Allium test para evaluar el efecto citotóxico y genotóxico de

Allium test para evaluar el efecto citotóxico y genotóxico de

Desarrollo humano
Allium test para evaluar el efecto citotóxico y
genotóxico de extractos naturales en células
meristemáticas de Allium cepa
Diana M. Muñoz-Solarte*, Nancy Guerrero-Pepinosa**
Resumen
Introducción: el uso de diferentes compuestos de origen natural para el tratamiento primario de enfermedades se ha incrementado; la mayoría de estos compuestos no cuentan con suficientes estudios de
toxicidad que validen su uso terapéutico. Los bioensayos son considerados pruebas efectivas para evaluar
efectos tóxicos de diferentes sustancias con el empleo de plantas. Allium test es un bioensayo para detectar
contaminantes y sustancias potencialmente tóxicas para la salud. Diversos estudios han demostrado su
potencialidad diagnóstica significativa. Metodología: estudio experimental. Para estandarizar el bioensayo
Allium test, fue necesario organizar tres réplicas, con cuatro Allium cepa con meristemos apicales de dos
centímetros de diámetro. Se realizaron los cortes y el montaje de cada muestra para el posterior análisis al
microscopio. Resultados: al usar Allium test, el mayor porcentaje de células se encuentran en interfase con
un 45%, seguido de un 42% de profase, lo cual evidencia una actividad normal del ciclo celular. Conclusiones: la estandarización del bioensayo Allium test en el laboratorio permitirá evaluar la citotoxicidad y
genotoxicidad de extractos de origen natural usados para el tratamiento primario de enfermedades.
Palabras clave: Allium cepa, bioensayo, citotoxicidad, fitotoxicidad, genotoxicidad.
Allium Test to Evaluate the Cytotoxic and Genotoxic Effect of Natural Extracts in Meristematic Cells of Allium strain
Abstract
*
Magíster (c) en Biología,
Universidad de Antioquia.
Coordinadora del Laboratorio de
Ciencias, Fundación Universitaria
María Cano, sede Popayán.
Correo-e:
dianamilenamunozsolarte@fumc.
edu.co
** Magíster en Biología, Universidad de
Antioquia. Docente investigadora,
Fundación Universitaria María
Cano, sede Popayán.
Correo-e:
nancyyadiraguerreropepinosa@
fumc.edu.co
Recibido: 15 de junio del 2012
Aprobado: 10 de octubre del 2012
Cómo citar este artículo: Muñoz-Solarte,
D. M. y Guerrero-Pepinosa, N. (2013). Allium
test para evaluar el efecto citotóxico y
genotóxico de extractos naturales en células
meristeméticas de Allium cepa. Memorias,
11(19), 83-86.
Introduction: The use of different natural compounds for the primary treatment of diseases has increased; most of these compounds do not have sufficient toxicity studies that validate their therapeutic use.
The bioassays are considered effective tests to evaluate toxic effects of different substances with the use
of plants; Allium is a bioassay test to detect pollutants and potentially toxic substances to health. Several studies have demonstrated significant diagnostic potential. Methodology: Experimental study. To
standardize the Allium test bioassay was necessary to organize three replicates, with 4 apical meristems
Allium strain with two centimeters in diameter, cuts and assembly of each sample were made for subsequent microscopic analysis. Results: By using Allium test, the highest percentage of cells are in interphase with 45%, followed by 42% of prophase, which shows a normal activity of the cell cycle. Conclusions:
Allium bioassay standardization in the laboratory test will assess the cytotoxicity and genotoxicity of
natural extracts used for the primary treatment of diseases.
Keywords: Allium strain, bioassay, cytotoxicity, phytotoxicity, genotoxicity.
Allium test para avaliar o efeito citotóxico e genotóxico de extratos naturais em células
meristeméticas de Allium cepa
Resumo
Introdução: o uso de diferentes compostos de origem natural para o tratamento primário de enfermidades vem aumentando; a maioria desses compostos não conta com suficientes estudos de toxicidade
que validem seu uso terapêutico. Os bioensaios são considerados provas efetivas para avaliar efeitos
tóxicos de diferentes substâncias com o emprego de plantas, Allium test é um bioensaio para detectar
contaminantes e substâncias potencialmente tóxicas para a saúde. Diversos estudos vêm demonstrando sua potencialidade diagnóstica significativa. Metodologia: estudo experimental. Para padronizar o
bioensaio Allium test, foi necessário organizar três réplicas, com 4 Allium cepa com meristemas apicais
de dois centímetros de diâmetro, realizaram-se os cortes e a montagem de cada amostra para a posterior
análise ao microscópio. Resultados: ao usar Allium test, a maior porcentagem de células se encontra em
interfase com 45%, seguido de 42% de profase, o que evidencia uma atividade normal do ciclo celular.
Conclusões: a padronização do bioensaio Allium test no laboratório permitirá avaliar a citotoxicidade
e genotoxicidade de extratos de origem natural usados para o tratamento primário de enfermidades.
Palavras-chave: Allium cepa, bioensaio, citotoxicidade, fitotoxicidade, genotoxicidade.
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Desarrollo humano
Memorias / Volumen 11, Número 19 / enero - junio 2013
Introducción1
cierto tiempo mediante respuestas individuales (reacciones fisiológicas, etológicas, morfológicas, bioquímicas (Fiskesjö y Dutka, 1996). En este contexto las
pruebas con plantas vasculares, entre ellas Allium cepa
(Fiskesjö, 1988), han demostrado potencialidad diagnóstica significativa (Kristen, 1997). La determinación
de dichos efectos se realiza a partir de la observación
del crecimiento, el flujo del ciclo celular y las mutaciones cromosómicas del ápice radical de la cebolla
(Allium cepa). Las plantas vasculares son ampliamente
reconocidas como excelentes modelos genéticos para
evaluar y detectar compuestos con potencial citotóxico
y genotóxico. Allium cepa es usada para evaluar daños
del adn, como alteraciones cromosómicas y mitóticas
(Leme y Marin, 2009).
Algunas pruebas biológicas tienen la capacidad
para detectar el efecto tóxico, citotóxico y genotóxico de compuestos utilizados como tratamiento primario de diferentes enfermedades. Además, son simples,
rápidos, económicos y pueden ser ejecutados con diferentes especies. El Allium test ofrece información valiosa para evaluar el mecanismo que tiene un agente y
los efectos sobre el material genético como los efectos
clastogénicos (inducción de rupturas cromosómicas en
la división celular) y aneugénicos (alteración en las estructuras de la célula, como el huso mitótico) (Fenech,
2000). La efectividad de Allium test se puede evidenciar
con el estudio de Andrioli, Wulff y Mudry (2006), en el
que evaluaron la toxicidad del metronidazol, un agente terapéutico usado para infecciones de tipo intestinal
cuyo efecto tóxico fue identificado con la evaluación
con varias técnicas.
Las células de los meristemos apicales de cebolla
muestran fácilmente un amplio rango de alteraciones
citológicas, lo que constituye el trabajo con raíces de
esa especie vegetal en material biológico sensible para
detectar sustancias potencialmente peligrosas tanto
para la salud humana como para el medio ambiente en
general. Se han reportado estudios en los que se han
evaluado los efectos citotóxicos del algunos extractos
utilizados para fines terapéuticos, como el del totumo
(Crecentia cujete) y la chuchuguaza (Maytenus laevis
reiss), en los cuales se evidencian efectos citotóxicos y
genotóxicos después de 24 horas de exposición (Espitia
et al., 2011; Freyre, Estrada y Bolaños, 2009).
Las pruebas de citotoxicidad son utilizadas para determinar la proporción de células que mueren después
de un proceso como la exposición a compuestos de diferente naturaleza. Existen varias pruebas para medir
el daño en el material genético (adn), entre las que se
Actualmente el uso masivo de sustancias a base de extractos de origen natural con propiedades antiinflamatorias, antihistamínicas y antisépticas se ha incrementado,
y en la mayoría de casos este tipo de sustancias se comercializan sin previos estudios de toxicidad, lo que pone en
riesgo la salud de las personas que las utilizan (Alfredo,
Anaruma, Pião, João y Casarotto, 2009).
Los estudios de citotoxicidad y genotoxicidad constituyen un paso importante en la evaluación toxicológica
de los medicamentos de origen vegetal que son mezclas
complejas con una o más acciones terapéuticas, en las
que también pueden estar presentes compuestos mutagénicos relacionados con el desarrollo de procesos carcinogénicos y teratogénicos (Nunes et al., 2012).
En los últimos años, los bioensayos han cobrado
interés en el campo de la investigación para evaluar los
potenciales efectos fitotóxicos, citotóxicos y genotóxicos de diferentes compuestos como los extractos de
origen natural que se utilizan ampliamente para tratar
diferentes enfermedades como la hipertensión y los dolores musculares (Asare et al., 2012).
La actividad farmacológica de los extractos de origen vegetal se asocia con su toxicidad, y el efecto inducido depende de la vía de administración, la dosis y la
susceptibilidad genética individual.
El objetivo del presente estudio es estandarizar la
técnica de Allium test para observaciones microscópicas de los ápices radicales de Allium cepa, con el fin de
evaluar el efecto fitotóxico, citotóxico y genotóxico de
compuestos de origen natural que se usan en tratamientos terapéuticos de uso tópico. Además, con este tipo de
estrategias investigativas, los investigadores jóvenes del
Programa de Fisioterapia de la Fundación Universitaria
María Cano, profundizarán y apropiarán el conocimiento de la estructura y los mecanismos celulares que son
fundamentales para la comprensión y el análisis de la
función del cuerpo humano (Ramírez, 2011).
Fundamento teórico
Los organismos biológicos tienen la capacidad de expresar las alteraciones más sutiles que operan durante
1
Artículo resultado del proyecto de investigación “Evaluación citotóxica y genotóxica del extracto de calendula (Calendula oficinallis)
en células meristemáticas de Allium cepa”, desarrollado en el 2012 en la
Fundación Universitaria María Cano, sede Popayán, por el grupo de investigación “Fisioterapia, cuerpo y movimiento (Ficmos)”. Allium test para evaluar el efecto citotóxico y genotóxico de extractos naturales en células meristemáticas de Allium cepa
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encuentran las pruebas citogenéticas como la cuantificación de Alteraciones Cromosómicas (ac) y el Intercambio de Cromátidas Hermanas (ich), que han sido
fuente de referencia por su alto grado de resolución, y
que se pueden visualizar y analizar con la prueba Allium
test.
Las alteraciones cromosómicas se caracterizan
por presentar cambios estructurales y numéricos en los
cromosomas de células que han sido expuestas a agentes físicos, químicos y biológicos. Este tipo de alteraciones también pueden ocurrir de manera espontánea.
el programa estadístico spss 15.0. Para el cálculo del im
y la duración de cada fase del ciclo celular se emplearon las siguientes fórmulas:
Metodología
Al estandarizar Allium test en condiciones de laboratorio se observaron claramente algunas organelas
celulares. Se identificaron los núcleos, los cromosomas teñidos de color violeta y las membranas celulares claramente definidas. En todas las células se
pudo diferenciar el núcleo densamente teñido (figura
1). Para el análisis al microscopio se escogieron los
campos en los que mayoritariamente hubiera células
meristemáticas y se procedió a su recuento, para posteriormente calcular el porcentaje de células por cada
fase de la mitosis según recomendaciones de Urteaga
y Lallana (2005). El procedimiento de conteo se repitió en otros campos cuidando que no se solaparan,
hasta obtener los datos de al menos 100 células. A su
vez, y asumiendo que la duración total del ciclo celular de Allium cepa es de 12 horas (Bishop y Klein,
1973), también se estimó la duración en minutos de
cada fase del ciclo (tabla 1).
Para estandarizar Allium test se hizo necesario seleccionar cuatro bulbos de Allium cepa de dos cm de diámetro aproximado (tres réplicas), los cuales fueron
asignados al medio agua destilada. Al cabo de las primeras 72 horas, se retiraron las cebollas de sus respectivos tratamientos y se procedió a preparar entre dos y
tres raíces de dos cm de longitud de cada cebolla para
análisis al microscopio. Se realizó la tinción y fijación
de células con base en el procedimiento de Fiskesjö y
Dutka (1996). Se tuvo en cuenta solamente la parte
apical de entre uno y dos cm y se añadieron dos gotas de la solución de fijación Carnoy hasta cubrirlas.
Se fijaron durante diez minutos. El exceso de fijador se
eliminó con pipeta y papel de filtro, e inmediatamente
después se añadió el colorante (orceína acético-clorhídrica). Se flameó hasta la emisión de vapores, evitando
la ebullición. Se dejó enfriar y se repitió entre dos y
tres veces durante 15 minutos. Posteriormente se realizaron cortes finos del ápice de la raíz de la cebolla, se
hizo el “squash” del tejido y se sellaron los bordes del
cubreobjeto con barniz de uñas transparente para evitar la deshidratación celular.
% IM No cel mitosis (P+M+A+T) x 100
No Total cel.
% IM No cel mitosis (P+M+A+T) x 100
No Total cel.
Resultados
Observaciones microscópicas
Los preparados fueron observados a través de un microscopio óptico binocular. Se calculó el índice mitótico (im) que estima el porcentaje de células en división
que existen en un tejido y que por tanto es una medida
de su potencial proliferativo. Teniendo en cuenta que
es una prueba de estandarización, para el análisis de
los datos se tuvo en cuenta el protocolo descrito, y se
aplicó estadística descriptiva para determinar las frecuencias de células en cada una de las fases del ciclo
celular. La estadística descriptiva se realizó utilizando
Nota: Nótese Pared celular (pc) y núcleo (n).
Figura 1. Panorámica de células meristemáticas apicales (40X)
Fuente: elaboración propia
De acuerdo con la tabla 1, al usar Allium test en condiciones normales, el mayor porcentaje de células se en-
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Desarrollo humano
Memorias / Volumen 11, Número 19 / enero - junio 2013
cuentran en interfase, con un 45%, seguido de un 42% de
profase. Es evidente una actividad normal del ciclo celular,
resultado que era de esperarse pues las células meristemáticas del ápice de cebollas en el proceso de estandarización
solo estuvieron expuestas a agua destilada.
Tabla 1. Porcentaje de células en cada fase del ciclo celular y estimación de la duración (min) de las fases correspondientes a los
segmentos radicales de Allium cepa
Fases
%
Tiempo (min)
Interfase
45
324
Profase
42
302
Metafase
8
57,6
Anafase
3
21,6
Telofase
2
14,4
Fuente: elaboración propia
Muchos investigadores han usado las plantas superiores en estudios de toxicidad, citotoxicidad y genotoxicidad, las cuales constituyen gran valor presuntivo.
Se sugiere incluir los bioensayos con plantas superiores, específicamente Allium cepa en pruebas de rutina
para evaluar el daño cromosómico inducido por sustancias químicas (Grant, 1992). Por estas razones, la
aplicación de los bioensayos en la evaluación del efecto de sustancias cobra importancia en el campo de la
biología, y para evaluar previamente los compuestos y
extractos de origen natural usados en tratamiento primarios de algunas enfermedades.
Conclusiones
Allium cepa es un organismo que ofrece un modelo
experimental factible de implementar en el laboratorio para evaluar la toxicidad de diferentes sustancias.
El bioensayo Allium test en células meristemáticas fue
estandarizado en el Laboratorio de Ciencias integradas
de la Universidad Cooperativa de Colombia y la Fundación Universitaria María Cano, Extensión Popayán,
que servirá para realizar posteriores evaluaciones de
toxicidad de compuestos y extractos de origen natural
como árnica y caléndula.
Cabe resaltar la pertinencia de los estudios experimentales en biología celular que deben tener en cuenta
los programas de ciencias de la salud, específicamente
fisioterapia, para brindar un abordaje más analítico a
los procesos biológicos relacionados directamente con
el funcionamiento del cuerpo humano.
Referencias
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