Biología reproductiva del plumero de mar Bispira brunnea

Transcripción

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS DEL MAR Y LIMNOLOGIA
BIOLOGIA MARINA
Biología reproductiva del plumero de mar Bispira brunnea (Polychaeta:
Sabellidae): un acercamiento para su producción en cautiverio
TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
MAESTRA EN CIENCIAS
PRESENTA:
BIÓL. YASMÍN DÁVILA JIMÉNEZ
TUTOR
Dra. María Ana Tovar Hernández
Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR
Dr. Fernando Nuno Dias Marques Simões
Facultad de Ciencias, UNAM, Unidad Académica Sisal
Dra. Nuria Méndez Ubach
Instituto de Ciencias del Mar y Limnología, UNAM, Unidad Mazatlán
Dr. Alejandro Granados Barba
Instituto de Ciencias Marinas y Pesquerías, Universidad Veracruzana
Dr. Eugenio de Jesús Carpizo Ituarte
Instituto de Investigaciones Oceanológicas, Universidad Autónoma de Baja California
MÉXICO, D. F.
Abril, 2016
Biología reproductiva del plumero de mar Bispira brunnea
(Polychaeta: Sabellidae): un acercamiento para su producción
en cautiverio
TESIS
Que para obtener el grado académico de
Maestro en Ciencias
(Biología Marina)
Presenta
Biól. Yasmín Davila Jiménez
Directora de tesis:
Dra. María Ana Tovar Hernández
Comité tutoral:
Dr. Fernando Nuno Días Marques Simões
Dra. María Nuria Méndez Ubach
Dr. Alejandro Granados Barba
Dr. Eugenio de Jesús Carpizo Ituarte
México, Abril 2016
Dedicatoria
A mis papás, Marycarmen y Benjamín,
a mi hermano Iván B.,
por todo su amor y paciencia,
por siempre creer en mí.
A mi tía Martha,
por su eterno abrazo reconfortante,
siempre estás en mi corazón.
Annelida of the Ganglia,
grand dame of dirt,
hermaphrodite of Nerves and of Love,
with her vine of five hearts and will to woo, who touches us all at last.
Hadara Bar-Nadav
Agradecimientos
A la Universidad Nacional Autónoma de México, UNAM que me ha forjado para ser
una profesionista con valores y ética, a quién le debo mi formacion académica.
Agradezo a CONACyT por la beca de maestria y beca mixta otorgadas.
Al posgrado en Ciencias del Mar y Limnologia, UNAM, así como a la coordinadora
del posgrado la Dra. Gloria Villaclara, a la Maestra Diana Juarez, a Guadalupe
Godoy, a Chantal Ruiz y Gabriela Almaraz por la buena disposicion que siempre
recibí de ellas ante cualquier duda o pregunta.
A mi directora de tesis, la Dra. Maria Ana Tovar Hernández que a pesar de la
distancia, siempre conte con su dirección y apoyo, por todas las revisiones,
comentarios y sugerencias realizadas a la tesis, las cuales tambien ayudaron a mi
crecimiento profesional y personal, por ser una gran motivación para mí. Al Dr. Nuno
Simões por todos sus consejos y sugerencias realizadas a este trabajo, por
recibirme en su laboratorio y por todo el apoyo académico que siempre recibí de él.
Agradezo a los miembros del comité tutoral: Dr. Nuno, la Dra. Nuria Méndez, el Dr.
Eugenio Carpizo Ituarte y al Dr. Alejandro Granados Barba por su valioso tiempo,
por todas revisiones, criticas y comentarios realizados durante el proceso de este
trabajo, que al final, enriquecieron enormemente esta tesis.
A la Mtra. Gemma Martinez por todo el apoyo técnico y los consejos brindados
durante el mantenimiento de los organismos vivos en la laboratorio. A Fernando
Mex, Biól. Yunuen, Dr. Ricardo, Antar, Dra. Natalia, Biól. Humberto, Mtro.Tulio
Villalobos, Biól. Arturo por el apoyo durante el mantenimiento y colecta de los
organismos, asi como toda la ayuda en las salidas al campo.
A la Dra. Maite Mascaro por ayudarme con los análisis estadisticos y por todas las
críticas constructivas que recibí de ella, por contagiarme ese amor a la ciencia.
Al Mtro. Jose Luis Bortolini por la elaboracion de la tecnica histológica y a la Dra.
Silvia Espinosa de la Facultad de Ciencias, por las fotografias de microscopia
electrónica de barrido.
A la Dra. Patricia Guadarrama y a la Mtra. Maribel Badillo, por el apoyo brindado en
las instalaciones de microscopía, a la Mtra. Iveth Gabriela Palomino Albarrán y
Patricia M. Balam por suministrar el alimento vivo usado para el mantenimiento de
los organismos.
A mis amigos de la maestria Sarai, Eri, Jose Luis, Antar, Ari, Efraín, Yoli, Yesica,
Martín, Humberto, Magui, Daniela, Giulia, Naty y Nacho por su gran amistad. Por
todos los momentos vividos durante mi estancia en Sisal.
A Arturo por su comprensión, cariño y apoyo en todo momento, por las todas las
aventuras, risas y enojos, por ser parte de este logro que sin duda no hubiera sido
el mismo, infinitas gracias.
A Michela y Maddy, por ser unas excelentes amigas durante mi estancia en Lecce,
Italia.
Sin olvidar a mis amigos Mont, Ara, Aurora, Gio, Carlitos..que de alguna u otra forma
fueron parte importate de esta tesis.
INDICE
LISTADO DE TABLAS .................................................................................................. 1
LISTADO DE FIGURAS ................................................................................................. 2
Resumen ......................................................................................................................... 4
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 5
2. ANTECEDENTES....................................................................................................... 7
2.1 Generalidades de los poliquetos ..................................................................... 7
2.3 Aspectos reproductivos de los sabélidos ..................................................... 9
2.5 Aspectos ornamentales de los invertebrados y en particular, de los
sabélidos................................................................................................................... 12
3. PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN ...................................................................... 15
4. OBJETIVOS E HIPOTESIS ..................................................................................... 16
4.1 Objetivo general ................................................................................................ 16
4.2 Objetivos particulares...................................................................................... 16
5. MATERIAL Y MÉTODOS ........................................................................................ 17
5.1 Área de estudio ................................................................................................. 17
5.3 Trabajo de laboratorio ..................................................................................... 18
5.3.1 Estructura y composición de las agregaciones .................................. 18
5.3.2 Distribución de gametos, morfología y gametogénesis .................... 20
5.3.3 Microscopía electrónica de barrido ....................................................... 22
5.3.4 Inducción del desove y fertilización ...................................................... 23
5.3.5 Tasa de crecimiento y reconstrucción del tubo de B. brunnea ....... 24
5.3.6 Descripción de la reproducción asexual por fisión natural en B.
brunnea ................................................................................................................. 24
5.3.7 Efecto del estrés en la adición de segmentos nuevos en B. brunnea
(Grupos I y II) ........................................................................................................ 25
5.3.8 Cambios morfológicos asociados a procesos regenerativos
presentes en los individuos producidos por mutilación (Grupos III y IV) 26
6. RESULTADOS.......................................................................................................... 27
6.1 Estructura de las agregaciones ..................................................................... 27
6.2 Distribución de gametos, morfología y gametogénesis ........................... 32
6.3 Inducción del desove y fertilización ............................................................. 33
6.4 Tasa de crecimiento y reconstrucción del tubo de B. brunnea .............. 33
6.5 Descripción de la reproducción asexual por fisión natural en B. brunnea
.................................................................................................................................... 34
6.6 Efecto del estrés en la adición de segmentos nuevos en B. brunnea
(Grupos I y II) ............................................................................................................ 35
6.7 Cambios morfológicos asociados a procesos regenerativos presentes
en los individuos producidos por mutilación (Grupos III y IV) .................. 35
7. DISCUSIÓN ............................................................................................................... 37
7.1 Estructura de las agregaciones ..................................................................... 37
7.2 Estadios de madurez sexual y la morfología de los gametos ................. 42
7.3 Inducción del desove ....................................................................................... 45
7.4 Tasa de crecimiento y construcción del tubo de B. brunnea .................. 46
en condiciones de laboratorio .............................................................................. 48
7.6 Efecto del estrés en la adición de segmentos nuevos en B. brunnea y
cambios morfológicos asociados a procesos regenerativos presentes en
los individuos producidos por mutilación (corte) ............................................ 49
8. Conclusión ............................................................................................................... 54
9. Referencias .............................................................................................................. 55
10. Anexos .................................................................................................................... 62
LISTADO DE TABLAS
Tabla 1. Procesamiento de tejidos para cortes en paraplast ................................................ 62
Tabla 2. Agregaciones correspondientes a octubre (2013), febrero (2014) y marzo (2014),
cada una con el número total de juveniles y adultos. ............................................................ 63
Tabla 3. Morfometría de juveniles y adultos. .......................................................................... 63
Tabla 4. Modos reproductivos de B. brunnea ......................................................................... 64
Tabla 5. Diferencias entre juveniles producidos sexualmente vs brotes producidos
asexualmente en las primeras etapas de desarrollo ............................................................. 65
1
LISTADO DE FIGURAS
Figura 1. Agregaciones de B. brunnea en el Caribe mexicano. ............................... 66
Figura 2. Estructuras generales de un sabélido......................................................... 67
Figura 3. Mapa de Majahual, Q. Roo .......................................................................... 68
Figura 4. Fotografías del proceso para la tasa de crecimiento, reconstrucción del
tubo y descripción de la reproducción asexual (fisión espontánea) en B. brunnea.
........................................................................................................................................ 68
Figura 5. Esquema del experimento de regeneración en B. brunnea. .................... 69
Figura 6. Efecto del estrés en B. brunnea (arreglo de los grupos I y II) .................. 69
Figura 7. Cambios morfológicos asociados a procesos regenerativos en B.
brunnea.. ........................................................................................................................ 70
Figura 8. Especies de moluscos eulímidos asociadas a las agregaciones de B.
brunnea. ......................................................................................................................... 70
Figura 9. Adultos de B. brunnea con fotografía digital. ............................................. 71
Figura 10. Juveniles de B. brunnea con fotografía digital. ........................................ 72
Figura 11. Juveniles de B. brunnea con microscopía electrónica de barrido.......... 73
Figura 12. Coeficiente de determinación (R2) de los rasgos biométricos de B.
brunnea .......................................................................................................................... 74
Figura 13. Reproducción asexual en B. brunnea con fotografía digital. .................. 75
Figura 14. Brotes de B. brunnea producidos asexualmente con fotografía digital..76
Figura 15. Juveniles de B. brunnea producidos por fisión espontánea y subsecuente
regeneración con microscopía electrónica de barrido............................................... 77
Figura 16.Distribución y morfología de gametos de B. brunnea con microscopía
electrónica de barrido ................................................................................................... 78
Figura 17. Cortes histológicos que muestran la ovogénesis en B. brunnea ........... 79
Figura 18. Método mecánico de punción.................................................................... 80
2
Figura 19. Gráfica de crecimiento del tubo de B. brunnea durante un periodo de 79
días realizada con el programa R................................................................................ 80
Figura 20. Crecimiento y reconstrucción del tubo de B. brunnea ............................ 81
Figura 21. Ilustración del proceso de la reproducción asexual por fisión natural en
B. brunnea ..................................................................................................................... 81
Figura 22. Reproducción asexual por fisión natural en B. brunnea ......................... 82
Figura 23. Gráfica del efecto del tratamiento (con tubo y sin tubo) en B. brunnea
sobre la adición de nuevos segmentos en el tiempo. ................................................ 82
Figura 24. Regeneración de los segmentos posteriores en B. brunnea. ................ 83
Figura 25. Gráficas de supervivencia en B. brunnea. ............................................... 84
Figura 26. Gráfica de supervivencia de los fragmentos posteriores de los grupos III
y IV .................................................................................................................................. 85
3
Resumen
El gusano poliqueto Bispira brunnea es un organismo gregario que se explota con fines
ornamentales. El propósito de este estudio fue generar conocimiento básico sobre aspectos
reproductivos de B. brunnea, que permitan desarrollar un método para su producción en
cautiverio. Diez agregaciones fueron colectadas en octubre 2013, febrero y marzo 2014 en
Majahual, Quintana Roo; se fijaron, midieron y se observaron bajo microscopio. Se usaron
técnicas de microscopio electrónico de barrido y técnicas histológicas. Se encontró que las
agregaciones tienen un número variable de individuos (24-56) por agregación y están
conformadas por tubos flexibles. Se registró por primera vez la asociación de un molusco
piramidélido ectosimbionte (Odostomia (Eulimastoma) caniculata y un nemátodo
endosimbionte con B. brunnea. Se determinó el estado reproductivo de 355 individuos (53
juveniles y 302 adultos). Los adultos presentaron reproducción sexual (hermafroditismo
simultáneo y gonocorismo) y asexual al mismo tiempo: 92.71% se reprodujeron
sexualmente y el 52% por arquitomía. Con el método de punción se obtuvieron gametos,
pero no se logró la fertilización. Los gametos se encontraron distribuidos en los segmentos
posteriores del tórax y en todo el abdomen. La ovogénesis fue extraovárica, diferenciada
en cuatro estados de desarrollo y con ovocitos asincrónicos. Los espermatozoides
presentaron el patrón morfológico de fertilización externa. El crecimiento del tubo fue de 630 mm en 79 días y la reconstrucción sucedió después de 24 horas. La reproducción
asexual por fisión natural ocurrió en 72 días y el nuevo fragmento presentó tres estados de
regeneración. Los gusanos adicionaron segmentos rápidamente y aceleraron su proceso
de reproducción asexual ante un estímulo externo. En 15 días se registró la regeneración
completa del organismo demostrando que el proceso de propagación artificial es más rápido
que el proceso por fisión natural. Este estudio provee información sobre B. brunnea que
sirve como línea base para su aplicación en protocolos de cultivo.
Palabras clave: agregaciones, oogenesis, arquitomía, reproducción sexual, regeneración,
Majahual, ornamental.
4
1. INTRODUCCIÓN
Durante la última década, se ha observado un incremento en la preferencia de
especies marinas ornamentales, destacando los corales y otros invertebrados. Una
gran variedad de gusanos poliquetos se usan con fines ornamentales,
especialmente los serpúlidos y los sabélidos (Olivotto et al., 2011).
A nivel global, los poliquetos se encuentran entre los diez invertebrados
marinos más comercializados. Los sabélidos comúnmente conocidos como
“gusanos plumero” o “flores de mar”, son utilizados en la industria de la acuariofilia
debido a la sorprendente coloración que presentan en la corona branquial (TovarHernández y Pineda-Vera, 2008); sin embargo, se desconocen las cifras exactas de
su comercialización. México es uno de los principales exportadores de
invertebrados, entre los cuales, los poliquetos ocupan un lugar muy importante
(Wabnitz et al., 2003).
La procedencia de este grupo de invertebrados es del medio silvestre y,
comúnmente se emplean técnicas destructivas que afectan no sólo a estos
animales, sino también a los invertebrados sésiles que se encuentran asociados a
la roca base, ya que la mayoría de la especies son obtenidas de arrecifes de coral
(Olivotto et al., 2011). Debido a la carencia de conocimiento de la reproducción y
desarrollo larvario de la mayoría de las especies comercializadas de gusanos
poliquetos, su cultivo es una alternativa para reducir la presión en las poblaciones.
Por ello, se ha intentado inducir la propagación artificial por la vía sexual del
sabélido solitario Sabellastarte spectabilis por Bybee et al. (2006a, b), que es una
especie llamativa que habita entre huecos y cavidades de coral en Hawaii. Por la
vía asexual, con el sabélido Pseudopotamilla reniformis se ha demostrado que
presenta alta capacidad de regeneración en las regiones corporales anterior y
posterior (Licciano et al., 2012; Kolbasova et al., 2013) y regeneración total a partir
de segmentos de la región media del cuerpo (Bely, 2006). Esta vía ofrece buenos
5
resultados para satisfacer la demanda del mercado ornamental debido a la facilidad
de obtención y bajo costo de producción (Murray et al., 2013), pero debe utilizarse
con reserva antes de hacer uso extensivo de este método para evitar repercusiones
en la estructura de la población a largo plazo.
El sabélido Bispira brunnea (Treadwell) es un organismo sésil, gregario y se
caracteriza por presentar tres variedades de color en la corona dependiendo del
área geográfica donde se encuentre. Así, la variedad bandeada se ubica en la costa
de Quintana Roo desde Cozumel hasta Xcalak y también en Belice, la variedad
blanca al norte del estado de Quintana Roo y Cozumel (Figura 1D), y finalmente, la
variedad violeta se registra para las Islas Caimán (Humman y Deloach, 2003; TovarHernández y Pineda-Vera, 2008).
Bispira brunnea se puede encontrar asociada a diferentes taxones como
esponjas, moluscos, crustáceos, corales y algas (Figura 1A, C). Se sabe que
presenta reproducción sexual, asexual y presenta el fenómeno de regeneración en
miembros de una sola agregación. Además es fotografiado para su venta como
postales, calendarios y está incluido en guías de buceo para la identificación rápida
de organismos del Caribe y es uno de los invertebrados marinos explotados con
fines ornamentales (Tovar-Hernández y Pineda-Vera, 2008).
En México, la exhibición de la especie es común en acuarios públicos y
privados, así como en mercados de mascotas. B. brunnea no está incluida en la
lista de CITES ni en la NOM-059-SEMARNAT-2010. En el mercado internacional,
se le conoce como “cluster duster” y, de acuerdo con el Tropical Marine Center, la
especie es comercializada, por lo menos, en el Reino Unido. Se estima que 18,500
individuos son vendidos anualmente en el mercado ornamental (Murray et al., 2012).
A pesar de la relevancia que tiene la especie en la industria de la acuariofilia,
no ha sido propagada con fines ornamentales y únicamente se extrae de su hábitat
6
natural. Es por eso que este estudio es pionero en desarrollar técnicas que permitan
reproducir de manera artificial a B. brunnea en condiciones controladas para tener
una mejor comprensión de la biología de la especie.
2. ANTECEDENTES
2.1 Generalidades de los poliquetos
Los anélidos fueron formalmente descritos por Linneo (1785). Se reconocen tres
clases: Polychaeta, Oligochaeta e Hirudinea. Las últimas dos clases se encuentran
dentro del taxón Clitellata. Actualmente se incluye a los fila: Echiura, Pogonophora,
Sipunculida y Vestimentifera como anélidos, aunque las relaciones entre estos y los
demás linajes se encuentran aún sin resolver (Rouse y Pleijel, 2007; Rousset et al.,
2007). La clase Polychaeta se considera la más diversa, con 15,000 especies
descritas (Tovar-Hernández et al., 2014). Esa diversidad se atribuye a su
considerable complejidad estructural, gran variedad morfológica y alta diversidad
funcional.
De manera general, el cuerpo de los poliquetos se divide en tres regiones: 1)
el peristomio, que porta estructuras sensoriales (ojos, antenas, palpos); 2) el
metastomio, que presenta segmentación homómera cuando todos los segmentos
son iguales entre sí, o heterómera cuando se diferencian los segmentos y
especializan entre sí, y 3) el pigidio, que es el extremo posterior y porta al ano
(Brusca y Brusca, 2002; Tovar-Hernández et al., 2014).
Los poliquetos se distribuyen prácticamente en todos los ecosistemas
bentónicos marinos, donde a menudo son el componente dominante en términos de
número de individuos y especies (Rouse, 2001); no obstante, los poliquetos han
logrado invadir con éxito el ambiente pelágico, cuerpos de agua dulce e inclusive el
medio terrestre. Nueve familias son consideradas holopláncticas (ca. 95 especies)
exclusivas de ecosistemas pelágicos de mar abierto (Suárez-Morales et al., 2005);
7
aproximadamente 60 especies de las familias Nereididae, Spionidae, Capitellidae,
Sabellidae y Serpulidae son dulceacuícolas (Wessenberg-Lund, 1958) y unas 10
especies de la familia Nereididae son semi-terrestres y arbóreas, propias de los
bosques húmedos tropicales (Glasby et al., 2000).
2.2 Características de la familia Sabellidae
El cuerpo de los sabélidos es heterómero, con tres regiones principales que
incluyen: corona branquial, tórax y abdomen. La corona branquial tiene dos lóbulos
basales de los que se extienden los radiolos. Estos lóbulos se encuentran unidos al
peristomio (Figura 2). La familia presenta el fenómeno de inversión setal como una
posible adaptación, en el que las notosetas cambian de una posición dorsal en el
tórax, a una ventral en el abdomen con el fin de no contaminar el área bucal cuando
se elimina el contenido fecal, ya que los sabélidos construyen tubos con una sola
apertura por donde salen las heces hacia la columna de agua (Tovar-Hernández,
2009).
La familia Sabellidae Latreille, 1825 consta de una subfamilia: Sabellinae, en
la que se reconocen 39 géneros (Capa et al., en prensa). Para el Gran Caribe se
enlistan 22 géneros y 51 especies (Tovar-Hernández y Salazar-Silva, 2008).
En especial, el género Bispira es un grupo bastante heterogéneo en cuanto a
su filogenia, ya que en diferentes estudios se ha sugerido como un grupo hermano
de Sabella, o grupo hermano del clado Sabella-Sabellastarte-PseudobranchiommaBranchiomma, presentado como una politomía, inclusive como un grupo parafilético
que no incluye a Branchiomma y Pseudobranchiomma (Faasse y Giangrande,
2012). Hasta el momento, el género consta de 22 especies que han sido registradas
en la Antártida, en el Ártico y en varias localidades de los trópicos (Capa et al.,
2013). Para la región del Caribe se tienen registradas tres especies: B.
melanostigma, B. paraporifera y B. brunnea (Tovar-Hernández y Salazar-Vallejo,
2006; Tovar-Hernández y Pineda-Vera, 2008).
8
2.3 Aspectos reproductivos de los sabélidos
La reproducción asexual en el orden Sabellida sucede por medio de dos vías:
paratomía, cuando las estructuras se modifican para dar origen a otro organismo
completamente diferenciable del parental para después separarse de él; y
arquitomía, cuando se fragmenta el organismo y después se regeneran las
estructuras faltantes en el nuevo organismo (Rouse y Pleijel, 2001).
La familia Sabellidae presenta un amplio rango de estrategias reproductivas,
ya sea por la vía sexual o asexual, y como el resto de los poliquetos, también
presenta el fenómeno de regeneración. Los sabélidos son mayoritariamente
gonocóricos;
sin
embargo,
muchas
especies
de
la
familia
presentan
hermafroditismo simultáneo, como es el caso de los géneros Amphiglena,
Branchiomma, Laonome y Perkinsiana (Rouse y Fitzhugh, 1994; Licciano et al.,
2002; Tovar-Hernández, 2009); en algunas especies ambos gametos (masculinos
y femeninos) se distribuyen en los mismos segmentos (Bybee et al., 2006a).
En la familia es común el desove libre de los gametos en la columna de agua,
pero también existe el depósito de masas de huevos en el bentos e incubación de
las larvas dentro o fuera del tubo, o incluso, en la corona branquial (McEuen et al.,
1983). La incubación está relacionada con organismos de cuerpo pequeño y se
considera una condición plesiomórfica para la familia (Rouse y Fitzhugh, 1994;
Giangrande et al., 2000).
La reproducción por la vía asexual también es común en la familia Sabellidae.
Esta ocurre por arquitomía, que es cuando el organismo se fragmenta por fisión en
dos o varias partes de manera natural, a partir de la cuales se regeneran la parte
anterior y posterior para formar individuos completos (Schroeder y Hermans, 1975;
David y Williams, 2011). La arquitomía ha sido documentada en Sabella variabilis,
Perkinsiana rubra, Myxicola aesthetica, Perkinsiana milae, Megalomma cinctum
(Kolbasova et al., 2013), y en Pseudobranchiomma schizogenica (Tovar-Hernández
9
y Dean, 2014), asi como en los espiónidos Amphipolydira vestalis, Pygospio elegans
y Dipolydora quadrilobata (Gibson y Paterson, 2003; Lindsay et al., 2008). En
algunos casos, se ha documentado que ocurre reproducción sexual y asexual al
mismo tiempo (Tovar-Hernández et al., 2011).
En lo que al género Bispira se refiere, únicamente existen trabajos de aspectos
reproductivos en dos especies: B. brunnea por Tovar-Hernández y Pineda-Vera
(2008) y B. volutacornis (distribuido en la costa oeste de Irlanda) por Nash y Keegan
(2003), que registraron solo reproducción sexual en un ciclo de 12 meses, siendo la
reproducción del macho más rápida que la de la hembra (Nash y Keegan, 2003).
2.4 Fenómeno de regeneración
La regeneración es la restauración de partes perdidas del cuerpo y puede ocurrir en
múltiples niveles de organización biológica originando estructuras iguales o
parecidas a las originales. Algunos animales pueden regenerar un individuo entero
a partir de un fragmento del cuerpo, como algunos cnidarios y platelmintos (Bely y
Nyberg, 2009). Filogenéticamente, la capacidad de regenerar se ha perdido y ha
surgido muchas veces a lo largo de la historia evolutiva de los organismos y la gran
mayoría de los estudios sobre regeneración están enfocados en organismos como
las hidras, planarias y anfibios (Bely, 2006).
Las células que participan en la regeneración proceden de diferentes tejidos
diferenciados y especializados. La habilidad de regenerar varía ampliamente,
inclusive entre especies del mismo género. Los procesos de regeneración, incluida
la mortalidad en respuesta a la herida, la rapidez de regeneración y los mecanismos
por los cuales las partes pérdidas son restauradas se desconocen para la mayoría
de las especies de sabélidos (David y Williams, 2011; Licciano et al., 2012).
Existen organismos capaces de reproducirse asexualmente y que tienen la
capacidad de regenerar, y organismos que pueden regenerar pero no pueden
10
reproducirse asexualmente, por lo que la reproducción asexual y la regeneración
tienen un origen evolutivo distinto (Bely y Wray, 2001). La reproducción asexual es
inducida endógenamente, mientras que la regeneración es la respuesta a una
amputación externa (Bely, 2006). Dos tipos de procesos están involucrados en la
regeneración: la epimorfosis que implica la proliferación celular con la diferenciación
de un blastema y la formación de las partes faltantes del cuerpo, y la morfolaxis,
que se refiere a la remodelación de las estructuras pre-existentes. Ambos términos
fueron descritos por Morgan en 1901 (Licciano et al., 2012).
Berrill (1978) mencionó que los sabélidos tienen la capacidad de reconstruir la
pérdida de segmentos anteriores y posteriores del cuerpo, aunque el proceso
morfogenético involucrado permanecía en esos años sin esclarecer. En estudios
posteriores Bely y Wray (2001) aislaron dos genes homólogos del oligoqueto
Pristina leydi. Describieron que el gen (en) se expresa en el desarrollo del sistema
nervioso durante el crecimiento del adulto, en la regeneración y en la fisión, mientras
que el gen (otx) juega un papel importante en la definición de estructuras anteriores
durante la embriogénesis.
En específico, la capacidad para regenerar segmentos posteriores es común
entre los anélidos, a diferencia de la regeneración anterior, ya que si los gusanos
son cortados en el tórax y el abdomen, la herida se restablece, pero los gusanos no
regeneran los segmentos faltantes y eventualmente mueren de hambre. Inclusive,
si el corte es realizado en la partes del prostomio y el peristomio, tampoco se
produce la regeneración (Bely, 2006).
11
Contrariamente a lo anterior, Kobalsova et al. (2013) demostraron que en
Pseudopotamilla reniformis, la regeneración de segmentos posteriores comienza
entre los 8-10 días de mutilados los organismos, con la formación de un nuevo
pigidio y setígeros, mientras que la región anterior comienza a formar rudimentos
branquiales. En las especies, Sabella spallanzanii y B. luctuosum la corona
branquial y los segmentos anteriores fueron los primeros en formarse. Lo anterior
determina, que esta estructura se vuelve importante, pero no esencial para la
supervivencia del organismo, debido a que a través de la pared del cuerpo también
se efectúa el intercambio gaseoso, necesario para la respiración (Licciano et al.,
2012). Asimismo, el gusano de fuego Eurythoe sp., posee regeneración anterior y
posterior. Después de la amputación, la regeneración anterior comenzó a las 24
horas, en la que el organismo exhibe una capa epitelial que cubre la herida. En el
caso de la regeneración posterior, ésta comenzó hasta el día 36, y para el día 90,
el gusano alcanzó una apariencia normal (Yáñez-Rivera y Méndez, 2014).
2.5 Aspectos ornamentales de los invertebrados y en particular, de los
sabélidos
La popularidad y demanda de invertebrados ornamentales ha incrementado durante
la última década, debido a que presentan colores llamativos, aspectos raros y
atractiva belleza (Murray y Watson, 2014). La industria del acuarismo ha tenido
mucho auge durante la última década, tanto es así, que ha alcanzado cientos de
millones de dólares y se puede tener acceso a las diferentes especies de
invertebrados marinos mediante la compra por internet. Diariamente, los
organismos son extraídos principalmente del Indo-Pacífico, el Mar Rojo y el Caribe
para ser usados en acuarios de arrecife (Calado y Chapman, 2006). Estados Unidos
y el Reino Unido son los países que más importan invertebrados marinos de uso
ornamental y los mayores exportadores son Indonesia y Filipinas (Wabnitz et al.,
2003).
12
Con base en datos de importadores y exportadores de Global Marine
Aquarium Database (GMAD), 516 especies de invertebrados son comercializadas
para uso ornamental. En este negocio, México ocupó un lugar importante como
exportador de invertebrados marinos entre los años 1988-2002 (Wabnitz et al.,
2003). Los poliquetos de uso ornamental de las familias Sabellidae y Serpulidae son
los más comercializados, se estima que 18,500 individuos son vendidos anualmente
tan solo en el Reino Unido (Murray et al., 2012) exportándose 128,248 ejemplares
de sabélidos entre los años 1998 y 2003 (Wabnitz et al., 2003).
De acuerdo con el estudio de Murray et al. (2012), entre los años 2007 y finales
del 2009, los poliquetos ornamentales que fueron importados por el Reino Unido,
para re-distribuirlos a su vez en Irlanda y el continente Europeo, provinieron de seis
regiones principales: Bali, Océano Índico, Singapur, República Dominicana,
Filipinas y Hawaii. Bali, Singapur y el Océano Índico contribuyeron con el 89% de
los 41,664 individuos importados en ese periodo. República Dominicana exportó al
famoso “cluster duster” al Reino Unido en el mismo periodo con la cantidad de 1,107
individuos.
Se han realizado diferentes estudios para comprender los aspectos de la
reproducción y facilitar el cultivo de poliquetos. Bybee y colaboradores (2006 a,b)
con Sabellastarte spectabilis, proporcionan información para su propagación con
fines ornamentales y acerca del crecimiento y supervivencia de los juveniles, así
como la tasa de filtración y análisis de contenido de ácidos grasos (Tamaru et al.,
2008; 2011). Para sabélidos que forman agregaciones, únicamente se tiene un
estudio enfocado en la reproducción asexual con la especie P. reniformis, en el que
se observó que este tipo de reproducción ocurre cuando las condiciones no son
favorables para la especie y como una adaptación para evitar el aumento de
mortalidad en los diferentes estadios larvales por depredación (Kolbasova et al.,
2013).
13
Por último Murray et al. (2013) propusieron el método de regeneración, como
una interesante técnica para el cultivo de sabélidos ornamentales mediante la
fragmentación del individuo, registrado anteriormente con éxito en el grupo de los
corales. Estos autores demostraron que dos especies de sabélidos (Sabella
pavonina y Sabellastarte sp.) son capaces de regenerar las partes fragmentadas en
tan solo cuatro semanas, obteniendo un porcentaje de supervivencia de casi el 80%
de los individuos.
14
3. PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN
Pregunta principal de investigación
¿Cuál es el método más adecuado para llevar a cabo la reproducción de B. brunnea
en cautiverio?
Preguntas secundarias:
•
¿Cuál es la proporción de hembras y machos en la población de B. brunnea?
•
¿Cuál es la proporción de individuos hermafroditas en la población de B.
brunnea y cómo es este hermafroditismo: simultáneo o secuencial?
•
¿Cuál es el porcentaje de individuos parentales que presentan nuevos
individuos o brotes dentro del mismo tubo?
•
¿Cuántos de estos individuos parentales también presentan reproducción
sexual y asexual al mismo tiempo?
•
¿Cuál es la talla a la que los individuos de B. brunnea alcanzan la madurez
sexual?
•
La ablación, punción o presión ¿son métodos funcionales para inducir el
desove de B. brunnea?
•
¿Cuál es tiempo que le toma a un gusano regenerar completamente la parte
anterior y la parte posterior?
•
¿Cuál es el porcentaje de supervivencia de los gusanos al ser manipulados
y/o fragmentados?
•
¿Los individuos o fragmentos regenerados logran producir gametos?
15
4. OBJETIVOS E HIPOTESIS
4.1 Objetivo general
Aportar datos sobre la biología reproductiva del plumero de mar B. brunnea
(Polychaeta: Sabellidae) que permitan desarrollar un método para su producción en
cautiverio.
4.2 Objetivos particulares

Describir la estructura y composición general de las agregaciones de B.
brunnea.

Describir los estadios de madurez sexual y la morfología de los gametos.

Probar un método mecánico para inducir el desove y la fertilización.

Determinar la tasa de crecimiento y reconstrucción del tubo de B. brunnea.

Describir el proceso asexual (fisión natural) en B. brunnea en condiciones
de laboratorio.

Evaluar el efecto del estrés en la adición de segmentos nuevos en B.
brunnea y observar los cambios morfológicos asociados a procesos
regenerativos presentes en los individuos producidos por mutilación (corte).
4.3 Hipótesis
Debido a que B. brunnea es un organismo gregario, su comportamiento éxito será
resultado del establecimiento de las larvas cerca de los adultos, de la reproduccion
sexual (gonogóricos y hermafroditas) y asexual en la misma agregación.
Debido a que los sabélidos poseen capacidad regenerativa, se espera que la
propagación artificial, mediante la mutilación del cuerpo con la consecuente
regeneración de estructuras faltantes, sea más rápida que por el proceso de fisión
natural.
16
5. MATERIAL Y MÉTODOS
5.1 Área de estudio
La recolecta de B. brunnea se llevó a cabo en la laguna arrecifal de Majahual, Q.
Roo (18º 42’ 35.7’’ N, 87º 42’ 44.7’’ W) (Figura 3), en la costa sureste de la Península
de Yucatán, forma parte del Sistema Arrecifal Mesoamericano, el cual bordea la
costa este de la península desde la Isla Contoy en el norte y en el sur hasta el Golfo
de Honduras (Hernández-Ballesteros et al., 2013). El promedio anual de la
temperatura superficial del mar es 28.2ºC, oscilando entre 29.7ºC en el verano y
26.5ºC en el invierno (Carricart-Ganivet, 2004).
El arrecife coralino es de tipo marginal con una extensión de 3,600 m
aproximadamente y se encuentra muy cercano a la costa (300 m). La laguna
arrecifal es somera, de 1 a 2 metros de profundidad con pastos marinos (Thalassia
testudinum y Syringodium filiforme) y amplias zonas arenosas donde se ubican
parches de arrecife. Los corales dominantes son Montastrea annularis, Porites
astreoides y Favia fragum (Bastida-Zavala et al., 2000). Además, como resultado
de una caracterización del Sistema Arrecifal Mesoamericano realizada por la
organización no gubernamental Amigos de Sian Ka’an, Majahual pertenece al área
protegida de los Arrecifes de la Costa Maya con 6,028 ha (Bezaury-Creel, 2005).
Majahual es un arrecife con valores altos de diversidad y riqueza,
principalmente en grupos de corales y peces (Arias-González et al., 2008). A pesar
de ello, en la última década, ha enfrentado niveles altos de explotación de turismo
y pesca (Villegas-Sánchez et al., 2010) dando lugar al incremento de la
infraestructura turística como caminos, cuartos de hospedaje y puertos, promovida
por el gobierno. Asimismo, la zona está expuesta a disturbios naturales como
tormentas y huracanes (Hirales-Cota et al., 2010).
17
5.2 Trabajo de campo
Los muestreos realizados en la laguna arrecifal de Majahual Q. Roo, fueron de tipo
intencional, que es un método no probabilístico que se caracteriza por el uso de
juicios y por un esfuerzo deliberado por obtener una muestra representativa (OrtizUribe, 2004). Se realizaron cinco muestreos: en octubre (2013), febrero, marzo,
septiembre (2014) y marzo (2015) con el permiso SAGARPA–CONAPESCA–
PPF/DGOPA.127/14, en cada uno de los muestreos realizados se recorrió un área
aproximada de 200 m2.
Las agregaciones de B. brunnea se recolectaron manualmente mediante
buceo libre, se trasladaron a la superficie y se colocaron en bolsas de plástico
etiquetadas previamente, por ejemplo: A1, M1 (agregación 1, mes 1). En octubre
(2013) se recolectaron nueve agregaciones, en febrero (2014) ocho agregaciones,
en marzo (2014) siete, en septiembre (2014) cuatro agregaciones y en marzo (2015)
cinco agregaciones. Todas las agregaciones se recolectaron adheridas a sustrato
rocoso o coral muerto, se evitó recolectar las agregaciones que se encontraban
adheridas a coral vivo. En total se recolectaron 33 agregaciones.
Diez agregaciones correspondientes a octubre (2013), febrero y marzo (2014)
se fijaron en formol al 10%, mientras que las restantes 23 agregaciones de todos
los meses se mantuvieron vivas en recipientes etiquetados con 2 L con agua marina
aireada con bombas. Todas las muestras se trasladaron al Laboratorio de Ecología
PIECEMO (Programa de Investigaciones en Ecología y Cultivo de Especies Marinas
de Ornato) de la Unidad Académica de Sisal, Facultad de Ciencias, UNAM.
5.3 Trabajo de laboratorio
5.3.1 Estructura y composición de las agregaciones
a) Descripción general
Diez agregaciones que fueron fijadas en formol se mantuvieron en esa sustancia
durante tres días: cinco agregaciones de octubre (2013), tres de febrero (2014) y
18
dos de marzo (2014). Después, se lavaron con agua corriente y se colocaron en
alcohol al 95%. Se hicieron observaciones cualitativas sobre la estructura y
composición de las agregaciones: distribución y organización de los tubos, sustrato,
epifauna, presencia de simbiontes, etc., y se midió el ancho y largo de los tubos. Se
determinó el número de individuos por agregación, para lo cual, cada individuo fue
separado de su respectiva agregación, se retiró de su tubo cuidadosamente y se
colocó en un vial etiquetado en código, por ejemplo: C1, M1, individuo 1.
b) Morfología y morfometría
Se describió la morfología y se registraron las medidas de longitud total del cuerpo,
ancho del tórax, longitud de la corona branquial, número de segmentos torácicos y
número de segmentos abdominales con ayuda de un microscopio estereoscópico
Leica EZ4D para cada uno de los individuos de las diez agregaciones. Las medidas
obtenidas se condensaron en una hoja de Excel y se usó el programa R para
analizar los datos Para obtener las correlaciones se usaron las mediciones de 232
individuos (28 juveniles y 204 adultos). Se determinó si los individuos eran juveniles
o adultos con base en su talla y se corroboró su clasificación con base en la
presencia o ausencia de gametos (ver punto c a continuación).
c) Madurez sexual y modos reproductivos
Para cada individuo se registró si éste presentaba alguna evidencia de reproducción
asexual, ya sea en pre-fragmentación, que es cuando el individuo tiene la parte
posterior del abdomen abruptamente adelgazada y con un tono más claro que el
resto del abdomen (Figura 13A-E), o en post-fragmentación, que es cuando el
individuo ya liberó el brote y tiene la particularidad de tener la zona de ruptura plana
(Figura 13F).
Para corroborar el estado de madurez y el sexo de cada ejemplar (hembra,
macho o hermafrodita) de las diez agregaciones, se hizo un corte longitudinal a lo
largo del cuerpo con una navaja para facilitar la búsqueda de gametos. Los
19
individuos de menor tamaño y sin gametos se consideraron juveniles, o bien
individuos sin gametos (adultos inmaduros). A los adultos que presentaban gametos
se les tomó una alícuota con una aguja y se observó al microscopio óptico Nikon
SMZ 745, principalmente para corroborar la presencia de espermatozoides, ya que
la de óvulos es evidente tan solo al abrir el ejemplar.
Se seleccionaron ejemplares adultos, juveniles y brotes de B. brunnea para
documentar a detalle la morfología externa con fotografía digital (cámara Cannon
S5 con adaptadores al microscopio estereoscópico Leica MZ75), los cuales se
tiñeron con Shirla Stain A, y posteriomente, fueron procesados para Microscopía
Electrónica de Barrido (ver técnica en el punto 5.3.3). Se registró el sitio donde
fueron encontrados los juveniles y se comparó la morfología de los juveniles
producidos sexualmente contra los brotes producidos por la vía asexual.
5.3.2 Distribución de gametos, morfología y gametogénesis
a) Distribución de los gametos y morfología
El corte longitudinal que se hizo a cada especimen permitió registrar la distribución
de los gametos a lo largo del cuerpo. La morfología y tamaño de los
espermatozoides se describió con base en observaciones al microscopio óptico y
corroborado con MEB (ver la técnica descrita en el punto 5.3.3). Los ovocitos se
analizaron con la
técnica histológica detallada a
continuación para la
gametogénesis.
b) Gametogénesis
Se fijaron 15 individuos pertenecientes a los acuarios de marzo (2014) con una
mezcla de alcohol, formol y ácido acético (solución Davidson) para evitar la
degradación y autolisis del tejido. Posteriormente, los tejidos fueron procesados
para cortes en paraplast en el Departamento de Biología Comparada de la Facultad
20
de Ciencias de la UNAM, mediante el proceso que se indica a continuación y que
se resume en la Tabla 1.
Se reemplazó el agua de los tejidos usando diferentes porcentajes de
alcoholes, que tienen por función endurecer y afirmar los constituyentes celulares.
Posteriormente, se realizó la aclaración con xilol, proceso que consiste en que el
tejido contenga un líquido que sea miscible con el alcohol al 100% y la parafina.
Después, se llevó a cabo la impregnación, donde el tejido se colocó tres veces en
parafina líquida regulada a la temperatura de 56-58°C, para favorecer una completa
sustitución del líquido intermediario por la parafina. La parafina líquida se vertió en
moldes y se solidificó a temperatura ambiente (Hewitson y Darby, 2010) Finalmente,
se realizaron los cortes seriados longitudinales de 7 μm de grosor con un microtomo
rotatorio Leica RM2125RT.
Se aplicó la técnica de tinción hematoxilina-eosina que tiñe de azul-violeta los
núcleos y las partes del citoplasma con una abundancia de retículo endoplásmico
rugoso. La eosina tiñe de rojo otras partes del citoplasma, así como muchos
componentes extracelulares fibrosos. El color azul-violeta se debe a la existencia
de regiones con carga negativa en el preparado (ácidos nucleicos, DNA, RNA),
debido a la basofilia que tiene el DNA y además se tiñen proteínas extracelulares
(Welsch, 2008; Cediel et al., 2009). Posteriormente, las muestras fueron montadas
con resina sintética en portaobjetos.
Cada una de las laminillas se observaron al microscopio óptico Nikon Eclipse
E600 para diferenciar cada uno de los estados reproductivos presentes en los
individuos. Posteriormente, se fotografiaron los estados reproductivos y la
distribución de los gametos. Asimismo, se midió el diámetro de 100 ovocitos.
Cada uno de los estados reproductivos fueron caracterizados con base en Bybee et
al. (2007):
21
•
Estado 1: no existe evidencia de actividad reproductiva en el celoma (no
puede ser determinado el sexo).
•
Estado 2: se observan estructuras de celomocitos en el celoma (el sexo no
puede ser determinado).
•
Estado 3: algunos gametos están presentes en el celoma (el sexo puede ser
determinado).
•
Estado 4: se observan paquetes densos de gametos dentro del celoma (el
sexo puede ser determinado).
5.3.3 Microscopía electrónica de barrido
Se procesaron muestras de ejemplares maduros sexualmente, maduros con
procesos de fisión, juveniles y brotes en regeneración previamente fijados en formol
al 10% para, con el uso del Microscopio Electrónico de Barrido (MEB), documentar
a detalle la morfología corporal externa, la distribución, tamaño y morfología de los
gametos, y los procesos regenerativos. El procesamiento de las muestras se realizó
en el Laboratorio de Microscopía Electrónica de Barrido de la Facultad de Ciencias,
UNAM y consistió en lo siguiente:
Los ejemplares sexualmente maduros fueron cortados longitudinalmente en
dos secciones con el propósito de determinar la distribución, el tamaño y la
morfología de los gametos. Estas secciones, así como los ejemplares juveniles, los
maduros con procesos de fisión y brotes en regeneración, fueron deshidratados con
dos cambios de etanol al 100%, y después fueron secados mediante la técnica del
punto crítico, que consistió en sustituir el líquido presente en la muestra por dióxido
de carbono, que luego se transformó en gas y se eliminó lentamente (Gomez de
Ferraris y Campos Muñoz, 2009).
22
Posteriormente, las muestras se montaron en portamuestras cubiertos con
cinta de platino; después se les hizo un recubrimiento de metalización con oro
(2000Å de espesor). Las muestras fueron observadas bajo MEB Cambridge 250 y
se obtuvieron fotografías digitales. Esta técnica se basa en la interacción de un haz
de electrones sobre la superficie del material. El haz realiza un barrido sobre la
superficie y al incidir en la misma, electrones secundarios son captados por un
detector dando lugar a una señal eléctrica que es ampliada y transmitida a un
monitor. Con la técnica de MEB se pueden observar superficies naturales o
artificiales de diferentes epitelios, células, fibras extracelulares, sustancias duras y,
órganos o animales enteros (Welsch, 2008).
5.3.4 Inducción del desove y fertilización
Se tomaron de 2 a 4 individuos por agregación y se les retiró el tubo cuidadosamente
a cada uno. Para inducir el desove se probaron tres métodos: el primero consistió
en realizar una pequeña incisión en la parte posterior del cuerpo para extraer los
ovocitos y esperma; en el segundo se colocaron organismos de manera individual
entre dos portaobjetos y se comprimieron; y en el tercero se utilizó una jeringa
ultrafina para hacer una ligera punción en la región abdominal. Del método más
viable para inducir el desove se tomaron muestras de gametos y se mezclaron en
un contenedor para inducir la fertilización.
EXPERIMENTACIÓN
Para los siguientes experimentos se usaron las agregaciones de septiembre (2014)
(n=4) y marzo (2015) (n=5). Todas las agregaciones se aclimataron durante 24
horas en el laboratorio antes de empezar cada uno de los experimentos evitando
algún estrés a priori.
23
5.3.5 Tasa de crecimiento y reconstrucción del tubo de B. brunnea
Se usaron 22 gusanos correspondientes a una sola agregación (septiembre 2014)
para determinar la tasa de crecimiento en B. brunnea. Para esto, cada tubo fue
desprendido de la agregación dejando a su respectivo gusano dentro del tubo
(Figura 4A-B). Los individuos fueron colocados en acuarios de recirculación de
cuatro litros de capacidad, a una temperatura entre 25 y 27ºC, salinidad de 35 ups
y fotoperiodo de 12 h con luz y 12 h en la oscuridad controlado con un temporizador.
Se alimentaron dos veces por semana con 6 ml de alimento KENT Marine microvert,
disuelto en 250 ml de agua marina. El experimento tuvo una duración de 72 días.
Dentro de este período, se seleccionaron dos organismos cada 5-7 días para medir
el aumento del tubo (Figura 4D). Con las mediciones registradas se obtuvo la
función lineal del crecimiento del tubo con el programa R.
Para documentar la reconstrucción de novo del tubo, se usaron 22 individuos
de otra agregación de septiembre (2014) a los que se les retiró cuidadosamente el
tubo: presionando con los dedos la parte basal del tubo y luego presionando
gradualmente hacia la parte media, hasta que el organismo saliera por completo por
la boca del tubo. Los individuos fueron colocados en acuarios de circulación con las
mismas condiciones descritas en el párrafo anterior. El experimento tuvo una
duración de 72 días. Dentro de este periodo, cada cinco días se seleccionaron dos
organismos, a los cuales se les midió y registró la parte del tubo reconstruido,
indicado en mm, y se fotografiaron con un microscopio Leica EZ4D (Figura 4E).
5.3.6 Descripción de la reproducción asexual por fisión natural en B. brunnea
Los 22 individuos utilizados en el punto 5.3.5 (tasa de crecimiento) fueron a su vez
empleados para describir la reproducción asexual. En un periodo de 72 días, cada
5-7 días se seleccionaron dos organismos, a los que se les retiró el tubo para
determinar los cambios morfológicos que pudieran ocurrir en el proceso de
reproducción asexual; se midieron y se fotografiaron las estructuras morfológicas
24
con un microscopio estereoscópico Leica EZ4D equipado con cámara integrada
(Figura 4E). Posteriormente, ambos individuos fueron colocados en viales
etiquetados y fijados con alcohol al 70%. Así, la descripción del fenómeno asexual
registrada en este estudio, está basada en datos puntuales de cada medición en
cada uno de los gusanos, es decir, no se le dio seguimiento a un solo gusano a lo
largo de su proceso de reproducción asexual, sino que se describen los cambios
morfológicos ocurridos al día en que cada individuo fue observado. Finalmente, se
elaboró una ilustración científica del proceso de reproducción asexual por fisión
natural.
Para los siguientes experimentos se usaron 96 gusanos de cuatro agregaciones de
marzo (2015). Los gusanos se dividieron en cuatro grupos o tratamientos (Figura
5).
5.3.7 Efecto del estrés en la adición de segmentos nuevos en B. brunnea
(Grupos I y II)
Grupo I: 24 individuos con tubo.
Grupo II: 24 individuos, a los que se les retiró el tubo presionando con los dedos la
parte basal del tubo, y luego presionando gradualmente hacia la parte media hasta
que el organismo saliera por completo por la boca del tubo.
Los grupos I y II se colocaron en ocho acuarios de cuatro litros de capacidad
con recirculación (Figura 6A, C), a una temperatura de 25 a 27ºC, salinidad de 35
ups y fotoperiodo de 8 horas con luz y 16 horas en la oscuridad. Se alimentaron dos
veces por semana con 6 ml de alimento KENT Marine microvert, disuelto en 250 ml
de agua marina. El arreglo de los individuos dentro de los acuarios para los grupos
I y II consistió de seis individuos por acuario (Figura 6B). Cada cinco a siete días se
revisaron dos individuos de cada grupo, durante un periodo de 79 días. Se evaluó
el efecto del estrés mediante un análisis de covarianza con el programa R.
25
5.3.8 Cambios morfológicos asociados a procesos regenerativos presentes en
los individuos producidos por mutilación (Grupos III y IV)
Grupo III: 24 individuos sin tubo, a los que se les realizó un corte transversal con
una navaja a la mitad del cuerpo para obtener dos partes: parte anterior y parte
posterior.
Grupo IV: 24 individuos sin tubo a los que se les aplicó un corte transversal en el
último cuarto del abdomen.
Para los grupos III y IV, se colocaron los dos fragmentos de cada individuo en
una caja Petri (Figura 7B). En total se utilizaron 48 cajas Petri y seis bandejas
(recipientes cuadrados de dos litros, de 38x29 cm). Los recipientes se mantuvieron
con agua de mar en recirculación con flujo reducido (Figura 4A), a una temperatura
de 26-27º C y 35 ups. Los individuos se alimentaron, dos veces por semana con 6
ml de alimento KENT Marine microvert, disuelto en 250 ml de agua marina. Cada
cinco a siete días se revisaron dos individuos fragmentados (su parte anterior y su
parte posterior) durante un periodo de 79 días, se registró el crecimiento y se
fotografió cada organismo en un microscopio Leica con cámara integrada (Figura
4D-E).
a) Análisis de supervivencia de todos los grupos
La supervivencia de los fragmentos se midió mediante el estimador no paramétrico
Kaplan-Meier, que estima la función de supervivencia en cada uno de los
experimentos y se basa en una cantidad de tiempo y en algún tipo de tratamiento
previo realizado al organismo (Goel et al., 2010). En este trabajo el tratamiento es
el corte realizado a los gusanos. Se obtiene mediante la fórmula y el resultado se
expresa en porcentaje:
=
.
−
.
.
26
6. RESULTADOS
6.1 Estructura de las agregaciones
Todos los tubos de B. brunnea se encontraron adheridos en su base al sustrato que
generalmente fue coral muerto o roca viva. La conformación de la agregación
propicia un hábitat para distintos filos: algas (Dictyota cf. linearis y D. cf. bartayresii),
crustáceos (cangrejo decorador), equinodermos (ofiuros), nemátodos, esponjas
incrustantes, poliquetos sílidos y micromoluscos (piramidélido, cerítido y turbínido).
De los micromoluscos se encontraron tres especies (Figura 8A-C) en las
agregaciones de marzo y septiembre (2014): seis individuos de la especie 1
(Odostomia (Eulimastoma) caniculata), tres de la especie 2 (Cerittium literatum) y
cuatro de la especie 3 (Turbo (Marmarostoma) castanea) cuyos tamaños variaron
entre 1 y 3 mm. Los nemátodos son comunes entre los sedimentos que cementan
los tubos, pero también se encontraron como endoparásitos de la cavidad celómica
en seis ejemplares adultos de B. brunnea (un parásito por sabélido), aunque se
desconoce su identidad por tratarse de estadios tempranos de desarrollo.
Las agregaciones de B. brunnea se conformaron por tubos flexibles
constituidos de partículas de arena fina (Figuras 1D, 10A). Éstos presentaron un
ancho de 1-2.8 mm, con una media de 1.74 ± 0.43 mm (n=80), y un alto de 2.5-6.5
mm, con media de 3.94 ± 0.77 mm (n=80). El número de individuos por agregación
fue variable independientemente de los meses de recolecta, encontrando el menor
número en la agregación VII (24 individuos) y el mayor en la agregación I (56
individuos) (Tabla 2).
La descripción morfológica y las medidas biométricas para adultos y juveniles fueron
las siguientes:
27
Adultos (Figura 9A-G, Tabla 3)
La corona branquial, estructura encargada de la respiración y alimentación, fue tan
larga como la longitud del cuerpo 12.45 ±3.13 mm (n=204; 5-20 mm) y cuenta con
24 radiolos ±2 (n=204; 18-28 radiolos) que están arreglados en dos semicírculos
(Figura 9G) y fusionados basalmente por una membrana palmada corta. El par de
radiolos más dorsales presentaron una saliente o extensión ancha en la parte basal,
tan larga como la membrana palmada. Las salientes o extensiones radiolares fueron
delgadas y se extienden a lo largo del radiolo, comenzando justo después de la
membrana palmada. Las pínulas más largas se localizaron a la mitad del radiolo.
Las puntas radiolares fueron largas y filiformes. Los labios dorsales fueron
triangulares y erectos (Figura 9G), y se extienden más allá de la membrana palmada
y presentan apéndices radiolares. Los labios ventrales fueron cortos, curvados. Los
sacos ventrales o sacos de arena, encargados del almacenamiento y selección de
partículas para la alimentación o construcción del tubo, se proyectaron por encima
de los lóbulos ventrales (Figura 9F). Los márgenes dorsales del collar no están
fusionados al surco fecal (Figura 9C). El anillo peristomial anterior está expuesto
dorsalmente (Figura 9C). Los márgenes laterales del collar están incisos (Figura
9C), formando así, dos lóbulos ventrales y dos dorsales. Los lóbulos ventrales,
encargados de moldear la boca del tubo, son triangulares y tienen el borde distal
redondeado (Figura 9A, F). El cojinete del collar está dividido longitudinalmente en
dos secciones, tiene forma de “w’’ y su naturaleza es glandular. Las setas del collar
(Figura 9B) fueron alargadas y presentaron limbos delgados, dispuestas en forma
de arco, y dentro de este arco hay setas tipo espina. La longitud del cuerpo fue de
18.7 ± 5.13 mm (n=204; 8-30 mm). El tórax presentó 12±1 segmentos (n=204; 7-15)
y midió 1.88 ± 0.38 mm de ancho (n=204;1-2.8 mm) (Figura 9D). Los cojinetes
ventrales fueron glandulares, de forma rectangular o ligeramente trapezoidal (Figura
9A). Los lóbulos torácicos notopodiales forman pequeños bultos (Figura 9B). Las
setas de la hilera superior fueron alargadas, con limbos delgados y dispuestas en
forma de arco; mientras que las setas de la hilera inferior son en forma de espina.
Los uncinos o ganchos torácicos son aviculares, presentaron varias hileras de
28
dientes pequeños sobre el diente principal, el pecho está bien desarrollado y el
manubrio fue de tamaño medio. Las setas acompañantes tienen una capucha
asimétrica que se adelgaza gradualmente hasta la punta. Las manchas u ojos
interramales son oscuras y pequeñas. El abdomen presentó 30±6 segmentos
(n=204; 13-49) (Figura 9D). Los lóbulos neuropodiales fueon cónicos y las setas
están dispuestas en un patrón en espiral apretado (Figura 9E), son alargadas, con
limbos muy delgados y también presentan setas tipo espina. Los uncinos
abdominales o ganchos fueron muy similares a los del tórax pero con un manubrio
corto. El pigidio fue bilobulado, presentó un epitelio glandular bien desarrollado y
ojos.
Juveniles (Figuras 10A-E, 11A-E, Tabla 3)
Los juveniles se encontraron dentro de sus propios tubos, adheridos a la base del
tubo de un adulto (Figura 10A) y poseen una apariencia muy similar a los adultos,
aunque pequeños (Figuras 10B-E, 11A-B). La corona branquial midió 7.3 ± 1.76 mm
(n=28; 3.5-11 mm) y presentó 21 ± 2 radiolos (n=28; 18-24 radiolos) y todas las
estructuras accesorias útiles en los procesos de alimentación, respiración y
construcción del tubo secundario: pínulas (Figura 11D), membrana palmada (Figura
11D), labios dorsales y ventrales, sacos de arena (Figura 10E, 11B). El cuerpo midió
9.25 ± 1.75 mm de largo (n=28; 6-12 mm), con un ancho a la altura del tórax de 1.2
± 0.5 mm (n=28; 0.5-2.5 mm). Presentaron 11 ± 1 (n=28; 9-14) segmentos torácicos
y 22 ± 5 (n=28; 12-32) segmentos abdominales (Tabla 3), claramente diferenciados
por la presencia del surco fecal (Figura 10C-D, 11A-C, E), así como notosetas y
neurosetas bien definidos tanto en el tórax como en el abdomen (Figuras 10D, 11C,
E).
Correlaciones
Todas las correlaciones mostraron valores positivos entre la talla y el estado de
madurez. El mayor valor de R2 para cada uno de los modelos ajustados de regresión
corresponde a la longitud total con respecto a la longitud de la corona branquial, con
una proporción de 0.652 (Figura 12B); mientras que el menor valor correspondió a
29
la longitud total y los segmentos torácicos 0.063 (Figura 12C). Finalmente, para la
longitud total con el ancho del tórax y los segmentos abdominales, las correlaciones
fueron de 0.367 y 0.295, respectivamente (Figura 12A, D).
De los 355 individuos muestreados, 53 fueron juveniles (14.92%) y 302 adultos
(85.07%). El número de adultos en las agregaciones varió entre 19 y 51, mientras
que el de juveniles varió entre 2 y 9 (Tabla 2). Se observaron dos modos de
reproducción: asexual por arquitomía y sexual (gonocorismo y hermafroditismo
simultáneo) como a continuación se describe:
Modo asexual por arquitomía (Figuras 13A-F, 14A-E, 15A-D, Tabla 4)
Incluye
individuos
con
pre-fragmentación
y
post-fragmentación.
La
pre-
fragmentación es cuando el individuo tiene la parte posterior del abdomen
abruptamente adelgazada y con un tono más claro que el resto del abdomen, lo que
sugiere estar próxima a ser liberada (Figura 13A-E). En la post-fragmentación, el
individuo parental ya liberó el brote (Figuras 13F, 10A).
Para el caso de la pre-fragmentación, la agregación X presentó la mayor
proporción (42.42%), mientras que la agregación VI el menor valor (14.81%), con
nueve individuos por agregación en promedio. Por otro lado, en la postfragmentación, la agregación IX obtuvo el mayor valor (53.33%) y el menor valor en
la agregación IV (9.09%), con un promedio de siete individuos que presentaron esta
particularidad por agregación (Tabla 4).
A su vez, la post-fragmentación presentó tres estados de regeneración:
1. Aquéllos brotes que se encontraron en una fase temprana posterior a la
fisión, sólo presentaron un blastema (masa diferenciada de células que
30
regenerarán partes del cuerpo) en la zona de abscisión (o de ruptura),
segmentos abdominales y pigidio (Figuras 13F, 14B, 15A-B).
2. Brotes con regeneración incompleta: presentaron coronas reminiscentes en
las que los radiolos son rudimentarios y variables, tanto en tamaño como en
desarrollo; las pínulas son cortas y en general, carecen de estructuras
accesorias para la alimentación (labios dorsales, ventrales), para la
construcción del tubo secundario (sacos de arena) y remodelado de la boca
del tubo (collar y lóbulos ventrales) (Figuras 14A, C-E, 15C). La mayoría no
formó segmentos torácicos, aunque aquellos brotes que los llegaron a
presentar, fueron en un número reducido (2-3 segmentos) y no presentaron
neurosetas (uncinos), en su lugar, presentaron otro setígero; es decir, dos
grupos de notosetas en el mismo segmento.
3. El estado más avanzado corresponde a la regeneración completa del brote y
su transformación en un estado juvenil. Su apariencia general es la de un
adulto, pero pequeño (Figura 15D). La corona branquial se ha completado
incluyendo todas sus estructuras accesorias; el tórax y el abdomen se han
diferenciado pero aún presentan 2 ó 3 segmentos en reorganización (Figura
15D); y el pigidio ha continuado la formación de segmentos nuevos. Estos
organismos se encontraron aún dentro del tubo parental, pero la presencia
de estructuras clave para la alimentación y para la construcción del tubo
sugieren que los juveniles estaban cerca de salir del tubo del parental,
construir su propio habitáculo y alimentarse.
Modo sexual (Figuras 16A-G, 17E, Tabla 4)
El modo sexual incluyó a machos (Figura 16C), hermafroditas simultáneos (Figura
16F) y hembras (Figura 17E). Del total de los 302 adultos examinados, 100 fueron
hembras (33.11%), 111 fueron machos (36.75%) y 69 fueron hermafroditas
simultáneos (22.84%).
31
La mayor proporción de hembras la presentó la agregación V (50%), mientras
que el menor valor lo presentó la agregación VII (16.66%), con un promedio total de
10 hembras por agregación. La mayor proporción de machos la presentó la
agregación VII (54.16%), mientras que el menor valor lo presentó la agregación V
(15.62%), con un promedio de 11 individuos por agregación. Los individuos
hermafroditas simultáneos presentaron el mayor valor en la agregación IV (32.43
%) y la menor proporción en la agregación IX (13.33%), con un promedio de siete
individuos por agregación (Tabla 4).
La comparación entre las diferencias de los juveniles producidos sexualmente vs
los brotes producidos asexualmente se muestran en la Tabla 5.
6.2 Distribución de gametos, morfología y gametogénesis
a) Distribución de los gametos y morfología (Figuras 16A-G, 17D)
En los cortes longitudinales realizados a los organismos adultos se observó que los
gametos tanto en hembras, machos y hermafroditas, se encontraron distribuidos en
los segmentos posteriores torácicos y en todos los segmentos abdominales,
particularmente en los mesenterios ventrales (Figuras 16A, D, 17D). Los ovocitos
presentaron un desarrollo asincrónico y se localizaron flotando libremente en el
celoma (Figura 16E). En el caso de los hermafroditas, ambos gametos,
espermatozoides y óvulos, se encontraron juntos, en los mismos segmentos (Figura
16F). Los espermatozoides se desarrollan en tétradas; los maduros tienen un
acrosoma pequeño y redondeado, núcleo esférico (3 μm), cuatro mitocondrias
esféricas y un flagelo notoriamente largo, tan largo como diez veces el diámetro del
núcleo (25-30 μm) (Figura 16C, G).
b) Gametogénesis (Figura 17A-F).
Únicamente fue posible determinar la ovogénesis mediante la técnica histológica y
de tinción con hematoxilina-eosina, ya que no se encontraron machos ni
32
hermafroditas en las muestras procesadas. La ovogénesis es extraovárica y los
estados de ovogénesis que se caracterizaron son los siguientes:
•
Estado 1: el celoma carece de células germinales o celomocitos (Figura 17A).
•
Estado 2: presenta racimos de células en previtelogénesis (celomocitos).
Durante esta etapa se observaron ovocitos con un núcleo largo
desproporcionado (Figura 13B-C).
•
Estado 3: presenta vitelogénesis notoria con un incremento en el volumen de
ovocitos (Figura 17D).
•
Estado 4: el celoma presenta ovocitos maduros con un diámetro variable de
60.97 ± 20 μm (n= 100, 22-98 μm) que se encuentran adyacentes a gotas de
lípidos y células germinales unidas exteriormente a los vasos sanguíneos
entre los septos intersegmentales (Figura 17E-F).
6.3 Inducción del desove y fertilización
Los métodos de incisión y de presión para inducir el desove no dieron resultado
favorable, contrario al método de punción, con el que sí se pudieron obtener
gametos (Figura 18A-B). La mayoría de los ejemplares que liberaron gametos con
este método resultaron machos y muy pocas fueron hembras. Los gametos
obtenidos se mezclaron en un contenedor, y posteriormente se observaron
gradualmente con ayuda de un microscopio óptico Nikon Eclipse Ci (Figura 18C),
pero no se logró la fertilización y en consecuencia, tampoco se obtuvieron larvas.
6.4 Tasa de crecimiento y reconstrucción del tubo de B. brunnea
La tasa de crecimiento del tubo de B. brunnea fue de 6-30 mm/79 días con una
media de 16.13 ± 7.42 mm (N=22) y una función lineal de y=0.2414x + 8.1068
(Figura 19). La parte nueva o añadida al tubo es fácilmente diferenciable del resto
por la coloración verde-parda, en contraste con la parte vieja que es color arena
(color en su ambiente natural) (Figura 20C).
33
La reconstrucción total del tubo, se presentó después de 24 horas de haber
retirado el tubo original (N=22). Las glándulas de los cojinetes ventrales secretan
moco con el que los gusanos forman un tubo primario compuesto únicamente por
moco en las primeras horas de experimentación. Posteriormente, los gusanos
comenzaron a canalizar y seleccionar las partículas suspendidas en el agua o de
sedimento con ayuda de los radiolos, pinulas y cilios, para utilizarlas después en la
cementación del tubo secundario, que culmina a las 24 horas. Los tubos
secundarios reconstruidos de novo presentaron un color verde-pardo debido a que
aparentemente, los individuos construyeron su tubo con sus propias excretas o con
partículas disponibles en la columna de agua de los sistemas a falta de arena del
medio natural (Figura 20B).
En la Figura 21 se ilustra de manera gráfica el proceso de fisión natural en B.
brunnea, que consiste en lo siguiente: en los primeros días del experimento (días 15), es notoria la formación de nuevos segmentos en el abdomen, siendo el
segmento adyacente al pigidio el más joven o recién formado. Al día 10, los
individuos añadieron cinco segmentos nuevos; ocho segmentos nuevos al día 18 y
12 al día 32 (Figura 22A). Conforme se fueron adicionando segmentos nuevos en
la parte posterior del cuerpo, el abdomen se fue adelgazando y tornando una
coloración más clara que la del resto del cuerpo (Figura 22B). Posteriormente, al día
59, la parte que contiene los nuevos segmentos adicionados (región posterior del
abdomen) se desprendió espontáneamente del resto del cuerpo. Este brote midió 5
mm y tuvo 27 segmentos abdominales (Figura 22C). Al día 72, este brote migró
hacia la parte posterior del tubo parental (Figura 22D) y la corona branquial comenzó
el proceso de regeneración, evidenciado por el desarrollo de radiolos pequeños
(Figura 22E). Los fragmentos nuevos son segmentos abdominales y no se observó
la reorganización de las setas.
34
6.6 Efecto del estrés en la adición de segmentos nuevos en B. brunnea
(Grupos I y II)
Se demostró mediante un valor de p< 0.05 que hubo un efecto significativo en el
tratamiento (con o sin tubo); es decir, que conforme pasa el tiempo al gusano que
se le aplicó el tratamiento (sin tubo) creció más rápido adicionando nuevos
segmentos, comparado con el gusano que permaneció en su tubo (Figura 23).
Además los gusanos sin tubo, presentaron un proceso de reproducción asexual
(arquitomía) para el día 32 y los gusanos con tubo hasta el día 59.
6.7 Cambios morfológicos asociados a procesos regenerativos presentes en
los individuos producidos por mutilación (Grupos III y IV)
Regeneración de la parte anterior (corona branquial y tórax)
Debido a la mortalidad de la parte posterior mutilada en ambos grupos, no se
observó la regeneración de la parte anterior. Esto se debe posiblemente, a que el
estrés del corte (mutilación) representa un gasto energético alto para el fragmento,
impidiéndole cicatrizar la herida, secretar moco suficiente para reconstruir el tubo
primario, y la posterior regeneración de estructuras faltantes.
Regeneración de la parte posterior (abdomen y pigidio)
Para la parte anterior mutilada, sí se observó la regeneración de la parte posterior:
en los tres primeros días después de que el cuerpo fue mutilado (corte) ocurrió la
cicatrización superficial de la herida (Figura 24A); al quinto día se presentó un pigidio
rudimentario (Figura 24B); entre el séptimo y décimo días la formación completa del
pigidio (Figura 24C); para el día 13 la formación de los primeros segmentos
posteriores (Figura 24E) y finalmente la adición de segmentos abdominales a partir
del 15 día, donde adquirió la apariencia de un individuo completo (Figura 24F).
a) Análisis de supervivencia con el estimador no paramétrico Kaplan-Meier
35
El grupo I (con tubo) presentó una supervivencia del 91.66%, el grupo II (sin tubo)
exhibió una supervivencia de 83.33 % (Figura 25A). En ambos grupos la alta
supervivencia fue resultado de que los gusanos no fueron sometidos al estrés del
corte (mutilación); sin embargo, en el grupo II la supervivencia fue menor porque el
gusano sí presentó estrés por no tener tubo, ya que este es la primera defensa o
barrera contra factores externos que lo ayudan a realizar sus actividades
fisiológicas.
En el grupo III, la parte posterior tuvo cero supervivencia, mientras que la parte
anterior dentro de los tres primeros días presentó una supervivencia de 58.33 %,
que disminuyó en los días 5 y 7 (24.9 % y 8.3%, respectivamente) y para el día 10
presentó un valor de cero (Figura 25B). El grupo IV, al igual que en el grupo anterior,
la parte posterior presentó cero supervivencia y la parte anterior en los primeros tres
días mostró un valor de 54.16 % de supervivencia, disminuyendo a un 4.16 % en el
día 10 y para el día 12 el valor fue de cero (Figura 25C).
En cuanto a los fragmentos posteriores de los grupos III y IV, se observó que
todos los fragmentos lograron cicatrizar la herida en los primeros días: a los cinco
días solo 14 (grupo III) y 10 (grupo IV) fragmentos lograron formar el blastema; al
séptimo día 6 (grupo III) y 5 fragmentos (grupo IV) formaron el pigidio; y, por último,
los primeros segmentos formados sólo se observan en 2 y 3 fragmentos (grupo III y
IV, respectivamente) (Figura 26).
36
7. DISCUSIÓN
7.1 Estructura de las agregaciones
Las agregaciones de B. brunnea se localizaron dentro de la laguna arrecifal que se
caracteriza por tener escombros de sustrato duro, parches de arena y praderas de
pastos marinos (Castro y Huber, 2003). Éstas reciben gran cantidad de luz debido
a la poca profundidad de la laguna y a que se encuentra protegida por la acción del
oleaje gracias a la barrera arrecifal. Estos factores hacen que la laguna arrecifal
funja como un sitio de alimentación, crianza y reproducción para distintos
organismos como es el caso de B. brunnea, así como macroalgas, anémonas,
equinodermos, anfípodos, tanaidáceos, larvas de peces y decápodos (CastellanosOsorio y Suárez-Morales, 1997; Trujillo-Luna y González-Vallejo, 2006; GonzalezMuñoz et al., 2012).
El tubo es una estructura protectora en los sabélidos y en B. brunnea se
encuentra expuesto totalmente, en contraste con otros sabélidos que habitan en
sustratos suaves, cuyos tubos se encuentra enterrados y protegidos por el
sedimento (Giangrande et al., 2014). Los tubos de B. brunnea son suaves y
flexibles, se inclinan según sea la dirección de la corriente de agua para con ello
favorecer la filtración de un número mayor de partículas de alimento. Este patrón se
ha observado en otras especies de Bispira, así como en especies de Sabella (Nicol,
1931) y Sabellastarte (Fitzsimons, 1965). En general, los tubos de los poliquetos
son importantes en la estabilización de los sedimentos. La estructura que forman es
un refugio para especies de tamaño pequeño y otros organismos sésiles (Merz,
2015). Además es un área de anclaje para distintos tipos de algas (Berke et al.,
2009).
En el género Bispira sólo se ha registrado la presencia de ectosimbiontes en
una especie: B. volutacornis, especie que vive en asociación con Gastrodelphys
37
clausii, un copépodo gastrodelfido que habita en la corona branquial del sabélido
(Nash y Keegan, 2006). En este estudio, se registran tres especies de moluscos
asociadas a los tubos de B. brunnea; dos de ellas epiobiontes (Ceritium litteratum y
Turbo (Marmarostoma) castanea) y una ectosimbionte (Odostomia (Eulimastoma)
caniculata). Esta última es remarcable porque pertenece a Pyramidellidae, una
familia de micromoluscos marinos caracterizada por ser ectoparásitos de poliquetos
sedentarios y de otros moluscos que se alimentan de los fluidos de sus hospederos
(Robertson y Mau-Lastovicka, 1979; Høisæter, 2014) como Crassostrea virginica
(Wilson et al., 1988), Chlamys hastata y C. rubia (Collin y Wise, 1997). Los
poliquetos
serpúlidos
y
sabeláridos
son huéspedes
comunes
de
estos
micromoluscos, siendo menos conocida la relación de éstos ectoparásitos
piramidélidos con sabélidos ya que únicamente se han registrado en Myxicola
infundibulum (Høisæter, 1989, 2014) y en este estudio en B. brunnea.
Como en B. brunnea, también se han registrado nemátodos dentro de los
tubos de B. bairdi (Arias et al., 2013); sin embargo, en este estudio se registra por
primera ocasión la presencia de nemátodos habitando la cavidad celómica de los
sabélidos (endoparásitos), pero como ocurre con los eulímidos, la identidad de la
especie de nemátodo endoparásito aún no es revelada. Actualmente, se conocen
nemátodos parásitos de bivalvos (Cáceres-Martínez y Vásquez-Yeomans, 2008) ,
parásitos de peces de agua salada de interés comercial (Cortés et al., 2009) y de
peces dulceacuícolas (Quiroz-Martinez y Salgado-Maldonado, 2013).
La morfología externa de B. brunnea es típica de la mayoría de los miembros de la
familia Sabellidae. Posee las estructuras básicas: corona branquial; cuerpo con
segmentos torácicos y abdominales, cada segmento equipado con setas y uncinos;
y pigidio. Respecto a la corona branquial, ésta actúa en el mecanismo de filtración
de partículas en suspensión, que son canalizadas como alimento o para la
construcción o re-construcción del tubo. Asimismo, ésta interfiere en el intercambio
38
respiratorio por medio de los radiolos o filamentos branquiales y las pínulas que
contienen (Giangrande, 1991). En B. brunnea, la corona es notoriamente larga,
siendo tan larga como la longitud del cuerpo y presenta una base que se encuentra
fuertemente adherida al peristomio, por lo que con rareza la especie libera la corona
como ocurre en muchos otros géneros de sabélidos que, al menor estímulo, liberan
la corona. En sabélidos que comparten estas características, el intercambio
respiratorio en la corona es alto (80%), distinto a los gusanos que pierden la corona
fácilmente en los que, debido a factores de estrés, suplen la respiración mediante
la pared del cuerpo (Sander, 1976; Giangrande et al., 2014). En consecuencia, en
B. brunnea la corona branquial es una estructura importante para la alimentación y
respiración, y debería tomarse en cuenta en el diseño de protocolos de cultivo de la
especie.
En cada uno de los segmentos del cuerpo se ubican las setas y uncinos,
siendo importantes en el movimiento peristáltico del cuerpo de los sabélidos dentro
del tubo, así como en el anclaje de los mismos, y éstas son reemplazadas
continuamente durante la vida del gusano (Merz y Woodin, 2006; Kobalsova et al.,
2014). Los movimientos del sabélido dentro del tubo permiten el intercambio de
agua, y con este, la expulsión de gametos y heces fecales fuera del tubo.
Bispira brunnea es un sabélido de talla mediana, cuyos individuos adultos
miden 8-30 mm. Una especie gregaria y de similar talla es B. bairdi, que posee un
tamaño entre 6-25 mm (Tovar-Hernández et al., 2011). En comparación,
Pseudopotamilla reniformis y S. pavonina son especies de talla grande; la primera
mide entre 50 a 70 mm (Kobalsova et al., 2013), y la segunda entre 150-200 mm
(Murray et al., 2011).
El comprender cómo es la morfología de cualquier especie (en estados juvenil
y adulto), y en qué es empleada cada estructura, así como sus rasgos biométricos,
resulta imprescindible cuando se pretende inducir su reproducción en cautiverio.
39
Así, los datos proporcionados de B. brunnea en este estudio, constituyen un pilar
fundamental para cualquier método de reproducción que se proponga hacer con la
especie.
Modo asexual
La arquitomía es el tipo de reproducción asexual más común en poliquetos que,
involucra la fragmentación del gusano seguida de una regeneración anterior y/o
posterior de cada uno de los nuevos individuos (David y Williams, 2011). Durante el
presente trabajo, individuos de B. brunnea se encontraron en un estado de prefragmentación o de post-fragmentación, resultado del proceso de arquitomía. Este
fenómeno reproductivo ocurre también y en un alto porcentaje en los sabélidos
Pseudobranchiomma schizogenica y en Pseudopotamilla reniformis (82 % y 95 %,
respectivamente) (Tovar-Hernández y Dean, 2014; Kolbasova et al., 2013) Mención
aparte merecen los géneros de serpúlidos Filograna y Salmacina que se reproducen
asexualmente, pero éstos a partir del proceso de paratomía, mediante la liberación
de un sola cría completamente formada desde la parte posterior del individuo
parental (Pernet, 2001).
La fisión natural en B. brunnea, seguida de la regeneración de las partes
faltantes, ha sido registrada también por lo menos en 14 especies de sabélidos
(Tovar-Hernández y Dean, 2014), pero en la mayoría de ellas (excepto en P.
reniformis por Kolbalsova et al. 2013), la reproducción asexual ha sido descrita
pobremente debido a la presencia de pocos brotes entre las muestras, que con
frecuencia pasan desapercibidos cuando se extraen los gusanos parentales de sus
tubos para ser propiamente identificados. En estudios realizados con anterioridad,
la reproducción sexual se presenta en ambientes favorables y bajo condiciones
estables, mientras que la reproducción asexual se ve favorecida en escenarios
inestables (Kobalsova et al., 2013); o bien, para evitar altas tasas de depredación y
mortalidad en estadios larvarios (Gambi et al., 2000); sin embargo, la información
40
es aún escasa sobre la relación que existe entre la reproducción asexual y el medio
físico.
Modo sexual
En este estudio se observaron machos y hembras de B. brunnea en una proporción
similar, y también hermafroditas simultáneos, presentando este último un porcentaje
de 22.84 %. Por otro lado, la especie hermana Bispira volutacornis no es
hermafrodita y se registró como una especie dioica (Nash y Keegan, 2003). En este
sentido, se puede argumentar que incluso dentro del mismo género, especies
hermanas poseen características reproductivas distintas entre sí, o inclusive abrir la
posibilidad de que B. volutacornis presente hermafroditismo, pero que no fue
detectado en el estudio de Nash y Keegan (2003). En contraste, en Branchiomma
bairdi el hermafroditismo simultáneo es más común en la población (93%) y se
presenta a lo largo del año, diferente a Sabellastarte spectabilis que posee
hermafroditismo secuencial (85%) y el 15% de la población posee ambos tipos de
gametos. También se tiene conocimiento de que la especie Branchiomma
luctuosum presenta hermafroditismo simultáneo (Licciano et al., 2002).
El hermafroditismo es poco conocido dentro de la familia Sabellidae, siendo el
hermafroditismo simultáneo el más común, exhibiendo dos tipos: El primero, con
gametos femeninos y masculinos encontrados juntos en los mismos segmentos
como en B. brunnea y en los géneros Branchiomma y Sabellastarte. El segundo,
con los gametos femeninos en unos segmentos y los masculinos en otros
segmentos, como ocurre en los géneros Perkinsiana, Laonome y Amphiglena
(Rouse y Fitzhugh, 1994).
Gregarismo
Bispira brunnea se caracteriza por ser una especie gregaria, patrón que
posiblemente es resultado del establecimiento gregario de las larvas, que ocurre
cerca o en la base de los tubos de adultos de la misma especie (conespecíficos),
41
como ocurre en los serpúlidos Hydroides dianthus e H. elegans. En el caso de esos
serpúlidos, las larvas reconocen una señal química soluble en el agua que está
asociada con los conespecíficos de una agregación (Toonen y Pawlik, 2001).
Aunque en este estudio no se determinó el asentamiento larvario de B. brunnea, se
demostró que los miembros de una sola agregación de esta especie experimentan
reproducción sexual (hermafroditas y gonocóricos) y asexual (fisión natural) al
mismo tiempo, por lo que la combinación de ambos modos reproductivos
determinan el comportamiento gregario como registraron (Nishi y Nishira, 1994) y
Kobalsova et al., (2013) para otras especies de poliquetos tubícolas.
De acuerdo con Toonen y Pawlik (1994), el establecimiento gregario es una
ventaja en los adultos, porque asegura un mayor éxito reproductivo; sin embargo,
la competencia intraespecífica aumenta. En B. brunnea, esta competencia entre los
miembros de una agregación podría ser por alimento o por espacio. Por otro lado,
la reproducción por fisión natural (asexual) produce clones, por lo que la presencia
de individuos sexuales en B. brunnea deviene importante para el intercambio
genético de las poblaciones. Finalmente, la presencia de hermafroditas simultáneos
en B. brunnea también es una ventaja para la especie cuando el número de
hembras o de machos, o su proporción, no garantice la reproducción.
7.2 Estadios de madurez sexual y la morfología de los gametos
a) Morfología y distribución de los gametos
De acuerdo con Rouse y Fitzhugh (1994) existen tres tipos de distribución de los
gametos en la familia Sabellidae, se pueden encontrar en los segmentos
abdominales, en segmentos torácicos y abdominales o pueden estar delimitados de
la mitad del cuerpo a la parte posterior en los segmentos torácicos. En B. brunnea
los gametos se encuentran ubicados en los segmentos torácicos posteriores y en
todos los segmentos abdominales, al igual que en B. luctuosum (Licciano et al.,
2002) y B. bairdi (Tovar-Hernández et al., 2009). En contraste, en S. spectabilis y S.
pavonina los gametos se presentan sólo en los segmentos abdominales (Bybee et
42
al., 2007); Murray et al., 2011), y en B. volutacornis los gametos se ubican
principalmente en todo los segmentos del cuerpo pero muy pocos en la región
torácica (Nash y Keegan, 2003).
Los ovocitos de B. brunnea son asincrónicos, lo que permite una reproducción
continua, aunque probablemente estacional, como en P. schizogenica (TovarHernández y Dean, 2014), S. spectabilis (Bybee et al., 2007), B. bairdi (TovarHernández et al., 2009), S. pavonina (Murray et al., 2011) y S. spallanzanii (Currie
et al., 2000). En el trabajo de Eckelbarger (2006) se menciona que el desarrollo del
ovario es similar entre las familias de la clase Polychaeta, pero el lugar, el número
y la complejidad estructural son variables inclusive dentro de especies hermanas.
En contraparte, la morfología del espermatozoide y la espermatogénesis son
altamente diversas dentro de la familia Sabellidae (Simon y Rouse, 2005).
De manera general, la espermatogénesis ocurre en tétradas de espermátidas
desarrollándose sincrónicamente. Las espermátidas forman racimos sinciciales
unidos por un citóforo central, con un número de células por racimo que van desde
cuatro a cientos de células (Schroeder y Hermans, 1975; Rouse y Fitzhugh, 1994).
Para el caso de algunos sabélidos y serpúlidos los espermatozoides son lanzados
en el agua, percibidos por la hembra y almacenados en espermatecas o en las
células epidérmicas
(Rouse, 1999) .Sin embargo, B. brunnea no presenta
espermateca y la fertilización tendría que ocurrir necesariamente en la columna de
agua (fertilización externa).
Franzén (1956) planteó que el espermatozoide que tiene un acrosoma simple,
un núcleo esférico, un reducido número de mitocondrias y un flagelo libre están
relacionados con una fertilización externa. Con base en lo anterior, el análisis de
Rouse (1999) propone que las especies que tienen un núcleo esférico y un
acrosoma pequeño presentan fertilización externa, mientras que aquellas con un
acrosoma alargado e incubación de la larva, presentan fertilización interna.
43
Teniendo esto en consideración, las características que muestra el espermatozoide
de B. brunnea (núcleo esférico y acrosoma pequeño y redondeado), así como el de
las especies S. pavonina (Murray et al., 2011) y S. spallanzanii (Currie et al., 2000),
refuerzan la correlación existente entre este tipo de espermatozoides y la
fertilización externa en la columna de agua.
b) Gametogénesis
De acuerdo con Giese y Pearse (1974) dos hipótesis se postularon para explicar el
control de la gametogénesis. Primero, el intrínseco: regulado por factores
endógenos, como la acumulación de nutrientes y la interacción entre hormonas y
segundo, el extrínseco: mediante variaciones ambientales. Respecto a este último,
se ha documentado que la reproducción está sincronizada con factores ambientales
con el fin de maximizar el éxito de la fertilización y/o la supervivencia de las crías
(Mercier y Hamel, 2009).
En este estudio sólo se registró el desarrollo de la ovogénesis en B. brunnea
sin determinar los factores que la regulan. En la clase Polychaeta la mayoría de las
especies tienen bien delimitados los ovarios pero el número, la complejidad
estructural e inclusive la posición cambian de una familia a otra, frecuentemente se
ubican en los parapodios o en la región ventral del cuerpo (Eckelbarger, 2006). En
la familia Sabellidae, la ovogénesis es extraovárica, donde los ovocitos
previtelogénicos son liberados desde el ovario al fluido celómico para finalizar la
vitelogénesis (Eckelbarger, 2005) lo cual ha sido corroborado en S. spallanzanii
(Giangrande et al., 2000), B. volutacornis (Nash y Keegan, 2003), S. spectabilis
(Bybee et al., 2006b) y B. brunnea, pero el estudio de la ovogénesis solamente se
ha documentado para el 0.3 % de las especies de poliquetos actualmente descritas
(Giangrande, 1997; Eckelbarger, 2006), Así, la información proporcionada aquí
sobre B. brunnea contribuye a reforzar el conocimiento en la familia.
44
En cuanto al diámetro de los ovocitos, en B. brunnea variaron de 22 a 98 μm
y son asincrónicos, al igual que en las especies P. schizogenica (25-70 μm) (TovarHernández y Dean, 2014), S. spectabilis con un diámetro de seis a más de 10 μm
(Bybee et al., 2007), B. bairdi con un mínimo de 7.5 μm y máximo de 110 μm (TovarHernández et al., 2009), S. pavonina entre 20 y 350 μm de diámetro (Murray et al.,
2011) y en S. spallanzanii van de 20 a 200 μm de diámetro (Currie et al., 2000).
Destaca el hecho de que en la única especie del género Bispira (B. volutacornis)
con información reproductiva (además de la especie motivo de este estudio), los
ovocitos no son asincrónicos, todos presentan el mismo estado de desarrollo, y su
diámetro es de 20 μm (Nash y Keegan, 2003).
En poliquetos, cuando los ovocitos son menores a 180 μm de diámetro el
desarrollo es indirecto, cuando son mayores a 180 μm de diámetro se tiene un
desarrollo directo sin estados larvales (Hermans y Schroeder, 1975). A pesar de
que en este trabajo no se pudo observar la larva se podría estipular que en B.
brunnea se presenta un desarrollo indirecto por el tamaño de su ovocito (22-98 μm);
sin embargo, en los sabélidos no existe una relación definida entre el tamaño del
huevo y el modo reproductivo (Giangrande, 1997).
7.3 Inducción del desove
La prueba realizada evidenció que la punción es el método más eficaz para inducir
la liberación de los gametos en B. brunnea. En Sabellastarte spectabilis la ablación
en la parte posterior del gusano fue exitosa para obtener gametos (Bybee et al.,
2007); en Branchiomma bairdi la presión y la incisión en el abdomen (TovarHernández et al., 2011); y, en el serpúlido Spirobranchus tetracerus la incisión
dorsal en la pared del cuerpo para obtener los gametos (Selim et al., 2005).
No obstante, cuando se pretenden aplicar alguno de estos métodos en diseños
experimentales para lograr la fertilización y estadios larvarios, se debe tener en
cuenta el modo reproductivo de la especie, ya que es variable. Cuando sólo hay
45
hembras y machos, el diseño resultaría más simple, pero cuando en una población
existen hembras, machos y hermafroditas simultáneos como en B. bairdi, se deben
tomar en cuenta otros factores porque: 1) morfológicamente es imposible distinguir
sexos; 2) en la práctica la probabilidad de encontrar hembras, machos o
hermafroditas maduros, es muy variable; 3) el tiempo empleado en retirar el tubo de
cada gusano, realizar la punción, observar al microscopio si son gametos maduros
y después combinarlos es elevado, por lo que el número de muestras y número de
personas que pueden hacer esta actividad deben concentrarse en el diseño
experimental, con la finalidad de obtener los mejores resultados y tener éxito al
momento de realizar la fecundación de los gametos.
7.4 Tasa de crecimiento y construcción del tubo de B. brunnea
Para la construcción de novo del tubo es necesario que el organismo produzca
moco, ya que con este el gusano construye el tubo primario que posteriormente
servirá de base para cementar las partículas del tubo secundario. Las células
glandulares presentes en los cojinetes ventrales de los sabélidos, son las
responsables de la producción del moco que recubre la epidermis (Mastrodonato et
al., 2006). En el ambiente natural, el moco secretado por los gusanos es mezclado
con sedimentos de diferente textura tomados de la columna de agua y excretas
(Giangrande et al., 2014).
En Sabella pavonina, Sabellastarte magnifica y en B. brunnea, los labios
dorsales y ventrales interfieren en la canalización de partículas hacia la boca y/o
hacía los sacos ventrales (sacos de arena), donde éstos son almacenados para
después ser usados para reparar o construir el tubo (Nicol, 1931; Bonar, 1972). En
condiciones de laboratorio, el tubo reconstruido de B. brunnea tiene un color verdepardo, lo cual puede deberse a la mezcla de las propias excretas de la especie a
falta de arena de su medio natural.
46
El reciente avance en el conocimiento, permitirá que otros estudios empleen
arena de colores atractivos en el cultivo de la especie, para con ello incrementar su
demanda en el mercado, como ha ocurrido con otros invertebrados y roca viva en
los acuarios tipo “mini-reefs”, que han incrementado su venta y popularidad debido
a su amplia diversidad de colores y formas ((Wabnitz et al., 2003; Murray et al.,
2012). El uso de la arena también podría servir para estudiar el efecto de
condiciones de cultivo en el crecimiento de la especie, indicado por los anillos de
crecimiento en el tubo (bandas de color alternadas).
En la familia Sabellidae, el moco no sólo está involucrado en la construcción
del tubo, sino también en la absorción de metabolitos que consisten principalmente
de polisacáridos y proteínas (Giangrande et al., 2014), e inclusive es necesario para
que ocurra la fertilización (Tovar-Hernández et al., 2011; Stabili et al., 2009). Se ha
registrado que los cnidarios sésiles, igualmente secretan moco que usan para cubrir
la superficie del disco oral, al mismo tiempo que funciona para captar el alimento y
hacer una limpieza superficial (Tibdall, 1984). De manera general, la producción de
moco involucra una pérdida de energía, tal es el caso de la liberación del moco en
los corales, que consumen más del 50% de energía en producirlo (Wild et al., 2004)
En general, se espera que los sabélidos reconstruyan rápidamente su tubo por
ser organismos sedentarios, obligados a contar con una estructura protectora como
lo es el tubo para ellos. En el trabajo de Shah et al. (2014) se comprobó que el tubo
le brinda al sabelárido Chaetopterus sp., una estructura estable en un ambiente
sujeto a fuerte oleaje y con un amplio rango de temperatura, presentando un rápido
crecimiento y capacidad de reparación del tubo, por lo que el tubo funciona contra
estresores ambientales, e inclusive frente a ataques de microorganismos patógenos
(Stabili et al., 2014).
Con respecto al crecimiento del tubo, en un estudio realizado con dos especies
de serpúlidos, Galeolaria hystrix y Spirobranchus carniferus, se encontró que en un
año crecieron de 2.5-6.6 cm y 0.4-3.4 cm, respectivamente (Riedi y Smith, 2014) ,
47
mientras que en B. brunnea, el tubo creció en 79 días 0.6-3 cm. En los serpúlidos el
carbonato de calcio es secretado en la abertura del tubo por un par de glándulas
ubicadas en el peristomio ventral, y el material orgánico es producido por el epitelio
en el escudo ventral. La tendencia es que cuando los gusanos son grandes, las
glándulas secretoras de calcio son de mayor tamaño y por lo tanto tienen mayor
capacidad de producción de carbonato de calcio (Riedi, 2012), los sabélidos
construyen el tubo con la arena disponible del medio natural y cuentan con
glándulas secretoras en los cojinetes ventrales y en zonas aisladas a lo largo del
cuerpo (Merz, 2015).
en condiciones de laboratorio
Los sabélidos gregarios B. brunnea, P. reniformis y P. schizogenica presentan el
proceso de arquitomía. Dentro de los tubos de las dos últimas especies se registró
la presencia de 3-4 fragmentos liberados del cuerpo parental, que después
regenerarán las partes faltantes (Kobalsova et al., 2013; Tovar-Hernández y Dean,
2014); es decir, un sólo individuo parental de estas especies es capaz de producir
varios fragmentos originados asexualmente uno detrás de otro (en cadena pero sin
estar unidos). En contraste, B. brunnea únicamente presenta un fragmento dentro
del tubo del organismo parental y en la parte posterior del mismo, con un tamaño
de 3.5-6 mm, lo que demuestra que la especie libera un brote de manera asexual a
la vez (no uno de trás de otro).
En lo que respecta a cómo los brotes nuevos generados asexualmente salen
del tubo del organismo parental, el trabajo realizado con serpúlidos de Pernet (2001)
explica que los adultos forman una ventana de escape de material calcáreo
depositado alrededor del margen del tubo, lo que permite la salida del brote cuando
alcanza cierto tamaño. Lo anterior puede deberse a que cuando el brote produce
sus propias hormonas el adulto forma la ventana de escape o bien, que la formación
del brote y de la ventana sucedan al mismo tiempo. En B. brunnea no se logró
48
observar cómo emerge el nuevo brote del tubo parental debido a la duración del
experimento y al período en el que éstos fueron revisados.
Las condiciones de laboratorio de temperatura, cantidad de alimento, salinidad
y fotoperiodo en las que se logró documentar la reproducción asexual de B. brunnea
fueron lo más parecidas a las de su entorno natural. Estos resultados pueden ser
útiles para establecer un protocolo de mantenimiento de agregaciones de B.
brunnea y generar una continua reproducción asexual por fisión natural, como se
ha hecho en algunas especies de espiónidos como Amphipolydora vestalis,
Dipolydora caullery, Dipolydora socialis y Pygospio elegans bajo condiciones de
laboratorio (David y Williams, 2011).
La vía de reproducción asexual puede ser ventajosa para el sector industrial
debido a que generalmente se presenta un cuello de botella en los estados larvales
y también en los factores que inducen o regulan el establecimiento de la larva en
los invertebrados. Además puede ayudar a proyectos que no cuenten con la
infraestructura y tecnología especializadas en reproducción de invertebrados
marinos con fines de ornato; sin embargo, la reproducción asexual es una vía que
debe tratarse con cautela ya que a la larga reduce la variación genética de la
especie.
7.6 Efecto del estrés en la adición de segmentos nuevos en B. brunnea y
cambios morfológicos asociados a procesos regenerativos presentes en los
individuos producidos por mutilación (corte)
La regeneración es un proceso importante debido a su papel en la recuperación
después de una lesión, así como en la reproducción asexual por arquitomía (David
y Williams, 2011). La regeneración se inicia en respuesta a una herida que amputa
una parte del cuerpo (Bely y Nyberg, 2009), y dependiendo de la frecuencia de la
lesión y la capacidad de regeneración deviene la supervivencia del individuo
49
(Lindsay et al., 2007; 2008) En este sentido, la regeneración puede ser sensible a
diferentes factores abióticos y es un buen marcador de estrés (Pires et al., 2015)
como el que se registró en B. brunnea al retirar el tubo de los gusanos: se
documentó un número de segmentos regenerados mayor que los gusanos que
conservaron su tubo.
La información obtenida en este estudio ofrece un panorama en el que al
exponer al organismo a un estrés (retirarle el tubo) y sin mutilarlo, se puede obtener
un mayor número de segmentos y nuevos brotes producidos asexualmente en
menos días, lo que posiblemente disminuiría el gasto energético provocado por la
pérdida de tejido (Lindsay et al., 2008).
Regeneración de la parte anterior (corona branquial y tórax)
En este estudio, la regeneración de la parte anterior no se observó en B. brunnea,
ya que los fragmentos murieron. En los sabélidos, la mortalidad de la región
posterior después de la amputación parece estar relacionada con la remoción de la
corona branquial. Trabajos previos suponen que la supervivencia del gusano
depende de la importancia de esta estructura para llevar a cabo el intercambio
gaseoso para la respiración (Licciano et al. 2012, 2015). Es posible que en B.
brunnea la irrigación a través del cuerpo no proporcione la suficiente respiración
para sobrevivir sin la estructura de la corona, por ejemplo se tiene conocimiento de
que en la especie Eudystilia vancouveri la corona branquial provee el 80% del total
de intercambio gaseoso en la respiración (Giangrande, 1991).
Asimismo, Bely (2006) mencionó que en sabélidos, si los gusanos son
cortados en el tórax y en el abdomen, la parte del abdomen logra sanar la herida
pero los gusanos no completan la regeneración de la corona branquial y
eventualmente mueren de hambre, como se observó para la especie Myxicola
infundibulum, pero en un estudio reciente se identificó que esta especie si logra
regenerar con éxito la corona branquial (Licciano et al., 2015). De igual manera se
50
puede observar que en otros sabélidos: P. reniformis, S. spallanzanii y B. luctuosum,
en los primeros 10 días se da la formación de los lóbulos branquiales rudimentarios
(Licciano et al. 2012, Kobalsova et al. 2013) y por ejemplo, para el día número 80 la
especie P. reniformis posee una corona branquial totalmente formada.
No obstante es importante realizar un estudio enfocado en los requerimientos
respiratorios de B. brunnea y también es necesario considerar la cantidad de
reserva energética disponible en el gusano, como puede ser el glicógeno, lípidos y
triglicéridos ya que estos son útiles para llevar a cabo la regeneración y otros
procesos bioquímicos y fisiológicos. En este sentido un estudio relacionado con la
cantidad de reserva energética, podría esclarecer la capacidad o incapacidad de la
especie para regenerar la parte anterior. Otro tipo de trabajos ya han evaluado las
reservas de energía en el organismo, como el de Freitas et al. (2015) para el onúfido
Diopatra neapolitana y el de Yáñez-Rivera y Méndez-Ubach (2014) para el
anfinómido Eurythoe sp.
Regeneración de la parte posterior (abdomen y pigidio)
En lo que respecta a la regeneración de la parte posterior, como respuesta a un
fenómeno de mutilación, se sabe que es común en los sabélidos (Licciano et al.,
2015). Bispira brunnea regeneró con éxito los segmentos posteriores: 15 días
después de la mutilación el gusano alcanzó la apariencia de un individuo completo,
al igual que las especies Bispira melanostigma, Branchiomma luctuosum, Myxicola
aesthetica, Pseudopotamilla reniformis, Sabella pavonina y Sabella spallanzanii,
que también recuperan su forma original después de sufrir mutilación (Licciano et
al., 2015).
La supervivencia de las partes anteriores, puede estar relacionada con el
hecho de que mantienen la corona branquial la cual como ya se mencionó
anteriormente, es importante para el intercambio respiratorio y la alimentación.
Asimismo, la regeneración de los segmentos posteriores no involucra la
diferenciación de tejido o un proceso de epimorfosis, como sucede en la
51
regeneración de la estructura de la corona (Licciano et al., 2012; Murray et al.,
2013); es decir, sólo se da la formación del pigidio y la adición de nuevos segmentos
(Hill et al., 1993) mediante el proceso de morfolaxis. Inclusive se puede argumentar
que si las reservas energéticas disponibles en el organismo fueran bajas los
gusanos podrían sobrevivir gracias a que poseen la corona branquial y con esto
lograrían regenerar los segmentos posteriores.
Cambios morfológicos
En cuanto a los cambios morfológicos asociados a procesos regenerativos, se ha
documentado que en los sabélidos, dentro de las primeras 24 horas, la herida
superficial es cubierta con epidermis y, esta fase inicial de cicatrización resulta de
la migración celular. Posteriormente, se restaura el pigidio y se da la adición de
nuevos segmentos posteriores (Hill et al., 1993). En el caso de B. brunnea, después
de realizar el corte en la región abdominal, la cicatrización superficial de la herida
se observó en el quinto día así como la formación de un pigidio rudimentario, en
comparación con las especies S. pavonina y Sabellastarte sp. , en las que este
proceso se registró en el séptimo día (Murray et al., 2013) y en P. reniformes entre
los días ocho y diez (Kobalsova et al., 2013).
Con base en la literatura, en B. brunnea se presentó el proceso de morfolaxis;
es decir, ocurre la remodelación de las estructuras pre-existentes. En consecuencia
los primeros segmentos posteriores en B. brunnea no se observaron hasta el día
13, en relación con P. reniformis registrados en el día 20 (Kobalsova et al., 2013) y
en S. pavonina en el día 21. La apariencia de un adulto completo en S. pavonina se
presenta para el día 28 (Murray et al., 2013), en 20 días para P. reniformis y en B.
brunnea en el día 15, cuando el organismo ya posee un tracto digestivo completo y,
puede efectuar la actividad de alimentación, por tener el pigidio y ano
completamente formados.
52
Este estudio no se enfocó en examinar con detalle el tipo de proceso,
morfolaxis o la epimorfosis, que presentó la regeneración, es decir, sólo se
realizaron observaciones hipotéticas sobre los cambios en las estructuras externas.
Más adelante se podría efectuar un análisis dirigido en marcadores moleculares
para tener una mejor comprensión de la regeneración en B. brunnea como el
realizado para el oligoqueto Pristina leydi (Bely y Wray, 2001).
53
8. Conclusión
La información obtenida del sabélido B. brunnea refuerza el conocimiento previo de
la especie sobre aspectos de biología reproductiva básica que a su vez, sirvió para
implementar de un método experimental adecuado para reproducir a la especie en
cautiverio, ofreciendo al mercado ornamental otra alternativa. Esa alternativa versa
en el uso del potencial de la especie para reproducirse asexualmente, así como el
de regeneración. Esas cualidades en combinación con la sencillez de la técnica
empleada en este estudio, así como su bajo costo y viabilidad, permiten proponer
la vía asexual para reproducir a la especie con fines comerciales.
Para futuras investigaciones resta conocer el ciclo larval de la especie, así
como los factores o señales involucrados en el desove, la fertilización, el
establecimiento y desarrollo de la larva. Por lo que se podrán realizar experimentos
que involucren ambos tipos de reproducción (asexual y sexual) y que ayuden a
ampliar el conocimiento sobre la biología reproductiva no solo de esta especie, sino
que puedan ser aplicables y útiles para otras especies de sabélidos poliquetos.
54
9. Referencias
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61
10. Anexos
Tabla 1. Procesamiento de tejidos para cortes en paraplast. Modificado de CampuzanoCaballero, 2010.
Deshidratación con alcoholes graduales:
1. Alcohol 50%
2. Alcohol 70%
Temperatura ambiente
3. Alcohol 80%
4. Alcohol 96%
5. Alcohol 100%-Xilol
Aclaración:
6. Xilol
Inclusión en paraplast:
7. Paraplast-Xilol
Temperatura 56-58ºC
8. Paraplast I
9. Paraplast II
62
Tabla 2. Agregaciones correspondientes a octubre (2013), febrero (2014) y marzo (2014),
cada una con el número total de juveniles y adultos.
Número de
agregación
Mes de colecta
Número de
juveniles
Número de
adultos
Número total de
individuos
I
octubre 2013
5
51
56
II
octubre 2013
4
30
34
III
octubre 2013
4
26
30
IV
octubre 2013
4
33
37
V
octubre 2013
5
27
32
VI
febrero 2014
2
27
29
VII
febrero 2014
5
19
24
VIII
febrero 2014
7
26
33
IX
marzo 2014
9
30
39
X
marzo 2014
8
33
41
53
302
355
Total
Tabla 3. Morfometría de juveniles y adultos. Se indica el rango, la media y la desviación
estándar para cada medida.
Juveniles (n=28)
Adultos (n=204)
Longitud de la corona
3.5-11 mm
7.30 ± 1.76 mm
5-20 mm
12.45 ± 3.13 mm
Número de radiolos
18-24 radiolos
21 ± 2.27 radiolos
18-28 radiolos
23.56 ± 2.37 radiolos
Largo del cuerpo (del tórax al
pigidio)
6-12 mm
9.25 ± 1.75 mm
8-30 mm
18.73 ± 5.13 mm
Ancho del tórax
0.5-2.5 mm
1.20 ± 0.50 mm
1-2.8 mm
1.88 ± 0.38 mm
Tórax (# segmentos)
9-14 segmentos
11.14 ± 1.17 segmentos
7-15 segmentos
Abdomen (# segmentos)
12-32 segmentos
13-49 segmentos
Medición
63
Tabla 4. Modos reproductivos de B. brunnea. *La proporción mostrada incluye a individuos
que presentan fisión (ya sea pre o post-fragmentación) y que al mismo tiempo presentan
gametos (sexualmente reproductivos).
Agregación
Número
de
individuos
Proporción
de
juveniles
Proporción de individuos sexualmente
reproductivos
Proporción de individuos
reproduciéndose asexualmente*
Hembras
Machos
Hermafroditas
Prefragmentación
Postfragmentación
I
56
8.92%
28.57%
44.64%
17.85%
15.68%
11.76%
II
34
11.76%
29.41%
20.58%
8.82%
36.66%
26.66%
III
30
13.36%
20%
36.66%
30%
34.61%
19.23%
IV
37
10.81%
35.13%
21.62%
32.43%
39.39%
9.09%
V
32
15.62%
50%
15.62%
18.75%
18.51%
11.11%
VI
29
6.89%
17.24%
44.82%
31.03%
14.81%
14.81%
VII
24
20.83%
16.66%
54.16%
8.33%
31.57%
31.57%
VIII
33
21.21%
30.76%
46.15%
23.07%
26.92%
46.15%
IX
39
23.07%
26.66 %
20%
13.33%
30%
53.33%
X
41
19.51%
42.42%
33.33%
24.24%
42.42%
27.27%
Promedio
35.5
5.3
10
11.1
6.9
8.6
7.2
Desviación
estándar
±8.75
±2.11
±4.46
±5.68
±3.24
±3.30
±4.18
64
Tabla 5. Diferencias entre juveniles producidos sexualmente vs brotes producidos
asexualmente en las primeras etapas de desarrollo
Modo sexual
Modo asexual
Lugar dónde se
encontraron
Dentro de sus propios tubos,
adheridos a la base de la
agregación
Dentro del tubo del organismo
parental
Apariencia general
Como adultos, excepto por la talla
(pequeños, enanos)
Gusanos o fragmentos anormales
Corona branquial
Completa: con radiolos, pínulas,
labios dorsales y ventrales bien
desarrollados
Sin corona o reminiscente: radiolos
rudimentarios, variables en tamaño y
en desarrollo. Algunos con pínulas
cortas. Sin labios dorsales o
ventrales
Segmentos torácicos
Cada uno con notosetas (setas) y
neurosetas (uncinos), excepto en
el segmento del collar, donde, de
manera general en Sabellidae,
sólo hay notosetas
Principalmente carecen de ellos,
aunque algunos presentan un
número reducido de segmentos
torácicos. En el último caso, los
segmentos no presentan neurosetas
(uncinos), en su lugar presentan otro
setígero; es decir, dos grupos de
notosetas en el mismo segmento
65
Figura 1. Agregaciones de B. brunnea en el Caribe mexicano. A, D) Variedad blanca. B-C)
Variedad bandeada. Fotografías: Humberto Bahena-Basave.
66
.
Figura 2. Estructuras generales de un sabélido. Modificado de Tovar-Hernández, 2009
67
Figura 3. Mapa de Majahual, Q. Roo. Modificado de González-Muñoz et al., 2012
Figura 4. Fotografías del proceso para la tasa de crecimiento, reconstrucción del tubo y
descripción de la reproducción asexual (fisión espontánea) en B. brunnea. A) Agregaciones
en acuarios de cuatro litros en sistemas de recirculación. B) Gusanos separados de las
agregaciones. C) Acomodo de los gusanos dentro de los acuarios. D-E) Medición individual
de los gusanos y observación bajo microscopio estereoscópico.
68
Figura 5. Esquema del experimento de regeneración en B. brunnea. Grupo I: Individuo con
tubo; Grupo II: individuo sin tubo; Grupo III: individuo sin tubo, con corte transversal en la
región media del cuerpo: parte anterior y posterior; Grupo IV: individuo sin tubo, con corte
transversal en la región posterior del cuerpo: parte anterior y abdomen posterior.
Figura 6. Efecto del estrés en B. brunnea (arreglo de los grupos I y II). A) Sistema de
acuarios individuales de cuatro litros en recirculación. B) Arreglo de cada uno de los grupos
dentro de los acuarios, grupo I con seis individuos con tubo por acuario; grupo II con seis
individuos sin tubo, por acuario. C) Acomodo de los gusanos en el acuario. D-E) Revisión
de cada uno de los gusanos y observación bajo el microscopio estereoscópico
69
Figura 7. Cambios morfológicos asociados a procesos regenerativos en B. brunnea. A)
Recipientes con agua de mar en recirculación y poco flujo a 26 º C de temperatura y 35 ups.
B) Arreglo de los grupos III y IV: cada caja Petri contiene un individuo fragmentado en parte
anterior y parte posterior. En el grupo III el corte es a la mitad; en el grupo IV el corte es en
los últimos segmentos del abdomen. En total se utilizaron 48 cajas petri en seis bandejas.
Figura 8. Especies de moluscos eulímidos asociadas a las agregaciones de B. brunnea. A)
Odostomia (Eulimastoma) caniculata, B) Cerittium literatum, C) Turbo (Marmarostoma)
castanea. Barras de escalas: 1 mm.
70
Figura 9. Adultos de B. brunnea con fotografía digital. A) Collar y segmentos torácicos en
vista ventral. B) Collar y segmentos torácicos en vista lateral. C) Collar y segmentos
torácicos en vista dorsal. D) Transición del tórax y abdomen en vista lateral. E) Distribución
de las setas en el abdomen. F) Collar en vista ventral mostrando los sacos de arena. G)
Base de la corona branquial y labios dorsales señalados con flechas.
71
Figura 10. Juveniles de B. brunnea con fotografía digital. A) Ubicación de un juvenil en la
base de la agregación, adherido al tubo de un adulto. B) Juveniles de diferente talla. C, E)
Juveniles en vista ventral. D) Juvenil en vista lateral. Las líneas transversales en C-E
muestran la división entre el tórax y el abdomen. Los juveniles en B-E fueron teñidos con
Shirla Stain A.
72
Figura 11. Juveniles de B. brunnea con microscopía electrónica de barrido. A) Vista dorsal
del gusano completo. B) Vista ventral del gusano completo. C) Vista lateral del tórax y
abdomen. D) Corona branquial. E) Tórax y segmentos abdominales anteriores. Barras de
escalas: A-E) 100 μm. Líneas diagonales continuas en A-C, E indican la transición entre el
tórax y el abdomen
73
.
Figura 12. Coeficiente de determinación (R2) de los rasgos biométricos de B. brunnea. A)
Longitud total del cuerpo con ancho del tórax. B) Longitud total del cuerpo con longitud de
la corona branquial. C) Longitud total del cuerpo con segmentos torácicos. D) Longitud total
del cuerpo con segmentos abdominales. En cada uno de los rasgos biométricos se ajustó
una curva potencial
74
Figura 13. Reproducción asexual en B. brunnea con fotografía digital. A-E) Prefragmentación: adelgazamiento abrupto indicado con flechas y atenuación del color en la
región posterior del gusano. F) Post-fragmentación: el individuo parental liberó el brote
quedando la zona de ruptura plana.
75
Figura 14. Brotes de B. brunnea producidos asexualmente con fotografía digital. A)
Organismo parental y brote, encontrados ambos dentro del mismo tubo. B) Brote postfragmentación extraído dentro del mismo tubo que el parental en estado de regeneración
1. C-E) Diferentes vistas de un brote en estado de regeneración 2. Abreviación: cv) cojinete
ventral.
76
Figura 15. Juveniles de B. brunnea producidos por fisión espontánea y subsecuente
regeneración con microscopía electrónica de barrido. A) Fragmento abdominal separado
naturalmente del progenitor (estado de regeneración 1). B) Detalle de la zona de ruptura.
C) Juvenil extraído del tubo parental (estado de regeneración 2). D) Regeneración completa
(estado de regeneración 3). Barras de escalas: A-B) 100 μm, C-D) 1 mm. Abreviación: cv)
cojinete ventral. En D las líneas diagonales semi-continuas muestran la reorganización de
los segmentos entre el tórax y el abdomen, y en números, se indican los segmentos
torácicos.
77
Figura 16.Distribución y morfología de gametos de B. brunnea con microscopía electrónica
de barrido. A) Sección longitudinal de un macho en el abdomen posterior mostrando el
celoma lleno de tejido espermático. B) Detalle de tejido espermático extraído de A. C)
Espermatozoides. D) Sección longitudinal del abdomen de un hermafrodita mostrando los
paquetes de gametos dentro del celoma. E) Gametos femeninos en los septos
intersegmentales. F) Óvulos y espermatozoides de un hermafrodita simultáneo. G) Detalle
de óvulos y espermatozoides de un hermafrodita. Barras de escalas: A) 300 μm, B) 20 μm,
C) 2 μm, D) 1 mm, E) 100 μm, F) 20 μm, G) 10 μm.
78
Figura 17. Cortes histológicos que muestran la ovogénesis en B. brunnea. A) Estado 1:
celoma sin células germinales o gametos. B-C) Estado 2: previtelogénesis, primeras células
germinales presentes en el celoma. D) Estado 3: vitelogénesis con un incremento en el
número de ovocitos en el celoma. E-F) Estado 4: ovocitos con un núcleo definido y células
germinales en el celoma. En A y D se incluye el plano de corte, donde: A indica la zona
anterior y P la zona posterior, d la zona dorsal y v la zona ventral. Las flechas en E apuntan
señalan los ovocitos en distinto grado de desarrollo.
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Figura 18. Método mecánico de punción. A) Desove de una hembra. B) Desove de un macho. C)
Observación bajo microscopio óptico Nikon Eclipse Ci. La flecha en A y B señalan los ovocitos y los
espermatozoides, respectivamente.
Figura 19. Gráfica de crecimiento del tubo de B. brunnea durante un periodo de 79 días
realizada con el programa R. Se hizo un ajuste lineal y se obtuvo la función para el
crecimiento.
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Figura 20. Crecimiento y reconstrucción del tubo de B. brunnea. A) Agregación mostrando
los tubos de color arena en su ambiente natural. B) Reconstrucción completa del tubo en
cautiverio, color verde-pardo. C) Crecimiento del tubo en condiciones de cautiverio, zona
adelgazada verde-pardo.
Figura 21. Ilustración del proceso de la reproducción asexual por fisión natural en B.
brunnea. Elaborada por Alberto Guerra
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Figura 22. Reproducción asexual por fisión natural en B. brunnea. A) Crecimiento de los
segmentos abdominales posteriores. B) Adelgazamiento del abdomen para liberar el brote.
C-D) Liberación y migración del brote hacia la parte posterior del tubo parental. E) Nuevo
brote con corona reminiscente.
Figura 23. Gráfica del efecto del tratamiento (con tubo y sin tubo) en B. brunnea sobre la
adición de nuevos segmentos en el tiempo.
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Figura 24. Regeneración de los segmentos posteriores en B. brunnea. A) Cicatrización de
la herida superficial indicada con la flecha. B) Formación de un pigidio rudimentario indicado
con la flecha. C-D) Formación completa del pigidio y los primeros segmentos abdominales.
E) Segmentos abdominales (gusano sin tubo). F) Crecimiento del gusano mediante la
adición de nuevos segmentos.
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Figura 25. Gráficas de supervivencia en B. brunnea. A) Supervivencia de grupo I (con tubo)
y grupo II (sin tubo). B) Supervivencia del grupo III: segmentos anteriores (parte posterior).
C) Supervivencia del grupo IV: segmentos anteriores (parte posterior).
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Figura 26. Gráfica de supervivencia de los fragmentos posteriores de los grupos III y IV. Se
observa que al paso del tiempo el número de fragmentos vivos disminuye, posterior al día
10 todos los fragmentos se mueren.
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Cartel presentado en el IV Simposio Latinoamericano de Polychaeta 2015.
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Biología reproductiva del plumero de mar Bispira brunnea

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