Ácido Cítrico - R

Ácido Cítrico
BOEHRINGER MANNHEIM / R-BIOPHARM
Enzymatic BioAnalysis/Food Analysis
Método UV
Para la determinación de ácido cítrico en
alimentos y otros materiales
Para uso in vitro solamente
Cat. No. 10 139 076 035
Test-Combinado para 3 x 12 determinaciones
Principio (Ref. A1)
El ácido cítrico (citrato) es convertido a oxaloacetato en la reacción
catalizada por la enzima Citrato Liasa (CL) (1).
oxaloacetato + acetato
(1)
Citrato
⎯ CL →
En presencia de la enzima L-malato deshidrogenasa (L-MDH) y de
L-lactado deshidrogenasa (L-LDH), el oxaloacetato y su producto de
decarboxilación, piruvato, se reducen a L-malato y L-lactato
respectivamente, por medio de nicotinamida-adenina dinucleótido
reducido (NADH) (2,3).
+
(2) Oxaloacetato + NADH + H ⎯ L-MDH →
+
(3) Piruvato + NADH + H
⎯ L-LDH →
L-malato + NAD
L-lactato + NAD
+
+
La cantidad de NADH oxidado en las reacciones (2) y (3) es
estequiométrico con la cantidad de citrato El NADH se mide por
medio de su absorbancia a 334, 340 ó 365 nm.
El test combinado contiene
1 Tres Botellas 1: cada una con 1,4 g de liofilizado conteniendo:
Tampón glicil-glicina; pH 7.8, L-malato deshidrogenasa, aprox. 136
U; L-lactato deshidrogenasa, aprox. 280 U; NADH, aprox. 12 U
2 Tres Botellas 2: cada una con 50 mg de citrato liasa liofilizada,
aprox. 12 U.
3 Botella 3: Solución estándar de ácido cítrico para control del
ensayo (la medición de la solución estándar no es necesaria para el
cálculo de los resultados). Usar la solución estándar sin diluir. (Fecha
de vencimiento: ver etiqueta).
Preparación de las soluciones para 10 determinaciones
1. Disolver el contenido de una Botella 1 con 12 ml de agua
bidestilada.
2. Disolver el contenido de una Botella 2 con 0.3 ml de agua
bidestilada.
Estabilidad de los reactivos
Los contenidos de las Botellas 1 y 2 son estables a 2-8ºC (ver
etiqueta).
La solución 1 es estable por 2 semanas a 2-8ºC ó por 4 semanas a
–20 a -25ºC.
Llevar la Solución 1 a 20-25ºC antes de su uso.
La solución 2 es estable por 1 semanas a 2-8ºC ó por 4 semanas a
–20 a -25ºC.
Procedimiento
1
Longitud de onda :
2
Cubeta de vidrio :
Temperatura:
Volumen final:
Leer contra aire
Soluc. de muestra:
340 nm, Hg 365 nm ó Hg 334 nm
1.00 cm de paso de luz
20-25ºC
3.020 ml
(sin cubeta en el paso de luz) ó contra agua
3
1-80 ug de ácido cítrico/ensayo (en 0.200-2.000
ml de volumen de muestra
1 La absorción máxima de NADH es a 340 nm. En espectrofotómetros las mediciones se
toman a la máxima absorción, si se utilizan fotómetros espectrales equipados con lámpara
de vapor de mercurio, las mediciones se toman a 365 nm ó 334 nm.
2 Si se desea se pueden utilizar cubetas descartables en lugar de cubetas de vidrio.
3 Ver las instrucciones para el rendimiento del ensayo.
4 La nicotinamida-adenina dinucleótido reducida, NADH-Na2, Cat. No. 127345, disponible
en Roche Applied Science.
Almacenar a 2-8° C
Esta traducción en español has sido realizada por R−Biopharm
Latinoamérica con el objeto de ayudar a los usuarios a entender el
procedimiento, pero no se actualizan regularmente por lo que no
pueden remplazar las instrucciones en inglés. Las instrucciones de
uso que son válidas, son aquellas incluidas en cada kit en Alemán y
en Inglés, dado que están escritas e impresas por el fabricante
(Roche). Refiérase siempre a las instrucciones incluidas en cada kit.
Pipetear en la cubeta
Solución 1
Blanco
Muestra
1,000 ml
1,000 ml
Solución de muestra*
0,200 ml
agua bidestilada
2,000 ml
1,800 ml
Mezclar**, leer las absorbancias de las soluciones (A1) luego de
aprox. 5 min e iniciar la reacción por la adición de:
Solución 2
0,020 ml
0,020 ml
Mezclar**, al finalizar la reacción (aprox. 5 min) leer las absorbancias
de las soluciones (A2).
*Enjuagar el tip de la pipeta con solución de muestra antes de dispensar la solución de
muestra.
** Por ejemplo, con una espátula plástica ó por agitación después de cubrir la cubeta con
Parafilm (marca registrada de la American Can Company, Greenwich, Ct., USA).
Determinar la diferencia de absorbancias (A1 – A2) para el blanco y
las muestras. Sustraer la diferencia de absorbancia del blanco de la
diferencia de absorbancia de la muestra correspondiente.
∆A = (A1 – A2)muestra - (A1 – A2)blanco
Ocasionalmente se puede obtener un valor negativo de (A1-A2)blanco.
Este valor debe sumarse al (A1 – A2)muestra de acuerdo a la fórmula de
cálculo.
La diferencia de absorbancias medida debe, como regla, ser mayor a
0.100 unidades de absorbancia para obtener resultados
suficientemente precisos (ver “Instrucciones para el desarrollo del
ensayo” y “Sensibilidad y Límite de detección” pto. 4).
Si la diferencia de absorbancia de la muestra (∆A muestra) es mayor
que 1.000 (medido a 340 nm, Hg 334 nm) ó 0.500 (medido a Hg 365
nm) respectivamente, la concentración de ácido cítrico en la solución
de muestra es muy alta. La solución de muestra debe diluirse en
dicho caso de acuerdo a la tabla de dilución.
Cálculos
De acuerdo a la ecuación general del cálculo de las concentraciones:
V x MW
c = ------------------------------ x ∆A (g/l)
ε x d x v x 1000
V
= volumen final (ml)
v
= volumen de muestra (ml)
MW
= peso molecular de la sustancia a ensayar (g/mol)
d
= paso de luz (cm)
ε
= coeficiente de extinción del NADH a:
-1
-1
340 nm = 6.3 (l x mmol x cm )
-1
-1
Hg 365 nm = 3.4 (l x mmol x cm )
-1
-1
Hg 334 nm = 6.18 (l x mmol x cm )
Corresponde para ácido cítrico (calculado como ácido anhidro):
3.020 x 192.1
2.900
c = ----------------------------------- x ∆A = ------------ x ∆A (g cítrico / l
ε x 1.00 x 0.200 x 1000
ε
de sol. de muestra)
para ácido cítrico (calculado como monohidrato):
3.020 x 210.1
3.173
c = ----------------------------------- x ∆A = ---------- x ∆A (g cítrico mono
ε x 1.00 x 0.200 x 1000
ε
hydrato/l sol.
de muestra)
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1/4
Si la muestra se ha diluido durante la preparación, los resultados
deben multiplicarse por el factor de dilución F.
Cuando se analizan muestras sólidas ó semisólidas que se pesan
para la preparación de la muestra, los resultados se calculan a partir
de la cantidad pesadas:
c ác. cítrico (g/l de sol. )
Contenido ác. cítrico = ----------------------------------- x 100 (g / 100g)
peso muestra en g/l sol.
1. Instrucciones para el funcionamiento del kit
La cantidad de ácido cítrico presente en el ensayo debe ser entre 1
ug y 80 ug. Para obtener una diferencia de absorbancias suficiente,
la solución de muestra debe diluirse para dar una concentración de
ácido cítrico entre 0.04 y 0.4 g/l.
Tabla de dilución
Cantidad estimada de ácido
cítrico por litro
Dilución con
agua
Dilución
Factor F
< 0.4 g
-
1
0.4-4.0 g
1+9
10
4.0-40 g
1 + 99
100
> 40 g
1 + 999
1000
Si la medida de la diferencia de absorbancias (∆A) es muy pequeña
(ej. < 0.100), debe prepararse nuevamente la solución de muestra
(pesar mas cantidad de muestra ó diluir menos la muestra) ó el
volumen de muestra que se pipetea en la cubeta puede aumentarse
hasta 2.000 ml. El volumen de agua agregada debe, en ese caso,
disminuirse para obtener el mismo volumen final en el ensayo para la
muestra y el blanco. El nuevo volumen de muestra v debe tomarse
en cuenta en los cálculos.
2. Información técnica
2.1. Al hacer los cálculos, debe indicarse claramente si los
resultados se van a dar como ácido cítrico (masa molar 192.1 g/l),
ácido cítrico monohidrato (masa molar 210.1) ó como citrato (masa
molar 189.1 g/l). (En las determinaciones enzimáticas, se mide el ión
citrato).
2.2. Al evaluar los resultados analíticos, debe tomarse en cuenta que
en la determinación acidimétrica del ”ácido total calculado como
ácido cítrico” se miden protones y en la determinación enzimática se
mide el ion citrato. Por lo tanto no se pueden comparar ambos
resultados directamente.
3. Especificidad (Ref. 1)
El método es específico para ácido cítrico.
Al analizar ácido cítrico monohidrato comercial, se obtienen
resultados de > 100% si el agua de cristalización se pierde durante
el almacenamiento y los resultados se calculan con el peso
molecular del ácido cítrico monohidrato (210.1).
4. Sensibilidad y límite de detección (Ref. 1.4)
La mínima diferencia en absorbancia para el procedimiento es de
0.005 unidades de absorbancia. Este valor corresponde, con un
máximo volumen de v = 2.000 ml y medido a 340 nm, a una
concentración de ácido cítrico de 0.25 g/l de solución de muestra (si
se utiliza un v = 0.200 ml, esto corresponde a 2.5 mg/l por litro de
solución de muestra).
El límite de detección de 0.5 mg/l deriva de la diferencia de
absorbancia de 0.010 (medida a 340 nm) y un máximo de volumen
de muestra de v = 2.000 ml.
5. Linealidad
La linealidad de la determinación es desde aproximadamente 1 ug
de ácido cítrico/ensayo (0.5 mg de ácido cítrico /l de solución de
muestra, volumen de muestra v = 2.000 ml) hasta 80 ug de ácido
cítrico /ensayo (0.4 g de ácido cítrico /l de solución de muestra,
volumen de muestra v = 0.200 ml).
6. Precisión
En una determinación por duplicado de una solución de muestra, se
puede obtener una diferencia de 0.005 a 0.010 unidades de
absorbancia. Con un volumen de muestra de v = 0.200 ml y medido
a 340 nm, esto corresponde a una concentración de ácido cítrico de
3-5 mg/l. (Si la muestra se diluye durante la preparación de la
misma, el resultado se debe multiplicar por el factor de dilución F. Si
la muestra se pesa para su preparación, ej. usando 1 g muestra/100
ml = 10 g/l, se puede obtener una diferencia de 0.03-0.05g/100 g).
En la literatura se han publicado los siguientes datos:
CV = 4.4 % n = 10
extracto de hígado de conejo
CV = 1.3 % n = 10
vino
1.3)
(Ref.
Jugo de fruta:
r = 0.095 + 0.025 x (c ácido cítrico en g/l) g/l
R = 0.130 + 0.054 x (c ácido cítrico en g/l) g/l
Vino:
Ácido cítrico < 400 mg/l
Ácido cítrico >400 mg/l:
r = 14 mg/l R = 39 mg/l
r = 28 mg/l R = 65 mg/l
2.13,2.14)
(Ref.
7. Interferencias / fuentes de error
Si la solución de muestra contiene ácido pirúvico libre, todo el NADH
se ha consumido previo a la medición de A1. En dicho caso se
recomienda agregar mas NADH a la muestra (ej. 0.100 ml de
4
solución de NADH, 5 mg/ml) ,y utilizar menos agua destilada.
8. Reconocimiento de interferencia durante el procedimiento del
ensayo
8.1 Si la conversión de ácido cítrico se ha completado en el tiempo
estipulado en “Procedimiento”, se puede concluir, en general, que no
han ocurrido interferencias.
8.2 Al completarse la reacción, la determinación puede reiniciarse
con el agregado de ácido cítrico ó citrato de sodio (cualitativa ó
cuantitativamente): si la absorbancia se altera posteriormente al
agregado del material estándar, esto también es una indicación que
no ha ocurrido interferencia.
8.3 Se pueden reconocer errores del operador ó interferencia en la
determinación por la presencia de sustancias contenidas en la
muestra, realizando una doble determinación utilizando dos
volúmenes diferentes de muestra (ej. 0.100 ml y 0.200 ml): las
diferencias en las mediciones de las absorbancias deben ser
proporcionales a los volúmenes de muestra utilizados.
Cuando se analizan muestras sólidas, se recomienda que se pesen
diferentes cantidades (ej. 1g y 2g) en recipientes de 100 ml. Las
diferencias de absorbancias medidas y los pesos de la muestra
utilizados deben ser proporcionales para volúmenes idénticos.
8.4 Se pueden reconocer posibles interferencias causadas por
sustancias contenidas en la muestra utilizando un estándar interno
como control: además de las determinaciones de la muestra, el
blanco y el estándar, se lleva a cabo otra determinación con la
muestra y el control juntos en el mismo ensayo. La recuperación se
puede calcular de la diferencia de absorbancias medidas.
8.5 Posibles pérdidas durante la determinación se puede reconocer
por medio de ensayos de recuperación: la muestra debe prepararse
y analizarse con y sin el agregado de material estándar. Dicha
adición debe recuperarse cuantitativamente dentro del rango del
error del método.
9. Riesgo de los reactivos
Los reactivos utilizados en la determinación de ácido cítrico no son
materiales riesgosos de acuerdo a las Regulaciones de Sustancias
Peligrosas, las Leyes Químicas ó la Regulación 67/548/EEC de la
CEE y subsecuentes Guías de alteraciones, suplementos y
adaptaciones. Aún así, deben cumplirse todas las medidas de
seguridad generales que se aplican a todas las sustancias químicas.
Luego de su utilización, los reactivos deben desecharse con el
descarte del laboratorio, pero deben observarse siempre las
regulaciones locales. El material de empaque puede desecharse en
recipientes destinados al reciclado.
10. Información general sobre la preparación de muestra
Al llevar a cabo el ensayo:
Usar muestras líquidas límpidas, incoloras y prácticamente
neutras directamente ó luego de diluirlas de acuerdo a la tabla de
dilución, y usar un volumen hasta 2.000 ml.
Filtrar soluciones turbias;
Desgasear muestras que contengan dióxido de carbono (ej. por
filtración);
Ajustar muestras ácidas a un pH aproximado de 8 por el agregado
de una solución de hidróxido de sodio ó de potasio;
Ajustar muestras ácidas y levemente coloreadas a un pH
aproximado de 8 por el agregado de una solución de hidróxido de
sodio ó de potasio y posterior incubación durante 15 min;
Tratar las muestras “altamente coloreadas” que se usan sin diluir
ó en grandes volúmenes con polivinilpolipirrolidona (PVPP) ó con
poliamida, (ej. 1 g/100 ml);
Moler ú homogeneizar las muestras sólidas ó semisólidas, extraer
con agua ó disolver en agua y filtrar si es necesario;
Desproteinizar muestras que contengan proteínas con ácido
perclórico;
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Extraer muestras que contengan grasa con agua caliente (la
temperatura de extracción debe ser mayor que el punto de fusión de
la grasa involucrada). Enfriar para permitir que la grasa se separe,
colocar el recipiente en baño de hielo por 15 min y filtrar;
Nota importante
No puede utilizarse la clarificación de Carrez en la preparación
de la muestra para la determinación de ácido cítrico debido a la
baja tasa de recuperación (absorción de ácido cítrico)
11. Ejemplos de aplicación
Determinación de ácido cítrico en jugos de fruta, refrescos, té y
bebidas similares
Remover turbidez por filtración y diluir la muestra hasta obtener una
concentración de ácido cítrico entre 0.04 y 0.4 g/l. La solución diluida
se puede utilizar para el ensayo aún si es coloreada. Solo jugos
intensamente coloreados deben decolorarse cuando se utilizan
puros en el ensayo debido a su bajo contenido en ácido cítrico. En
dichos casos proceder como sigue:
Mezclar 10 ml de jugo con 0.1 g de poliamida ó polivinilpolipirrolidona
(PVPP), agitar por 1 min y filtrar. Usar la solución clara ó levemente
coloreada para el ensayo, neutralizar si es necesario.
Determinación de ácido cítrico en vino
Vinos levemente coloreados pueden utilizarse directamente para el
ensayo ó luego de una dilución de acuerdo a la tabla de dilución.
Vinos altamente coloreados deben decolorarse cuando se utilizan
puros para la determinación, sobre todo cuando se aumenta el
volumen debido a su baja concentración de ácido cítrico:
Mezclar 10 ml de vino con 0.1 g de poliamida ó polivinilpolipirrolidona
(PVPP), agitar por 1 min y filtrar. Usar la solución clara ó levemente
coloreada para el ensayo.
Determinación de ésteres de ácido cítrico en vino
Calentar 20 ml de muestra y 6 ml de hidróxido de potasio alcohólico
(aprox. 2 M; metanol ó etanol) por 10 min en un condensador de
reflujo mientras se agita; enfriar a 20-25 ºC y neutralizar con ácido
sulfúrico (2 M). Transferir cuantitativamente a un recipiente graduado
de 50 ml y llevar a volumen con agua destilada. Utilizar la solución
obtenida directamente en el ensayo ó luego de una dilución, si es
necesario (= ácido cítrico total, que el la suma del ácido cítrico libre y
el esterificado).
Determinación de ácido cítrico en cerveza
Para la remoción de ácido carbónico, agitar aproximadamente 5-10
ml de cerveza durante 1 min con agitador de vidrio ó filtrar. La
muestra libre de CO2 se utiliza para el ensayo sin posterior dilución.
Determinación de ácido cítrico en pan, productos cárnicos,
queso, vegetales y productos de fruta
Moler aprox. 20-50g de material de muestra (usar por ej. mortero u
homogeneizador). Pesar 10g de muestra bien mezclada en
recipiente de homogeneización y agregar 50 ml de ácido perclórico
(1 M); homogeneizar por 2 min (hasta 10 min). Se permite un
calentamiento hasta 35 ºC. Centrifugar el homogenato.
Ajustar 20 ml del sobrenadante a pH 8-10 con aprox. 4 ml (medir el
volumen de OHK necesario) de solución de hidróxido de potasio (5
M). Colocar la solución en el refrigerador por 15 min para que
precipite cuantitativamente del perclorato de potasio formado, filtrar,
y descartar los primeros ml. Usar el filtrado directamente en el
ensayo ó luego de su dilución de acuerdo a la tabla de dilución.
Para el cálculo del contenido (en g/100 g) de acuerdo a la fórmula ya
mencionada (ver Cálculos), se necesita la cantidad de muestra
utilizada para preparar la solución. Si se utiliza la preparación de
muestra recién descripta y, considerando la cantidad de agua de la
muestra, el peso de la muestra se calcula de acuerdo a la siguiente
fórmula:
A x 1000 x d
Peso muestra = ----------------------------- (g/l de solución de muestra)
(b + a x w) x (d + e)
Donde:
a = muestra pesada en g
b = volumen de ácido perclórico en ml
d = volumen de sobrenadante para ajustar pH
e = volumen de KOH para ajustar pH a 8-10 en ml
w = contenido de agua de la muestra (%p/p) / 100
1000 = factor para g expresado en mg
(La gravedad específica de agua de la muestra a 20-25 ºC es aprox.
1 g/ml. Puede despreciarse para el cálculo).
Si se desea determinar, además de ácido cítrico libre, ácido cítrico
esterificado, ej. ésteres cítricos de polifenoles ó antocianos, los
ésteres deberán convertirse en ácido libre por hidrólisis alcalina.
Proceder como se detalla en Vinos.
Determinación de ácido cítrico en margarina, aceite comestible
y ungüentos
Pesar aproximadamente 5 g de muestra homogeneizada en un
recipiente de agitación, agregar 70 ml de agua destilada y mientras
se agita vigorosamente sobre un agitador térmico, llevar a ebullición.
Transferir la fase acuosa con pipeta en un recipiente graduado de
100 ml. Repetir la extracción con aprox. 20 ml de agua destilada.
Permitir que baje la temperatura a 20-25 ºC y llevar a volumen con
agua destilada. Colocar el recipiente durante 15 min en baño de
hielo ó en el refrigerador. Filtrar a través de filtro de papel. De
acuerdo a la concentración de ácido cítrico esperada, usar el filtrado
puro ó diluido para el ensayo.
Determinación de ésteres de ácido cítrico
(ej. ésteres glicéridos de ácido cítrico, agentes emulsionantes)
El ácido cítrico que está unido a ésteres mono y diglicéridos de ácido
cítrico respectivamente, puede determinarse en presencia de ácido
cítrico libre (citrato) si la muestra se extrae con cloroformo y los
ésteres son subsecuentemente saponificados con hidróxido de
potasio. En ese caso proceder:
Hervir las muestras bien desmenuzadas y homogeneizadas que
contienen hasta aprox. 120 mg de éster monoglicérido de ácido
cítrico (ej. éster mono-oleilcitril glicérido, PM aprox. 550) ó hasta
aprox. 170 mg de éster diglicérido de ácido cítrico (ej. éster dioleilcitril glicérido, PM aprox. 810) con 50 ml de cloroformo en
recipiente redondo con condensador con reflujo por aprox. 2 horas.
Filtrar y lavar con cloroformo. Evaporar el cloroformo en evaporador
rotatorio. Hervir el residuo seco con 25 ml de hidróxido de potasio
metanólico (1 M) durante 10 min. en condensador de reflujo. Enfriar
hasta 20-25 ºC y neutralizar o acidificar levemente con aprox. 5 ml
de ácido clorhídrico (5 M). Transferir la solución cuantitativamente a
un recipiente graduado de 100 ml, llevar a volumen con agua, y
filtrar. Usar la solución clara para el ensayo.
Para la determinación del contenido se debe tener en cuenta el peso
molecular del glicérido.
12. Otras aplicaciones
El método puede ser utilizado para los análisis de papel, cosméticos,
detergentes (Ref. 3.6), medicamentos, así como el análisis de
muestras biológicas con fines de investigación.
Para detalles del muestreo, tratamiento y estabilidad de la muestra
ver Re. 1.3 y 1.5.
Determinación de ácido cítrico en muestras de fermentación y
en medio de cultivo de células
Colocar la muestra (luego de centrifugar si es necesario) en un baño
de agua a 80ºC por 15 min para detener las reacciones enzimáticas.
Centrifugar y utilizar el sobrenadante (diluido de acuerdo a la tabla
de dilución si es necesario) para el ensayo. Alternativamente se
puede desproteinizar con ácido perclórico. Ver los ejemplos
mencionados anteriormente.
Homogeneizar medio gelatinoso de agar con agua y proseguir el
tratamiento como se ha descrito.
Referencias
1.1 Gruber, W. & Möllering, H. (1966) Citrat-Lyase und Bestimmung von Citrat,
Biochemische Zeitschrift 346, 85-88
1.2 Möllering, H. & Gruber, W. (1966) Determination of citrate with citrate lyase, Anal.
Biochem. 17, 369-376
1.3 Dagley, St. (1974) in Methoden der enzymatischen Analyse (Bergmeyer, H. U.,
Hrsg.) 3. Aufl., Bd. 2, S. 1607-1611; Verlag Chemie Weinheim and (1974) in Methods
of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.) 2nd ed., vol. 3, pp. 1562-1565, Verlag
Chemie, Weinheim/ Academic Press, Inc., New York and London
1.4 Möllering, H. (1985) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.)
3rd ed., vol. VII, pp. 2-12; Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach/Florida, Basel
1.5 Passonneau, J. V. & Brown, J. G. (1974) in Methoden der enzymatischen
Analyse (Bergmeyer, H. U., Hrsg.) 3. Aufl. Bd. 2, S. 1613-1614, Verlag Chemie
Weinheim and (1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed.) 2nd
ed., vol. 3, p. 1568, Verlag Chemie, Weinheim/Academic Press, Inc., New York and
London
2.1 Bundesverband der Deutschen Feinkostindustrie e.V. Bonn; Analysenmethoden:
Bestimmung von Citronensäure in Tomatenmark, IV/41 (Dezember 1979)
2.2 Norme Française Homologuée NF V 76-104 (Octobre 1980) Jus de Fruits et Jus
de Légumes, Détermination de la Teneur en Acides Carboxyliques
2.3 Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach §35 LMBG;
Untersuchung von Lebensmitteln: Bestimmung von Citronensäure (Citrat) in
Fleischerzeugnissen, 07.00-13 (November 1981); Bestimmung von Citronensäure
(Citrat) in Wurstwaren, 08.00-15 (November 1981); Bestimmung von Citronensäure
in Tomatenmark, 26.11.03-5 (Mai 1983); Bestimmung von Citronensäure in
2013-10
3/4
Tomatenketchup und vergleichbaren Erzeugnissen, 52.01.01-5 (November 1983);
Bestimmung von Citronensäure (Citrat) in Fruchtsäften, 31.00-14 (November 1984);
Enzymatische Bestimmung des Gehaltes an Citronensäure (Citrat) in Frucht- und
Gemüsesäften, L 31.00-14 (Januar 1997); Bestimmung des Gehaltes an
Citronensäure (Citrat) in Gemüsesäften, spektralphotometrische Bestimmung von
NADH, 26.26-12 (Januar 1997)
2.4
Schweizerisches
Lebensmittelbuch,
Kapitel
61B
(Enzymatische
Bestimmungen)/3.1 (1981), Kapitel 2A (Milchmischgetränke)/18 (1980), Kapitel 2B
(Sauermilchprodukte)/ 15 (1980), Kapitel 4 (Milchdauerwaren)/10.3 (1993), Kapitel
28A (Frucht- und Gemüsesäfte u.a.)/7.5 (1988), Kapitel 30 (Wein)/36 (1967), Kapitel
2.8 Henniger, G. & Mascaro, L. (1985) Enzymatic-ultraviolet determination of citric
acid in wine, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 68, 1024-1027
2.9 Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists
(1990), 15th ed., vol. 2, p. 746 (985.11)
2.10 Deutsche Norm DIN 10325 (Januar 1986) Bestimmung des
Citronensäuregehaltes in Schmelzkäse (Enzymatisches Verfahren)
2.11 Nederlandse Norm NEN 2851 (1e druk, september 1987) Vruchtesappen:
Bepaling van het citronenzuurgehalte; Enzymatische methode (Fruits juices Determination of the citric acid content - Enzymatic method)
2.12 RSK-Values, The Complete Manual, Guide Values and Ranges of Specific
Numbers for Fruit Juices and Nectars, Including the Revised Methods of Analysis
(1987), 1st ed., Verlag Flüssiges Obst/Liquid Fruit, D-56370 Eschborn, pp. 97-100
2.13 Recueil des méthodes internationales d'analyse des vins et des moûts,
Complément no 1 à l'édition officielle de juin 1990, OFFICE INTERNATIONAL DE LA
VIGNE ET DU VIN, S. 187-189
2.14 Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften L 272 (3. Oktober 1990),
Rechtsvorvorschriften: Verordnung (EWG) Nr. 2676/90 der Kommission vom 17.
September 1990 zur Festlegung gemeinsamer Analysenmethoden fr den Weinsektor
(S. 94-96); Official Journal of the European Communities L 272 (3 October 1990),
Legislation: Commission Regulation (EEC) No 2676/90 of 17 September 1990
determining Community methods for the analysis of wines (pp. 94-96)
2.15 International Dairy Federation, Provisional Standard 34C (1992) Cheese &
Processed Cheese products, Determination of Citric Acid Content (Enzymatic
Method)
2.16
Verband
Deutscher
Landwirtschaftlicher
Untersuchungsund
Forschungsanstalten,
VDLUFA
(1993)
Enzymatische
Bestimmung
des
Citronensäuregehaltes in Käse und Schmelzkäse, Methodenbuch Band VI, C8.7
2.17 Deutsche Norm DIN EN 1137 (Dez. 1994) Frucht- und Gemüsesäfte;
Enzymatische
Bestimmung
des
Gehaltes
an
Citronensäure
(Citrat);
Spektralphotometrische Bestimmung von NADH (Fruit and vegetable juices;
Enzymatic determination of citric acid (citrate) content; NADH spectrometric method)
2.18 European Standard EN 1137 (Dec . 1994) Fruit and vegetable juices, Enzymatic
determination of citric acid (citrate) content by the NADH spectrometric method
2.19 Deutsche Norm DIN 10259 (Juni 1998) Material zur Herstellung von
Umhüllungen für Zigarettenfilter, Zigaretten und andere Tabakerzeugnisse,
Bestimmung des Citratgehaltes
2.20 International Standard ISO 2963 (März 1997) Cheese and processed cheese
products - Determination of citric acid content - Enzymatic method
2.21 Standard der Russischen Föderation / Standard of the Russian Federation /
Gosstandart Rossii GOST R 51129-98 (1998) Fruit and vegetable juices. Method for
determination of citric acid (citrate)
30A (Wein aus Trauben)/6.4 (1993), Kapitel 34 (Gärungsessig)/4.5 (1994), Kapitel
34A (Essig und essigähnliche Erzeugnisse)/21 (1970)
2.5 Gombocz, E., Hellwig, E., Vojir, F. & Petuely, F. (1981) Deutsche LebensmittelRundschau 77, 4-5
2.6 Brautechnische Analysenmethoden, Band III, S. 565-568 (1982),
Methodensammlung der Mitteleuropäischen Brautechnischen Analysenkommission
(MEBAK)
2.7 International Federation of Fruit Juice Producers (IFU, Methods of Analysis, no.
22- 1985); contained in "Code of Practice for Evaluation of Fruit and Vegetable
Juices" (1996) edited by Association of the Industry of Juices and Nectars from Fruits
and Vegetables of the European Economic Community (A.I.J.N.)
2.22 Standard der Russischen Föderation / Standard of the Russian Federation /
Gosstandart Rossii GOST R 51257-99 (1999) Processed cheese. Method for
determination of citric acid content
3.1 Mayer, K. & Pause, G. (1965) Eine enzymatische Citronensäure-Bestimmung,
Mitt. Geb. Lebensmittelunters. Hyg. 56, 454-458
3.2 Mayer, K. & Pause, G. (1969) Enzymatische Zitronensäurebestimmung an gerbund farbstoffreichen Weinen, Lebensm.-Wiss. Technol. 2, 143
3.3 Büsching, L. (1968) Methode zur enz. Bestimmung von Citronensäure und
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3.4 Schiweck, H. & Büsching, L. (1971) Citronensäure- und Raffinosegehalt in
Zuckerrübenwurzelkörpern und -blättern während des Wachstums und Füllung der
Citronensäure während der Saftreinigung, ZUCKER 24, 249-253
3.5 Piendl, A. (1974) Citrat im Bier, Brauwissenschaft 27, 250-257 und 305-311
3.6 Taraborelli, J. A. & Upton, R. P. (1975) Enzymatic Determination of Citrate in
Detergent Products, J. Am. Oil Chem. Soc. 52, 248-251
3.7 Gerstenberg, H. (1978) Nachweis von Teigsäuerungsmitteln in Brot aufgrund des
Zitronensäuregehalts, Lebensm. Chemie u. gerichtl. Chemie 32, 125-126
3.8 Seppi, A. & Sperandio, A. (1983) L'acido citrico nei vini, determinazione con
metodo enzimatico e con metodo chimico ufficiale, La Rivista della Societa Italiana di
Scienza
dell' Alimentazione 12, 479-482
3.9 Lagemann, M., Anders, D., Graef, V. & Bödeker, R.H. (1985) Einfluß von Kakao
auf die Ausscheidung von Oxalat, Citrat, Magnesium und Calcium im Urin bei
Kindern,
Monatsschr. Kinderheilkd. 133, 754-759
3.10 Klopper, W. J., Angelino, S.A.G.F., Tuning, B. & Vermeire, H.A. (1986) Organic
acids and glycerol in beer, J. Inst. Brew. 92, 225-228
3.11 Talpay, B. (1988) Inhaltsstoffe des Honigs - Citronensäure (Citrat), Deutsche
Lebensmittel- Rundschau 84, 41-44
3.12 Schlimme, E., Lorenzen, P. Chr., Martin, D. & Thormählen, K. (1996) Analytical
differentiation of butter types by specific compositional parameters of the aqueous
butter phase, Milchwissenschaft 51, 139-143
3.13 Saalfeld, U. & Freund, W. (1999) Charakterisierung pulverisierter Sauerteige
und Möglichkeiten ihrer qualitativen Bestimmung im Brot - Teil 1: Säuregehalt und
Abbauvermögen für L-Malat und Citrat, Deutsche Lebensmittel-Rundschau 95, 209219
Solución control de Ácido cítrico del ensayo (Botella 3)
Concentración *: ver etiqueta de la botella
La Solución control de ácido cítrico es una solución acuosa
estabilizada de ácido cítrico. Sirve como control del ensayo
enzimático para la determinación de ácido cítrico en alimentos y
otros materiales.
Aplicación:
1. Adición de la solución control de ácido cítrico al ensayo:
La solución control se utiliza en el ensayo en el lugar de la solución
de muestra.
2. Reiniciar la reacción, cuantitativamente:
Luego de finalizada la reacción con la solución de muestra y luego
de leída A2 agregue 0.100 ml de solución control del ensayo. Lea la
absorbancia A3 al finalizar la reacción (aprox. 10 min.). Calcular la
concentración a partir de la diferencia (A2-A3) de acuerdo a la
fórmula general para el cálculo de la concentración. Debe tomarse
en cuenta el cambio de volumen. Los resultados obtenidos, casi no
difieren de la concentración que figura en la etiqueta porque la
dilución de la mezcla del ensayo por el agregado de la solución
control es insignificante.
3. Estándar interno:
La solución control del ensayo puede utilizarse como estándar
interno para controlar el correcto funcionamiento del ensayo (errores
groseros) y para ver si la solución de muestra está libre de
sustancias interferentes.
Pipetear dentro
Blanco
Muestra
Estándar
Muestra +
de la cubeta
estándar
Solución 1
1.000 ml
1.000 ml
1.000 ml
1.000 ml
Solución
0.200 ml
0.100 ml
muestra
0.200 ml
0.100 ml
Control ensayo
2.000 ml
1.800 ml
1.800 ml
1.800 ml
Agua destilada
Mezclar, leer las absorbancias de las soluciones (A1) luego de aprox.
5 min. Continuar como se describe en el esquema de pipeteo bajo
del “Procedimiento”. Seguir las instrucciones dadas en “Instrucciones
para el desarrollo del ensayo”· y en los pié de página.
La recuperación del estándar se calcula de acuerdo a la siguiente
fórmula:
2 x ∆A muestra + estándar - ∆A muestra
recuperación = ----------------------------------------------- x 100 (%)
∆A estándar
* Determinada como ácido cítrico anhidro
2013-10
4/4