Tesis Irene_28_05_15_Ultima_versión

PROGRAMA DE DESARROLLO DE LAS CIENCIAS BÁSICAS
(PEDECIBA)
TESIS DE MAESTRIA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
ORIENTACIÓN: GENÉTICA
TÍTULO:
Análisis de secuencias del cromosoma
X de CHOK1 a partir de la
microdisección y secuenciación de Xq
Autor: Lic. Irene María da Cruz Guerisoli
Orientador: Dr. José Sotelo-Silveira
Co-orientador: Dra María Vittoria Di Tomaso
Co-orientador: Dr. Gustavo Folle
Tribunal:
Dra. Cora Chalar
Dra. Adriana Mimbacas
Dr. Juan Martín Marqués
Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (I.I.B.C.E)
Facultad de Ciencias – Universidad de la República
MONTEVIDEO – URUGUA
1
INDICE
AGRADECIMIENTOS .............................................................................. 4
RESUMEN............................................................................................... 5
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................ 7
1.1
La línea celular CHO........................................................................... 7
1.2
El subclon CHOK1 ............................................................................. 7
1.3
El genoma de hámster Chino y CHOK1 ............................................... 9
1.4
El cromosoma X de hámster Chino y CHOK1 .................................... 12
1.5
El brazo largo del cromosoma X de CHOK1....................................... 20
1.6
Problema de investigación ............................................................... 21
2- HIPÓTESIS ...................................................................................... 21
2.1 Objetivo General ................................................................................... 22
2.2 Objetivos Específicos ........................................................................... 22
3. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................... 23
3.1
Aislamiento de Xq CHOK1 ................................................................ 23
3.2
Generación de sonda Xq y FISH en metafases de CHOK1 .................. 25
3.3
Estimación del tamaño del cromosoma X de CHOK1 ......................... 28
3.4
Secuenciación del amplificado de Xq de CHOK1 ............................... 28
3.5
Control de calidad de la biblioteca de lecturas Xq CHOK1.................. 29
3.6
Importación de las lecturas en CLC Genomic Workbench .................. 29
3.7
30
Información de las referencias genómicas de CHOK1 y hámster Chino
3.8
Alineamiento de la biblioteca de Xq al genoma de hámster Chino ...... 32
3.9
Identificación de las secuencias del genoma de CHOK1 que
corresponden al cromosoma X ................................................................... 32
3.9.1 Identificación de scaffolds y contigs de CHOK1 homólogos al
cromosoma X de hámster Chino ................................................................. 33
3.9.2
Identificación de scaffolds y contigs de Xq de CHOK1 CriGri v1.0 ...... 34
3.10 Localización de marcadores cromosómicos del cromosoma X de
hámster Chino en elconjunto de scaffold y contigs para el X de CHOK1. ...... 35
3.11 Identificación de las secuencias de Xq homólogas al cromosoma 5 y 6
de hámster Chino ....................................................................................... 37
3.12
Identificación de Repetidos .............................................................. 37
3.13 Análisis de Rna-seq y descripción de los genes anotados en los
scaffolds y contigs del cromosoma X de CHOK1. ........................................ 38
4. RESULTADOS ................................................................................... 40
4.1
Aislamiento, amplificación y especificad de Xq CHOK1 ..................... 40
2
4.2
Secuenciación de Xq de CHOK1, control de la calidad y especificidad
de la biblioteca. .......................................................................................... 41
4.3
X hámster Chino vs Xq CHOK1: Control de la especificidad de la
biblioteca de Xq ......................................................................................... 45
4.4
Identificación de las secuencias del genoma de CHOK1 que
corresponden al cromosoma X ................................................................... 48
4.5
Análisis global de secuencias repetidas en la colección de “scaffolds y
contigs” del X de CHOK1 ............................................................................ 58
4.6
Contenido de secuencias génicas en la colección de secuencias del
cromosoma X de CHOK1 ............................................................................ 63
5. DISCUSIÓN ................................................................................... 69
5.1
Aislamiento y amplificación del brazo largo Xq de CHOK1. ................ 69
5.2
Obtención de la biblioteca de lecturas de Xq CHOK1 ......................... 70
5.3
Las secuencias de Xq se alinearon, en su mayoría, al cromosoma X de
hámster Chino............................................................................................ 71
5.4
Identificación de scaffolds y contigs correspondientes a los brazos
largos y cortos del cromosoma X de CHOK1. .............................................. 74
5.5.
Diferencias en la composición de ADN repetido entre los brazos Xp y
Xq de CHOK1 ............................................................................................. 76
5.6
Identificación de genes en el cromosoma X de CHOK1: análisis de
expresión génica ........................................................................................ 77
6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS .................................................. 79
7. REFERENCIAS .................................................................................. 81
ANEXO I ............................................................................................... 86
3
AGRADECIMIENTOS
Gracias a mi orientador Dr. José Sotelo-Silveira por su dedicación, motivación,
criterio y por su confianza en mí depositada en el transcurso de la elaboración
de la tesis
Gracias a mis co-orientadores la Dra. María Vittoria Di Tomaso y el Dr. Gustavo
Folle, por la orientación, apoyo entusiasmo y aliento en el proceso de
formación.
Gracias al tribunal integrado por la Dra. Adriana Mimbacas, Dra. Cora Chalar y
Dr. Juan Martín Marqués por el interés mostrado en mi trabajo y por las
sugerencias recibidas en mi labor científica.
Gracias a mis compañeros del Departamento de Genómica, Vale, Joaca,
Andrés Di, Guille, Facu, Andrés I, por el apoyo, las discusiones, el aliento y
buena disposición de siempre a colaborar
Gracias a los Jefes y a mis compañeros del DPAN, por abrirme las puertas para
aprender en las tareas del laboratorio.
Gracias a mis compañeros del Departamento de Genética por la colaboración
en el proceso de la elaboración de este trabajo
Gracias a mis compañeras de la Asociación Española por brindarme apoyo, y
contención.
Gracias por la comprensión, paciencia y el ánimo recibidos de mi familia, a mi
novio y a mis amigos que de alguna manera me brindaron su apoyo
incondicional durante esta etapa tan importante para mi vida.
Gracias a todos…
4
RESUMEN
La línea celular proveniente de ovario de hámster Chino (CHO), es una de las
más empleadas en investigación biológica, biomédica y en la producción de
proteínas recombinantes con fines terapéuticos. En nuestro laboratorio se
determinó que la organización de la cromatina en el único cromosoma X
submetacéntrico de CHOK1 presenta características inusuales. El brazo largo
Xq presenta en casi su totalidad un patrón de cromatina heterocromático
(banda C positivo) lo cual indicaría que este brazo presenta un alto orden de
empaquetamiento, alta cantidad de secuencias repetidas en tándem,
replicación tardía, poca presencia de genes y baja actividad transcripcional, en
contraste con el brazo corto Xp eucromático.
El objetivo de esta tesis fue estudiar la composición molecular del cromosoma
X de CHOK1 a nivel de su secuencia. Para lograrlo, se combinaron tres
aproximaciones de tecnología de avanzada. Primero, se aisló el brazo largo Xq
de CHOK1 mediante microdisección LASER UV. Segundo, se amplificaron las
pequeñas cantidades de ADN obtenidas mediante procedimientos de alta
sensibilidad. Luego el ADN amplificado fue secuenciado por secuenciación
masiva.
Para
estudiar
las
secuencias
obtenidas,
se
emplearon
estrategias
bioinformáticas que combinaron análisis comparativos, en base a los genomas
de CHOK1 y el X de hámster Chino recientemente publicados. Estos análisis
permitieron
identificar
1187
scaffolds/contigs
que
corresponderían
al
cromosoma X de CHOK1, totalizando 110 MB, que reflejan el 77% del largo
estimado para este cromosoma. Adicionalmente, se logró discriminar que 61
scaffolds y contigs corresponderían al brazo Xp, 137, al brazo Xq, presentando
homología con el X de hámster Chino y 989, a Xq, no siendo homologos al X
de hámster Chino. Este último conjunto presenta un 67,3% de secuencias
similares al cromosoma 5 y 6 de hámster Chino. Dichas secuencias se
localizarían en el tercio distal de Xq de CHOK1, por debajo de la constricción
secundaria. La composición global de ADN repetido de X y Xq no aparenta ser
diferente al cromosoma paterno. Sin embargo, en la porción distal a la
5
constricción secundaria de Xq predominan secuencias de ADN satélite y un
menor porcentaje de secuencias SINEs con respecto al brazo Xp. Estimamos
que la densidad génica en el brazo largo Xq es menor que en el brazo corto Xp.
Se identificaron por primera vez genes en Xp y Xq de CHOK1, un bajo número
de genes en el extremo distal del brazo largo que presentaría una escasa
actividad transcripcional.
En suma, se pudo demostrar que la secuenciación de segunda generación de
cromosomas microdisecados es factible y puede ser realizada a partir de
algunas pocas moléculas de ADN. Al combinar nuestros datos con marcadores
previos, se logró mejorar el conocimiento de la estructura del cromosoma X,
generando una valiosa información para la construcción de un futuro mapa de
este cromosoma, tanto para la línea CHOK1 como para el hámster Chino. Nos
planteamos a futuro realizar una secuenciación a mayor profundidad (>30x),
empleando una biblioteca con un largo de inserto mayor a la biblioteca
estándar paired-end. Esto tendría como ventaja la posibilidad de mejorar el
ensamblado de las secuencias de Xq, permitiendo integrar esta información
con las secuencias detectadas para Xq de CHOK1.
6
7. REFERENCIAS
Albert’s B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York:
Garland Science; 2002. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21054/
Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman, DJ. 1990 Basic local alignment search
tool. J. Mol. Biol. 215:403-410.
Arrighi FE, Hsu TC, Pathak S, Sawada H. 1971. The sex chromosome of the Chinese
hamster:constitutive heterochromatin deficient in repetitive DNA sequence. Cytogenet.Cell
Genet. 13, pp.268-274.
Bahr SM, Borgschulte T, Kayser K, Lin N. 2009. Using microarray technology to select
housekeeping genes in Chinese hamster ovary cells. Biotechnology and bioengineering,
104(5), pp.1041–1046.
Brinkrolf K, Rupp O, Laux H, Kollin F, Ernst W, Linke B, Kofler R, Romand S, Hesse F,
Budach WE, Galosy S, Müller D, Noll T, Wienberg J, Jostock T, Leonard M, Grillari J,
Tauch A, Goesmann A, Helk B, Mott JE, Pühler A, Borth N. 2013. Chinese hamster
genome sequenced from sorted chromosomes. Nat Biotechnol, 31(8), pp.694–5.
Cai, Y. Ludeman SM, Wilson LR, Chung AB, Dolan ME. 2001. Effect of O6-benzylguanine
on nitrogen mustard-induced toxicity, apoptosis, and mutagenicity in Chinese hamster
ovary cells. Mol Cancer Ther, 1(1), pp.21–8.
Cao Y, Shuichi Kimura, Joon-young Park, Miyuki Yamatani, Kohsuke Honda, Hisao
Ohtake, Omasa T. 2011. Chromosome identification and its application in Chinese hamster
ovary cells. BMC proceedings, 5 Suppl 8(Suppl 8), p.O8.
CLC Genomics Workbench 6.5 (http://www.clcbio.com)
Di Tomaso MV, Martínez-López W, Folle GA, Palitti F. 2006. Modulation of chromosome
damage localization by DNA replication timing. International journal of radiation biology,
82(12), pp.877–86.
Di Tomaso, MV, Martínez-López W, Palitti, F. 2010. Asynchronously replicating
Eu/heterochromatic regions shape chromosome damage. Cytogenetic and genome
research, 128(1-3), pp.111–7.
81
Drets ME & Shaw MW. 1971. Specific Banding Patterns of Human Chromosomes. Proc.
Nat. Acad. Sci. USA, 68(9), pp.2073–2077.
Elsik C, Mackey AJ, Reese JT, Milshina NV, Roos DS, Weinstock GM. 2007. Creating a
Folle G., Martínez-López W, Boccardo E, Günter O. 1998. Localization of chromosome
breakpoints: implication of the chromatin structure and nuclear architecture. Mutation
research, 404(1-2), pp.17–26.
Gammell P. 2007. MicroRNAs: recently discovered key regulators of proliferation and
apoptosis in animal cells : Identification of miRNAs regulating growth and survival.
Cytotechnology, 53(1-3), pp.55–63.
Gibbs, R. et al., 2004. Genome sequence of the Brown Norway rat yields insights into
mammalian evolution. Nature, 428(6982), pp.493–521.
Goldman MA, Holmquist GP, Gray MC, Caston LA, Nag A. 1984. Replication timing of
mammalian genes and middle repetitive sequence. Science 224: 686-692.
Goldman MA. 1988. The chromatin domain as a unit of gene regulation. BioEssays 9:5055
Hammond S, Swanberg JC, Kaplarevic M, Lee KH. 2011. Genomic sequencing and
analysis of a Chinese hamster ovary cell line using Illumina sequencing technology. BMC
Genomics,12(1), p.67.
Höckner M, Erdel M, Spreiz A, Utermann G, Kotzot D. 2009. Whole genome amplification
from microdissected chromosomes. Cytogenet Genome Res.125(2):98-102.
Holmquist G. & Caston L. 1986. Replication time of interspersed repetitive DNA sequences
in hamsters. Biochim Biophys Acta., 868((2-3)), pp.164–77.
Hsu, T. & Arrighi, F. 1971. Distribution of constitutive heterochromatin in mamallian
chromosomes. Chromosoma, 34(3), pp.243–53.
Ishidate, M.J., Harnois, M. & Sofuni, T. 1988. A comparative analysis of data on the
clastogenicity of 951 chemical substances tested in mammalian cell cultures. Mutat Res,
195(2), pp.151–213.
82
Jayapal, K.P., Wlaschin, K.F. & Hu, W., 2007. Recombinant Protein Therapeutics from
CHO Cells — 20 Years and Counting. Chem Eng Prog, 103(10), pp.40–47.
Jenkins, N., Murphy, L. & Tyther, R., 2008. Post-translational Modifications of Recombinant
Proteins: Significance for Biopharmaceuticals. Molecular Biotechnology, 39(2), pp.113–
118.
Jenuwein T & Allis CD. 2001. Translating the Histone Code. Science 293: 1074-1079
Kao, F. & Puck, T., 1968. Genetics of somatic mammalian cells, vii. induction And isolation
of nutritional mutants in chinese hamster cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 60(4), pp.1275–
1281.
Kohany, O. Gentles AJ, Hankus L, Jurka J. 2006. Annotation, submission and screening of
repetitive elements in Repbase: RepbaseSubmitter and Censor. BMC bioinformatics, 7,
p.474.
Korenberg JR & Rykowski MC. 1988. Human genome organization: Alu, Lines, and the
molecular structure of metaphase chromosome bands. Cell 53:391-400.
Kuroiwa, A Watanabe T, Hishigaki H, Takahashi E, Namikawa T, Matsuda Y. 1998.
Comparative FISH mapping of mouse and rat homologues of twenty-five human X-linked
genes. Cytogenetics and cell genetics, 81(3-4), pp.208–212.
Kuroiwa, A Tsuchiya K, Matsubara K, Namikawa T, Matsuda Y. 2001. Construction of
comparative cytogenetic maps of the Chinese hamster to mouse, rat and human.
Chromosome Research, 9(8), pp.641–648.
Lewis NE, Liu X, Li Y, Nagarajan H, Yerganian G, O'Brien E, Bordbar A, Roth AM,
Rosenbloom J, Bian C, Xie M, Chen W, Li N, Baycin-Hizal D, Latif H, Forster J,
Betenbaugh MJ, Famili I, Xu X, Wang J, Palsson BO. 2013. Genomic landscapes of
Chinese hamster ovary cell lines as revealed by the Cricetulus griseus draft genome. Nat
Biotechnol, 31(8), pp.759–65.
Martínez-López W, Folle GA, Obe G, Jeppesen P. 2001. Chromosome regiones enriched
in hypercetylated histone H4 are preferred sites for endouclease- and radiation-induced
breakpoints. Chromosome Research 9: 69-75.
83
Martínez-López W, Porro V, Folle GA, Méndez-Acuña L, Savage JRK, Obe G. 2000.
Interchromosomal distribution of gamma ray-induced chromatid aberrations in Chinese
hámster ovary (CHO) cells. Genetics and Molecular Biology 23:1071-1076
Martínez-López W & Di Tomaso MV (2006) Chromatin remodeling and chromosome
damage. Human and Experimental Toxicology 25: 539-545.
Müller D, Katinger H, Grillari, J. 2008. MicroRNAs as targets for engineering of CHO cell
factories. Trends Biotechnol, 26(7), pp.359–65.
Mullins L. & Mullins J. 2004. Insights from the rat genome sequence. Genome Biol, 5(5),
p.221.
Murer-Orlando, M. & Richer, C., 1983. Heterochromatin heterogeneity in Chinese hamster
sex bivalents. Cytogenet Cell Genet, 35(3), pp.195–9.
Ono, T. & Sonta S, 2000. Comparative mapping of seven genes in mouse, rat and Chinese
hamster chromosomes by fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet, 89(34), pp.209–213
Puck, T., Ciecura, S. & Robinson, A., 1958. Genetics of somatic mammalian cells III. Longterm cultivation of euploid cells from human and animal subjects. J Exp Med, (108),
pp.945–956.
Romanenko SA, Perelman PL, Serdukova NA, Trifonov VA, Biltueva LS, Wang J, Li T, Nie
W, O'Brien PC, Volobouev VT, Stanyon R, Ferguson-Smith MA, Yang F, Graphodatsky AS.
2006. Reciprocal chromosome painting between three laboratory rodent species. Mamm
Genome, 17(12), pp.1183–92.
Schmid CW & Jelinek WR. 1982. The Alu family of dispersed repetitive sequence. Science
216:1065-1070
Smit A. & Hubley R. RepeatModeler Open-1.0. 2008–2010 〈http://www. repeatmasker.org〉.
Soloneski, S. González M, Piaggio E, Reigosa M.A, Larramendy M. 2002. Effect of
dithiocarbamate pesticide zineb and its commercial formulation, azzurro. III. Genotoxic
evaluation on Chinese hamster ovary (CHO) cells. Mutat Res, 514(1-2), pp.201–12.
84
Therman E & Susman M. 1992. Human Chromosomes. Structure, behavior, and effects.
Springer-Verlag, New York.
Trummer E, Ernst W, Hesse F, Schriebl K, Lattenmayer C, Kunert R, Vorauer-Uhl K,
Katinger H, Müller D. 2008. Transcriptional profiling of phenotypically different Epo-Fc
expressing CHO clones by cross-species microarray analysis. Biotechnol J, 3(7), pp.924–
37.
Wakefield MJ. & Australian T. 2005. Chromosome X : General Features.pp.1–6.
Wlaschin KF & Hu WS. 2007. A scaffold for the Chinese hamster genome. Biotechnology
and Bioengineering, 98(2), pp.429–439.
Wurm FM & Hacker D. 2011. First CHO genome., 29(8), pp.8–10.
Xu X, Nagarajan H, Lewis NE, Pan S, Cai Z, Liu X, Chen W, Xie M, Wang W, Hammond S,
Andersen MR, Neff N, Passarelli B, Koh W, Fan HC, Wang J, Gui Y, Lee KH, Betenbaugh
MJ, Quake SR, Famili I, Palsson BO, Wang J. 2011. The genomic sequence of the
Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nature biotechnology, 29(8), pp.735–41.
Yang F, O'Brien PC, Ferguson-Smith MA. 2000. Comparative chromosome map of the
laboratory mouse and Chinese hamster defined by reciprocal chromosome painting.
Chromosome Research, 8(3), pp.219–227.
85