geográfica (Schachter-Broide et
al., 2004), y para recuperar información acerca de los orígenes de una población, incluso de un
solo individuo (Dujardin, 2008). Debido al bajo costo de esta moderna técnica, podría ser de
aplicación común en los programas de vigilancia entomológica (Dujardin, 2008).
.
14
HIPÓTESIS
Hipótesis 1: Los porcentajes de infección por Trypanosoma cruzi son más bajos en las zonas
geográficas costeras, dado el tipo de alimentación que estos insectos tienen en estos sectores, la
que es escasa en hospederos mamíferos reservorios del parásito.
Hipótesis 2: La gran diversidad de hospederos que son fuente de alimentación de los vectores no
permite que los genotipos de T. cruzi tengan una distribución estructurada.
Hipótesis 3: Dado el bajo nivel de dispersión de estos insectos, la existencia de barreras y
distancias geográficas, sus poblaciones están estructuradas, con una filogenia de haplotipos que
se corresponde con su distribución geográfica.
OBJETIVO GENERAL
Detectar y genotipificar el parásito Trypanosoma cruzi en los vectores silvestres de la enfermedad
de Chagas capturados en distintas zonas periurbanas y silvestres de Chile, y caracterizar
genéticamente los vectores capturados.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Objetivo 1: Determinar el nivel de infección por T. cruzi en M. gajardoi y M. spinolai
en las distintas zonas geográficas estudiadas
Objetivo 2: Genotipificar poblaciones de T. cruzi infectantes en los insectos vectores.
Objetivo 3: Comparar los resultados de detección y genotipificación de T. cruzi entre
las distintas zonas geográficas costeras y del interior.
15
Objetivo 4: Determinar los patrones filogeográficos y estructuración poblacional de
los vectores silvestres a través de la secuenciación de los genes mitocondriales que
codifican para la subunidad I de la Citocromo oxidasa (COI) y Citocromo b (Cyt b).
Objetivo 5: Identificar diferencias de conformación alar entre las dos especies de
vectores silvestres.
16
MATERIALES Y MÉTODOS
1.- Captura de insectos
Se realizaron capturas de ejemplares de M. spinolai y M. gajardoi entre los años 2007 y 2010 en
las siguientes regiones: XV Región de Arica y Parinacota en las localidades de Playa Corazones,
Caleta Vitor y Caleta Camarones; I Región de Tarapacá en las localidades de Río Seco y San
Marcos; II Región de Antofagasta en la localidad de El Médano; III Región de Atacama en
Caleta Zenteno y Peral Norte; IV Región de Coquimbo en las localidades de Llanos de Challe,
Montepatria, Caleta Toro y la Reserva Nacional las Chinchillas en Illapel; Región Metropolitana
en la localidad de Til Til y Colina; las coordenadas geográficas de cada uno de los sitios de
captura se encuentran en la Tabla 1. Los ejemplares fueron capturadas manualmente (ser humano
como cebo), para esto se esperó aproximadamente 10 minutos en un lugar que cumplía con las
condiciones bióticas/abióticas para albergar a estos insectos, y si durante este tiempo no se
acercaba ningún insecto el investigador cambiaba de lugar para repetir la experiencia en otro
sitio. Los ejemplares capturados se mantuvieron en condiciones óptimas de crecimiento (26° C,
65-70% de humedad relativa, fotoperiodo de 14 hrs luz y 10 hrs de oscuridad) en un incubador y
fueron alimentadas con roedores de laboratorio (Mus musculus), aproximadamente 10 minutos
después de la alimentación se recolectó muestras de sus deyecciones que fueron ocupadas para el
posterior análisis de PCR. Para esto la muestra de cada vinchuca se diluyó con agua destilada, se
centrifugó por 30 s a 14 x G y luego se hirvió por 10 minutos quedando la muestra lista para
extraer los microlitros que fueron depositados en el tubo con la mezcla de la reacción.
2.- Detección de T. cruzi por PCR
Esta técnica permite amplificar las regiones hipervariables de los minicírculos del DNA
kinetoplastídico de T. cruzi. La reacción de amplificación se realizó utilizando un termociclador
Techne® TC-512. La mezcla de la reacción tenía 5µl de la muestra, 3µl de los oligonucléotidos
121(5’- AAA TAA TGT ACG GGG GAG ATG CAT GA-3’) y 122 (5’- GTT TCG ATT GGG
GTT GGT GTA ATA TA –3’) (Wincker et al., 1994) a una concentración de 25 µM, 5µl de
buffer de Taq polimerasa (que contiene 67mM de Tris-HCl pH 8.8, 16.6mM de (NH4)2 SO4,
6.7mM de MgCl2, 10 mM 2-mercaptoetanol.), 0,5µl de BSA 1%, 5µl (0.4mM) de los cuatro
17
dNTP (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 4 unidades de Taq polimerasa (0,5µl) y agua bidestilada
hasta un volumen final de 50µl.
El procedimiento de amplificación consistió en 2 ciclos iniciales de 98º C por 1 min y 64º C por 2
min; 33 ciclos intermediarios de 94º C por 1 min y 64º C por 1 min y un ciclo final de 72º C por
10 min. Además, cada ensayo contenía un control positivo, un marcador de peso molecular (DNA
en escalera de 100 pb) y un control negativo de PCR, donde el DNA de la muestra fue
reemplazado por agua destilada. Luego 10 µl del amplificado se mezcló con 4 µl de buffer de
carga al igual que ambos controles y el marcador de peso molecular.
Para la visualización del producto amplificado que tenía un tamaño de 330 pb, se realizó
electroforesis en gel de agarosa al 2% teñida con bromuro de etidio, y se examinó en un
transiluminador digital de Bio Rad®. La presencia de una única banda al mismo nivel que la
banda de 330 bp del marcador de peso molecular, indicó la presencia del kDNA y, en
consecuencia, un resultado positivo de PCR (Botto-Mahan et al., 2005; Rozas et al., 2005;
Campos et al., 2007a).
3.- Genotipificación de T. cruzi
3.1.- Transferencia del DNA a membranas por simple difusión
Se realizaron geles en cuadruplicado con los resultados positivos de PCR, cada gel se sometió a
incubación por dos veces en presencia de una solución de NaOH 0.5N y NaCl 1.5M por 20 min
cada una. Posteriormente, se neutralizó con una solución de Tris-HCl 1M pH 8,0 y NaCl 1,5 M
por dos veces, con agitación constante por 20 min cada una. Finalizado este tratamiento, el gel se
invirtió sobre un papel filtro Whatman 3MM saturado previamente con una solución SSC 2x
(NaCl 3M, citrato de Na 0.3M) que sirve como puente. Sobre el gel invertido se colocó la
membrana de nylon y el papel absorbente. Todo el sistema se presionó con un peso de
aproximadamente 1 kg por toda la noche para transferir el DNA por capilaridad desde el gel a la
membrana de nylon. Después de terminada la transferencia, el DNA se fijó a la membrana
irradiando ésta última con luz UV por 1 min y luego se dejó secar (Southern, 1975).
3.2.- Preparación de la sonda
En este ensayo se ocuparon las sondas que detectan los linajes TcI, TcII TcV y TcVI que fueron
generadas desde los clones de los parásitos sp104, NR, CBB y V195, respectivamente. Para
18
confeccionar las sondas, se realizó un PCR usando los primers CV1 y CV2 para cada uno de los
clones a ocupar, según las condiciones descritas (Veas et al., 1991). Una vez terminada la
reacción, el producto amplificado se digirió con enzimas de restricción (ScaI y Sau 96I) usando
las condiciones del fabricante. Luego, se visualizó el producto con una electroforesis en gel de
agarosa al 2%, descrito anteriormente. Una vez comprobado que el fragmento tenía el tamaño
adecuado, el producto se purificó previa electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusión
y se diluyó la banda con un kit de purificación de DNA QIAGEN® dejando los fragmentos de
DNA listos para la radiomarcación.
3.3.- Marcación radioactiva de la sonda
Las sondas de DNA kinetoplastídico fueron marcadas utilizando el kit de marcación Rediprime
de Amersham®. Para esto, se desnaturalizó el DNA por calentamiento y enfriamiento rápido en
hielo. En un volumen final de 50µl la mezcla de reacción tenía además del DNA 2U del
fragmento Klenow de la DNA polimerasa I, 5µl de dCTP marcado con P32, los nucleótidos
dGTP, dATP y dTTP a 1 mM, oligonucléotidos al azar y tampón de reacción que viene en el kit.
La incubación se realizó por 30 min, luego de lo cual se purificó la sonda marcada por
cromatografía de exclusión en resina P6 (Solari et al., 2001; Zulantay et al., 2004; Campos et al.,
2007b).
3.4.- Hibridación con la sonda radiactiva
La membrana se prehibridó con solución de hibridación (5x SSC, reactivo bloqueador del kit
0.5% p/v, lauril sarcosinato de sodio 0.1%, SDS 0.02% p/v), en un frasco de hibridación a 55º C
por 2 horas, distribuyendo la solución en un horno rotatorio. Luego se eliminó al máximo la
solución de hibridación y se agregó 5 ml de solución fresca de hibridación la cual contiene la
32
sonda de DNA marcada con P
previamente desnaturalizada. Las membranas se incubaron toda
la noche a 55ºC y luego se lavaron dos veces por 30 minutos a 50° C con 50 ml de solución SSC
2x, SDS 0.1% y dos veces por 15 minutos a 68º C, en una solución de SSC 0.1x y SDS 0.1%
(condición de máxima estrictez). Finalmente, para visualizar las muestras que hibridaron con la
sonda marcada, las membranas se colocaron en una pantalla cuantificadora de P-imager de Bio
Rad® (Solari et al., 2001; Zulantay et al., 2004; Campos et al., 2007b). Los resultados de las
pruebas de PCR y genotipificación entre las poblaciones de insectos de las zonas costeras y el
19
interior de este estudio fueron analizados por estadística descriptiva y la prueba de Chi-cuadrado
(análisis de tabla de contingencia) corrigiendo el alfa por el método de Bonferroni en el caso de la
comparación de los genotipos (Sokal y Rohlf, 1995).
4.- Caracterización molecular de los vectores
4.1.- Extracción de DNA de los vectores y amplificación de los genes mitocondriales
De las 14 localidades mencionadas anteriormente se excluye la localidad de Colina y se suma un
ejemplar T. eratyrusiformis proveniente de
Salinas de Bustos, y un ejemplar T. breyeri
proveniente de Patquía Viejo, ambas localidades pertenecientes al Departamento de
Independencia, Provincia de La Rioja, Argentina (cortesía de Catalá S). Parte de los ejemplares
capturados fueron sacrificados para extraer sus extremidades y ocuparlas en la extracción de
DNA del insecto. Para esto las extremidades fueron cortadas y maceradas en un tubo eppendorf e
incubadas toda la noche con proteasa K. Se siguió el protocolo del Kit de extracción de DNA de
tejido E.Z.N.A. Tissue DNA® de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Luego, mediante
PCR se amplificó un segmento de 663pb del gen micocondrial que codifica la proteína Cyt b y un
segmento de 651pb que codifica la proteína COI. Para la amplificación del gen Cyt b se usaron
los primers CYTB7432F, (forward) (5´-GGACG(AT)GG(AT)ATTTATTATGGATC-3´) y
CYTB7433R, (reverse) (5´-GC(AT)CCAATTCA(AG)GTTA(AG)TAA -3´) (Monteiro et al.,
2003), mientras que para la amplificación del gen COI, se usaron los primers LCO1490 (forward)
(5´-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3´)
y
HCO2198
(reverse)
(5´-
TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3´) (Folmer et al., 1994), El procedimiento de
amplificación se realizó de la misma manera para los dos genes como se describe a continuación:
una fase de desnaturalización inicial de 94º C por 3 min, 30 ciclos de 94º C por 1 min de
desnaturalización, 45º C por 1 min de alineación y 72º C por 1 min de elongación y una fase final
de 72º C por 10 min (Pfeiler et al., 2006). Para la visualización del producto amplificado se
realizó electroforesis en gel de agarosa al 2% teñida con bromuro de etidio, y se examinó en un
transiluminador digital de Bio Rad®.
4.2.- Análisis de secuencias
Posteriormente, los amplificados fueron secuenciados en un secuenciador automático ABI3730
XL por Macrogen®. Las secuencias fueron editadas con los programas Bioedit 7.0.8.0 (Hall,
20
1999) y se alinearon con Clustal W (Thompson et al., 1997) implementado en Bioedit 7.0.8.0.
Después de la alineación, los sitios que mostraron sustituciones de nucleótidos fueron
reexaminados por inspección visual con los datos del fluorograma en cada secuencia. Las
secuencias de los genes COI y Cyt b fueron concatenadas de forma manual. En total 164 insectos
fueron secuenciados con ambos genes. Las secuencias de cada gen fueron depositadas en
Genbank con los números de accesión xxxxxx-xxxxxx.
4.3.- Relaciones filogenéticas entre haplotipos.
El número de haplotipos sobre el total de secuencias se calculó usando DnaSp 5.1 (Librado y
Rozas, 2009). Las relaciones filogenéticas entre haplotipos se infirieron con el métodos de
máxima verosimilitud (ML) utilizando un servidor en línea PhyML 3.0 (Guindon y Gascuel,
2003) y el mejor modelo de sustitución nucleotídica fue seleccionado con el criterio Akaike
Information Criterion (AIC) (Akaike, 1974), implementado en el programa JmodelTest 0.1.1
(Posada, 2008). Se eligió el modelo TrN + G (G = 0.129, -lnL = 3185.2847). El soporte
estadístico de los nodos fue estimado con el método de bootstrap con 1000 árboles replicas
(Felsenstein, 1985), usando PhyML 3.0 (Guindon y Gascuel, 2003). Se utilizó a T.
eratyrusiformis y T. breyeri como grupo externo basado en su proximidad filogenética de ser
especies hermanas con el género Mepraia (Hypsa et al., 2002; de Paula et al., 2005). El árbol
filogenético se visualizó con el programa FigTree v1.1.2. Se consideraron los valores de
bootstrap sobre 70% como significativos (Hillis y Bull, 1993; Wilcox et al., 2002).
4.4.- Estructura filogeográfica
Se realizó una red de haplotipos sólo con las secuencias Mepraia spp. mediante el algoritmo de
Median Joining implementado en el software Network 4.2.0.1 (Bandelt et al., 1999). Se calculó
los índices de variabilidad genética de cada una de las poblaciones usando DnaSp 5.1 (Librado y
Rozas, 2009). Los índices calculados fueron: el número de sitios polimórficos (S), número de
haplotipos (h), número promedio de diferencias entre dos secuencias (k), diversidad haplotípica
(Hd) y nucleotídica (Π). Las diferencias pareadas entre poblaciones fueron calculadas usando el
índice de fijación (Fst) y la significancia de los valores se estimó con 1000 permutaciones usando
Arlequin 3.5.1 (Excoffier et al., 2005). La estructura genética se estimó con un análisis de
varianza molecular AMOVA (Excoffier et al., 1992) usando Arlequin 3.5.1 (Excoffier et al.,
21
2005), esto fue realizado para calcular la proporción de la variacion genética explicado por la
división de las distintas jerarquías poblacionales. Los niveles jerárquicos se definieron sobre la
base del árbol filogenético y la red de haplotipos y su significancia en cada uno de los niveles se
calculó con una prueba de 1000 permutaciones utilizando Arlequin 3.5.1 (Excoffier et al., 2005).
5.1.- Obtención de alas y procesamiento de datos
La caracterización por morfometría geométrica se realizó ocupando las alas de los ejemplares
adultos provenientes de las distintas zonas de captura previamente mencionadas. Los ejemplares
adultos representan un pequeño porcentaje en las poblaciones de las zonas endémicas, y son los
que minoritariamente se encuentran al momento de realizar las recolecciones (Botto-Mahan et al.,
2005; Bacigalupo et al., 2006). Es por esto, que para aumentar el número de ejemplares adultos,
las ninfas de estadío III, IV y V recolectadas en cada una de las actividades de terreno fueron
alimentadas regularmente con roedores de laboratorio y mantenidas en una cámara de crianza con
condiciones controladas de 26° C, 70% de humedad relativa y 14 horas de luz y 10 horas de
oscuridad hasta que alcanzaron su madurez sexual. Luego de ser sacrificados a cada macho se le
extrajeron las alas las cuáles fueron montadas entre dos portaobjetos para conservarlas y
fotografiarlas con una cámara digital (PowerShot SD600 Digital ELPH, 6.0 megapíxeles, Canon).
Utilizando el software COO (Dujardin, 2004) se seleccionaron ocho puntos anatómicos o hitos
(landmarks) previamente descritos (Dujardin, 2008) sobre el ala derecha de cada ejemplar (figura
1). Los puntos anatómicos seleccionado se convirtieron en matrices de coordenadas
bidimensionales las cuales se sometieron al análisis generalizado de Procrustes (AGP)
(Bookstein, 1991; Rohlf y Marcus, 1993; Rohlf y Slice, 1990) a través del software MOG
(Dujardin, 2003). Este algoritmo permite obtener las variables de conformación excluyendo los
efectos no biológicos dados por la traslación, escalamiento y rotación. Las variables de
conformación se obtienen calculando las distancias para cada uno de los puntos de un individuo
con respecto a un consenso (la configuración promedio de las estructuras estudiadas) utilizando el
criterio de los mínimos cuadrados. Se obtuvo una matriz de variables de conformación que tiene
los componentes no-uniformes (Partial Warps) y uniformes, que describen las deformaciones
regionales y globales de la arquitectura del ala, respectivamente (Bookstein, 1991).
22
Figura 1: Puntos anatómicos que se ocuparon sobre el ala derecha de los insectos analizados
5.2.- Variación de la conformación
Se formaron tres grupos correspondientes a M. gajardoi braquíptero, M. spinolai braquíptera y M.
spinolai macróptero. Sobre la matriz de las variables de conformación, utilizando el software
MOG (Dujardin, 2003), los grupos fueron comparados mediante un análisis de componentes
principales denominado “Relative Warps” (RW) en morfometría geométrica. Este análisis
permite visualizar la distribución de los individuos en los dos primeros componentes principales
(PC o RW), los que representan la mayor parte de la variación de la conformación, de esta
manera se puede detectar la formación de las agrupaciones. Distancias euclidianas se calcularon
entre las conformaciones de consenso para cada grupo y la significancia estadística se estimó
entre las distancias con 1000 permutaciones corregida por el método de Bonferroni utilizando el
software COV (Dujardin, 2006).
5.3.- Alometría
Cuando diferentes estructuras anatómicas crecen de manera desigual conforme crece el individuo
se dice que son alométricas, entonces la alometría se puede definir como la diferencia en la
conformación que se atribuye al crecimiento desproporcionado de las estructuras (efecto
alométrico). Se estimó la existencia de este efecto y su significancia con 1000 permutaciones con
el software COV (Dujardin, 2006) a través de un análisis de regresión multivariada entre el
tamaño y las variables de conformación, esto también estima si las pendientes de crecimiento son
iguales en caso de existir alometría. Luego se realizó un análisis multivariado de covarianza
(MANCOVA) para estimar si las diferencias siguen siendo significativas entre los grupos al
quitar el efecto alométrico.
23
RESULTADOS
1.- Detección y genotipificación de T. cruzi
De las 14 localidades analizadas tres no mostraron insectos infectados (Llanos de Challe, Caleta
Toro y Montepatria), y la localidad de la Reserva las Chinchillas (Illapel) fue la que mostró el
mayor porcentaje de infección seguida de Colina (Tabla 1). Las zonas costeras tienen un menor
porcentaje de positividad (16.3%) en comparación con las zonas del interior (29.3%), dichas
diferencias resultaron significativas (P < 0.05) al igual que al comparar la positividad en M.
gajardoi (18%) que resultó menor que en M. spinolai (26.7%) (criterio de separación de especies
de Frías et al. 1998). El genotipo TcI fue el más frecuente seguido del TcII, no existen diferencias
significativas en la frecuencia de genotipos entre la costa y el interior y sólo el genotipo TcI tuvo
una mayor frecuencia estadísticamente significativa las zonas del interior (P < 0.0125). Dentro
del grupo costero se observa una diferencia significativa con el genotipo TcVI al comparar las
poblaciones de San Marcos y Río Seco con las poblaciones de la Región de Arica y Parinacota.
Tabla 1: Porcentajes de infección y genotipificación de Trypanosoma cruzi en los vectores
silvestres Mepraia spp. y sus respectivos sitios de muestreo.
Nombre de la localidad
Corazones, Arica, RAP
Caleta Vitor, RAP
Caleta Camarones, RAP
Rio Seco, RT
San Marcos, RT
El Médano, RAN
Caleta Zenteno, RAT
Llanos de Challe, RAT
Peral Norte, RAT
Caleta Toro, RC
Montepatria, RC
Reserva Las Chinchillas, RC
Til Til, RM
Colina, RM
Total
Latitud y longitud
18°28'47" S; 70°19'27" O
18°45'45" S; 70°20'34" O
19°12'16" S; 70°16'08" O
21°00'06" S; 70°09'52" O
21°06'56" S; 70°07'30" O
24°36'51" S; 70°33'31" O
26°51'08" S; 70°48'36" O
28°08'52" S; 71°04'32" O
28°43'21" S; 70°31'02" O
30°44'30" S; 71°42'05" O
30°51'16" S; 70°41'51" O
31°30'28" S; 71°06'19" O
33°06'19" S; 70°55'53" O
33°14'52" S; 70°45'03" O
NºPositivos
5/37 (21.6%)
13/58 (22.4%)
5/75 (5.3%)
12/46 (26.1%)
8/28 (28.6%)
6/60 (10%)
14/55 (25.4%)
0/42 (0%)
6/48 (12.5%)
0/40 (0%)
0/24 (0%)
41/75 (54.6%)
16/102 (15.6%)
60/128 (46.8%)
188
TcI
2
2
2
4
1
---7
TcII
2
7
4
1
2
---1
TcV TcVI
3
2
1
----
----
----
----
16
6
50
90
11
2
20
50
9
15
3
21
11
40
3
1
----
NN
7
6
---6
10
13
29
TcI, TcII, TcV, TcVI: Trypanosoma cruzi I, II, V y VI respectivamente. NN: cepa no
identificada. 1/14: número de individuos positivos/total de individuos capturados. RAP: Región
de Arica & Parinacota, RAT: Region de Tarapaca, RAN: Región de Antofagasta, RAT: Región
de Atacama, RC: Región de Coquimbo, RM: Región Metropolitana, ----: no se pudo
genotipificar. Nota: la suma de los genotipos sobre el número de positivos representa los casos de
infecciones mixtas con dos y hasta tres genotipos de T. cruzi.
24
2.1.- Relaciones filogenéticas entre haplotipos
Luego de la edición, el largo de las secuencias fue de 508pb para el gen COI y 514pb para el gen
Cyt b que al concatenarlas sumaron un largo de 1022pb. La matriz completa fue de 164
secuencias concatenadas sin el grupo externo que dieron un número de 33 haplotipos. Los
ejemplares de T. eratyrusiformis y T. breyeri utilizados como grupo externo sólo tienen el gen
Cyt b secuenciado, completando la matriz con “Missing data” (símbolo: ?) para el gen COI,
método previamente validado por Wiens y Morrill (2011). El filograma de ML muestra un gran
grupo monofilético coincidente con todos los haplotipos del género Mepraia, dentro de este
grupo se observa tres líneas evolutivas bien soportadas correspondientes a M. gajardoi, M.
spinolai y la tercera correspondientes a insectos capturados en las zonas limítrofes de distribución
entre las dos líneas evolutivas anteriores (figura 2). Esta filogenia de haplotipos muestra una
relación estrecha con el lugar de procedencia geográfica de los haplotipos (figura 3).
2.2-. Diversidad genética intrapoblacional
En total se analizaros 13 poblaciones cuyos índices de variabilidad genética y de neutralidad se
muestran en la tabla 2. Este análisis mostró una variedad en los valores de diversidad haplotípica
(Hd) y bajos valores de diversidad nucleotídica (Π), observándose poblaciones monomórficas
(Médano, Caleta Toro) así como poblaciones con moderada y alta variación (ver tabla 2).
2.3.- Estructura filogeográfica
La red de haplotipos muestra una alta estructuración poblacional (figura 3), con sitios geográficos
que muestran en su totalidad al menos un haplotipo distinto, existiendo sólo dos haplotipos
compartidos: el haplotipo 9 compartido entre Caleta Vitor y Caleta Camarones, y el haplotipo 12
compartido entre Río Seco y San Marco.
Los grupos del AMOVA se formaron de acuerdo a los clados que resultaron del análisis
filogenético de haplotipos (figura 2), formando tres grupos de poblaciones. El porcentaje de
variación aportado por los distintos niveles poblacionales fue: 56.4% entre grupos, 41.8% entre
poblaciones dentro de su grupo y un 1.8% de la variacion es aportado por la variación
intrapoblacional. Los índices de fijación basados en los componentes de la varianza dan valores
altos y significativos (P < 0.05): Fct: 0.56376 (asociado a la variacion entre grupos), Fsc: 0.95880
25
(asociado a la variacion entre poblaciones dentro de su grupo), Fst: 0.98203 (coeficiente de
diferenciación total). Se analizaron otras hipótesis: juntando la zona intermedia al linaje de M.
gajardoi y otra juntando la zona intermedia al linaje de M. spinolai. Todas las hipótesis
mostraron valores significativos de los índices de fijación, sin embargo la hipótesis filogenética
es la que muestra los resultados más altos del índice Fct. La diferenciación pareada entre todas las
poblaciones a través del índice Fst mostró elevados valores y completa significancia (P < 0.05)
entre todas las comparaciones.
Figura 2: Relaciones filogenéticas entre haplotipos método de máxima verosimilitud, modelo
TrN + G (G = 0.129, -lnL = 3185.2847), construido con secuencias concatenadas de los genes
COI y Cyt b. Los valores de soporte de los nodos fueron calculados mediante bootstrap con 1000
iteraciones. Los colores representan la distribución geográfica de los haplotipos.
26
Tabla 2: Índices de diversidad genética por población
Localidad de la población
Corazones, Arica, RAP
Caleta Vitor, RAP
Caleta Camarones, RAP
Rio Seco, RT
San Marcos, RT
El Médano, RAN
Caleta Zenteno, RAT
Llanos de Challe, RAT
Peral Norte, RAT
Caleta Toro, RC
Montepatria, RC
Reserva Las Chinchillas, RC
Til Til, RM
N
13
13
13
15
11
11
16
8
14
14
14
11
11
S
5
5
5
6
1
0
1
6
1
0
8
4
1
h
5
4
2
4
2
1
2
4
2
1
3
3
2
k
1.026
1.359
2.692
1.676
0.545
0.000
0.458
2.607
0.143
0.000
3.604
1.891
0.327
Hd ± SD
0.628 ± 0.143
0.679 ± 0.112
0.538 ± 0.060
0.619 ± 0.120
0.545 ± 0.072
0.000 ± 0.000
0.458 ± 0.095
0.821 ± 0.101
0.143 ± 0.119
0.000 ± 0.000
0.582 ± 0.092
0,691± 0.086
0.327 ± 0.153
Π ± SD
0.00100 ± 0.00036
0.00133 ± 0.00032
0.00263 ± 0.00029
0.00164 ± 0.00060
0.00053 ± 0.00007
0.00000 ± 0.00000
0.00045 ± 0.00009
0.00255 ± 0.00040
0.00014 ± 0.00012
0.00000 ± 0.00000
0.00353 ± 0.00059
0.00185 ± 0.00023
0.00032 ± 0.00015
N: número de secuencias, S: número de sitios polimórficos, h: número de haplotipos, Hd:
diversidad haplotípica, Π: diversidad nucleotídica, k: número promedio de diferencias entre dos
secuencias. Las poblaciones son las mismas de la Tabla 1.
Figura 3: Red de haplotipos construido con el algoritmo de Median Joining, cada circulo
representa un haplotipo, el tamaño la frecuencia y los colores el lugar de procedencia geográfico
visible en el mapa de la Figura 2.
27
En total se obtuvieron 31 alas de M. gajardoi provenientes de las distintas localidades de captura
en la región de Arica y Parinacota, y 28 de M. spinolai provenientes de la Región de Coquimbo y
Metropolitana. En 10 individuos adultos provenientes de la localidad costera de Médano, Región
de Antofagasta se detectaron alas vestigiales que no fueron incluidas en el análisis morfométrico
(figura 4). La inspección de los especimenes sobre los dos primeros componentes principales
(PC) muestra claramente dos agrupaciones estadísticamente significativas correspondientes a M.
gajardoi y a M. spinolai (M. gajardoi versus M. spinolai braquíptero P < 0.0001, M. gajardoi
versus M. spinolai macróptero P < 0.0001), no observándose diferencias significativas entre los
M. spinolai braquípteros y macrópteros (P = 0.508) (figura 5). Los dos primeros PC explicaron el
85% de la variación de la conformación total.
El análisis del efecto alométrico muestra una contribución del tamaño alométrico en la variación
de la conformación (P < 0.0001) y las pendientes de crecimiento en cada uno de los tres grupos
no mostró diferencias significativas (Wilks lambda = 0.490, F = 1.502, P = 0.09). Esto sugiere
que las pendientes de crecimiento son iguales, de esta manera se puede extraer la contribución del
efecto alométrico en la variación de la conformación. Al quitar este efecto las diferencias en
conformación alar siguen siendo significativas entre M. gajardoi y ambos M. spinolai
braquípteros y macrópteros (P < 0.0001 y P = 0.002, respectivamente).
Figura 4: Polimorfismos alares en machos de Mepraia spp. A: M. gajardoi braquíptero. B:
ejemplar proveniente de la zona intermedia (Médano) con alas vestigiales. C: M. spinolai
micróptero. D: M. spinolai braquíptero. E: M. spinolai macróptero.
28
Figura 5: Inspección de los especimenes sobre los dos primeros componentes principales (PC o
relative warps). Las nubes correspondientes a cada grupo fueron delimitadas por la técnica de los
polígonos. Los dos primeros PC explicaron el 85% de la variación de la conformación total.
Rangos: PC1 de -0,0157 a 0,102, y PC2 de -0,045 a 0.046.
29
DISCUSIÓN
1.- Detección y genotipificación de T. cruzi
La significativa diferencia en los porcentajes de infección entre los vectores costeros y del
interior, se puede deber al tipo de alimentación. Los insectos costeros suelen coexistir con una
mayor cantidad de aves y reptiles en su hábitat teniendo por lo tanto una mayor probabilidad de
alimentarse de estos, ya que las aves son refractarias a la infección con T. cruzi (Nery-Guimaraes
y Lage, 1972; Kierszenbaum et al., 1976). La mayor cantidad de sangre de éstas en la dieta de los
vectores explicaría el menor porcentaje de infección en las zonas costeras, incluso antes que se
reportara la infección en M. gajardoi por Botto-Mahan et al., (2008) se especulaba que estos
insectos dado el tipo de alimentación no estarían infectados (Sagua et al., 2000). Sería importante
dilucidar el papel que cumplen los reptiles en la transmisión del parásito, ya que son una
población importante en los ecosistemas costeros del norte de Chile. Aunque el porcentaje de
infección en las zonas costera es más bajo que en las zonas del interior, existe un claro riesgo de
transmisión al hombre debido al asentamiento humano en estas zonas silvestres. Esto último está
dado por un creciente grupo de recolectores de algas a lo largo de toda la franja costera del norte,
así como en poblaciones rurales de pescadores (Caleta Camarones, Rio Seco y San Marcos), los
cuales en los diferentes viajes a terreno reportaron ser picados y acechados por estos insectos,
convirtiéndose con sus mascotas en un posible reservorio del parásito. Estos reportes son de gran
importancia tomando en cuenta que a través de PCR se ha detectado la presencia de T. cruzi en
momias de la cultura Chinchorro en las costas de la Región de Arica con una data de 9.000 años
de antigüedad, que corresponde al reporte más antiguo de la enfermedad de Chagas (Guhl et al.,
1999; Aufderheide et al., 2004). Probablemente los primeros eventos de dispersión de T. infestans
no fueron asociados a humanos, luego un proceso pasivo de dispersión surgió con la
domesticación animal en las primeras tribus andinas hace 3500 años atrás y se mantuvo en las
culturas precolombinas (Solari, 2011; Torres et al., 2011). Si consideramos que T. infestan llegó a
lo que es hoy territorio chileno durante los movimientos precolombinos, se puede deducir que el
vector silvestre M. gajardoi fue el responsable de propagar la enfermedad en la cultura
Chinchorro, ya que T. infestans aún no arribaba al país y M. spinolai se distribuía más hacia el
sur. También hay que considerar que no existen reportes de T. infestans habitando las zonas
costeras donde se asentaba esta Cultura. Los tiempos de divergencia entre las variantes andina y
30
no andina en T. infestans están datados alrededor de los 0.388-0.588 ma (Torres et al., 2011), una
data mucho menor si consideramos que la diversificación de Mepraia con T. eratyrusiformis y T.
breyeri podría haber empezado en el Mioceno hace aproximadamente 20 ma. Estos datos
históricos sugieren que la infectividad de M. gajardoi y su papel en la diseminación de T. cruzi es
bastante ancestral, sin dejar de lado el papel posterior que cumplió T. infestans.
Los genotipos más frecuentes encontrados fueron TcI y TcII, existiendo una mayor frecuencia del
genotipo TcI en las zonas del interior. Los demás genotipos no mostraron diferencias
significativas en su distribución geográfica entre la costa y el interior, sugiriendo que la
distribución de los genotipos no sigue un patrón filogeográfico.
La diferencia del genotipo TcVI al comparar insectos de las poblaciones de San Marcos y Río
Seco con poblaciones de la Región de Arica y Parinacota es un resultado importante de discutir,
ya que este es un genotipo raro y más relacionado al ciclo doméstico (Sturm y Campbell, 2010).
Considerando que las poblaciones de insectos capturados en San Marcos y Río Seco estaban
bastante cercanas a los domicilios de los pescadores, se podría sugerir que estos genotipos
tendrían su base en los pescadores o sus mascotas.
La existencia de parásitos que no pudieron ser identificados, se puede deber a la variedad
genética que existe dentro del linaje TcI o el TcII (Arenas et al., 2011), sugiriendo que existen
subgrupos dentro de estos linajes que no tienen una complementariedad total con las sondas
utilizadas en este estudio. Sería adecuado para afinar esta técnica la construcción de nuevas
sondas que reconozcan estos genotipos.
2.1.- Relaciones filogenéticas entre haplotipos
El filograma de haplotipos muestra claramente tres grupos monofiléticos soportados, un grupo
formado por haplotipos provenientes del extremo norte, otro por el extremo sur y un tercer grupo
ubicado en la zona intermedia (poblaciones de Médano y Caleta Zenteno) de los dos anteriores.
El grupo del extremo norte es congruente con M. gajardoi mientras que el grupo sur lo es con M.
spinolai. Esta topología es diferente a la encontrada con el gen COI por Calleros et al., (2010)
quienes muestran sólo dos grupos monofiléticos agrupando a los individuos de la región
intermedia con el nodo de M. gajardoi, cambiando de relación al nodo de M. spinolai al realizar
el análisis con el marcador nuclear ITS de rRNA. Los estudios citogenéticos realizados por los
31
mismos autores revelan un patrón C-positivo en los insectos intermedios y M. spinolai mientras
que en M. gajardoi un patrón C-negativo similar a los ITS. Ellos proponen que la diferencia entre
estas topologías se podría explicar por introgresión debido a eventos ancestrales o actuales de
hibridación entre las especies, es decir, los individuos de las zonas intermedias derivarían de una
población que tenía o actualmente tiene flujo génico entre M. gajardoi y M. spinolai. De hecho,
existen nuevas evidencias en base a cruzamientos en cautiverio que estas especies no tendrían un
aislamiento reproductivo, existiendo híbridos fértiles (Botto-Mahan et al., 2011), lo que permite
sugerir la existencia de hibridación en la naturaleza. Esto puede ocurrir en un contexto alopátrico
con poblaciones que ya completaron su proceso de especiación o en poblaciones que aún están en
etapa de especiación y no han completado su aislamiento. Estas últimas se caracterizan por tener
una variación latitudinal en sus patrones ecológicos lo que se ajusta al caso de Mepraia. Como
consecuencia de este flujo génico se forma una zona de hibridación que en este caso podría estar
representada por las poblaciones de Médano y Caleta Zenteno. Para poder esclarecer esta
hipótesis y detectar la introgresión con mayor certeza se recomienda hacer más estudios con
marcadores nucleares como microsatélites o polimorfismos en la longitud de fragmentos
amplificados (AFLP).
Una segunda explicación es la existencia de haplotipos ancestrales. Si las actuales poblaciones de
Mepraia descienden de una población ancestral donde existían múltiples haplotipos, es posible
que la extinción diferencial de dichos haplotipos en las diferentes especies o poblaciones genere
un patrón de relación entre éstos que no se corresponde con el proceso real de divergencia, es
decir, el árbol de genes no es congruente con el de las especies. Esto es típico de las especies que
han divergido recientemente, puesto que el proceso de aislamiento no se ha completado aún
(Avise y Wollenberg, 1997).
Frías (2010), basándose en caracteres mayoritariamente morfológicos y citogenéticos, propone
que las poblaciones de la zona intermedia descienden del linaje de M. gajardoi a través de un
modelo de especiación parapátrica, describiendo una tercera especie la que denominó Mepraia
parapatrica. Esta hipótesis propone un origen de las especies de tipo latitudinal siendo el linaje
de M. gajardoi el más ancestral, el cual previamente se habría separado de su especie hermana de
Argentina T. eratyrusiformis por el surgimiento de la Cordillera de Los Andes. El carácter
principal del primer evento habría sido la heterocromatinización de los telómeros originando a
M. parapatrica, luego se plantea el quiebre del cromosoma Y con el surgimiento de los insectos
32
micrópteros típicos de M. spinolai. Esto se habría producido por la colonización de los insectos
de acuerdo con los distintos cambios de hábitat debido a los eventos geológicos. La acomodación
de los segmentos de heterocromatina separa los linajes de M. gagardoi y M. spinolai similar a lo
demostrado por Calleros, et al., 2010 y congruente con sus resultados realizados con marcadores
nucleares.
Que las poblaciones de las zonas intermedias sean una tercera especie no deja de ser
controversial, considerando que en esta subfamilia existe una gran plasticidad morfológica
(Dujardin et al., 1999) y que la hipótesis cariotipica del quiebre del cromosoma Y no es aceptada
por otros autores (Calleros et al., 2010). Según Mas-Coma y Bargues (2009) se deben reunir una
serie de evidencias moleculares tanto mitocondriales como nucleares, datos morfológicos,
citogenéticos y de cruzamientos para subir a nivel de especie una determinada población en
Triatominae. Sin embargo, el modelo parapátrico propuesto se acomoda bien para explicar el
origen de estos linajes.
Los análisis de divergencia muestran que la distancia pareada media para el gen Cyt b entre el
linaje de M. gajardoi y M. spinolai fue de 7.6%. Monteiro et al., 2004 reportan valores similares
con el mismo gen entre especies que están cercanamente emparentadas (T. infestans – T.
platensis y T. sordida – T. garciabesi). Sin embargo Mas-Coma y Bargues, (2009) reportan que
estos valores están descritos en el rango que separa subespecies en Triatoma phyllosoma,
Triatoma dimidiata y Triatoma brasiliensis lo que se ajusta con la capacidad de cruzamiento que
tienen algunos de estos taxa.
Considerar si estos linajes son especies distintas o no, dependerá del concepto de especie que se
utilice para describirlos ya sea éste taxonómico, ecológico, evolutivo, filogenético o biológico,
debido a que actualmente no existe un claro consenso del concepto único de especie siendo el
más antigüo y frustrante problema de la biología (Mayr, 1996). De esta manera, tomando en
cuenta el concepto filogenético y evolutivo de especie, estos grupos podrían ser tres unidades
evolutivas independientes, lo que concuerda con M. gajardoi, M. parapatrica y M. spinolai, sin
embargo el concepto biológico de especie basado en el aislamiento reproductivo sigue siendo el
más universal. Tomando en cuenta este concepto estos linajes pueden ser tres subespecies
derivadas de una variación latitudinal de las características ecológicas y climáticas. La
aproximación más robusta para considerar a un linaje como especie es un criterio formado por
33
una combinación de estos conceptos. Por ejemplo, si tomamos como concepto de especie sólo el
filogenético tendríamos que prácticamente duplicar el número total de especies existentes.
2.2.- Estructura filogeográfica y diversidad genética
La red de haplotipos muestra una marcada estructuración con una relación estrecha de la
filogenia con el lugar de procedencia geográfica de los haplotipos, así como los tres linajes que
muestra la filogenia de haplotipos. Se observan nuevos haplotipos a una escasa distancia lo que
nos permite sugerir una limitada capacidad de dispersión de estos insectos formando colonias con
baja variabilidad intrapoblacional. Esto se confirma con el análisis de AMOVA. En todas las
hipótesis realizadas, la mayor variabilidad se encuentra entre poblaciones dentro de su grupo,
seguido de la variabilidad entre grupos y una baja variación intrapoblacional. Debido a que los
índices de fijación fueron significativos en todas las hipótesis, nos sugiere que la zona intermedia
se asemeja con los dos linajes, sin embargo, tiene una mayor cercanía con el linaje de M.
gajardoi (Fct: 0.45) que con M. spinolai (Fct: 0.4). Esto se observa también en las diferencias
pareadas que existen entre la zona intermedia con el linaje de M. gajardoi (4.9% COI, 5.9% Cyt
b) y con el linaje de M. spinolai (6.3% COI, 7.9% Cyt b). La hipótesis filogenética de los tres
linajes es la que presenta el mayor índice (Fct: 0.56) y, por lo tanto, es la estructura más marcada.
La comparación entre pares de poblaciones muestra que todas las poblaciones entre si tienen una
diferencia significativa debido a su alta estructuración haplotípica.
Con respecto a los índices de diversidad genética (tabla 2), se observa una baja variabilidad en las
poblaciones que forman el linaje intermedio (M. parapatrica). Esto se puede explicar por el
proceso de formación de la zona de hibridación que sufrió fuerte selección en contra de los
genotipos híbridos y, por lo tanto, las poblaciones derivan de unos pocos descendientes, similar a
lo que sucede en un efecto fundador. Otra explicación que también se puede dar en el caso de la
población de Caleta Toro, es la característica geográfica de playas rocosas aisladas o separadas
por playas de arena que impiden un flujo génico continuo quedando poblaciones aisladas. De esta
manera, los individuos fundadores de estos sectores rocosos se reproducen entre ellos dejando
una descendencia con poca variabilidad. Se observa una marcada estructuración en las
poblaciones del vector silvestre pero no se observa una distribución geográfica marcada en los
genotipos de T. cruzi por lo menos a esta escala de análisis. Se sugiere que no existe una
34
coestructuración y esto se puede deber a la poca especificidad del vector dado sus hábitos
oportunistas así como también del parásito.
2.3.- Probables orígenes de Mepraia y sus barreras geográficas
Las mayores barreras geográficas que explican la distribución de esta genealogía de genes son el
surgimiento de la Cordillera de Los Andes que comenzó a tener alturas importantes en el
mioceno hace 20 ma. Como se dijo anteriormente, este evento separó una población ancestral
originando por el lado de la región Argentina a T. eratyrusiformis y T. breyeri. Luego la
formación del desierto de Atacama en el plioceno tardío (Hartley y Chong, 2002) logró aislar las
poblaciones a la región costera. Otra barrera importante es la gran cuenca del Río Loa que aisló el
linaje de M. gajardoi con el linaje intermedio, lo cual se sustenta por la gran extensión de bancos
de arena que existe actualmente en su desembocadura, y que probablemente tuvo gran
importancia como barrera durante el pleistoceno tardío cuando abundaban los cambios
orogénicos, climáticos y volcánicos (Vuilleumier, 1971; Solari, 2011). Incluso, pese a una
exhaustiva búsqueda, en una gran extensión entre el norte de la península de Mejillones y el Río
Loa no fue posible encontrar ejemplares aunque existían las condiciones bióticas y abióticas para
su existencia. La formación de los valles transversales permitió la colonización de la depresión
intermedia, esto siguiendo el probable origen de Mepraia de tipo latitudinal propuesto por Frías
(2010). Otra posible hipótesis es que la población ancestral se haya separado por el lado norte y
sur, y que la formación del desierto de Atacama y los siguientes cambios geológicos moldearon
estas dos grandes líneas evolutivas, que en su proceso de dispersión se solaparon permitiendo el
flujo génico formando así una zona de hibridación. Considerando esto, no se puede descartar que
la colonización haya empezado por el lado sur siendo el linaje de M. spinolai el más ancestral
dispersándose de sur a norte. Probablemente por esto es que las actuales poblaciones de T.
eratyrusiformis y T. breyeri se encuentran en la zona de La Rioja aproximadamente en los 30º S.
La hipótesis que plantea la filogenia de haplotipos es que los insectos intermedios son los más
ancestrales, es decir, la población ancestral se habría separado a nivel de la zona intermedia y por
el lado chileno se diseminó hacia el norte por la costa y al sur a través de los valles transversales.
Esta hipótesis no es estadísticamente significativa (bajo soporte del nodo) y se debe tener en
cuenta que en los haplotipos del grupo externo falta la información del gen COI, por lo que la
ancestralidad de los linajes aún no está resuelta. Un análisis posterior con una matriz completa
35
podría establecer de manera más robusta las relaciones de ancestralidad de los linajes así como
poder datar la divergencia de éstos y contrastarlos con los diferentes eventos geológicos.
Los resultados de este análisis nos revela dos claras conformaciones que separan
significativamente los linajes de M. gajardoi y M. spinolai (figura 5). El hallazgo de nuevos
polimorfismos (alas vestigiales, figura 4) en la zona intermedia es congruente con el análisis
filogenético de haplotipos, es decir, tres linajes siendo el intermedio con características
morfológicas híbridas. Según los estudios de Frías (2010) los insectos de las zona intermedia (M.
parapatrica) son todos alados braquípteros y la aparición de los individuos micrópteros es un
carácter propio de M. spinolai debido al quiebre del cromosoma Y portador del gen de las alas
sugerido por este autor. La existencia de estos insectos con alas vestigiales me permite inferir que
el carácter de las alas es más bien un rasgo continúo, y como lo sugieren otros autores no estaría
ligado a un sistema sexual polimórfico (Calleros et al. 2010).
CONCLUSIONES
•
Se detecta un menor porcentaje de infección en los insectos costeros. A pesar de esto, son
un claro riesgo de transmisión para el hombre sugiriendo que su participación en la
trasmisión del parásito podría ser bastante antigua.
•
No se observa un claro patrón estructurado en la distribución de los genotipos de T. cruzi
y, por lo tanto, no existe una congruencia con la filogenia de los vectores.
•
Se observa alta estructuración filogeográfica de los insectos, es decir, una relación
estrecha de la filogenia de genes con el lugar de procedencia geográfica muestreado.
•
La filogenia de haplotipos muestra tres linajes significativos que se corresponden con M.
gajardoi, M. parapatrica y M. spinolai. Sin embargo, según nuevos datos de cruzamiento
estos tres linajes podrían ser subespecies que no han culminado su aislamiento
reproductivo. Por otro lado, estos linajes cumplen con los conceptos de morfoespecies,
filogenético y evolutivo, siendo unidades evolutivas que están siguiendo una historia
independiente.
36
•
La técnica de morfometría geométrica permitió separar perfectamente los linajes de M.
gajardoi y M. spinolai, descubriéndose un nuevo polimorfismo (alas vestigiales) en los
insectos de la zona intermedia (no analizados), lo que se corresponde con los resultados
moleculares. Este hallazgo permite sugerir que el tamaño alar es más bien un carácter
continuo.
•
Como conclusión final, la estructura poblacional del vector no es congruente con la
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54
ÍNDICE
RESUMEN ..................................................................................................................................................................... 1
ABSTRACT ................................................................................................................................................................... 2
INTRODUCCIÓN.......................................................................................................................................................... 3
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA...................................................................................................................................... 4
1.- Trypanosoma cruzi y el DNA kinetoplastidico ..................................................................................................... 4
2.- Ciclo biológico ...................................................................................................................................................... 5
3.- Genotipos de T. cruzi ............................................................................................................................................ 5
4.- Taxonomía y antigüedad de los vectores .............................................................................................................. 6
5.- Características de los vectores silvestres de Chile ................................................................................................ 8
5.1.- Mepraia spinolai ............................................................................................................................................ 8
5.2.- Mepraia gajardoi ........................................................................................................................................... 8
6.- Capacidad de amplificación de T. cruzi en T. infestans y M. spinolai ................................................................. 9
7.- Problemática de los vectores silvestres ............................................................................................................... 10
8.- Caracterización de los vectores con marcadores moleculares ............................................................................. 11
8.1.- Generalidades en Triatominae .................................................................................................................... 11
8.2.- La variabilidad genética .............................................................................................................................. 12
8.3.- Filogeografía y estructura poblacional ...................................................................................................... 13
9.- Caracterización de los vectores por morfometría geométrica ............................................................................. 14
HIPÓTESIS .................................................................................................................................................................. 15
OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................................................... 15
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................................................................... 15
MATERIALES Y MÉTODOS..................................................................................................................................... 17
1.- Captura de insectos ............................................................................................................................................. 17
2.- Detección de T. cruzi por PCR ............................................................................................................................ 17
3.- Genotipificación de T. cruzi ................................................................................................................................ 18
3.1.- Transferencia del DNA a membranas por simple difusión (Southern blotting) ...................................... 18
3.2.- Preparación de la sonda .............................................................................................................................. 18
3.3.- Marcación radioactiva de la sonda ............................................................................................................. 19
3.4.- Hibridación con la sonda radiactiva ........................................................................................................... 19
4.- Caracterización molecular de los vectores .......................................................................................................... 20
4.1.- Extracción de DNA de los vectores y amplificación de los genes mitocondriales ..................................... 20
4.2.- Análisis de secuencias ................................................................................................................................. 20
4.3.- Relaciones filogenéticas entre haplotipos................................................................................................... 21
4.4.- Estructura filogeográfica ............................................................................................................................ 21
5.1.- Obtención de alas y procesamiento de datos .............................................................................................. 22
5.2.- Variación de la conformación .................................................................................................................... 23
5.3.- Alometría ..................................................................................................................................................... 23
RESULTADOS ............................................................................................................................................................ 24
1.- Detección y genotipificación de T. cruzi ............................................................................................................. 24
2.1.- Relaciones filogenéticas entre haplotipos ................................................................................................... 25
2.2.- Diversidad genética intrapoblacional ......................................................................................................... 25
3.3.- Estructura filogeográfica ............................................................................................................................ 25
DISCUSIÓN................................................................................................................................................................. 30
1.- Detección y genotipificación de T. cruzi ............................................................................................................. 30
2.1.- Relaciones filogenéticas entre haplotipos ................................................................................................... 31
2.2.- Estructura filogeográfica y diversidad genética ......................................................................................... 34
3.3.- Probables orígenes de Mepraia y sus barreras geográficas ....................................................................... 35
55
CONCLUSIONES........................................................................................................................................................ 36
Tablas
Tabla 1: Porcentajes de infección y genotipificación de Trypanosoma cruzi en los vectores silvestres Mepraia sp y
sus respectivos sitios de muestreo. ............................................................................................................................... 24
Tabla 2: Índices de diversidad genética por población ................................................................................................. 27
Figuras
Figura 1: Puntos de Landmark que se ocuparon sobre el ala derecha de los insectos analizados ................................ 23
Figura 2: Relaciones filogenéticas entre haplotipos ..................................................................................................... 26
Figura 3: Red de haplotipos .......................................................................................................................................... 27
Figura 4: Polimorfismos alares en machos de Mepraia sp. .......................................................................................... 28
Figura 5: Inspección de los especimenes sobre los dos primeros componentes principales......................................... 29
56

ricardo andrés campos soto

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