Siguiendo la línea de la investigación desarrollada en los últimos

Siguiendo la línea de la investigación desarrollada en los últimos

Introducción
Siguiendo la línea de la investigación desarrollada en los últimos años por nuestro grupo, esto es, la síntesis y
actividad de nuevos análogos de feromonas sexuales como posibles inhibidores de la percepción feromonal, se
plantearon nuevas estructuras en respuesta a los resultados obtenidos hasta el momento. Las estructuras se pensaron en
base a dos hechos observados, primero análogos con pequeñas modificaciones en la estructura hidrocarbonada para
verificar la importancia de ésta a la hora de unirse a las proteínas implicadas en el proceso olfativo de insectos.
Segundo, cambios de grupo funcional respecto a la feromona original con el fin de obtener carbonilos de diferente
electrofilia para aumentar la potencia inhibidora de los compuestos, ya que se sabe que es importante en el anclaje a las
enzimas de degradación.
Todos los compuestos sintetizados fueron testados en pruebas de campo sobre los cultivos correspondientes de los
insectos plaga acerca de los que se realizó la investigación.
También se optimizó un método para evaluar los inhibidores in vitro, sobre un extracto antenal de machos de Cydia
pomonella, con el fin de justificar el mecanismo de actuación de éstos.
Se trabajó sobre tres insectos plaga, Ostrinia nubilalis del maíz, Cydia pomonella de árboles frutales y Lobesia botrana
de la vid.
Memoria
Síntesis de compuestos -dicarbonílicos análogos de la feromona de Ostrinia nubilalis
Para comprobar el efecto que ejerce la electrofilia del carbonilo en la inhibición de los compuestos, se pensó en
la síntesis de los siguientes análogos de la feromona original (1): el -cetoéster etílico (2), el cetoéster metílico
(3) y la -cetoamida (4). A continuación y en adelante, se muestran las estructuras con la nomenclatura típica en este
campo.
La estrategia llevada a cabo consistió en sintetizar primero el derivado alquilado del 1,3-ditian-2-carboxilato de
etilo (5), a partir del Z11-14:Br y el ditiano correspondiente. Después a partir de éste se obtendrían el carboxilato de
metilo y la correspondiente amida, que por desprotección proporcionarían los análogos esperados.
O
O
O
OMe
R
O
Br
OEt
R
O
NH2
R
S
R
S
COOEt
5
O
S
S
COOEt
Síntesis de análogos de la feromona de Cydia pomonella
Para evaluar la importancia del flúor en los inhibidores sintetizados hasta el momento por nuestro grupo,
generalmente trifluormetilcetona, se pensó en hacer los correspondientes análogos sin fluorar, las metilcetonas.
Sorprendentemente, estos compuestos resultaron presentar actividad inhibidora de la feromona, siendo en algunos casos
la potencia superior a la de las correspondientes trifluorometilcetonas.
Los análogos sintetizados fueron la E7,E9-11:MK (6) y la E8,E10-12:MK (7). La primera se obtuvo por
metilación del correspondiente ácido con metil litio. La segunda se preparó en 4 pasos a partir de la feromona de C.
pomonella, el E8-E10-dodecadieno (8). Primero se preparó el tosilato, que por tratamiento con cianuro sódico se
transformó en el correspondiente ciano derivado. La hidrólisis del mismo se realizó en hidróxido de potasio dando lugar
al ácido que posteriormente se metiló con metil litio.
Debido a la eficacia de la metilcetona (7), se intentó mejorar el rendimiento de su síntesis. Para ello se partió
de la feromona que por tratamiento con anhidridotriflúoracético y posteriormente con cianuro sódico se obtuvo el
correspondiente ciano derivado. La metilcetona (7) se obtuvo por adicción de metil litio y posterior hidrólisis del
imiduro formado.
En las pruebas de campo del siguiente año se decidió ahondar en los hechos observados en la anterior
campaña. Para ello se decidió sintetizar tanto las trifluormetilcetonas como las metilcetonas de los correspondientes
compuestos monoinsaturados, esto es, el E10-12:MK (9), E10-12:TFMK (10), E8-12:MK (11) y el E8-12:TFMK (12).
Primero se decidió obtener los correspondientes yoduros insaturados (E10 y E8), que posteriormente en análogos
procesos, esto es, tratamiento con el anión formado sobre el 2-metil-1,3-ditiano, seguido del tratamiento con Nclorosuccinimida, dio lugar a los compuestos 9 y 11. También se obtuvieron a partir de estos yoduros los derivados los
compuestos 10 y 12 por tratamiento con tert-butil litio y posterior adición de trifluoroacetato de etilo. Para la obtención
del yoduro E10-insaturado se partió del 10-heptin-1-ol, el cual se protegió con metoximetano y se metiló en el triple
enlace por tratamiento con n-butil litio y yoduro de metilo. Seguidamente se redujo el triple enlace a doble enlace E,
con sodio en amoniaco líquido y se desprotegió el grupo alcohol en presencia de ácido clorhídrico y metanol. El
posterior tratamiento con yodo en presencia de trifenilfosfina e imidazol dio lugar al compuesto deseado. El yoduro E8insaturado se preparó a partir del 1,7-heptanodiol, el cual se monoprotegió por tratamiento con cloruro de
tertbutildifenilsililo en presencia de imidazol y dimetilaminopiridina. Después se obtuvo el yododerivado el cual se
adicionó sobre el anión formado del 1-pentino por tratamiento con n-butil litio. La redución del triple enlace a doble
enlace E se realizó en amoniaco líquido en presencia de sodio. La desprotección del grupo de silicio con cloruro de
tetrabutilamonio seguido del tratamiento con yodo, imidazol y trifenilfosfina, dio lugar al compuesto deseado.
De igual manera se decidió probar en campo la metilcetona derivada de cadena saturada, que se preparó por metilación
con metil litio del ácido tridecanoico.
Se sintetizaron compuestos -dicarbonílicos análogos a la feromona por diferentes métodos que los utilizados
para el caso de los análogos de O. nubilalis, debido a la imposibilidad de desproteger el ditiano derivado sin afectar al
sistema diénico conjugado. Para la síntesis del -cetoéster etílico (13) y el cetoéster metílico (14), se añadió a la sal
de litio formada por tratamiento del yododerivado de la feromona con tertbutil litio, el oxalato de dietilo y dimetilo
respectivamente. En el caso de la -dicetona metílica (15) se utilizó como electrófilo el piruvato de etilo previamente
protegido en forma de acetal etílico, que tras desproteger en presencia de tetrafluoroborato de litio dio lugar al
compuesto deseado.
La mayoría de los derivados se sintetizaron a partir de la feromona comercial (8), pero debido a las dificultades
de adquirir ésta se optó por sintetizarla en el laboratorio. Esto se realizó en 10 pasos a partir de 1,8-octanodiol
comercial, que tras monoproteger con 3,4-dihidro-2H-pirano se sometió a oxidación a aldehído y reacción de HornerWadsworth-Emmons con fosfonoacetato de trietilo. Tras reducir a alcohol y oxidar a aldehído se realizó nuevamente
una HWE, obteniéndose el sistema diénico (E,E). Finalmente se reduce el ester a alcohol, se pasa a mesilato, se elimina
con hidruro de litio y aluminio y se desprotege el alcohol obteniéndose la feromona (8) con un 98% de pureza
isomérica.
Síntesis de análogos de la feromona de Lobesia botrana
Primero se llevó a cabo la síntesis de la feromona sexual (E7Z9-12:OAc) (16) en 7 pasos, se monoprotegió el
1,7-heptanodiol en forma de éter de silicio y se oxidó el alcohol libre a aldehído. Por medio de una olefinación de Takai
con Cr(II) y yodoformo se obtuvo el correspondiente E-yodoalkeno terminal, que se sometió a un acoplamiento de
Sonogashira con el 1-butino obteniéndose el alquenino que finalmente se redujo utilizando cinc al correspondiente
dieno (E7,Z9). La desprotección del éter de silicio rindió en el alcohol E7Z9-12:OH que en una posterior acetelización
dio lugar a la feromona (16) esperada. A partir del alcohol E7Z9-12:OH y por procedimientos similares a los descritos
anteriormente para los análogos de C. pomonella, se obtuvieron los análogos E7Z9-12:TFMK (17) y E7Z9-12:MK (18).
Pruebas de campo de los productos sintetizados
Una vez obtenidos los análogos de las feromonas sexuales, el siguiente paso fue evaluar su capacidad
inhibidora de atracción feromonal sobre los machos de las plagas de O. nubilalis, C. pomonella y L. botrana. El estudio
se realizó mediante pruebas de campo en cultivos de maíz, de árboles frutales y vid, ubicados en la provincia de Lleida.
El equipo encargado de llevarlas a cabo fue el grupo del Dr. Magí Riba de la Escola Tècnica Superior de Enginyeria
Agrícola de la UdL. El período de capturas abarcó del mes de Mayo a Septiembre de 2008 a 2011.
Para evaluar la potencia de los compuestos se comparan las capturas obtenidas en trampas cebadas con
feromona con trampas que contienen feromona e inhibidor. La proporción utilizada fue de 1:10 y 1:1 para el caso de los
compuestos más activos (feromona:inhibidor) y se prepararon por triplicado dichas formulaciones. Las trampas se
colocaron en distribución lineal al azar, con una separación de al menos 20 metros entre ellas. El conteo del número de
insectos capturados se llevó a cabo semanalmente y durante el mismo se rotaron las trampas para contribuir a la
aleatoriedad del ensayo.
Ensayos de actividad de inhibidores sobre extractos antenales de Cydia pomonella
Nuestro grupo cuenta con una amplia experiencia en ensayos in vivo e in vitro de inhibidores de esterasas. Sin
embargo no se disponía de una metodología in vitro para evaluar la potencia de los inhibidores sobre insectos en los que
el componente feromonal mayoritario es un alcohol, es decir sobre oxidasas. Con tal de optimizar unas condiciones
generales, se decidió trabajar con la trifluorometilcetona E8E10-12:TFMK, de la que ya se conocía su eficacia
inhibidora en túnel de viento, electroantenograma y pruebas de campo.
Las pruebas in vitro consisten en incubar las enzimas de las antenas de machos con la feromona y comparar los
resultados de degradación de la misma, en presencia también de determinadas concentraciones de inhibidor. Para esto
hay que conseguir un extracto de antenas homogéneo en un tampón de un determinado pH, a una temperatura adecuada
y con concentraciones óptimas de sustrato, inhibidor y enzima.
Para los análisis de los resultados se utilizó un equipo de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de
masas trabajando en impacto electrónico (EI). La cuantificación se hizo comparando la cantidad de feromona que
quedaba después de la incubación con el extracto antenal, con la de un patrón interno (n-decanol).
Tras muchos ensayos cambiando pH, temperatura, cosolvente orgánico para solubilizar la feromona e
inhibidor, concentración de sustrato, cantidad de antenas por ensayo, cofactor, volumen utilizado, patrón interno,
disolvente orgánico de extracción, se llegó a unas condiciones satisfactorias en las que se podía ver la actividad
enzimática.
Utilizando el mismo método puesto a punto, se trató de probar la eficacia inhibidora del E8E10-12:COCOMe
(15).
Resultados
Se ha conseguido sintetizar satisfactoriamente un número de 14 análogos de feromona, 3 para Ostrinia
nubilalis, 9 Cydia pomonella y 2 Lobesia botrana. Así mismo también se realizó la síntesis estereoespecífica de la
feromona sexual de los dos últimos insectos.
Tanto las pruebas en laboratorio como las de campo realizadas, confirmaron a los compuestos
trifluorometílicos derivados como buenos inhibidores de la percepción y revelaron a las metilcetonas derivadas de la
feromona como mejores compuestos para la disrupción de la comunicación química en estos lepidópteros. Así mismo es
de relevante importancia la estructura de la cadena hidrocarbonada, quedando patente la necesidad de mantener la
estructura de la feromona.
Sobre los compuestos dicarbonílicos derivados de la feromona sexual de O. nubilalis no se pudo sacar ninguna
conclusión debido al bajo número de capturas en pruebas de campo realizadas, debido a la escasez actual de plaga por la
utilización de maíz transgénico.
En cuanto a los derivados dicarbonílicos de la feromona sexual de C. pomonella mostraron cierta actividad en
campo, superior al correspondiente derivado fluorado pero inferior a la metilcetona.
Para las pruebas realizadas in vitro sobre extractos antenales de C. pomonella tanto el E8E10-12:TFMK como
el E8E10-12:COCOMe no mostraron capacidad de inhibición sobre las enzimas involucradas en el catabolismo de la
feromona.