reacción en cadena de la polimerasa

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IBT-UNAM
Métodos físico-químicos en
Biotecnología (2006-II)
Presentado a:
Dr. Roberto P. Stock Silberman
Rodríguez M & Rodríguez W
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INDICE
CAPITULO 1 INTRODUCCIÓN..................................................................................3
CAPITULO 2 RESEÑA HISTÓRICA ..........................................................................4
CAPÍTULO 3 PCR EN TIEMPO REAL ......................................................................7
3.1 DEFINICIÓN ............................................................................................................7
3.2 EL ENSAYO..............................................................................................................7
3.3 PRINCIPIO QUÍMICO DEL ENSAYO ..............................................................................8
3.3.1 Química no específica .....................................................................................9
3.3.2 Primers marcados con fluoróforos ................................................................12
3.4 INSTRUMENTACIÓN PARA EL PCR EN TIEMPO REAL .................................................19
3.5 ANÁLISIS DE LOS DATOS .........................................................................................23
3.4.1 Ensayos de cuantificación absoluta ................................................................26
3.4.2 Ensayos de cuantificación relativa .................................................................26
3.6 ESTRATEGIAS DE NORMALIZACIÓN .........................................................................30
3.6.1 Cuantificación de ARN mensajero..................................................................31
CAPITULO 4 APLICACIONES DEL PCR EN TIEMPO REAL .............................36
4.1 VIROLOGÍA ...........................................................................................................36
4.2 MICROBIOLOGÍA CLÍNICA (COSTA, J. 2004) ............................................................37
4.3 INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA....................................................................................39
4.3.1 Validación de los resultados de microarreglos de DNA.................................40
4.3.2 Identificación de mutaciones .........................................................................40
4.4 ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS (GMO) (BUSTIN, 2005) ..................41
4.5 APLICACIONES FUTURAS Y PERSPECTIVAS (VALASEK ET AL., 2005) ........................41
CAPITULO 5 TRAMPAS DEL RT-PCR EN TIEMPO REAL.................................43
5.1. CALIDAD DEL ARN...............................................................................................43
5.2. DETECCIÓN NO ESPECÍFICA ....................................................................................44
5.3. DETECCIÓN ESPECÍFICA .........................................................................................45
5.4 LINEARIDAD DEL PASO DE REVERSOTRANSCRIPCIÓN ................................................46
5.5 ANÁLISIS DE LOS DATOS .........................................................................................48
5.6 EL NIVEL UMBRAL..................................................................................................50
CONCLUSIONES ........................................................................................................52
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................53
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Introducción
CAPITULO 1
INTRODUCCIÓN
En los últimos años, la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) ha
surgido como una metodología robusta y ampliamente utilizada en investigación biológica
ya que puede detectar y cuantificar cantidades muy pequeñas de secuencias específicas de
ácidos nucleicos. Como herramienta de investigación, la principal aplicación de esta
tecnología es la rápida y precisa valoración de cambios en la expresión de genes como
resultado de la fisiología, la fisiopatología o la evolución. Este método puede ser aplicado
a sistemas modelo para medir respuesta a estímulos de tipo experimental y para adentrarse
en los cambios potenciales a nivel proteico y funcional. De este modo, la fisiología puede
ser correlacionada con eventos moleculares para tener un mejor entendimiento de los
procesos biológicos.
En el campo del diagnóstico clínico de tipo molecular, el RT-PCR puede ser usado para
medir cargas virales o bacterianas, o en evaluación del estado de enfermedades como el
cáncer.
En la presente monografía se discuten los conceptos básicos de la técnica de PCR, la
química e instrumentación del RT-PCR y se incluyen aplicaciones presentes, desventajas
y perspectivas futuras para esta tecnología en las diferentes ramas de las ciencias
biomédicas y bioquímicas.
Esperamos que este documento sea una herramienta útil para los nuevos estudiantes y
curiosos que quieren obtener información básica de calidad y en idioma español acerca de
las tecnologías de punta para el desarrollo de procesos biológicos, bioquímicos y
biotecnológicos.
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Reseña Histórica
CAPITULO 2
RESEÑA HISTÓRICA
El concepto de producir muchas copias de una molécula específica de ADN mediante un
proceso cíclico utilizando una enzima ADN polimerasa y oligonucleótidos que
funcionaran como primers fue expuesto por primera vez en un artículo en 1971 por
Kleppe y sus colegas. En ese momento la demostración práctica de esta teoría no fue
posible debido a la dificultad y el costo de producción de los oligonucleótidos, el no
contar con polimerasas termoestables y la ausencia de termocicladores automáticos.
La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) fue llevada a cabo por Kary Mullis en 1983 (Saiki
et al., 1985; Mullis et al., 1987), razón por la que recibió el
Premio Nobel una década después. La gran utilidad de esta
técnica se difundió a principios de los ochenta por toda la
comunidad científica. Los nuevos equipos y las avanzadas
técnicas de secuenciación, así como los programas de
computación para la manipulación de datos que se fueron
sucediendo, permitieron el desarrollo de mejores ensayos
de PCR. La aparición de la Internet hizo posible el acceso
a bases de datos como GenBank, EMBL y DDBJ, las
Dr. Kary Mullis
cuales permitieron la comparación de secuencias en todo el
mundo. El uso de la Taq ADN polimerasa fue uno de los impulsos más importantes dados
a la tecnología de PCR (Saiki et al., 1988). Esta enzima fue incluso obtenida de forma
recombinante, con lo que se eliminaron funciones no deseadas de la enzima original. En
1990 ya se contaba con buffers de PCR, dNTPs, MgCl2 y Taq polimerasa de forma
comercial. El mejoramiento de los buffers incrementó considerablemente la actividad y la
estabilidad de las polimerasas.
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Reseña Histórica
A principios de los años noventa Higuchi y sus colaboradores del Roche Molecular
Systems y de Chiron (1992; 1993) desarrollaron una técnica de PCR en la cual incluyeron
el bromuro de etidio (EtBr) en el medio de reacción, la cual se llevó a cabo bajo la luz
ultravioleta. Desde el año 1966, Le Pecq y Paoletti reportaron que este agente intercalante
del ADN de doble cadena fluoresce bajo la luz UV. Esta propiedad fue aprovechada para
grabar la acumulación de ADN utilizando una videocámara. Esta sencilla reacción
combinada con la videografía permitió el nacimiento del PCR en tiempo real, el cual
combina la enorme sensibilidad de la técnica de PCR con la precisión que asegura el
monitoreo “in situ” de los productos generados por esta reacción a través del tiempo.
La primera compañía que desarrolló la instrumentación necesaria para llevar a cabo el
RT-PCR fue Applied Biosystems en el año 1996, y desde entonces otras compañías como
BioGene, Bioneer, Bio-Rad, entre otras han desarrollado nuevos equipos. Una parte
importante de estas máquinas se utilizan en investigación académica, y de acuerdo a un
estudio realizado en el año 2003, de 406 investigadores entrevistados, el 48% piensa
realizar RT-PCR en su futuro trabajo (Arlington, 2003). La figura 2.1 muestra el numero
de publicaciones en la base de datos Medline que contienen la palabra “real time” y
“PCR” en el título o en el resumen. Como vemos, ocurrió un incremento del 43% entre el
2003 y 2004, donde aparecieron 3522 publicaciones (Valasek et al., 2005). Estos datos
demuestran que la técnica de RT-PCR se perfila como uno de los métodos de vanguardia
en las ciencias biomédicas, fundamentalmente en el diagnóstico molecular y la fisiología.
Figura 2.1 Curva de utilizaciòn de la
técnica de PCR en tiempo real. Se
presenta el número de publicaciones
en la base de datos de Medline que
contienen las palabras Real-time y
PCR
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Reseña Histórica
¿Por qué el PCR en tiempo real?
Mediante la técnica de PCR es posible amplificar un segmento de ADN de manera
exponencial, ya que después de cada ciclo se duplica la cantidad de ADN que existe si la
reacción ocurre con máxima eficiencia. La realidad es que las reacciones de PCR alcanzan
un plateau o meseta debido al agotamiento de los reactantes luego de numerosos ciclos
(Wittwer et al., 1997a). Además, la autohibridación de los productos cada vez más
numerosos contribuye al efecto de meseta, por lo que se hace imposible calcular la
cantidad de ADN de partida midiendo la cantidad de producto final. Es esta característica
del PCR convencional la que impone la necesidad del PCR en tiempo real. Dado que la
reacción de PCR en sus inicios amplifica el ADN de manera eficiente, y existe una
correlación entre el ADN de partida y el ADN formado durante la fase exponencial, es
posible cuantificar la cantidad de ADN de partida.
La principal meta del RT-PCR es distinguir y cuantificar de manera específica una
secuencia de ácido nucleico en una muestra incluso cuando ésta se presenta en pequeñas
cantidades. Durante la amplificación, la velocidad en que se llega a un nivel determinado
de fluorescencia (umbral) correlaciona con la cantidad de ADN que tenemos al inicio.
Además, el producto final puede ser caracterizado si se somete a incrementos de
temperatura para determinar en qué momento la doble cadena se separa. Este punto de
fusión es una propiedad única que depende de la longitud y de la secuencia nucleotídica
del producto.
Otra de las ventajas de la técnica de PCR en tiempo real es la cuantificación de ARN. Esto
es posible gracias al uso de las reverso transcriptasas, enzimas que generan ADN
complementario (ADNc) a partir de un templado de ARN. Bajo condiciones apropiadas,
la cantidad de ADNc generado por reversotranscripción es proporcional al número de
moléculas de ARN presente en una muestra dada. Entonces este ADNc puede ser el
templado para una reacción de PCR en tiempo real, utilizando su sensibilidad y precisión
para determinar cambios en la expresión de genes. Esta técnica es conocida como RTPCR en tiempo real y se ha convertido en el método más popular para la cuantificación de
los niveles de ARN mensajero (Bustin et al., 2000). Todo esto demuestra que la técnica de
PCR en tiempo real permite cuantificar con alta precisión tanto los niveles de ADN como
los de ARN.
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PCR en tiempo real
CAPÍTULO 3
PCR EN TIEMPO REAL
3.1 Definición
La Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real, también conocida como Real
Time PCR (RT-PCR) muestra la capacidad de monitorear el progreso de la reacción de
PCR a medida que esta ocurre. Los datos son colectados a lo largo del proceso de PCR y
no al final como se realizaba antes. Este método revolucionó la forma en que se usaba la
técnica de PCR para cuantificación de ADN y ARN. El RT-PCR usa moléculas de un
reportero fluorescente para monitorear la amplificación de productos durante cada ciclo de
reacción. Esta técnica combina los pasos de amplificación de ADN y la detección en un
único ensayo y evita tener que preparar geles de electroforesis para detectar los productos
amplificados. Un análisis apropiado de los datos y/o de la química también permite
eliminar la necesidad de realizar pruebas de Southern Blot o secuenciación de ADN para
identificación de los amplicones. Su simplicidad, especificidad y sensibilidad junto con su
potencial como técnica en aplicaciones futuras y la evolución hacia nuevos conocimientos
de la química, además de la confiabilidad en la instrumentación y protocolos mejorados,
han hecho del RT-PCT una tecnología altamente competitiva para la detección de ADN y
ARN.
3.2 El ensayo
La tecnología del RT-PCR está basada en la detección de una señal fluorescente
producida proporcionalmente durante la amplificación del ADN blanco (Fig. 3.1). Antes
que revisar la cantidad de ADN blanco producido después de un número fijo de ciclos, las
pruebas de RT-PCR determinan el punto en el tiempo durante el proceso de ciclado
cuando se detecta por primera vez la amplificación de un producto de PCR. Este se
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PCR en tiempo real
determina identificando el número del ciclo en el cual la intensidad de la emisión del
reportero marcado se levanta sobre el ruido de fondo.
Desnaturalización
Primer
Sonda
Fluoresceína
Alineamiento del primer/ hibridización de sonda
Polimerasa
Hibridado
Extensión
Fig. 3.1 Representación esquemática de un ensayo de RT-PCR usando el método Taqman®
Este número del ciclo está referido como el ciclo umbral o “threshold cycle” (Ct). El Ct se
determina en la fase exponencial de la reacción de PCR y es inversamente proporcional al
número de copias del blanco. Por lo tanto cuanto más alto es el número de copias iniciales
de los ácidos nucleicos a amplificar, más pronto se observa un aumento significativo en
la fluorescencia, y son más bajos los valores de Ct. Los ensayos de RT-PCR son
altamente reproductivos (Fig. 3.2(A)) y pueden discriminar fácilmente entre valores
diferentes de cantidad de templado (Fig. 3.2 (B)).
3.3 Principio químico del ensayo
El RT-PCR puede utilizar fluoróforos generales de unión no específica a ADN como el
Bromuro de Etidio o el SYBR Green I, sondas de hidrólisis (Sondas 5’ nucleasa), sondas
de hibridización, molecular beacon o sondas de secuencias específicas (Ej. Scorpions®).
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Fluorescencia
PCR en tiempo real
Fluorescencia
Ciclos
Ciclos
Fig. 3.2 Reproducibilidad y precisión del RT-PCR. Análisis de una placa de 96 pozos que contiene réplicas
del mismo templado. El ensayo fue llevado a cabo en un instrumento Stratagene MX 4000 usando el método
Taqman®. El promedio de Ct para las 96 reacciones es 23±0.3. (B) Dos reacciones mezcladas, ajustadas por
triplicado. Una contiene 1x103 copias de templado de ADN y marca un Ct de 23.1±0.15. La otra tiene 2x103
copias de templado de ADN y marca un Ct de 24.1±0.1. Esto corresponde exactamente al valor esperado de
DCt de 1. (Bustin, S. 2005)
3.3.1 Química no específica
En general, los agentes intercalantes usados en la química no específica son fluoróforos
que aumentan notablemente la emisión de fluorescencia cuando se unen a ADN de doble
cadena (ADNdc). El más utilizado en RT-PCR es el SYBR Green I (Fig. 3.3), el cual
interacciona con el surco menor del ADNdc, emitiendo 1000 veces más fluorescencia que
cuando está libre en solución. El incremento de ADN en cada ciclo se refleja en un
aumento proporcional de la fluorescencia emitida. El SYBR Green I absorbe luz en una
longitud de onda de 480 nm y la emite a 520 nm. (Fig. 3.4) (Valesek M y Repa J, 2005).
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PCR en tiempo real
Figura 3.3. Representación de la interacción de SYBR green I con el ADN de doble cadena.
Figura 3.4 Fluorescencia del SYBR green I con el
ADN de doble cadena.
Una ventaja importante en la química no
específica es que el diseño y ajuste de los
ensayos es directo y los costos de materiales
son bajos (sin tener en cuenta el costo del
aparato de RT-PCR). Esto hace que sea
particularmente atractivo para el análisis de
polimorfismos de nucleótidos simples (SNP),
el cual ha llegado a ser el marcador de
selección para la identificación de múltiples
genes asociados con enfermedades complejas
como cáncer o diabetes.
Los polimorfismos bialélicos pueden ser detectados por la combinación de
amplificaciones aleloespecíficas con la detección de SYBR Green I. Las amplificaciones
alelo específicas toman ventaja de la inhabilidad relativa de la Taq polimerasa para
extender primers que están mal apareados con su blanco en el extremo 3’. El ensayo es
llevado a cabo en dos tubos separados, cada uno de los cuales contiene un par de primers
específicos de una u otra variante de SNP. Aunque estarán siendo amplificados los alelos
con errores de apareamiento, esto ocurre mucho menos eficientemente que para los alelos
bien apareados, retardando su amplificación y obteniendo valores de Ct mucho mayores.
La especificidad del ensayo puede ser mejorada con el uso de primers tipo tallo-asa para
el PCR alelo-específico, ya que estos son mejores que los lineales porque discriminan
entre secuencias cercanas relacionadas. (Hazbon, et al., 2004)
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PCR en tiempo real
El uso de análisis de curvas de disociación para identificar diferentes amplicones, evita la
necesidad de realizar reacciones de amplificación separadas. Siguiendo el ensayo de PCR,
el producto de ADNdc es fundido en ADN de cadena sencilla (ADNcs) por un ciclo en el
que se incrementa la temperatura y colectando los datos de fluorescencia en cada escalón
de temperatura. La magnitud de la reducción en la fluorescencia del SYBR green se debe
a su relajamiento desde el ADNdc, suministrando una cantidad de ADNdc disociado en
cada paso, mostrado en cada ciclo de la curva de disociación. (Fig. 3.5).
Fig. 3.5 Análisis de la curva de disociación de
SYBR Green I. A primera vista, se observa la
velocidad en que se pierde el SYBR green I a
medida que aumenta la temperatura. El ejemplo
muestra un rango de datos entre 72°C y 90°C. El
pequeño pico en 74,5 °C se debe probablemente
a la formación de producto dimérico, ya que este
es el único pico que ocurre en la muestra NTC.
EL pico principal aparece alrededor de 85,5°C
aunque hay algunos con una diferencia de perfil
fácilmente distinguible y un pico en 86.5°C.
Estos diferentes perfiles muestran diferentes
productos de PCR. (Bustin, S. 2005)
Además, como diferentes amplicones pueden fundir a diferentes temperaturas, el SYBR
Green I puede ser usado para distinguir diferentes alelos por su temperatura de fusión
(Tm). Por ejemplo, la enfermedad de Huntington es causada por un número expandido de
repeticiones CAG en el gen de Hungtington y la curva de disociación de un sujeto normal
muestra un único pico de fusión, mientras que los individuos que padecen la enfermedad
presentan dos picos. (Elenitoba-Johnson, et al., 2001).
Muchos sistemas de tubos cerrados que han sido desarrollados pueden usarse en
combinación con el análisis de punto de fusión de productos del PCR para identificar
tanto variantes homocigotas como heterocigotas, (Wittwer, et al., 2003) y ha sido posible
desarrollar ensayos triples que usan SYBR Green I y curvas de disociación para
identificar diferentes genes blanco en el mismo tubo. (Hernández, et al., 2003).
El principal inconveniente de los agentes intercalantes es su baja especificidad, debido
que se unen de manera indistinta a los productos generados inespecíficamente o a dímeros
de primers, muy frecuentes en las reacciones de PCR. Para mejorar la especificidad se
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PCR en tiempo real
deben emplear condiciones de reacción óptimas y una selección cuidadosa de primers
para disminuir el riesgo de formación de dímeros. (Costa, J., 2004). Además, es
recomendable iniciar reacciones de síntesis de ADN a temperaturas elevadas (Hot start
PCR), lo cual disminuye de forma notable el riesgo de amplificaciones inespecíficas.
3.3.2 Primers marcados con fluoróforos
A pesar de su atractivo, hay varios problemas asociados con el uso de marcadores no
específicos. En particular, hay un ensanchamiento del rango de fusión y la compresión de
la Tm entre genotipos, lo cual puede dar resultados ambiguos. Además, los agentes
intercalantes de ADNdc pueden redistribuirse durante la fusión liberando el agente desde
los heterodúplex de bajo punto de fusión y redistribuyéndose hacia los de alto punto de
fusión.
El uso de primers marcados para el análisis de fusión evita estos problemas pues tienen la
ventaja de que no se usan sondas específicas para cada ensayo. El uso de un primer con
fluoróforo marcador y otro primer sin marcar posibilita obtener perfiles de fusión del
amplicón inmediatamente después de que se completa la reacción de PCR y resultan en
curvas de fusión de forma distinta para diferentes alelos, incluyendo aquellos que tienen
diferencias en una única base. (Grundy et al., 2003)
Otro método hace uso del principio de transferencia de energía fluorescente mediante
resonancia (FRET). En este, se presenta una interacción dependiente de la distancia entre
los estados excitados de dos marcadores diferentes, en los cuales la excitación se
transfiere de una molécula donadora a una molécula aceptora a distancias alrededor de 70
– 100 Å sin la emisión de un fotón. Como resultado, la emisión del fluoróforo reportero es
reprimida. En general, uno de los primers de amplificación tiene el reportero y un
dominio represor unido a una estructura tallo-asa en su extremo 5’ .Cuando está en
solución, la emisión de fluorescencia del reportero es reprimida. Una señal fluorescente
sólo se genera cuando los oligonucleótidos marcados se incorporan en el producto de
amplificación. (Fig. 3.6).
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PCR en tiempo real
Sonda
beacon
Gen blanco
Emisión de fluorescencia
Fig. 3.6 Sondas marcadas con fluoróforos. a) El
diseño original usa un p r i m e r con una
estructura tallo-asa que tiene en su extremo 5’
un fluoróforo y un represor al final de la
estructura. b) Durante el primer ciclo de PCR
los primers se extienden y se vuelven
templados durante los siguientes ciclos de
PCR. Esto lineariza la estructura tallo-asa,
separa el donador y aceptor y resulta en
emisión de fluorescencia desde el fluoróforo
(Mocellín et al., 2003)
Gen blanco
La síntesis de primers marcados se ha simplificado mucho recientemente mediante el uso
del mismo tipo de estructuras tallo-asa, pero solamente con un fluoróforo reportero, el
cual se autoreprime con base en la secuencia que sigue. Estos primers, conocidos como
LUX®, se reprimen cuando están libres en solución, fluorescen débilmente cuando se
desnaturalizan y emiten una luz fuerte cuando se incorporan al ADN. La fluorescencia
diferencial de los primers marcados permite el uso de PCR para determinación específica
de alelos en un solo tubo. (Fig. 3.7)
Fig 3.7. Primers LUX®. Un primer contiene un
fluoróforo, el otro no se encuentra marcado. El
primer fluorogénico tiene una secuencia corta final
de 4–6 nucleótidos en el extremo 5’ que es
complementaria al extremo 3’ del primer. La
estructura tallo-asa resultante provee un a represión
óptima del fluoróforo atacado. Cuando se incorpora
el primer dentro del producto de A D N d c, el
fluoróforo deja de reprimir y se emite una señal.
(Bustin, S. 2005)
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PCR en tiempo real
Sondas de hibridización específicas
Son sondas marcadas con dos tipos de fluoróforos, un donador y un aceptor. El proceso
también se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET)
entre las dos moléculas. Las más utilizadas son las sondas de hidrólisis, conocidas
comercialmente como Taqman®, las sondas conocidas como molecular beacons, los
scorpions y las sondas FRET.
a) Sondas de hidrólisis: Son oligonucleótidos marcados con un fluoróforo donador en el
extremo 5’ que emite fluorescencia al ser excitado y un aceptor en el extremo 3’ que
absorbe la fluorescencia liberada por el donador. Para que esto ocurra, las moléculas
donadora y aceptora deben estar espacialmente próximas. Además, el espectro de emisión
de la primera se ha de solapar con el espectro de absorción de la segunda. En la tabla 3.1
se relacionan los fluoróforo más empleados y sus espectros de excitación y emisión.
Mientras la sonda está intacta, la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el
aceptor. Sin embargo, durante la amplificación de ADN templado, la sonda se hibrida con
su cadena complementaria. Al desplazarse a lo largo de la cadena, en su acción de
síntesis, la ADN polimerasa de Thermus aquaticus, que tiene actividad 5’ exonucleasa,
hidroliza el extremo libre 5’ de la sonda, produciéndose la liberación del fluoróforo
donador. Como donador y aceptor están ahora espacialmente alejados, la fluorescencia
emitida por el primero es captada por el detector (Fig. 3.8).
Las sondas de hidrólisis ofrecen precisión similar que la que ofrecen los ensayos seguidos
con SYBR Green I (Wilheim et al., 2003a), pero éstas además dan gran seguridad de
alcanzar la especificidad. Debido a esto, el uso de sondas de hidrólisis es un método
recurrente para la genotipificación. Dos sondas fluorogénicas, marcadas con dos
marcadores espectralmente diferentes, pueden ser utilizadas para discriminar entre alelos
nativos y mutantes. Si se detecta la amplificación de una muestra de ADN desconocido
por la identificación del fluoróforo del alelo nativo y no por la del alelo mutado, la
muestra se considera como homocigoto del tipo nativo y, de forma inversa, si se encuentra
fluorescencia del marcador de identificación del mutante, se clasifica como homocigoto
de la cepa mutante. Si se presentan marcajes de ambos fluoróforos, esta se designa como
heterocigota para los dos alelos.
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PCR en tiempo real
TABLA 3.1 Principales moléculas fluorescentes empleadas como marcadores en la PCR a tiempo real
(Costa J, 2004)
Fig. 3.8 Resumen de la química asociada a las sondas Taqman®
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PCR en tiempo real
b) Molecular beacons: Son sondas parecidas a las anteriores. Tienen una molécula
donadora en el extremo 5’ y una aceptora en el extremo 3’ pero, además, presentan una
estructura secundaria en forma de asa, en la que reside la secuencia de unión específica
con el ADN diana.
Los extremos permanecen plegados cuando la sonda no está hibridada, lo que conlleva a
que donador y aceptor estén muy cerca uno de otro. En esta conformación la fluorescencia
emitida por el donador es absorbida por el aceptor y no es captada por el lector del equipo.
Sin embargo, al hibridar con el ADN blanco la sonda se abre, alejándose donador y
aceptor, pudiéndose detectar la fluorescencia emitida por el primero (Fig. 3.9).
Fig. 3.9 Molecular beacons
El uso de los molecular beacons proporciona un nivel adicional de especificidad, ya que
es muy poco probable que falsos amplicones o primers-dímeros posean secuencias blanco
para ellos, la generación de fluorescencia es exclusiva de la síntesis de los amplicones
analizados. (En: www.molecularbeacons.org)
c) Scorpions: Son moléculas bifuncionales que contienen un primer covalentemente
unido a una sonda (Fig. 3.10). Las moléculas también contienen un fluoróforo que puede
interactuar con un represor (quencher) para reducir la fluorescencia. Cuando las
moléculas se usan en una reacción de PCR, el fluoróforo y el represor se separan
generando un incremento en la luz emitida (Fig. 3.11). Las ventajas de los scorpions se
basan en que la sonda está acoplada físicamente al primer. Esto significa que la reacción
que se lleva a cabo para generar la señal es un cambio unimolecular. En contraste con las
colisiones bimoleculares requeridas por otras tecnologías tales como Taqman® o
molecular beacons. Las ventajas de un cambio unimolecular son significativas, pues la
reacción es instantánea y ocurre antes que cualquier reacción inespecífica o colateral
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PCR en tiempo real
Fig. 3.10. Elementos de un primer Scorpions
como los realineamientos de los amplicones o el plegamiento inadecuado del templado.
Esto conduce a señales más fuertes, a un diseño más confiable de la sonda, a tiempos de
reacción más cortos y a una mejor discriminación. Los scorpions son primers con una
estructura tallo-asa que contiene un fluoróforo y un represor. La estructura tallo asa está
separada del primer por un “bloqueador”, el cual es una estructura con modificaciones
químicas que previene que se copie la estructura tallo asa del primer. Durante la reacción
de PCR, los primers scorpions se extienden para formar los productos del PCR. En la
etapa de alineamiento del ciclo de PCR, las secuencias de la sonda en la cola del primer se
curvan para hibridar la secuencia blanco en el producto del PCR (Fig. 3.11). Como la cola
del scorpion y el producto del PCR forman parte de la misma hebra de ADN, la
interacción es intermolecular. La secuencia blanco generalmente se escoge para estar a 3
bases del extremo 3’ del primer scorpion.
d) Sondas FRET: El sistema se compone de dos sondas que se unen a secuencias
adyacentes del ADN blanco. Una de las sondas lleva un donador en el extremo 3’ y la otra
un aceptor en el extremo 5’. Cuando las sondas están hibridadas, los dos fluoróforos están
próximos. Al ser excitado, el donador transfiere su energía al aceptor que, a su vez, emite
la fluorescencia que detecta el lector del equipo (Fig. 3.12).
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PCR en tiempo real
Fig. 3.12 Sondas FRET
Fig. 3.11 Reacción de un primer Scorpion
Fig. 3.12 Sondas FRET
18
PCR en tiempo real
En todos estos sistemas, el incremento de ADN en cada ciclo se corresponde con un
aumento de hibridación de las sondas, lo que conlleva un aumento en la misma proporción
de fluorescencia emitida. El empleo de sondas garantiza la especificidad de la detección y
permite identificar polimorfismos o mutaciones puntuales, pero su costo es más elevado
que el SYBR Green I y la optimización de las condiciones de la reacción resulta más
difícil.
e) Otras sondas
Hay más químicas de sondas disponibles, todas con ventajas y desventajas. Entre ellas se
cuentan los Hybeacons, los cuales requieren solo un fluoróforo y hace uso de las
propiedades de represión del ADN. Esto los hace fáciles de diseñar y sintetizar. (French et
al., 2002). Las sondas Light up están compuestas de naranja de tiazol conjugada a
péptidos de ácidos nucleicos (PNA) y combina las excelentes propiedades de los PNA,
que permiten el uso de sondas más cortas con un extraordinario aumento en la
fluorescencia. Las sondas Eclipse® son sondas lineales que tienen un marcador del surco
menor (MGB su sigla en inglés), un represor en el extremo 5’ y el fluoróforo en el
extremo 3’ (Bustin et al, 2004a).
3.4 Instrumentación para el PCR en tiempo real
Un requerimiento imprescindible para llevar a cabo con efectividad esta técnica es la
utilización de una instrumentación adecuada que permita detectar la señal fluorescente y
grabar el proceso de la reacción de PCR. Los instrumentos deben emitir y detectar
longitudes de onda específicas simultáneamente, por lo que el basamento químico de esta
técnica y la instrumentación están estrechamente relacionados.
Hasta el momento existen tres formas fundamentales para suministrar la energía de
excitación para los fluoróforos: mediante lámparas, diodos emisores de luz (LED) o láser.
Las lámparas son instrumentos de emisión de amplio espectro, mientras que el de los
LEDs y lásers es más restringido. Los equipos que presentan lámparas (generalmente de
tungsteno halógeno o cuarzo tungsteno halógeno) pueden incluir filtros que limitan la luz
emitida a longitudes de onda de excitación específicas. Entre ellos se encuentran el ABI
Prism 7000 de Applied Biosystems, el Mx4000 y Mx3000P de Stratagene, y el iCycler iQ
de Bio-Rad. El sistema de LED está representado por el LightCycler de Roche, el
SmartCycler de Cepheid, el Rotor-Gene de Corbett y el DNA Engine Opticon 2 de MJ
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PCR en tiempo real
Research. La única máquina que utiliza láser para la excitación hasta el momento es el
ABI Prism 7900HT (Valasek et al., 2005).
Para colectar los datos, la energía de emisión de los fluoróforos también debe ser
detectada en longitudes de onda específicas. Los detectores están representados por
cámaras acopladas a dispositivos de carga, tubos fotomultiplicadores u otro tipo de
fotodetectores. Generalmente se emplean filtros o canales para detectar pequeños rangos
de longitudes de onda. Usualmente se pueden detectar varias longitudes de onda discretas
simultáneamente, lo que permite correr múltiples ensayos en un solo tubo de reacción.
Otra porción importante de la instrumentación consiste en un termociclador efectivo para
llevar a cabo las reacciones de PCR. Es muy importante que estos mantengan una
temperatura consistente a lo largo de todos los tubos de ensayo dado que pequeñas
desviaciones de la temperatura resultan en errores graves de cuantificación (Wilhelm et
al., 2000; Zuna et al., 2002). Un bloque de calentamiento (Peltier o por resistencia) o el
calentamiento por aire, o una combinación de ambos, son los más utilizados. Los bloques
calentadores cambian la temperatura más lentamente que los calentadores de aire, lo que
resulta en ciclos más largos.
La instrumentación del PCR en tiempo real no estaría completa sin un hardware de
computación y un software de análisis de datos apropiado. Los softwares simplifican el
análisis de los datos arrojando los resultados en forma de gráficos que muestran la
amplificación y disociación de los productos. Las curvas de amplificación permiten el
análisis cinético y la cuantificación del ADN de partida, mientras que las curvas de
disociación revelan las características, entre ellas la pureza, del producto final de la
reacción.
El primer termociclador de PCR en tiempo real fue
producido por Appied Biosystems de forma comercial en
1997, el ABI 7700 (Fig. 3.13). El sistema de detección de
este equipo consiste en un termociclador conectado a un
láser y a un sistema óptico CCD (dispositivo de carga
acoplada, el cual genera una respuesta eléctrica
proporcional a la luz que captó). Este equipo detecta un
Fig. 3.13 ABI 7700
rango de fluorescencia desde 500 a 660nm. La
fluorescencia se induce emitiendo luz láser simultáneamente a todas las muestras a través
20
PCR en tiempo real
de un arreglo múltiple de fibras ópticas. Las emisiones de fluorescencia resultantes de la
interacción con los fluoróforos viajan en reversa y son detectadas por la cámara CCD, las
cuales son medidas cada 7 segundos y posteriormente se analizan por el software. Este
instrumento puede utilizarse para análisis basados en agentes intercalantes, molecular
beacons y sondas de hidrólisis. Las corridas demoran aproximadamente 2 horas.
Posteriormente, Roche Diagnostics comenzó la distribución del Light Cycler (Fig. 3.14),
el cual utiliza pequeños capilares de vidrio como tubos de reacción (Wittwer et al., 1989;
1997b; ). Estos capilares se colocan en un muestrario en forma de carrusel dentro de una
cámara de aire termostatada, cuya rotación asegura la homogeneidad de la temperatura del
sistema. La combinación de un volumen de muestra pequeño, la forma cilíndrica de los
capilares y el ajuste de la temperatura mediante el aire, permite obtener gradientes de
temperatura muy pronunciados que se traducen en tiempos más
cortos de reacción, con el consecuente incremento de la
especificidad. Este sistema utiliza un potente diodo emisor de luz
azul para la excitación en vez de un delicado láser y la
fotodetección se realiza con tres diodos que tienen tres filtros de
longitudes de onda diferentes, lo cual permite combinar distintos
fluoróforos simultáneamente. Una corrida completa de PCR con
40 ciclos puede tomar sólo de 15 a 20 minutos..
Fig. 3.14. Light Cycler
El Rotor-Gene de Corbett
Research (www.corbettlifescience.com, Fig. 3.15)
utiliza un diseño de rotor de centrífuga que tiene
numerosas ventajas (Fig. 3.16):
1-Uniformidad óptica: Cada tubo pasa frente la
misma fuente de luz excitatoria, la cual atraviesa las
paredes laterales, y la fluorescencia emitida retorna al
mismo sistema de detección, en este caso un tubo
fotomultiplicador. Esto determina que no haya
necesidad de realizar la calibración óptica del equipo,
Fig. 3.15. El Rotor-Gene
por lo que no se necesita un fluoróforo de normalización.
21
PCR en tiempo real
El Rotor-Gene utiliza varios LEDs de diferentes longitudes de onda que están. acoplados
a un filtro de banda estrecha. Este equipo además tiene un paso óptico pequeño y menos
complejo que el de los sistemas que utilizan fibra óptica, los cuales tienden a ser lentos,
frágiles y caros. De acuerdo a las necesidades del operador, el sistema de detección cuenta
con filtros “band pass” (que permiten el paso de rangos discretos de longitudes de onda y
por ende se prefieren para los ensayos de multiplexing) y filtros “high pass” (a través de
los cuales pasan todas las longitudes de onda por encima de un valor de corte
determinado, lo que incrementa la sensibilidad de la detección).
2-Rápida recolección de los datos: Todos los tubos pasan por el detector cada 150
milisegundos.
3- Al igual que en el Light Cycler, la rotación garantiza la uniformidad de la temperatura
del aire del sistema. Además no hay diferencia entre los tiempos de equilibración térmica
entre pozos durante los cambios de temperatura. Los fabricantes garantizan que entre
muestra y muestra la variación de temperatura es menor a 0.01 grados Kelvin. El rotor
opera a velocidad normal cuando está calentando (Aproximadamente 500 rpm), y al
enfriar incrementa la velocidad, por lo que la fuerza centrifuga que se ejerce sobre cada
muestra asegura que no haya condensación y las burbujas de aire son eliminadas
automáticamente.
Fig. 3.16. Vista Interior del Roto-Gene
22
PCR en tiempo real
3.5 Análisis de los datos
El análisis cuantitativo de los datos se traduce en la evaluación de las curvas de
amplificación, en las que se representa la fluorescencia detectada versus el número de
ciclos de PCR (Fig. 3.17). La sensibilidad del equipo está determinada por el ciclo al cual
la fluorescencia emitida se incrementa por encima del ruido de fondo. El número de
copias del templado se puede determinar con alta precisión a partir del número de ciclos
que se suceden para que la señal alcance un determinado nivel de fluorescencia llamado
umbral, el cual debe interceptar la curva en la fase exponencial, y es determinado de
manera arbitraria. Este punto debe seleccionarse entre dos ciclos sucesivos, por lo que
debe ser un número fraccionario.
Fig. 3.17. Curva de amplificación
Ploteo ΔRn vs Número de ciclo, donde ΔRn = (Rn+) – (Rn-) siendo:
Rn+ = Intensidad de emisión del PCR con molde
Intensidad de emisión de la referencia pasiva
Rn- = Intensidad de emisión del PCR sin molde (NTC)
Intensidad de emisión de referencia pasiva
23
PCR en tiempo real
Donde la referencia pasiva debe ser un ácido nucleico idéntico a la muestra que estamos
analizando pero sin el fragmento de secuencia correspondiente al templado, de esta forma
tenemos un control negativo perfecto.
Las curvas de amplificación constan de tres partes diferentes:
1)
La fase inicial donde no se puede medir a acumulación del producto de PCR pues
hay pocos cambios en la señal de fluorescencia, lo que define la línea basal
2)
La fase exponencial, donde la fluorescencia cambia a medida que se forman más
productos
3)
La fase de meseta, donde no se distinguen cambios en la fluorescencia a pesar de
que se siguen acumulando productos
Para cada muestra, el número de ciclos necesarios para interceptar el valor umbral se
llama “ciclo umbral” o “threshold cycle” (Ct). El Ct es inversamente proporcional al
número de copias iniciales del ADN muestra. Por tanto, si graficamos el logaritmo de la
cantidad inicial de ADN de estándares de concentración conocida versus el Ct, el
resultado es una línea recta. En cada corrida de PCR en tiempo real debemos analizar
muestras estándar de concentración inicial conocida, de esta forma estamos determinando
el rango dinámico de detección de nuestro método, requisito indispensable para publicar
resultados de calidad. Se pueden analizar diferentes diluciones decimales del mismo
estándar, preferentemente en cuadruplicados. Para presumir la reproducibilidad de
nuestros resultados, debemos tener desviaciones estándar menores a 0.2 unidades de Ct.
Por cada unidad de Ct que cambia en el resultado de una amplificación, se incrementa al
doble la concentración inicial de muestra calculada.
Para lograr una mayor exactitud en la cuantificación es necesario calcular al eficiencia de
la amplificación.
Durante la fase exponencial, la señal S puede ser representada por la ecuación 1 (Wilhelm
y Pingoud, 2003):
S= pNoεc
(1)
Donde p es un factor de proporcionalidad que relaciona la concentración del producto de
PCR y la señal S, No es la cantidad de templado, ε es la eficiencia de la amplificación
(1≤ε≥2; donde ε=2 significa una eficiencia del 100%) y c es el número de ciclo.
24
PCR en tiempo real
Si despejamos c tenemos la siguiente ecuación:
c= -(logε)-1(logNo +logp-logS)
(2)
donde m=-(logε)-1 y b= -(logε)-1(logp-logS) y resulta la ecuación 3:
c= mlogNo + b
(3)
Esta ecuación describe la relación lineal entre los valores de Ct y el logaritmo de la
concentración de templado No. Los parámetros m y b pueden determinarse por regresión
lineal a partir de valores (S;Ct) de estándares de templado de concentración conocida.
Despejando No obtenemos:
No = 10(Ct-b)/m
(4)
La eficiencia puede ser entonces calculada como:
ε= 10-1/m
(5)
Si sustituimos ε en la ecuación 4, obtenemos la ecuación 6:
No = ε(b-Ct)
(6)
El máximo valor de ε es 2.0 (si se duplica la cantidad de producto en cada ciclo), pero los
valores experimentales de ε fluctúan entre 1.5 y 1.9. Si la eficiencia es baja disminuye la
sensibilidad del ensayo pero permite cuantificaciones con mayor precisión (mayor
reproducibilidad entre repeticiones).
El error en los valores de Ct resultan del ruido de fondo y del método de cálculo de Ct. En
ensayos altamente optimizados, podemos obtener errores estándares menores de ± 0.2
ciclos, asumiendo una eficiencia de amplificación del 100%, lo que implica que el error
relativo mínimo para la cuantificación está entre el 10 y el 20%.
El rango dinámico de esta técnica es extraordinariamente alto, con más de seis órdenes de
magnitud .
Para calcular la concentración inicial de nuestro templado se grafica el logaritmo decimal
de las concentraciones de los estándares versus el Ct. El resultado es una recta cuya
pendiente deberá ser teóricamente igual a –3.32 si tenemos una eficiencia de
amplificación del 100% (Ecuación 5). En la práctica, un ensayo es aceptable hasta con un
92% de eficiencia.
25
PCR en tiempo real
El cálculo del rango dinámico se puede realizar en amplificaciones monoplex (un solo
blanco biológico) o en modelos multiplex (para dos o más blancos biológicos
amplificados simultáneamente).
Curvas de desnaturalización
Estas curvas representan la relación que existe entre la fluorescencia y la temperatura
(Fig.3.18.a). Se realizan para corroborar la identidad del amplicón luego del ensayo de
PCR, puesto que debe tener una temperatura de desnaturalización (Tm) específica. La
detección se puede realizar con intercalantes del ADN como el SYBR Green o con sondas
específicas como los Molecular Beacons. Otras como los Scorpions no pueden utilizarse
pues forman parte del producto de PCR, como tampoco se utilizan las sondas TaqMan,
dado que su señal depende de la hidrólosis de la sonda. Para la caracterización de los
productos de la reacción de PCR se utilizan más los agentes intercalantes del ADN,
mientras que las sondas específicas se usan para otros estudios como los de
genotipificación. En estas curvas la señal decrece gradualmente como resultado de la
disminución de la fluorescencia dependiente de la temperatura y posteriormente
disminuye de forma abrupta debido a la separación de las dos hebras de ADN. La
temperatura de desnaturalización o Tm se identifica como el punto más alto de la derivada
negativa de la curva de desnaturalización (Fig. 3.18.b). En esta representación además, el
área bajo el pico es proporcional a la cantidad de producto, por lo que las curvas de
desnaturalización también permiten cuantificar la cantidad de producto que tenemos si
contamos con estándares de concentración conocida (Wilhelm et al, 2003).
3.4.1 Ensayos de cuantificación absoluta
El objetivo es determinar el número exacto de moléculas de ADN o ARN presentes en
una muestra. El resultado estará expresado en las mismas unidades que los estándares de
la curva de calibración (número de copias, ng/mL,). Este tipo de cuantificaciones se
emplean para la detección y cuantificación de cargas virales, agentes patógenos o en la
terapia génica.
3.4.2 Ensayos de cuantificación relativa
Este tipo de cuantificaciones permite determinar cuantas veces (más o menos) ácido
nucleico se tiene de un templado o una muestra biológica determinada con respecto a un
tejido o muestra de referencia. Los resultados son expresados de manera relativa por lo
que no se necesita una curva de calibración con un estándar de concentración conocida.
26
PCR en tiempo real
Fig.3.18. Resultado de una curva de desnaturalización de un producto de PCR y un control
negativo. El producto de PCR tiene una Tm aparente de 87.5°C, mientras que el control negativo
contiene dímeros de primers con una Tm aparente de 83°C. a)Curva de disociación. B)
Representación del pico de desnaturalización
La aplicación más utilizada de este método es la comparación de los niveles de expresión
génica (mRNA) entre diferentes tejidos o en el tiempo, o la respuesta de un tejido a
diferentes tratamientos.
Primeramente debemos realizar una normalización de la cantidad relativa de cada muestra
respecto a un gen normalizador, preferentemente de expresión constitutiva en la célula
(control endógeno). Estos genes mantienen un nivel de expresión constante aún en
diferentes estados fisiológicos de la célula y no deben afectarse en respuesta a los
tratamientos que estamos evaluando, en caso de que así sea. Para que este método sea
exitoso el rango dinámico de la muestra y del control endógeno debe ser similar. Un
método sensible para evaluar si esta regla se cumple es calcular el ΔCt para diferentes
diluciones de la muestra y del gen normalizador.
ΔCt = Ct (muestra)-Ct (normalizador), donde Ct (muestra) y Ct (normalizador) es el ciclo
al cual la muestra y el normalizador respectivamente alcanzan el nivel umbral de
fluorescencia en el ensayo de PCR en tiempo real. El cálculo de ΔCt se realiza para
diferentes diluciones del templado y de la referencia, y se grafica la dilución analizada vs
el resultado del ΔCt para cada una. Esta evaluación tiene como propósito determinar la
eficiencia de amplificación entre diferentes concentraciones de ARNm tanto para la
muestra como para el control endógeno, y demostrar que para una misma muestra, la
proporción obtenida entre el mARN templado y la referencia sea siempre la misma. Si la
27
PCR en tiempo real
eficiencia de amplificación de la muestra y de la referencia son similares, el resultado de
esta gráfica debe ser una línea recta de pendiente prácticamente 0 ó menor de 0.1, como se
muestra en la Fig. 3.19.
Fig. 3.19. Ejemplo de una curva de calibración.
Aquí como vemos el valor de la pendiente de la gráfica es de 0,0471. Es de esperar que el
valor de ΔCt sea mayor en la muestra que en el normalizador, teniendo en cuenta que el
nivel de expresión del mensajero sea mayor en el normalizador, por lo que ΔCt debe ser
un valor positivo, aunque puede ser negativo también.
Luego procedemos al cálculo del ΔΔCt (Livak y Schmittgen, 2001):
ΔΔCt =ΔCt (muestra)- ΔCt (calibrador),
donde la muestra puede ser el nivel de expresión mRNA en riñón, pulmón, etc de un gen
X y el calibrador puede ser el nivel de expresión de ese mismo gen en cerebro (tejido de
referencia).
Entonces el ΔΔCt se calcula para diferentes tejidos así como la expresión relativa de
mRNA, que está dada por la ecuación:
Expresión relativa = 2 -ΔΔCt
Si el tejido de referencia a comparar es el de menor expresión de mensajero, su valor de
ΔCt será el mayor y el nivel de expresión de las muestras siempre aumentará respecto a la
referencia, pero de igual forma puede disminuir.
28
PCR en tiempo real
Para ejemplificar este modelo, mostramos la evaluación de la expresión del gen c-myc en
cuatro tejidos diferentes: hígado, riñón, pulmón y cerebro. Se emplea como control
endógeno o normalizador, la expresión de la enzima gliceraldehído 3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH) en estos tejidos. La normalización de los tejidos se lleva a cabo
calculando:
ΔCt pulmón = Ct (c-myc)pulmón- Ct (GAPDH)pulmón
ΔCt hígado = Ct (c-myc) hígado – Ct (GAPDH) hígado
y así sucesivamente con los otros dos tejidos.
Luego calculamos ΔΔCt y la expresión relativa de c-myc en pulmón, hígado y riñón
tomando como referencia el valor de ΔCt en cerebro:
ΔΔCt pulmón = ΔCt pulmón - ΔCt cerebro
ΔΔCt hígado = ΔCt hígado - ΔCt cerebro
ΔΔCt riñón = ΔCt riñón - ΔCt cerebro
y graficamos la expresión relativa de c-
myc tomando como referencia los niveles en
cerebro como se muestra a continuación:
Otros ensayos de cuantificación relativa se han realizado utilizando como controles
endógenos la expresión de β-actina, β2-microglobulina y ARN ribosomal. La selección del
calibrador depende del tipo de relación que queremos calcular. El diseño más simple es
utilizar el control no tratado como calibrador, en el caso en que estudiemos expresión
diferencial entre muestras tratadas y no tratadas. En este caso, el ΔΔCt del calibrador es 0
y su expresión relativa 20 es igual a 1, por definición. Un resultado similar se obtiene
29
PCR en tiempo real
cuando analizamos el aumento de la expresión de un gen a través del tiempo y el
calibrador representa la cantidad de mensajero a tiempo cero.
3.6 Estrategias de normalización
El principio de cuantificación mediante la técnica de PCR en tiempo real parece muy
simple: mientras más copias de templado tenemos, menor número de ciclos de PCR serán
necesarios para alcanzar el nivel umbral. Pero en la práctica, la relación entre el número
de copias del templado y el Ct no es tan sencilla. En primera instancia, lograr
cuantificaciones reproducibles a partir de templados que se encuentran poco abundantes
(<1000 copias) en una mezcla compleja de ácidos nucleicos constituye muchas veces una
tarea problemática (efecto Monte Carlo, Karrer et al., 1995). En segundo lugar, hay que
tomar en cuenta que muchas muestras biológicas pueden contener inhibidores de
reversotranscriptasas, polimerasas u otros reactivos utilizados en las reacciones de PCR,
por lo cual es necesario investigar la presencia de estos inhibidores cuando queremos
poner a punto un ensayo de cuantificación específico. Una manera fácil de lograrlo, por
ejemplo, es realizando un RT-PCR en tiempo real de referencia, en el cual adicionamos
una cantidad conocida de ARN y medimos las variaciones en los valores de Ct (Smith et
al., 2003).
En tercer lugar, es necesario aplicar una adecuada estrategia de normalización que permita
controlar la cantidad de material de partida, las variaciones en la eficiencia de
amplificación y las diferencias entre muestras. A pesar de las numerosas estrategias que se
han puesto en práctica, el máximo problema de la normalización para el PCR en tiempo
real sigue en pie: los experimentos de RT-PCR en tiempo real para cuantificar la cantidad
de ARN a partir de muestras biológicas complejas. Existen variaciones en la cantidad de
ARN expresado entre células de diferentes linajes o que se encuentran en distintos estados
de diferenciación. Para el caso de las muestras de sangre, la citometría de flujo
(Raaijmakers et al., 2002) y los anticuerpos acoplados a perlas magnéticas (Deggerdal y
Larsen, 1997) han permitido separar subpoblaciones celulares definidas. Sin embargo,
para las biopsias de tumores sólidos no existe prácticamente ninguna forma de separar o
contar células, a lo que se une la alta heterogeneidad celular inherente a este tipo de
patología: células cancerosas, epiteliales, estromales, componentes del sistema inmune y
del sistema vascular contribuyen a formar la masa tumoral. Esta variabilidad nos permite
30
PCR en tiempo real
sin embargo generar resultados cualitativos, pero debemos ser muy cuidadosos si
queremos realizar un análisis cuantitativo. Afortunadamente, con la técnica de captura por
microdisección utilizando láser se puede cuantificar la cantidad de ARN mensajero
proveniente de un corte de tejido como número de copias del templado por área de
disección (Fink et al., 1998).
3.6.1 Cuantificación de ARN mensajero
El PCR en tiempo real es muy utilizado para la cuantificación de los niveles de ARN
mensajero, pero existen muchos problemas que pueden afectar la calidad de los
resultados, entre los que se encuentra la variabilidad inherente al ARN, la variabilidad de
los protocolos de extracción y diferencias en la eficacia de la reverso transcripción, entre
otros. Es por esto que se hace imprescindible utilizar un método de normalización de los
resultados que nos permita una cuantificación lo más cercana posible a la realidad
(Huggett et al., 2005).
A) Tamaño de la muestra
La primera forma de minimizar el error experimental es partiendo de masas o volúmenes
de tejido similares a partir del cual aislaremos nuestro ácido nucleico templado.
Desgraciadamente grupos de muestras del mismo tamaño no siempre son representativos
entre sí. Cuando trabajamos con cultivos celulares en monocapa, muchas veces se
dificulta la estimación de la densidad celular, no sólo por la pérdida debido a la
mortalidad sino por cambios morfológicos y fisiológicos que pueden ocurrir en las
células. Se hace evidente entonces que asegurar muestras de igual tamaño, densidad o
peso, minimiza los errores pero no es suficiente.
B) Cuantificación de ARN
Una cuantificación precisa y de calidad del ARN que queremos reverso transcribir es
esencial para lograr muestras de partida homogéneas. Existen muchos métodos para
cuantificar ARN, y entre los más precisos está el uso del reactivo ribogreen, el cual se
intercala de manera precisa en los ácidos nucleicos de doble cadena y es mucho más
sensible que el bromuro de etidio. De esta forma, si tenemos una preparación
relativamente pura de ARN celular y medimos la cantidad de ARN ribosomal (el cual
31
PCR en tiempo real
consta de muchas estructuras secundarias) por unión al ribogreen, podemos inferir que el
resto de nuestro ARN, sea mensajero o de transferencia, también conserva una buena
integridad. Se utiliza el ARN ribosomal como referencia pues representa
aproximadamente del 85 % al 95% de todo el ARN celular, mientras que el ARN
mensajero se encuentra entre el 2 y el 5%, por tanto se asume que la relación
ARNr:ARNm no cambia entre grupos de análisis, lo cual no siempre es válido. Los
niveles de ARNr varían menos en condiciones que afectan a los de ARNm (Schmittgen y
Zakrajsek, 2000), por lo que su utilización como normalizadores se ha vuelto más
confiable que muchos genes de referencia. Un reporte reciente donde se comparan los
niveles de expresión de ARN entre células nucleadas de la sangre en resposo o activadas,
reveló que el ARNr 18S es el blanco de referencia más estable.
En este tipo de análisis podemos realizar una electroforesis, donde debemos observar dos
bandas bien definidas que corresponden al ARNr 28S y 18S, siendo la de 28S mucho más
intensa debido a que, en condiciones normales, este ARNr se encuentra al doble de la
concentración del ARNr 18S (Fig.3.20.a). También podemos utilizar un bioanalizador
(Agilent Bioanalyser) donde, de manera similar a una cromatografía, separamos los ARNr
y se visualiza el cromatograma por tinción con ribogreen. Los tiempos de retención de los
ARNr 28S y 18S ya son conocidos (Fig.3.20.b). No obstante, la normalización de una
muestra respecto al ARN total tiene la desventaja de no controlar las variaciones
inherentes a la reverso transcripción o a las reacciones de PCR.
C) ADN genómico
La cuantificación de ADN genómico para la normalización pudiera parecer una buena
estrategia, por cuanto no se necesita hacer un paso previo de reverso-transcripción, pero la
realidad es que existen inconvenientes. Por ejemplo, cuando las células están proliferando,
tenemos mucho más ADN, lo que puede representar el doble de la información genética
para células eucariotas. En el caso de las bacterias o las células tumorales, podemos tener
8 copias o más de la información genética de un cierto loci comparado con células que no
se replican. De esta forma aunque partamos de una cantidad de células similar, existe
mucha variabilidad en la cantidad de ADN genómico extraído. Otro problema es la
carencia de protocolos altamente estandarizados para una purificación de ADN genómico
de calidad.
32
PCR en tiempo real
b
ARNr 28S
ARNr 18S
Fig. 3.20. Ejemplo de una cuantificación de ARNr de buena calidad mediante (a) Gel de
agarosa y (b) Agilent Bioanalyser.
D) Genes de referencia
Se utilizan en los ensayos de cuantificación relativa que describimos previamente. Una de
las ventajas de esta técnica es que tanto el gen a cuantificar como el normalizador, son
detectados utilizando el RT-PCR en tiempo real. Existen numerosas publicaciones que
subrayan el hecho de que no existe ni un solo gen de referencia universal, pues todos se
regulan de alguna forma y ninguno se expresa constitutivamente en todos los tipos
celulares y bajo cualquier condición experimental. Muchos de los genes de referencia
“clásicos” ampliamente utilizados como normalizadores en los RT-PCR en tiempo real
son genes regulados, hecho que se conoce desde mucho antes de que surgiera la técnica de
PCR en tiempo real. Tal es el caso del ARNr 18S, el cual se sobreexpresa frente a una
infección con citomegalovirus, o del gen que codifica para la GAPDH, el cual se
transcribe de manera similar en diferentes tejidos de rata, pero esto no correlaciona con las
cantidades de ARN mensajero encontradas en dichos tejidos. A pesar de estas evidencias,
estos genes de referencia se siguen utilizando como normalizadores sin un proceso previo
de validación. Reportes recientes han demostrado que muchos de estos genes no pueden
utilizarse como normalizadores. Una de las peores situaciones que se pueden presentar es
que el gen de referencia se vea afectado por las condiciones que queremos evaluar.
La validación de los genes de referencia está sujeta también a los problemas de la
normalización. El grado de variabilidad aceptable para un gen de referencia depende de la
33
PCR en tiempo real
resolución requerida. Aún cuando el gen de referencia seleccionado sea variable, esto no
interesa siempre que la diferencia entre grupos sea mayor que la variación del gen de
referencia. Si un ARN de referencia tiene un error de 1 log puede no ser ideal, pero es
suficiente para medir cambios en los templados de 2 log o más.
Existen muchos programas sustentados en la plataforma de Excel que permiten el análisis
de muchos genes de referencia. El programa Gnorm permite la elección del gen de
referencia apropiado mediante el cálculo de la media geométrica de la expresión del
ADNc candidato. En este programa se toma como factor de normalización la media
geométrica entre pares de genes internos de referencia que muestran un perfil de
expresión similar, partiendo del principio de que pares de genes que presenten patrones de
expresión estables entre sí, son genes de control adecuados. (Vandesompele et al., 2002).
Este
software
se
encuentra
disponible
en
el
sitio
(http://www.genomebiology.com/2002/3/7/research/0034/). No obstante, este modelo
requiere de una extensa validación práctica para identificar la combinación adecuada de
genes de referencia para cada experimento en particular, siendo los mejores candidatos
para esto los genes coexpresados. El programa BestKeeper también selecciona el gen de
referencia menos variable a partir de las medias geométricas y se encuentra disponible en
el sitio http://www.gene-quantification.de/BestKeeper-1.zip.
Un tercer programa llamado Norm-Finder, no sólo mide la variación del normalizador
sino que establece una gradación entre los genes de referencia potenciales en términos de
cuánto difieren entre los diferentes grupos de estudio, entendiéndose esto como diferentes
condiciones experimentales.
Muchos autores han sugerido utilizar diversos genes de referencia en vez de confiar en un
solo transcripto. Este es un método robusto de normalización altamente favorable cuando
deben realizarse cuantificaciones muy precisas. Esta técnica no obstante está limitada por
problemas de disponibilidad de la muestra o el costo de las mismas.
E) Moléculas artificiales
Estas moléculas de ARN “artificiales” pueden ser obtenidas a partir de otro organismo en
el cual sus genes hayan sido clonados o pueden generarse de forma sintética. Dado que
conocemos su cantidad exacta, pueden ser adicionadas a la muestra en las etapas de
extracción de ARNm y así estarán sujetas a todos los errores experimentales que afectan
34
PCR en tiempo real
al ARN de interés. Además no se verán afectadas por las fluctuaciones propias de los
sistemas biológicos que muchas veces afectan a los genes de referencia. Sin embargo, la
generación de estas moléculas “alien” no es asequible a muchos laboratorios, sobre todo
los que realizan pocos ensayos de RT-PCR en tiempo real. La adquisición comercial de
este tipo de estándares para la normalización permanece todavía como una idea teórica
que no ha sido validada.
En términos generales, una adecuada normalización es crítica para obtener resultados
biológicos relevantes. Dado que no existe una sola estrategia que sea aplicable a todas las
condiciones experimentales, la clave para una buena normalización en los ensayos de
PCR en tiempo real es la demostración de que el gen utilizado como referencia ha sido
correctamente validado (Bustin et al., 2005).
35
Aplicaciones
CAPITULO 4
APLICACIONES DEL PCR EN TIEMPO REAL
La emergente tecnología del PCR en tiempo real ha demostrado su versatilidad y utilidad
en diversos campos de la investigación biomédica y el diagnóstico biomolecular, siendo la
limitante la imaginación de investigadores y fabricantes de nuevos equipos, productos y
servicios asociados a estas ramas del conocimiento.
Entre los campos de acción que más recurren a esta tecnología se cuentan la virología, la
microbiología clínica y la investigación biomédica, aunque existen otras como las
industrias alimenticias y farmacéuticas que han hecho o harán uso de esta tecnología.
En el presente capítulo se revisarán algunas de las aplicaciones actuales y las perspectivas
futuras de la tecnología del RT PCR.
4.1 Virología
El PCR en tiempo real ha sido extremadamente útil para el estudio de agentes virales
asociados a enfermedades infecciosas y ha ayudado a clarificar en alguna medida los
procesos infectivos de dichas enfermedades. La mayor parte de los ensayos que se
encuentran en la literatura muestran un aumento en la frecuencia de detección de virus
comparándolos con las técnicas tradicionales, lo cual ha hecho más atractivo el uso del RT
PCR en muchas áreas de la virología.
El RT PCR se ha hecho valioso en estudios generales de virología, desde la simple
confirmación de la presencia o ausencia de virus de diferentes enfermedades, o del
monitoreo de la actividad de genes específicos como resultado del crecimiento bajo
condiciones manipuladas. También se puede seguir la entrada alterada o replicación de un
virus causada por la modificación tejido-específica y permite comparar entre replicación
viral y expresión de genes celulares. (Mackay et al., 2002).
EL RT PCR ha mejorado la velocidad y el alcance de la medición de cepas virales y las
diferencias entre títulos de pacientes que muestran diferentes síndromes debidos a
36
Aplicaciones
variaciones del mismo virus. (Furuta et al., 2001). También, los estudios epidemiológicos
han avanzado ya que con la técnica de RT PCR se puede medir con precisión la cantidad
de dos ácidos nucleicos blanco en una sola reacción. El uso de nuevas estrategias
químicas ha permitido una mejor discriminación de múltiples genotipos virales en un solo
recipiente y ha provisto una alternativa a los métodos de detección de virus basados en
ensayos de morbilidad y mortalidad.
El uso del RT PCR ha suministrado datos más profundos sobre el papel de algunos
compuestos que tienen inhibición en la reacción de PCR como también ha dado luz sobre
la eficiencia de diferentes métodos de extracción de ácidos nucleicos de un diverso tipo de
muestras. Esta capacidad de utilizar templados de diversos tipos de muestras, llena un
requerimiento importantísimo para un sistema ideal de detección, que es capaz de aplicar
una tecnología sencilla en muchos campos. Esta flexibilidad se destaca por la detección de
ácidos nucleicos virales, derivados en diferentes formas de plantas, animales, lodos
urbanos, fluido cerebroespinal, cultivo de tejidos, células sanguíneas mononucleares,
plasma, suero, saliva y orina.
También, condiciones críticas como sarcoma, carcinoma, neoplastia cervical intraepitelial
y desórdenes linfoproliferativos pueden ser fácilmente estudiados para investigar
relaciones directas o indirectas con infecciones virales. También, el seguimiento de la
carga viral por técnicas de RT PCR ha sido beneficioso para realizar seguimiento de
pacientes a quienes se les han trasplantado órganos.
Esta tecnología se está convirtiendo en una herramienta esencial en el aseguramiento de
vectores de terapia génica viral antes de su uso en pruebas clínicas. Adicionalmente, el
estudio de virus emergentes ha sido complementado con la técnica de RT PCR como
herramienta para demostrar relaciones existentes entre secuencias virales únicas, señales
clínicas y síntomas de cada paciente.
La velocidad y flexibilidad del RT PCR también ha sido de utilidad para los intereses
comerciales y ha sido usada para la detección de contaminación microbiana en
preparaciones de reactivos producidos a gran escala en sistemas de expresión eucarióticos.
4.2 Microbiología clínica (Costa, J. 2004)
Las aplicaciones del RT PCR en el campo de la microbiología clínica no difieren mucho
de las que utilizan comúnmente las reacciones de PCR convencional. Entre ellas se
37
Aplicaciones
cuentan el diagnóstico etiológico, el control del tratamiento con antimicrobianos y la
caracterización genética de agentes infecciosos. No obstante, es previsible que gracias a
sus indudables ventajas y a la sencillez de su empleo, la RT PCR haya ido reemplazando a
la PCR convencional y que su aplicación se extienda a un número cada vez mayor de
agentes infecciosos, implementándose progresivamente en la rutina asistencial. Algunas
empresas de diagnóstico (Roche Diagnostics, Artus, Abbott, Celera) han hecho ya una
apuesta decidida por la nueva tecnología y tienen disponibles, o los tendrán en breve, kits
para el diagnóstico de los agentes infecciosos de mayor interés comercial mediante
sistemas de PCR a tiempo real (VIH, VHB, VHC, citomegalovirus). Sin embargo, hay
muchas enfermedades infecciosas, con menor interés comercial, en las que el uso de
métodos moleculares de diagnóstico aporta indudables ventajas. La PCR a tiempo real,
combinada con los nuevos sistemas automáticos para la preparación de las muestras,
ofrece una plataforma ideal para el desarrollo de una gran variedad de pruebas
moleculares para la identificación o cuantificación de esos agentes infecciosos. Es el caso
de muchos virus, (familia de los Herpesvirus, virus respiratorios, enterovirus, virus JC,
virus BK, etc.) o de bacterias que no crecen en medios de cultivo como Tropheryma
wippeli, o que crecen mal como Bordetella pertussis o Bartonella o muy lentamente como
Mycobacterium tuberculosis. También, de micosis invasivas, especialmente por
Aspergillus ssp. o de infecciones parasitarias como las ocasionadas por Toxoplasma
gondii en líquido amniótico o en líquido cefalorraquídeo (LCR).
Otro campo potencial de aplicación del RT PCR es en la identificación de organismos
fácilmente cultivables, cuya detección rápida sea beneficiosa por algún motivo. Por
ejemplo, la identificación de Streptococcus del grupo B (S. agalactiae) en frotis vaginales.
La colonización del tracto genital de mujeres parturientas por este agente se relaciona con
un mayor riesgo de infección neonatal grave. El tiempo necesario para el aislamiento de
esta bacteria mediante cultivo es de 1-2 días, mientras que por PCR a tiempo real su
identificación se puede llevar a cabo en 30 min. La reducción del tiempo de diagnóstico
puede mejorar la prevención de esas infecciones en recién nacidos. En otros casos, como
la sepsis, la supervivencia del enfermo puede depender de un diagnóstico precoz del
agente causal que permita establecer el tratamiento antibiótico específico en etapas
tempranas del proceso. Probablemente en pocos años se habrán optimizado protocolos de
38
Aplicaciones
PCR múltiple a tiempo real para la identificación de los 10 o 20 agentes más frecuentes de
la sepsis en unas pocas horas.
Lógicamente, la PCR a tiempo real no va a reemplazar al hemocultivo, porque la sepsis
puede estar ocasionada por una variedad de microorganismos mucho más amplia, pero la
demora en el tratamiento se podrá reducir en un número considerable de casos, lo que sin
duda puede mejorar el pronóstico de este grave proceso.
El éxito de un tratamiento no sólo se basa en un diagnóstico etiológico precoz, sino que en
muchas ocasiones la determinación rápida de la sensibilidad del agente causal a los
fármacos antimicrobianos puede ser determinante. La PCR a tiempo real proporciona
métodos ágiles y sencillos para la identificación de mutaciones puntuales asociadas con
resistencias a fármacos antimicrobianos. Por ejemplo, en apenas una hora se puede
determinar la presencia en heces de enterococos resistentes a vancomicina, facilitando el
control de la transmisión de este patógeno en los centros sanitarios. En los últimos años se
han desarrollado métodos sencillos para la detección rápida de mutaciones asociadas con
resistencias a meticilina en Staphylococcus aureus y a rifampicina y a isoniacida en
Mycobacterium tuberculosis. También se han descrito procedimientos para la
identificación de mutaciones asociadas con resistencia a agentes antivíricos, como la
lamivudina en VHB. Hoy día ya están disponibles kits comerciales para algunas
aplicaciones comentadas en este apartado y en el futuro irán apareciendo muchos otros.
Incluso para las enfermedades infecciosas menos frecuentes están, o estarán disponibles,
protocolos bien optimizados, sencillos y rápidos para que puedan ser implementados en la
rutina asistencial.
No obstante, hay que hacer hincapié en que esta potente metodología sólo será útil si los
laboratorios de microbiología clínica participan en programas de control de calidad bien
definidos por entes gubernamentales.
4.3 Investigación biomédica
Gran parte de los desarrollos alcanzados en la tecnología de RT PCR tuvieron sus inicios
en investigaciones puntuales que llegaron a términos comerciales. Este estudio primario
de diferentes fenómenos asociados a las disciplinas de biomedicina, bioquímica y
biotecnología es necesario tanto en empresas de diagnóstico como en empresas cuyos
departamentos de Investigación y Desarrollo son cruciales para sus futuros desarrollos.
39
Aplicaciones
El RT PCR ha llegado a ser absolutamente común en la investigación básica dentro de las
ciencias biomédicas. Cuando se requieren datos de expresión genética para un proyecto
de investigación, está tecnología puede ser utilizada. Sin embargo, hay usos adicionales
que son particularmente útiles a la investigación básica. El RT PCR se puede utilizar para
genotipificar modelos de tipo knockout, knockin o de ratones transgénicos o para
determinar la eficacia de los métodos en sistemas de células animales o en cultivos
celulares. Con el uso del RT PCR para la discriminación de alelos, la detección de
polimorfismos en un solo nucleótido (SNP), que pueden predisponer a individuos a
enfermedades particulares, puede determinarse en poblaciones, facilitando así los estudios
epidemiológicos.
4.3.1 Validación de los resultados de microarreglos de DNA
Debido a la confiabilidad del PCR en tiempo real, muchos investigadores utilizan el
método de cuantificación relativa o absoluta de la expresión de genes para validar y
corroborar los resultados de los microarreglos de DNA o arreglos de oligonucleotidos
(Por ej: Affymetrix GeneChip). Los microarreglos son usados porque permiten que un
investigador observe de una manera “imparcial” cómo la manipulación experimental
puede afectar algunos de los miles de genes presentes en el microarreglo. Algunos
microarreglos pretenden contener el “genoma entero” de un organismo modelo y pueden
ser así teóricamente probados para determinar cambios en la expresión dentro del
“transcriptoma entero”. El problema es que puede haber artificios, y es difícil conseguir
datos cuantitativos confiables o con poder estadístico adecuado con la actual tecnología de
arreglos. Así muchos investigadores escogen el RT PCR como técnica de soporte para
validar y para cuantificar mejor los genes de interés de sus microarreglos.
4.3.2 Identificación de mutaciones
El RT PCR se ha usado idealmente para el análisis de mutaciones, incluyendo los
polimorfismos de un sólo nucleotido (SNP), substituyendo a menudo otras técnicas tales
como la secuenciación, análisis del polimorfismo conformacional de una sola hebra, y
análisis de polimorfismos de fragmentos de restricción. Para detectar mutaciones en la
secuencia, el análisis de la curva de fusión se hace automáticamente en el producto
40
Aplicaciones
amplificado (amplicon) inmediatamente después del termociclado y de la medición de la
fluorescencia.
Aunque cualquiera de las químicas fluorescentes descritas en el numeral 3.3 de este
documento se puede utilizar para la detección de mutaciones, las sondas de hibridación
son de uso frecuente. Después de que se completa la reacción de PCR, las sondas de
hibridación se unen al amplicón en tándem, permitiendo que la energía fluorescente se
transfiera del donante al aceptor, el cual emite una señal. Como la temperatura de reacción
del recipiente aumenta durante el análisis de la curva de fusión, la sonda donadora se
disociará, dando como resultado una disminución en la fluorescencia. Si hay alguna
mutación en el amplicón (en la región de hibridación), la sonda donadora se unirá menos
fuertemente y disociará a una temperatura más baja. Así las mutaciones pueden ser
detectadas fácilmente observando un cambio en el punto de fusión del producto de PCR.
Este tipo de análisis puede también ser utilizado para genotipificar
organismos
individuales o experimentales (Por ej: discriminación alélica).
4.4 Organismos genéticamente modificados (GMO) (Bustin, 2005)
La aprobación mundial de una gran cantidad de organismos genéticamente modificados
(GMOs), y los requisitos de etiquetado asociados, han dado lugar al desarrollo de métodos
basados en RT PCR para la detección de la presencia de GMOs en alimentos o en aditivos
para los mismos. La detección de organismos genéticamente modificados por RT PCR se
basa en la amplificación paralela del transgen y de un gen endógeno de referencia que
proporciona un control tanto para la pérdida de inhibición como para la capacidad de
amplificar el DNA blanco en la muestra. Además, para los análisis cuantitativos, la
amplificación del gen de referencia proporciona una estimación de la cantidad total de
DNA blanco presente en la muestra. Ubicar el DNA blanco es particularmente apropiado,
debido a la alta estabilidad de esta molécula bajo las condiciones extremas usadas durante
el procesamiento de algunos productos alimenticios.
4.5 Aplicaciones futuras y perspectivas (Valasek et al., 2005)
Cualquier necesidad de medir rápida y exactamente pequeñas de cantidades de ácidos
nucleicos representa un nicho potencial a futuro para las innovaciones basadas en RT
PCR. Ya que las máquinas se vuelven más rápidas, baratas, pequeñas, y más fáciles de
41
Aplicaciones
usar, el desarrollo de ensayos estandarizados, y los avances en microfluidos, la óptica, y
los termocicladores, se podrán cubrir más campos de aplicación. En el sector alimenticio y
la agricultura, la técnica de RT PCR puede probablemente ampliar el uso para detección e
identificación de microorganismos, parásitos u organismos genéticamente modificados.
Las ciencias forenses se pueden beneficiar de la sensibilidad, especificidad, y velocidad
de las técnicas de RT PCR, especialmente porque el tiempo es crucial para muchas
investigaciones criminales y el tamaño de la muestra puede ser limitado. La reducción en
el costo y la disminución en los tamaños de los equipos abren una puerta para el
diagnostico de enfermedades en áreas alejadas junto con los estudios epidemiológicos in
situ y pueden facilitar la transferencia de tecnologías científicas a los países en vías de
desarrollo. Ya que la demanda para medir la expresión genética es poco probable que
disminuya, nuevas generaciones de máquinas para RT PCR deben ser desarrolladas.
Como las computadoras, las primeras generaciones de máquinas deberán ser
relativamente más baratas y por lo tanto se incrementará el acceso global y el aumento de
la tecnología. La enseñanza del RT PCR podrá ser usada como una plataforma para
introducir conceptos claves en biología molecular, así como también una oportunidad para
dar a los estudiantes habilidades científicas relevantes. El RT PCR generará un foco de
atención hacia el transcriptoma, permitiendo a los investigadores entender mejor los
programas transcripcionales que son la base de la fisiología, la patofisiología, y
desarrollo.
La evolución de la ciencia y de la tecnología de la biología molecular puede ser vista
cronológicamente por épocas que están marcadas por la maduración del estudio de
biomoléculas particulares. Básicamente, el análisis del DNA (genómica) fue primero
realizado en el proyecto del genoma humano. Ahora, el análisis de los perfiles de
expresión del RNA (transcriptómica) está alcanzando madurez. El futuro inminente
promete grandes saltos en análisis de las proteínas (proteómica), y en lípidos biológicos o
intermediarios metabólicos (lipómica o metabolómica, respectivamente). Se espera que
los pedazos del rompecabezas biomolecular puedan ser juntados, conduciendo a una
comprensión más holística de la biología. Para formar una figura coherente, sin embargo,
serán necesarios avances paralelos en la adquisición, la compilación, y el análisis de
datos.
42
Trampas del RT-PCR en tiempo real
CAPITULO 5
TRAMPAS DEL RT-PCR EN TIEMPO REAL
La cuantificación de ADN genera datos robustos que son informativos y reproducibles,
esto se debe a que la información contenida dentro del genoma es independiente del
contexto. De forma general, cada célula normal dentro de un organismo contiene la misma
secuencia de ADN, las mismas mutaciones y los mismos polimorfismos. El transcriptoma,
por otra parte, depende altamente del contexto celular y temporal, por lo que la
información que nos brinda es muy variable. Si esto lo combinamos con las limitaciones
técnicas inherentes a cualquier ensayo de RT-PCR en tiempo real, puede ser difícil
obtener resultados que puedan ser interpretados de una manera correcta. La calidad del
templado, la variación entre operadores y la subjetividad en el análisis de los datos son
sólo algunos de los aspectos técnicos que convierten al RT-PCR en tiempo real en una
técnica frágil que puede hacer difícil la correcta interpretación de los datos. Un ejemplo de
ello es la cuantificación de ARNm que proviene de biopsias como las derivadas de
colonoscopías, células aisladas o muestras obtenidas mediante la microdisección por láser,
donde la cantidad de templado es muy baja. Desgraciadamente bajo estas circunstancias la
cuantificación de ARNm por RT-PCR en tiempo real puede ser utilizada de manera
inapropiada para llegar a conclusiones nada comprometidas con la realidad. Por todo esto
existen dudas de que en el futuro, los análisis basados en el transcriptoma se vuelvan
técnicas de rutina (Bustin y Nolan, 2004b).
5.1. Calidad del ARN
Anteriormente hemos destacado que la calidad del ARN templado es el factor más
importante para obtener resultados de relevancia biológica. Muchas muestras, en especial
las biopsias de tejido humano, son únicas, y por ende deben ser tratadas con extremo
cuidado, desde su colección, transporte y almacenamiento. Debe existir alta rigurosidad
43
en los protocolos de extracción de ARN, el cual es extremadamente delicado. Un
templado adecuado para una reacción de RT-PCR en tiempo real debe cumplir con los
siguientes criterios:
1-Debe estar libre de ADN, especialmente si el templado es un gen sin intrones
2-No deben copurificar inhibidores de la reversotranscripción
3- La preparación debe estar libre de nucleasas para un almacenamiento adecuado
Existen muchos componentes dentro de la sangre y los tejidos que inhiben los ensayos de
RT-PCR. La sangre de los mamíferos en cantidades tan pequeñas como al 1% v/v inhibe a
la Taq polimerasa (Panaccio y Lew, 1991). El ácido húmico, polímero componente de las
muestras extraídas de suelo, inhibe las reacciones de PCR (Zhou et al., 1996), así como el
calcio proveniente de los alimentos (Rossen et al., 1992). Las drogas terminadoras de
cadena como el Aciclovir son también inhibidores de la Taq polimerasa, lo que lleva a
obtener resultados que son falsos negativos en determinados pacientes (Yedidag et al.,
1996). Algunos componentes de los medios de cultivo y de los agentes de extracción de
ácidos nucleicos, e incluso los palillos de madera utilizados para picar colonias
bacterianas, son algunos de los inhibidores más comunes de las reacciones de PCR (Lee et
al., 1995). Otros inhibidores son altamente específicos, como los provenientes del
músculo esquelético, los cuales frenan a la Taq polimerasa pero no a la polimerasa aislada
de Thermus thermophilus (Belec et al., 1998).
5.2. Detección no específica
En estos métodos se utilizan agentes intercalantes del ADN de doble cadena como el
SYBR Green (Ishiguro et al., 1995), el cual se adiciona a la mezcla de reacción y, aunque
no es específico, es muy utilizado para cuantificar ADN si el PCR se combina con curvas
de disociación que permitan evaluar la calidad del producto de reacción (Ririe et al.,
1997). Los ensayos que utilizan intercalantes del ADN que fluorescen tienen dos ventajas
respecto a los que se basan en sondas específicas:
1- Pueden incorporarse a protocolos optimizados que utilizan los mismos primers y
las mismas condiciones experimentales.
2- Son mucho más baratos.
Estas características convierten a los agentes intercalantes del ADN en herramientas útiles
para los primeros pasos en la optimización de las técnicas de PCR en tiempo real, por
44
ejemplo, para determinar si existe alguna interacción entre los primers mediante el
análisis de curvas de disociación o para explorar de forma preliminar la técnica de
detección de múltiples amplicones antes de utilizar un ensayo basado en sondas
fluorescentes específicas.
Entre las desventajas de la detección no específica se encuentra la unión indiscriminada
hacia cualquier estructura de doble cadena, lo que produce fluorescencia en el control sin
templado debido a su unión a los dímeros de primers. Un segundo problema es que las
curvas de disociación para analizar la calidad del producto obtenido son absolutamente
necesarias, lo cual incrementa la complejidad de los análisis. Un tercer problema es que
muchas de estas moléculas son capaces de unirse a una sola molécula de amplicón, por lo
que la intensidad de la señal fluorescente luego de la radiación dependerá del tamaño del
ADN de doble cadena. Si asumimos similares eficiencias de amplificación, el PCR en
tiempo real de un templado más largo generará una mayor señal fluorescente.
5.3. Detección específica
El análisis específico de los templados requiere el diseño y la síntesis de una o varias
sondas fluorescentes. Algunas sondas pueden ser utilizadas además para realizar curvas de
disociación, lo cual provee otro nivel de control para el producto de la reacción. La mayor
ventaja de estas sondas es que aseguran un segundo paso de especificidad, la cual ya no
sólo radica en los primers utilizados. Los artefactos de la amplificación que pueden
ocurrir debido a un mal funcionamiento de los primers o a la formación de dímeros entre
ellos no genera señal fluorescente, lo cual obvia la necesidad de realizar un Southern Blot,
curvas de disociación o la secuenciación del producto luego del ensayo de PCR para
confirmar la identidad del amplicón. Las sondas además pueden ser marcadas con
diferentes fluoróforos, lo cual permite la detección simultánea de varios productos de
amplificación en una misma reacción de PCR (multiplexing). Dentro de las desventajas
del uso de sondas específicas se encuentra paradójicamente la no detección de los
artefactos que ocurren, los cuales siempre disminuyen la eficiencia del ensayo. Debido a
esto se hace necesario utilizar los fluoróforos intercalantes del ADN de doble cadena para
optimizar el tipo de primers a utilizar y las condiciones de la reacción, y de esta forma,
asegurarnos de que no ocurran apareamientos anómalos. El uso de las sondas específicas
es además costoso, cada templado requiere de su sonda particular, incrementando mucho
el costo en los ensayos de multiplexing.
45
5.4 Linearidad del paso de reversotranscripción
La primera etapa de las reacciones de RT-PCR puede llevarse a cabo utilizando tres tipos
de primers ADNc diferentes: al azar, oligo-dT o primers específicos por el templado, los
cuales difieren significativamente entre sí respecto a la cantidad de ADNc que se obtiene.
Es necesario puntualizar además que la temperatura de desnaturalización de los primers al
azar y de los oligo-dT está muy por debajo de la temperatura óptima de funcionamiento de
las reversotranscriptasas termoestables, por lo que al ser utilizados deben preincubarse
previamente con el ARN a bajas temperaturas o deben ser modificados químicamente. La
compañía Ambion demostró que la reversotranscripción a partir de muestras biológicas
puede ocurrir aún sin la adición exógena de primers, dado que en los tejidos existen
primers internos. Esto por supuesto conlleva a una alteración de los resultados en el paso
de PCR posterior. El uso de primers al azar produce varios ADNc a partir de un templado
de ARN, por lo que este método es, por definición, no específico. Sin embargo rinde la
mayor cantidad de ADNc, lo cual es decisivo en la identificación de transcriptos que se
encuentran en bajas cantidades. Se ha demostrado que los hexámeros al azar pueden
sobreestimar la cantidad de templado hasta en 19 veces respecto a los primers secuenciaespecíficos (Zhang and Byrne, 1999), además de que la mayoría del ADNc sintetizado
proviene del ARN ribosomal. La síntesis de ADNc utilizando oligo-dT es más específica
para el ARNm y es capaz de amplificar ARNm con estructuras secundarias significativas.
Debido a que el uso de los oligo-dT requiere de ARN de alta calidad, no se utilizan en los
casos en que el ARN se fragmenta, como el obtenido por microdisección con láser.
Los primers específicos por el templado de ARN constituyen la opción más sensible de
cuantificación (Lekanne et al., 2002). La relación lineal Ct vs cantidad de templado en una
reacción de RT-PCR en tiempo real utilizando oligonucleótidos específicos es más
amplia que para los ensayos donde se utilizan primers al azar, lo cual se ilustra muy bien
en la figura 5.1.
46
Fig. 5.1.
El poder analítico del RT-PCR también depende de la eficiencia de conversión de ARN a
ADNc, lo cual recae sobre la enzima utilizada. Por otro lado, debe considerarse otro factor
importante conocido como el efecto “Monte Carlo”, una limitación inherente a toda
técnica de PCR donde se quiera amplificar un templado que se encuentran en pequeñas
cantidades formando parte de una mezcla compleja (Karrer et al., 1995). La eficiencia de
la amplificación entre templados individuales dentro de una población de ADNc depende
de su concentración: cada uno tiene una cierta probabilidad de ser amplificado o ignorado
una vez que sobrepasa cierto rango de dilución. Una explicación a este fenómeno puede
ser el considerar que la hibridación de los primers con cada molécula de templado en cada
ciclo de PCR es un evento azaroso. Bajo condiciones de exceso de primers, la
probabilidad de hibridación depende de la temperatura de hibridación, el tiempo y el
número de templados disponibles. Si la cantidad de templado es limitante y se encuentra
dentro de una mezcla compleja, disminuirá la eficiencia de su amplificación debido a que
47
la probabilidad de hibridación con el primer será menor. Si estas diferencias ocurren
durante la fase exponencial de la amplificación, el reporte de la concentración final de ese
templado en particular será completamente errónea.
5.5 Análisis de los datos
El parámetro Ct se ha convertido en el más utilizado para realizar cuantificaciones
utilizando la técnica de RT-PCR en tiempo real. Anteriormente explicamos que el ciclo
umbral (Ct) se define como el ciclo donde la fluorescencia excede un valor umbral
“escogido” por encima del ruido de fondo. Aquí la palabra crítica es “escogido”, dado que
el ruido de fondo no es un valor absoluto y también se ve influenciado por las condiciones
de la reacción. Muchas veces, los valores de Ct no son indicativos de una amplificación
genuina, y en otros casos, una verdadera amplificación no provee un valor de Ct
significativo. Este último caso se da cuando el número de ciclos que determinan el ruido
de fondo se “escogen” de forma incorrecta, a partir de los cuales se establece la línea
umbral de fluorescencia. Normalmente, estos ciclos son los primeros antes de que el
producto de PCR se acumule de forma significativa al inicio de la fase exponencial, y
suelen ser del 3 al 15 (AB Prism 7700) o del 5 al 9 (instrumentos de Stratagene),
dependiendo del equipo. Muchas veces, la línea base de fluorescencia que se determina en
el experimento no es la apropiada para cada pozo de reacción. Un ejemplo de esto se
muestra en la figura 5.2, donde se muestra una comparación de dos curvas de
amplificación que tienen valores de ΔRn similares (0.023 vs 0.02) pero sólo uno de ellos
rebasa la línea umbral y da una respuesta positiva. Esto se debe a que la fluorescencia
verde se mantiene constante desde las primeras etapas del ensayo de PCR y comienza a
incrementarse a partir del mismo nivel de la fluorescencia umbral, sin embargo, la
fluorescencia representada por la línea roja sufre un descenso significativo de 0.015
unidades, por lo que el aumento de fluorescencia en la fase exponencial de amplificación
no rebasa la línea umbral. Este fenómeno puede darse por diferencias en la sensibilidad
química de los fluoróforos a los múltiples cambios de temperatura que ocurren
normalmente en toda reacción de PCR. Aquí no podemos decir que no ocurre
amplificación en el ensayo representado por el fluoróforo rojo, sino que es necesario
realizar un ajuste de la línea basal donde se incluya el ciclo donde la línea roja presenta la
menor fluorescencia (de 3 a 32 y no de 3 a 15 como estaba previamente determinada), lo
48
cual se traduce en valores de Ct similares para ambos fluoróforos. Una analogía útil es la
comparación entre la altura que alcanzan dos personas al saltar: sólo podemos compararlo
si ambas saltan desde el mismo nivel.
Fig. 5.2
49
5.6 El nivel umbral
El nivel umbral calculado por los equipos de PCR en tiempo real depende de la línea basal
y generalmente se predetermina para corridas estandarizadas. Sin embargo, este nivel
puede cambiarse en dependencia de las condiciones del ensayo y siempre debe estar
relacionado con el ΔRn más bajo y el más alto valor de Ct asociados con el menor número
de copias del templado. Es muy importante puntualizar dos aspectos relacionados con la
selección del nivel umbral:
1- No es necesario utilizar un mismo nivel umbral para cada corrida. Una misma corrida
puede ser analizada con múltiples valores umbrales y son referidas como “ventana de
valores dentro de un rango umbral” (Applied Biosystems).
2- El nivel umbral siempre debe interceptar la fase exponencial del ploteo de
amplificación. Si los valores de Ct son muy altos y los de ΔRn son muy bajos, claramente
no nos encontramos en una región definida de la fase exponencial, en cuyo caso hay que
ajustar el nivel umbral.
La utilización de múltiples niveles umbrales para el cálculo de Ct es la excepción, pero
muchas veces resulta necesario para cuantificar muestras que difieren mucho en cuanto a
la cantidad inicial de templado (Fig.5.3). Muchas veces existe tan poco ARNm que la
disminución del umbral conlleva a que el control de la reacción sin templado (NTC)
también arroje un resultado positivo. La interpretación de este resultado ha sido objeto de
numerosos debates. La situación es clara cuando por ejemplo, tenemos valores de Ct para
las muestras de 18 a 25 cuando el NTC tiene un valor de Ct de 39. No obstante el hecho
de que el NTC haya arrojado un resultado positivo (haya alcanzado el nivel de
fluorescencia umbral) debe ser resaltado en cualquier publicación. Cuando los valores de
Ct están por debajo de 30, es muy probable que exista contaminación en el laboratorio.
La situación es diferente cuando los niveles de Ct para la muestra y el NTC son
comparables, lo que normalmente ocurre con bajos niveles de templado. Cuando
analizamos múltiples muestras y sólo uno de los replicados tiene un valor positivo de Ct,
la muestra puede estar contaminada. Se recomienda siempre utilizar dos pozos para los
NTC: uno que debe ser sellado antes de la adición de las muestras, los controles positivos
y los estándares y el otro debe ser sellado al final para así detectar cualquier
contaminación si hay diferencias significativas entre los valores de Ct de ambos NTCs.
50
Fig. 5.3. A. Curva de amplificación donde el nivel umbral seleccionado de 0.12 no detecta resultados
claramente positivos. B. La reducción manual de la línea umbral permite tomar en cuenta los resultados
positivos de Ct para todas las muestras, donde también se incluye ahora el NTC (morado).
51
Conclusiones
CONCLUSIONES
Como hemos visto a través de todo este trabajo, la técnica de PCR en tiempo real es
altamente poderosa y puede generar resultados reproducibles con significado biológico.
Sin embargo, está más que demostrado que hay que tomar muchas precauciones durante
la planeación, la ejecución del ensayo y el análisis e interpretación de los resultados. En el
futuro será necesario introducir nuevos estándares y reportar todo el procedimiento para
establecer guías confiables que puedan validar los resultados experimentales y que sean
utilizadas por los editores para la revisión rigurosa de las publicaciones. En resumen, el
PCR en tiempo real es una técnica que debe ser tratada con respeto.
52
Referencias bibliográficas
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reacción en cadena de la polimerasa

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