Excell Contaminantes Qcos y Bcos ENOFORUM Montpellier 2016

Transcripción

El disfrute del vino-placer
Aromas y Bouquets:
El aroma es el olor percibido por
olfacción directa y el bouquet se
percibe por vía retronasal.
Antonio Tomás PAL ACIOS GARCÍA
Univers idad de la Rioja
Universidad de la Rioja
Lab orat orio E XCE LL Ib érica, S.L.
2 6 0 0 6 Log roñ o – La Rioja
www.lab excell.com
Lista de riesgos químicos:
•
•
Productos fitosanitarios y herbicidas,
Metales pesados: plomo, mercurio, arsénico...,
•
•
•
Productos de limpieza y desinfección,
Grasas y aceites,
Migraciones de los envases: bisfenol A y diglicidil-éter de bisfenol A,
ftalatos, nonilfenoles,
Etilenglicol y dietilenglicol,
Carbamato de etilo, aminas biógenas, ocratoxina A
Antifermentos: natamicina, benzoico, sórbico.
Ferrocianuro,
•
•
•
•
•
•
TIPOS DE AROMAS:
•Primario o varietal
•Secundario o fermentativo
•Terciario o de crianza
Substancias liberadas del roble, virutas o chips de roble o por exceso
de tostado: hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), migraciones
de los tapones: contaminantes orgánicos persistentes, bifenilos
policlorados y HAP,
Familia de compuestos considerados como alergénicos: anhídrido
sulfuroso, derivados de productos de leche y huevo.
LA EVALUACIÓ N DE LA CALIDAD:
El disfrute del vino-placer
Gustos Elementales
Número infinito de sabores.
• DULCE: Sacarosa. Reacción inmediata.
Punta de la lengua.
• ÁCIDO: Tartárico o cítrico. Mayor
persistencia. Laterales y base de la lengua.
• SALADO: Cloruro sódico. Mayor
persistencia. Bordes de la lengua.
• AMARGO: Quinina. Lento en
percepción pero más constante. Parte
posterior de la lengua.
• UMAMI: Glutámico.
Calidad: sensibilidad del catador
El Consumidor
Las exigencias del consumidor
1 – LA SEGURIDAD ALIMENTARIA:
La salud
2 – LA SATISFACCIÓN:
a) Ausencia de defectos
b) La caracterización o tipicidad
3 - LO S SERVICIOS:
Aquisición cultural, recuerdos, sentimientos
Sam Harrop:
International
Wine Challenge,
2012
1
Fuentes de Contam inación:
Mercaptanos y Sulfuros
•
Numerosas y diversas, pero las principales son
f recuentemente los mismas
SULFUROS:
– 2-Metil-3-tiofanona: miga de pan (0,1-1,0 µg/L)
– Sulfuro de etilo: ajo (15-18 µg/L)
– Sulfuro de dimetilo: oliva (1,4-8,5 µg/L)
•
•
Alteraciones microbianas
sobre el vino:
– Levaduras
DISULFUROS:
– Disulfuro de dimetilo: col (30- 45 µg/L)
– Disulfuro de dietilo: cebolla, caucho (25-40 µg/L)
•
• Brettanomyces intermedius
• Zygosaccharomyces bailii
TIOLES:
– Bacterias acéticas:
– Metano-tiol: podrido (0,3 µg/L)
– Etanotiol: cebolla, gas, ajo (1,1 µg/L)
– Mercato-etanol: corral, palo de gallinero (1-10 µg/L)
•
• Lactobacillus sp.
• Pediococcus sp.
ÉSTERES:
– Acetato de tio-metilo: vegetales podridos, queso (10-40 µg/L )
– Acetato de tio-etilo: quemado, sulfurado (10-30 µ/(L)
– Acetato de metil-sulfanol-propilo: ajo, champiñón (100-115 µg/L)
Calidad: sensibilidad del consumidor
4%
2% 2% 2%
•
Ambiente de bodegas de
vinificación y crianza:
– Fuente contaminante indirecta
•
Materiales de contacto
directo:
– Madera de roble y alternativos
– Sistemas de taponado y
netamente de corcho
– Revestimientos de cubas
– Bacterias lácticas :
– 3-Metil-Sulfanil-propano: patata cruda, tubérculo
– 2-Metil-sulfanil-etanol: judía verde (1-10 mg/L)
– Metionol: coliflor, col cocida (3,2-4,5 mg/L)
5%
Defectos de materias primas:
– Uvas insuficientemente maduras
– Estado sanitario insuficiente
• Acetobacter/Gluconobacter
ALCOHOLES:
•
•
7%
35%
12%
Identificación Precisa de la Naturaleza
y del Origen de las Contam inaciones:
Comprensión, Prev ención y Solución de los
problemas !
•
El análisis sensorial (degustación) es siempre la primera herramienta de
diagnóstico a la disposición del técnico.
•
Ello permite seguir orientando la investigación, pero nunca diagnosticar
precisamente la naturaleza ni el origen del problema, llevando incluso a
confusión.
•
Ello no permite detectar niveles bajos del problema, solo cuando la
alteración es ya efectiva en el vino …
12%
19%
No identificado
Cuadra
Cuero
Animal
Boñiga
Caballo
Betún
Laca
Madera mojada
Brett
•
Raramente posible anticipar acciones con esta herramienta !
•
El factor tiempo en el diagnóstico es siempre crítico !
Serie Etil-fenol
Contaminaciones/Alteraciones del Vino
Las fuentes son numerosas !
•
(fermentación)
(accidentes
de extracción,
fluidos refrigerantes )
Oxidación y reducción
Contaminaciones
por materiales de contacto (revestimiento s
Contaminación ambiental (atmósfera)
- . M ejores p rocedimientos de ex tracción.
- . M ejores técnicas separ ativas .
de cubas, madera)
- . M ejor sen sibilid ad en la detección.
En el curso del embotellado
–
–
–
•
Contaminaciones
externas
En el curso de la crianza
–
–
–
–
•
Contaminaciones
fitosanitarias (parásitos, pesticidas).
Alteraciones de la vendimia (parásitos, accidentes de vendimia mecánica).
En el curso de la vinificación
–
–
•
Rápida evolución tecnológica
De la uva
–
–
•
Técnicas analíticas finas:
Oxidación
Contaminaciones
por materiales
enológicos)
de contacto (revestimiento s,
filtros, productos
En el curso de la evolución en botella
–
–
–
–
–
Alteraciones microbianas en el curso del envejecimiento
Oxidación
Reducción
Contaminación por embalajes de contacto (corcho)
Condiciones de transporte/alm ac en ami en to (a parte de la temperatura)
2
Desarrollo de la SPME
(micro-extracción en fase sólida)
Check List
Utilización de la SPME en modo espacio de cabeza (HSSPME) para aislar
y concentrar las moléculas específicas sin utilización de solventes y de
manera automática:
- . Fase PDMS (apolar) para los haloanisoles (poco polares)
Detección simultánea específica
por SIDA-HSSPME-GC-MS
(Chatonnet et al., J Int Sci Vig ne Vin. 39, n°3 (2005), 137-147)
- . Fase Poliacrilato (polar) para los fenoles volátiles (polares)
(Mejias et al., Journal of Chromatog raphy A 995 (2003), 11–20)
Aplicaciones del
CHECK LIST:
Optim ización del m étodo Check List
Análisis simultáneo de 26
moléculas implicadas en
defectos organolépticos en
un nivel inferior o igual a sus
umbrales de percepción:
7
2M35DP
TC A
Geosmina
IB MP
R esp uest as rela ti vas
6
5
4
3
2
1
0
F ibr a
D VB/ CAR /PDMS
Fibr a PD MS
-. Identificación de defectos
complejos (combinación de
defectos).
-. Prevención de defectos
organolépticos.
-. Asistencia en compra-venta de
vinos.
-. Coupages y mezclas.
-. Control de calidad en general.
-. Peritaje jurídico.
Ti po de fi bra
6
2M35DP
TC A
Geosmina
IBMP
R esp uest as rela ti vas
5
-. A juste del pH (7).
-. U tilización de la SPME, fibra DVB/CAR/PDMS
( m ezcla).
-. A juste de la polaridad por dilución 1/2 .
4
3
2
1
0
sin dilución
dilució n=1/2
Di luc ión
Optim ización del m étodo
Influencia del um bral de detección y las
unidades olfativas en los “coupages”
0, 018
U. olfativas = 8
0, 016
0, 014
0, 012
mg/l
U. olfativas = 10
0, 0 1
Umbral
de te cción
0, 0 08
0, 0 06
0, 0 02
0
Dietilsulfuro
• O p t imización del tiem po de extr acción: Para incrementar la productividad y no
llegar al equilibrio de absorción de algunos compuestos, se eligió 60 minutos.
C onc. re al
0, 0 04
Mercatoetanol
• O p t imización de la temp eratu ra de extr acción: La temperatura controla la
evaporación y absorción en la fibra. El valor seleccionado es de 45ºC, (máximo de
absorción de pirazinas).
3
La Tradición versus La Tecnología
¿Que es terroir?
¿Que es Terroir ?
Cuevas de la Villa de Requena cuyo s ubs uelo es tá ocupado por
antiguas bodegas
Lo hago yo mismo,
igual que mi
tatarabuelo lo
hacía……. Nada de
nuevas tecnologías,
levaduras o esas
porquerías…….
Control de Calidad
versus
Identificación de
Problemas
4
Ejem plo 4: Carácter «vegetal, cartón
m ojado, papel, cham piñón»
Ejem plo 1: Defecto «hum edad+corcho»
detectado por cata
Vino tinto D.O.Ca. Rioja
Aspergillus sp
Contaminación corcho:
-. una polución por tapones de
corcho de la botella ?
Trans-nonenal
Trans-octenal
Conc entración
TCA
1,5 ng/l
TeC A
nd (<0,2 ng/l)
effets:
PCA Synergie
1,0des
ng/l
TBA
2,6 ng/l
Vino de la D.O. Ribera del Duero con
falta de fruta y aromas de cartón
mojado, sin madera neta.
Sinergia!
Equivalente TCA 4.1
ng/l > umbral
Mohos en madera
o en corcho:
Contaminación de origen estrictamente medioambiental:
-. Ambiente de bodega
-. Materiales de contacto, contaminación indirecta
-. Penicillium
-. Aspergillus
-. Monilia sitophila
-. Candida sp
Aspergillus sp
Ejem plo 2: Carácter «vegetal»
Ejem plo 5: Carácter «ahum ados, tizón,
quím ico, abrillantador de m etal»
Vino de Shyraz de la D.O. Valencia que presenta una desviación
organoléptica importante con un carácter «vegetal»
Concentration
Método
alcohol es/al deh idos insaturados C6
nd (<0,1 mg /l )
(ot ro mét odo)
2-isobutil -3 -metoxipirazina
nd (<3 ng /l )
Check List
2-isopropil -me toxipi ra zi na
nd (< 4 ng/l)
Check List
2-hetoxi-3-hexadieno
3,3 µg/L
Check List
Concentración superior al umbral de
percepción medido por Excell (0,25 µg/L)
Degradación de ácido sórbicoutilizadopara la estabilización de taninos
enológicos líquidos por bacterias lácticas después del envasado.
Ejem plo 3: Carácter «terroso»
Vino blanco de la D.O. Mancha que presenta durante la vinificación una
desviación organoléptica importante del «tipo terroso».
Guaiacol
Vino del Priorat con exceso de
madera tostada, ahumados.
Bacterias en corcho:
-.
-.
-.
-.
-.
-.
-.
-.
-.
Bacillus
Corinobaterium sp
Flavobacterium sp
Kurthia sp
Micrococcus
Nocardia sp
Pseudomonas sp
Streptomyces sp
Listeria sp
Ejem plo 6: Partículas en suspensión
«insolubles» en botella.
Concentración
Geosmina
nd (< 1,5 ng /l)
2 -MIB
nd (<6,0 ng/l)
nd (<4,0 ng/l)
IPMP
2-metoxi-3,5-dimetil-pirazina
2M3,5DMP
16,2 ng/l
ORIGEN:
-. Productos enológicos (chips) ?
-. P o r el cor cho utilizado
Metoxi-Is o-Bor neol
Is opr opil-Metoxipir az ina
Contenido muy superior al
umbral definido por
SIMPSON et al. 2004: 2
ng/L en vino
Vino del Alentejo (Portugal)
embotellado con partículas
en suspensión
-. Estado sanitario de la uva ?
5
Ejem plo 7: ¿Adición de «glicerina»?
Vinos de D.O. Mancha y Rueda parados en Alemania por detección de
«3-Metoxi-1,2-Pro pa ne di ol 3-MPD y Diglicerol cíclico DC».
Compuesto
Vino A
Vino B
n.d.
0,2 mg/L
1,1 mg/L
n.d
3-MPD
DC
a) Cultivos de m icroorganism os
sobre m edios sintéticos
• Un medio específico para cada micro-organismo:
-. Muy difícil diferenciar entre bacterias lácticas en cultivos
genéricos.
-. El control de Brettanomyces necesita un mediode cultivo
específico que casi ningún laboratorio utiliza.
-. Muchos falsos positivos .
• Retraso de crecimiento en cultivos variable según
los micro-organismos y sus estados fisiológicos (2
a 8 días):
- Respuesta muy tardía para ser verdaderamente útil en
casi todos los casos de bodega !.
Concentración superior al límite legal OIV
Proviene de glicerina de grasa vegetal o animal
Concentración superior al límite legal OIV
Proviene de glicerina de hidrocarburos
• No toma en cuenta los gérmenes viables no
cultivables en función de su estado fisiológico en el
momento del control !.
El Vino con 3-MPD puede provenir de la utilización de
chips de roble americano.
Contam inaciones Microbiológicas
del Vino:
P ueden aparecer en todos los estadios de la elaboración
B- Vinificación
Fermentación
P ri
r incip
ncipiio
o
Cult ivo so bre
br e med io esp
es pecíf
ecífico
ico
S uiviBr
uiv iBr ett EExc
xcell
ell
Cult ivo
Cultiv
o / PPCR
C
CR
Rm
mig
igrració
aciónn so
sobr
bree
g el
gel
Cultivo
Cultiv
o sobre m
medio
edio sintético
específico
específ
específico
ico
Cultivo
C
Cultivo
ultivo sobr
sobre
e medio
medio
se miespecífico
semiespecíf
ico / PCR
P CR /
E lectrofo
Electr
oforesis
resis
58 días
días
55-8
8
dí
as
69 días
días
66-9
9
días
Ti empo
Tie
mpo de
resp uest a
C- Crianza
A- Uva
b) Evolución de los cultivos sim ples
sobre m edios sintéticos
D- Envejecimiento
en botella
E
E specíf
specíf ico
ico
S ensi
ens ibilid
bilidaad
d
Espe
cífic
E specífico
Espe
cífico
o según
según
segú nlos
los
los
microo
rganismos
puntados
m icr oorga
microo
rganismos
nismosa
aapun
puntados
tadospo
po
porrr la
la
la
elecci
elección
ó n de los
lo sfra
fragm
gmentos
entos
Detección de gérm enes
De tección de gér menes
Detecci
ón d
de
e gér
gér men
men
es=qu
qu
iescen tes
tesquiescente
ale ator
ator ios
ioss=
=aleatorios
sub -estim
-estim
ació n
n
Detecci
quiescentes
ón
aleat
orios
es
subiescen
ale
sub
= subació
d
la
blaci
ón p
p oten
oten cialm
cialm
enteación
peligr
osa
estimación
de
ede
la po
la
popoblación
blaci ón
estim
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peligr
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Depen
Dep ende
de de la espe
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cificidad
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el
medio de
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cultivo
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po tencialmente pelig rosa
potencialmen te peligrosa
La baja
baja
viabilidad
de
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l s
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célu
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l s
s debido
debido a
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s "e
"estresan
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La
ba
ja viabilidad
viab il idad de
de llas
a
células
lascond
condiciones
icci ione
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del
cocondu
nducircira
aa
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fa
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n egat
egat
ivos
del
delvi
vin
vino
no
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puede
pu ede
co
nducir
rr esult
esult
resulatd
ados
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falsos
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n
ativos
ivos
P recisi
recisiión
ón
P
recis
ón
Aplicaación
ción de
de
Aplic
Aplica
ción
la tt écnica
écnica
la
Fáácil
deep
ppuesta
uesta a
a pun
pun
to,
F
Fá
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uesta
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equipam
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co
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equ
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ip amiento
iento
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ococo
costoso
sstt oso
Manoode
de
oobr
braacualitativo
cualitativo
Man
Mano
deo
bra
cualitativo///
Equipam
iento específico
específico
E
Equipam
quipamiento
iento
específico
Cult
Cultiv
ivo/
o/dde
etecció
tecciónnddee
m
micro
icrocolo
colonias
nias
Cultivo
C
Cultivo
ultivo sobr
sobreemedio
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semiespecífico
se miespecífico++ identificación
ide ntificació nde
de
colonias
/
anticuer
pos
colonias
colonias//anticuer
anticuerpos
pos
fluer
flueresce
escentes
ntes
2-4
días
2-4
2- 4días
días
Sem
S emiii específico
Sem
específico
esp ecíficosegún
según
segúnm
m
medio
edio
ediode
de
de
cultivo
ci
cultivo
cultivo+
++espe
espe
especificidad
cifficidad
icidad de
de
d elos
los
los
anticuerpos
a nticuerpos
10
10uf
ufc/m
c/ mLL
Def
ectos
de
fun
cion
ion amiento
amiento
De
Defe
D
ef
fecto
ectos
ct s
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de
defun
funciona
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Costo
Costoso
Mate
aterrial
rial
ial
específico
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Costoso
Costoso
so///M
/Mate
Mater
ial esp
específico
específico
PP
PP
rec
recaucion
aucio nes
esdde
de
e man
manipu
ipua
l lación
ción
ión
recaucion
recauciones
es
de
manipu
manipu
la
a
l cción
severas
se
severas
severas
veras
Poco costoso
Retr aso en la r espuesta
No detecta los gér m enes
viables no cultivables (VNC)
Principales m icro-organism os
contam inantes del Vino
•
Levaduras
– Brettanomyces intermedius
•
• Producción de fenoles
volátiles (etil-fenoles)
Como detectarlos y
cuantificarlos rápidamente y
selectivamente ?
No detecta
los VNC
Defecto de
funcionam ie nt o
Los gérm enes viables no
cultivables (VNC)
Distr ibución
m icr obianas
car acter ística de las poblacion es
de Br ett en una m uestr a de vino
• Producción de ácido acético,
acetato de etilo y ácidos
grasos volátiles.
– Zigosaccahromyces baïlli
• Refermentación de azúcares
residuales por la presencia de
antisépticos
Bacterias acéticas
– Acetobacter sp., Gluconobacter
sp. :
Retr aso en la r espuesta
• Células viables
No cultivables
•
Bacterias lácticas
– Lactobacillus sp.
• Producción de aminas
biógenas
• Degradación láctica de glicerol
– Pediococcus sp.
• Producción de aminas
biógenes
• Producción de acetiltetrahidropiridinas
• Producción de acroleína
• Células viables y
cultivables
••Células
Células m uer tas
o m or ibundas
Una parte importante de los microorganismos pueden sin embargo
desarrollarse después de un tiempo
de aclimatación variable con la
desaparición del estrés fisiológico
(antiséticos, temperatura,….)
6
c) Técnicas alternativas
en desarrollo
Aplicaciones de la PCR:
Epif lour escencia
C itometría de flujo para detectar
Brettanomyces
A nálisis microscópico
M ed io s coSni
n pf recu
f" Brett"
rso res d e aro mas
Pr incipio
M arcaje de célula s por
floures cencia /Cuantific ación de la
s eñal flo uresc ente
Marcaje
M arcajepor
porfflo
loures
ur escenc
cencia
ia no
no
específic
pec ífic a d
de
e cé
élu
lula
las
s viv
v iv ie
ien
nte
tes
s
Observ ación m icros cópic a
C ultivo sobre medio líquido s emies pec ífic o / detec c ió n de
m etabolit os por análisis s ens orial
Tiempode
respuesta
24 horas
< 15 minutos
15 m in utos
2-13
2-13 días
Específico
No
No esp
es pe
ecífico
c ífic o
NNo
o espec
especííf ic
ico
o
No
No esp
es pe
ecífico
c ífic o
Sensibilidad
100.
10
0.000
0 00 cel/m
cel/mL
L
20
2
00
0 ce
c el/m
l/mL
L
100.
100
.000
0 00 cel/m
cel/mL
L
Precisión
Diagnóstico clínico
Seguimiento y Evaluación de terapia
Detección de cepas resistentes a antibióticos
Detección de pobla ciones
D etec ción de poblac iones v iables
via bles en el curso del
en el curs o del c recim ie nto
crecimiento
Tes
Test tsemi-c
s emi-cuantitativo
uantita tivo
Detección de mutaciones puntuales
La
l idad
de célula
Labaja
bajaviabi
v iabil
i dad de
célulass
Las L
morf
as morfolo
ologías
gías
ambiguas
am big uasdede
mic
m icroorgan
r oor ganismos
is mos pueden
pueden fácilmente
fácilment des
e dese
envnvocar
oc ar en eide
n identific
ntific acion
aciones
es
debi
debi
ddoo aa la
las
s condic
c ondicione
iones
s
erronea
erroneas
s
estres
estresantes
antes de
del
l vino
v ino cconduce
onduce a a
re
res
sultados
ult ados de
de fals
falsos
os nega
negatti vivoos
s
M ano de obra cualit ific ado /
Material específico / Apli c able
Aplicación de Mano de obra c ualif ic ada / Materia l
s ola m ente c uando la fe rm enta c ió n
la técnica
espec íf ic o
alcohóli c a es tá term in ada o
bloquedada
Fácil puesta a punto / Cos to bajo
Polimorfismo genético
Filiación humana
Fác il pues ta a punto / Costo bajo
Medicina Forense
Pedigrí animal
Algo interesante:
Interés limitado por ser no específicas
no específica, semicuantitativa y retrasos
muy prolongados
Control de calidad
PCR Clásica:
Técnicas Moleculares:
Aplicaciones Prácticas
Gel de agaros a teñido con
bromuro de etidio
¿ Que es la PCR ?
PCR a tiempo real:
d) Medida de los principales microorganismos contaminantes del v ino por
análisis biomoleculares cuantitativ os en
tiempo real
1983 – 1985: Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR)
Ventajas:
Alta sensibilidad
Alta especificidad
Rapidez
Kary Mullis
Otras ventajas:
• Detección a partir de cualquier muestra biológica (sangre,
piel, cabellos, saliva, líquido cefaloraquídeo, etc…)
• No es necesario que la muestra sea estéril.
• Detección de un patógeno en particular aún en presencia
de otros patógenos.
• Desarrollo de la técnica
para detectar
contaminantes:
>>
>>
Excell Gen Levaduras
Excell Gen Bacterias
7
PCR a Tiempo Real:
Generación de señal por deshibridación de la sonda
(Scorpions)
Equipam iento de la PCR a
Tiem po Real:
Tapón de cierre a presión
El fluoróforo emite señal
cuando el agente
bloqueador (Quencher) se
encuentra alejado por
efecto de la hibridación a
la secuencia target
Gran superficie de
calentamiento
interno
Reflectores
ópticos
Ventanas ópticas
pulidas
PCR a Tiem po Real
Tiem po Real:
Mg 2 +
target Scorpion
La especificidad y la
multiplicidad de fragmentos y
de sondas fluorescentes
utilizadas permite la detección
simultánea de diferentes tipos
de micro-organismos !
Taq DNA Polimerasa
IC Scorpion
dCTP
dGTP
Gracias a una curva de
calibración efectuada para cada
tipo de micro-organismos diana,
es posible cuantificar
precisamente la cantidad de
células presentes en las
muestras
Control
Interno (CI)
dUTP
dATP
[Población] = [Población] CT X(1/ ECT )
Características del m étodo
Gen Levaduras / Bacterias
Tiem po Real:
Tubo de reacción
Ventilador
•
El método de extrac ción de las moléculas de ADN micro biano desarroll ado
es original y muy eficaz.
•
Muy bajo nivel de ruido, permite obtener señal en relación a l nivel de ru ido
muy importante y así una gran sensibilidad (límites de detección muy
bajos, ejemplo: Brettanomyces <10 células /100 mL).
•
Los sistemas de marcaje de las moléculas de ADN diana son muy
sofisticados y discriminantes; se utilizan fragmentos y sondas específicas
que hacen posible la detección simultánea de varios microorganismos.
•
Para la utilización de un patrón interno, el riesgo de resultado “falso
positivo” es casi nulo.
•
Es muy rápido: 8 horas.
Calentador
Bloques
Ópticos
Cuerpo
electrónico
8
Características comparativas de los
métodos cuantitativos «Tiempo Real»
Gen levaduras
Exce
Ex cell
ll
/ bacterias
Gen
Ge n
Pr incip
inc ipio
io
Otr
Otras
Otros
oslab
metodologías
labo
or ato
ra tor
rioios
s
PCR
PCRcuantitativo
cuan titativoen
entiempo
tiemp oreal
rea l
Ejem plo 10: Gen Bacterias
Bacterias lácticas en el curso de la crianza y aminas biógenas
Segu imi ento de pro du cto s de
sínt esis d e m icro or gan ismo s
diag nós tico Br ett Ex cell
Análisis por cr omato grafía
g aseosa
mg/l
Histamina
Tiempo
88ho
h oras
ho
ras
ra s
40
40
4 ho
0 hor
ra s
as
30
60
300
0
30
60
300
0
30
60
300
Testigo
0,2
11,1
11,2
35,7
0,0
0,8
20,0
84,6
0,0
0,2
5,7
9,5
Inoculado
0,2
3,4
8,7
35,9
0,0
0,9
1,3
82,0
0,0
0,4
2,1
8,6
2 hhoras
ora s
Alta:
Alta:ddete
ete cción
cción de etilfen
e tilfe nole
oless
Fr
Frag
agmen
mentos
to s++Sond
Son das
as
FrFag
Fra
ragmen
gmen
me tos
nto
tossúnic
ú
únnica
ciamen
a ment
men
tee
te
Fra gmen tos + Sond as espe cíficas
(p(pr
rooductos
du ctos de
de s
síntesis
íntes isde
de
esp
es pecíf
ecífi cas
icas
esp
eesp
spec
ecíf
ecíficos
ífico
icos s
Bre
Br ettano
ttan om
myces
yces))
LLím
ímetete
e de
deddete
etección
cción ba
baja
a
j (etil-4(et il-41100cel
10
cel
celvviab
viables
iableles
s //100
1
100
00mL
m
mLL
1000
100
1 000
0cel
cel
ce/l10
/ 100
0 mL
mL
f feno
enoll ==27
27 micr
microg
og /L; umb
umbral
ra lde
de
per
pe cepci
rcepción:
ón: 450 m
micr
icrog/L)
og/L )
Co
Co
Contr
ntr
nt ro
ololil nter
intern
int ern
nooo
No contr
No
No
olco
inter
c ntr
on no
tro
ol ilnter
in ter
nono Rie sgo
Incer
I ncertidum
tid um bre
br e = 31 m
micr
ci r og/L
og /L
No
No
Noffalsos
also
falsossneg
ne gativos
gat
ativo
ivos
s
Rie
Riesgo
sgo
dede
de
falsos
f alsos
falsnos
egativos
neg
n ega
ativo
tivo
ss
Esp ecífi
Espec
ífico
co
Sen sibilid
sib ilida
add
Pre cisió
Prec
isiónn
Ap licació
Apli
cació n de
de
la ttécn
écnic
ica
a
Mano
Ma node
deobr
obra
a cualificada
cualificada/ /Mater
Mateial
rialespecífico
espe cífico
Rápido / Sensible /
Altamente específico.
Detección de 5 tipos de
gérmenes
Menos rápido / menos
sensible / menos
específico / Detección
de un solo germen
Tiramina
0
(días)
T iemp
iem po
o dde
e
re spu
res
pueesta
sta
Putrescina
Poco tra bajo / Ma terial espe cífico
Recon tamin ación
evid en te d e vin o
in ocu lad o con b acterias
lácticas p or b acterias
p rod u ctoras d e
h istamin a
(Ped iococcu s)
30 días
después fin
FML
Rápido / Sensible /
Específico. Ideal para el
seguimiento regular del
vino con riesgos
Ejemplo 8: comparación
de técnicas analíticas
en el seguimiento de «Brettanomyces»
mg/L
Histamina
Tiempo
Recon tamin ación
evid en te d e vin o
in ocu lad o con b acterias
lácticas p or b acterias
p rod u ctoras d e h istamin a
y d e p u trescin a
(Lactob acillu s)
Putrescina
Tiramina
0
30
60
300
0
30
60
300
0
30
60
300
Testigo
0,2
11,1
11,2
35,7
0,0
0,8
20,0
84,6
0,0
0,2
5,7
9,5
Inoculado
0,2
3,4
8,7
35,9
0,0
0,9
1,3
82,0
0,0
0,4
2,1
8,6
(días)
LD: Cata
60 días después find e la FML
300 días después fin de FM L
(células/mL)
(célula s/mL)
LQ: M edios cultivo
1316 12
3 10 90
55 90
310 90
25 500
LQ: Cromatografía
Bact. Acé tic as
Bacte ria s l ácti ca s
La ctob ac li l us s p.
13 1612
12 5000
Pedi c oco cc us s p.
LQ: PCR tr
invierno
primavera verano
Sour ce: Br uce Zoecklein; Enology—Gr ap e Chem istr y
Gr oup, Vir ginia Tech; USA; Am . J. Enol. Vitic. 54:294-300
Ejemplo 9: Gen Levaduras
66 12
40
Ba ct. Ac éti ca s
Ba cteri as l ác tic as
L ac o
t ba ci l us sp .
Pe di coc oc cu s sp .
3
C o n la utilización de Gen Histidina Descarboxilasa habría sido posible anticiparse al
c a mbio de composición del vino en aminas biógenas por el incremento
f i nal de la población de bacterias lácticas del vino
Aplicaciones de la PCR
a Tiempo Real
Control de relleno de barricas
2013
2014
2015
- . Re sul tado s en el día :
-. A dapt aci ón de l a prepa raci ón en el e mbo te llado ,
-. S e lec ció n de un medio de fil tra ció n ant es del embo te lla do,
El vino utilizado para el
relleno de barricas debe ser
continuamente vigilado
para evitar la diseminación
de contaminantes.
-. C o ntro l de esteri li zac ión después de l a fil tra ció n en e l curso del
e m b ot el lado
9
Aplicaciones de la PCR
a Tiempo Real
Control de la eficacia de lavado de barricas
Aplicaciones de la PCR a
Tiempo Real:
Aplicaciones de la METAGENÓMICA:
Identificación de
contaminantes
LEVADURAS y BACTERI AS en
MOSTOS
CONTAMI NANTES en PARADAS y
FERMENTACI ONES LENTAS
Acetobacter aceti
Acetobacter pas teurianus
Brettanomyces bruxellens is
Gluconobacter oxydans
Hans enias pora uvarum
Lactobacillus brevis
Lactobacillus hilgardii
Lactobacillus plantarum
Pediococcus damnos us
Pediococcus parvulus
Pichia membranaefaciens
Zygos accharomyces bailii
Acetobacter aceti
Oenococcus oeni
CONTAMI NANTES en VI NOS
Acetobacter aceti
Hans enias pora uvarum
Pichia membranaefaciens
Saccharomyces cerevisiae
EMBOTELLADOS
Saccharomyces cerevisiae
Madurez microbiológica: en el Suelo
Te tra cla dium maxil liforme
Phoma he rba rum
Mortierel la hya lina
Phoma eupy re na
Embell isia a llii
Fusarium equis eti
Alterna ria radicina
Botry ospha eria dothidea
Gibbe re lla a venac ea
Cla dospori um cla dosporioi de s
Aspe rgil lus fumiga tus
Epicoccum ni grum
Fusarium sporotrichioide s
Mortierel la alpina
Pre ussi a tenerifae
Cosmospora g iga s
Fusarium oxy sporum
Acrostal ag mus luteoalbus
Fusarium re dolens
238 especies de hongos diferentes
W ine Seq
Madurez microbiológica: en la Uva
89 especies de
hongos diferentes
Botryot inia fuc keliana
Botryot inia porri
Candida railenens is
Candida tropic alis
Candida zeylanoides
Cibor inia c amelliae
Clados poriums phaer os permum
Cosmos pora vilior
Crypt oc oc cus adeliensis
Cyberlindnera ja dinii
Sac c har omyc es c erevis iae
Pichia membr anifac iens
Torulas pora delbruec kii
Debaryomyc es hansenii
Malass ezia res tric ta
Clitocybe s ubditopoda
Wic kerhamomyc es anomalus
Penic illiumpaneum
Aureobas idium pullulans
Botrytis elliptic a
Penic illiumc orylophilum
Wallemia s ebi
Fus arium equis eti
Phoma eupyr ena
Tetracladium maxilliforme
Uloc ladium c ons ortiale
Exophiala spinifera
Gibberella avenacea
Mortierella alpina
Sac c har omyc es kudriavz evii
Clados porium clados por ioides
Epic oc cum nigrum
Fus arium oxysporum
Humicola fus coatr a
Lewia inf ectoria
Penic illiumbr evic ompac tum
Penic illiumc ommune
Penic illiumexpansum
Peyronellaea pinodella
Preuss ia intermedia
Alternaria arbust i
Alternaria longipes
Alternaria radicina
Alternaria radicina
As pergillus caes iellus
As pergillus fumigat us
As pergillus sc lerotiorum
As pergillus tubingens is
Bionec tria oc hroleuca
Boeremia exigua
10
Madurez microbiológica: Suelo y la Uva
Microbiologycal m aturity of grapes
•Representation of the community of bacteria (left) and fungi (right) in Zinfandel, Cabernet
Sauvignon and Chardonnay
Weighted UniFrac PCoA plot showing the dissimilarities among all
sample types from Suffolk Merlot and including Californian must.
Ir atxe Zar r aonaindia et al. m Bio 2015;
doi:10.1128/m Bio.02527-14
•
Nicholas A. Bokulich et al. PNAS 2014;111:E139-E148
• ©2 0 1 4 b y Na tio na l Ac ad e my o f Sc ie n ce s
Microbiologycal
statem ent of
w ineries:
Estado
m icrobiológico
del suelo del
viñedo:
Figure 1. Spatial distribution
of yeast and bacteria in the
environment of the winery
through vintage.
Bokulich NA, Ohta M, Richards on PM, Mills DA(2013) Monitoring Seas onalChanges in Winery-Resident
M icrobiota. PLoS ONE 8(6): e66437. doi:10.1371/journal.pone.0066437
http://127.0.0.1:8081/plosone/article?id=info:doi/10.1371/journal.pone.0066437
Microbiologycal m aturity of grapes
Ejem plo 11: Contam inación em botellado
vinos dulces (Navarra)
Control microbiológico del aire (ufc/m3 )
Picchia sp
Bacterial community in grape must with different regional patterns.
Nicholas A. Bokulich et al. PNAS 2014;111:E139-E148
• ©2 0 1 4 b y Na tio na l Ac ad e my o f Sc ie n ce s
11
Ejem plo 12: Crescate Levaduras
“Fósiles” autóctonas (4 Kilos)
Sensibilidad de los métodos:
Para un mismo tiempo de exposición
Método de
polvo
TB A
TCP
1
(referencia)
SPME
SB SE
X16.000
X5
X 50
X 20
1
(referencia)
Método Q uick Trap
Ejemplo 13:
Análisis de un contenedor
Análisis
ambientales
Cromatograma en modo SIM de
mues treos del container
- Cuantificación de TBA a 220
ng/m3
15 minutos
- Presencia importante de
estireno.
Q uick Trap
Inspe cción de la atmósfera
de bode ga
Comparación con los
umbrales de aceptabilidad
definidos.
R e chazo del contenedor: no apto para transporte de materiales sensibles como barricas,
ri esgo de alteración de los materiales transportados .
2007/2008 -Innovación QUICK TRAP:
Control de los ambientes sensibles.
Método patentado (n° de depósito: 07-59164)
Análisis de una bodega que presenta un defecto olfativo mal identificado
Cromatograma en modo Scan y en
modo SIM de mues treo de la atmós fera
Características del método:
- Extracción de las moléculas por un
polímero absorbente (SBSE).
- ~ 120 moléculas buscadas: Haloanisoles,
Halofenoles, HAP, BTEX, Pesticidas,
Terpenos, Alergenos químicos…
- Termodesorpción, análisis GC/MS
- Expresión de los resultados en µg de
compuestos/m3.
- Investigación de otras moléculas no
prioritariamente buscadas.
- 15 minutos de adsorción
- Resultados sobre las 24h.
!
Método Q uick Trap
Ejemplo 14:
SIM
(Stir Bar Sorptive Extraction)
4 horas
Concentración en ng/m3
TCA
TCP
TeCA
PCA
TBA
24
9
trazas
trazas
nd
TBP
trazas
Presencia de TCA que no
explica el defecto olfativo.
Scan
Identificación de Borneol y de Isoborneol
Concentración en µg/m3
Isoborneol
Isoborneol Borneol
Cuantificación
pos teriori
2-metilisoborneol
Geosmina
a
1,26
0.43
nd
trazas
Sistema robusto
Muestreo simplificado
Pres encia de Borneol e I s oborneol que explica
el defecto olfativo
12
Ejemplo 14:
Ejemplo 15:
Análisis
Análisis de una bodega que presenta un defecto genérico de corcho
Análisis de una bodega con muchas
reclamaciones en exportación
Pallet 2
nd
Pallet 3
trazas
Pallet 4
trazas
Check List Atmosfera
En ng/g de absorbente
Nave 1
Sala Barricas 1
Sala Barricas Subterráneo
Nave 2
Sala Guarda Botella
Sala Insumos
TCA
TCP
TeCA
nd
0,9
trazas
nd
trazas
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
trazas
nd
Sala Producción
nd
nd
nd
PCA
PCP
TBA
TBP
Ventilación
nd
nd
nd
nd
trazas
nd
nd
6,8
nd
nd
16,3
3,6
nd
nd
nd
nd
64,8
trazas
2,3
4,7
9,4
1,4
12,2
5,3
8,5
12,3
78,2
nd
25,6
Trazas
+++
---+
--
nd
nd
nd
3,5
Trazas
+
TeCP
TBA
Pallet 1
nd
Vino blanco mesa
nd
Tinto D.O. 2007
nd
Tinto D.O. 2008
nd
Agua planta V. mesa
6
Agua planta V. D.O.
6,8
Tinto I D.O. Bot. 9:02
9,2
4,4
nd
nd
Tinto II D.O. Bot. 6:50
10,8
9,3
8,4
Tinto II D.O. Bot. 9.34
Ejemplo 14:
Ejemplo 15:
Análisis de una bodega que presenta un defecto genérico de corcho
Check List Insumos
en ng/g
Estructura madera nave 1
Ladrillo nave 1
Techo sala barricas Subterráneo
Pilares sala barricas Subterráneo
Ladrillo sala barricas Subterráneo
Estructura madera nave 2
Plumavit paneles guarda botella
Bins Madera
Pallet madera
Cartones
Tierra filtrante
Alternativos (chips)
Corchos (ng/tapón)
Tapa Rosca (disco)
TCA
TCP TeCA TeCP
PCA
PCP
TBA
TBP
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
trazas
nd
nd
nd
trazas
2,8
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
trazas
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
29,3
14,8
3,6
trazas
nd
4,7
trazas
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
136,2
29,3
trazas
nd
nd
12,3
trazas
38,2
1,3
178,3
32,0
12,0
trazas
15,8
28,3
18,3
5,4
7,3
6,5
16,4
4,8
463,2
trazas
683,5
82,1
trazas
trazas
1280,4
258,1
78,2
24,2
Trazas
nd
29,4
trazas
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
3,2
trazas
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
37,4
trazas
nd
nd
nd
nd
nd
Vinos
analizados
Ejemplo 15:
¿TCA?
TCA
Análisis
Balsa I
Balsa II
Balsa III
TCA (ng/l)
nd
nd
trazas
TeCA (ng/l)
nd
nd
nd
TBA (ng/l)
5,9
20,6
141
PCA (ng/l)
nd
nd
nd
TCP (ng/l)
2,2
2,6
trazas
nd
TeCP (ng/l)
nd
nd
TBP (ng/l)
13,1
44,5
6,2
PCP (ng/l)
trazas
trazas
tarzas
6
3,6
TBA
Vino 1
nd
nd
Vino 2
nd
trazas
Vino 3
nd
2,1
Vino 4
nd
trazas
Vino 5
nd
nd
Vino 6
trazas
5,3
Vino 7
nd
nd
Vino 8
nd
6
Vino 9
nd
trazas
Vino 10
nd
7,3
Vino 11
nd
nd
Vino 12
nd
9,3
Vino 13
nd
nd
Vino 14
nd
3
Vino 15
nd
5,3
Vino 16
nd
trazas
Vino 17
nd
5,5
Vino 18
nd
nd
Ejemplo 15:
57 ng/l
321 ng/g
Chl orel l a
13
Ejemplo 17: Los aportes de O2
en bodega, aspectos prácticos
ANALISIS SENSORIAL
VALIDACIÓN DE PANELES
DE CATA
Oxígeno en trasiego y
lavado de barricas
Llenado de
barricas en 2
estaciones
6
5
4
3
BBL
Empuje con
nitrógeno
BFE
2
Método de Investigación de la
Sensibilidad Gustativa.
UNE 87-003-95
BR
Llenado cabezal
especial
1
0
Dep ósit o
Bar rica
M edido por flour ometr ía
Ejemplo 16: Validación de un panel de cata:
Anova de dos vías . Las barras representan si existe efecto producto o catador para
cada atributo. La barra de color (amarillo, naranja, rojo) significa que no parece ser tal y una
barra gris que no la hay, (Amarillo: p <0,05, Naranja: p <0,01 y Rojo: p <0,001). La altura es el
valor F. Sirve para investigar el grado de reproducibilidad de un panel. También da una idea
de similitudes entre catadores de un mismo panel. Es útil para detectar falta de
entendimiento, diferencias de escala y catadores con desviaciones.
D epósito
de pr ecis ión: Pr es ens
Oxígeno en trasiego de depósito a depósito con bomba de
tangencial a 2 velocidades
mg/L de
Oxígeno
M edido por flour ometr ía
Ejemplo 16: Validación de un panel de cata:
G ráf icos Tucker-1: en la parcela cargas de correlación, el otro tipo, cada punto
de pr ecis ión: Pr es ens
muestra el atributo de un asesor específico. Cuanto más ruido contiene un atributo de un
evaluador, más cerca del centro aparecerá el punto. Cuanto más estructurada sea la información
de un atributo, más cerca aparecerá del círculo exterior (100% varianza explicada para ese
atributo y 50% el círculo interior).
14
Oxígeno en el servicio y consumo del vino
Figura 1: representación de la evolución de l
oxígeno disuelto (mg(L) del vino D.O. Valencia
2009 en botella, copa y decantador al minuto, a
los 30, 75 y 120 minutos.
Figura 2: representación del oxíg eno disuelto y
el potencial redox del vino D.O . Ribera del
Duero 1999 con y sin sedimentos al minuto y a
la media hora. (O2 : Oxígeno en ppm y EV:
Potencial redox en mV).
CONCLUSIONES:
El Control de Calidad químico y microbiológico son
herramientas preventivas y fundamentales en el vino
del Siglo XXI.
Los defectos sensoriales hacen que los vinos sean
iguales y no diferenciables. Para poder disfrutar de las
virtudes de un vino, es necesario evitar los defectos.
El consumidor habitual de vino es capaz de discernir
entre vinos “buenos” y “malos”, castigando a estos
últimos con la no adquisición.
La viticultura y enología, como prácticas culturales
muy tradicionalistas, se disfrutan más cuando la
tecnología es un recurso de apoyo y control.
LosUnivers
aromas
y el olfato son
idad de la Rioja
causa y efecto que nos permiten
conocer el medio donde nos
desenvolvemos. El viñedo
forma parte del paisaje y
acumula en su fruto miles de
precursores que despiertan
cuando es vino, convirtiéndose
en uno de los perfumes mas
complejos y agradables del
mundo. Consumiendo vinos
nos convertimos en parte del
paisaje y lo hacemos nuestro…
″LA TECNOLOGÍA ÚTIL ES AQUELLA QUE ESTÁ AL ALCANCE DE
TODOS″
Henry Ford
15

Excell Contaminantes Qcos y Bcos ENOFORUM Montpellier 2016

Transcripción

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