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¿Cual es el objetivo de realizar Biotecnología animal?
A.
Biotecnologí
Biotecnología animal
B.
C.
D.
Se pueden generar animales modificados (“animales
transgénicos”) para muchos propósitos, que sirvan de
modelos a enfermedades humanas o introducir nuevos
caracteres a animales importantes en producción como vacas
o peces
Métodos genéticos como selección asistida por marcadores
(MAS) ayuda a identificar zonas en el cromosoma con
caracteres importantes como crecimiento
Los genes se pueden transferir a través de especies, familias
e incluso reinos como resultado de tecnología del DNA
recombinante
Los principales objetivos de la biotecnología animal son razas
que sean más nutritivas y animales económicamente más
productivos, incrementen el crecimiento y desarrollo, así como
anticuerpos y producción de vacunas
Métodos de transferencia de genes
en animales
Métodos de transferencia de genes
en animales
Para insertar un gen correctamente en un animal, el
gen (denominado el transgen) necesita
expresarse en el momento adecuado y la
cantidad y lugar adecuado del animal
Promoters y secuencias reguladoras son esenciales
El gen se debe incorporar al cromosoma para una
expresión adecuada
Microinyección
1. La inyección del gen de interés en un huevo
fertilizado de un animal donador
2. El gen debe ser insertado antes que la primera
división celular de tal modo que todas las
células del animal contienen el gen
3.
Los pasos en el proceso son:
a. Identificació
Identificación (y a veces modificació
modificación por mutació
mutación) de
un gen de interé
interés
b. Inserció
Inserción del gen de interé
interés en el vector apropiado
c. Microinyecció
Microinyección del DNA dentro del pronucleo de un
huevo fertilizado
d. Implantació
Implantación del huevo microinyectado en una madre de
alquiler
e. Permitir el desarrollo del embrió
embrión hasta su nacimiento
f. Demostració
Demostración que el gen ha sido incorporado de manera
estable en el genoma huesped y es heredado en la
descendencia
g. Demostrar que el gen se expresa y es correctamente
regulado en el organismo del huesped
1
Transferencia génica de célula madre embrionaria
4. Animales fundadores,
fundadores, que son los animales que tienen
el nuevo gen en las cé
células germinales (reproductivas
(reproductivas))
se cruzan para establecer nuevas lí
líneas gené
genéticas con
las caracterí
características de interé
interés
5. Se ha desarrollado la Microscopí
Microscopía diferencial de
interferencia de manera que el el nú
nú cleo de los huevos
son visibles para insertar en las madres lo antes posible
6. Problemas potenciales:
potenciales:
a. Sobreviven pocos huevos inyectados
b. El gen se inserta al azar en los cromosomas
c. No todas las cé
células del animal reciben el gen
d. El gen no se expresa lo suficiente
1.
(ES) Células indiferenciadas que se dividen para producir células
diferenciadas mientras mantienen sus características de
indiferenciadas (llamadas células pluripotentes)
2. Células madre embrionarias “Embryonic stem (ES) cells” se usan
para promover reemplazamiento génico dirigido (recombinación
homóloga) de manera que el gen se inserta en el cromosoma
adecuado
3. Los pasos son los siguientes:
a. Células ES se extraen del embrión
b. El gen de interés se inserta en las células (llamado
“transfección”)
c. El gen es dirigido por recombinación homóloga y marcadores de
selección
d. Las células ES con el gen adecuado se inyectan en embriones
parcialmente desarrollados denominados “blastocitos”, que se
implanta en una madre
e. La descendencia es cribada por el caracter de interés
4. Se puede usar para modelos de enfermedades humanas como la
enfermedad de Gehrig, cancer, Alzheimer, fibrosis cistica
Problemas con recombinación
homóloga
Recombinación no-homóloga frecuente
Solución: vectores de reemplazo
La construcción KO contiene 1) Gen neoR
Flanqueado por 2) 2 segmentos de gen objetivo
y 3) El gen HSVtk
Parte del gen se reemplaza con neoR
Células ES se seleccionan por la integración NeoR y contra
ka integración de HSVtk* (NeoR+/ HSVtk-) en ganciclovir
2
2
en
1
lg
ge
n
Recombinación
homóloga
de
to
5.
en
gm
NeoR
se
se
gm
en
to
d
el
Vectores de reemplazo
HSVtk
Plásmido de
reemplazo linearizado
Integración al azar
NeoR
NeoR+/ HSVtk-
Puede inactivar gene para monitorizar el efecto en crecimiento o
para desarrollar tratamientos
6. Mutagé
Mutagénesis dirigida en rató
ratón
a. Inserció
Inserción de DNA en un lugar especí
específico del cromosoma
b. Genes se pueden tambié
también inactivar (llamado
(llamado KO)
c. Los pasos en crear ratones KOs son:
1) Un gen se inactiva al eliminar una parte del gen e insertar un
gene de resistencia a antibió
antibiótico en su lugar. DNA homó
homólogo
donde la recombinació
recombinación va a ocurrir flanquea ambos lados
del marcador.
.
El
DNA
insertado
tambié
é
n
lleva
un
gen
que
marcador
tambi
produce la piel negra
2) El gen se transfiere a cé
células madres embrionarias.
embrionarias. La
células contendrá
contendrán dos copias del gen de interé
interés y dos
copias del de del gen de piel negra (en homozigosis)
NeoR+/ HSVtk+
HSVtk convierte ganciclovir en una
droga tóxida y mata células HSVtk+
3) Las cé
células se criban con antibió
antibióticos para determinar la
correcta inserció
inserción del DNA
4) Las cé
células madre embrionarias se transfieren a embriones
de rató
ratón tempranos
5) Los embriones se implantas en madres se permite su
nacimiento
6) La descendencia tendrá
tendrán piel blanca y negra,
negra, siendo la piel
negra un marcador para el gen eliminado.
eliminado. Esto se llama una
quimera,
quimera, osea un rató
ratón con cé
células normales y cé
células
modificadas
7) La descendencia se cruzan con un rató
ratón blaco y cualquier
rató
ratón completamente negro será
será un rató
ratón KO, conteniendo
el gen inactivado en cada cé
célula.
lula. Esto muestra que el gen
inactivado está
está presente en todas las cé
células
d. El maí
maíz KO se confirma para el gen diana por PCR
Retrovirus y transferencia gé
génica
1. Puede infectar a un animal de manera muy eficiente e
integrar DNA en genomas
2. Usa RNA como genoma e infecta cé
células sin matarlas
3. Durante al infecció
infección el RNA se convierte en DNA por la
enzima transcriptasa reversa.
reversa. El DNA se integra en el
genoma de la célula huesped expresá
expresándose los genes
víricos y formando el virus
4. Puede infectar diferentes tipos celulares con una sola
copia de DNA, pero solo puede llevar pequeas
candidades de DNA
5. Si el virus se usa como vector, el virus es inactivado
eliminando los genes necesarios para el
empaquetamiento y transcripció
transcripció n reversa
3
Animales transgé
transgénicos y sus aplicaciones
A.
Animales transgé
transgénicos tiene genes eliminados (Knockout, KO) o
genes añ
añadidos (Knockin
(Knockin,, KI) dependiendo de la aplicació
aplicación del
animal
B.
Ratones
1. Se usa como modelo para enfermedades humanas bien por KO
del gen or reemplazando el gen normal con un gen mutado
2. Es posible usarlos como factorí
factorías vivas:
vivas:
a. Productos transgé
transgénicos como factor IX de coagulació
coagulación en
leche animal
b. El gen de interé
interés se debe expresar bajo un promotor
especí
específico de mamas
c. Las proteí
proteínas que se secretan en la leche son má
más fá
fáciles de
aislar porque se pueden unir a la membrana plasmá
plasmática de
células de grasa producida en la leche
Se pueden generar vacas con una mayor resistencia a
enfermedades,
enfermedades, reduciendo la cantidad de vacunas,
vacunas, antibió
antibióticos y
visitas de veterinarios
4. Somatotropina bovina recombinante (rBST)
)
ha
sido
aprovada como
rBST
droga animal y permite a las vacas incrementar la producció
producción de
leche hasta un 25%. La controversia es que aunque se ha probado
que la rBST no es tó
tóxica en humanos y las vacas no tienen mayor
cantidad de proteí
proteínas en su cuerpo
D. Cerdos,
Cerdos, Ovejas y Cabras
1. Modificadas por ingenierí
ingeniería gené
genética como bioreactores para
producir proteí
proteínas como factores VIII y IX de coagulació
coagulación, hormona
del crecimiento e interleukinas
2. Las proteí
proteínas se pueden secretar en leche de ovejas y cabras sin
efecto en los animales
C.
Vacas
1. Producidas por microinyecció
microinyección de huevos siguiendo los pasos
siguientes:
siguientes:
a. Coleccionar óvulos de terneras sacrificadas
b. Maduració
Maduración del óvulo in vitro
c. Fertilizació
Fertilización del óvulo in vitro
d. Microinyecció
Microinyección de DNA en el pronú
pronúcleo masculino
e. Desarrollar los embriones hasta el estadí
estadío de blá
blástula
f. Cribar cé
células de embriones es estadod de blá
blástula por el gen
insertado (transgen
(transgen)) usando PCR
g. Implantar los embriones en vacas recié
recién fertilizada
h. Nacimento de terneros
2. Ingenierí
Ingeniería gené
genética se usa en alterar composició
composición de la leche para
producir proteí
proteínas humanas,
humanas, como insulina,
insulina, eritropoietina (EPO), y
anticuerpos monoclonales
3.
d. El mayor obstá
obstáculo es impedir la respuesta inmune por el
cuerpo humano.
humano. Cerdos alterados gené
genéticamente con
antí
antígenos de superficie modificados,
modificados, y la producció
producción de cerdos
sin una copia del gen implicada en respuesta inmune
e. La primera aplicació
aplicación será
será má
más probablemente el transplante
de isletas celulares porcinas productoras de insulina de cersos
KO (que
(que no producen insulina de cerdo)
cerdo) para tratar diabetes.
Corazó
Corazón e hí
hígado será
serán los primeros órganos transplantados
E.
Revolució
Revolución biotecnoló
biotecnológica:
gica: Humanizací
Humanizacíon de tejidos y órganos de
cerdos
1. PPL Therapeutics ha producido el primer cerdo clonado con un
gen inactivado que codifica la enzima 1,3 galactosil transferasa
(GT), que cataliza el movimiento de galactosa a la superficie de las
células del cerdo
2. El sistema inmune humano,
humano, que reconoce la galactosa en c élulas
extrañ
extrañas ataca cé
células o tejidos con el azú
azúcar,
car, causando el
rechazo de órganos
3.
Cerdos transgé
transgénicos tienen problemas como letargo,
letargo, piel má
más
gruesa,
gruesa, problemas de hígado,
gado, úlceras y artritis
El único éxito con cerdos ha sido con somatotropina de cerdo
producida en E. coli y usado para tratar cerdos
5. Xenotransplante
a. El uso de órganos animales en pacientes humanos
b. Cerdos es el ánimal elegido puesto que son fá
fácil de crecer y
cruzar,
cruzar, tiene órganos de tamañ
tamaño similar al humano y pueden ser
modificados gené
genéticamente.
ticamente.
c. Preocupaciones sobre la tecnologí
tecnología incluye aspectos éticos,
ticos, uso
de órganos animales en humanos,
humanos, y enfermededes como
retrovirus endó
endógenos porcinos (PERV), similar a HIV, que se
puede transmitir a humanos
4.
3.
4.
Cerdos con KO en los dos genes GT se está
están investigado,
investigado, junto
con cerdos enanos que con tienen PERV y son deseables para
xenotransplantes
Los receptores usados por el PERV para entrar cé
células se han
caracterizado,
caracterizado, y un mé
método de cribado se ha desarrollado para
identificar si el PERV está
está en cé
células animales,
animales, asegurando la
inocuidad del xenotransplante
4
Aves
1.
2.
3.
4.
Productos de granja como el pollo se puede mejorar disminuyendo
el contenido de grasa y colesterol de los huevos
Los huevos pueden servir como bioreatores para producir proteí
proteínas
valiosas a travé
través de conseguir que secreten proteí
proteínas valiosas
dentro del huevo
Los retrovirus son candidatos para la transfecció
transfección de embriones en
estado de blatodermos.
blatodermos. Los problemas mayores es la inestabilidad
del gen introducido y el pequeñ
pequeño tamañ
tamaño. La estructura del óvulo
hace dificil la penetració
penetración por microinyecció
microinyección
El uso de liposomas en un posible sistema de transformació
transformación de
células del blastodermo.
blastodermo. Células transformadas se insertan en
embriones del huesped debajo del espacio subgerminal para
producir un animal quimé
quiméricoL
Propagación animal
A.
Inseminació
Inseminación artificial
1. Permite animales de interé
interés gené
genético ser cruzados má
má
eficientemente,
eficientemente, permitiendo el esperma diluido de un un toro ser
inseminado entre 500 y 1000 vacas
2. Usado en ternero para incrementar la frecuencia de caracteres de
interé
interés
3. Ha incrementado la diversidad gené
genética de animales en extinció
extinción
entre zooló
zoológicos
B.
Clones animales
1. Clonació
Clonación de germoplamas vivos (lifestocks
(lifestocks)) ha sido comú
común
durante los últimos 20 añ
años
2. Las cé
células se pueden separar despué
después de fertilizar (entre
(entre 8 y 19
células),
lulas), y los embriones se pueden desarrollar como gemelos.
gemelos.
Esto se ha intentado en humanos pero producen embriones
defectivos y no se implantaron
3.
Métodos de transferencia nuclear incrementa el nú
número de
descendientes de una hembra a cientos o miles
a. La primera clonació
clonación animal con éxito fué
fué el de una oveja en
1986, pero los estudios se iniciaron en los 1950s, donde
núcleos de cé
é
lulas
en
diferentes
estados
de desarrollo se
c
transfirieron a óvulos enucleados (sin nú
núcleo)
cleo) para estudiar el
desarrollo de una rana leopardo
b. La comercializació
comercialización permite caracteres de interé
interés ser
propagados y mantenidos en organismos vivos,
vivos, para
aplicaciones en agricultura y medicina
5
4.
Electrofusión
La clonació
clonación de Dolly
a. Se realizó
realizó en 1996 en el instituto Roslyn en Escocia y fue la primera
vez que un animal fue clonado usando ccé
élulas somá
somáticas
b. El m
mé
étodo usado fue:
fue:
1) A ccé
élulas de ovulo en metafase se les eliminó
eliminó el n
nú
ú cleo
2) Una ccé
é lula mamaria de oveja en cultivo se le eliminó
eliminó los nutrientes
para que entre en el ciclo estacionario G0
3) Las dos ccé
élulas se fusionaron por choque el
elé
éctrico ((electrofusi
electrofusió
ón)
4) Las cé
células que se desarrollaron en cultivo para formar un embri
embrió
ón
se introdujeron en una madre preparada hormonalmente para
implantació
implantaci
ón
5) El embri
embrió
ón se desarrolló
desarrolló totalmente y el genotipado de DNA
confirmó
confirm
ó que Dolly era un clon
c. Dolly muri
murió
ó en 2003 de un cá
cáncer de pulmó
pulmón normalmente encontrado
en ovejas de m
má
ás edad;
edad; aná
análisis de DNA demostró
demostró que los tel
teló
ómeros
eran m
má
á s cortos de lo normal
d. La controversia permanece,
permanece, no está
está claro si Dolly fue clonada de una
célula mamaria o de una ccé
élula madre embrionaria. Se necesitaron
277 para clonar Dolly, lo que lo hace muy ineficiente
http://www.brinkmann.com/pdf/cell_fusion.pdf
Pulso de fusión
Células se ponen juntas
Fase de Heterokaryon: Producto de fusión
núcleos distintos
Fusión inducida por un pulso eléctrico
5. ¿por que armó
armó tanto revuelo?
revuelo? Porque clonar puede
producir desarrollos importantes:
importantes:
a. Se puede estudiar los efectos ambientales en
animales idé
idé nticos
b. La gené
genética de las enfermedades puede estudiarse
en má
má s detalle
c. Se puede estudiar la gené
gené tica del desarrollo en má
más
detalle
d. Animales modificados gené
gené ticamente y clonados
posteriormente pueden producir grandes cantidades
de proteí
proteínas terapé
terapé uticas humanas en la leche
6. Ratones se clonaron en 1998 usando una inyecció
inyecció n de
nú cleo en óvulos enucleados,
enucleados, y se han clonado cabras,
cabras,
conejos y gatos
6
Regulació
Regulación de animales transgé
transgénicos
A.
B.
Mucho má
más preocupació
preocupació n pú
pública de animales que de
plantas transgé
transgé ncias,
ncias, debido a su efecto potencial en el
medio ambiente,
ambiente, el riesgo a la salud de consumir
alimientos modificados gené
genéticamente
La crí
crítica tiene preocupació
preocupació n porque la FDA quiere regular
animales modificados gené
gené ticamente de la misma manera
que drogas animales,
animales, animales transgé
transgénicos pueden ser
aprovados demasiado rá
rápido y sin la revisió
revisió n del gobierno
Patente de animales modificados
gené
genéticamente
A.
B.
C.
D.
E.
En 1930 el congreso de los EEUU aprobó
aprobó el Acto de patentes,
patentes, pero
plantas no se patentaron hasta 1970. En 1987, la oficina de patentes
de EEUU declaró
declaró que organismos multicelulares no humanos que no
ocurren normalmente,
normalmente, incluyendo animales se pueden patentar
Patentes,
Patentes, trademarks, copyrights, y andtrade secrets se consideran
propiedad intelectual y hay un gran debate por desarrollos en
biotecnologí
biotecnología en los últimos 15 añ
años.
os. Mucho debate se ha generado
en patentes animales
Se incluye interrogantes sobre posibles consecuencias de los usos
comerciales de organismos patentados,
patentados, incluyendo implicaciones
medioambientales,
medioambientales, la salud del animal modificado y efectos
potenciales del proceso evolutivo
Agricultores está
están preocupados de patentes animales,
animales, puesto que
animales patentados pueden generar un menor nú
número de granjas y
más potentes y pequeñ
pequeños granjeros no pueden tener la nueva
tecnologí
í
a
o
animales
tecnolog
Discusió
Discusiónes abiertas sobre aspectos éticos,
ticos, sociales,
sociales, y legales osn
importatnes para asegura el progreso adecuado de la biotecnologí
biotecnología
7