Biotecnología de Plantas - Biología Molecular y Bioquímica

Biotecnología de Plantas - Biología Molecular y Bioquímica

Biotecnología de Plantas
Desafíos para la expresión de genes introducidos
1. Importancia del promotor y elementos enhancers
2. Hay dos factores principales que determina si los
genes se expresan en el momento y cantidad
adecuadas
a) Un gen debe ser introducido en todas las células y
ser estabble para la transferencia a su
descendencia:
i. El promotor debe ser reconocido y bien
regulado o siempre activo. Un promotor fuerte
que se usa de manera rutinario es el promotor
del virus del mosaico de la colifor (CaMV 35S) y
el promotor de la Rubisco, regulada por luz
ii. Se debe suministrar terminación y señal de
poliadenilación
iii. Se pueden necesitar secuencias que dirija la
proteína a un orgánulo determinado
b) Uso de codones:
i. Los genes necesitan especificar aminoácidos que
coincida con los tRNA y grupos de aminoácidos de
la planta
ii. Los genes se pueden modificar para que contenga
los codones adecuados (ingeniería de codones)
Dinero que mueve la Ingeniería Genética
• Inversión global estimada alrededor de
20.000 millones de euros
• 2/3 consiste en inversión privada
• Un estudio industrial estimó el mercado
potencial para productos biotecnológicos en
278.000 millones de euros en 2005
Hindmarsh et al. 1998
DESARROLLO DE TECNOLOGÍA DE
DNA RECOMBINANTE
• Aislar genes
• Manipular el diseño
• Integrar el DNA recombinante en las células
de la planta
• regenerar un planta completa
PARA LA MEJORA POR INGENIERÍA GENÉTICA
SE NECESITA.....
1.
Conocer los procesos que controlan la característica a
mejorar
2.
Identificar especies o variedades que contienen los genes
de interés (cualquier especie)
3.
Aislar el gen
4.
Organizar el gen para que se exprese en el lugar y modo
adecuado
5.
Que la proteína (si la hay) sea funcional
6.
Transformar plantas y seleccionar transformantes que
expresen la proteína a niveles suficientes
7.
Rezar......
DESARROLLO DE TECNOLOGÍA DE
DNA RECOMBINANTE
• CONFERIR CARACTERÍSTICAS DESEADAS DE MANERA
PRECISA
•
CRUZAR BARRERAS DE ESPECIES
•
CREAR NUEVAS COMBINACIONES DNA
•
INTRODUCIR SÓLO EL GEN DE INTERÉS
Expresar un gen..
PROMOTOR
GEN
TRANSFORMAR PLANTAS
Promotores: regulación
PROMOTOR
RNA polimerasa
PROMOTOR
GEN
transcripción
GEN
Promotores
•Promotores fuertes
GEN
•Promotores débiles
GEN
•Promotores específicos de tejidos
GEN
DesarrollosBiotecnológicos
GMOs - Organismos Geneticamente modificados
• GMO - Un organismo que expresa caracteres que resultan
de la introducción de DNA extraño
• También llamado organismo transgénico
Términos importantes
• Mejora
 Gen beneficioso añadido de misma especie
 Gen añadido por cruces dentro de especies
Source: USDA
• Transformación
 Gene beneficioso de otra especie
 Gen añadido por ingeniería genetica
Source: USDA
Aclaremos conceptos
• Mejora clásica ≠ Biotecnología
 Mejora sólo intercambia genes dentro de especies
Sólo en especies afines
 PERO no es lo mismo que biotecnología
• Biotecnología añade características que no son disponibles en
estas especies
 Soja no tiene un gen que degrada Roundup
 El gen viene de Bacteria
Cruce interespecífico
Wheat
Rye
X
Triticale
Nueva especie, pero NO
un producto
biotecnológico
Biotecnología Vegetal
•Tradicional
Mejora clásica
Recombinante
Técnicas de DNA
http://www.insp.mx/xcongreso/ponencias/5
Los resultados de mejora clásica son
buenos per muy lentos…
corn
cob
teosinte
John Doebley photo
Tomate silvestre
(Lycopersicon pimpinellifolium )
D= 1 cm
www.quirkyworks.com/design/ Samples/plant-breeding.jpg
híbridos
(heterosis)
Mutagénesis: Nuevo caracter sin un nuevo Gen
 Mutagénesis cambian la secuencia de un gen
 Nuevas, características interesantes se pueden obtener
Tratemiento de Mutagénesis
Gen Normal
susceptible
ATTCGA
Gen resistente
mutante
ATTGGA
El mercado de cosechas biotecnológica está
dominado por cinco Países
6%
4 mha
63%
43 mha
21%
14 mha
3%
3 mha
3%
3 mha
Estos países suponen el 98% del mercado
15 % de incremento en cultivo biotec en 2003
a2003
growing season data. http://www.isaaa.org/Press_release/Briefs30-2003/press/b30_english.htm
Productos de Biotecnología bacteriano y animal
Source: Chr. Hansen
Biotecnología chymosin
 enzyma usado en productos lácteos
 gen de levaduras
 obtenidos de bacterias GE
 reemplaza el enzima del hígado
bST (aomatotropina bovina)
Source: Rent Mother Nature
 incrementa la producción de la leche
 gen de la vaca
 protein harvested from GE bacteria
 replaces cow protein originally
harvested from pituitary glands
of slaughtered cows
Cultivo de tejidos de plantas y
aplicaciones
Cultivo de tejido de plantas
Se define como el cultivo de partes de plantas en
condiciones estériles tales como órganos,
embriones, semillas, y células en medio líquido o
solidificado
Células diferenciadas se pueden cultivar in vitro para
generar plantas enteras, con el uso de una
pequeña cantidad de material
Tejido meristemático (células en crecimiento) se usa
para crecer plantas con flores, y es libre de virus,
aspecto importante en la propagación de plantas
Los pasos básicos de cultivo de plantas son:
a) Remover una pieza de tejido de una planta,
denominado un explanto.
b) Coloca un explanto en un medio nutritivo para forzar a
las células del explando convertirse en indiferenciadas
y formas un callo: Desdiferenciación.
c) El tejido que forma el callo se transfiere a otro medio
nutritivo que permite si diferenciación en un tejido:
Rediferenciación.
d) La planta se transfiere a sustrato.
La capacidad de una célula vegetal a producir una planta
completa se llama Totipotencia.
Hay 6 tipos de cultivo in vitro que pueden crear una planta completa:
a) Cutivo de callo – cultivo de un tejido desdiferenciado de un
explanto que se desdiferencia
b) Cultivo celular – cultivo de células o agregado de células
(pequeño grupo de células) en cultivo líquido
c) Cultivo de protoplasto – cultivo de células vegetales que
tienen sus paredes celulares quitadas
d) Cultivo de embriones – cultivo de embriones aislados
e) Cultivo de semillas – cultivo de semillas para generar plantas
completas
f)
Cultivo de órganos – Cultivo de órganos de plantas aislados
como anteras, raíces, tallos, yemas etc.
B.
Micropropragación
1. Plantas de interés se clonan a través de un proceso
de cultivo in vitro denominado “propagación clonal in
vitro” o micropropagación
2. Forma parte de una industria muy importante puesto
que tiene el potencial de crear muchas más plantas a
partir de un material inicial (por ejemplo olivos)
Hay 4 etapas en la micropropagación:
Etapa 1 – Iniciación de un explanto estéril, esterilización de
la superficie del tejido para prevenir contaminación, y
tranferencia de explantos a un medio nutritivo.
Etapa 2 – Iniciación del tallo, que es la multiplicación del
tejido del tallo a partir de explantos en un segundo tipo
de medio nutritivo.
Etapa 3 – Iniciación de raíz, que es la multiplicación de un
tejido de raíz de explantos en medio nutritivo.
Etapa 4 – Transferencia de las plantas a un medio estéril u
otro sustrato bajo condiciones controlas para crecer
plantas completas.
Nutrientes como vitaminas, sacarosa, y hormonas vegetales pueden
controlar el cultivo del tejido. Por ejemplo alterando las cantidades de
las hormonas auxinas y citoquinicas induce multiples tallos para formar
un cultivo.
Embriones somáticos (embriogénesis somática)
a) Produce estructura embrion-like llamados embrioides de tejidos de
plantas.
b) Hormonas como auxinas afecta el desarrollo normal y forma embrioides
de tejidos “normales”.
c) Los callos también se pueden usar, cambiando las hormonas para inducir
la formación de embriones, y cada embrioide puede formar una nueva
planta.
d) También se pueden producir en cultivo líquido, usando células
individuales o tejido de plantas:
i. Las paredes celulares se degradan con enzimas para formar
protoplastos.
ii. Se regenera la pared celular, comienza la división celular, y se forma
agragaciones celulares.
iii. Las agragaciones celulares se cultivan en un medio sólido para formar
tallos y raíces.
e) Este es el método preferido para produccióna gran escala, usando
bioreactores para producir millones de embrioides.
f)
Embrioides también se pueden empaquetar como semillas artificiales, que
se encapsulan para la distribución y se protegen con un complejo de agar
y otros geles.
Productos químicos de plantas
a) Metabolitos primarios y secundarios son útiles para las
plantas para funcionar como protección de mamíferos,
insectos, y patógenos. Muchos de estos compuestos son
usados en medicina y alimentación.
b) Más del 25% de los productos farmacéuticos en Europa
vienen de plantas y el 75% de la población mundial dependen
de medicina obtenida de hierbas
c) En muchos casos el desarrollo de una droga comienza con la
identificación de una hierba medicinal ampliamente usada
normalmente por indígenas. Es compuesto químico (principio
activo) es aislado, sintetizado químicamente y testado en
ensayos clínicos.
Cultivo celular:
i. Produce compuestos químicos sin la necesidad de usar
plantas tropicales y subtropicales para crecer plantas
completas, que pueden dañar el medio ambiente
ii. Puede producir mayoras cantidades de metabolitos que
plantas completas en condiciones controladas como un
bioreactor
iii. Shikonina, un producto químico que se usa en muchas
cremas, cosmétidos y tintes se ha producido en grandes
bioreactores que producen entre 1.5 y 4.0 gramos de
shikonina por litro de cultivo
iv. Muchos procesos de producción requieren mucho tiempo
(hasta 10 años) y costa mucho desarrollar, por lo tanto las
ventas deben amortizar los costes
v. Los genes se pueden introducir en plantas de manera que
permita a las células de plantas producir metabolitos qye no
producen normalmente
vi. Puede ser perjudicial para países en desarrollo, que se
basa en la extracción de metabolitos de plantas en lugar
que producirlos
Otros usos del cultivo de tejido
1. Fusion de protoplastos
a) Protoplastos se generan por digestión de la
pared celular
b) Dos protoplastos de dos especies no
relacionadas se fusionan por productos
químicos o electroporación
c) El material genético se mezcla junto, y las
células híbridas se criban buscando
caracteres de interés
Variación somaclonal
a) La variabilidad genética producida por cultivo de tejidos. Esta
variabilidad puede ser explotada para mejora características
de cosechas y plantas ornamentales, tales como maíz, trigo,
cebada, y patata
b) Caracteres tales como tolerancia a sal y metales pesados,
resistencia a insectos, y mejora de la calidad de semilla se
puede generar por un proceso de selección
c) La variabilidad genética se produce por cambios en el
número cromosómico debido a reorganizaciones
cromosómicas, amplificación génica, y la activación de
transposones. Como resultado, planta hijas difieren de
parentales. El manteniemiento de caracteres deseables es
esencial
Colecciones de Germoplasma
a) El material genético de una planta, que puede contener
características importantes e incrementar el valor de una
planta, como resultado de mayor tolerancia a sequía y plagas
b) Germoplasma antiguo se usa para introducir nuevos
caracteres tales como resistencia a enfermedades en plantas
actuales
c) El germoplasma va desapareciendo debido a la perdida de
cultivo tradicional, eliminaciónd de viejos cultivos, y el uso de
plantas modernas en lugar de plantas antiguas
d) Banco de genes
Introducir genes en plantas
1) Infectar células de plntas con plásmidos como
vectores que llevan el gen de interés
2) Disparar balas microscópicas que contienen en su
superficie el gen directamente a la célula
Ingeniería genética de plantas
Transformación de plantas y Agrobacterium tumefaciens.
1. Una bactería común de suelo que causa tumor en
agalla
2. La bacteria entra por lugares donde la planta ha sido
dañada
3. La bacteria tiene un plásmido llamado “plasmido Ti”
que contiene genes llamados “genes vir (virulencia)”
que codifica una proteína que transfiere una región
del plásmido llamado “T-DNA” a células donde se pa
producido el daño
4. Una vez que las células vegetales son infectadas,
las hormonas vegetales estumula el crecimiento de
las células tumorales
5. El T-DNA ha sido construido de manera que tiene los
genes vir eliminados, de manera que el DNA extraño
puede ser insertado en genoma de plantas,
transformando la misma
6. Un método de transformación general:
a) Células de un disco de hoja, plántulas, o yemas, y
protoplastos reciben el DNA y las células crecen
b) Se usa un medio de selección de aquellas células
con el nuevo caracter
c) Las células transformadas se cultivan en un medio
sólido para formar un callo
d) Las hormonas son modificadas para promover la
formación de tallos y raíces
e) Se examinan las plantas modificadas para determinar
si se expresa el gen introducido
Agrobacterium
･ Bacteria patogena de plantas
･ Causa enfermedad crown
gall
･ Plasmido Ti en cepas patogenas
･ T-DNA transferido a celulas de la
T-DNA
planta
Plasmido Ti
El ingeniero de la naturaleza:
Agrobacterium tumefaciens
Ingenería genética de plantas con
Agrobacterium tumefaciens
• A. tumefaciens: usado
rutinariamente.
• Contiene T-DNA
(plásmido bacteriano)
• Los genes se integran en
el DNA bacteriano
cuando se transfiere el TDNA
Inducción del tumor
por A. tumefaciens
El tumor de A.tumefaciens puede ser
grandecito…
Biología de A. tumefaciens
Bién conocido que produce el tumor de agalla
A.tumefaciens es una
bacteria que vive en el
suelo (en la rizosfera)
donde usa nutrientes que
provienen de las raíces
Infecta a través de heridas
son atraídas
quimiostáticamente a ellas
www-genvagar.slu.se/teknik/ djup/plasm.htm
T-plasmido bacteriano produce
receptores para actosiringona
Daño en plantas produce
acetosiringone
Las bases de ingeniería genética
mediada por Agrobacterium
• T-DNA de A. tumefaciens se excinde e integra en el
genoma de plantas como parte de una infección natura
• Cualquier DNA insertado en el T-DNA será también
integrado
Genes importantes condificados por
el plásmido Ti
1. Citoquininas
(hormona vegetal esencial en división celular y crecimiento
tumoral)
2. Enzimas para la síntesis de ácido indolacético (auxina)
Hormona vegetal (induce elongación de tallo y hoja, induce partenocarpia y previene
envejecimiento)
3. Enzimas implicadas en síntesis y liberación de metabolitos
de plantas: las opinas
(derivados de aminoácidos)
las grocinopinas (derivados fosforilados de azúcares)
Nopaline
Opinas y agrocinopinas son NUTRIENTES de A.tumefacies.
No puden ser usados por otras especies bacterianas
Proporciona un nicho único para A .tumefaciens
Cytoquininas son hormonas vegetales
derivadas de la purina adenina
Zeatina es una de de las citoquininas cuya
síntesis puede ser codificada por el
plásmido Ti
Aislada del maíz
Expresión específica celular de citoquinica
en célula infectada por A.tumefaciens
Opinas son nutrientes que se usan para
detectarse entre bacterias
Las células de plantas comienzan a secretar
Las opinas
del T-DNA bacteriano transferido
opina difunde en células de alrededor y
sirve como moléculas señal para la
conjugación de Agrobacterium
(Quorum sensing)
Plásmido Ti
Región
T-DNA
Genes que
producen
tumor
Catabolismo de Opinas
Region
Vir (virulencia)
ORI
DNA entre bordes
L y R es
Transferido a una
planta como
ssDNA
Genes codificados
por el T-DNA se
pueden sustituir
por otros genes
Vectores basados en plásmidos
Ti
Sistemas binarios
Vectores co-integrativos
Necesita 3 vectores
Necesita 2 vectores:
Plásmido Ti desarmado
Con gen de interés
(sin genes vir)
Vector helper
para infección
(con genes vir)
Forma
plásmido co-integrado
después de
recombinación
homóloga sobre T-DNA
Plámido con el Ti desarmado
capáz de infectar
Vector intermedio
Con región T-DNA y el gen
de interés
(trasferido por conjugación)
Vector helper Para
trasferencia del plásmido
intermedio al Agro
Vectores co-integrativos
(plásmido ti híbridos)
Ráramente
usados
DESVENTAJAS:
1) Se requiere mucha homología entre plásmido Ti y plásmido de E. coli (vectores
intermedios basados en pBR322) lo que hace que sean dificil de construir y usar
2) Transferencia ineficiente comparados con vectores binarios
Vectores binarios
Región T DNA eliminada
Gen de interés
Marcador de selección
en planta
Marcador de selección
en bacteria
Disarmed
Ti
plasmid
ori para E.coli
Región de
Virulencia
ori para A. tumefaciens
Plásmido
HELPER
ori para Agro
DESVENTAJA: Según la orientación, los plásmidos con dos orígenes de replicación
pueden ser inestables en E. coli
VENTAJA: Se usan vectores pequeños, lo que incrementa la eficiencia de transferencia
de E. coli a Agrobacterium.
No se requiere recombinación intermolecular
Promotores usados para la expresión
en plantas transgénicas
35S, promotor del virus del mosaico de la coliflor CaMV
CaMV es un genoma circular de doble
cadena dsDNA
CaMV 35S es un promotor muy fuerte
(constitutivo o ectópico) que es activo en la
mayoría de tejidos de dicotiledoneas
Pasos en la creación de una planta transgénica
1. Los dos plásmidos se transfieren a Agrobacterium
2. Un cultivo vegetal se infecta con el Agro
3. Productos de los genes Vir escinden el T-DNA y lo transfieren
al cromosoma de la planta
L-Border
Polilinker
Gen de resistencia a Kan
Gen de interés
4. Selección de células transformadas en Kan
5. Confirmar la presencia del transgen por PCR
6. Una planta completa se puede crecer de células
transformadas !!!
R-Border
Callo
Tejidos especializados de plantas
que se forman en una herida; se
forma un cambiun para sellar la
herida de manera progresiva
Células del Callo
Son las má fáciles de transformar
(sus paredes son muy delgadas)
Protoplastos (sin paredes
celulares son más fáciles de
transformar, pero es más deficil de
obtener una planta completa
Los callos se producen por manipulación de
concentraciones externas de hormonas vegetales
Hormonas vegetales fundamentales
Auxinas
Auxina natural es el ácido indolacético (IAA)
Meristemo apical es el sitio principal
de síntesis de auxinas
Citoquininas
Relacionadas estructuralmente a
la adenina
Producida por tejidos de crecimiento
activo, especialmente raíces,
embriones y frutos
auxina < CITOQUININA TALLOS
AUXINA > citoquinina  RAÍCES
auxinA = citoquinina  callo indiferenciado
Producir callo  transformar callo 
estimular tallo por adición de citoquinina
+ citoquinina
Procedimento fácil
(según especie) para
dicotiledóneas
Biology of Plants, Raven et. al., Freeman Worth Publishing, 1999
Monocots no son fáciles de manejar –
callo es difícil de iniciar, callus A.tumefaciens no es
una bacteria patogénica para monocots
1. Se elimina el pericarpo y se obtienen embriones
inmaduros (0.5 - 1.0 mm)
2. Los embriones inmaduros
se colocan en un medio de
inducción de callos
La transfomación se
realiza con una pistola
de genes
Medio muy osmótico
prepara el callo para
transformación
DNA con el gen de interés y resistencia a antibiótico
cubre partículas de oro
Los callos se
colocan en una
cámara de vacío, la
presión de Helio
dispara el DNA
hacia las células
Los callos se dejan
en medios con alto
osmótico durante
20 horas después
del disparo
Arma de genes
Partículas de oro
recubiertas con el
DNA
Cámara de vacío
plantsciences.montana.edu/ .../transform1.htm
3. Bombardeo de partículas usando una pistola de genes que usa Helio
Gas de Helio
Metodología
Discos de
ruptura
macroprojectiles
Célula vegetal
Partículas recubiertas
con el DNA
1. Bombardeo de células con partículas de oro
2. Detectar actividad con proteínas marcadoras
- No requiere cultivos celulares o pretratamiento de cultivos
- Es la que se emplea normalmente para la transformación de monocots
Después del disparo los callos se sitúan en un medio
de selección por varias semanas
Los callos se transfieren a medio para inducir la
producción de tallos
Despúes de inducir pequellos tallos se
transfieren a a contenedores con medio que
induce la foramación de raíces
Las pequeñas plantas se transplanta a suelo y
se aclimatan bajo condiciones de alta humedad
Con los procedimientos actuales solo entre un 10-20% de las plantas
actuales son trangénicas,y por tanto se deben comprobar en la expresión
del transgen
4. Electroporación
metodología
Optimizació
Optimización de mutiples variables
Desidad de protoplasto
2 x 106mL-1
Concentración plásmido
200µg/mL
Tamaño plásmido
3-6 Kb
Eliminaciónd de
paredes celulares no
siempre necesario
1.5 kV
Concentración de iones
KCl 125 mM
Examinar células para la actividad de transgen
(por ejemplo expresión GUS)
Gen reportador – gen cuya expresión es fácil de
observar. Usada para “reportar” la expresión del gen
- regulación y localización
http://home.ust.hk/~rocklab/dc3gus/
ABA-inducible expression
• gen GUS (uidA)
X-Glc
β-glucuronidasa
Precipitado azul
Ácido 5-bromo-4-cloro-3-inolil
-β-D-glucurónico
Guard cells
Roots
•Proteína fluorescente verde (GFP)
Proteína de la medusa Aequorea victoria.
GFP se produce en muchos organismos heterólogos
Muchas variantes disponibles comercialmente (proteína fluorescente
roja)
• Gen de la kuciferasa (luc)
A. thaliana C24 wild type (left)
35S-mgfp4-ER transformed (right)
La mosca de fuego de norte américa libera luz verde durante la oxidación del sustrato luciferina
Cámaras CCD pueden detectar bioluminiscencia en tiempo real
Aequorea victoria