Cerebral metabolic rate of oxygen and amplitude-integrated

Cerebral metabolic rate of oxygen and amplitude-integrated

Modelo de asfixia perinatal en cerdos recién nacidos
Curso CHEA
“Animal de experimentación como reactivo biológico en
investigación,
diagnóstico y control de fármacos”
Depto de Neonatología, Hospital de Clínicas, Facultad de Medicina
Dra. Fernanda Blasina, [email protected]
Causas de mortalidad neonatal
Birth Asphyxia
29%
Source: WHO 2001 estimates (based on
data collected around 1999)
Infection
Complications
of Prematurity
32%
24%
Other
5%
Congenital
Anomalies
10%
Asfixia perinatal en países desarrollados:
-10% de los recién nacidos sufren asfixia leve a moderada
-1% sufre asfixia severa
 Incidencia de 2 -4 por 1000 RN de término.
 Mortalidad de 20 – 50% en el periodo neonatal
 25% de los que sobreviven presentan secuelas neurológicas
(retardo mental, parálisis cerebral, epilepsia, trastornos del
aprendizaje).
Review Hypoxia-ischemia in the inmature brain. Susan J. Vannucci and Henrik Hagberg. April 2004
 CHPR, 2005 la prevalencia fue de 14,5%.
 En ese año fue la cuarta causa de mortalidad infantil y
neonatal.
Daño hipóxico isquémico del recién nacido
Incidencia de muerte o daño neurológico severo: 2-3/1000 nac. vivos
en países desarrollados. Aumenta en países en vías de desarrollo
ENCEFALOPATÍA
MUERTE
Retraso del desarrollo
Parálisis cerebral
TERAPIAS INEFICACES
Gunn and Gluckman, CLINICAL OBSTETRICS AND GYNECOLOGY
2005,Volume 50, Number 3, 636–651
Robertson et al, 2012
Susceptibilidad cerebro inmaduro
• Aumento sensibilidad a excitotoxicidad.
• Expresión máxima de receptores.
• Incompleta maduración de mecanismos
inhibidores.
• Disminución de proteínas de unión al Ca+.
• Aumento sensibilidad radicales libres
Susceptibilidad cerebro inmaduro
• Susceptibilidad oligodendrocitos en
desarrollo.
• Estado hiperexcitable e hipermetabólico.
• Pobre capacidad vasodilatadora en tejido
nervioso.
Asfixia perinatal
Redistribución FSC
Aumneto PA
Hipoxia Hipercpnia
Acidosis
Aumento de FSC
Pérdida
Autorregulación
Cae
PA
Hemorragia
FSC
Cae
Lesión neuronal
primaria
Ventana
terapéutica
(horas)
Lesión neuronal
secundaria
Animal
models
Acute studies
n (%)
Chronic
studies n (%)
Total reviwed
Non-human
primate
14 (48)
15 (52)
29
Piglet
61(90)
7(10)
68
Fetal sheep
and newborn
lamb
54(87)
8(13)
62
Rodent
31(38)
51(62)
82
Dog
30 (100)
0
30
Others
17(81)
4(19)
21
TOTAL
Roohey et al, 1997
ACUTE STUDIES
Models (n)
Metabolic n(%)
Clinical n (%)
Pathology n(%)
Non-H Primate
(14)
10 (34)
4(14)
6(20)
Piglet (61)
61(100)
2(3)
1(2)
Sheep (54)
51(94)
11(20)
4(7)
Rodent (31)
28(90)
4(13)
4(13)
Roohey et al, 1997
Anestésicos?
Sistémicos: Ketamina, Propofol
Inhalatorios:isofluorano, halotano, enfluorano
Considerar farmaconcinetica en cada especie y el efecto
sobre parámetros que se vayan a evaluar a nivel del
sistema nervioso central (ej: electroencefalograma).
Método de hipoxia-isquemia
asfixia
Primates 14
10
Cerditos 61
31
Oveja 54
42
Roedores 31
15
Perros 17
isquemia
2
17
0
1
Duración?
Tracey et al, 2006
EDAD???
Neonatal
Piglet: 3 de mediana
(0-30)
Fetal
Roohey et al, 1997
TERM
HUMAN
newborn
GRADO de DESARROLLO ENCEFÄLICO????
Clancy et al, 2001
Predicen 95 eventos neurogenéticos en 9 especies
diferentes
Factores que modulan severidad del daño
Glicemia
Temperatura
Ginsberg et al, 1989
DIFERENCIAS ENTRE GÉNERO MASCULINO O FERMENINO??
Dev Med Child Neurol. 2007 Jan;49(1):74-8. Links
Sex and the pathogenesis of cerebral palsy.

Johnston MV,

Hagberg H.
Kennedy Krieger Institute and the Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore,
Maryland, USA. [email protected]
Cerebral palsy (CP) and related developmental disorders are more common in males than in
females, but the reasons for this disparity are uncertain. Males born very preterm also
appear to be more vulnerable to white matter injury and intraventricular hemorrhage than
females. Experimental studies in adult animals and data from adult patients with stroke
indicate that sex hormones such as estrogens provide protection against hypoxic-ischemic
injury, and the neonatal brain is also influenced by these hormones. However, hormonal
influences on the fetus and neonates are substantially different from those on adults. Recent
data from neonatal rodents subjected to hypoxia-ischemia also demonstrate differences
between males and females. Knockout of the gene for poly (ADP-ribose) polymerase (PARP1), a major step in the cascade of injury, protected male but not female mouse pups from
hypoxic-ischemic injury. Other reports demonstrated major differences between male and
female neurons grown separately in cell culture, suggesting that sex differences in the fetal
or neonatal period result from intrinsic differences in cell death pathways. This new
information indicates that there are important neurobiological differences between males and
females with respect to their response to brain injuries. This information is relevant to
understanding the pathogenesis of CP as well as to the design of future clinical trials of
Modelo de asfixia perinatal en cerdos recién nacidos
Por qué cerdos?
-Similitud anatómica, fisiológica y genética con
seres humanos (K.N. Kuzmuk and L.B. Schook, 2011)
-Tecnología utilizada a nivel clínico es útil en
este modelo.
IMPORTANCIA DE CONTAR CON ÁREA
DE INVESTICACIÓN ADJUNTA AL ÁREA
ASISTENCIAL CLÍNICA: oportunidad de
medicina traslacional

Reproducción de situaciones clínicas.

Generación de situaciones que reproducen
patologías en forma experimental.

Desarrollo de modelos animales diversos.

Entrenamiento y manejo de situaciones
complejas
Laboratorio
METODOLOGÍA
 Cerdos recién nacidos, 1500 - 2000 g, menores
de 2 días, proveniente de granja local.
 Ketamina 20 mg/k/dose I/M
 Termocuna y vía venosa periférica
 Aporte de fluídos con suero glucosado al 5% (70
ml/k/día)
 Anestesia intravenosa total con midazolam +
ketamina + fentanyl
 Electrocardiografía,
pulsioximetría,
temperatura.
 Vía aérea por
traqueostomía, tubo
endotraqueal de
tamaño adecuado.
 Cateterización de
arteria femoral para
medida de la presión
arterial.
 Catetherización de la
arteria pulmonar por
medio de
toracotomía para su
monitorización
invasiva.
 Estabilización
hemodinámica y
metabólica
 Tiempo de
preparación total 1
hora.
Monitor:
* Electrocardiograma
*Frecuencia cardiaca
*Presión arterial sistémica
*Presión arterial pulmonar
*Saturación de oxígeno
Data digitalization
ECG
SatO2
SAP
PAP
Monitoreo de Función Cerebrl (MFC)
MFC o electroencefalograma de amplitud integrada
Patrones de MFC
Normal: Lim sup> 10 mcv. Lim inf > 5 mcv. Ciclos de actividad
normal.
Moderado: Lim sup> 10 mcv. Lim inf< 5 mcv.
Severo: Lim sup < 10 mcv. Lim inf < 5 mcv.
Pediatrics 1999;103;1263-1271
OBJETIVOS
•Desarrollo de un modelo de asfixia perinatal controlado
por la tolerancia fisiológica individual.
•Estudiar la respuesta hemodinámica, electroencefálica,
equilibrio ácido-base y variables hematimétricas
durante las primeras horas.
•Evaluar la actividad mitocondrial, anatomía patológica,
integridad de proteínas, ADN y ARN encefálicas.
Generación de hipoxia en modelo experimental:
-Se mantiene FiO2 de 0,08 durante un período que permita al
menos 17 minutos de MFC por debajo de 7uV, FC por encima de
80lpm y presión arterial media por encima de 20mmHg.
-Al caer la hemodinamia hasta los umbrales indicados reanimación
con FiO2 1 por 30 minutos, luego FiO2 0,21 según tolerancia
-FC se eleva en respuesta a la hipoxia y desciende cuando la
reserva miocárdica se limita, muestra estabilidad luego de la
reanimación.
-Posibilidad
nanosomal
de
evaluar
terapias
neuroprotectoras:
quercetina
Modelo de Hipoxia Neonatal
FiO2 8%
Parámetros críticos para reanimación: MFC, PAM, FC
Tiempo 0
Tiempo 1
Tiempo 2
Tiempo 3
M
F
C
10 uV
Quercetina
7 uV
5 uV
0
1
2
Tiempo (horas)
Gasometrías cada 30 minutos
Gasometrías cada 10 minutos
09/12/10
21/12/10
23/12/10
30/12/10
26/10/10
11/11/10
ECG
SatO2
Presión art. sistémica
Monitorización de presión arterial pulmonar
Presión arterial sistémica, frecuencia cardiaca, Presión art. pulmonar
Gasto cardiaco, saturación, gasometría
QUERCETIN 25mg/kg
1/10/08
Capacidad neuroprotectora in vivo en cerdos recién nacidos ante la hipoxia
Evaluación
•Hemodinamia sistémica y pulmonar
•Equilibrio ácido base y metabolismo
•Encefálico: monitoreo de función cerebral
•Imagenología (Resonancia, PET)
•FiO2 8% hasta descenso de MFC debajo de 7uV durante 40 min con ligadura carotídea
•Presión arterial sistémica degajo de 20mmHg o
•frecuencia cardiaca debajo de 80 cpm
Evaluación del daño provocado por la hipoxia y uso de
agentes neuroprotectores.
A nivel sistémico
Equilibrio ácido base y metabolismo en sangre
Parámetros ventilatorios durante el experimento y variación de los
mismos según estado del animal
Estabilidad hemodinámica y necesidad de aporte inotrópico
A nivel cerebral
MFC durante todo el experimento. Se revierte daño?
Eutanasia con KCl:
Evaluación de perfil genético: ADN, ARN y proteínas
Evaluación anatomopatológica (en cerdos de 3 días)
Evaluación de actividad mitocondrial por reducción de sales de tetrazolio
Se les realizará un primer estudio de imagenología funcional cerebral PET a través
de la administración de [18F] FDG con el fin de determinar el grado de captación de
glucosa de las distintas regiones del SNC y de realizar estudios comparativos entre
los distintos grupos pre y post hipoxia.
Luego de realizada la hipoxia en estos cerdos, se vigilará la recuperación anestésica
y una vez extubados y con ventilación espontánea serán trasladados al bioterio de
Facultad de Medicina o al HC según su condición.
En este grupo de animales, tras 72 hs de sobrevida, se realizará evaluación
metabólica (glicemia), comportamental y monitoreo de función cerebral diarios y a las
72 hs se realizará una resonancia nuclear magnética y un segundo estudio PET con
[18F] FDG a los efectos de valorar la captación del glucosa por el tejido nervioso al
cabo de tres días de la hipoxia, con o sin tratamiento.
Duración hipoxia y posthipoxia
HIPOXIA Y QUERCETINA 20
mgkg
HIPOXIA Y QUERCETINA 10
mg/kg
HIPOXIA
0:00:00
1:12:00
2:24:00
3:36:00
duración hipoxia
4:48:00
6:00:00
período posthipoxia
7:12:00
8:24:00
9:36:00
FiO2 durante Hipoxia y quercetina, 8 hs
1
0,8
Hipoxia
Hipoxia y Quercetina 10 mgkg
Hipoxia y Quercetina 20 mgkg
0,6
0,4
FiO2
0,2
Saturación de O2 de Hb
(%)
0
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
500
400
300
200
100
pO2
0
Presión parcial de O2 durante Hipoxia y
quercetina, 8 hs Hipoxia
Hipoxia y Quercetina 10 mgkg
Hipoxia y Quercetina 20 mgkg
Hipoxia+Quercetina 10 mg/kg
Hipoxia y Quercetina 20 mg/kg
Hipoxia
PAS sistólica (mmHg)
120
100
80
60
40
20
0
Presión Arterial Sistémica sistólica
Hipoxia
Hipoxia y Quercetina 10 mgkg
Hipoxia y Quercetina 20 mg/kg
Temperatura
Hipoxia y Quercetina 10 mgkg
Hipoxia
Hipoxia y Quercetina 20 mg/kg
temperatura (ºC)
40,5
40
39,5
39
38,5
38
180,000
160,000
140,000
120,000
100,000
80,000
60,000
40,000
20,000
0,000
Glicemia
Hipoxia y Quercetina
10 mgkg
Hipoxia
Hipoxia y Quercetina
20 mg/kg
30
Amplitud integrated EEG (uV)
25
20
15
10
5
0
-5
Cerebral function monitor post reanimatio
(superior margin)
hypoxia
-Se incuba un hemisferio cerebral por 30 minutos a 37ºC en solución
conteniendo TTC
- Luego de mantiene 12hs hasta pasaje a formol para fotografía y
posterior medida del daño
Brains after hypoxia
2hs survival
12 hs survival
Controls
Sham
Absolute
Muchas gracias por su
atención!!