Rheumatoid Factor IgM - NovaTec Immundiagnostica GmbH

Rheumatoid Factor IgM - NovaTec Immundiagnostica GmbH

NovaLisaTM
Rheumatoid Factor IgM
ELISA
Enzyme immunoassay for the quantitative determination of IgM Rheumatoid Factor in human serum or
plasma
Enzymimmunoassay zur quantitativen immunenzymatischen Bestimmung von IgM Rheumafaktoren in
Humanserum oder Plasma
Enzimoinmunoensayo para la determinación cuantitativa de IgM Factor Reumatoideo en suero o plasma
humano
Only for in-vitro diagnostic use
English:
Deutsch:
Espanol
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bis 13
a 19
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Bibliography / Literatur / Bibliographie /
Bibliografia / Bibliografía
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Symbols Key / Symbolschlüssel /
Explication des symboles / Legenda / Símbolos
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23
Summary of Test Procedure / Kurzanleitung
Testdurchführung / Résumé de la procedure de test /
Schema della procedura / Resumen de la técnica
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24
________________________________________________________________
Product Number: RFM3010 (96 Determinations)
________________________________________________________________
ENGLISH
1. INTRODUCTION
Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic relapsing inflammatory arthritis usually affecting multiple joints with a varying
degree of systemic involvement. RA is a highly variable disease that can range from a mild illness of brief duration to a
progressive destructive polyarthritis associated with systemic vasculitis. It is estimated that RA affects 0.5 % to 1 % of the
population worldwide and is two to three times more common in females than in males. The prevalence of RA increases
with age, peaking at 35-45 years of age.
The etiology of RA is not fully understood. Evidence points to a complex interplay between environmental and genetic
factors. The main genetic risk factor of RA is a certain form of the HLA-DR (human leukocyte antigen, subtype DR) allele.
Untreated, RA leads to bone erosion, cartilage damage, joint destruction, functional limitation and severe disability, and
has a significant impact on health-related quality of life.
Joint destruction in RA begins within a few weeks of symptom onset; early treatment decreases the rate of disease
progression. Therefore, early diagnosis and suitable therapy are of decisive importance for the prognosis of RA.
Therapeutic goals include preservation of function and quality of life, minimization of pain and inflammation, joint
protection, and control of systemic complications.
A characteristic of RA is the presence of certain autoantibodies collectively known as rheumatoid factors (RF).
Rheumatoid factors are a subset of antiglobulins with antibody activity directed against antigenic sites in the Fc region of
immunoglobin G. They exist as IgA-, IgG- and IgM-isotypes, with IgM and IgG being the most common. Rheumatoid
factors have been reported to occur in around 70-80 % of patients diagnosed with RA. They may occur early in the
disease and can even precede the development of clinical manifestations by several years.
The concentration of RF tends to be highest when the disease peaks and tends to decrease during prolonged remission.
However, these factors are not unique to RA. Positive RF test results may also be seen in healthy people and in people
with viral infections and a number of other diseases such as: infectious mononucleosis, endocarditis, tuberculosis,
syphilis, liver disease, sarcoidosis and systemic lupus erythematosus.
Therefore, the diagnosis cannot be made by laboratory tests alone. Clinical exams, X-rays and abnormal laboratory
values (RF, erythrocyte sedimentation rate, C-reactive protein, anti-CCP) are used to determine a diagnosis of
rheumatoid arthritis and assess treatment effectiveness.
The presence of rheumatoid factors may be detected by latex agglutination, nephelometry and several quantitative
immunoassays, e. g. radioimmunoassays and ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay).
2. INTENDED USE
The Rheumatoid Factor IgM ELISA is intended for the quantitative determination of IgM rheumatoid factors in human
serum or plasma (citrate).
3. PRINCIPLE OF THE ASSAY
The quantitative immunoenzymatic determination of IgM rheumatoid factors is based on the ELISA (Enzyme-linked
Immunosorbent Assay) technique.
Microtiter strips are precoated with Fc fragments of human immunoglobulin G to bind corresponding antibodies of the
specimen. After washing the wells to remove all unbound sample material horseradish peroxidase (HRP) labelled antihuman IgM conjugate is added. This conjugate binds to the captured rheumatoid factors. The immune complex formed by
the bound conjugate is visualized by adding Tetramethylbenzidine (TMB) substrate which gives a blue reaction product.
The intensity of this product is proportional to the amount of IgM rheumatoid factors in the specimen. Sulphuric acid is
added to stop the reaction. This produces a yellow endpoint colour. Absorbance at 450 nm is read using an ELISA
microwell plate reader.
4. MATERIALS
4.1. Reagents supplied
Fc Fragment Coated Wells: 12 breakapart 8-well snap-off strips coated with Fc fragments of human
immunoglobulin G; in resealable aluminium foil.
Sample Diluent***: 1 bottle containing 100 ml of buffer for sample dilution; pH 7.2 ± 0.2, coloured yellow; ready to
use; white cap.
Stop Solution: 1 bottle containing 15 ml sulphuric acid, 0.2 mol/l; ready to use; red cap.
Washing Solution (20x conc.)*: 1 bottle containing 50 ml of a 20-fold concentrated buffer for washing the wells;
pH 7.2 ± 0.2; white cap.
Rheumatoid Factor anti-IgM Conjugate**: 1 bottle containing 20 ml of peroxidase labelled antibodies to human
IgM; coloured red; ready to use; black cap.
TMB Substrate Solution: 1 bottle containing 15 ml 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB); ready to use; yellow cap.
Rheumatoid Factor IgM Negative Control***: 1 bottle containing 2 ml control solution; coloured yellow; ready to
use; blue cap.
2
Rheumatoid Factor IgM Positive Control***: 1 bottle containing 2 ml control solution; coloured yellow; ready to
use; red cap.
Rheumatoid Factor IgM Standards***: 6 vials, each containing 2 ml; coloured yellow; ready to use; yellow cap:
Standard A:
Standard B:
Standard C:
Standard D:
Standard E:
Standard F:
*
**
***
0
3
10
30
100
300
IU/ml
IU/ml
IU/ml
IU/ml
IU/ml
IU/ml
contains 0.1 % Bronidox L after dilution
contains 0.2 % Bronidox L
contains 0.1 % Kathon
4.2. Materials supplied
1 Strip holder
1 Cover foil
1 Test protocol
1 Distribution and identification plan
4.3. Materials and Equipment needed
ELISA microwell plate reader, equipped for the measurement of absorbance at 450/620 nm
Incubator 37 °C
Manual or automatic equipment for rinsing wells
Pipettes to deliver volumes between 10 and 1000 µl
Vortex tube mixer
Deionised or (freshly) distilled water
Disposable tubes
Timer
5. STABILITY AND STORAGE
The reagents are stable up to the expiry date stated on the label when stored at 2...8 °C.
6. REAGENT PREPARATION
It is very important to bring all reagents, samples and standards to room temperature (20…25 °C) before
starting the test run!
6.1. Coated Snap-off Strips
The ready to use breakapart snap-off strips are coated with Fc fragments of human immunoglobulin G. Store at 2…8 °C.
Immediately after removal of strips, the remaining strips should be resealed in the aluminium foil along with the desiccant
supplied and stored at 2…8 °C; stability until the expiry date.
6.2. Rheumatoid Factor anti-IgM Conjugate
The bottle contains 20 ml of a solution with anti-human IgM horseradish peroxidase, buffer, stabilizers, preservatives and
an inert red dye. The solution is ready to use. Store at 2…8 °C. After first opening stability until the expiry date when
stored at 2…8 °C.
6.3. Rheumatoid Factor IgM Controls
The bottles labelled with Negative and Positive Control contain a ready to use control solution.
Negative Control:
Positive Control:
< 5 IU/ml
> 20 IU/ml
It contains 0.1 % Kathon and has to be stored at 2...8 °C. After first opening stability until the expiry date when stored at
2…8 °C.
6.4. Rheumatoid Factor IgM Standards
The vials labelled with Standard A, B, C, D, E and F contain a ready to use standard solution calibrated in accordance
with the 1st British Standard 64/002. The standards have the following concentrations in international units (IU/ml):
Standard A:
Standard B:
Standard C:
Standard D:
Standard E:
Standard F:
0
3
10
30
100
300
IU/ml
IU/ml
IU/ml
IU/ml
IU/ml
IU/ml
3
The solutions have to be stored at 2…8 °C and contain 0.1 % Kathon. After first opening stability until the expiry date
when stored at 2…8 °C.
6.5. Sample Diluent
The bottle contains 100 ml phosphate buffer, stabilizers, preservatives and an inert yellow dye. It is used for the dilution of
the patient specimen. This ready to use solution has to be stored at 2…8 °C. After first opening stability until the expiry
date when stored at 2…8 °C.
6.6. Washing Solution (20x conc.)
The bottle contains 50 ml of a concentrated buffer, detergents and preservatives. Dilute washing solution 1 + 19; e. g.
10 ml Washing Solution + 190 ml fresh and germ free redistilled water. The diluted buffer will keep for 5 days if stored at
room temperature. Crystals in the solution disappear by warming up to 37 °C in a water bath. After first opening stability
until the expiry date when stored at 2…8 °C.
6.7. TMB Substrate Solution
The bottle contains 15 ml of a tetramethylbenzidine/hydrogen peroxide system. The reagent is ready to use and has to be
stored at 2...8 °C, away from the light. The solution should be colourless or could have a slight blue tinge. If the substrate
turns into blue, it may have become contaminated and should be thrown away. After first opening stability until the expiry
date when stored at 2…8 °C.
6.8. Stop Solution
The bottle contains 15 ml 0.2 M sulphuric acid solution (R 36/38, S 26). This ready to use solution has to be stored at
2…8 °C. After first opening stability until the expiry date.
7. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
Use human serum or plasma (citrate) samples with this assay. If the assay is performed within 5 days after sample
collection, the specimens should be kept at 2…8 °C; otherwise they should be aliquoted and stored deep-frozen (-20…
-70 °C). If samples are stored frozen, mix thawed samples well before testing. Avoid repeated freezing and thawing.
Heat inactivation of samples is not recommended.
7.1. Sample Dilution
Before assaying, all samples should be diluted 1 + 100 with Sample Diluent. Dispense 10 µl sample and 1 ml Sample
Diluent into tubes to obtain a 1 + 100 dilution and thoroughly mix with a Vortex.
8. ASSAY PROCEDURE
8.1. Test Preparation
Please read the test protocol carefully before performing the assay. Result reliability depends on strict adherence to the
test protocol as described. If performing the test on ELISA automatic systems we recommend increasing the washing
steps from three to five and the volume of Washing Solution from 300 µl to 350 µl to avoid washing effects. Prior to
commencing the assay, the distribution and identification plan for all specimens and standards should be carefully
established on the result sheet supplied in the kit. Select the required number of microtiter strips or wells and insert them
into the holder.
Please allocate at least:
1 well
6 wells
1 well
1 well
(e. g. A1)
(e. g. B1, C1, etc.)
(e. g. H1)
(e. g. A2)
for the substrate blank,
for Standard A, B, C, D, E and F,
for the Negative Control
and
for the Positive Control
It is recommended to determine standards, controls and patient samples in duplicate.
Perform all assay steps in the order given and without any appreciable delays between the steps.
A clean, disposable tip should be used for dispensing each standard, control and sample.
Adjust the incubator to 37 ± 1 °C.
1.
Dispense 100 µl of each Standard (A, B, C, D, E and F), controls and diluted samples into their respective
wells. Leave well A1 for the substrate blank.
2.
Cover wells with the foil supplied in the kit.
3.
Incubate for 30 min at 37 ± 1 °C.
4.
When incubation has been completed, remove the foil, aspirate the content of the wells and wash each well
three times with 300 µl of Washing Solution. Avoid overflows from the reaction wells. The soak time between
each wash cycle should be > 5 sec. At the end carefully remove remaining fluid by tapping strips on tissue
paper prior to the next step!
Note: Washing is critical! Insufficient washing results in poor precision and falsely elevated absorbance values.
4
5.
Dispense 100 µl Rheumatoid Factor anti-IgM Conjugate into all wells except for the blank well (e. g. A1). Cover
with foil.
6.
Incubate for 30 min at room temperature (20…25 °C). Do not expose to direct sunlight.
7.
Repeat step 4.
8.
Dispense 100 µl TMB Substrate Solution into all wells.
9.
Incubate for exactly 15 min at room temperature (20…25 °C) in the dark.
10. Dispense 100 µl Stop Solution into all wells in the same order and at the same rate as for the TMB Substrate
Solution.
Any blue colour developed during the incubation turns into yellow.
11. Measure the absorbance of the specimen at 450/620 nm within 30 min after addition of the Stop Solution.
8.2. Measurement
Adjust the ELISA Microwell Plate Reader to zero using the substrate blank in well A1.
If – due to technical reasons – the ELISA reader cannot be adjusted to zero using the substrate blank in well A1, subtract
the absorbance value of well A1 from all other absorbance values measured in order to obtain reliable results!
Measure the absorbance of all wells at 450 nm and record the absorbance values for each control and patient sample in
the distribution and identification plan.
Dual wavelength reading using 620 nm as reference wavelength is recommended.
Where applicable calculate the mean absorbance values of all duplicates.
9. RESULTS
9.1. Assay Validation Criteria
In order for an assay to be considered valid, the following criteria must be met:
Substrate blank
in A1:
Absorbance < 0.100
Standard A
in B1:
Absorbance < 0.200
Standard B
in C1:
Absorbance > Standard A
Standard C
in D1:
Absorbance > Standard B
Standard D
in E1:
Absorbance > 0.100
Standard E
in F1:
Absorbance > 0.400
Standard F
in G1:
Absorbance > 1.000
Negative Control
in H1:
Result < 5 IU/ml
Positive Control
in A2:
Result > 20 IU/ml
Standard A < Standard B < Standard C < Standard D < Standard E < Standard F
If these criteria are not met, the test is not valid and must be repeated.
9.2. Calculation of Results
In order to obtain quantitative results in IU/ml plot the (mean) absorbance values of the Standards A – F (y-axis, linear)
on graph paper in a system of coordinates against their corresponding concentrations (x-axis, logarithmic) and draw a
standard calibration curve.
Read results from this standard curve employing the (mean) absorbance values of each patient specimen and control.
All suitable computer programs available can be used for automated result reading and calculation.
5
9.3. Typical Calibration Curve
2,5
2
OD
1,5
1
0,5
0
0,1
1
10
100
1000
RF IgM (IU/ml)
9.4. Interpretation of Results
Normal value ranges for this ELISA should be established by each laboratory based on its own patient populations in the
geographical areas serviced.
The following values should be considered as a guideline:
negative:
grey zone:
positive:
< 10
10 - 15
> 15
IU/ml
IU/ml
IU/ml
Positive results should be verified concerning the entire clinical status of the patient.
10. SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS
10.1. Precision
Intraassay
n
Mean (OD)
CV (%)
Pos Serum
Pos. Serum
Neg. Serum
24
24
24
1.170
2.127
0.216
1.0
2.1
2.0
Interassay
n
Mean (IU/ml)
CV (%)
Pos. Serum
Pos. Serum
12
12
33.7
148.6
5.3
6.4
10.2. Diagnostic Specificity
The diagnostic specificity is defined as the probability of the assay of scoring negative in the absence of the specific
analyte. It is 94.1 %.
10.3. Diagnostic Sensitivity
The diagnostic sensitivity is defined as the probability of the assay of scoring positive in the presence of the specific
analyte. It is 98.0 %.
10.4. Analytical Sensitivity
The analytical sensitivity – defined as the apparent concentration of the analyte that can be distinguished from the zero
calibrator – is < 0.5 IU/ml.
10.5. Interferences
Interferences with hemolytic, lipemic or icteric sera are not observed up to a concentration of 10 mg/ml hemoglobin,
5 mg/ml triglycerides and 0.5 mg/ml bilirubin.
11. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of the specimen may affect the absorbance values. Any clinical
diagnosis should not be based on the results of in vitro diagnostic methods alone. A precise diagnosis should take into
consideration clinical history, symptomatology as well as serological data.
In immunocompromised patients and newborns serological data only have restricted value.
6
12. PRECAUTIONS AND WARNINGS
In compliance with article 1 paragraph 2b European directive 98/79/EC the use of the in vitro diagnostic medical
devices is intended by the manufacturer to secure suitability, performances and safety of the product. Therefore the
test procedure, the information, the precautions and warnings in the instructions for use have to be strictly followed.
The use of the testkits with analyzers and similar equipment has to be validated. Any change in design, composition
and test procedure as well as for any use in combination with other products not approved by the manufacturer is
not authorized; the user himself is responsible for such changes. The manufacturer is not liable for false results and
incidents for these reasons. The manufacturer is not liable for any results by visual analysis of the patient samples.
Only for in-vitro diagnostic use.
All components of human origin used for the production of these reagents have been tested for anti-HIV antibodies,
anti-HCV antibodies and HBsAg and have been found to be non-reactive. Nevertheless, all materials should still be
regarded and handled as potentially infectious.
Do not interchange reagents or strips of different production lots.
No reagents of other manufacturers should be used along with reagents of this test kit.
Do not use reagents after expiry date stated on the label.
Use only clean pipette tips, dispensers, and lab ware.
Do not interchange screw caps of reagent vials to avoid cross-contamination.
Close reagent vials tightly immediately after use to avoid evaporation and microbial contamination.
After first opening and subsequent storage check conjugate and control vials for microbial contamination prior to
further use.
To avoid cross-contamination and falsely elevated results pipette patient samples and dispense conjugate without
splashing accurately to the bottom of wells.
The NovaLisa™ ELISA is only designed for qualified personnel who are familiar with good laboratory practice.
WARNING:
WARNING:
In the used concentration Bronidox L has hardly any toxicological risk upon contact with skin and
mucous membranes!
Sulphuric acid irritates eyes and skin. Keep out of the reach of children. Upon contact with the eyes,
rinse thoroughly with water and consult a doctor!
12.1. Disposal Considerations
Residues of chemicals and preparations are generally considered as hazardous waste. The disposal of this kind of waste
is regulated through national and regional laws and regulations. Contact your local authorities or waste management
companies which will give advice on how to dispose hazardous waste.
13. ORDERING INFORMATION
Prod. No.:
RFM3010
Rheumatoid Factor IgM ELISA (96 Determinations)
7
DEUTSCH
1. EINLEITUNG
Die Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch rezidivierende entzündliche Arthritis meist mehrerer Gelenke, mit
unterschiedlichem Ausmaß an systemischer Beteiligung. Die Erkrankung ist höchst variabel und kann von einem milden
Verlauf und kurzer Dauer bis zu fortschreitender destruktiver Polyarthritis mit systemischer Gefäßentzündung reichen.
Man schätzt, dass 0,5 % bis 1 % der Bevölkerung weltweit betroffen sind, wobei Frauen zwei- bis dreimal häufiger
erkranken als Männer. Die Prävalenz der RA steigt mit dem Alter an und erreicht bei 35-45 Lebensjahren ihren
Höchststand.
Die Krankheitsursache der RA ist nicht vollständig aufgeklärt. Es deutet jedoch alles darauf hin, dass es sich um ein
komplexes Zusammenspiel von Umwelteinflüssen und genetischen Faktoren handelt. Der wichtigste genetische
Risikofaktor für RA ist eine bestimmte Form des HLA-DR (human leukocyte antigen, Subtyp DR) Allels.
Unbehandelt führt RA zu Knochenabbau, Knorpelschäden, Gelenkzerstörung, funktioneller Beeinträchtigung und
schwerer Behinderung und hat einen beträchtlichen Einfluss auf die gesundheitsbezogene Lebensqualität. Die
Gelenkzerstörung beginnt innerhalb weniger Wochen nach Auftreten der Symptome, wobei ein frühzeitiger
Behandlungsbeginn das Fortschreiten der Erkrankung verlangsamt. Daher sind eine möglichst frühe Diagnose und eine
geeignete Therapie von entscheidender Bedeutung für die Verlaufsprognose. Therapieziele umfassen den Erhalt von
Funktion und Lebensqualität, die Minimierung von Schmerzen und Entzündung, den Gelenkschutz und die Kontrolle
systemischer Komplikationen.
Ein Charakteristikum der rheumatoiden Arthritis ist die Anwesenheit bestimmter Autoantikörper, der sogenannten
Rheumafaktoren (RF). Rheumafaktoren sind ein Subtyp von Antiglobulinen mit Antikörper-Aktivität, die gegen antigene
Bereiche in der Fc-Region von Immunglobulin G gerichtet sind. Sie kommen in Form von IgA-, IgG- und IgM-Isotypen vor,
wobei IgM und IgG am häufigsten vertreten sind. Nachweisbar sind sie bei etwa 70-80 % der Patienten mit
diagnostizierter RA. Rheumafaktoren können früh im Krankheitsverlauf erscheinen und dem Auftreten klinischer
Symptome sogar um mehrere Jahre vorausgehen. Ihre Konzentration tendiert zu Höchstwerten, wenn die Krankheit ihren
Höhepunkt erreicht und sinkt während längerfristiger Remission eher ab. Allerdings sind Rheumafaktoren nicht spezifisch
für RA. Sie können auch bei Gesunden und Menschen mit viralen Infektionen und einer Reihe anderer Erkrankungen wie
infektiöser Mononucleose, Endocarditis, Tuberkulose, Syphilis, Lebererkrankungen, Sarcoidose und systemischem Lupus
erythematosus auftreten.
Daher kann die Diagnose rheumatoide Arthritis nicht allein aufgrund von Labortests gestellt werden. Klinische und
Röntgenuntersuchungen sowie abnormale Laborwerte (RF, Erythrozytensedimentationsrate, C-reaktives Protein, antiCCP) dienen dazu, die Diagnose zu sichern und die Wirksamkeit einer Therapie zu beurteilen.
Rheumafaktoren können durch Latex-Agglutination, Nephelometrie und verschiedene quantitative ImmunoassayVerfahren, z. B. Radioimmunoassays und ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) nachgewiesen werden.
2. VERWENDUNGSZWECK
Der Rheumatoid Factor IgM-ELISA ist für den quantitativen Nachweis von IgM Rheumafaktoren in humanem Serum oder
Plasma (Citrat) bestimmt.
3. TESTPRINZIP
Die quantitative immunenzymatische Bestimmung von IgM Rheumafaktoren beruht auf der ELISA (Enzyme-linked
Immunosorbent Assay)-Technik.
Mikrotiterstreifen als solide Phase sind mit Fc-Fragmenten von humanem IgG beschichtet. Vorhandene Rheumafaktoren
in der Probe binden an die immobilisierten Antigene der Mikrotiterplatte. Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierte antihuman-IgM Antikörper binden an Antigen-Antikörperkomplexe in positiven Proben. Die entstandenen Immunkomplexe
werden durch Blaufärbung nach Inkubation mit Tetramethylbenzidin (TMB)-Substratlösung nachgewiesen. Stoppen der
enzymatischen Reaktion mit Schwefelsäure führt zu einem Farbumschlag von blau zu gelb, der einfach nachgewiesen
und mit einem ELISA-Reader bei 450 nm gemessen werden kann.
4. MATERIALIEN
4.1. Mitgelieferte Reagenzien
Fc-Fragment beschichtete Mikrotiterstreifen: 12 teilbare 8er-Streifen, beschichtet mit Fc-Fragmenten von
humanem IgG; in wieder verschließbarem Aluminiumbeutel.
Probenverdünnungspuffer***: 1 Flasche mit 100 ml Puffer zur Probenverdünnung; pH 7,2 ± 0,2; gelb gefärbt;
gebrauchsfertig; weiße Verschlusskappe.
Stopplösung: 1 Flasche mit 15 ml Schwefelsäure, 0,2 mol/l, gebrauchsfertig; rote Verschlusskappe.
Waschlösung (20x konz.)*: 1 Flasche mit 50 ml eines 20-fach konzentrierten Puffers zum Waschen der Kavitäten;
pH 7,2 ± 0,2; weiße Verschlusskappe.
Rheumafaktor anti-IgM Konjugat**: 1 Flasche mit 20 ml Peroxidase-konjugierten Antikörpern gegen humanes
IgM; rot gefärbt; gebrauchsfertig; schwarze Verschlusskappe.
TMB-Substratlösung: 1 Flasche mit 15 ml 3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidin (TMB); gebrauchsfertig; gelbe
Verschlusskappe.
8
Rheumafaktor IgM Negativ-Kontrolle***: 1 Fläschchen mit 2 ml Kontrolllösung; gelb gefärbt; gebrauchsfertig;
blaue Verschlusskappe.
Rheumafaktor IgM Positiv-Kontrolle***: 1 Fläschchen mit 2 ml Kontrolllösung; gelb gefärbt; gebrauchsfertig; rote
Verschlusskappe.
Rheumafaktor IgM Standards***: 6 Fläschchen, je 2 ml, gelb gefärbt, gebrauchsfertig; gelbe Verschlusskappe:
Standard A:
Standard B
Standard C:
Standard D:
Standard E:
Standard F:
*
**
***
0
3
10
30
100
300
IU/ml
IU/ml
IU/ml
IU/ml
IU/ml
IU/ml
enthält 0,1 % Bronidox L nach Verdünnung
enthält 0,2 % Bronidox L
enthält 0,1 % Kathon
4.2. Mitgeliefertes Zubehör
1 selbstklebende Abdeckfolie
1 Rahmenhalter
1 Arbeitsanleitung
1 Ergebnisblatt
4.3. Erforderliche Materialien und Geräte
Photometer mit Filtern 450/620 nm
Feuchtkammer/Brutschrank mit Thermostat
Manuelle oder automatische Waschvorrichtung
Mikropipetten mit Einmalspitzen (10 - 1000 µl)
Vortex-Mischer
Plastikröhrchen für den einmaligen Gebrauch
Röhrchen-Ständer
Aqua dest.
Timer
5. STABILITÄT UND LAGERUNG
Testkit bei 2...8 °C lagern. Die Reagenzien nicht nach den angegebenen Verfalldaten verwenden. Die Verfalldaten sind
jeweils auf den Flaschenetiketten und auf dem Außenetikett angegeben.
6. VORBEREITUNG DER REAGENZIEN
Alle Reagenzien und Proben sind vor ihrer Verwendung auf Raumtemperatur (20...25 °C) zu bringen!
6.1. Beschichtete Streifen
Die abbrechbaren Streifen sind mit Fc-Fragmenten von humanem IgG beschichtet. Die gebrauchsfertigen Vertiefungen
sind bei 2...8 °C aufzubewahren. Nichtverbrauchte Vertiefungen im Aluminiumbeutel zusammen mit dem Trockenmittel
sofort wieder verschließen und bei 2...8 °C lagern. Haltbarkeit bis zum angegebenen Verfalldatum.
6.2. Rheumafaktor anti-IgM Konjugat
Das Fläschchen enthält 20 ml einer Lösung von anti-human IgM-Meerrettichperoxidase, Puffer, Stabilisatoren,
Konservierungsmittel und einen inerten roten Farbstoff. Die gebrauchsfertige Lösung ist bei 2...8 °C aufzubewahren.
Nach dem ersten Öffnen haltbar bis zum angegebenen Verfalldatum (bei 2...8 °C).
6.3. Rheumafaktor IgM Kontrollen
Die Fläschchen mit Negativ- und Positiv-Kontrolle enthalten jeweils 2 ml gebrauchsfertige Kontrolllösung.
Negativ-Kontrolle:
Positiv-Kontrolle:
< 5 IU/ml
> 20 IU/ml
Die gebrauchsfertigen Lösungen sind bei 2...8 °C aufzubewahren und enthalten 0,1 % Kathon. Nach dem ersten Öffnen
haltbar bis zum angegebenen Verfalldatum (bei 2...8 °C).
9
6.4. Rheumafaktor IgM Standards
Die Fläschchen mit Nullstandard A und Standards B, C, D, E und F enthalten je 2 ml gebrauchsfertige Standardlösung,
kalibriert gemäß dem „1st British Standard 64/002“. Die Konzentrationen der Standards in internationalen Einheiten
(IU/ml) sind:
Standard A:
Standard B:
Standard C:
Standard D:
Standard E:
Standard F:
0
3
10
30
100
300
IU/ml
IU/ml
IU/ml
IU/ml
IU/ml
IU/ml
Die gebrauchsfertigen Lösungen sind bei 2…8 °C aufzubewahren und enthalten 0,1 % Kathon. Nach dem ersten Öffnen
haltbar bis zum angegebenen Verfalldatum (bei 2...8 °C).
6.5. Probenverdünnungspuffer
Die Flasche enthält 100 ml Phosphatpuffer, Stabilisatoren, Konservierungsmittel und einen inerten gelben Farbstoff. Die
gebrauchsfertige Lösung ist bei 2...8 °C aufzubewahren. Die Lösung wird für die Verdünnung der Proben eingesetzt.
Nach dem ersten Öffnen haltbar bis zum angegebenen Verfalldatum (bei 2...8 °C).
6.6. Waschlösung (20x konz.)
Die Flasche enthält 50 ml konzentrierten Puffer, Detergenzien und Konservierungsmittel. Der Inhalt wird auf einen Liter
mit Aqua dest. verdünnt (1 + 19). Der verdünnte Puffer ist bei Raumtemperatur 5 Tage haltbar. Die Waschlösung wird
zum Waschen der Streifen eingesetzt. Sollte eine Kristallisation im Konzentrat auftreten, die Waschlösung auf 37 °C
erwärmen und vor dem Verdünnen gut mischen. Nach dem ersten Öffnen, Konzentrat haltbar bis zum angegebenen
Verfalldatum (bei 2...8 °C).
6.7. TMB-Substratlösung
Das Fläschchen enthält 15 ml eines Tetramethylbenzidin/Wasserstoffperoxidgemisches. Die gebrauchsfertige Lösung ist
bei 2...8 °C vor Licht geschützt aufzubewahren. Die Lösung ist leicht hellblau. Sollte die TMB-Substratlösung dunkelblau
sein, ist sie kontaminiert und kann nicht im Test verwendet werden. Nach dem ersten Öffnen haltbar bis zum
Verfalldatum bei sachgerechter Lagerung von 2…8 °C.
6.8. Stopplösung
Das Fläschchen enthält 15 ml 0,2 M Schwefelsäure (R36/38, S26). Die gebrauchsfertige Lösung ist bei 2...8 °C
aufzubewahren. Nach dem ersten Öffnen haltbar bis zum angegebenen Verfalldatum (bei 2...8 °C).
7. ENTNAHME UND VORBEREITUNG DER PROBEN
Es sollten humane Serum- oder Plasmaproben (Citrat) verwendet werden. Werden die Bestimmungen innerhalb von 5
Tagen nach Blutentnahme durchgeführt, können die Proben bei 2...8 °C aufbewahrt werden, sonst tiefgefrieren (-70...
-20 °C). Wieder aufgetaute Proben vor dem Verdünnen gut schütteln. Wiederholtes Tiefgefrieren und Auftauen
vermeiden!
Hitzeinaktivierung der Proben wird nicht empfohlen.
7.1. Probenverdünnung
Proben vor Testbeginn im Verhältnis 1 + 100 mit Probenverdünnungspuffer verdünnen, z. B. 10 µl Probe und 1 ml
Probenverdünnungspuffer in die entsprechenden Röhrchen pipettieren, um eine Verdünnung von 1 + 100 zu erhalten; gut
mischen (Vortex).
8. TESTDURCHFÜHRUNG
8.1. Testvorbereitung
Gebrauchsinformation vor Durchführung des Tests sorgfältig lesen. Für die Zuverlässigkeit der Ergebnisse ist es
notwendig, die Arbeitsanleitung genau zu befolgen. Die folgende Testdurchführung ist für die manuelle Methode validiert.
Beim Arbeiten mit ELISA Automaten empfehlen wir, um Wascheffekte auszuschließen, die Zahl der Waschschritte von
drei auf fünf und das Volumen der Waschlösung von 300 µl auf 350 µl zu erhöhen. Vor Testbeginn auf dem mitgelieferten
Ergebnisblatt die Verteilung bzw. Position der Patientenproben und Standards auf den Mikrotiterstreifen genau festlegen.
Die benötigte Anzahl von Mikrotiterstreifen (Kavitäten) in den Streifenhalter einsetzen.
Hierbei mindestens
1 Vertiefung
6 Vertiefungen
1 Vertiefung
1 Vertiefung
(z. B. A1)
(z. B. B1, C1, etc.)
(z. B. H1)
(z. B. A2)
für den Substratleerwert (Blank),
für die Standards A, B, C, D, E und F,
für die Negativ-Kontrolle und
für die Positiv-Kontrolle
Prinzipien der Qualitätssicherung in der Laboratoriumsmedizin erfordern zur höheren Sicherheit für Kontrollen und
Patientenproben mindestens Doppelbestimmungen.
10
Den Test in der angegebenen Reihenfolge und ohne Verzögerung durchführen.
Für jeden Pipettierschritt der Standards, Kontrollen und Proben saubere Einmalspitzen verwenden.
Den Brutschrank auf 37 ± 1 °C einstellen.
1.
Je 100 µl Standard A, B, C, D, E und F und vorverdünnte Proben in die entsprechenden Vertiefungen
pipettieren. Vertiefung A1 ist für den Substratleerwert vorgesehen.
2.
Die Streifen mit der mitgelieferten Abdeckfolie bedecken.
3.
30 min bei 37 ± 1 °C inkubieren.
4.
Am Ende der Inkubationszeit Abdeckfolie entfernen und die Inkubationsflüssigkeit aus den Teststreifen
absaugen. Anschließend dreimal mit 300 µl Waschlösung waschen. Überfließen von Flüssigkeit aus den
Vertiefungen vermeiden. Das Intervall zwischen Waschen und Absaugen sollte mindestens 5 sec betragen.
Nach dem Waschen die Teststreifen mit den Öffnungen nach unten kurz auf Fließpapier ausklopfen, um die
restliche Flüssigkeit zu entfernen.
Beachte:
Der Waschvorgang ist wichtig, da unzureichendes Waschen zu schlechter Präzision und
falsch erhöhten Messergebnissen führt!
5.
100 µl Rheumafaktor anti-IgM Konjugat in alle Vertiefungen, mit Ausnahme der für die Berechnung des
Leerwertes vorgesehenen, pipettieren. Mit Folie abdecken.
6.
30 min bei Raumtemperatur (20...25 °C) inkubieren. Nicht dem direkten Sonnenlicht aussetzen.
7.
Waschvorgang gemäß Punkt 4 wiederholen.
8.
100 µl TMB-Substratlösung in alle Vertiefungen pipettieren.
9.
Genau 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur (20...25 °C) inkubieren.
10. In alle Vertiefungen 100 µl Stopplösung in der gleichen Reihenfolge und mit den gleichen Zeitintervallen wie bei
Zugabe der TMB-Substratlösung pipettieren.
Während der Inkubation gebildete blaue Farbe schlägt nach gelb um.
11. Die Extinktion der Lösung in jeder Vertiefung bei 450/620 nm innerhalb von 30 min nach Zugabe der
Stopplösung messen.
8.2. Messung
Mit Hilfe des Substratleerwertes (Blank) in A1 den Nullabgleich des Mikrotiterplatten-Photometers (ELISA-Readers)
vornehmen.
Falls diese Eichung aus technischen Gründen nicht möglich ist, muss nach der Messung der Extinktionswert der Position
A1 von allen anderen Extinktionswerten abgezogen werden, um einwandfreie Ergebnisse zu erzielen!
Extinktion aller Kavitäten bei 450 nm messen und die Messwerte der Standards und Proben in das Ergebnisblatt
eintragen.
Eine bichromatische Messung mit der Referenzwellenlänge 620 nm wird empfohlen.
Falls Doppel- oder Mehrfachbestimmungen durchgeführt wurden, den Mittelwert der Extinktionswerte berechnen.
9. BERECHNUNG DER ERGEBNISSE
9.1. Testgültigkeitskriterien
Der Test wurde richtig durchgeführt, wenn er folgende Kriterien erfüllt:
Substrat-Leerwert
Standard A
Standard B
Standard C
Standard D
Standard E
Standard F
Negativ-Kontrolle
Positiv-Kontrolle
in A1:
in B1:
in C1:
in D1:
in E1:
in F1:
in G1:
in H1:
in A2:
Extinktion < 0,100
Extinktion < 0,200
Extinktion > Standard A
Extinktion > Standard B
Extinktion > 0,100
Extinktion > 0,400
Extinktion > 1,000
Ergebnis < 5 IU/ml
Ergebnis > 20 IU/ml
Standard A < Standard B < Standard C < Standard D < Standard E < Standard F
Sind diese Kriterien nicht erfüllt, ist der Testlauf ungültig und muss wiederholt werden.
9.2. Messwertberechnung
Um quantitative Ergebnisse in IU/ml zu erhalten, werden die OD-Mittelwerte der Standards A - F auf der y-Achse
(linear) gegen die entsprechenden Rheumafaktor IgM Konzentrationen (x-Achse, logarithmisch) aufgetragen.
Daraus wird eine Standardkurve erstellt, aus der sich über die Extinktionsmittelwerte die jeweiligen Konzentrationen der
Kontrollen und Patientenproben in IU/ml direkt ablesen lassen.
Im Handel erhältliche Auswertungsprogramme ermöglichen eine automatische Erstellung der Standardkurve und
Kalkulation der Ergebnisse.
11
9.3. Typische Standardkurve
2,5
2
OD
1,5
1
0,5
0
0,1
1
10
100
1000
RF IgM (IU/ml)
9.4. Interpretation der Ergebnisse
Normwert-Bereiche für diesen ELISA sollten, basierend auf dem entsprechenden Patientenkollektiv im jeweiligen
Einzugsgebiet, individuell von jedem Labor erstellt werden.
Folgende Angaben gelten als Richtlinien:
negativ:
< 10 IU/ml
Grauzone:
10 - 15 IU/ml
positiv:
> 15 IU/ml
Positive Ergebnisse sollten mit dem kompletten Krankheitsbild des Patienten abgeglichen werden.
10. TESTMERKMALE
10.1. Präzision
Intraassay
n
Pos. Serum
Pos. Serum
Neg. Serum
24
24
24
Interassay
n
Pos. Serum
Pos. Serum
12
12
Mittelwert (OD)
Vk (%)
1,170
2,127
0,216
Mittelwert (IU/ml)
1,0
2,1
2,0
Vk (%)
33,7
148,6
5,3
6,4
10.2. Diagnostische Spezifität
Die diagnostische Spezifität ist definiert als die Wahrscheinlichkeit des Tests, ein negatives Ergebnis bei Fehlen des
spezifischen Analyten zu liefern. Sie ist 94,1 %.
10.3. Diagnostische Sensitivität
Die diagnostische Sensitivität ist definiert als die Wahrscheinlichkeit des Tests, ein positives Ergebnis bei Vorhandensein
des spezifischen Analyten zu liefern. Sie beträgt 98,0 %.
10.4. Analytische Sensitivität
Die analytische Sensitivität entspricht der niedrigsten messbaren Konzentration des Analyten, die vom Nullstandard
unterschieden werden kann. Sie ist < 0,5 IU/ml.
10.5. Interferenzen
Hämolytische, lipämische und ikterische Proben ergaben bis zu einer Konzentration von 10 mg/ml für Hämoglobin, von
5 mg/ml Triglyceride und von 0,5 mg/ml für Bilirubin keine Interferenzen im vorliegenden ELISA.
Hinweis: Die Ergebnisse beziehen sich auf die untersuchten Probenkollektive; es handelt sich nicht um garantierte
Spezifikationen.
11. GRENZEN DES VERFAHRENS
Kontamination der Proben durch Bakterien oder wiederholtes Einfrieren und Auftauen können zu einer Veränderung der
Messwerte führen. Zur Diagnosestellung müssen zusätzlich zu den Laborbefunden anamnestische Daten sowie die
Symptomatologie des Patienten berücksichtigt werden.
Bei Immunsupprimierten und Neugeborenen besitzen die Ergebnisse serologischer Tests nur einen begrenzten Wert.
12
12. SICHERHEITSMASSNAHMEN UND WARNHINWEISE
Gemäß Art. 1 Abs. 2b der EU-Richtlinie 98/79/EG legt der Hersteller die Zweckbestimmung von In-vitro-Diagnostika
fest, um deren Eignung, Leistung und Sicherheit sicherzustellen. Daher sind die Testdurchführung, die Information,
die Sicherheitsmaßnahmen und Warnhinweise in der Gebrauchsanweisung strikt zu befolgen. Bei Anwendung des
Testkits auf Diagnostika-Geräten ist die Testmethode zu validieren. Jede Änderung am Aussehen, der
Zusammensetzung und der Testdurchführung sowie jede Verwendung in Kombination mit anderen Produkten, die
der Hersteller nicht autorisiert hat, ist nicht zulässig; der Anwender ist für solche Änderungen selbst verantwortlich.
Der Hersteller haftet für falsche Ergebnisse und Vorkommnisse aus solchen Gründen nicht. Auch für falsche
Ergebnisse aufgrund von visueller Auswertung wird keine Haftung übernommen.
Nur für in-vitro-Diagnostik.
Alle verwendeten Bestandteile menschlichen Ursprungs sind auf Anti-HIV-AK, Anti-HCV-AK und HBsAG nichtreaktiv getestet. Dennoch sind alle Materialien als potentiell infektiös anzusehen und entsprechend zu behandeln.
Reagenzien und Mikrotiterplatten unterschiedlicher Chargen nicht untereinander austauschen.
Keine Reagenzien anderer Hersteller zusammen mit den Reagenzien dieses Testkits verwenden.
Nicht nach Ablauf des Verfalldatums verwenden.
Nur saubere Pipettenspitzen, Dispenser und Labormaterialien verwenden.
Verschlusskappen der einzelnen Reagenzien nicht untereinander vertauschen.
Flaschen sofort nach Gebrauch fest verschließen, um Verdunstung und mikrobielle Kontamination zu vermeiden.
Nach dem ersten Öffnen Konjugat- und Standardfläschchen vor weiterem Gebrauch auf mikrobielle Kontamination
prüfen.
Zur Vermeidung von Kreuzkontamination und falsch erhöhten Resultaten Patientenproben und Konjugat sorgfältig
in die Kavitäten pipettieren.
Der NovaLisa™ ELISA ist nur für die Anwendung durch Fachpersonal vorgesehen, welches die Arbeitstechniken
einwandfrei beherrscht.
WARNUNG:
WARNUNG:
Bronidox L zeigt in der verwendeten Konzentration nahezu keine toxikologischen Risiken an Haut
bzw. Schleimhaut.
Schwefelsäure reizt Augen und Haut! Nach Berührung mit den Augen gründlich mit Wasser spülen
und einen Arzt aufsuchen.
12.1. Entsorgungshinweise
Chemikalien und Zubereitungen sind in der Regel Sonderabfälle. Deren Beseitigung unterliegt den nationalen
abfallrechtlichen Gesetzen und Verordnungen. Die zuständige Behörde informiert über die Entsorgung von
Sonderabfällen.
13. BESTELLINFORMATIONEN
Produktnummer:
RFM3010
Rheumatoid Factor IgM ELISA (96 Bestimmungen)
13
ESPANOL
1. INTRODUCCIÓN
La artritis reumatoide (AR) es una artritis inflamatoria crónica recurrente que suele afectar múltiples articulaciones con un
grado variable de compromiso sistémico. La AR es una enfermedad muy variable que puede ir desde una enfermedad
leve de corta duración a una poliartritis destructiva progresiva asociada con vasculitis sistémica. Se estima que la AR
afecta a 0,5% a 1% de la población en todo el mundo y es de dos a tres veces más común en mujeres que en hombres.
La prevalencia de la AR aumenta con la edad, alcanzando un máximo de 35 a 45 años de edad.
La etiología de la AR no se entiende completamente. La evidencia apunta a una compleja interacción entre factores
ambientales y genéticos. El principal factor de riesgo genético de la AR es una cierta forma del alelo HLA-DR (antígeno
leucocitario humano, subtipo DR).
Si no se trata, la AR conduce a erosión ósea, daño del cartílago, destrucción de las articulaciones, limitación funcional y
discapacidad severa, y tiene un impacto significativo en la calidad de la vida.
La destrucción de las articulaciones en la AR comienza a las pocas semanas de inicio de los síntomas; un tratamiento
temprano disminuye la tasa de progresión de la enfermedad. Por lo tanto, el diagnóstico precoz y el tratamiento
adecuado son de importancia decisiva para el pronóstico de la AR. Los objetivos terapéuticos incluyen la preservación
de la función y la calidad de vida, la minimización del dolor y la inflamación, protección de las articulaciones, y el control
de las complicaciones sistémicas.
Una característica de AR es la presencia de ciertos autoanticuerpos conocidos colectivamente como factores
reumatoides (FR). Los factores reumatoides son un subconjunto de antiglobulinas con actividad de anticuerpos dirigidos
contra sitios antigénicos en la región Fc de inmunoglobulina G. Existen isotipos como IgA, IgG e IgM, siendo IgM e IgG
las más comunes. Se han reportado factores reumatoides en alrededor del 70-80% de los pacientes diagnosticados con
AR. Pueden ocurrir al comienzo de la enfermedad e incluso puede preceder al desarrollo de manifestaciones clínicas por
varios años.
La concentración de FR tiende a ser más alta en los picos de la enfermedad y tiende a disminuir durante la remisión
prolongada. Sin embargo, estos factores no son exclusivos de la AR. Resultados positivos en las pruebas de FR también
pueden ser vistos en personas sanas y en personas con infecciones virales y en una serie de otras enfermedades tales
como: mononucleosis infecciosa, endocarditis, tuberculosis, sífilis, enfermedad hepática, sarcoidosis y lupus eritematoso
sistémico.
Por lo tanto, el diagnóstico no se puede solo hacer mediante pruebas de laboratorio. Exámenes clínicos, rayos X y
valores anormales de laboratorios (FR, velocidad de sedimentación globular, proteína C-reactiva, anti-CCP) se utilizan
para determinar el diagnóstico de la artritis reumatoide y evaluar la efectividad del tratamiento.
La presencia de factores reumatoides puede ser detectada por aglutinación de látex, nefelometría y varios
inmunoensayos cuantitativos, por ejemplo, radioinmunoensayos y ELISA (Ensayo inmunoenzimáti.
2. USO PREVISTO
El enzimoinmunoensayo se utiliza para la determinación cuantitativa de IgM Factor Reumatoideo en suero o plasma
(citrato) humano.
3. PRINCIPIO DEL ENSAYO
La determinación inmunoenzimatica cuantitativa de IgM Factor Reumatoideo se basa en la técnica ELISA (Enzymelinked Immunosorbent Assay).
Las tiras de micropocillos que se usan como fase sólida están recubiertas con FC fragmentos de inmunoglobulina
humana G. Los anticuerpos existentes en la muestra se unen a los antígenos inmovilizados de la placa de
microtítulación. El conjugado de anticuerpos IgM anti humano con peroxidasa de rábano, se une con los complejos
antígeno-anticuerpo en muestras positivas. Estos complejos inmunológicos desarrollan una coloración azul después de
incubarlos con sustrato de tetrametilbenzidina (TMB). Finalmente se añade ácido sulfúrico para detener la reacción,
causando un cambio de coloración de azul a amarillo. La densidad óptica se mide con un lector de ELISA a 450 nm.
4. MATERIALES
4.1. Reactivos suministrados
Microtiras recubiertas con FC fragmentos: 12 tiras de 8 pocillos rompibles, recubiertos con FC fragmentos de
inmunoglobulina humana G, en bolsa de aluminio.
Diluyente de la muestra***: 1 botella de 100 ml de solución de tampón para diluir la muestra; pH 7.2 ± 0.2; color
amarillo; listo para ser utilizado; tapa blanca.
Solución de parada: 1 botella de 15 ml de ácido sulfúrico, 0.2 mol/l, listo para ser utilizado; tapa roja.
Solución de lavado (20x conc.)*: 1 botella de 50 ml de una solución de tampón 20x concentrado para lavar los
pocillos; pH 7.2 ± 0.2; tapa blanca.
Conjugado Factor Reumatoideo IgM anti-humano**: 1 botella de 20 ml de conjugado de anticuerpos IgM antihumano con peroxidasa; color rojo; tapa negra; listo para ser utilizado.
Solución de sustrato de TMB: 1 botella de 15 ml 3,3’,5,5’-tetrametilbenzindina (TMB); listo para ser utilizado; tapa
amarilla.
14
Control negativo de IgM**: 1 botella de 2 ml control; color amarillo; tapa azul; listo para ser utilizado.
Control positivo de IgM***: 1 botella de 2 ml control; color amarillo; tapa roja; listo para ser utilizado.
Soluciónes de estandar (Factor Reumatoideo)***: 6 botellas de 2 ml, color amarillo, tapa amarilla,
listas para ser utilizadas:
Estandar A:
Estandar B:
Estandar C:
Estandar D:
Estandar E:
Estandar F:
*
**
***
0
3
10
30
100
300
IU/ml
IU/ml
IU/ml
IU/ml
IU/ml
IU/ml
contiene 0.1% de Bronidox L después de diluir
contiene 0.2% Bronidox L
contiene 0.1% Catón
4.2. Accesorios suministrados
1 lámina autoadhesiva
1 soporte
1 hoja de instrucciones
1 hoja de resultados
4.3. Materiales e instrumentos necesarios
4.2. Materiales suministrados
1 Soporte para tiras
1 Lámina sellante
1 Protocolo de procesamiento
1 Plan de distribución e identificación
4.3. Materiales y equipos necesarios
Lector de ELISA equipado para medir absorbancia a 450/620 nm
Incubadora a 37°C
Equipo manual o automático para el lavado de los pozos
Pipetas de 10 – 1000 µl
Vórtex para mezclar los tubos
Agua destilada o desionizada
Tubos de plástico desechables
Temporizador
5. ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO
Los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta cuando se almacenan a 2...8 °C.
6. PREPARACION DE LOS REACTIVOS
¡Es muy importante que tenga todos los reactivos, muestras y patrones a temperatura ambiente (20…25 °C) antes de
iniciar la ejecución de la prueba!
6.1. Tiras recubiertas rompibles
Las tiras vienen listas para ser usadas y se rompen para separar los pozos están recubiertas con FC fragmentos de
inmunoglobulina humana G.. Inmediatamente después de retirar las tiras que va a utilizar, asegúrese de guardar las tiras
que no van a ser usados dentro de la bolsa de aluminio resellable junto con el desecante suministrado y almacenarla a
una temperatura entre 2...8 °C; las tiras son estables hasta la fecha de caducidad.
6.2. Conjugado Factor Reumatoideo IgM anti-humano
El frasco contiene 15 ml de una solución anticuerpos de IgM anti-humano conjugada con peroxidasa de rábano, contiene
un tampón, estabilizantes, conservantes y un colorante rojo inerte. La solución está lista para usar. Conservar entre
2 ... 8° C.
6.3. Controles Factor Reumatoideo IgM
Las botellas de los controles contienen de solución de control listas para ser utilizadas.
Control Negativo
< 5 IU/ml
Control Positivio
> 20 IU/ml
Las soluciones tienen que estar almacenadas de 2...8° C y contienen 0.1 % de Catón. Después de la primera abertura, el
producto se conserva hasta la fecha de caducidad si esta almacenado de 2...8°C.
15
6.4. Estándares Factor Reumatoideo IgM
Las botellas de estándar contienen un solución de estándar lista para ser utilizada. Las concentraciones en unidades
internacionales (IU) de los estandares (calibrados de acuerdo con el "1st British Standard 64/002) son
Estandar A:
Estandar B:
Estandar C:
Estandar D:
Estandar E:
Estandar F:
0
3
10
30
100
300
IU/ml
IU/ml
IU/ml
IU/ml
IU/ml
IU/ml
Las soluciones tienen que estar almacendas de 2...8° C y contienen 0.1 % de Catón. Después de la primera apertura, el
producto se conserva hasta la fecha de caducidad si esta almacenado entre 2...8°C.
6.5. Tampón de dilución para la muestra
La botella contiene 100 ml de tampón de fosfato, estabilizadores, conservantes y un colorante amarillo inerte. La solución
se usa para diluir las muestras. La solución lista para ser utilizada ha de almacenarse entre 2...8°C. Después de la
primera abertura, el producto se conserva hasta la fecha de caducidad si esta almacenado de 2...8°C.
6.6. Solución para lavar (20x conc.)
El frasco contiene 50 ml de buffer concentrado, detergentes y preservativos. Diluir la solución de lavado 1 + 19; ej: 10 ml
de solución de lavado + 190 de agua destilada fresca y libre de gérmenes. La dilución de a solución de lavado es estable
por 5 días a temperatura ambiente. Los cristales en la solución de lavdo desaparecer por el calentamiento hasta 37 °C
en un baño de agua. Después de la primera abertura, el producto se conserva hasta la fecha de caducidad si esta
almacenado de 2...8°C.
6.7. Solución de TMB
El frasco contiene 15 ml de un sistema de tetrametilbencidina/peróxido de hidrógeno. El reactivo está listo para ser
usado y debe ser almacenado a 2...8 °C en oscuridad. La solución debe estar incolora o puede tener un ligero tinte azul.
Si el sustrato se torna azul, esto indica que puede haberse contaminado y por lo tanto debe desecharse. Después de la
primera abertura, el producto se conserva hasta la fecha de caducidad si esta almacenado de 2...8°C.
6.8. Solución de parada
La botella contiene 15 ml de 0.2 M de ácido sulfúrico (R36/38, S26). La solución lista para ser utilizada se tiene que
almacenar entre 2...8°C. Después de la primera abertura, el producto se conserva hasta la fecha de caducidad si esta
almacenado de 2...8°C.
7. RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
Use suero humano o plasma (citrato) como muestras en este ensayo. Si el ensayo se realiza dentro de los 5 días
después de la recolección de la muestras, estas deben mantenerse a 2 ... 8° C, de lo contrario deben ser almacenados
en alícuotas y congelarse (-20 ...-70° C). Si las muestras se almacenan congeladas, estas deben descongeladas y se
deben mezclar bien antes de la prueba. Evite congelar y descongelar repetidamente. La inactivación térmica de las
muestras no se recomienda.
7.1. Dilución de las muestras
Antes del ensayo, las muestras tienen que estar diluidas en relación 1+100 con el tampón de dilución para la muestra
p.e. 10 µl de la muestra con 1 ml de tampón, mezclar bien con la mezcladora Vortex.
8. PROCEDIMIENTO
8.1. Preparación para la prueba
Por favor, lea detenidamente el protocolo de la prueba antes de realizar el ensayo. La confiabilidad de los resultados
depende del seguimiento estricto del protocolo de la prueba tal cual se describe en el inserto. Si se realiza la prueba de
ELISA en sistemas automáticos se recomienda aumentar el volumen de la solución de lavado de 300 µl a 350 µl para
evitar efectos del lavado. Antes de comenzar el ensayo, se debe establecer cuidadosamente la distribución e
identificación de las muestras y los estándares en la hoja de resultados suministrada con el kit. Seleccione el número
necesario de tiras de microtitulación o pozos e insértelos en el soporte.
Por favor, destinar al menos:
1 pozo (por ejemplo, A1)
6 pozos (por ejemplo B1, C1, etc)
1 pozo (por ejemplo H1)
1 pozo (por ejemplo A2)
para el blanco
para el estándar A, B, C, D, E, y F
para el control negativo y
para el control positivo
Se recomienda determinar los estándares, control y muestras por duplicado.
Realice todos los pasos del ensayo en el orden indicado y sin retrasos apreciables entre los pasos.
16
Debe usar una punta desechable limpia para la dosificación de cada estándar y cada muestra.
Ajuste la incubadora a 37 ± 1 °C
1.
Agregue 100 µl de cada estándar (A, B, C, D, E, F), controles y muestras en sus respectivos pozos. Deje el
pozo A1 libre para el blanco del substrato.
2.
Cubra todos los pozos con el sellante que viene en el kit.
3.
4.
Incube durante 30 min. a 37° C ± 1° C
Cuando se complete el tiempo de incubación, retire la lámina sellante, aspire el contenido de los pozos y lave
cada pozo tres veces con 300 µl de solución de lavado diluida. Evite desbordamientos entre los pozos de
reacción. El tiempo de remojo entre cada ciclo de lavado debe ser >5 seg. ¡Al finalizar, retire con cuidado el
líquido sobrante golpeando las tiras sobre una toalla de papel antes de seguir al siguiente paso!
Nota:
5.
¡El lavado es crítico! Un lavado insuficiente resulta en una mala precisión y valores de absorbancia
falsamente elevados.
6.
Pipetar 100 µl de Conjugado Factor Reumatoideo IgM anti-humano en cada pocillo con excepción del blanco.
Cubrir con una lámina adhesiva.
Incubar 30 min a la temperatura ambiente (20…25°C). Evitar la luz solar directa.
7.
Repetir el lavado como en el paso numero 4.
8.
9.
Agregue 100 µl de solución de sustrato TMB en todos los pozos.
Incube durante exactamente 15 minutos a temperatura ambiente (20...25 °C) en oscuridad.
10. Pipetear en todos los pocillos 100 µl de la solución de parada en el mismo orden y mismo intervalo de tiempo
como con el sustrato de TMB. Toda coloración azul formada durante la incubación se convierte en amarilla.
11. Mida la absorbancia de la muestra a 450/620 nm durante los siguientes 30 minutos después de haber
adicionado la solución de parada.
8.2. Lectura
Ajuste el lector de placas de micropozos de ELISA a cero usando el pozo blanco A1.
Si - por razones técnicas - el lector de ELISA no se puede ajustar a cero con el blanco del substrato en el pozo A1, restar
el valor de absorbancia del pocillo A1 a todos los valores de absorbancia de otras medidas con el fin de obtener
resultados fiables!
Mida la absorbancia de todos los pozos a 450 nm y registre los valores de absorbancia para cada estándar y muestra de
paciente indicado en el plan de distribución e identificación.
Es aconsejable la medición bicromática a una longitud de onda de referencia de 620 nm.
Cuando sea necesario, calcule la absorbancia media de los duplicados.
9. CALCULO DE LOS RESULTADOS
El ensayo es válido si se cumplen los siguientes criterios:
Blanco del substrato
Estándar A
Estándar B
Estándar C
Estándar D
Estándar E
Estándar F
Control Negativo
Control Positivo
Absorbancia
Absorbancia
Absorbancia
Absorbancia
Absorbancia
Absorbancia
Absorbancia
Resultado
Resultato
En A1:
En B1:
En C1:
En D1:
En E1:
En F1:
En G1:
En H1
En A2
< 0.100
< 0.200
> Estándar A
> Estándar B
> 0.100
> 0.400
> 1.000
< 5 IU/ml
> 20 IU/ml
Estándar A < Estándar B < Estándar C < Estándar D < Estándar E < Estándar F
Si estos criterios no se cumplen a prueba no es válida y debe repetirse.
9.2. Cálculo de resultados
Con el fin de obtener resultados cuantitativos en IU/ ml la media de los valores de la absorbancia de los estándares A F (eje Y) en papel cuadriculado se interpola contra de sus correspondientes concentraciones (eje x), y se dibuje una
curva de calibración.
Lea los resultados de esta curva empleando los valores de absorbancia (media) de cada muestra de paciente.
Todos los programas informáticos disponibles adecuados se puede utilizar para la lectura automatizada de resultados y
el cálculo.
17
9.3. Típica curva de Calibración
2,5
2
OD
1,5
1
0,5
0
0,1
1
10
100
1000
RF IgM (IU/ml)
9.4. Interpretación de Resultados
Por lo tanto, cada laboratorio debe considerar el intervalo especificado por el fabricante como una guía general y
producir su propio rango de valores calculados en base al estadístico obtenido por el laboratorio, donde reside la
población local.
Los siguientes valores deben considerarse como una directriz:
Normal:
< 10 IU/ml
Zona intermedia: 10 - 15 IU/ml
Positivo:
> 15 IU/ml
Los resultados positivos deben verificarse con relación al estado clínico del paciente.
10. CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DE DESEMPEÑO
10.1. Precisión
Intraensayo
Suero pos.
Suero pos.
Suero neg.
n
24
24
24
Promedio (OD)
1.170
2.127
0.216
CV(%)
1.0
2.1
2.0
Interensayo
Suero pos.
Suero pos.
n
12
12
Promedio (IU/ml)
33.7
148.6
CV(%)
5.3
6.4
10.2. Especificad del ensayo
La especificidad del ensayo se define como la probabilidad que tiene el ensayo de dar un resultado negativo en ausencia
de la sustancia a analizar específicamente 94,1 %.
10.3. Sensibilidad del ensayo
La sensibilidad del ensayo se define como la probabilidad que tiene el ensayo de dar un resultado positivo en presencia
del analítico específico 98.0 %.
10.4. Sensibilidad analítica
La sensibilidad analítica se define como la menor concentración que se puede distinguir del estándar cero. Es de
< 0.5 IU/ml.
10.5. Interferencias
Interferencias con sueros hemolíticos, lipémicos o ictéricos no se observan hasta una concentración de 10 mg/ml de
hemoglobina, 5 mg/ml de triglicéridos y 0.5 mg/ml de bilirrubina.
11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Una contaminación de las muestras con bacterias, o una congelación y descongelación repetida pueden producir
cambios en los valores de la extinción.
El diagnóstico de una infección no solamente se debe basar en el resultado del ensayo. Es necesario considerar la
anamnésis y la sintomatología del paciente junto al resultado serológico. Estos resultados sólo tienen valor restringido en
personas inmunodeprimidas o en neonatos.
18
12. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS
En cumplimiento con el Artículo 1, Párrafo 2b de la Directiva 98/79/CE del Parlamento Europea sobre el uso de
dispositivos médicos para diagnóstico in vitro, es responsabilidad del fabricante asegurar la idoneidad, desempeño
y seguridad del producto. Por lo tanto, el procedimiento de prueba, la información, precauciones y advertencias
contenidas en las instrucciones de uso deben ser seguidas estrictamente. El uso de los kits con analizadores y
equipos similares debe ser validado. No esta autorizado realizar ningún cambio en el diseño, composición y
procedimiento del ensayo, así como ningún uso en combinación con otros productos no aprobados por el
fabricante; el usuario es responsable de tales cambios. El fabricante no se hace responsable por resultados falsos o
por cualquier incidente causado por esta razón. El fabricante no se responsabiliza por los resultados obtenidos
mediante el análisis visual de las muestras de los pacientes.
Sólo para uso en diagnóstico in vitro.
Todos los componentes de origen humano utilizados para la producción de estos reactivos han sido examinado
para determinar la presencia de anticuerpos anti-VIH, anticuerpos anti-HCV y anticuerpos anti-HBsAg y se ha
determinado que no son reactivos. Sin embargo, todo el material debe ser considerado y tratado como
potencialmente infeccioso.
No intercambiar reactivos o tiras de diferentes lotes de producción.
No se deben utilizar reactivos de otros fabricantes en combinación con los reactivos de este kit.
No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.
Use sólo puntas para micropipeta, dispensadores y material de laboratorio limpio.
No intercambie las tapas de los viales. Esto evita la contaminación cruzada.
Cierre los viales de los reactivos con fuerza inmediatamente después de usarlos para evitar la evaporación y
contaminación microbiana.
Después de abrir el kit por primera vez y almacenarlo, verifique que los viales del conjugado y los estándares no
presenten contaminación microbiana antes continuar usándolo.
Para prevenir la contaminación cruzada y la obtención de resultados falsamente elevados, pipetee las muestras de
los pacientes y dispense el conjugado con precisión hacia el fondo de los pozos evitando que se produzcan
salpicaduras.
El NovaLisa™ ELISA está pensado exclusivamente para su uso por personal especializado que domine
perfectamente las técnicas de trabajo.
ADVERTENCIA:
La concentración utilizada de Bronidox L no presenta riesgos de toxicidad en contacto con
la piel las membranas mucosas!
ADVERTENCIA:
El ácido sulfúrico irrita los ojos y la piel. Manténgalo fuera del alcance de los niños. ¡Si
entra en contacto con los ojos, lavar con abundante agua y consultar a un médico!
12.1. CONSIDERACIONES PARA EL DESCARTE
Los residuos de productos y preparaciones químicos generalmente son considerados como residuos peligrosos. La
eliminación de éste tipo de residuos está regulada por leyes y regulaciones nacionales y regionales. Póngase en
contacto con las autoridades locales o empresas de manejo de residuos para que lo asesoren sobre cómo eliminar los
residuos peligrosos.
13. INFORMACIÓN PARA PEDIDOS
Numero de Producto
RFM3010
Factor Reumatoideo IgM (96 Determinaciones)
19
20
21
BIBLIOGRAPHY / LITERATUR / BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAFIA / BIBLIOGRAFÍA
Aletaha, D.; Neogi, T.; Silman; A.J.; et al. (2010) 2010 rheumatoid arthritis classification criteria: an American College of
Rheumatology/European League Against Rheumatism collaborative initiative. Ann. Rheum. Dis. 69 (9): 1580-1588.
Bas S.; Perneger, T.V.; Seitz, M.; Tiercy, J.M.; Roux-Lombard, P.; Guerne, P.A. (2002) Diagnostic tests for rheumatoid
arthritis: comparison of anti-cyclic citrullinated peptide antibodies, anti-keratin antibodies and IgM rheumatoid factors.
Rheumatology (Oxford); 41 (7): 809-814.
Nell, V.P.K.; Machold, K.P.; Stamm, T.A.; Eberl, G.; Heinzl, H.; Uffmann, M.; Smolen, J.S.; Steiner, G. (2005)
Autoantibody profiling as early diagnostic and prognostic tool for rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. 64 (12): 17311736.
Swedler, W.; Wallman, J.; Froelich, C.J.; Teodorescu, M. (1997) Routine measurement of IgM, IgG, and IgA rheumatoid
factors: high sensitivity, specificity, and predictive value for rheumatoid arthritis. J. Rheumatology 24 (6): 1037-1044.
Vallbracht, I.; Rieber, J.; Oppermann, M.; Forger, F.; Siebert, U.; Helmke, K. (2004) Diagnostic and clinical value of anticyclic citrullinated peptide antibodies compared with rheumatoid factor isotypes in rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis.
63 (9): 1079-1084.
Vittecoq, O.; Pouplin, S.; Krzanowska, K.; Jouen-Beades, F.; Menard, J.F.; Gayet, A.; Daragon, A.; Tron, F.; Le Loet, X.
(2003) Rheumatoid factor is the strongest predictor of radiological progression of rheumatoid arthritis in a three-year
prospective study in community-recruited patients. Rheumatology (Oxford). 42 (8): 939-946.
Westwood, O.M.; Nelson, P.N.; Hay, F.C. (2006) Rheumatoid factors: what's new? Rheumatology (Oxford) 45 (4): 379385.
22
Symbols Key / Symbolschlüssel / Explication des symboles / Legenda / Símbolos
Manufactured by / Hergestellt von / Fabriqué par / Prodotto da / Fabricado por
In Vitro Diagnostic Medical Device / In Vitro Diagnosticum / Dispositif médical de diagnostic
in vitro / Diagnostico in vitro / Producto para diagnóstico In vitro
Lot Number / Chargenbezeichnung / Numéro de lot / Lotto / Número de lote
Expiration Date / Verfalldatum / Date de péremption / Scadenza / Fecha de caducidad
Storage Temperature / Lagertemperatur / Température de conservation /
Temperatura di conservazione / Temperatura de almacenamiento
CE Mark / CE-Zeichen / Marquage CE / Marchio CE / Marca CE
[REF]
Catalogue Number / Katalog Nummer / Référence du catalogue / Numero di codice /
Número de Catálogo
Consult Instructions for Use / Gebrauchsanweisung beachten /
Consulter la notice d’utilisation / Consultare le istruzioni / Consulte las Instrucciones de Uso
MTPl
Microplate / Mikrotiterplatte / Microplaque / Micropiastra / Microplaca
CONJl
Conjugate / Konjugat / Conjugué / Coniugato / Conjugado
CONTROL –l
Control serum, negative / Kontrollserum, negativ / Sérum de contrôle négatif /
siero di controllo, negativo / Suero control negativo / Soro de controle negativo
CONTROL +l
Control serum, positive / Kontrollserum, positiv / Sérum de contrôle positif /
siero di controllo, positivo / Suero de control positivo
CALl
Calibrator resp. Standard/ Kalibrator bzw. Standard/ Callibrateur resp Etalon /
Calibratore ossia Standard / Calibrador o bien Estándar
DILl
Sample diluent buffer / Probenverdünnungspuffer / Tampon diluant pour échantillon /
soluzione tampone per i campioni / solución tampón para muestras
SOLN STOP│
Stop solution / Stopplösung / Solution d’arrêt / Soluzione bloccante / Solución de parada
SUB TMB│
TMB Substrate solution / TMB-Substratlösung / Substrat TMB / soluzione substrato TMB /
solución substrato TMB
WASH BUFl
l20xl
Washing solution 20x concentrated / Waschlösung 20x konzentriert /
Tampon de lavage concentré 20 x / soluzione di lavaggio concentrazione x20 /
solución de lavado concentrado x20
Contains sufficient for “n” tests / Ausreichend für “n” Tests / Contenu suffisant pour “n”
tests / Contenuto sufficiente per “n” saggi / Contenido suficiente para ”n” tests
23
SCHEME OF THE ASSAY
Rheumatoid Factor IgM
Assay Preparation
Prepare reagents and samples as described.
Establish the distribution and identification plan for all specimens and standards on the result sheet
supplied in the kit.
Select the required number of microtiter strips or wells and insert them into the holder.
Assay Procedure
blank
Standard A - F
Negative
Control
Positive
Control
Sample
(diluted 1+100)
blank
-
-
-
-
-
Standard A - F
-
100 µl
-
-
-
Negative Control
-
-
100 µl
-
-
Positive Control
-
-
-
100 µl
-
Sample
(diluted 1+100)
-
-
-
-
100 µl
Cover wells with foil supplied in the kit.
Incubate for 30 min at 37 °C.
Wash each well three times with 300 µl diluted Washing Solution.
Conjugate
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
Cover wells with foil supplied in the kit.
Incubate for 30 min at 20….25 °C.
Wash each well three times with 300 µl diluted Washing Solution.
TMB Substrate
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
Incubate for exactly 15 min at room temperature in the dark.
Stop Solution
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
Photometric measurement at 450 nm (reference wavelength: 620 nm)
NovaTec Immundiagnostica GmbH
Technologie & Waldpark
Waldstr. 23 A6
D-63128 Dietzenbach, Germany
Tel.:
+49 (0) 6074-48760
Email: [email protected]
Internet: www.NovaTec-ID.com
Fax:
+49 (0) 6074-487629
RFM3010-engl,dt,es-17102014-CS
24