Protocolo práctico - Sección Genética Evolutiva

Protocolo práctico - Sección Genética Evolutiva

Protocolo 2009, Sección Genética Evolutiva – Facultad de Ciencias
Mapeo genético en Drosophila. Mapeo de tres puntos
Coordinadora: Dra Beatriz Goñi
Sección Genética Evolutiva
OBJETIVOS: Determinar la posición de cada mutación incógnita en el mapa de
recombinación de genes ligados al cromosoma X mediante el cruzamiento de tres
puntos.
CRITERIOS
1. El genotipo del organismo que produce los gametos productos del crossingover
debe ser HETEROCIGOT PARA TODOS LOS LOCI.
2. El cruzamientos debe construirse de tal manera que EL GENOTIPO DE
TODOS LOS GAMETOS PUEDAN DETERMINARSE DE MANERA
PRECISA al observar el fenotipo de la progenie. Cada clase fenotípica debe
reflejar el genotipo de los gametos producidos por los parentales
3. Se produzca un suficiente número de progenie en el mapeo experimental que
recobre una muestra representativa de todas las clases de crossingovers..
CONCEPTOS
El cruzamiento de tres puntos permite determinar el ORDEN de los genes. Los tipos de
gametos parentales estarán necesariamente en mayor frecuencia. Detemine el tipo de
configuración de las marcas (cis o trans) parentales. La habilidad de identificar las dos
clases recíprocas de progenie parental y las dos clases de progenie dobles crossing-over
le permitirá determinar el orden de los genes de los tres loci.
El cruzamiento de tres puntos permite hallar la DISTANCIA en el mapa de ligamiento
por la frecuencia de crossing-over o cromosomas recombinantes entre loci ligados. Si
uno asume que la probabilidad de que ocurra un crossing-over entre dos loci, ello es
directamente proporcional a la distancia entre los dos loci,
Probabilidad de crossing-over = K (distancia)
donde K es una constante proporcional, entonces uno podría PREDECIR que las
distancias de mapa serían aditivas.
CERTEZA en los experimentos de mapeo.
Como la frecuencia máxima de recombinación detectable entre pares de genes ligados
es de 50 %, para genes a distancias mayores a las 20 unidades de mapa, la ocurrencia de
múltiple crossing-over no se detectaría y subestimaría las distancias reales entre loci.
Por lo tanto, la construcción de mapas genéticos certeros provienen de experimentos
con genes que están muy próximos unos de otros.
La predicción de las distancias de mapa entre pares de loci funciona para
distancias menores a 10 ó 20 unidades de mapa.
Hay otro factor que afecta los datos de mapeo. Este factor involucra la reducción del
número esperado de dobles crossing-over cuando los genes están bastante cerca unos de
otros en el cromosoma. Esta reducción, de denomina INTERFERENCIA, y puede
ilustrarse en experimentos de mapeo de tres puntos.
1
Protocolo 2009, Sección Genética Evolutiva – Facultad de Ciencias
La interferencia es el efecto en el cual la ocurrencia de un crossing-over en cierta
región reduce la probabilidad de un crossing-over en una región cercana.
El concepto de interferencia es cuantificada mediante la proporción entre los
DCOobs/DCOesp. Esta proporción se llama coeficiente de coincidencia:
C=
DCOobs /DCOesp
Una vez que C esta calculada, interferencia (I) se cuantifica usando una ecuacion
simple:
I= 1.0 - C
Si la interferencia es completa, no se producen dobles crossing-overs, entonces I= 1.0.
Si se observan menos crossing-over dobles (DCOobs) que los esperados (DCOesp),
entonces I es un número positivo, y la Interferencia es positiva. Si se observan mas
dobles crossing-overs esperados que los esperados, entonces I es un número negativo
y la Interferencia en negativa. En los sistemas eucariotas, la interferencia positiva es
la mas frecuentemente observada.
Mapeo de tres puntos. TAREAS EXPERIMENTALES
Se conformarán grupos de trabajo de DOS alumnos.
Se analizarán TRES LOCI incógnitas con ligamiento en el cromosoma X. La
posición de estos loci en el mapa de recombinación se hallará experimentalmente
mediante el cruzamiento de tres puntos. Para ello se utilizará una cepa marcadora que
porta DOS mutaciones (que afectan genes diferentes a las mutaciones “incognitas”)
ellos son: crossveinless, cv y forked, f.
Obtenga información genética sobre estos dos genes en la pagina web:
http://flybase.org/
Ello será importante para discutir el mapa de recombinación de los loci involucrados en
este práctico.
PROCEDIMIENTO:
El experimento de mapeo de tres puntos consta de:
DOS cruzamientos y un total de TRES generaciones (Parental, F1 y F2).
•
(SEMANA 1) Primer cruzamiento (parental)
EXAMINE moscas de las cepas mutantes #1, #2, y #3, cepa marcadora, cv f
Identifique el carácter mutante en cada una de ellas con respecto a moscas cepa salvaje.
Construya TRES cruzamientos, empleando individuos de las CEPAS PURAS
(parentales). Realice un cruzamiento por cada cepa mutante (locus incógnita), #1, #2, y
#3, de la siguiente manera (llene TABLA):
Cruce hembras vírgenes cv f x machos incógnita #1 ó #2 ó #3
Prepare un tubo por cada tipo de cruzamiento. Utilice 8-10 ♀♀ vírgenes (se las
brinda el docente) y 10-12 ♂♂ por cada tubo. Proporcione Ud los machos en este
cruzamiento. Anestesie individuos de las cepas mutabtes y examine cuidadosamente el
sexo de los individuos.
2
Protocolo 2009, Sección Genética Evolutiva – Facultad de Ciencias
(SEMANA 2) Elimine las moscas parentales antes de los siete días siguientes al
cruzamiento. Tire las moscas a la morgue. Coloque papel absorbente en el medio
de cultivo para proporcionar superficie para la pupación de las larvas.
•
(SEMANA 3) Observación de la F1 y segundo cruzamiento.
Anestesie SUAVEMENTE la progenie del cruzamiento anterior
¿Cual es el fenotipo observado en los individuos F1 , y qué conclusiones obtiene?
Si su mutación se encuentra en el cromosoma X no necesita colectar ♀♀ F1 vírgenes
para el siguiente cruzamiento, ¿porque?
Cruce ♀♀ F1 x ♂♂F1 del cruzamiento anterior, realice DOS tubos con 8-10 moscas
de cada sexo por loci incógnita (total seis tubos).
(SEMANA 4) Elimine las moscas F1, siguiendo el procedimiento = SEMANA
2.
•
(SEMANA 5 ) Observación y análisis de la F2 y mapeo de los loci incógnitas
Anestesie la progenie F2 del cruzamiento realizados en la clase anterior. Siga un
orden establecido, primero los tubos cruzamiento #1, luego #2, y #3. Examine UN
TUBO por vez. En cada caso, separe los machos de las hembras (¿porque?). Luego
clasifique los individuos en las distintas clases fenotipicas.
¿COMO CLASIFICAR las moscas? Para facilitar este trabajo, separe
PRIMERO el fenotipo de más fácil identificación, luego, el siguiente. Dentro de cada
grupo identifique a su vez si porta algun(s) carácter(es) mutante(s) no considerados en
la clasificación previa, y así sucesivamente.
Coloque los datos en la TABLA, donde ha determinado previamente las clases
fenotipicas y los genotipos esperadas en la progenie de cada experimento.
En base a SUS DATOS, calcule el orden correcto de los genes en cada
experimento y la distancia entre los loci involucrados. Calcule el coeficiente de
coincidencia y determine si hubo interferencia positiva, neutra o negativa. Dibuje el
mapa genético y muestre las distancias de recombinación entre los pares de loci
adyacentes en cada experimento.
Finalmente, CONSTRUYA el mapa de recombinación PROBABLE para el
total de CINCO loci empleados en el práctico. Discuta los datos obtenidos utilizando los
datos del mapa genético conocido para los genes marcadores utilizados, cv f. ¿Podría
identificar los genes candidatos a cada loci analizados con los datos obtenidos, provea
de hipotesis?
BIBLIOGRAFIA
A Database of Drosophila Genes & Genomes. http://flybase.org/
Essentials of Genetics (5th Edition) [Paperback] William S. Klug (Author) and Michael
R Cummings. Ver Chaper: “Linkage and Chromosome mapping”.
Concepts of Genetics...William S. Klug (Author) and Michael R Cummings.
Ashburner, M. (1989). Drosophila: A Laboratory Handbook and Manual. Two volumes.
: xliii + 1331pp; 434pp. (“Recombinacion en hembras Drosophila”).
3
Protocolo 2009, Sección Genética Evolutiva – Facultad de Ciencias
TABLA
DATOS del Cruzamiento de Tres Puntos para el
Mapeo Genético del LOCUS #.........
Cruzamiento
parental
Fecha:
Cruzamiento
♀ F1
Fecha:
_________________ ♀♀
(genotipo)
x
_____ ___________
(genotipo)
__________________
(fenotipo)
_________________
(fenotipo)
________________ ♀♀ F1* x
(genotipo)
________________
(genotipo)
________________
(fenotipo)
________________
(fenotipo)
♂♂
♂♂
*Indique el genotipo de la hembra F1,
mostrando el orden correcto de los genes:
Progenie F2, Fecha:
Fenotipo:
moscas:
Parental
(___________________)
Parental
(___________________)
Crossing-over, Región I
(___________________)
Crossing-over, Región I
(___________________)
Crossing-over, Región II
(___________________)
Crossing-over, Región II
(___________________)
Crossing-over Doble, RI+RII
(___________________)
Crossing-over Doble, RI+RII
(___________________)
Genotipo:
Número de
___________________
___________________
___________________
___________________
___________________
___________________
___________________
___________________
___________________
___________________
___________________
___________________
___________________
___________________
___________________
___________________
TOTAL:
__________________
Describa AQUÍ el mapa genético obtenido:
4
Protocolo 2009, Sección Genética Evolutiva – Facultad de Ciencias
Diagrama del mapa genético parcial de los cuatro cromosomas de
D. melanopgaster y la correspondencia con los cromosomas mitóticos.
5