Lysinibacillus sphaericus - Revista Hipótesis

Transcripción

MOSQUITOS,
MINERÍA Y
PETRÓLEO.
LYSINIBACILLUS SPHAERICUS:
LA VERSATILIDAD DE UN MICROORGANISMO EN
BENEFICIO DEL AMBIENTE Y LA SALUD PÚBLICA
Jenny Dussán Garzón, Lucía C. Lozano Ardila,
Tito D. Peña Montenegro, Vivian A. Bojacá
http://bancaynegocios.com/wp-content/uploads/2013/07/000_Hkg8843310.jpg
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Culex_sp._Tanzania.jpg
Fotografía de Alejandro Arango, http://www.flickr.com/photos/alejoarango/4991333208/
Mosquitos, minería y petróleo.
Lysinibacillus sphaericus: la versatilidad
de un microorganismo en beneficio del
ambiente y la salud pública
MÁS DE DOS DÉCADAS DE ESTUDIO
Quizás lo más maravilloso cuando nos acercamos al conocimiento del mundo microscópico es entender cómo organismos con un tamaño promedio de 1 µm y un cromosoma casi mil veces más
pequeño que el del hombre tienen una capacidad metabólica incalculable que es funcional según el
ambiente donde se encuentre.
Un ejemplo sorprendente es la bacteria Lysinibacillus sphaericus, un microorganismo que durante
más de veinte años ha sido el actor central de los proyectos desarrollados por profesores y varias generaciones de estudiantes (microbiólogos, biólogos, ingenieros químicos, ambientales, etc.) vinculados al Centro de Investigaciones Microbiológicas (CIMIC). El entendimiento de por qué este microorganismo es tan particular y versátil nos ha posibilitado responder algunos interrogantes, como por
qué tiene capacidad para matar larvas de mosquitos que son vectores de enfermedades tropicales
como el dengue, qué características sobresalientes le permiten desarrollar una actividad fisiológica
Jenny Dussán
Garzón
Ph. D., profesora asociada
del Departamento de
Ciencias Biológicas de la
Universidad de los Andes.
[email protected]
Lucía C. Lozano
Ardila
Ph. D., investigadora del
Centro de Investigaciones
Microbiológicas de la
Universidad de los Andes
[email protected]
Tito D. Peña Montenegro
M. Sc., investigador del
Centro de Investigaciones
Microbiológicas de la
[email protected]
Vivian A. Bojacá
M. Sc., asistente graduada
del Departamento de
Ingeniería Civil y Ambiental de la
[email protected]
Figura 1. Microscopia electrónica de esporas de Lysinibacillus sphaericus.
Fuente: Klein D, Uspensky I, Braun S. Tightly Bound Binary Toxin in the Cell Wall of Bacillus sphaericus. Applied and Environmental Microbiology 2002;
68(7): 3300-3307, http://aem.asm.org/content/68/7/3300/F5.large.jpg. Se publica con autorización del American Society for Microbiology Journals.
42 Hipótesis, Apuntes científicos uniandinos, número especial, 2013
Figura 2. Microscopia electrónica de célula vegetativa de Lysinibacillus sphaericus.
Fuente: Jenny Dussán Garzón, CIMIC. En [8].
Figura 3.
Microscopia electrónica de la espora madura de Lysinibacillus sphaericus.
Fuente: Jenny Dussán Garzón, CIMIC. En [8].
específica cuando se encuentra en suelos o cuerpos de agua
contaminados con compuestos provenientes de la extracción de
petróleo, qué lo potencia para acumular en su superficie metales
como el plomo, cromo, uranio etc., por qué puede tener un papel
dual —matar larvas de mosquitos y remediar ambientes—.
formulación mixta de dos bacterias: Bacillus thuringiensis y
Bacillus sphaericus [4]. En el año 2006 el grupo de Pollmann
y colaboradores [5] lo aisló en una mina de uranio y encontró
uranio acumulado en una proteína adherida a su pared celular,
hoy conocida como capa-S.
En la década de los años noventa, pensando que Colombia es
un país megadiverso en flora y fauna, y que de la misma forma seguramente lo era en la microbiota presente en ambientes
acuáticos y terrestres, decidimos realizar un muestreo en varias
partes del territorio colombiano. La gran diversidad encontrada
nos llevó a iniciar un viaje fascinante por el conocimiento, desde
el nivel microscópico hasta el molecular, de uno de los microorganismos más interesantes y versátiles del mundo microbiano.
DÉCADA DE LOS AÑOS NOVENTA
¿Quién es Lysinibacillus sphaericus?
Lysinibacillus sphaericus (Ls), conocido antes como Bacillus
sphaericus, fue aislado en 1904 por Neide y Meyer en ambientes acuáticos [1]. Es un microorganismo que tiene la capacidad
de formar una estructura especializada conocida como espora,
que tienen una forma circular, en posición terminal del esporangio, y vista por el microscopio tiene forma similar a una raqueta
(figura 1 y 2) [2, 8].
En 2007 se propuso transferirlo al nuevo género Lysinibacillus,
por presentar lisina y asparagina en el peptidoglicano de la pared celular [3]. Su importancia a nivel mundial, y por lo cual es
ampliamente conocido, quedó asentada en los años ochenta,
cuando la Organización Mundial de la Salud (OMS) aprobó el
control biológico de mosquitos en países tropicales con una
L. sphaericus y su papel en el control de
mosquitos transmisores de enfermedades tropicales
¿Por qué L. sphaericus mata larvas de mosquitos que transmiten enfermedades tropicales como el dengue?
Una de las características más apasionantes que tienen las
bacterias que pertenecen al grupo conocido comúnmente como
bacilos es la de formar una espora. Pero ¿qué es una espora,
por qué la forman y qué ventaja le confiere a este tipo de microorganismos?
La vida del mundo microbiano se basa en utilizar los nutrientes
del medio que habitan estos microorganismos para metabolizarlos, y en utilizar la energía y los compuestos obtenidos para
dividirse, generar más células y continuar su crecimiento. Los
bacilos tienen en su genoma información genética para responder según el ambiente en que se encuentre. Por ello pueden
detener el crecimiento y la división, y comenzar un proceso de
diferenciación celular en el que forman una estructura especializada conocida como espora (figura 3) [8]. Particularmente,
L. sphaericus, durante el proceso de esporulación, tiene una
ventaja especial: parte de su metabolismo puede sintetizar dos
Universidad de los Andes, Facultad de Ciencias 43
toxinas, conocidas como BinA de 42 kDa y BinB de 51 kDa, que
conforman el cristal paraesporal [6] y que tienen la capacidad
de matar larvas de mosquitos de los géneros Anopheles, Aedes
y Culex, vectores de enfermedades como la malaria, el dengue,
la filariasis, etc. (figura 4). Estas enfermedades, endémicas en
países tropicales, se propagan por medio de los mosquitos, y
el ciclo se ve favorecido por las condiciones climáticas, lo cual
genera un problema de salud pública [7]. No es de extrañar,
entonces, que a comienzos de los noventa iniciáramos un muestreo por Colombia en busca del L. sphaericus, con el objetivo de
encontrar cepas nativas con actividad entomopatógena.
1, Mtx-2 y Mtx-3, activas también contra mosquitos cuando la
bacteria se encuentra en estado vegetativo y no en espora [9].
Los resultados de su gran capacidad de ejercer control biológico
han sido aún más interesantes porque en los proyectos actuales
se ha podido relacionar su actividad toxigénica con la de otra
proteína, conocida como capa-S [10]. Entonces, es un hecho
que la gran diversidad y la alta actividad entomopatógena del L.
sphaericus podría ser utilizada en formulaciones para el control
integrado de plagas de mosquitos presentes en regiones donde
año tras año se reportan brotes de dengue, una enfermedad que
merece toda la prevención y atención.
En regiones como la zona del Pacífico, del Atlántico, los Llanos Orientales y el altiplano cundiboyacense realizamos más de
quinientos aislamientos, a partir de los cuales seleccionamos
veintidós cepas con características típicas de Ls y activas contra
larvas de tercer instar de Culex quinquefasciatus, entre las que
producían una mortalidad del 100% en 24 horas, comparable a
la de la cepa de referencia 2362 del L. sphaericus de la OMS
(figura 5) [8].
PRIMERA DÉCADA DEL SIGLO XXI
Con estos resultados iniciamos la línea de investigación de L.
sphaericus en control biológico de Culex quinquefasciatus. Los
estudios a nivel fisiológico, bioquímico y molecular de las veintidós cepas determinaron que teníamos Ls con alta, media y baja
actividad entomopatógena. Se evidenció la actividad y codificación genética de la toxina binaria, y en algunas de las cepas
estudiadas encontramos otras proteínas toxígenas, como la Mtx-
Figura 4. Adulto de Culex quinquefasciatus.
Fuente: http://phil.cdc.gov/PHIL_Images/02122002/00025/PHIL_1771.tif
L. sphaericus y su impacto en la minería:
biorremediación de metales
¿Por qué este microorganismo puede acumular en su superficie
metales como el plomo, cromo y uranio?
La remoción de metales constituye uno de los mayores retos de
descontaminación de ambientes a nivel mundial, y, por supuesto, a nivel nacional, debido a que entre las fuentes de contaminación se encuentran los procesos de extracción de recursos
naturales como el carbón, los minerales y el petróleo. También
se ha reportado contaminación por procesos industriales como
la fabricación de baterías, pinturas, revestimientos, soldaduras y
curtiembres, además de productos de uso agropecuario, como
Figura 5. Larva de Culex quinquefasciatus.
Fuente: http://phil.cdc.gov/PHIL_Images/12554/12554.tif
pesticidas, fertilizantes y aditivos de alimentación animal [10].
Entre 2003 y 2007, en diferentes sitios del mundo dedicados a
la minería, se aislaron bacterias cuya clasificación correspondía
a L. sphaericus. Resultó muy interesante determinar que en la
parte externa de su pared tenían metales acumulados en una
cubierta hexagonal que recuerda una cubeta llena de huevos (figura 6). Los trabajos de Pollmann con la cepa del L. sphaericus
JG-A12 mostraron cómo este hallazgo podría derivar en alternativas para el tratamiento in situ de aguas de minas de uranio
[11]. Los estudios bioquímicos y moleculares demostraron que
la bioadsorción se debía a la presencia de una proteína conocida
como capa-S, que conforma nanoclústers en los que se pueden
acumular diferentes tipos de metales [11]. Otro mecanismo ampliamente descrito, relativo a un grupo de microorganismos muy
diferentes de los bacilos, es la presencia de bombas de eflujo
que permiten la entrada de compuestos, antibióticos y otros elementos como metales a la célula [12].
Así pues, necesariamente teníamos que responder tres preguntas: ¿Los aislamientos de L. sphaericus que previamente
habíamos estudiado en control de mosquitos también tenían la
capacidad de acumular metales como el plomo, cromo, arsénico
y mercurio? ¿La proteína capa-S, responsable de la bioadsorción/unión de metales en estos microorganismos se encontraba
presente? ¿Pueden tener bombas de eflujo para la entrada y
remoción de metales por acumulación interna? Entonces, a comienzos del año 2000 iniciamos una nueva línea de investigación centrada en L. sphaericus y la biorremediación de metales.
Decidimos trabajar con lodos aceitosos provenientes de los procesos de extracción del petróleo, que tienen diferentes metales
asociados; por lo tanto, estos residuos se convierten en pasivos
ambientales de gran impacto en las regiones de los Llanos y la
Orinoquia colombianos. La capacidad de bioadsorción de arsénico, cobalto y cromo fue evidente en varias de las cepas estudiadas. De igual forma, aislamientos con alta actividad toxigénica
contra larvas de Culex quinquefasciatus mostraron tolerancia a
concentraciones mayores de 10.000 ppm de arsenato, de 750
ppm de plomo y de 200 ppm de cromo hexavalente [13]. En
todos los aislamientos estudiados se determinó la presencia de
la proteína capa-S (> 100KDa), con una alta expresión durante
la fase vegetativa de crecimiento (no en espora) (figura 7) [14].
Adicionalmente se encontró níquel en extractos celulares y plomo atrapado en el periplasma y la membrana celular (resultados
actuales) (figura 8 y 9) [12, 15]. De manera que es probable
que este microorganismo tenga mecanismos dependientes de
bombas de eflujo también para acumular metales. Estos resultados en remoción de metales mostraron el potencial de este microorganismo y su aplicación en un futuro cercano en procesos
de biorremediación en campo impactados por la extracción de
recursos naturales como petróleo y minería.
Figura 6. Vista tridimensional de una capa recristalizada de proteínas Capa–S de Lysinibacillus sphaericus por microscopía de fuerza atómica.
Fuente: Tomado de Progress in Organic Coatings 47, Sleytr et al. 2003.
1
2
3
4
5
M
250 kDA
148 kDA
98 kDA
64 kDA
50 kDA
36 kDA
Figura 7. Electroforesis de proteínas extraidas de cultivos en fase vegetativa de Lysinibacillus sphaericus. La banda de alto peso molecular (mayor a 148 kDa) corresponde a proteínas Capa-S.
Fuente: Fotografía de Lucía C Lozano Ardila, CIMIC. En [10].
DÉCADA DE 2010
L. sphaericus y la era de las ómicas:
genómica, transcriptómica filogenómica y más… petróleo
En este fascinante viaje por el conocimiento y entendimiento
de la versatilidad metabólica del L. sphaericus necesariamente teníamos que detenernos y preguntarnos: ¿Cómo podemos
profundizar más en el conocimiento de este microorganismo y
entender su relación con los aislamientos de otras partes del
mundo? Naturalmente, la respuesta nos condujo a la secuenciación del genoma de aislamientos, que mostraron los resultados
más interesantes, menos similares al comportamiento esperado, con mayor versatilidad en cuanto a remoción de metales,
al tipo y número de metales absorbidos y/o acumulados y a la
actividad entomotoxigénica contra mosquitos. Del género Lysinibacillus se encuentran secuenciados hasta el momento cinco
genomas, uno de los cuales corresponde a L. sphaericus, cepa
C3-41, patógena para larvas de mosquitos comercializada principalmente en China [16]; Lysinibacillus fusiformis, cepas ZC1,
que presenta la capacidad de reducir cromo hexavalente [17], y
cepa ZB2; Lysinibacillus massiliensis 4400831 y Lysinibacillus
boronitolerans F1182 [18].
Así, en el inicio de esta tercera década de estudio del L. sphaericus nos hemos concentrado en el análisis de las secuencias
de los genomas de dos aislamientos nativos. La cepa CBAM5,
aislada a partir de muestras de lodos corte-base-aceite provenientes de la exploración petrolera en la región del Casanare
[19]. En la secuencia de su genoma se determinó la presencia
de genes que codifican para toxinas con actividad larvicida en
mosquitos, genes relacionados con la proteína de capa-S, así
como genes involucrados en la resistencia a arsénico, cromo
y plomo [20].
En el segundo aislamiento, L. sphaericus OT4b.31, proveniente
de larvas de coleóptero encontradas en la sabana de Bogotá,
identificamos diferentes regiones con operones implicados en
la bioacumulación de Cd, Zn, Co, Cu, Ni, Cr y As, al igual que
secuencias codificantes y homólogas para la proteína de la
capa-S, genes implicados en la degradación de hidrocarburos
aromáticos como el tolueno y el fenol, y ningún gen compartido
codificante para la toxicidad de mosquitos (figura 10) [21].
¿Qué significado, en términos de aplicación ambiental y salud
pública, aporta la secuenciación de genomas? Pues bien, el
hecho de tener secuenciados los genomas de varias cepas
del género Lysinibacillus nos permitirá, desde el conocimiento
básico, continuar relacionando las actividades biológicas con
los genes que las codifican, y así podremos dirigir los estudios
de transcriptomas para la expresión de genes específicos de
interés en condiciones ambientales con miras a la remoción de
metales y a la actividad entomopatógena. Por otra parte, con
los genomas secuenciados trataremos de entender y acercanos más a la clasificación filogenética de este grupo de microorganismos que siempre ha sido controvertida y modificada
[22]. La utilización de la filogenómica es importante porque se
presenta como una nueva alternativa en la que los genes con
anotación funcional presentes en los genomas secuenciados
permiten realizar la comparación y clasificación de organismos
de forma más discriminada [12]. Los dos genomas secuenciados mostraron un plus adicional en L. sphaericus: la capacidad
de degradar compuestos aromáticos y saturados. De manera
que con algunos de los aislamientos de mayor interés extraídos
de los lodos aceitosos grado API medio y liviano provenientes
de la región del Casanare iniciamos una evaluación preliminar.
Los resultados obtenidos hasta el momento han mostrado que
la anotación en los genomas de las cepas CBAM5 y OT4b.31
es funcional y se expresa exitosamente en términos de de-
120 %
Concentración relativa
100 %
80 %
60 %
40 %
20 %
0 %
CBAM5
Citoplasma
Figura 8.
Microscopía electrónica de barrido de células vegetativas de Lysinibacillus sphaericus cepa
OT4b.31.
Fuente: Fotografía de Tito D Peña Montenegro, CIMIC. En [21].
3(III)7
Ot4b31
Membrana
Periplasma
Figura 9.
Absorción de plomo en periplasma, membrana celular y citoplasma de células vegetativas de
Lysinibacillus sphaericus cepa OT4b.31.
Fuente: Imagen de Vivian Andrea Bojacá, CIMIC. En [15].
Figura 10. Mapa genómico de Lysinibacillus sphaericus cepa OT4b.31. Desde fuera hacia el centro: scaffolds orientados y ordenados cromosomales (azul y rojo) y extracromosomales (naranja y
negro), genes anotados en cadena positiva, genes anotados en cadena negativa, genes de RNA, contenido de GC y GC skew.
Fuente: Imagen de Tito D Peña Montenegro, CIMIC. En [21].
gradación de lodos aceitosos provenientes de las prácticas de
explotación del petróleo.
Importancia de la riqueza presente en Colombia
de L. sphaericus
Luego de más de dos décadas de estudio de la bacteria L.
sphaericus podemos afirmar que Colombia posee una riqueza
de valor incalculable de este microorganismo. Ubicados en el
trópico, donde la presencia de mosquitos vectores de enfermedades como el dengue es un problema de salud pública que
merece atención, L. sphaericus es una excelente opción para el
manejo de plagas en épocas de invierno, pues está ampliamente
documentado que las cepas nativas pueden ejercer control biológico al matar larvas de Culex quinquefasciatus por tres mecanismos: 1. Producción de la toxina binaria (BinA, BinB) durante
la esporulación; 2. Producción de toxinas Mtx-1, Mtx-2 y Mtx-3
por la célula vegetativa, y 3. Por la proteína capa-S, asociada a
la pared celular durante el crecimiento exponencial.
En el campo de la biorremediación, la aplicación del L. sphaericus es fundamental y prioritaria. Colombia cuenta con una gran
riqueza de recursos naturales en carbón, minería y petróleo. Sin
embargo, las prácticas de explotación de estos recursos generan altísimos impactos ambientales por los residuos sólidos y/o
líquidos que quedan como pasivos en el suelo o que terminan
contaminando aguas y, en consecuencia, generando un problema de salud pública y efectos negativos en la flora, fauna y la microbiota de la región afectada. En el sector minero, por ejemplo,
para la extracción de metales como el oro se generan residuos
con altas concentraciones de otros metales sin valor comercial,
pero sumamente tóxicos, como el arsénico, el cromo y el plomo,
que son separados a su vez con cianuro o mercurio para obtener
el oro puro, etc. Estos elementos nocivos son comparables con
los lodos aceitosos provenientes de la explotación del petróleo,
que vienen igualmente acompañados con alta concentración de
metales muy tóxicos, como el bario, el cadmio y el plomo. De
manera que la implementación de la capacidad dual que tiene L. sphaericus en la remoción por adsorción y/o acumulación
de diferentes metales por los dos mecanismos documentados
—bombas de eflujo o por adsorción a la proteína capa-S—,
contribuiría inmensamente al desarrollo de tecnologías limpias,
amigables con el ambiente, y se reflejaría en el crecimiento del
sector minero debido a la innovación de tecnologías dirigidas
a la captura de metales de interés económico en cuerpos de
agua, así como a las prácticas generales de biorremediación de
pasivos ambientales provenientes de la extracción del petróleo.
Nota
El conocimiento año tras año ha sido enriquecedor gracias a
la tesis doctoral de Lucía C. Lozano Ardila (2012), las tesis de
maestría de Diana R. Andrade Linares (1997), Lucía C. Lozano
Ardila (1998), Sandra del Pilar Vanegas Moyano (2001), Geidy X.
Ortega Trujillo (2004), Julián E. Zamora Prieto (2006), Silvia C.
Rivera Rodríguez (2007), Lina Velásquez Brun (2009), Vivian A.
Bojacá Bautista (2013), Tito D. Peña Montenegro (2013), Javier
E. Vargas Calle (en curso), Lina E. Manchola Muñoz (en curso),
Darío A. Rangel Shaw (en curso) y los trabajos de pregrado de
Silvia C. Rivera Rodríguez (2005), Ruth Ortiz Castro (2007), Lina
Velásquez Brun (2008), Vivian A. Bojacá Bautista (2010) y Javier
E. Vargas Calle (2012). •
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