Metodos inmunologicos Se inventaros desde mas o menos la

Metodos inmunologicos Se inventaros desde mas o menos la

Metodos inmunologicos
Se inventaros desde mas o menos la tercera década del siglo 20 han tenido gran utilidad porque
gracias a estos se ha podido ayudar en el diagnostico de una gran cantidad de enfermedades ,hoy
en dia estos métodos siguen siendo de gran utilidad no solo en el diagnostico de enfermedades
infecciosas si no tambien en el diagnostico de las enfermedades no infecciosas como es el caso de
las enfermedades … entonces se definen los métodos inmunológicos como aquellos en los cuales
primero que todo se genera un complejo inmune y este debe de ser detectado utilizando
diferentes metodologias q permitan visualizar la formación de ese complejo inmune , cada dia se
expanden mas los usos de estos métodos no solo son importantes desde el punto de vista medico
clínico humano , clínico animal y de los alimentos , se han utilizado como ayudas diagnosticas para
la confirmación de enfermedades infecciosas o no infecciosas por ej podemos detectar Ag , Acs en
una muestra , por ejemplo en una muestra tisular, de un tejido se pueden detectar Ags tambien
en el suero en el plasma se pueden detectar Ags . la diferencia entre detectar Ags y detectar Acs es
bastante grande porque al detectar un Ag nos esta permitiendo (dependiendo de dos factores la
sensibilidad y la especificidad de esa prueba de lab) confirmar presencia de enfermedad y la
detección de Acs confirmación del titulo de Acs y variación de títulos de Acs en un periodo de
tiempo determinado , de todas maneras la presencia de Acs nos esta mostrando que el paciente
tuvo o tiene la enfermedad no solo permite detecta tambn permiten cuantificar decir cuanta es la
concentración de una determinada molecula de Ac o de Ag que tiene un individuo en un momento
determinado , frente a un determinado agente o frente a una enfermedad . los métodos
inmunológicos se han clasificado en 2 grupos :
Convencionales o clásicos: se empezaron a utilizar en diagnostico de algunas enfermedades
infecciosas dentro de estos están los de precipitación , eliminación, método de fijación del
complemento , neutralización q se dividen en dos tipos de inhibición de la hemaglutinación e
inhibición de la hemolisis , son métodos que son bastante utilizados .
Inmunoanalisis o métodos no clásicos
Radio inmunoanalisis o inmunoensayo radiométrico
inmuno ensayo enzimático , de cuatro tipos :clorimetrico , luminicente , quimioluminicente y
bioluminicente .
También el inmunoensayo no enzimático luminicente y otros métodos como la
inmunofluorecencia , la inmunohistoquimica y el western blot .
Primer grupo métodos de, precipitación : se forma un precipitado y para que esto ocurra ( un
precipitado es una sustancia que se vuelve insoluble en una solución ) se requiere de un medio
liquido para que se produzca la precipitación , los elementos solubles que intervienen en esa
reaccion forman el complejo inmune esos reactantes los ags y acs que están solubles se vuelven
insolubles al formarse el complejo inmune , estas pruebas se clasifican en :
Floculación , inmunoturbidimetria , nefelometría, inmunodifusion doble , inmunodifucion radial
Floculación: son microscópicas, se requiere un microscopio de luz para poder visualizar formación
de grumos en la reacción microscópica, un ejemplo de una muy utilizada hoy en dia es la VDRL
iniciales del laboratorio que las implemento. Esta técnica permite detectar Acs no treponemicos
en la enfermedad que se conoce con el nombre de sífilis .
Inmunoturbidimetria : cuando se genera reacción Ag –Ac se genera un cambio en la
transparencia de esa solución , pasa de una solución transparente a una solución con diferentes
cambios de turbidez , esa turbidimetria se mide con un aparato llamado fotómetro , este tiene una
fuente de luz la cual pasa a travez de un filtro y este filtro escoge una determinada longitud de
onda que incide sobre un tubo que tiene esta solución parte de la luz es absorbida y parte es
transmitida y esto mide la que es transmitida , el porcentaje de luz transmitida es inversamente
proporcional a la cantidad de turbidez , la cantidad de absorción de la luz es directamente
proporcional a la turbidez que hay allí … como se sabe si es un Ac o un Ag ?depende que voy a
detectar yo , si detecto un Ac contra toxoplasma aunque no se utiliza para esto , lo que debo
tener son concentraciones poco … del Ag y en el suero del paciente van a ver los Acs ,
concentración de Acs proporcional a la turbidez.
Nefelometría : muy semejante a la inmunoturbidimetria pero se basa en un efecto llamado
Tyndall que se refiere a la capacidad que tienen las partículas suspendidas en el aire de dispersar
la luz , entonces lo que se hace es medir el grado de dispersión de la luz, entre mayor sea el grado
quiere decir esos complejos inmunológicos son mas grandes , por esto se puede medir el complejo
inmune , se utiliza para medir moléculas importantes para el sistema inmune , por ejemplo la
proteína c reactiva para cuantificarla , factores del complemento , moléculas de Ac , aquí todas
esas moléculas están actuando como Ag , incluso los mismos Acs , por este método puedo medir
concentraciones totales de IgM , IgG , IgA o IgE … Contra que parte de la molécula de Ac debe
estar dirigido ese Ac ?
La inmunodifusion doble y radial se caracterizan porque se utiliza un medio semisólido que
usualmente se forma con moléculas o sustacias químicas como la agarosa, la …. , la mas utilizada
es la agarosa , la diferencia entre la inmunodifusion doble y la inmunodifusion radial es que en la
inmunodifusion radial el ag o el ac se disuelve en ese medio semisólido ,cuando la agarosa esta
liquida allí se coloca el ag o el ac , en cambio en la inmunodifusion doble no se requiere agregar
ninguno de los dos reactantes , en ambos métodos se hacen posos , huecos o agujeros y en el
caso de la inmuno difusión radial alii se coloca la muestra del paciente el ag o el ac dependiendo
de lo que haya colocado en ese medio semisólido , ese suero del paciente va a difundir en ese
medio y al ocurrir esto va a provocar una reacción con su contra parte en el medio que forma un
halo de precipitación , un halo de color blanquesino alrededor del sitio donde se pudo la muestra
del paciente en la doble no se produce un halo en esta se coloca un pozo central y unos pozos
periféricos en eel pozo central se agrega ag o ac y en los otros las muestra s de pacientes va a
haber una migración simultanea en ese medio semisólido y en el punto de encuentro de ags y asc
se genera una línea de precipitación la presencia de esta indica que en la muestra hay lo que yo
quiero detectar , la otra diferencia entre estas dos es que en la radial se puede hacer
cuantificación porque yo puedo medir el diámetro del halo y compararlo frente a un estándar
mientras que en el otro no tengo la manera de medir un diámetro .
Por ejemplo estoy detectando por inmunodifusion radial la proteína c reactiva en el medio
semisólido debo tener los Acs contra la proteína c reactiva , en los pozos el suero de paciente , al
cabo de 48 horas miro la concentración de esta en el suero del paciente , dependiendo del tamaño
del halo.
La inmunodifusion doble es una técnica que se empleo mucho para mirar la presencia de acs
frente a algunos eventos experimentales o frente a unas enfermedades como micoticas
sistémicas como por ejemplo la histoplasmosis ,la criptococosis , la aspergilosis indican la
presencia de esos acs pero no me dice en que consiste . esta se emplea de igual manera como se
emplea elementos inmunoturbidigenicos o inmunogenicos para factores de complemento ,
proteínas de fase aguda .
Métodos de aglutinación : utilizan partículas o células , cuando se utilizan células se pretende
detectar en células la presencia del ag , tambn existe la posibilidad de hacer absorción de ags a
células principalmente a globulos rojos tambn se pueden utilizar partículas que se van a unir a un
determinado ag , por ejemplo el Ltex , tambn se utilizo en un tiempo el oro coloidal estos se
métodos se clasifican en dos tipos , directos e indirectos .
Directos : en estos se detecta la presencia de ag en una determinada células ej las pruebas de
hemoclasificacion para detectar si una persona es A , B u O, si es Rh positivo o negativo por la
presencia de Ag a , b o d en glóbulos rojos y para eso se requieren Acs antia A , anti B y anti D en
laboratorio , entonces debido a la reacción Ag –Ac se aglutinan glóbulos rojos y esto se observa
macroscópica o microscópicamente .
Las pruebas indirectas se han dividido en dos grupos : en los cuales donde no se requiere un anti
anticuerpo – usualmente en estos con el simple hecho de que el ag se una al ac y se produzca un
entrecruzamiento de estas partículas o estas células y se forme un complejo inmune insoluble es
suficiente para que se produzca la reacción ,, ej para detectar proteína c reactiva , en la sparticulas
se coloca el ac contra prot c reactiva y uego se agrega suero del paciente donde se supone hay
prot c reactiva y esto provoca una aglutinación directa q es macroscópica
Utilizando anti anticuerpo estas se utilizan cuando el ac que se quiere detectar es denominado con
ac incompleto es decir q a pesar d éter 2 sitios de unión al ag solo le funciona uno ent para poder
producir la aglutinación se requiere un anti ac , una ig g dirigida contra esa ig g humana
usualmente se producen en conejos , ratones o ratas a esto se les denomina anti IgG esto es el
principio de una técnica que se conoce con el nombre de coombs indirecto esta es una prueba de
lab qu e se utiliza para detectar reacciones trasnfucionales y para detectar ant contra el rh o
contra el ag d estos acs contra rh se forma por ej en mujeres rh negativas cuyo producto es rh
positivo , la evidencia de coombs indirecto positivo indica riesgo bastante alto de q el niño
presente eritoblastosis fetal o una enfermedad hemolítica del recién nacido .
Métodos de neutralización : estos permiten detectar presencia de Acs frente a determinados
microrganismos, porque estos Acs tienen la capacidad de neutralizar la acción de algunas de esas
moléculas producidas por los microrganismos como es el caso de las hemaglutininas y las
hemolisinas, las hemoglutininas aglutiman globulos rojos y las hemolisinas rompen hemolisan
globulos rojos , usualmente este método permite detectar acs neutralizantes estos acs
neutralizantes no solo pueden ser IgM si no q tambn pueden ser IgG.
PARA HACER LAS PRUEBAS DE HEMOAGLUTINACION SE UTILIZAN GLOBULOS ROJOS DE POLLOS
RECIEN NACIDOS esto permite detectar acs frente a muchas enfermedades virales como la
influenza , el sarampión y la rubeola.
Las pruebas de inhibicion de la hemolisis la mas conocida es la prueba de antiestreptolisina , la
estreptolisina es una proteína por la cual el estreptococo productor de la hepatitis estreptocoxica
pero tambn productor de secuelas post estreptocoxicas como es el caso de la fiebre reumática o
de la poliartritis reumática , por eso este método se utilizaba mucho para detectar acs frente a la
estreptomisina q indicaba que el parciente puediera tener anti acs que puedieran reconocer las
válvulas cardiacas o reconocierona la membrana sinovial a nivel de las articulaciones .
Los métodos de fijación del complemento : se caracterizan porq permiten detectar la presencia de
una reacción ag – ac utilizando para esto complemento de conejo . el método se caracteriaza por
tener 2 estapas , en la primera etapa se coloca en contacto el suero del paciente que es el que
tiene los acs en contacto con el ag , aquí pueden ocurrir dos cosas : la primera es que el suero del
paciente tenga acs para este ag ent se produce reacción ag – ac
Lo segundo q puede ocurrir es q haya acs frente el ag y no haya reacción además se agrega
complemento si hay reacción ag-ac el complemento se consume pasa de una concentración alta a
a una concentración baja debido a que esta reacción ag – ac se caracteriza por consumir el
complemento. Pero hasta ahí no se ha podido visualizar la reacción para visualizarla se utilizan acs
de conejo estérilisados . constituye en tener los acs a los cuales se les han unido acs dirigidos
contra los glóbulos rojos estos acs son producidos en animales de experimentación , si el
complemento se consume no va a haber conplemento para que se produzca destrucción de
globulos rojos por lo tanto no hay hemolisis esto dice que la prueba es positiva si no hay reacción
ag-ac el complemento no se consume e indica que la prueba es negativa, es para enfermedades
micoticas sistémicas como la histoplasmosis, la criptococosis etc.
Inmunofluorecencia : se implemento en 1954 , dio origen a los inmunoanalisis , consiste en el
uso de un fluorocromo ue es una molecula que tiene la propiedad de que cuando es estimulada
por una fuente de luz de longitud de onda corta mas o menos entre los 35º y 450 nm usualmente
produce luz a una longitud de onda mayor a la cual es estimulada entre los 520 y los 590 nm , si es
estimulada por una luz violeta o ultra violeta puede producir una luz de color verde o de color
anaranjado o de color rojo y eso va a depender del tipo de fluorocromo que se utiliza hay 3 q son
los mas utilizados : la fluoresceína , la rodamina y la auramina la mas utilizada es la fluoresceína
produce una luz de color verde manzana .
La inmunofluorecencia requiere un microscopio especial, llamado microscopio de fluorescencia y
se caracteriza por tener dos fuentes de luz , una fuente de luz ultra violeta y una fuente de luz
visible , la fuente de luz ultravioleta inside sobre la muestra y estimula el fluorocromo este libera la
luz viaja por los objeticvos llega al ocular y de esta manera se puede observar. La
inmunofluorecencia puede ser de dos tipos la directa y la indirecta.
Inmunofluorecencia directa: es una prueba de un solo paso sirve para detectar ags , complejos
inmunes presentes en un tejido , por ejemplo si hay depósitos de c3 a nivel del glomérulo renal y
para esto requiere un ac contra el c3 marcado con el fluorocromo y asi nos muestra estos
complejos inmunes , es de un solo paso porq solo se requiere el tejido fijado a una placa
portaobjetos y desps se lle agrega el ac .
Inmunofluorcencia indirecta: es una técnica de 2 pasos , permite detectar acs frente a un
determinado ag por ejemplo frente a toxoplasma , frente a eimeria , babesia ,treponema
palidum , consiste en : en placas porta objetos se pone el ag en contacto con el suero del paciente
, si el suero del paciente tiene acs estos se pegan al ag , en segunda etapa se elimina el exceso de
acs o el exceso de suero del paciente presente en esta reacción se hace un lavado barriendo lo
que no se unio y en una tercera etapa se agrega un anti ac una anti IgG o una anti IgM si hay
complejos inmunes allí entonces el anti ac se va a pegar y el microscopio va a producir una
fluorecencia q va a pertmitri determinar si hay acs contra el microrganismo entonces va a ver una
fluorecencia de color verde o de color anaranjado dependiendo de lo que se quiera buscar.
Inmunohistoquimica : se caracteriza por que no se requiere de microscopio de fluorecencia , no
utiliza fluorocromos en el proceso de marcaje si no que utiliza enzimas la que mas utiliza es la
peroxidasa, la detección del complejo inmune formado se hace por una reacción enzimática en la
cual hay cambio de color y este cambio de color prenste en el sitio donde esta localizado el ag es
un indicio de que la reacción es positiva . solo se utiliza para detección de ag o de complejo
inmune en biopsias de diferentes tejidos por ej biopsias renales , hepáticas . Por medio de este
método por ejemplo se pueden detectar no solo complejos inmunes si no tambn ags presentes en
algunos tumores y la presencia de esos ags pueden servir en el pronostico de ese cáncer.
Inmunoanalisis
Son métodos de laboratorio que permitieron detectar concentraciones muy bajas de diferentes
ags , gracias a estos inmunoanalisis se pueden hacer mediciones de muchas moléculas como
citoquinas, de acs dirigidos contra determinados microrganismos , hormonas por este se puede
detectar un embarazo 4 o 5 dias depues de la consepcion detecta cantidades muy pequeñas no
solo de nanogramos si no tambnie de picogramos … picogramos es 10 a la menos 12 gramos , se
mejoro la detección de moléculas porque se empezaron a conjugar con otras moléculas como
isotopos radiactivos yodo 125 y yodo 131 de esto surgio el radiinmunoensayo .
Radioinmunoensayo : para detectar radiación se utiliza un equipo que se llama contador de los
rayos gamma por que el yodo 125 y el yodo 131 producen radiación gamma que son fuentes de
energía de alta penetración , el gran problema de este es que es altamente contaminante a pesar
de que los yodos tienen una vida media muy corta , esa es otra desventaja .
Inmunoensayo enzimático : los ags y los acs se les conjugo enzimas como la peroxidasa de rábano
picante y la fosfatasa alcalina , gracias a estas conjugación de las moléculas con las enzimas , se
podría hacer la detección de diferentes maneras una es colorimétrica , cambios de color se forma
un color café hay unos metros colimetricos , pruebas rápidas para detectar embarazo . y los
fluorometricos que utilizan una reacción enzimática que activa el fluorocromo uya intensidad va a
ser proporcional a la cantidad de ag o ac que hay .
Quimioluminicente : reacción exergonica genera liberación de enrgia por producción de luz .
El ultimo avance de los inmunoensayos es la inmunoluminicencia basada en … , la diferencia con
la enzimática es el uso de moléculas como bromio, torio . Estas moléculas son estimuladas por
una fuente de luz ultravioleta que genera luz fluorecente y esta se encarga de detreminar la
presencia de un ag .
Inmunocromatografia : pruebas de embarazo , en una superficie solida que es un pael de
nitrocelulosa allí se colocan acs o ags en determinados sitios que permiten la captura del ag que se
quiera detectar en la muestra .
Wenster blot : es un método que permite discriminar la precenca de acs contra diferentes ags de
la muestra ya sea de un mismo microo o de diferente microo en una muestra , utiliza papel de
nitrocelulosa para poder detectar acs contra diferentes ags el primer paso del western blot es la
electroforesis : es una prueba física en la cual se coloca una corriente eléctrica en un medio
semisólido , por medio de esto se hace separación de las proteínas por sus diferentes pesos
moleculares luego de esto se hace la transferencia de esas proteínas al papel de nitro celulosa
utilizando una corriente directa el papel se corta en fragmentos y luego se coloca en contacto con
el suero del paciente luego de un tiempo de incubación con agitación constante se lava la tira de
nitro celulosa y se coloca en contacto con un anti ac dirigido contra la IgG humana marcado con
una enzima usualmente se utiliza la fosfatasa alcalina , se deja encubar un tiempo y se vuelve a
lavar , luego se agrega el sustrato que permite que se produzca la reacción enzimática y esta
genera un cambio de color en el sitio donde esta esa base puede ser una prueba confirmatoria de
algunas enfermedades como en pacientes que se sospeche tengan VIH , primero se hace una
prueba rápida , una prueba de Elisa que es una prueba inmunocromatografica si esta da positiva
se debe confirmar con una prueba de Elisa normal y si las dos son positivas se debe confirmar con
el western blot allí se van a mostrar el patrón de acs que esa persona tiene contra el VIH.
La confiabilidad depende de una alta sensibilidad mayor de 98 %y una alta especificidad del
100%
Sensibilidad: probabilidad que una prueba de laboratorio especifica para una determinada
enfermedad sea positiva en un paciente que tenga esa enfermedad
Especificidad: probabilidad que la prueba sea negativa en pacientes que no tengan la enfermedad
Puede ser altamente sensible y especifica pero esto además esto va asociado al valor predictivo
positivo y negativo
Valor predictivo positivo: es la probabilidad de que una persona que dio positiva en una
determinada prueba tenga la enfermedad
Valor predictivo negativo: es la probabilidad de que una persona con una prueba negativa no
tenga la enfermedad
El valor predictivo depende en gran medida de la prevalencia de la enfermedad en una
determinada región +para poder determinar todos los anteriores se emplea la tabla de
contingencia
Si la prueba es positiva en pacientes enfermos es un verdadero positivo si es negativa en
pacientes enfermos es falso negativo
Si la prueba es positiva en personas sanas es un falso positivo y si es negativa en personas sanas
es un verdadero negativo
La probabilidad de que una prueba sea positiva es los enfermos , la especificidad es la cantidad de
personas positivas sobre el total de personas sanas
El valor predictivo positivo es el número de verdaderos positivos sobre el total de muestras que
dieron positivas por esa prueba
Valor predictivo negativo: Verdaderos negativos sobre el total de personas que fueron negativas
por esta prueba
Una prueba puede tener una muy alta sensibilidad pero un valor predictivo positivo bajo eso
quiere decir que si la prueba es positiva la probabilidad de tener la enfermedad es baja .