LIQUIDO SEMINAL

Análisis básico del
semen
Rosa Pello Gutiérrez
Elisa Ramírez Mendoza
Hospital 12 de Octubre
¿Que es Liq. Seminal ?
„
Espermatozoides
„
Suspendidos en secreciones:
„
„
„
Se junta con secreciones:
„
„
„
„
testículo
y el epidídimo.
Próstata,
vesículas seminal
y las glándulas bulbouretrales
Dando lugar a un liquido viscoso
denominado eyaculado
Hospital 12 de Octubre
„
Los parámetros analizados en el semen reflejan :
„
„
la función exocrina de las glándulas sexuales masculinas
y nos orientan sobre patologías del sistema genital.
„Al
sufrir una transformación desde el momento de la eyacualción,
para su estudio correcto:
„Debemos
tratar la muestra con unas condiciones adecuadas
„y estandarizadas para evitar sesgos artificiales.
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„Gran
variabilidad biológica:
„2 muestras de semen que difieran
entre 1 y 3 semanas.
„Si los resultados discrepan seria
necesario una 3º muestra.
„Por
ser un fluido biológico (sangre, LCR), debe ser tratado con
precaución en el laboratorio, para evitar posibles
contaminaciones (VIH, Hepatitis..)
Hospital 12 de Octubre
Obtención de la muestra
„
„
„
„
„
„
Por masturbación el mismo día del examen
Frasco de vidrio o de plástico atemperado 20- 40 ºC, de boca
amplia
Sólo una eyaculación
Se recomienda: abstinencia de 3-7 días.
„ Maximizar la calidad de la muestra.
„ Y reducir la variabilidad
Lo ideal: recoger la muestra en un cuarto cerca del laboratorio.
„ Evitar choque térmico (20 - 40 ºC).
„ Entregarlo lo antes posible (1h).
Hacer hincapié:
„ Evitar la perdida.
„ Lavarse bien las manos y genitales antes.
„ No utilizar preservativo ni el coitus interruptus.
„ Usar frascos estériles.
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Formulario para el paciente
„
Nombre.
„
Periodo de abstinencia.
„
Fecha y hora de recolección.
„
„
Si toma medicación:
„ Deberá hacerse hincapié en que informen de si toman
fármacos, enfermedades concomitantes (fiebre), ejercicio
físico intenso y situaciones de estrés.
Si fuma, o si tiene hábitos tóxicos y tiempo de abstinencia.
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La OMS divide el estudio del
semen
„ Examen
„
„
„
„
„
„
„
básico
1.Examen macroscópico: licuefacción, aspecto, volumen,
viscosidad, pH.
Concentración de esp. y otras células.
Motilidad
Estudio microscópico
Vitalidad.
Morfología espermática.
Presencia de aglutinaciones.
Detección de anticuerpos antiespermatozoide unidos a la
superficie esp.
„ Opcional
„ Avanzados
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„
Opcional
„
„
„
„
„
„
Índice de teratosrpermia.
Test hipoosmótico.
Cultivos seminales.
Análisis bioquímico de Líquido Seminal.
Análisis automático de la movilidad espermática.
Test del Hámster.
„Avanzados
„Test
de función espermática:
„Especies reactivas de oxígeno.
„Test de la zona pelúcida.
„Evaluación de la reacción acrosómica.
„Análisis automático de la morfología espermática.
„Técnicas de recuperación de espermatozoides móviles:
„Swim-up.
„Gradientes de densidad.
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1.Examen macroscópico
„
Licuefacción:
„
„
„
„
„
Se licua a temperatura ambiente (15-60 min).
Al recibirla: incubar a 37ºC durante 20-25 min.(1h)
Y agitar (no vortex)
Determinamos si esta licuado.
37ºC
Si sigue sin estar licuada:
„ Observar: grumos, hebras, coágulos.
„ Liquido anormal.
„ Sin importancia clínica, interfiere en el análisis del semen.
„ Utilizar; digestión enzimático, tampón fosfato 1:1, medio de
cultivo.
„ Referir los resultados a volumen inicial.
„ Y si es para TRA, medio estéril, y no usar digestión enzimático.
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1.Examen macroscópico
„
Aspecto:
„
Observaremos después de la licuefacción.
„
Color normal: nacarado o gris opalescente.
„
„
37ºC
Color rojizo o marrón (hematíes).
Color amarillento (ictericia, alta vitamina B2) o alta nivel de
flavoproteínas oxidadas de vesículas germinales (elevada
abstinencia).
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1.Examen macroscópico
„
Volumen:
„
„
„
„
„
Para medirlo:
„ Tubo graduado de 15 ml, cónico, tipo Falcon, con tapa
hermética,
„ testado para tóxicos celulares.
Volumen referencia: > 2ml
V < 2ml: hipospermia u oligospermia.
Cuando existe orgasmo y no eyaculación tras la masturbación
nos encontramos ante una aspermia (ausencia de eyaculado)
Aspermia sospecharemos de una eyaculación retrógrada.
Hospital 12 de Octubre
„
Protocolo para el estudio de los espermatozoides
de los pacientes con eyaculacion retrógrada
„
„
„
La OMS no tiene recomendaciones.
Noche anterior a la recogida de la muestra: ingerir una cucharada
sopera de bicarbonato sódico
„ Con ello alcalinizamos la orina
„ y evitamos al máximo el daño de los espermatozoides
„ Pues muchas veces estos son utilizados para TRA.
El día de la recogida:
„ Orina, mide osmolaridad y pH.
„ Seguidamente se toma 4 gramos o 2 cucharadas soperas de
bicarbonato sódico, y agua ½ litro, 750 ml diabéticos.
„ Se espera, recoge orina: osmolaridad de 350-400 miliosmol/Kg y
pH 7.2-8.
„ Entonces se recoge orina postorgasmo en frasco con medio de
cultivo.
„ Hacemos alícuotas, centrifugo 600g, 8 minutos y procedimiento
habitual.
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1.Examen macroscópico
„
Viscosidad
„
„
„
„
„
Diferenciarlo licuefacción
Cogeremos una pipeta Pasteur con semen y dejaremos
caer su contenido
Valor de referencia: gotas,
„ o se forme un filamento < 2cm.
Si fuera mayor, anotaremos viscosidad anormal.
Y lo trataremos: añadiendo medio tampón
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1.Examen macroscópico
„
pH
„
„
„
„
„
„
Utilizando tiras reactivas de rango 6.4-8.0
1 gota de semen en la tira y 30 seg.
Comparamos color con la escala de colores
Valor de referencia: pH > 7.2
pH: ác
„ infección
pH <7.2 + azoospermia,
„ sugiere obstrucción de conductos
eyaculadores o agenesia bilateral
de deferentes
Hospital 12 de Octubre
2.Motilidad espermática
„
„
Tipos de motilidad:
„ Tipo a: movilidad rápida y progresiva, > 25 micrometros/seg a
37ºC, 5 veces la cabeza en 1 segundo.
„ Tipo b: movilidad progresiva lenta o perezosa
„ Tipo c: movilidad no progresiva, < 5 micrometros/seg, 1 vez la
cabeza por segundo
„ Tipo d: inmóvil
Valor de referencia (60 minutos):
„
„
„
> 50% de los espermatozoides con movimiento tipo a + b.
Ó >25 % con movilidad tipo a.
< 50% Astenozoospermia
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2.Motilidad espermática
„
„
„
„
„
„
„
10 microlitros
Porta atemperado 37ºC
Se deja estabilizar unos 60 seg.
Tipo a: 3%
Tipo b: 32%
Tipo c: 5%
Tipo d: 60%
Observamos a 100 aumentos
„ muestra homogénea.
A continuación pasamos a 400 X con contraste de fase.
„ Contamos, 1º los móviles tipo a y b,
„ y a continuación los c y d.
Se contaran 200 esp. en un porta, con contador de laboratorio.
Repetimos con otro porta.
Tipo a: 20%
Tipo b: 40%
Tipo c: 5%
Tipo d: 35%
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2.Motilidad espermática
„
Valoraremos si la diferencia entre los contajes esta dentro
del 95% de i.c. de error debido al azar.
Tipo a: 3 y 20%
Tipo b: 32 y 40%
Tipo c: 5 y 5%
Tipo d: 60 y 35%
M: 47.5%
D:25%
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2.Motilidad espermática
„
„
„
En el momento de la valoración, pueden surgir inconvenientes:
„ Las colas sueltas no se cuentan.
„ Puede a ver aglutinaciones.
„ La muestra este muy concentrada.
„ En muestras muy viscosas pueden producirse falsas
astenozoospermias…
De todos modos, lo conveniente es q los miembros del equipo que
se van a dedicar al contaje, se entrenen a través de videos para
poder realizar un control de calidad.
Método alternativo:
„
ASAC, CASA: incluye el análisis de espermatozoides asistido por
computadora
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3.Vitalidad espermática
„
Nos permite evaluar los espermatozoides vivos.
Según la OMS se estudiaría cuando la < 50% movilidad
„
Se hace de manera indirecta, estudiando el estado de la mmb.
„
„
„
„
Los vivos tiene la mmb plasmática intacta
„ y los muertos dañada.
Tinción supravitales, eosina –negrosina.
y los basados en la capacidad
osmorreguladora de la membrana:
„ Solución hipoosmótica, 37ºC, 5min.
„
Valor de referencia > 60% hinchados
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4.Aglutinaciones y agregaciones
„
Aglutinación: visualización de espermatozoides móviles unidos por las
cabezas, colas, cabeza-cola.
„ Agregación: unión de esp. a espermatozoides inmóviles, generalmente
muertos, a otras cél, a restos, fibras mucosas.
„
„
„
Se valora a la vez que la movilidad
Se anota en el seminogramas con una escala semicuantitativa:
„ No aglutinación (-), pequeñas aglutinaciones pueden ser normales (< 10%)
„ Totalidad (+++)
La presencia de aglutinaciones:
„ sugiere presencia de anticuerpos,
„ causa inmunológica de infertilidad,
„ infección,
„ aparece con + frecuencia en eyaculados
hiperconcentrados.
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5.Morfología espermática
„
„
„
„
„
„
Técnica de tinción recomienda: Papanicolau, Shorr, Diff-Quick.
„ Cabeza: azul
„ Pieza intermedia: rojiza
„ Cola: azul o rojiza
Deben de evaluarse 200 espermatozoides.
2 extensiones.
Observar con objetivo de inmersión.
Sólo se cuentan los espermatozoides completos.
y valorar la diferencia de los porcentajes y este debe de estar
dentro del 95% de i.c. de error debido a azar.
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Criterios de la OMS 1999
Cabeza
Pieza intermedia
Forma
Ovalada
Acrosoma
Bien definido, ocupé
40-70% de la cabeza
Longitud
4-5micras
Anchura
2.5-3.5 micras
Longitud
1.5 * L cabeza
Anchura
< 1 micra
Forma
Delgada unida
axialmente a la cabeza
Flagelo
Recto, uniforme, + delgada P intermedia.
Desenrollado. 45 micras
Restos citoplasmáticos
en la pieza intermedia
< 1/2 cabeza
Valores limitantes
Se consideran anormales
% de normalidad
> 15% para FIV
Morfología anómala.
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6.Concentración espermática
„
Valor de referencia: > 20 millones /ml.
„
Para medir la concentración espermática la OMS recomienda:
Contaje
400x
Dilución
Semen,
microL
Diluyente
microL
<15
1:5
100
400
15-40
1:10
50
450
40-200
1:20
50
950
>200
1:50
50
2450
Diluyente es una solución fijadora: solución salina + formalina
„Si
hay menos de 2 *campo, centrifugo 3000g, 15 minutos.
„y anotaremos < 2 millones*campo, y si son móviles, o no.
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6.Concentración espermática
„
Hemocitómetro: cámara de NEUBAUER Improved.
„
„
„
„
Makler, Microcell.
M de contraste de fases (200 a 400x)
Solo espermatozoides completos.
Se debe de realizar por duplicado
< 10 esp * cuadro grande: contamos 25 cuadros
10-40 esp: contamos 10 cuadros
> 40 esp: 5 cuadros
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„
Si contamos:
„230 espermatozoides
„Dilución 1:20
„Hemos contado 10 cuadros
„Para
determinar la concentración en millones /ml.
Factores de conversión
Nº de cuadrados grandes contados
Dilución
25
10
5
1:5
20
8
4
1:10
10
4
2
1:20
5
2
1
1:50
2
0.8
0.4
Hospital 12 de Octubre
„
230/2= 115 millones/ml.
7.Cel redondas
„
Cél epiteliales, las de la espermatogénesis y leucocitos.
„
Valor normal < 5 millones/ml
„
La concentración de estas células se puede medir directamente a
partir de la siguiente fórmula
„C
= (N x S)/100
„N = 10 células inmaduras 100 espermatozoides contados
„S = 20 millones de espermatozoides/ml
„C = (10 x 20) /100 =2 millones de células/ml
Hospital 12 de Octubre
„
↑ leucos, son indicativos de infección (cultivo), y mala calidad
espermática.
„
„
No debería exceder 1 millón/ ml.
Las técnicas para la detección esta basada en la presencia:
„
„
„
de la peroxidasa intracelular
de antígenos específicos de leucocitos
↑ células inmaduras, desordenes de la espermatogénesis:
„Hipoespermatogénesis,
varicocele, alteración de las células
de Sertoli.
„Para diferenciarlas de los leucos tinción Bryan-Leishman,
diferente morfología, y ausencia de peroxidasa.
„Asocia ↓éxito FIV.
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Resumiendo
Normalidad
Anomalía
Volumen
> 2ml
Aspermia:ausencia de
eyaculado
Hipospermia <2ml
Viscosidad
< 2cm
Licuefacción
Completa
pH
> 7.2
Concentración esp
> 20 millones esp/ml
Nº esp eyaculados
> 40millones esp
Movilidad
> 50% tipo a+b
Astenozoosspermia
Morfología
< 15% anormales FIV
Teratozoospermia
Vitalidad
> 75% de formas no
teñidas
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Estudio de post-vasectomías
„
„
„
„
Solo determinaremos el volumen, pH <7, recuento.
Según la Sociedad Británica de Andrología:
„ Pasado 3-4 meses
„ Y 24 eyaculaciones
La OMS requiere un examen exhaustivo de todo el sedimento
„ obtenido por centrifugación durante 15 min a 800g, para
clasificar a un paciente de azoospérmico.
Debido a que la imprecisión de la cámara es alta.
„ No debe indicarse “ 0 espermatozoides”
„ Mejor “no se observan espermatozoides”
„ Dilución 1:1, Nebubauer Improved, afirmar 95% seguridad
„ Que tiene < 30.000 espermatozoides / mL
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„
„
„
Técnicas de recuperación
espermática
1.SWIM-UP
Técnica de selección que se basa en la capacidad de los espermatozoides
con movilidad progresiva para desplazarse en un medio de cultivo adecuado
Se recuperan menos pero más móviles
Echamos medio
de cultivo
Echamos medio
de cultivo 1:1
lavamos
Centrifugación
10 min, 500g
Elimino
sobrenadante
botón
Recupero el
sobrenadante
Lo dejamos a 37ºC
Desde 30- 90 min
REM
Se hace recuento
espermático
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Técnicas de recuperación
espermática
„
„
2. Gradientes de densidad
Selección de los mejores que pueden vencer los gradientes y llegar al
fondo del tubo.
„ Gradientes discontinuos, disminuyen a saltos.
„ 3 capas (45/ 70/ 90), 2 capas (45/ 90)
„ Volumen de la capa es variable: 0.3/ 0.5/ 1.0 mL.
„ Centrifugamos 5 min, 300-600g, recogemos el botón del fondo.
„
Lavamos, centrifuga 5min, 300-600g.
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8.Anticuerpos antiespermatozoides
(AAE)
•
•
•
•
•
Ensayo obligado en cualquier seminograma básico
Presentes hasta en el 40% de los casos de infertilidad
inexplicada
Origen femenino o masculino
Barrera inmunológica : producción de Ac al entrar en
contacto con el sistema inmune
Causas masculinas:
•
•
•
trauma (vasectomía…)
reacciones inflamatorias
criptorquidia...
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•
Efectos:
•
•
•
•
Tipos:
•
•
•
Aglutinación
Efecto citotóxico
Dificultad de paso a través del moco cervical y la unión y
penetración de la zona pelúcida
Ig G: por trasudación desde la sangre
Ig A: producidas por las células inmunológicas afincadas en el
tracto genital
Pruebas para la detección de AAE adheridos a la
membrana espermática:
• •IBT
IBT
• •MAR
MAR
-Identificar presencia de AAE
-Caracterizar los isotipos
-Cuantificar la respuesta inmune
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™ MAR:
™ IBT:
•Partículas
de látex
•Empleo de semen
completo
•Matriz
de poliacrilamida
•Lavado previo del semen
- Normalmente no existen IgA, si no existe Ig G: como screening
es suficiente la prueba de la IgG como screening.
™
Cálculos y resultados:
•
Contar al menos 200 espermatozoides móviles
Resultado expresado en % de espermatozoides móviles que
•
Cuando > 50% se considera que existe factor inmunológico
•
llevan partículas unidas
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Parámetros bioquímicos:
interpretación práctica
Semen: suspensión de células reproductivas en un
líquido complejo llamado plasma seminal
Los componentes del plasma
seminal se mezclan durante la
eyaculación y son el resultado
de la secreción de diferentes
glándulas exocrinas.
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™
Próstata:
Próstata
•
•
•
•
•
ubicación: debajo de la vejiga urinaria
produce una secreción opaca blanquecina
pH ácido (pH: 6.2-6.8)
30% del volumen total
Secreciones:
•
•
•
•
•
•
Ác. cítrico
fosfatasa ácida
Espermina
Albúmina
Zn…
Función:
•
•
Liquefacción
Movilidad espermática
Hospital 12 de Octubre
™
Vesículas seminales:
•
•
•
•
•
Situación: detrás de la próstata
Secreción opalescente viscosa ligeramente
amarillenta
60% del volumen total
pH alcalino
Secreciones:
•
•
•
•
•
•
Fructosa
PG
Lactoferrina
Bicarbonato
Fibrinógeno
Función:
•
•
Producción de ATP
Motilidad y viabilidad
Hospital 12 de Octubre
™
Epidídimos:
dimos
•
•
•
Lleva espermatozoides de los testículos a los vasos
deferentes
Mide 3.8 cm de longitud
Dividido en:
•
•
•
•
Secreción:
•
•
•
•
•
Cabeza
Cuerpo
Cola
Alfa glucosidasa
Carnitina
Función: Maduración de los espermatozoides.
Tránsito: 10 – 14 días
Almacenamiento: 1 mes
Hospital 12 de Octubre
Cambios del espermatozoide en el epidídimo:
•
•
•
•
•
•
Disminución de la gota citoplasmática
en la pieza intermedia
Cambios eléctricos en la superficie de
membrana
Aumento del contenido de AMPc
Modificación de la forma del acrosoma
Adquisición de proteínas de superficie
Estabilización de la cromatina nuclear
Hospital 12 de Octubre
™
Glándula de Littré:
•
•
™
Localización: mucosa uretral posterior
Producción de un líquido mucoso
Glándulas de Cowper:
•
•
•
Localización: debajo de la próstata
Secreción alcalina
Secreciones:
•
•
•
•
Mucoproteinas
Galactosa
Ác. oxálico
Funciones:
•
•
Limpia la uretra
Lubrica la mucosa uretral
Hospital 12 de Octubre
Distribución de los marcadores bioquímicos del plasma
seminal en eyaculación fraccionada
-Primera fracción:
-Segunda fracción:
- Vesículas seminales
-Prostática
-Epidídimos
-Espermatozoides
Hospital 12 de Octubre
•
A pesar de la gran cantidad de sustancias presentes,
ninguna aporta mayor información que el análisis
directo del número y características funcionales del
espermatozoide
•
Algunos parámetros bioquímicos representativos de la
función de las principales glándulas son suficientes
para diagnosticar los principales síndromes asociados
a la infertilidad masculina
•
OMS: Zn, fructosa, α- glucosidasa
•
Medición del pH y del volumen seminal
Hospital 12 de Octubre
•Función de las vesículas seminales:
-Fructosa
-Fructosa corregida
•Función de la próstata:
-Ácido cítrico
-Zinc
-Fosfatasa ácida
•Función del epidídimo:
-Alfa glucosidasa
Sustancia
Lugar de producción
Valor de referencia
Zn
Próstata
> 2.4 µmol/eyaculado
Citrato
Próstata
> 52 µmol/eyaculado
Fosfatasa ácida
Próstata
> 200 U/eyaculado
Fructosa
Vesículas seminales
> 13 µmol/eyaculado
α-glucosidasa
Epidídimo
> 20 mU/eyaculado
Hospital 12 de Octubre
Marcadores bioquímicos de la
maduración espermática
Maduración: cambios bioquímicos producidos en la
espermiogénesis y en la migración de los túbulos
seminíferos al epidídimo:
•
remodelado de la membrana: motilidad
•
desarrollo de la reacción acrosómica
•
remodelado nuclear
•
cambios funcionales fuera del testículo: capacitación
Hospital 12 de Octubre
™
Maduración testicular:
•
•
ROS : producción de radicales libres de oxígeno
Cociente de isoformas de CK :
CK-MM
CK-BB + CK-MM
•
™
Contenido de DHA : disminuye según avanza la
maduración
Capacitación:
•
•
•
•
•
•
salida de colesterol de la membrana
entrada de Ca
⊕ adenil-ciclasa
↑ AMPc
⊕ proteinkinasa A
fosforilación de Tyr en proteínas flagelares
Hospital 12 de Octubre
•
Hiperactivación espermática :
⊕ Adenil ciclasa
↑ AMPc
Fosforilación Tyr
Cambios en el patrón
de motilidad:
VSL ⇒ VCL y ↑ AHL
Test positivo si ≥ 30% espermatozoides:
- VCL > 150 µm/sg y/o
- ALH ≥ 6 µm
•
•
•
Fosforilación de Tyr
Contenido G 6P
Contenido NADPH
Hospital 12 de Octubre
Control de calidad en el estudio
espermático
•
•
Control de calidad: conjunto de procesos dirigidos a
asegurar la fiabilidad técnica
Tipos de pruebas:
•
•
•
Diagnóstica: concentración, movilidad, morfología…
Terapéutica: técnicas de recuperación para FIV…
Control de calidad:
•
•
Analítico: detectar y minimizar los errores de medida
Biológico: asegurar la viabilidad de los espermatozoides
Hospital 12 de Octubre
™
CC analítico interno:
- Distribución aleatoria
de los espermatozoides
Imprecisión
- Error de contaje:
Uso de ↓ nº de espermatozoides
representativos
Cansancio del técnico,
Inexactitud
materiales en condiciones no idoneas...
- CC interno: minimizar al máximo la imprecisión
Hospital 12 de Octubre
™
1-5% de las muestras trabajadas → CC interno:
- Nivel intra-individual: realizar todas las muestras por
duplicado. Si la diferencia es mayor que el error de contaje
establecido, rechazar la medición.
- Nivel del observador: instruir al nuevo personal realizando
mediciones en paralelo hasta que no existan desviaciones
sistemáticas
- Seguimiento continuo de los resultados mediante el
procesamiento de especímenes conocidos:
• material de control
• muestras de pacientes
• vídeos…
Diario: ensayo por duplicado
Semanal: análisis por diferentes técnicos
Cuatrimestral: CC externo y calibración de pipetas
Anual: calibración de cámaras de contaje…
Hospital 12 de Octubre
1er contaje: 15
2º contaje: 30
total: 45
1er contaje: 20
2º contaje: 25
Hospital 12 de Octubre
total: 45
™
CC externo:
•
•
•
CC interno y externo complementarios
Analizar las muestras de CC externo como si
fueran muestras de rutina
Muestras que abarquen la totalidad del rango
clínico
-
concentración: 3-30 mill/mL
movilidad: 10-40%
morfología: < 20% de formas normales
•
Muestras procedentes de varones seronegativos
para VIH y hepatitis
•
1999: primer programa de calidad externo
Hospital 12 de Octubre
™
CC biológico:
•
•
Asegura la viabilidad de los espermatozoides que se
usarán en FIV…
CCB interno: aseguran el adecuado funcionamiento
e inocuidad de los aparatos y materiales:
•
•
•
•
•
Tª: estufas, incubadores…
[CO2]
Humedad
Toxicidad de medios de cultivo, pipetas…: test de
supervivencia espermática o test de los embriones de
ratón
CCB externo: evalúan la capacidad del laboratorio
para detectar materiales y medios tóxicos para el
espermatozoide
Hospital 12 de Octubre
Muchas gracias por
escucharnos.
Hospital 12 de Octubre