FILOGENÉTICA Y GENÉTICA DE POBLACIONES DE Potos flavus
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FILOGENÉTICA Y GENÉTICA DE POBLACIONES DE Potos flavus
FILOGENÉTICA Y GENÉTICA DE POBLACIONES DE Potos flavus (CARNIVORA: PROCYONIDAE) CON SECUENCIAS DE ADN MITOCONDRIAL MARIA FERNANDA JARAMILLO TRUJILLO TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar al título MAGISTER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MAESTRIA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Bogotá, D. C. 2014 1 FILOGENÉTICA Y GENÉTICA DE POBLACIONES DE Potos flavus (CARNIVORA: PROCYONIDAE) CON SECUENCIAS DE ADN MITOCONDRIAL MARIA FERNANDA JARAMILLO TRUJILLO APROBÓ ______________________________ ______________________________ Ingrid Schuler Ph.D Manuel Antonio Franco Cortes MD PhD Decana Académica Director Posgrado en Ciencias Biológicas 2 FILOGENÉTICA Y GENÉTICA DE POBLACIONES DE Potos flavus (CARNIVORA: PROCYONIDAE) CON SECUENCIAS DE ADN MITOCONDRIAL MARIA FERNANDA JARAMILLO TRUJILLO APROBÓ Manuel Ruiz García Ph.D María Ignacia Castillo Amezquita PhD Director Jurado 1 ______________________________ Ignacio Manuel Zarante Montoya MD Ph.D Joao Víctor Muñoz Duran PhD Jurado 2 Jurado 3 3 NOTA DE ADVERTENCIA “La Universidad no se hace responsable de los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por qué no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque la tesis no contenga ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. Artículo 23 de la Resolución N° 13 de julio de 1946. 4 AGRADECIMIENTOS A Manuel Ruiz García que me permitió hacer parte de este proyecto y que me confió las muestras de una especie tan maravillosa y poco estudiada, por su confianza y paciencia gracias. A Myrera Pinedo Castro por toda su disposición y enseñanzas, gracias. A todos mis compañeros del laboratorio por sus aportes y colaboración, gracias. A mi familia por todo su apoyo, gracias. A mi hijo que me acompañó durante todo este proceso y que me enseño que los grandes sueños merecen un esfuerzo adicional pero que siempre será bien recompensado. 5 TABLA DE CONTENIDO 1. RESUMEN .........................................................................................................................................7 2. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................7 3. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................................9 4. MARCO TEÓRICO .............................................................................................................................10 5. OBJETIVO .........................................................................................................................................14 5.1 Objetivo general ............................................................................................................................14 5.2 Objetivos específicos .....................................................................................................................14 6. METODOLOGÍA ...............................................................................................................................15 6.1 Obtención de muestras y localidades ......................................................................................15 6.2 Extracción, amplificación y secuenciación de ADN ...................................................................18 6.3 Alineamiento de secuencias de ADN mitocondrial ..................................................................21 6.4 Análisis filogenéticos ................................................................................................................21 6.5 Análisis de diversidad, heterogeneidad y flujo génico ............................................................24 6.6 Detección de cambios demográficos .......................................................................................24 6.7 Tiempos de divergencia ...........................................................................................................25 7. RESULTADOS ...................................................................................................................................26 7.1 Análisis de filogenia ..................................................................................................................26 7.2 Diversidad genética ..................................................................................................................39 7.3 Heterogeneidad y flujo génico entre las poblaciones ..............................................................40 7.4 Cambios demográficos .............................................................................................................43 7.5 Tiempos de divergencia ...........................................................................................................49 8. DISCUSIÓN /CONCLUSIONES .............................................................................................................. 8.1 Filogenia y correspondencia de supuestas especies definidas morfológicamente .................59 8.2 Diversidad genética, heterogeneidad genética y flujo génico .................................................63 8.3 Cambios demográficos y tiempos de divergencia ....................................................................64 9. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................................68 6 1. RESUMEN Este es el primer estudio desarrollado sobre sistemática molecular, genética de poblaciones y filogeografía dentro de Potos flavus (Procyonidae) con un numero representativo de muestras (n=100) y que abarca una parte importante de la distribución de este carnívoro neotropical. Para llevar a cabo este trabajo se analizaron secuencias del gen mitocondrial NADH – 5 (280 pares de bases; pb), de 99 individuos de P. flavus, representando cuatro poblaciones diferentes (megalotus (15), chapadensis (17), chiriquensis (3) y Amazonas Occidental (64)) provenientes de 5 países (Colombia, Perú, Brasil, Ecuador y Bolivia). Adicionalmente 24 muestras fueron secuenciadas también para el gen mitocondrial Citocromo Oxidasa-b, Cyt-b (426 pb), representando las poblaciones anteriormente mencionadas con excepción de chiriquensis. A partir de las secuencias obtenidas se realizó un análisis de las relaciones filogenéticas. Se indagó si los datos moleculares obtenidos permiten diferenciar las subespecies propuestas morfológicamente, se evaluó el estado genético de las poblaciones (diversidad genética, heterogeneidad genética y flujo génico), y sobre su historia evolutiva (se calcularon tiempos de divergencia y cambios demográficos de la especie y se relacionaron con posibles causas climatológicas y geológicas). Los principales resultados obtenidos fueron los siguientes: 1- La especie muestra altos niveles de diversidad genética mitocondrial; 2- Las muestras que representaron las poblaciones de megalotus, chiriquensis y amazonas occidental, pertenecen a una única población, mientras chapadensis en Bolivia y unos individuos peruanos provenientes de ciertos departamentos de ese país formaron dos poblaciones diferentes. 3- El proceso de diversificación parece haberse dado en el mioceno medio. 2. INTRODUCCIÓN El orden Carnivora incluye 11 familias y clásicamente han sido divididos en dos superfamilias monofileticas: Caniformia y Feliformia (Eisenberg 1989, Wozencraft, 1989, Wyss y Flynn 1993). Caniformia ha sido usualmente organizada en las familias de Canidae, Ursidae, Procyonidae, 7 Mustelidae, Otariidae, Odobenidae, y Phocidae mientras Feliformia fue dividida en las familias Viverridae, Felidae, Herpestidae y Hyaenidae ((Eisenberg 1989, Flynn & Nedbal 1998). Los prociónidos son una de las 11 familias tradicionales dentro del orden carnívora. Esta familia está compuesta por 14 especies incluidas en 6 géneros (Wozencraft 2005) que están distribuidas geográficamente a través de las américas e incluye frugívoros arborícolas (olingos [Bassaricyon spp.] y los del cola prensil Kinkajou [Potos flavus]) y omnívoros terrestres y arbóreos encontrados a través de diversos hábitats (cola anillada y cacomistle [Bassariscus spp.]; coaties [Nasua spp. and Nasuella olivácea]; y mapaches [Procyon spp.]) (Zeveloff 2002). Procyonidae muestra un importante éxito de colonización en Sur América. La diversificación de los actuales prociónidos neotropicales parece ser antes de la formación del puente de panamá (alrededor de 3 millones de años atrás) (Koepfli et al. 2007). Así la radiación de especies de Procyonidae precede el gran intercambio biótico americano en desacuerdo con muchas explicaciones tradicionales paleontológicas. Los primeros prociónidos aparecen en el registro fósil de Norte América a principios del Mioceno (Hunt 1996, Baskin 1998, 2004). Potos flavus es la especie más basal de los prociónidos y de acuerdo con Koepfli et al. (2007), su diversificación se dió alrededor de hace 21,6 a 24 MA. Se obtuvieron secuencias de los genes mitocondriales Cyt-b y NADH5 para 24 y 99 individuos respectivamente. Mediante la construcción de árboles filogenéticos de máxima verosimilitud, Neighbour-Joining, y bayesianos se exploraron las relaciones de parentesco entre las mismas. Con el mismo conjunto de datos, se calcularon diferentes medidas de diversidad genética para la población en general y para 4 subpoblaciones divididas geográficamente y con base en algunos morfotipos determinados previamente por algunos autores. Se evaluaron adicionalmente estadísticos de heterogeneidad y flujo génico entre las subpoblaciones asignadas, se aplicaron diferentes test para evaluar posibles cambios demográficos y finalmente se establecieron los tiempos de divergencia mediante el análisis de los árboles bayesianos, y la construcción de una red de haplotipos y “Bayesian skyline plot” 3. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 8 El Neotrópico es rico en biodiversidad y podría decirse que contiene algunos de los menos comprendidos y más estudiados depredadores del mundo. Los carnívoros representan los más altos niveles tróficos dentro de las áreas neotropicales siendo especies claves que pueden alterar comunidades de mamíferos omnívoros y herbívoros e indirectamente a comunidades de plantas. Desafortunadamente debido a las presiones de las poblaciones humanas, muchas áreas tropicales y los mamíferos dentro de ellas están aumentando su riesgo. Este problema se ve agravado por la carencia de datos genéticos, de la biología evolutiva y conservación de estas especies. (RuizGarcía & Shostell 2013). La mayor parte de trabajos filogenéticos en carnívoros se han centrado en aclarar las relaciones existentes entre las familias como por ejemplo Li Yu et al. (2004), Agnarsson et al. (2010), Fulton & Strobeck (2006). Las relaciones entre prociónidos por su parte también han sido abordadas desde la perspectiva molecular, Koepfli et al. (2007) realiza un análisis de la filogenia al interior de la familia a partir de secuencias nucleares y estima los posibles tiempos de divergencia entre cada uno de los géneros de Procyonidae, adicionalmente realiza un análisis de los posibles fenómenos que afectaron la colonización de esta familia en centro y Sur América. Sin embargo son pocos los estudios que se han realizado a nivel de genero para la familia Procyonidae, específicamente para Potos flavus solo existe un estudio preliminar de filogenia y posible existencia molecular de subespecies definidas morfológicamente (Ruiz – García et al. 2012 a), en este estudio preliminar se calculan unos tiempos de divergencia para Potos mucho menores de los calculados por Koepfli et al. (2007) y se da una idea original de la existencia de algunas subpoblaciones aisladas. Este es el primer estudio con un número de muestras representativas de todo el rango de distribución en Sur américa, que permitirá determinar la correspondencia entre las subespecies definidas y su relación molecular, adicionalmente se realizarán las estimaciones de divergencia temporal para ver que tanto se ajustan con lo descrito previamente por otros autores y como se relacionan con los grandes periodos históricos que han influido en la distribución de la biota que conocemos actualmente. Por último, el uso de las herramientas moleculares, como por ejemplo el estudio del ADN mitocondrial permite determinar estrategias de conservación efectivas basadas en la clasificación 9 sistemática de las especies y de sus poblaciones diferenciadas por debajo del nivel de especies (subespecies). La incertidumbre sobre las unidades de conservación guía tanto a la confusión en el establecimiento de planes de manejo como a errores en el establecimiento de prioridades (O´Brien 1994). Precisamente por eso, se hace enormemente importante describir la estructura genética, la filogeografía y la determinación de linajes evolutivamente significativos (ESU’s; Moritz 1994) y su posible correspondencia con subespecies definidas morfológicamente para las poblaciones muestreadas de P. flavus. 4. MARCO TEORICO P. flavus también conocido como Kinkajou, perro de monte o martucha, es la única especie perteneciente al género Potos. De acuerdo con Ford & Hoffmann (1988) se han identificado las siguientes subespecies, con la localidad tipo. 1. P. f. prehensilis, Atoyac River in Veracruz, México 2. P. f. chiriquensis, Chiriqui Panama 3. P. f. megalotus, Santa Marta Magdalena 4. P. f. meridensis, Merida Venezuela 5. P. f. modestus, Balzar Ecuador 6. P. f. flavus, Surinam 7. P. f. nocturnus, Alagoas State in Brazil 8. P. f. chapadensis, Matto Grosso State in Brazil El mapa de distribución para estas subespecies de acuerdo con los mismos autores es el siguiente: 10 Figura 1. Mapa tomado de Ford & Hoffmann (1988). 1. P.f. chapadendis; 2 P.f.chiriquensis.; 3, P.f. flavus; 4, P.f megalotus; 5, P.f. meridensis; 6, P. f. modestus; 7, P.f. nocturnos; 8, P.f. prehensilis. El símbolo de interrogación cuestiona la distribución pata Trinidad. A continuación se presenta la descripción detallada para la especie de acuerdo con lo compilado en un artículo por estos autores. El género Potos difiere de otros géneros de procyonidos en tener orejas pequeñas y redondeadas, la presencia de dos glándulas cutáneas ventrales (esternal y medio abdominal), una cola prensil, una larga y estrecha lengua extensible y un báculo único que termina en 4 cortos brazos de punta redondeada. Distribución El Kinkajou probablemente se encuentra a los largo del trópico de Centro y Sur América. El rango conocido es desde Mato Grosso en el centro de Brasil, oriente de Perú, norte de Ecuador, e incluye las Guyanas, Surinam, Venezuela y Colombia; hacia el norte a lo largo de Centro América a San Luis Potosi y al sur Tamaulipas en el este de México y Guerrero en el occidente 11 de México. Un avistamiento cerca a Acuna, Tamaulipas, México por Leopold (1959) es el registro más al norte. Algunas áreas dentro del rango de distribución en las cuales no se encuentre Kinkajú son altas montañas andinas, Catinga y Chaco de Brasil y aparentemente los estados secos en Venezuela. El Kinkajou fue reportado en la isla de trinidad; pero Allen & Cahpman (1897) considera esta distribución incorrecta o dudosa porque está basada en pruebas insuficientes. Los Kinkajous se encuentra en altitudes hasta los 2500 msnm; en Venezuela, 162 animales fueron colectados entre los 24 y los 1.750 msnm, pero el 97% fueron encontrados alrededor de los 500 m. Registro fósil Los prociónidos se encuentran entre los más raros fósiles conocidos de carnívoros, y no hay registro fósil de Potos. El pobre registro fósil es atribuido a los hábitos arbóreos de la especie y a la carencia de datos fósiles de los bosques lluviosos que parecen ser sus centros evolutivos. Potos ha sido un linaje independiente desde aproximadamente el Mioceno (Simpson 1945). El género parece ser originario de Centro o Suramerica (Hershkovitz 1972), o de Norte América con posterior migración a Sur América durante el Pleistoceno (Patterson & Pacual, 1972). Dieta Kinkajou parece ser principalmente frugívoro, pero suplementa su dieta. Reportes de observaciones alimenticias y análisis de contenido estomacal incluyen una variedad de pulpa de frutas y semillas, flores, miel, pequeños escarabajos, algunas larvas de insectos, hojas y brotes jóvenes. Algunos Kinkajous fueron encontrados alimentandose del nectar de Quararibea cordata en Perú ya que ellos visitan más de un árbol por noche, los Kinkajous contribuyen potencialmente a la polinización cruzada. Su larga y delgada lengua sugiere una adaptación para una dieta frugívora, para romper el cono y remover la miel de las colmenas y para capturar insectos y abejas sin aguijón de la colmena. El Kinkajou tiene un intestino simple, sin ciego, por lo que al comer grandes cantidades de fruta presenta una limitada absorción. 12 Oroaetus isidori es un predador de Kinkajous en Colombia . El aguila Arpia (Harpia harpyja) fue observada trayendo un Kinkajou a su polluelo en dos ocasiones durante 4 meses de estudio. Algunas veces se han reportado ser comidos por jaguares, el mayor predador de la especie son los humanos, son vendidos como mascotas y su pelaje es comercializado. Mas de 100 animales vivos por año, mas cientos de pieles (216 en 1966) fueron exportadas desde Perú solamente. La destrucción de sus hábitats ha reducido el rango y número de estos individuos. Los Kinkajous parecen preferir hábitats boscosos imperturbados, solo el 3% de 162 animales colectados en Venezuela fueron encontrados en áreas abiertas como huertos o cultivos. Los Kinkajous son estrictamente nocturnos y usualmente duermen en sitios oscuros y retirados durante el dia. De acuerdo con la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza, esta especie se encuentra clasificada en la categoría LC preocupación menor, el mapa de distribución para la especie se observa a continuación: 13 Figura 2. Distribución geográfica de Potos flavus. Tomado de IUCN (International Union for Conservation of Nature) 2008. Potos flavus. In: IUCN 2013. IUCN Red List of Threatened Species. Version 2013.2 <www.iucnredlist.org 5. OBJETIVO 5.1 Objetivo general Determinar la estructura genética y la filogenia molecular de P.flavus a través de su rango de distribución en Colombia y en Suramérica, mediante marcadores mitocondriales. 5.2 Objetivos específicos Reconstruir la filogeografía y las relaciones filogenéticas internas, de las subespecies consideradas a partir de las secuencias de dos genes mitocondriales y determinar si existe correspondencia entre los diferentes acervos genéticos encontrados y las subespecies morfológicas definidas previamente por otros autores. Determinar los niveles de variabilidad del gen mitocondrial NADH5 como un todo y en cada una de los subpoblaciones analizadas de P. flavus. Detectar los posibles cambios demográficos a través de la historia natural de P. flavus (Expansiones demográficas, flujo génico, cuellos de botella entre otros). Estimar posibles brechas de divergencia temporal para la especie y entre las subespecies estudiadas y encontrar relaciones entre esas brechas temporales con los cambios climáticos y geológicos. Buscar en cuantos linajes evolutivamente significativos (ESU’s) quedan asignados los individuos analizados en el seno de cada una de las subespecies estudiadas. 14 6. METODOLOGIA 6.1 Obtención de muestras y localidades Las muestras fueron obtenidas por el profesor Manuel Ruíz García en una porción representativa del rango de distribución de la especie. Las muestras consistían en pelos con bulbo, pieles, dientes y huesos. Se extrajeron, amplificaron y secuenciaron muestras de un total de 100 individuos identificados morfológicamente y con un origen geográfico determinado. 99 de estas muestras fueron analizadas para el gen mitocondrial NADH5 con una longitud de 280 pares de bases; adicionalmente se obtuvieron las secuencias de 23 de estas muestras, más 1 individuo para el también gen mitocondrial Citocromo Oxidasa-b (Cyt-b) de 426 pares de bases. Adicionalmente se extrajo, amplificó y secuenció para NADH5 (280 pb) una muestra de la especie Bassaricyon alleni, proveniente de Ecuador la cual fue utilizada como grupo externo en los análisis de filogenia. En la tabla 1 y 2 se muestra el origen geográfico de las muestras amplificadas para cada marcador; de acuerdo con este origen se asignaron las posibles subespecies morfológicas encontrando representación de tres (P. f. chiriquensis, P. f. megalotus y P. f. chapadensis) de las ocho propuestas por Ford & Hoffmann (1988), los individuos muestreados en la Amazonia Occidental que incluye localidades de cuatro países (Colombia, Ecuador, Perú y Brasil), no fueron asignados a ninguna subespecie ya que no existe un morfotipo claro en la descripción realizada por los precitados autores en el que puedan agruparse las muestras obtenidas de esta región Amazónica. En la figura 3 pueden observarse las localidades muestreadas para los 100 individuos de Potos flavus. 15 Tabla 1. Numero de muestras secuenciadas por cada localidad para Cyt-b. Subespecie o Región Geográfica Pais P. f. megalotus Colombia P. f. chapadensis Bolivia Colombia Ecuador Región Amazónica Perú Departamento ó localidad Cauca (PNN Munchique) Risaralda Meta Cochabamba Amazonas (Rio Loreto Yacu, Amacayacu y la Libertad) Morona Santiago (Fatima -Macas) Loreto (Iquitos, río Napo, río Galvez) Cajamarca (San finesco) Huanuco Pasco Ucayali (Pucallpa) Total Cantidad 1 1 1 2 3 2 7 1 1 2 3 24 Tabla 2. Numero de muestras secuenciadas por cada localidad para NADH5 Subespecie o Región Geográfica Pais P. f. megalotus P. f. chiriquensis P. f. chapadensis Región Amazónica Departamento ó localidad Cantidad Cauca (PNN Munchique) 1 Antioquia (Zaragoza) 4 Cesar (Valledupar) 1 Tolima (Villahermosa) 1 No determinada (Decomiso aeropuerto el Dorado, Instituto Alexander Von Humboldt) 2 Colombia Casanare (Vereda centro norte, cerro pan de azucar) 1 Huila (Cueva de los Guacharos) 1 Norte de Santander (Magua) 1 Cundinamarca (Decomiso) 1 Risaralda 1 Meta (Decomiso, Jaime Duque y San Martin) 3 Colombia Chocó (PNN los Katios) 3 Cochabamba (Campoyuqui, río Chimore) 12 Beni (La tejeria,prov.cercado,San Javier) 2 Bolivia Santa Cruz 1 No determinada 1 Tarija (Sajta) 1 Amazonas (Rio Loreto Yacu, Puerto Nariño, Tarapoto, San Francisco, Amacayacu, Leticia y la Libertad) 13 Colombia Vaupes (Río guaviare, frente a bocas del río ariari) 1 Caqueta (Aracuara) 1 Morona Santiago (Fatima -Macas) 3 Ecuador Napo (Tena) 3 Brasil Para (Belen) 1 Loreto (Iquitos, río Napo, río Galvez, río Nanay, Quistocochaua, San joaquin de Omaguas,) 18 Cajamarca (San finesco) 1 San Martin (Tarapoto) 1 Perú Huanuco (Tingomaria) 4 Pasco 8 Ucayali (Pucallpa, Yarinococha, padre abad, san alejandro) 8 Total 99 16 Figura 3. Ubicación Geográfica de las localidades en las cuales se obtuvieron muestras de Potos flavus que fueron secuenciadas para Cyt b y NADH5. 17 6.2 Extracción, amplificación y secuenciación de ADN El ADN fue extraído de trozos de piel, pulpa dentaria y médula de hueso cuando las muestras provenían de animales muertos y de bulbo de pelo cuando los individuos se muestrearon vivos. La preparación de los tejidos se realizó de la siguiente manera: Piel: se cortó una muestra de aproximadamente 1cm², ésta fue picada y macerada usando 300μl de buffer de lisis de piel (solución de 2.5 ml de Tris-HCL, 0,1 ml de EDTA, 1 ml de NaCl y 2ml de SDS 10% en 44,4 ml de H2O), este macerado fue transferido a un tubo al que se agregaron 300μl adicionales de buffer, 10 μl de proteinasa-k [20 mg/ml] y 20 μl de ditiotreitol (DTT) y finalmente fue llevado a incubación en baño de maría (56°C) durante dos noches. Pulpa dentaria: se tomaron uno o dos dientes de cada individuo dependiendo de la cantidad de pulpa dentaria que presentaran, los dientes se lavaron con hipoclorito y agua destilada y se rompieron para extraer la pulpa interior, este tejido fue transferido a un tubo eppendorf. Pelo: se tomaron pelos en los que se distinguiera fácilmente el bulbo y se lavaron con detergente dodecilsulfato sódico (SDS) al 20% y 1 ml de agua destilada, de la siguiente manera: Se incluyeron los pelos con el bulbo hacia abajo en un tubo eppendorf de 1.5 μl con 1 ml de agua destilada, se agregaron 40 μl de SDS al 20%, se dió vortex a la muestra, se retiró el sobrenadante y se agregó nuevamente agua destilada llevando al vórtex nuevamente. Este procedimiento fue repetido hasta que se eliminara la espuma de la muestra, por último se realizó un lavado con 500 μl de Etanol absoluto, se dió vórtex, se descartó el sobrenadante y se dejó secar en horno por 1 minuto a 50 °C. Medula de hueso: se realizó una limpieza previa del hueso con hipoclorito y agua destilada, después, se rompieron los huesos para extraer la medula, se tomó una pequeña cantidad de este tejido y se llevó a un tubo eppendorf. La extracción del ADN se realizó para las muestras de piel con algunas variaciones de los protocolos descritos en Sambrook et al. (1989). 18 Una vez la muestra de piel se encontraba preparada y digerida como se describió anteriormente, se procedió a realizar la extracción utilizando fenol – cloroformo: Se colocó en un tubo eppendorf la mayor cantidad de muestra digerida posible y se añadieron 500 μl de la solución fenol – cloroformo – alcohol - isoamílico (25:24:1), en el mismo volumen de la muestra. Se realizó una mezcla suave por 20 segundos mediante inversión, se centrifugó a 13000 rpm por 15 minutos, se extrajó la mayor cantidad de sobrenadante y se añadió en un nuevo tubo descartando el precipitado. A ese sobrenadante se adicionó el mismo volumen de cloroformo – alcohol isoamilico (24:1) y se mezcló suavemente por inversión. Se centrifugó a 13000 rpm por 15 minutos, en el caso en el que algunas muestras después de este lavado presentaron en la interfase una capa blanquecina se repitió el lavado con la solución cloroformo – alcohol isoamilico (24:1). Sobre el volumen final obtenido se agregó dos veces el volumen de etanol al 100% y se dejó en nevera a - 20° C durante una noche. Al día siguiente la muestra fue centrifugada por 15 minutos a 13000 rpm, posteriormente se descartó el sobrenadante y se dejó secar el alcohol en el horno a una temperatura de 40° C. Finalmente el pellet se resuspende en agua Mili – Q, esteril y se guarda en nevera. Para las muestras de pelo, medula de hueso y pulpa dentaria se añadieron 200 µl de una solución de resina Chelex® al 20%, 20 µl de DTT y 10 µl de Proteinasa – K [20 mg/ml], a cada una de las muestras de los tejidos antes mencionados. Posteriormente las muestras fueron dejadas por una noche en baño maría (56°C), el día siguiente se llevaron a temperatura de ebullición durante 8 minutos. Finalmente fueron centrifugadas y el sobrenadante fue utilizado para protocolo de PCR. Para la amplificación del segmento de los dos genes mitocondriales se utilizó la Reacción en Cadena de la Polimerasa, PCR. Para cada muestra se preparó un mix que contenía 2 μL de DNA (diluido o no según el caso), 13,5μL de agua Mili-Q, 1 μL de genTaq® polimerasa, 1 μL de DNTP’s, 3,0 μL de MgCl2, 1 μL de cada cebador, (para Citocromo-b se utilizaron los cebadores de Irwin et al. (1991) con algunas modificaciones, 19 H15149 y L14724, 5’- CAGAATGATATTTGTCCTCA-3’ y 5´-GATATGAAAAACCATCGTTG-3’, y para NADH5 los cebadores utilizados fueron L12673 y H12977, 5’ GGTGCAACTCCAAATAAAAGTA -3’ y 5´- AGAATTCTATGATGGATCATGT 3’ propuestos por Waits et al. (1999), 2,5 μL de buffer 10X; el producto siguió un protocolo de PCR de denaturación a 94°C durante 5 minutos, 35 ciclos a 94°C por 1 minuto, 35 ciclos a 50°C por 30 segundos, 35 ciclos a 72°C por 1 minuto, y una extensión final de 72°C por 5 minutos. Todas las amplificaciones incluyendo controles positivos y negativos fueron chequeados en gel de agarosa al 2%. Las muestras que presentaron una banda nítida con la longitud esperada, fueron enviadas para secuenciación automática de la cadena “L” a MACROGEN U.S.A. Este tipo de secuenciación ha sido realizada de esta manera en diversas especies estudiadas en el laboratorio de Genética de poblaciones de la Pontificia Universidad Javeriana para los dos genes objetos de análisis en este estudio. Las secuencias obtenidas para otros carnívoros tales como Eira barbara, Tremarctos ornatus, Puma concolor, Panthera onca, varias especies del genero Pseudalopex entre otros, han sido secuencias confiables una vez verificada la calidad de las mismas comparando ambas cadenas, lo cual permite confiar en los análisis obtenidos con este tipo de secuencias. Por otra parte las muestras fueron alineadas manualmente y chequedas con los cromatogramas enviados por MACROGEN U.S.A (pueden verse esas figuras en el Anexo 1), de esta manera se verifica una vez más la calidad de las secuencias, tomando para el análisis solo las muestras que presentaran picos estables y una secuencia coherente. De igual manera para tener certeza adicional sobre la secuencia obtenida se enviaron las amplificaciones del mismo individuo a partir de varios tejidos (ejemplo piel y diente). Las secuencias que no cumplieron con la longitud o coherencia esperada para las secuencias fueron excluidas del análisis. 6.3 Alineamiento de secuencias de ADN mitocondrial Las secuencias fueron alineadas manualmente y con el Technology Ltd). 20 Software DNA Alignment (Fluxus 6.4 Análisis filogenéticos Los análisis filogenéticos fueron realizados usando los programas MEGA versión 5.2.2 (Tamura et al. 2011) y BEAST v. 1.6.2 (Drummond & Rambaut, 2007), en este último programa además de las relaciones filogenéticas se determinaron los tiempos de divergencia entre las diferentes poblaciones analizadas y entre las secuencias obtenidas para Potos y las especies utilizadas como grupos externos, los carnívoros: Bassaricyon alleni (Procyonidae) para las secuencias de NADH5 y Pseudalopex culpaeus (Canidae) para Citocromo b (Cyt b). Inicialmente se escogió el mejor modelo de substitución nucleotídica para las secuencias obtenidas entre 24 modelos diferentes (Nei & Kumar, 2000). Se eligió el modelo que presentara los valores más bajos para el parámetro “Akaike” Criterio de Información, corregido, AICc. Se construyeron arboles utilizando tres metodologías para cada gen mitocondrial, por métodos basados en distancias (Neighbour-Joinig), métodos de máxima verosimilitud (MaximumLikelihood) y por métodos bayesianos. Primero, mediante el software MEGA 5.2.2, se construyeron árboles basados en el método Neighbour-Joining (Saitou & Nei M. 1987). Los valores de bootstrap se determinaron con 500 réplicas, las distancias evolutivas fueron computarizadas usando el método parámetro-3 de Tamura (Tamura K. 1992). El segundo grupo de árboles fue obtenido utilizando el mismo software, siguiendo el método de Maximum-Likelihood y el modelo GTR (Nei & Kumar, 2000) para NADH5 y el modelo HKY (Hasegawa et al. 1985) para Cyt b. Los valores de bootstrap se determinaron con 500 réplicas. Finalmente se construyeron arboles con procedimientos bayesianos llevados a cabo con el programa BEAST v. 1.6.2 (Drummond & Rambaut 2007), estos análisis fueron realizados usando el Hasegawa – Kishino – Yano (HKY), como modelo de substitución nucleotídica, con base en las frecuencias estimadas con un modelo de heterogeneidad de sitios gamma y tasas que varían entre los sitios. Los análisis fueron corridos asumiendo un reloj molecular relajado con una tasa log-normal no-correlacionada (Drummond et al. 2006). El tamaño efectivo de la muestra (ESS) para las estimaciones de los parámetros y la convergencia se chequeo utilizando el programa 21 Tracer v 1.5 (Rambaut & Drummond, 2007). Las estimaciones de las divergencias temporales y los intervalos superiores e inferiores al 95 % de las densidades posteriores mayores (HPD) de estos parámetros al igual que las medias, las medias geométricas, medianas, densidades marginales y trazas fueron también estimados con el programa Tracer v 1.5. Para determinar los valores reales de estos parámetros, se obtuvó el árbol de autocorrelación (ACT) y ESS para las estimaciones de los parámetros. El árbol final se estimó en TreeAnnotator v1.6.2 y visualizado en FigTree v. 1.3.1. Adicionalmente, este programa fue corrido para estimar el tiempo del más reciente ancestro común (TMRCA) para los diferentes linajes de haplotipos encontrados. Este valor se tomó como un prior para el “treeModel.rootHeight” en el análisis Bayesiano con una distribución normal y una desviación estándar. El prior utilizado en el análisis realizado para las secuencias de NADH5 fue de 21 MA + 0.5 MA, teniendo en cuenta que Koepfli et al. (2007), estimó que la división entre Potos y los demás prociónidos ocurrió hace 21.6 – 24 MA (95% densidades posteriores mayores (HPD): 12.1–36 MA). Por otra parte para el conjunto de datos obtenidos de Cyt b se utilizó un prior de 41.2 MA que es el tiempo estimado para la separación de Canidae y Procyonidae, esto teniendo en cuenta que la especie utilizada como grupo externo es un zorro (Pseudalopex culpaeus) (Bininda - Emonds et al. 1999). 6.5 Análisis de diversidad, heterogeneidad y flujo génico Estos análisis se realizaron para las secuencias obtenidas para el gen mitocondrial NADH5, con el software DNAsp 5.10 (Rozas et al. 2010), se determinaron el número de sitios polimórficos (S), el número de haplotipos (h), la diversidad Haplotípica (Hd), la diversidad nucleotídica (π), el número promedio de diferencias nucleotídicas (k), y el coeficiente de coancestralidad (θ) por secuencia para determinar la diversidad genética en P. flavus. Inicialmente se tomaron estas estimaciones para la totalidad de las muestras (n=99), después se dividieron en cuatro grupos teniendo en cuenta la distribución geográfica y las posibles subespecies asignadas (P. f. megalotus (n=15), P. f. chiriquensis (n=3), P. f. chapadensis (17), Región Amazónica (n=64)) y se realizó el mismo análisis para cada población por separado. Se utilizaron diversas pruebas para medir la heterogeneidad genética y determinar estimas de posible flujo génico entre las supuestas subespecies: HST, HST, KST, KST*, Z and Z* (Hudson et al. 1992a, b), Snn (Hudson 2000), X2 (en las frecuencias haplotipicas con pruebas de permutación 22 de 10.000 réplicas), GST (a partir de las frecuencias haplotipicas) y, γST, NST, FST (a partir de las secuencias de los nucleótidos; Hudson et al. 1992a). 6.6 Detección de cambios demográficos Para detectar la existencia de cambios demográficos se utilizaron diversos procedimientos. 1. Distribución de desemparejamientos (Mismatch distribution), fue obtenida siguiendo el método de Rogers & Harpending (1992) and Rogers et al., (1996). Se compararon las curvas obtenidas asumiendo tamaños constantes y no constantes para la distribución empírica observada. Se usó el estadístico “raggedness” rg (Harpending et al. 1993, Harpending 1994) y el estadístico R2 de Ramos-Onsins & Rozas (2002) para determinar la similitud entre las curvas observadas y las teóricas. Estas gráficas fueron obtenidas analizando el conjunto de secuencias en general y posteriormente para tres de los grupos construidos a partir de la ubicación geográfica y posibles subespecies, en esta ocasión los individuos provenientes del Parque Nacional los Katios en Colombia (3) que fueron clasificados en los análisis anteriores como P. f. chiriquensis, se incluyeron dentro del grupo colombiano de P. f. megalotus, de esta manera se evaluaron posibles fenómenos de expansión o contracción poblacional para las siguientes subpoblaciones: P. f. megalotus (n=18), P. f. chapadensis (n= 17) y región Amazónica Occidental (n= 64). 2. Tests Fu and Li D* and F* (Fu & Li 1993), el estadístico Fu FS (Fu, 1997) y el test Tajima D (Tajima 1989) para determinar posibles cambios en los tamaños poblacionales (Simonsen et al. 1995, Ramos-Onsins & Rozas 2002). Estos estadísticos se calcularon para las secuencias obtenidas de NADH5. 3. “Bayesian skyline plot” (BSP) fue obtenido para las secuencias del Cyt b y NADH5 por medio de los software BEAST v. 1.6.2 y Tracer v1.5. Los priores de los árboles fueron seleccionado con cinco pasos y un modelo skyline por tramos constante con 10.000.000 generaciones (el primer 1,000,000 fue descartado como “burn-in”). Se seleccionó como el tiempo máximo que el 95% superior de HPD (densidades posteriores mayores) y la traza de la altura de la raíz como la treeModel.rootHeigh. Estos análisis se llevaron a cabo para los últimos 1,15 MA para NADH5, y 1,3 MA para Cyt b. 23 6.7 Tiempos de divergencia Para calcular el tiempo de divergencia entre las diferentes subpoblaciones de Potos y los grupos externos se utilizó el método bayesiano descrito anteriormente en los análisis filogenéticos. Adicionalmente se calculó el tiempo de divergencia entre los haplotipos encontrados para los dos genes mitocondriales, por medio de Median Joining Network (MJ) (Bandelt et al. 1999). Esta red fue construida por medio del software Network 4.6 (Fluxus Technology Ltd). Adicionalmente, el estadístico ρ fue estimado y transformado en años (Morral et al. 1994). La desviación estándar de ρ también fue calculada (Saillard et al. 2000). El estadístico ρ es imparcial y altamente independiente de los acontecimientos demográficos pasados. Las tasas de mutación utilizadas fueron para Cyt b una divergencia de nucleótidos del 1,55% por cada millón de años (Wayne et al. 1997), lo cual representa una mutación cada 153.976 años y para NADH5, una divergencia nucleotidica de 1.22% por cada millón de años (Culver et al. 2000), que representa una mutación cada 309.310 años. Estas estimaciones fueron obtenidas para Canidae y Felidae, respectivamente. Se asume entonces en este trabajo que estas tasas de mutación pueden ser similares para Procyonidae. 7. RESULTADOS De todas las amplificaciones obtenidas y enviadas a secuenciar, 99 muestras de 280 pares de bases del gen mitocondrial NADH5 y 24 secuencias para el caso del gen mitocondrial Cyt b, con una longitud de 426 pares de bases, mostraron unas secuencias confiables para ser incluidas en el análisis del presente trabajo de investigación. Para evaluar la calidad de las secuencias se tuvieron en cuenta los cromatogramas remitidos para cada secuencia por MACRO GEN USA, el envío de más de un amplificado para un mismo individuo provenientes de diferentes tejidos que al final resultaron en secuencias idénticas y la alineación manual de las mismas que permitió detectar posibles inconsistencias. 7.1 Análisis de filogenia Se determinó que el mejor modelo mutacional entre 24 modelos evolutivos probados para las secuencias de Cyt B incluyendo la secuencia del grupo externo, fue el modelo de substitución 24 nucleotídica Hasegawa-Kishino-Yano (HKY), con un valor de “Akaike” Criterio de Información, corregido, AICc, de 2706.703, mientras para NADH5 y el grupo externo el mejor modelo fue el de General Time Reversible (GTR), con un valor de AICc de 10074.127. De acuerdo con los árboles obtenidos se observa que el género Potos es monofiletico. Las gráficas construidas a partir de los métodos de máxima verosimilitud y algoritmo NeighbourJoining, para el caso de las secuencias analizadas para el gen mitocondrial Cyt-b (n=24), muestran una topología muy similar figura 4 (A y B) tal como se describe a continuación; se forman 2 grupos principales soportados por diferentes valores de boostrap para cada árbol, pero incluyendo a los mismos individuos para cada uno de los grupos conformados; el primer clado está constituido por individuos de Perú, Colombia y Ecuador todos muestreados en la región amazónica con excepción de un individuo (identificado N13 Jaime Duque) a quien se le señaló para efectos del presente estudio como origen geográfico la región oriental de Colombia. Sin embargo, por la manera como se agrupa en estos análisis preliminares y como se agrupa en la red de haplotipos tal como se mencionará más adelante, de acuerdo con sus características genéticas este parece ser un individuo proveniente de la región amazónica. Los trece individuos reunidos dentro de este primer grupo, de acuerdo con los valores obtenidos de bootstrap, no parecen estar relacionados de una manera específica. Sin embargo, en los dos árboles si se observa que dentro de este grupo hay una muestra que se diferencia más que las demás. Esta secuencia se obtuvo a partir de un individuo muestreado en el departamento de Cajamarca en Perú. En el segundo grupo aparecen 11 individuos provenientes de Colombia, Perú y Bolivia; dentro de este grupo, para los dos árboles se presenta una asociación soportada con unos valores de boostrap altos (97 y 92) entre dos muestras provenientes de la región de Cochabamba en Bolivia. Las otras muestras se encuentran mezcladas sin asociación aparente para estos dos árboles, entre estas se encuentran individuos provenientes de la región amazónica de Colombia y Perú y muestras de la zona andina colombiana (Cauca y Risaralda). Se obtuvieron dos árboles más, construidos con las mismas metodologías (máxima verosimilitud y Neighbour-Joining), para el gen NADH5 con un número mucho mayor de muestras. Estos pueden observarse en la figura 5 (A y B) y de manera general presentan las siguientes características: en los dos árboles se observa que la mayoría de las muestras no tiene una 25 conformación en grupos fuertemente soportados. Se encuentran mezclados individuos de todas las localidades para todos los países muestreados. Sin embargo los dos casos muestran 2 agrupaciones, uno de individuos peruanos y otro de bolivianos que se resaltan entre la mezcla de las muestras restantes. Estos grupos son, en el árbol construido con la metodología de máxima verosimilitud, un conjunto de 12 individuos más dos muestras que no se encuentran dentro del mismo grupo pero si están muy cercanas a estos, 13 individuos provienen de Bolivia (Cochabamba, Beni, Tarija y Santa Cruz) y un individuo proveniente de Cajamarca, Perú. El segundo grupo incluye 14 muestras peruanas de los departamentos de Pasco, Ucayali, Huanuco y San Martin y una muestra colombiana proveniente del departamento de Risaralda, para un total de 15. El árbol construido con el algoritmo Neighbour-Joining también realiza estas dos agrupaciones. Para el caso del grupo boliviano se encuentra representado por las mismas 12 muestras del árbol anterior incluyendo un individuo peruano, pero en este caso las 2 muestras también de origen boliviano que se encontraron muy próximas en el árbol anterior quedaron muy distantes en este árbol. Por su parte el grupo peruano también se encontró conformado por las 15 muestras representadas en el árbol anterior incluyendo la muestra colombiana. Con respecto a la muestra (N13 Jaime Duque) mencionada en la primer parte de los resultados, para los arboles construidos con las secuencias de NADH5, en ambos casos se encontró estrechamente relacionada con una muestra proveniente de San Martin Meta. Sin embargo esta relación no está soportada por valores significativos de boostrap. Por otra parte dos individuos secuenciados para NADH5 de los cuales no se contaba con localidad geográfica exacta, (POTOSFLAVUS150DECOMISOBOGOTACOLOMBIA, POTOSFLAVUS159COLOMBIA), se mostraron relacionados en los dos árboles con individuos provenientes de la región amazónica. Sin embargo, estas relaciones no se encuentran soportadas con valores altos de boostrap. Para los arboles construidos con métodos bayesianos se obtuvieron 3 gráficas para cada árbol: una muestra las probabilidades posteriores, otra muestra los tiempos de divergencia y otra los intervalos entre estos tiempos. Para el primer grupo de árboles con secuencias de Cyt b (Figura 6, A, B Y C) se observa una tipología muy similar a la encontrada en los arboles construidos con métodos de distancias 26 genéticas. En general, se evidencia una división en dos grandes grupos, soportados fuertemente con una probalidad igual a 1. A su vez, la organización de los individuos dentro de cada grupo se soporta con probabilidades del 0,98 y 0,56; dentro del primer grupo se encuentran mezcladas entre sí muestras de Ecuador, Perú y Colombia incluyendo la muestra (N13 Jaime Duque). El segundo grupo se caracteriza por tener muestras peruanas y colombianas entremezcladas. Así mismo, se encontró nuevamente una estrecha relación soportada por una por una probabilidad de 1 entre las dos muestras bolivianas. Con respecto a los arboles construidos con NADH5, se encuentran que los dos grupos observados anteriormente en los arboles basados en distancias genéticas, conformados por individuos de una parte de las subpoblaciones peruanas y bolivianas están soportados con valores altos de probabilidades posteriores. El primer grupo reúne con una probabilidad igual a 1, 11 individuos bolivianos y 1 peruano; el grupo peruano por su parte con una probabilidad del 0,99 agrupa los 14 individuos peruanos más 1 muestra colombiana de manera idéntica a lo descrito para los arboles basados en distancias genéticas. En este caso la muestra (N13 Jaime Duque), se encontró relacionada a un individuo proveniente de San Martin, Meta en Colombia con una probabilidad de 0,94. 27 A B Figura 4. Diferentes arboles filogeneticos obtenidos para Potos flavus para el gen mitocondrial Cyt b. Arbol con el metodo Neighbor-Joining con parámetro-3 de Tamura (A); Arbol Maximum likehood modelo HKY (B). Los números en los nodos son los valores en porcentaje de bootstrap. 28 A 29 B 30 Figura 5. Diferentes arboles filogeneticos obtenidos para Potos flavus para el gen mitocondrial NADH5. Arbol con el metodo Neighbor-Joining con parámetro-3 de Tamura (A); Árbol Maximum likehood modelo GTR (B). Los numeros en los nodos son los valores en porcentaje de bootstrap. A 31 B 32 Figura 6. Árbol Bayesiano obtenido para Cyt b, suponiendo una diversificación del linaje mitocondrial hace 21MA: A) los valores en los nodos muestran las probabilidades posteriores,B) los valores en los nodos muestran los rangos de oscilación de los tiempos de divergencia C) Los valores en los nodos muestran los posibles tiempos de divergencia. 33 A 34 B 35 C 36 Figura 7. Árbol Bayesiano obtenido para NADH5, suponiendo una diversificación del linaje mitocondrial hace 21MA: A) los valores en los nodos muestran las probabilidades posteriores, B) los valores en los nodos muestran los rangos de oscilación de los tiempos de divergencia C) Los valores en los nodos muestran los posibles tiempos de divergencia. 7.2 Diversidad genética. En la tabla 3 se observan los valores obtenidos para estimar la diversidad genética de P. flavus y para las cuatro subpoblaciones (P. f. chiriquensis, P. f. megalotus, P. f. chapadensis y Región Amazónica). Los estadísticos obtenidos para P. flavus para el gen mitocondrial NADH5 (280 pb) son los siguientes: Número de sitios polimórficos (S) 191, fueron encontradas un total de 286 mutaciones, el número de haplotipos encontrados fue de 83 (en 99 individuos estudiados), la diversidad haplotipica Hd = 0,995 ± 0,002, la diversidad nucleotidica π = 0,12569 ± 0,00795, número promedio de diferencias nucleotidicas k = 34,564 ± 2,162 y theta por secuencia θ= 36,963 ± 9,250. De esta manera se observa que P.flavus presenta altos niveles de diversidad genética. Tabla. 3. Estadísticos de diversidad genética para P. flavus y 4 subpoblaciones P.flavus No. P.flavus megalotus P.flavus P.flavus Región chriquensis Chapadensis Amazónica 99 15 3 17 64 No. de sitios 280 280 280 280 280 No. de sitios 191 124 64 96 184 286 146 65 102 259 83 14 3 14 53 0,995 ± 0,002 0,990 ± 0,028 1,000 ± 0,272 0,971 ± 0,032 0,993 ± 0,004 Secuencias analizadas polimórficos o segregantes (S) No. total de mutaciones No. total de haplotipos (h) Diversidad 37 haplotipica (Hd) Diversidad 0,12569 nucleotidica 0,00795 ± 0,14084 ± 0,01605 0,15357 ± 0,07609 ± 0,11796 0,04773 0,01898 0,01012 43,000 ± 20,109 21,228 ± 3, 401 32,676 ± (π) No. promedio 34,564 ± 2,162 39,295 ± 6,659 de diferencias ± 2,559 nucleotidicas (k) theta por 36,963 ± 9,250 38,136 ±14,102 42,667 ± 25,854 28,396 ± 10,273 secuencia θ 38,915 ± 10,513 Los niveles más altos de diversidad genética por subpoblaciones se observan en la subespecie chiriquensis. Sin embargo, estos resultados parecieran estar influenciados por el bajo número de muestras (n=3). Por ejemplo, la diversidad haplotipica es la más alta posible Hd = 1,000 debido a que los tres individuos muestreados presentaron tres haplotipos diferentes. Por el contrario, los valores de diversidad haplotipica y nucleotidica más bajos los presenta la subpoblación boliviana, a la cual se le asignó el morfotipo chapadensis. En general, los índices de diversidad genética encontrada para cada subespecie o subpoblación asignada son muy altos. 7.3 Heterogeneidad y flujo génico entre las poblaciones Tabla 4. Estadísticos de heterogeneidad genética y flujo génico entre las 4 subpoblaciones de Potos flavus. *, 0.01<P<0.05; ***, P<0.001, Nm = flujo génico. Prueba Valor Probabilidad X² 288,161 0,0335 * Hst 0,00643 Kst Prueba Valor Nm GST 0,02535 19,23 0,0000 *** γST 0,11071 4,02 0,08059 0,0000 *** NST 0,17577 2,34 Kst* 0,05113 0,0000 *** FST 0,16614 2,51 Z 2201,99167 0,0000 *** Z* 7,25293 0,0000 *** 38 Snn 0,80325 0,0000 *** Antes de describir los resultados encontrados, se aclara que los valores de flujo génico que se tomaron en cuenta fueron los suministrados por los estadísticos (γST, NST y FST), ya que el valor de flujo génico estimado con el coeficiente GST está basado en diferencias entre haplotipos y no entre secuencias por lo cual los valores calculados por los otros métodos son más precisos. Tal como se observa en la tabla anterior, todas las pruebas de heterogeneidad presentaron valores significativos. Sin embargo, cuando se observan los valores de flujo génico (Nm) que resultaron ser valores altos y teniendo en cuenta que Nm > 1 indica homogeneidad genética, se puede deducir que las diferencias significativas que muestran las diversas pruebas realizadas, se deben a que el tamaño de la muestra (n=99) es grande por lo tanto los estadísticos utilizados se hacen más sensibles para detectar cualquier cambio que ocurra por más pequeño que este sea. Esta hipótesis que indica que existen diferencias significativas pero que estas diferencias solo las están aportando una pequeña parte de la muestra ya que el flujo génico entre las poblaciones es alta, se corrobora cuando se excluye la subpoblación Boliviana tal como se explica mas adelante. Por otra parte cuando se compara la diferenciación genética por pares de subespecies los resultados son los siguientes: Tabla 5. Estadísticos de heterogeneidad genética (KXY, GST, ΔST, γST, NST, FST y Da) por pares de subespecies. Población 1 Megalotus Megalotus Megalotus Chiriquensis Chiriquensis Chapadensis Población 2 Chiriquensis Chapadensis REGIÓN_AMAZÓNICA Chapadensis REGIÓN_AMAZÓNICA REGIÓN_AMAZÓNICA Kxy 41,24445 37,43137 37,69167 45,54902 45,39063 33,38511 GST 0,04377 0,00992 0,01036 0,04933 0,06770 0,01131 ΔST 0,00957 0,01731 0,00422 0,02009 0,00481 0,00887 γST 0,07097 0,14810 0,03418 0,20716 0,03984 0,07632 NST 0,03637 0,20780 0,06362 0,32868 0,20022 0,19388 FST 0,03029 0,20452 0,05938 0,30959 0,18210 0,19408 Da 0,00454 0,02784 0,00814 0,05128 0,03006 0,02356 Cuando se observan los valores de FST y se tiene en cuenta lo siguiente: valores FST de 0,05 a 0,15 indican poca diferenciación genética, de 0,15 a 0,25, diferenciación genética grande, > 0,25 diferenciación genética muy grande, se concluye que se presenta heterogeneidad genética grande (0,204) entre las poblaciones de megalotus y chapadensis, entre las poblaciones de chiriquensis y Región Amazónica (0,182) y entre chapadensis y Región Amazónica Por su parte, la diferenciación genética entre chiriquensis y chapadensis es muy grande (0,309). No existe 39 diferenciación genética entre megalotus y chiriquensis (0,036) y por último la heterogeneidad entre megalotus y la Región Amazónica es pequeña (0,059). Cuando se realizan estos mismos análisis pero se excluye a la población boliviana (chapadensis) se observan los siguientes resultados mostrados en la tabla 6: Tabla 6. Estadísticos de heterogeneidad genética y flujo génico entre 3 subpoblaciones de Potos flavus. (megalotus, chiriquensis y Región Amazónica). ns, no significativo; *, 0.01<P<0.05; **, 0.001<P<0.01; ***, P<0.001, Nm = flujo génico. Prueba Prueba Valor Probabilidad Valor Nm X² 164,000 0,0648 ns GST 0,03532 13,65 HST 0,00279 0,0390 * γST 0,06016 7,81 KST 0,03250 0,0010 ** NST 0,10481 4,27 KST* 0,01602 0,0020 ** FST 0,09443 4,79 Z 1586,08209 0,0000 *** Z* 7,03813 0,0020 ** Snn 0,84286 0,0000 *** Cuando se excluye la población boliviana aumentan considerablemente los valores de flujo génico para las pruebas, γST, NST, FST, lo que apoya la idea de que la boliviana es una subpoblación aislada y se encuentra diferenciada de las demás. Con respecto a los estadísticos de heterogeneidad la prueba X² pierde la significancia. La comparación de las tres subpoblaciones entre si muestran los siguientes valores que se observan en la tabla 7 para FST. Tabla 7. Estadísticos de heterogeneidad genética (Kxy, GST, ΔST, γST, NST, FST y Da) por pares de subespecies, excluyendo a la subpoblación boliviana. Población 1 Megalotus Megalotus Chiriquensis Población 2 Chiriquensis REGIÓN_AMAZÓNICA REGIÓN_AMAZÓNICA Kxy 41,37778 37,83646 45,40625 GST 0,04377 0,01036 0,06770 40 ΔST 0,00955 0,00422 0,00479 γST 0,07073 0,03423 0,03981 NST 0,03659 0,06336 0,20009 FST 0,03042 0,05929 0,18204 Da 0,00456 0,00813 0,02995 Siguiendo el análisis realizado para los resultados obtenidos con la comparación de las cuatro subpoblaciones, se tiene que: existen diferencias grandes entre las subpoblaciones Chiriquensis y Región amazónica (0,182), y muy pocas diferencias entre Megalotus y Región amazónica Megalotus y Chiriquensis. 7.4 Cambios demográficos De las diferentes pruebas aplicadas para detectar cambios demográficos históricos, solo el estadístico “Fu’s Fs” obtuvo un nivel de significancia y presentó un valor negativo (- 34,156) lo que indica una expansión poblacional. Los estadísticos D*(Fu y Li), F*(Fu y Li), D (Tajima) no fueron significativos. Sin embargo, todos presentaron valores negativos, lo que da indicios y corrobora que la especie a lo largo de su historia evolutiva ha estado sometida a un proceso de expansión poblacional. Estos valores pueden apreciarse en la tabla 8. Tabla 8. Valores de estadísticos para determinar expansiones o constricciones poblacionales. ns = no significativo, * probabilidad significativa. Estadístico P.flavus Megalotus + chapadensis chiriquensis 2 R (Ramos- Región Amazónica 0,0865 0,1375 0,1108 0,0819 0,0011 0,0137 0,0220 0,0018 D*(Fu y Li) -1,50098 ns 0,09594 ns -1,78380 ns -1,82903 ns F*(Fu y Li) -1,67878 ns -0,10316 ns -1,89263 ns -1,99828 ns Fu’s Fs -34,156 (0,000)* -1,596 ns -0,689 ns -13,463 (0,000)* D (Tajima) -1,26775 ns -0,53055 -1,26139 ns -1,42111 Onsins y Rozas) r (estadístico raggedness) Estas pruebas fueron aplicadas también para la subpoblaciones analizadas. En el caso de los individuos agrupados dentro de chiriquensis, que son apenas tres para efecto de estos análisis se incluyeron dentro de la población de las muestras también colombianas pero agrupadas como megalotus. 41 En general, todos los estadísticos presentan valores negativos con excepción de D*(Fu y Li) para la subpoblación Megalotus + chiriquensis (0,09594). Solamente el estadístico Fu’s Fs fue significativo para la Región amazónica, lo que también sugiere indicios de expansión cuando el análisis se realiza por subpoblaciones. Con respecto al análisis de distribución Mismatch fueron calculados los estadísticos R2 y r que pueden ser observados en la tabla 8. Se aplicó la prueba a la población en general y a cada una de las subpoblaciones que se definieron para las demás pruebas de cambios demográficos. Las figuras 8 a la 15 muestran lo encontrado para cada caso. Figura 8. Gráfico de distribución de diferencias entre pares de secuencias (Distribución Mismatch) para un modelo de tamaño poblacional constante para P. flavus Figura 9. Gráfico de distribución de diferencias entre pares de secuencias (Distribución Mismatch) para un modelo crecimiento/declinación poblacional en P. flavus. 42 En el caso de la población en general, se observa claramente que la distribución más ajustada se da cuando hay un modelo de expansión poblacional, lo cual es validado por el pequeño valor del estadístico r. Figura 10. Gráfico de distribución de diferencias entre pares de secuencias (Distribución Mismatch) para un modelo de tamaño poblacional constante para megalotus + chiriquensis Figura 11. Gráfico de distribución de diferencias entre pares de secuencias (Distribución Mismatch) para un modelo crecimiento/declinación poblacional en megalotus + chiriquensis. Cuando se analizan las gráficas obtenidas para la subpoblación megalotus + chiriquensis, se observa que aunque el ajuste de la curva no es el ideal (r=0,0137), por lo tanto hay más coherencia entre la gráfica obtenida para un modelo de cambio poblacional, en concreto de expansión poblacional. 43 Figura 12. Gráfico de distribución de diferencias entre pares de secuencias (Distribución Mismatch) para un modelo de tamaño poblacional constante para chapedensis. Figura 13. Gráfico de distribución de diferencias entre pares de secuencias (Distribución Mismatch) para un modelo crecimiento/declinación poblacional en chapadensis. Un resultado similar al descrito anteriormente para megalotus + chiriquensis, se da en chapadensis, cuando se analizan las gráficas obtenidas para la subpoblación no se observa un buen ajuste (r=0,0220), pero si se observa más relación entre lo esperado y lo observado para la gráfica obtenida para un modelo de cambio poblacional. 44 Figura 14. Gráfico de distribución de diferencias entre pares de secuencias (Distribución Mismatch) para un modelo de tamaño poblacional constante para Región Amazónica. Figura 15. Gráfico de distribución de diferencias entre pares de secuencias (Distribución Mismatch) para un modelo crecimiento/declinación poblacional en Región Amazónica. Para la subpoblación amazónica, se evidencia una clara expansión poblacional. De acuerdo con los resultados obtenidos, el nivel de ajuste (estadístico raggednes) depende del tamaño de la muestra. Aunque para megalotus + chiriquensis, y para chapadensis ninguna de las dos graficas se ajustó idealmente, si se observó un ajuste más pronunciado cuando se aplica un modelo de cambio poblacional, lo que soporta los análisis iniciales que mostraron una tendencia a la expansión poblacional tanto para P.flavus como para las subespecies valoradas. Por ultimo para explorar las posibles contracciones o expansiones poblacionales en la especie estudiada se obtuvieron las siguientes gráficas con métodos bayesianos; estos análisis se realizaron para el conjunto de los datos de los dos genes mitocondriales. 45 Figura 16. “Bayesian skyline plot” (BSP) obtenido para las secuencias de Cyt-b para P. flavus , teniendo en cuenta los últimos 1.3 MY de diversificación mitocondrial. Según lo evidenciado en la anterior gráfica, podría suponerse que la especie en los últimos 1,3 millones de años mostró un comportamiento de tamaño relativamente constante hasta los últimos 120.000 años, en donde se observa un rápido fenómeno de expansión poblacional. 46 Figura 17. “Bayesian skyline plo” (BSP) obtenido para las secuencias de NADH5 for P. flavus asumiendo una diversificación mitocondrial en los últimos 1,15 MA. Para el set de datos obtenidos con NADH5 el comportamiento observado para los últimos 1.15 MA es el siguiente: Un crecimiento constante hasta los últimos 100.000 años en donde se evidencia una rápida expansión poblacional, que se detiene aproximadamente en los últimos 25 mil años, para comenzar un descenso en los últimos 15.000 años. 7.5 Tiempos de divergencia Para el conjunto de las 99 muestras de NADH5, se encontraron 83 haplotipos definidos por 191 sitios variables. La red de haplotipos no permitió separar completamente a las subpoblaciones. Sin embargo, tal como se describe a continuación, la agrupación de algunos individuos y el cálculo de los tiempos de divergencia si permite hacer inferencias siguiendo la tendencia que se mostró en los arboles filogenéticos de la agrupación de un grupo boliviano y otro grupo peruano. H_22 fue el haplotipo con la frecuencia relativa más alta agrupando 4 individuos, 3 individuos 47 correspondientes al morfotipo chapadensis y uno proveniente de Cajamarca en Perú. Los haplotipos que siguen en frecuencia relativa fueron: Hap_11 con tres individuos peruanos, 2 provenientes de Tingomaria, (Huanaco) y uno proveniente de la región de Pucallpa en Ucayali; Hap_18, representado por tres individuos, uno de Amacayacu, Amazonas colombiano, otro de San Francisco también localidad amazónica colombiana y otro individuo proveniente de Iquitos, amazonia peruana; Hap_82 agrupó 3 individuos todos provenientes del departamento de Loreto en la amazonia peruana; el siguiente grupo de haplotipos estuvo representado por 2 individuos cada uno: Hap_20 , individuos provenientes de Puerto Nariño y San Francisco, dos localidades amazónicas colombianas; Hap_25, los individuos provienen del departamento de Ucayali en el Perú; Hap_46, fueron muestreados en Pasco, Perú; Hap_66, de Yarinococha, departamento de Ucayali (Perú); Hap_67, este también se encontró representando por dos muestras peruanas de Ucayali; Hap_74, este haplotipo representó dos individuos bolivianos provenientes de Cochabamba y Tarija; por último el Hap_80 agrupó dos muestras provenientes de la región oriental de Colombia, Meta. Los 72 haplotipos restantes se encontraron en un individuo cada uno. Debido al gran número de haplotipos teniendo en cuenta el número de muestras y que no existieron uno o varios haplotipos con una frecuencia relativa alta, no fue posible considerar haplotipos ancestrales o descendientes. Sin embargo, se calculó el estadístico rho para determinar los posibles tiempos de divergencia entre los más frecuentes y los restantes, en la tabla 9 se observa el valor estimado de divergencia calculado para algunos haplotipos. 48 Tabla 9. Valor calculado para el estadístico rho y su equivalencia en años, para el gen mitocondrial NADH5, utilizando un modelo mutacional de 309.310 años para NADH5. No de Haplotipo rho Tiempo en años 22 AL 74 0,66667 206.207,70 66 AL 67 2 618.620,00 22 AL 55 5,8 1.793.998,00 22 AL 27 7 2.165.170,00 22 AL 66 8,6667 2.680.696,98 22 AL 41 9,4 2.907.514,00 22 AL 11 11,143 3.446.641,33 25 AL 30 11,333 3.505.410,23 22 AL 56 12,2 3.773.582,00 22 AL 53 13,8 4.268.478,00 22 AL 80 14,667 4.536.649,77 22 AL 76 14,8 4.577.788,00 22 AL 20 15,333 4.742.650,23 22 AL 26 17,4 5.381.994,00 22 AL 51 18,4 5.691.304,00 22 AL 82 18,857 5.832.658,67 22 AL 18 19,714 6.097.737,34 22 AL 17 22,4 6.928.544,00 50 AL 51 25,5 7.887.405,00 22 AL 46 37,333 11.547.470,23 17 AL 4 40,5 12.527.055,00 1 AL 17 41 12.681.710,00 32 AL 11 49,5 15.310.845,00 En la tabla anterior se observa que el mayor tiempo de divergencia fue estimado en 15.310.835,00 años, esta diferencia fue encontrada entre un haplotipo de origen amazónico (Iquitos) y un haplotipo también peruano pero proveniente de Huanuco y Ucayali; el segundo tiempo de divergencia en importancia es de 12.681.710,00 años y se presentó entre dos haplotipos de muestras colombianas uno proveniente de del Parque Nacional Natural Los Katíos, en Rio Sucio Chocó (chiriquensis) y otro de Zaragoza Antioquia en la cordillera occidental de los andes colombianos; el tercer tiempo (12.527.055,00 de años) se halló también entre dos haplotipos provenientes de Colombia uno de Rio Sucio Choco y otra muestra obtenida en la localidad de San Francisco en la amazonia colombiana. 49 Otros tiempos de divergencia en orden descendente son mostrados a continuación; 11.547.470,23 años de divergencia fueron encontrados para un haplotipo representado por muestras de 3 individuos bolivianos más uno proveniente del departamento de Cajamarca (Perú) y otro haplotipo que contiene muestras de 2 individuos muestreados en Pasco (Perú); 7.887.405,00 años, esta diferencia corresponde al tiempo de divergencia entre un haplotipo representado por un individuo de Leticia (Colombia) contra un haplotipo representando por un individuo asignado al morfotipo chiriquensis; por el contrario la divergencia más reciente ocurrió hace 206.207,70 años y se dio entre un haplotipo boliviano y un haplotipo representado por dos muestras asignadas a la misma subespecie chapadensis. A continuación (tabla 10) se presenta la descripción de los haplotipos obtenidos para los resultados descritos anteriormente y para el grupo de secuencias de cyt b (tabla 11). Tabla 10. Descripción de haplotipos encontrados para el gen mitocondrial NADH5 Haplotipo Frecuencia Subespecie o Muestra y localidad subpoblación asignada Hap_1 1 megalotus POTOSFLAVUS144ZARAGOCOLOM Hap_2 1 POTOSFLAVUS150DECOMISOELDORADO Hap_3 1 Región Amazónica megalotus Hap_4 1 POTOSFLAVUS15SANFRANCISCOLOM Hap_5 1 Hap_6 1 Hap_7 1 Hap_8 1 Hap_9 1 Hap_10 1 Hap_11 3 Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica POTOSFLAVUS1588ZARAGOCOLOM POTOSFLAVUS173PTONARCOLOM POTOSFLAVUS19ELARATENAECUA POTOSFLAVUS21FATIMAECUA POTOSFLAVUS22-1FATIMAECUA POTOSFLAVUS22FATIMAECUA POTOSFLAVUS104PASCOPERU POTOSFLAVUS87TINGOMAPERU POTOSFLAVUSN11PUCALLPAPERU POTOSFLAVUS23TINGOMA 50 Hap_12 1 Hap_13 1 Hap_14 1 Hap_15 1 Hap_16 Hap_17 Hap_18 1 1 3 Hap_19 Hap_20 1 2 Hap_21 Hap_22 1 4 Hap_23 Hap_24 Hap_25 1 1 2 Hap_26 Hap_27 1 1 Hap_28 1 Hap_29 1 Hap_30 1 Hap_31 1 Hap_32 1 Hap_33 1 Hap_34 1 Hap_35 1 Hap_36 Hap_37 1 1 Hap_38 1 Hap_39 1 Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica chapedensis chiriquensis Región Amazónica chapadensis Región Amazónica chapadensis Chapadensis (3) Región Amazónica (1) Chapadensis megalotus Región Amazónica Chapadensis Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica chapadensis Región Amazónica Región Amazónica Región POTOSFLAVUS83IQUITOSPERU POTOSFLAVUS1IQUITOSPERU POTOSFLAVUS19TARAPOTOCOLOMBIA POTOSFLAVUSSANFRANCCOLOM POTOSFLAVUS27CAMPOYUBOLIVIA POTOSFLAVUS126PNLOSKATIOSCOLOM POTOSFLAVUS31AMACAYACUCOLOM POTOSFLAVUS69IQUITOSPERU POTOSFLAVUSSANFRANCICOCOLOM POTOSFLAVUS32CAMPOYUBOLIVIA POTOSFLAVUS33PTONARI COLOM POTOSFLAVUS66SANFRANCOLOM POTOSFLAVUS36CAMPOYUBOLIVIA POTOSFLAVUS39CAMPOYUBOLIVIA POTOSFLAVUS45CAMPOYUBOLIVIA POTOSFLAVUSN2CHUCHINIBOLIVIA POTOSFLAVUSCAJAMARCAPERU POTOSFLAVUS40CAMPOYUBOLIVIA POTOSFLAVUS2VILLAHERTOLIMACOLOM POTOSFLAVUS42LAESCALERAUCAYAPERU POTOSFLAVUS86UCAYALIPERU POTOSFLAVUS44CAMPOYUBOLIVIA POTOSFLAVUS47NANAYRIOPERU POTOSFLAVUS52QUISTOCIQUITOSPERU POTOSFLAVUS56SANJOAQPERU POTOSFLAVUS59LORETOPERU POTOSFLAVUS61IQUITOS POTOSFLAVUS62BORAIQUITOSPERU POTOSFLAVUS4TINGOMARIAPERU POTOSFLAVUS63IQUITOSPERU POTOSFLAVUS64LALIBERTADCOLOM POTOSFLAVUS65CHIMOREBOLIVIA POTOSFLAVUS68PTONARICOLOM POTOSFLAVUS70PASCOPERU POTOSFLAVUS71NAPOPERU 51 Hap_40 Hap_41 1 1 Hap_42 1 Hap_43 1 Hap_44 1 Hap_45 1 Hap_46 2 Hap_47 1 Hap_48 1 Hap_49 Hap_50 1 1 Hap_51 Hap_52 Hap_53 Hap_54 Hap_55 Hap_56 Hap_57 1 1 1 1 1 1 1 Hap_58 Hap_59 1 1 Hap_60 Hap_61 Hap_62 1 1 1 Hap_63 Hap_64 1 1 Hap_65 Hap_66 1 2 Hap_67 2 Hap_68 1 Hap_69 1 Hap_70 Hap_71 1 1 Amazónica chapadensis Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica chapedensis Región Amazónica chiriquensis megalotus chiriquensis megalotus megalotus megalotus Región Amazónica chapadensis Región Amazónica megalotus megalotus Región Amazónica megalotus Región Amazónica chapadensis Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica Región Amazónica megalotus megalotus POTOSFLAVUS6CAMPOYUQBOLIVIA POTOSFLAVUS82BELLAVINAPOPERU POTOSFLAVUS85NAPORIOPERU POTOSFLAVUS92PASCOPERU POTOSFLAVUS93PASCOPERU POTOSFLAVUSCERROJONAPASCOPERU POTOSFLAVUSCERROJONAPASCOPERU POTOSFLAVUS89PASCOPERU POTOSFLAVUSHUANACO10PERU POTOSFLAVUSPASCO105PERU POTOSFLAVUS8LATEJERIABOLIVIA POTOSFLAVUS112LETICIACOLOM POTOSFLAVUS118RIOSUCIOCOLOM POTOSFLAVUS125VALLEDCOLOM POTOSFLAVUS126RIOSUCIOCCOLOM POTOSFLAVUS127BOCARIARIVAUPESCOLOM POTOSFLAVUS142VILLAVMETACOLOM POTOSFLAVUS149CUNDINCOLOM POTOSFLAVUS152ARARACAQUETACOLOM POTOSFLAVUS13CAMPOYUBOLIVIA POTOSFLAVUS156AMACAYACUCOLOM POTOSFLAVUS157ZARAGOZACOLOM POTOSFLAVUS158ZARAGOZACOLOM POTOSFLAVUS159COLOMBIA POTOSFLAVUS160PNNMUNCHIQUECOLOM POTOSFLAVUSPTONARINOCOLOM POTOSFLAVUSN1STCRUZBOLIVIA POTOSFLAVUS14YARINACPERU POTOSFLAVUS18YARINACPERU POTOSFLAVUSN8PUCALLPPERU POTOSFLAVUSN12PUCALLPERU POTOSFLAVUSN9PUCALLPPERU POTOSFLAVUSN10PUCALLPERU POTOSFLAVUSCHAMEZACASANARECOLOMBIA POTOSFLAVUSRISARALDACOLOMBIA 52 Hap_72 1 Hap_73 1 Hap_74 2 Hap_75 1 Hap_76 Hap_77 1 1 Hap_78 1 Hap_79 Hap_80 1 2 Hap_81 1 Hap_82 3 Hap_83 1 Región Amazónica Región Amazónica chapadensis Región Amazónica chapadensis modestus Región Amazónica chapadensis modestus Región Amazónica Región Amazónica modestus POTOSFLAVUSARCATENANECUADOR POTOSFLAVUSARCATENANECUADOR POTOSFLAVUS16CAMPOYU BOLIVIA POTOSFLAVUS24SAJTABOLIVIA POTOSFLAVUSN25BELEMBRASIL POTOSFLAVUSN24BOLIVIA POTOSFLAVUS122PNCUEVAGUACHAROSCOLO M POTOSFLAVUS78INDIANAPERU POTOSFLAVUS41CAMPOYUBOLIVIA POTOSFLAVUSN13METACOLOMBIA POTOSFLAVUS147SANMARTINMETACOLOMBIA POTOSFLAVUSN3VIRACOCPERU POTOSFLAVUS77IQUITOS PERU POTOSFLAVUS95RIOGALV PERU POTOSFLAVUS21IQUITOSPERU POTOSFLAVUS138MAGUANORSANTANDERCOL OM Tabla. 11 Descripción de haplotipos encontrados para el gen mitocondrial Cyt-b Haplotipo Frecuencia Subespecie o Muestra y localidad subpoblación asignada Hap_1 2 Región Amazónica POTOS103HUANACOPERU POTOS86PADREABADUCAY Hap_2 3 megalotus (1) POTOSN13JAIMEDUQUECOMETA POTOS63IQUITOSPERU Región Amazónica (2) POTOS61IQUITOSPERU Hap_3 1 Región Amazónica POTOSN11OPUCALLPAPER Hap_4 1 Región Amazónica POTOSN9PUCALLPAPERU Hap_5 1 Región Amazónica POTOS64LALIBERTADCOLOMBIA Hap_6 1 Chapedensis POTOS65RCHIMORECOCHABAMBA Hap_7 1 Megalotus POTOS160MUNCHIQUETAMBOCOLOM Hap_8 1 Región Amazónica POTOS105PASCOPERU Hap_9 1 Región Amazónica POTOS71RNAPOPERU Hap_10 1 Región Amazónica POTOS70PASCOPERU 53 Hap_11 1 Región Amazónica POTOS15SANFRANCISCOLOM Hap_12: 1 Región Amazónica POTOS95RIOGALVEZPERU Hap_13 1 Chapadensis POTOS40CAMPOYUQUIBOLIVIA Hap_14 1 Región Amazónica POTOS99CAJAMARCAPERU Hap_15 1 Región Amazónica POTOS59LORETOPERU Hap_16 1 Región Amazónica POTOS31AMACAYACUCOLOM Hap_17 1 Región Amazónica POTOS1IQUITOSPERU Hap_18 1 Megalotus POTOS16RISARALDACOLOM Hap_19 1 Región Amazónica POTOS103MACASECUADOR Hap_20 1 Región Amazónica POTOS104MACASECUADOR Hap_21 1 Región Amazónica POTOS82RIONAPOPERU Con respecto a la red de haplotipos obtenida para el gen mitondrial Cyt b, se encontraron 21 haplotipos de 24 muestras y 59 sitios variables, el haplotipo más representado (Hap_2), mostró una frecuencia relativa de tres individuos, seguido por el Hap_2 que incluyó dos individuos provenientes de Ucayali (Perú9). Los demás 19 haplotipos están representados por un solo individuos cada uno, como en el caso de los análisis realizados con NADH5 no es posible determinar unos haplotipos ancestros o descendientes. Las figuras 18 y 19 muestras las redes de haplotipos para cada gen, por otra parte en la tabla 12 se presentan algunos cálculos de tiempos de divergencia entre los haplotipos obtenidos con cyt b. 54 Figura 18. Red de haplotipos para NADH5. Verde, amazónica, azul, chiriquensis, naranja megalotus, purpura chapadensis. 55 Figura 19. Red de haplotipos para cyt b. Verde, amazónica, azul, chiriquensis, naranja megalotus, purpura chapadensis. Tabla 12. Valor calculado para el estadístico rho y su equivalencia en años, utilizando un modelo mutacional de 153.976 años para cyt b. Haplotipo 2 AL 15 2 AL 21 9 AL 16 4 AL 5 2 AL 9 2 AL 11 2 AL 10 2 AL 16 6 AL 13 6 AL 1 2 AL 13 2 AL 6 2 AL 12 2 AL 3 2 AL 5 2 AL 18 2 AL 4 2 AL 7 2 AL 8 2 AL 1 10 AL 13 6 AL 14 18 AL 16 15 AL 13 10 AL 18 14 AL 18 7 AL 15 10 AL 1 19 AL 1 rho tiempo de divergencia en años 0,5 76.988,00 0,5 76.988,00 0,5 76.988,00 0,5 76.988,00 1 153.976,00 1,25 192.470,00 1,25 192.470,00 1,25 192.470,00 2,5 384.940,00 4,3333 667.229,33 6,25 962.350,00 6,25 962.350,00 6,25 962.350,00 7 1.077.832,00 7 1.077.832,00 7,25 1.116.326,00 7,25 1.116.326,00 7,5 1.154.820,00 8 1.231.808,00 11,2 1.724.531,20 12 1.847.712,00 13 2.001.688,00 13 2.001.688,00 13,5 2.078.676,00 14 2.155.664,00 15 2.309.640,00 16 2.463.616,00 18 2.771.568,00 19,333 2.976.869,33 56 Los tiempos de divergencia estimada mediante los arboles bayesianos tal como se observan en la figura 7 C son los siguientes. De acuerdo con el gen mitocondrial NADH5 aparentemente Potos divergió de Procyonidae, específicamente de Bassaricyon alleni, que fue la especie empleada como grupo externo hace alrededor de 23,71 MA. La primera diversificación dentro del género se dio hace 13,64 MA separándose en dos grandes grupos que a su vez se diversificaron hace 13,36 y 11,89 MA. Dentro del primer grupo el mayor número de linajes fueron diferenciados entre 6,61 MA y 1,2 MA, para el segundo de 8,79 MA a 1,73 MA. Para el gen cyt b el árbol bayesiano muestra una separación inicial del 41,57 MA, tiempo en el que Potos aparentemente divergió de los canidos teniendo en cuenta que la especie utilizada como grupo externo es un zorro. El primer proceso de diversificación dentro del género ocurrió hace 23,69 MA cuando se dividió en dos grandes grupos. Estos a su vez divergieron a los 21,38 y 16,04 MA. Dentro del primer grupo los principales procesos de diferenciación se han dado entre los 15,01 MA y 2,75 MA; para el segundo grupo el mayor número de linajes fueron diferenciados entre 10,59 y 1,77 MA. Estos resultados deben ser tomados con precaución ya que como la especie utilizada como grupo externo es una especie de la cual Potos divergió hace mucho tiempo, los valores obtenidos para el resto de las divergencias van a estar sesgados por ese valor inicial que es muy distante. 8 DISCUSIÓN /CONCLUSIONES 8.1 Filogenia y correspondencia de supuestas especies definidas morfológicamente La agrupación inicialmente evidenciada a partir de los arboles construidos por diversos métodos, para los dos genes, que muestra un grupo boliviano parece ser soportado también por los análisis de heterogeneidad, flujo genético y por la red de haplotipos. Los doce individuos conformaron el mismo grupo en todos los árboles, incluyéndose también un individuo de origen peruano proveniente de Cajamarca. Por otra parte en los análisis de heterogeneidad genética se observó que cuando se comparan las poblaciones por pares, los valores mayores de heterogeneidad resultan cuando se realiza la comparación contra chapensis, encontrándose la mayor diferencia con la población más alejada geográficamente que en este caso es chiriquensis. En ese mismo orden megalotus también diverge y se observa que la menor 57 diferenciación se da con la población amazónica que es también la más cercana. De esta manera se sugiere que la población boliviana si está aislada de las demás poblaciones. Otra prueba de lo anterior son los análisis de flujo génico cuando se excluye la población boliviana, estos valores aumentan considerablemente, de la misma manera al excluir esta población del análisis de heterogeneidad se muestra que el estadístico X² pierde su nivel de significancia estadística dando una idea de que chapadensis aporta gran parte de las diferencias que fueron consideradas como significativas. Una vez se realizó el análisis de los haplotipos también se observó la agrupación de las 12 muestras que se presentaron en los arboles de filogenia. Por su parte, las muestras bolivianas que se encuentran por fuera en estos árboles también se muestran distanciadas en la red de haplotipos. Nuevamente, en este grupo se incluye la muestra proveniente de Cajarmarca Perú que comparte haplotipo con dos muestras provenientes de Cochabamba (Bolivia). Estas dos regiones son montañosas y se encuentran conectadas por la cordillera. Sin embargo, tampoco es claro porque el haplotipo solamente se encuentra en Cajamarca y no se ha dispersado por otras zonas peruanas cercanas. Sin embargo, como se verá más adelante existe también un aparente aislamiento geográfico de algunas muestras peruanas cuando se calcula el tiempo de divergencia. Por último los niveles más bajos de diversidad genética por subpoblación fueron presentados por chapadensis. Tal como lo indica preliminarmente Ruiz–García et al. (2012a) y de acuerdo con lo anterior se sugiere que sí existe una correspondencia limitada entre las subespecies morfológicas tal como las mencionan Ford & Hoffmann (1988), por lo menos para el morfotipo descrito como P. f. chapadensis (Allen en 1904) con localidad tipo en Chapada, Matto Grosso en Brasil, región continua a las localidades muestreadas en Bolivia, por lo que se esperaría que la subespecie encontrada en esta región de Brasil sea igual a la que se tomó para efectos del presente estudio como chapadensis. Teniendo en cuenta estos resultados, se puede sugerir que este grupo, además de estar separado geográficamente, pueden conformar un grupo históricamente aislado ameritando que se trate como una Unidad Evolutiva Significativa (sensu Moritz 1994). Esto, sin embargo, se debe verificar haciendo un análisis con un mayor número de muestras. 58 Por otra parte se observa que para los arboles construidos con las secuencias de NADH5 se forma un grupo que fue llamado en la sección de resultados como peruano. Este incluye 15 individuos provenientes de los departamentos de Huanuco, Ucayali y Pasco (zona centro y amazonía sur de la geografía peruana) y una muestra que proviene del departamento de Risaralda en Colombia. Con respecto a las 14 muestras peruanas, estas se encuentran alejadas de otras muestras peruanas pero que provienen de los departamentos de Loreto y San Martin y de la muestra peruana proveniente de Cajamarca de la que se habló en un análisis anterior (todas ellas más al norte en la geografía peruana). La red de haplotipos mostró una conformación similar agrupándose de manera cercana estas 15 muestras incluyendo la colombiana, como se puede observar en la tabla 8 el valor más alto de divergencia calculado entre la red de haplotipos, la presentaron dos muestras peruanas, un haplotipo proveniente del departamento de Loreto y otro que incluía individuos de los departamentos de Huanuco y Ucayali. De acuerdo con los datos moleculares, se puede determinar que las muestras agrupadas inicialmente dentro de la población peruana que provienen de los departamentos de Pasco, Huanuco y Ucayali, deben ser tratadas como una subpoblación diferente, por lo menos, de acuerdo a los datos obtenidos en este caso. Sin embargo, se observa cierto nivel de flujo génico ya que algunas muestras que provienen de esos departamentos se encontraron relacionadas en los árboles y en la red de haplotipos con muestras amazónicas. Una vez más existe un indicio de que hay ciertas barreras geográficas que podrían haber aislado a ciertas poblaciones de Potos flavus. Posiblemente se trate de la cordillera andina, ya que las poblaciones que se han mostrado con algún grado de aislamiento comparten como característica estar sobre la cordillera en Bolivia y Perú o en el piedemonte de la misma. Sin embargo, no existe un morfotipo definido para esa área geográfica que permita evaluar una posible correspondencia entre una subespecie morfológica y los datos moleculares. No obstante, de forma preliminar podría considerarse a esta población como una Unidad Evolutiva Significativa. Aparentemente para las muestras amazónicas de Colombia, Ecuador y norte de la Amazonía del Perú y para las muestras de megalotus, no existe una diferenciación genética que permita construir grupos determinados y bien soportados. Los análisis de flujo génico también presentaron valores importantes que sugieren conexión entre esas subpoblaciones; sin embargo, cuando se evalúan los datos de heterogeneidad por subpoblaciones, se observa que entre chiriquensis y las muestras de la región amazónica (Perú, Colombia y Ecuador) si existen valores 59 que permiten determinar heterogeneidad genética entre esas dos subpoblaciones. Esto se observa en los árboles y en la red de haplotipos para NADH5. Se evidencia que estas muestras presentaron una distancia de separación importante. Sin embargo, este resultado está muy seguramente influenciado por el bajo número de muestras con que se cuenta para chiriquensis. Por lo tanto, se recomiendan estudios que incluyan más ejemplares que correspondan con el morfotipo de chiriquensis y se incluyan poblaciones centro americanas que permitan determinar si efectivamente corresponde a subespecies que deban ser tratadas como Unidades Evolutivas Significativas. Para el caso de las muestras denominadas (POTOSFLAVUS159COLOMB, POTOSFLAVUS150COLOMB y POTOSFLAVUSN13METACO), para las que se conocía el país de origen geográfico, pero no la localidad exacta, teniendo en cuenta los arboles filogenéticos y la red de haplotipos se permitió determinar que posiblemente el individuo 159 y 150 provenientes de Colombia son individuos de origen amazónico dado su cercanía con miembros de ese grupo en los árboles y ubicación en la red. Por su parte, para el individuo N13 se estableció que procede de la región oriental de Colombia ya que comparte el mismo haplotipo con un individuo proveniente de San Martin Meta, individuo con el que se relacionó mediante una alta probabilidad en el árbol bayesiano. Se observa que la frecuencia relativa de los haplotipos se encuentran distribuidos por el rango de distribución estudiado casi uniformemente con unas pequeñas excepciones que no agrupan más de 4 individuos, por lo que se sugiere que esta especie no siguió un modelo de especiación que permitiera establecer un haplotipo ancestral, al asentarse por un tiempo considerable en una zona geográfica determinada, que le permita dejar una marca molecular y de allí dispersarse a otros sitios convirtiéndolos en haplotipos descendientes. Al contrario, pareciera que la especie se hubiera distribuido rápidamente a través de varios puntos geográficos sin tener un claro origen geográfico, al menos, en Sudamérica. Esta hipótesis podría ser considerada si se tiene en cuenta que Kays et al, (2000), mediante microsatélites, determinó la organización social del Potos flavus encontrando que la hembra es la que se dispersa a otros lugares fuera de su grupo original. Este modelo de dispersión es inusual en sistemas de mamíferos, y no se conoce en otras especies de carnívoros (Greenwood 1980, Fuller et al. 1992, McNutt 1996, Waser 1996). Por lo tanto, los kinkajous parecen ser inusuales entre los mamíferos por tener una dispersión sesgada hacia la 60 hembra (Greenwood 1980, Kays 1999). Teniendo en cuenta que los análisis son realizados con secuencias de ADN mitocondrial, este comportamiento pudiera ser un indicio de la explicación de los altos niveles de diversidad genética y de gran cantidad de haplotipos distribuidos por todo el rango de distribución de la especie. Adicionalmente apoya la hipótesis de que una barrera geográfica pudo interferir para la dispersión de las hembras de kinkajou que habitan en zonas de la cordillera de los Andes peruanos y bolivianos. 8.2 Diversidad genética, heterogeneidad genética y flujo génico La especie, en general, presenta niveles elevadísimos de diversidad genética (Hd=0,995 y π=0,12569). Estos superan los niveles encontrados en otras especies tales como en lo mustélidos Eyra barbara (Hd = 0.972 and π = 0.0661; Ruiz-García et al.2012 a) y Lontra felina (Hd = 0.93 and π = 0.005; Vianna et al. 2010), en 3 especies de zorros neotropicales, Pseudoalopex culpaeus (Hd = 0.952 y π = 0.008), Pseudoalopex sechurae (Hd = 0.893 y π = 0.015; Ruiz-García et al. 2012b) y Cerdocyon thous (Hd = 0.830 y π = 0.019; Tchaika et al. 2006); también se muestra niveles superiores a los encontrados para felinos tales como, Leopardus jacobita (Hd = 0.557 y π = 0.0047; Ruiz-García et al. 2012 c) y Leopardus guigna (Hd = 0.94 y π = 0.00461; Napolitano et al. 2012), incluso para felinos que han mostrado niveles de diversidad muy altos tales como el jaguarundí, Puma yaguaroundi (Hd = 0.940 y π = 0.072; Ruiz-García and Pinedo-Castro 2012), jaguar, Panthera onca, (Hd = 0.937 y π = 0.078; Ruiz-García et al. 2012d), Leopardus pajeros (Hd = 0.932 and π = 0.0513; Ruiz-García et al. 2012c) y Leopardus pardalis (Hd = 0.962 and π = 0.068; Eizirik et al. 1998). Estos altos niveles de diversidad genética pueden correlacionarse con las diferencias morfológicas de los individuos encontrados a lo largo del rango de distribución de la especie tal como lo describen autores como Cabrera (1958), Hall (1981) y Kortlucke (1973) Con respecto a los resultados de heterogeneidad se observó significancia de los estadísticos evaluados. Sin embargo, y teniendo en cuenta los valores elevados de flujo génico, esta heterogeneidad es relativamente pequeña. Como el tamaño de la muestra es relativamente grande, permite que los estadísticos detecten estas diferencias, aunque como se mencionó anteriormente, la mayor parte de los estadísticos analizados fueron relativamente bajos. No obstante, el grupo 61 boliviano fue claramente detectable al igual que la población del centro y sur de la Amazonía peruana, al menos, para el marcador NADH5. 8.3 Cambios demográficos y tiempos de divergencia. Los test aplicados para evaluar posibles eventos de constricciones o expansiones poblacionales, muestran una tendencia que sugiere que la especie ha expandido sus poblaciones en algún momento de su historia evolutiva. Esto es corroborado por las gráficas obtenidas por métodos bayesianos que sugieren que la especie aumentó sus poblaciones considerablemente en los últimos 120.000 años en el caso de NADH5 y, para el cyt b, en los últimos 100.000 años. De acuerdo con el árbol bayesiano para NADH5, la primera diversificación dentro del género se dio hace 13,64 MA separándose en dos grandes grupos que a su vez se diversificaron hace 13,36 y 11,89 MA. Dentro del primer grupo, el mayor número de linajes fueron diferenciados entre 6,61 MA y 1,2 MA, mientras que para el segundo de 8,79 MA a 1,73 MA. Para el gen cyt b, el árbol bayesiano mostró el primer proceso de diversificación dentro del género hace 23,69 MA cuando se dividió en dos grandes grupos. Estos a su vez divergieron a los 21,38 y 16,04 MA. Dentro del primer grupo. Los principales procesos de diferenciación se dieron entre los 15,01 MA y 2,75 MA; para el segundo grupo, el mayor número de linajes fueron diferenciados entre 10,59 y 1,77 MA. Las divergencias entre las redes de haplotipos para NADH5 no fueron iguales a los que se calcularon para los análisis bayesianos, pero si resultan tener alguna similitud sobre todo con el primer tiempo calculado para la divergencia dentro del género, los tiempos de divergencia entre los haplotipos calculados oscilaron entre 206.207,70 y 15.310.845,00 años. Para el cyt b la menor divergencia fue de 76.988,00 y la mayor de 2.976.869,33 años. La diferencia encontrada para esta prueba entre los dos genes puede deberse a que el análisis para NADH5 se realizó con muchas más muestras lo que permite encontrar haplotipos más o menos divergentes que si tengo una población pequeña, adicionalmente debe tenerse en cuenta que las tasas de mutación para los dos genes son muy diferentes. 62 De acuerdo con las divergencias encontradas entre los haplotipos para las secuencias de NADH5 se sugiere una diversificación entre 206.207,70 y 15.310.845,00 años, lo que es un tiempo mucho mayor al calculado preliminarmente por Ruiz–García et al, (2012a), con 24 secuencias de Cyt b, y los tiempos para el mismo gen calculados en el presente estudio, en donde se encontró una posible diversificación del género en los últimos 3 millones de años e incluso los últimos 40.000, sin embargo como se mencionó antes este resultado esta problablemente muy sesgado al número de muestras utilizadas y a que el valor de mutación utilizado para el gen de Cyt b es menor al que se utiliza para NADH5. De acuerdo con el punto de vista paleontológico, al parecer Potos está altamente emparentado con el género Bassaricyon, basados en su presunta relación con los géneros extintos Bassaricyonoides y Parapotos que de acuerdo a lo descrito por Baskin (2003) parecen divergir en el Mioceno Temprano (15-20 Millones de años), lo cual concuerda con Simpson’s (1945) quien supone un ancestro del Kinkajou en el Mioceno sobre la base de su morfología altamente derivada. Sin embargo, teniendo en cuenta los datos moleculares (Fulton y Strobeck, 2006, Koepfli et al, 2007), Potos no sería un linaje hermano de Bassaricyon. Así entonces el registro fósil más cercano, ya que Potos no cuenta con registro fósil, es Parapotos cuya diversificación habría ocurrido en el Mioceno en Norteamérica (15 Millones de años). Por lo tanto de acuerdo con los datos paleontológicos, no está claro cuando el género Potos apareció y donde comenzó su diversificación. La revisión realizada por Soibelzon & Prevosti (2013), acerca de los fósiles sudamericanos de Carnívoros, muestra que sólo dos géneros actuales de Prociónidos aparecen en el registro fósil (Procyon y Nasua) más otros dos géneros extintos (Cyonasua y Chapadmalania) y ninguno de ellos está relacionado con Potos. Por otra parte, para calcular los tiempos de divergencia mediante procedimientos bayesianos, se debe partir de un registro fósil, teniendo en cuenta la carencia del registro en este caso, se tomó como base los estudios moleculares de Koepfli et al. (2007). Resulta interesante encontrar que los tiempos de divergencia tan antiguos encontrados en este estudio, parecen ser lógicos siguiendo diversos estudios moleculares que han demostrado que 63 Potos es el género más basal de Procyonidae (Fulton y Strobeck, 2006, Koepfli et al, 2007), siendo la primera taxa a divergir de los prociónidos existentes. Los resultados obtenidos en este estudio apoyan la hipótesis formulada por Koepfli et al. (2007), que sugiere que la diversificación de los actuales prociónidos neotropicales, parece ser antes de la formación del istmo de panamá (alrededor de 3 millones de años atrás). Así la radiación de especies de Procyonidae, por lo menos para P. flavus precede el gran intercambio biótico americano dado por la formación del ismo de Panamá. De acuerdo con estas estimaciones se sugiere que la diversificación de Potos se inició en el Mioceno medio, continuando en el Mioceno tardío, este período coincide con el proceso de mayor enfriamiento global, junto con la formación de la capa de hielo de la Antártida y una importante caída en el nivel global del mar (Haq et al. 1987, Zachos et al. 2001; Miller et al. 2005), así mismo los bosques tropicales se redujeron y se transformaron en ambientes de Sabana (Potts & Behrensmeyer 1992). Estos eventos jugaron un papel destacado en la diferenciación de otras especies de mamíferos (Delsuc et al. 2004, Johnson et al. 2006.). Estos cambios en el clima y en el nivel del mar aumentaron en conjunto la aridez terrestre y la estacionalidad, que promovió un cambio de los hábitats de vegetación de ambientes cerrados (bosques tropicales y subtropicales) a hábitats de vegetación más abiertos (bosques y pastizales), lo que probablemente promovió la diversificación del Kinkajou. Este tipo de fenómenos pueden explicar la diferenciación encontrada entre las poblaciones restringidas a las cordilleras con otras poblaciones de tierras bajas. Sin embargo, se recomienda realizar estudios que incluyan todas las subespecies propuestas morfológicamente, especialmente de las poblaciones centro americanas para determinar si el punto de diversificación de la especie se dio en esa zona y los haplotipos ancestrales se encuentran allí, adicionalmente el estudio de estos haplotipos podrían confirmar los valores de divergencia encontrados en este estudio. También se recomienda ampliar la población muestreada de chapadensis incluyendo individuos provenientes del Matto Groso en Brasil para poder determinar si estos también se diferencias de las poblaciones amazónicas o este fenómeno se da por estar en el límite de la cordillera en el caso de las muestras bolivianas. 64 Por último un estudio con genes nucleares a través de microsatélites, podrían permitir la evaluación de la tendencia poblacional más reciente de la especie, ya que como se observa en la figura 17, hay indicios de un descenso poblacional en los últimos 15.000 años. En conclusión: 1. P.f.chapadensis y los individuos peruanos provenientes de los departamentos de Pasco, Huanaco, y Ucayali parecen conformar subespecies (sensu Ford y Hoffmann ) o cuando menos, unidades evolutivas significativas diferentes (sensu Moritz 1994) que ameritan ser conservadas independientemente de la restante distribución analizada de P. flavus. 2. La especie muestra niveles muy altos de diversidad genética. Esta tendencia se conservó tanto a nivel global, como cuando el análisis se realizó por subpoblaciones. 3. Aunque los estadísticos muestran valores significativos para los análisis de heterogeniedad genética, los valores de flujo génico encontrados son altos entre las subpoblaciones evaluadas. Las diferencias entre poblaciones la está aportando, principalmente, chapadensis, que es la que difiere primordialmente de las demás. La población peruana ubicada en la zona andina central y en la parte sur de la Amazonía de ese país, y las muestras de chiriquensis aportaron cierto grado de heterogeneidad pero menor al encontrado en la población boliviana. 4. La especie, en general, muestra tendencia a determinar una expansión poblacional a través de su historia evolutiva. 5. Los valores de divergencia entre Potos de acuerdo con la red de haplotipos construida para NADH5 varían entre 206.207,70 y 15.310.845,00. Debe tenerse en cuenta que las redes de haplotipos se encuentran sesgadas a que el modelo mutacional que se utilice tenga el mismo comportamiento para la especie que se calculó y para la especie objeto de estudio. 6. Se sugiere un inicio de la diversificación del género en el Mioceno medio, antes de la formación del istmo de Panamá. 7. Todos los cambios climatológicos y ambientales ocurridos durante el Mioceno, parecen haber influido sobre los procesos de diferenciación de la especie entre sí. 65 9. 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