Curso Teórico-Práctico Básico de Citometría de Flujo

Transcripción

Curso Teórico-Práctico
Básico de Citometría de
Flujo:
Introducción teórica a la
citometria de flujo.
Qué es la Citometría de flujo?
La citometría es una técnica que permite medir
simultáneamente múltiples características
físicas y químicas de células o partículas en
suspensión que atraviesan un haz de luz
(laser), y ofrece la posibilidad de separar las
células (sorting) en función de sus
características.
Historia de la citometría de flujo
Fulwyler, describe el
proceso de separación
electrostática.
1930
1940
1934
Moldavan, Primer
contador celular
automatizado.
1950
1947
Gucker,
Citómetro
de flujo para
detectar
bacterias en
aerosoles.
1960
1953
Crosland-Taylor,
diseñó la cámara
de flujo. Aplica el
principio de
Reynolds (1883)
al flujo laminar.
1965
1970
1969
Van Dilla, primer
citómetro de flujo a
partir de la cámara
de flujo con ejes
ortogonales, en el
National Laboratory
de Los Alamos.
Historia de la citometría de flujo
• 1970 Se construyen los primeros citómetros de flujo.
• 1980- Actualidad se han producido muchos adelantos en
las aplicaciones de la citometría de flujo en el campo de la
investigación clínica-biológica, sobretodo a partir del
desarrollo de los anticuerpos.
Componentes de un citómetro de
flujo
Fluídica
• Flujo laminar (sistema presurizado).
• Cámara
Óptica
Electrónica
Informática
de flujo (enfoque hidrodinámico).
Fluídica (I)
Cámara de
flujo
LASER
Tanque Líquido
de arrastre
(SHEATH)
Tanque de Deshechos
(WASTE)
Muestra
(suspensión celular)
Fluídica (II)
Flujo laminar
Flujo turbulento
Fluídica (III)
La cámara de flujo:

determina las características del
flujo

permite el ENFOQUE
Cámara de
Flujo
Líquido de
arrastre
HIDRODINÁMICO

se produce la intercepción entre el
láser y la muestra, PUNTO DE
INTERROGACIÓN
LASER
Células
Muestra
Fluídica (IV)
 Enfoque hidrodinámico permite el paso
individualizado de las células a través de la cámara
de flujo.
 La disminución de la presión y el aumento de la
velocidad en el centro del flujo provoca la focalización
(Bernoulli, 1738).
Fluídica (V)
• La velocidad del líquido de arrastre viene determinada
por la presión a la que está sometido, no modificable en
la mayoría de citómetros analizadores.
• La diferencia de presiones entre el líquido de arrastre y
la muestra, determina la velocidad del paso de células
por la cámara de flujo (low/med/high).
flujo
Fluídica
• Cámara
Óptica
• LASER
(Light Amplification by Stimulated
Emission of Radiation).
• Luz
Electrónica
Informática
dispersada y fluorescencia.
• Sistema
de filtros para la recolección de la señal.
Óptica (I)
Velocidad de muestra baja
Velocidad de muestra alta
Haz del
laser
Intensidad de luz
Muestra
Líquido de
arrastre
Máxima iluminación
CV bajos
Iluminación variable
CV altos
Óptica (II)
· Cada célula (evento) que atraviesa la fuente de luz (láser) genera
una señal (dispersión de la luz, fluorescencia) que es recogida por
espejos y filtros ópticos.
· La especificidad de la detección está controlada por la selección de
longitudes de onda por parte de espejos y filtros ópticos.
Óptica (III)
· Los filtros ópticos absorben o reflejan determinadas
longitudes de onda.
· Tipos de filtros:
 Paso largo (Long Pass)
 Paso corto (Short Pass)
 Paso de banda (Band Pass)
 Espejos Dicroicos
 Neutros
Óptica (IV)
Combinando los distintos filtros podemos detectar los distintos
fluorocromos que presente la muestra simultáneamente.
Qué información da un citómetro
de flujo sobre una célula
1. Tamaño celular (Forward Scatter,
FSC).
2.Complejidad o granulosidad celular
(Side Scatter, SSC).
3.Fluorescencia (FL).
1. Tamaño celular (FSC).
(SSC).
1. Tamaño celular (FSC)
Difracción. Recogida entre 0.5 y 2 º. Proporcional al tamaño celular.
Refracción. Entre 2-15º. Información sobre la estructura celular
externa. Depende del índice de refracción entre el medio y las
células. Disminuye en las células muertas.
LASER
www.the-aps.org/education/lot/cell/cell.JPG
1. Tamaño celular (Forward Scatter,
FSC).
2. Complejidad o granulosidad celular
(SSC).
3. Fluorescencia (FL).
2. Complejidad o granulosidad
celular (SSC)
Luz dispersada lateralmente, a 90º .
Nos informa sobre la estructura
celular interna.
LASER
www.the-aps.org/education/lot/cell/cell.JPG
2. Complejidad o granulosidad
celular (SSC)
1. Tamaño celular (FSC).
(SSC).
· El fluorocromo absorbe la
energía del láser, vibra y emite
fotones de una longitud de
onda mayor que la del láser.
Muestra
· La fluorescencia emitida por
cada fluorocromo o colorante
debida a la excitación del láser es
dispersada a 90º.
Fuente de luz
Líquido de
arrastre
SSC
Fluorescencia
FSC
La especificidad de la detección está controlada por la
selección de las longitudes de onda mediante espejos y filtros
ópticos.
PE FL
FITC FL
488nm SSC
Filtros de paso de
banda
Espejos
dicroics
Lente confocal
Detector del
FSC
Las células negativas también son detectadas.
PE FL
FITC FL
Espejos
Dicroicos
488nm SSC
Detector
del FSC
Lente
Confocal
EXITACIÓN
EMISIÓN
Fluoresceína (FITC)
Ficoeritrina (PE)
Ficoeritrina-Cianina5 (PECy5)
Peridinín-clorofil·la (PerCP)
519 nm
578 nm
670 nm
675 nm
633 nm
Aloficocianina (APC)
Aloficocianina H7 (APC-H7)
Aloficocianina-Cianina7 (APC-Cy7)
660 nm
785 nm
767 nm
405 nm
Alexa405
Alexa430
Pacific Blue
421 nm
540 nm
455 nm
Hoechst33342
DAPI
Indo1
460 nm
461 nm
401 nm
488 nm
365 nm
Intensdad relativa
400 nm
500 nm 600 nm 700 nm
Excitation
Emission
Fluoresceína (FITC)
Intensidad relativa
400 nm
500 nm
600 nm 700 nm
Excitation
Emission
Ficoeritrina (PE)
Compensación
Exempl
e
Intensidad Relativa
W
FL2
FL1
FITC
PE
W
H
H
488
Longitud de onda
505-520
570-590
Ejemplo
Solamente deberíamos
detectar fluorescencia en
el canal del FITC (FL1).
FL2-%FITC(FL1)
Seleccionamos la
población de interés
Una vez compensada
solamente tenemos
fluorescencia en el detector
que nos interesa.
Cómo compensamos?
• Para compensar lo que hacemos es restar señal de un
detector a otro.
• Se necesitan controles positivos con una sola fluorescencia
conocida.
• Los equipos analógicos restan la señal antes de procesarla
y por lo tanto, no se puede recuperar.
• Los equipos digitales procesan la señal entera y después
aplican matrices.
%FL2 compensación= Median FL2pos-Median FL2neg x 100
Median FL1pos-Median FL1neg
Comprovación de la compensación
Qué fluorocromos escogemos y porqué?
Fluorocromos más brillantes para los marcajes “dim” EVITANDO el
solapamiento de los espectros con la población brillante!
Com se define y se mide el brillo de un fluorocromo?
Por su capacidad de discriminar Células DIM de les Negativas así como
las Células Negativas del Background.
Esta capacidad está influenciada por el CV, el ruido electrónico,
backgound, autofluorescencia celular….
Por lo tanto, una medida de Sensibilidad de resolución de un fluorocromo
es el ÍNDICE DE TINCIÓN.
Índex de Tinció (Stain Index)
Es una medida del brillo
D= Distancia de la población
positiva de la negativa
W= Anchura de la población
negativa
1. Interesan fluorocromos con elevados Índices de Tinción.
2. Interesa MINIMIZAR las compensaciones.
Ejemplo: Estudiamos la expresión de CD62L (débil) en la población CD8
(alta).
CD8 FITC/CD62L PE
• El FITC tiene un elevado grado de solapamiento con el PE.
• Compromete la resolución en el canal del PE.
• Menor Sensibilidad de resolución en la población problema
(CD62L).
1. Escoger otro fluorocromo para el CD8 con menos solapamiento en
PE (ex. PerCP-Cy5.5 ó APC).
2. Escoger otro fluorocromo para el CD62L igual de brillante, que
no se solape con el FITC (ex. APC)
Tándems
• 2 fluorocromos unidos
químicamente:
PE-Cy5
PE-Cy7
APC-Cy5
APC-Cy7
PerCP-Cy5.5...
Inconvenientes:
• Pueden degradarse a consecuencia de: luz, fijación, elevadas
temperaturas…
• Emitiendo en el detector del fluorocromo parental:
Ej. APC-Cy7 al degradarse emitirá en APC y PE-Cy7 en PE dando
Falsos positivos
Tándems
Prevención:
Alternativa: APC-H7
• Minimizar la exposición a la
luz, calor y evitar fijaciones con
formaldehído.
• Más estable a la luz y
temperatura.
• Si no se pueden evitar las
fijaciones: usar soluciones
estabilizantes.
• Más estable a la fijación con
formaldehído.
• Bajo solapamiento en otros
detectores.
Controles Isotípicos:
• Tenemos en cuenta la tinción inespecífica de un anticuerpo con
un ISOTIP determinado conjugado a un fluorocromo en concreto.
Ex. Mouse IgG1 FITC
• Distintos isotipos presentan distinto background:
FMO: “Fluorescence Minus One”
• Los controles FMO contienen todos los anticuerpos de la muestra menos
1.
• El detector en el cual no hay anticuerpo es el que el FMO proporciona el
control negativo:
Ejemplo.
CD3 CD4 CD8 CD25 CD127 CD45.
El FMO para situar la región de positividad para el CD25 sería:
– CD3 CD4 CD8 --- CD127 CD45
FMO: “Fluorescence Minus One”
Ejemplo: CD3 FITC / CD4 PE / CD8 PE-Cy5 / CD45RO PE-Cy7.
Control Isotípic
FMO
Tots Ac
Ejemplo. CD4 FITC / IL-2 PE
¿Dónde situamos el cuadrante de positividad para la IL2 PE?
Dades procedents Joseph Trotter,
Cytometry Part A 69A:1037–1042 (2006)
Otros aspectos a considerar:
• Unión inespecífica:
ex. PE-Cy5 se pueden unir inespecíficamente a las Fc expresadas en
limfocitos B, monocitos y células dendríticas.
Solución:
- Célulasde Rata o Ratón: usar bloqueo de FC comerciales.
- Células humanas: Cocktails de IgGs, suero humano.
- Usar otros tándems de baja o nula afinidad por los receptores Fc: PETexasRed y PE-Cy7.
• Efecto del tamaño del fluorocromo en marcajes intracelulares: No
influye! Recomendación usar fluorpcromos brillantes.
Creación de paneles multicolor
1. Seleccionar los florocromos de acuerdo al instrumento que vamos a usar.
2. Adecuar el brillo de los florocromos al nivel de expresión del antigeno.
• Florocromos Brillantes - Antígenos poco expresados
• Florocromos débiles - Antígenos muy expresados
3. Minimizar el solapamiento de espectros de emisión en marcadores que se
expresan en la misma célula.
4. Evitar combinaciones que generen falsos positivos en caso de degradación
del florocromo.
5. Intentar, dentro de lo posible, usar florocromos excitados por el LASER rojo
en antígenos que se expresen en células con alta autoflorescencia.
IV Fórum de usuarios FACS
flujo
Fluídica
Óptica
• Cámara
• LASER
.
• Luz
• Sistema
Electrónica
• Amplificación
• Conversión
Informática
mediante PMTs.
a valores digitales.
Electrónica (I)
La fluorescencia generada por cada célula es recogida por diversos
detectores fotomultiplicadores de la señal (PMTs).
PMTs convierten la señal luminosa recibida en pulsos eléctricos.
Intensidad
LASER
Tiempo
Electrónica (II)
De cada señal podemos obtener la altura, anchura y área.
Intensidad
Tiempo
Altura Pulso
(H)
Anchura Pulso
(W)
Área Pulso
(A)
Electrónica (III)
1 Células en fase G2/M (4n)
2 Células en fase G1 (2n)
FL3-W
LASER
LASER
FL3-A
Electrónica (IV)
Estas señales eléctricas son amplificadas y digitalizadas
mediante los ADCs (Analog to Digital Converters).
A cada señal de fluorescencia generada por cada evento se le
asigna un canal de intensidad de fluorescencia, en función
de la señal detectada por los PMTs, en un histograma de 1 o 2
parámetros.
Cada evento está correlacionado de manera individual con
todos los parámetros analizados (FSC, SSC, y
fluorescencias).
Electrónica (V)
Células
apoptóticas
SSC
Células
grandes
Célules
vivas
Eje Y
Eje X
Células
muertas
FSC
Electrónica (VI)
Número de células
• Histograma uniparamétrico.
Negativas
Positivas
6
4
1
150 160 170 .. 190
1 2 3 4 6 7
Canal de fluorescencia
Intensidad de fluorescencia
Electrónica (VII)
• Histograma biparamétrico.
Población
positiva
para PE
PE FL
Población doble
positiva
Población
negativa
FITC FL
Población positiva
para FITC
Electrónica (VIII)
Escala
lineal
Escala
logarítmica
flujo
Fluídica
• Cámaro
Óptica
• LASER
• Luz
• Sistema
Electrónica
.
• Amplificación
• Conversión
Informática
• Análisis
mediante PMTs.
a valores digitales.
en un sistema informático.
Análisis de datos
El citómetro nos da datos de la muestra que adquirimos:
•
•
•
•
Formato Estándar (FCS 2.0, FCS 3.0).
Archivo de Texto.
Información de cada célula.
Necesidad de compartir y comparar datos entre diferentes laboratorios y equipos.
Software (I)
• Distinguimos 3 tipos de archivos:
o
Documento o Protocolo o Plantilla: es exclusivo del software. Nos
permite visualizar los datos y escoger la información que deseamos
guardar.
o
Instrument Settings: es un archivo de la configuración de los
detectores. Nos permite guardar las condiciones de adquisición para
poder adquirir muestras en las mismas condiciones.
o
Data: archivo FCS. Contiene la información sobre la muestra y es
estándar. Eso nos permite analizar estos datos con otros softwares
distintos al de adquisición.
Software (II)
• Las diferentes formas de representar los datos en el software son, en
general:
o
Gráficos de puntos biparamétricos:
Dispersión
Densidad
Contorno
Software (III)
Gráficos monoparamétricos:
Gráficos especiales:
Software (IV)
¿Cómo estudiamos la población que nos interesa?
• Utilizamos Regiones y “Gates”. Eso nos permite estudiar poblaciones
concretas.
Esquema de un citómetroSeparador
B
D
F
Detectores
H
(PMTs)
Laser 488nm
E
Laser 633nm
A
C
FSC
SSC
Filtros
Datos
Placas
deflectoras
+
-
+
-
Análisis
Filtros
Detectores
(PMTs)
Muestra
Aplicaciones de la citometría de flujo
· Inmunofenotipaje
· Análisis de marcadores de
superfície
· Proliferación celular
· Ciclo celular (ploidías)
· Análisis de proteínas
intracelulars
· Apoptosis
· Estudio de microorganismos
· Esayos funcionales
(potencial de membrana
mitocondrial, extrusión
sondas fluorescentes,
metabolismo oxidativo…)
· Fosforilación de proteínas
· Sorting de poblaciones puras
con características específicas de
interés.
Aspectos a tener en cuenta en el planteamiento
de un experimento de citometría de flujo
• Qué fluorocromos podemos medir?
• Qué fluorocromos queremos medir?
• Cuántos queremos medir
simultáneamente?
• Cómo interaccionan entre ellos?
Aspectos a tener en cuenta en el planteamiento
de un experimento de citometría de flujo
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/ResearchTools/Fluorescence-SpectraViewer.html
http://www.bdbiosciences.com/external_files/media/spectrumviewer/
index.jsp
Aspectos a considerar
• El equipo da valores absolutos.....pero no sabe si una
muestra presenta fluorescencia o no. Es necesario
referenciarla a un control.
• Aumentar la velocidad de paso de la muestra (aumentando
el diferencial de presiones) dificulta la resolución de las
poblaciones.
• El software nos permite ver los datos de una forma
estadística. Nos muestra los datos de manera que los
podamos interpretar.
• Antes de diseñar un experimento preguntad al personal de
la UCTS.
UCTS – Plataforma de Citómica
En la UCTS, disponemos de 2 citómetros FacsCalibur de BD. Los
citómetros disponen de 2 LASERS.
• LASER Azul que emite luz a 488nm de longitud de onda.
• LASER Rojo que emite luz a 633nm.
Detección de 4 fluorescencias simultáneamente. 3 en el LASER
Azul y 1 en el LASER Rojo.
Disposem de 1 citòmetre Fortessa de BD. Disposa de 4 LASERS.
•
•
•
•
LASER Blau que emet llum a 488nm de longitud d’ona.
LASER Vermell que emet llum a 633nm.
LASER Violeta que emet llum a 405nm.
LASER Groc-verd que emet llum a 561nm.
Detección de 11 fluorescències simultàniament. 5 en el Blau, 5 en el Grocverd, 3 en el Vermell i 3 en el Violeta.
• También disponemos de 1 separador celular que disponen
de 4 LASERES (488 nm, 633 nm , 405 nm , 561 nm) y
9 detectores de fluorescencia.
Prácticas
 Se realizarán unas prácticas para aprender a
usar el citómetro en sus aspectos más básicos:







Encender el citómetro
Crear un documento de trabajo
Pasar muestras
Compensar
Obtener datos
Apagar el citómetro
Análisis de datos
Responsable UCTS: Dra Rosa Prieto
Responsables Plataforma de Citómica:
Irene Sales – email: [email protected]
Email: [email protected]
Telf: 934894179 (ext.4179)

Curso Teórico-Práctico Básico de Citometría de Flujo

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