5. Microscopía de fluorescencia y epifluorescencia

Transcripción

5. Microscopía de fluorescencia y
epifluorescencia
5. Microscopía de fluorescencia
Fluorescencia
Espectro de luz visible:
La longitud de onda determina el color
Fluorescencia
¿Qué es?
Es un proceso de interacción entre la radiación y la
materia en el cual un material absorbe radiación de
una fuente específica y muy rápidamente emite luz
cuya energía es menor (de mayor longitud de onda)
que la de la radiación que ha absorbido.
Fluorescencia
Espectro de luz visible:
Excitación
Emisión
Fluorescencia
¿Cómo se produce?
Los
electrones
son
excitados
a
estados
vibracionales y rotacionales más altos y cuando
vuelven a su estado fundamental emiten la energía
de excitación en forma de radiación.
Fluorescencia
¿Cómo se produce?
E
Diagrama de Jablonski
S'1
S1
S0
Fluorescencia
¿Cómo se produce?
E
S'1
S1
S0
Fluorescencia
¿Cómo se produce?
1) La absorción de la luz de excitación eleva la
molécula del fluorocromo a un estado de excitación
con un mayor contenido de energía, S’1.
Fluorescencia
¿Cómo se produce?
E
S'1
S1
S0
Fluorescencia
¿Cómo se produce?
2) En este estado de excitación se mantienen un
tiempo determinado, de 10-9 a 10-8 segundos, en el
cual la molécula sufre cambios conformacionales e
interacciones con las moléculas de su entorno.
Como consecuencia, parte de la energía del estado
S’1 se disipa, creándose un estado S1 de menor
energía.
Fluorescencia
¿Cómo se produce?
E
S'1
S1
S0
Fluorescencia
¿Cómo se produce?
3) Pasado este tiempo de excitación la molécula
emite luz de menor energía volviendo a su estado
fundamental, S0.
Fluorescencia
¿Cómo se produce?
E
S'1
S1
S0
Fluorescencia
●
Debido a la disipación interna de energía la luz
emitida tiene siempre una longitud de onda mayor
(menor energía) que la luz de excitación.
●
La cantidad de luz emitida es muy pequeña en
comparación con la utilizada para la excitación.
Fluorescencia
●
Lo
que
diferencia
fosforescencia
a
(ambos
la
fluorescencia
son
de
procesos
la
de
luminiscencia) es el tiempo de vida más largo de
éste
último
proceso
que
puede
ir
desde
milisegundos a minutos y ocurre después de que el
proceso de absorción haya terminado.
Fluorescencia
●
Los materiales que fluorescen lo hacen porque
contienen
estructuras
con
configuraciones
moleculares particulares conocidas como fluoróforos
o fluorocromos.
Fluorescencia
●
Un fluorocromo es una molécula capaz de absorber
fotones y emitir fotones de menor energía (mayor
longitud de onda).
●
Un
fluoróforo
es
la
parte
del
fluorocromo
responsable de la emisión de la fluorescencia.
Fluorescencia
Tipos de fluorescencia:
●
La fluorescencia primaria es la que se da porque
existe una configuración inherente a la estructura
molecular.
Algunas de las fluorescencias más intensas que se
observan se asocian con moléculas aromáticas, la
fluorescencia de materiales inorgánicos se observa
en muchos minerales y piedras preciosas, y quelatos
específicos:
Clorofila, aceite de inmersión, GFP
Fluorescencia
Tipos de fluorescencia:
●
La fluorescencia secundaria ocurre cuando una
molécula específica o un grupo capaz de fluorescer,
un fluorocromo, se introduce en la estructura de la
muestra.
Éste es el procedimiento para la mayoría de las
aplicaciones biológicas de la microscopía de
fluorescencia.
Fluorescencia
Espectros de excitación y emisión:
Debido a la diferente configuración electrónica de los
fluorocromos cada uno presenta un espectro de
excitación y de emisión característico y único.
Los fabricantes dan el pico de máxima excitación y
el pico de máxima emisión o bien los espectros de
excitación y emisión.
Fluorescencia
Espectro de excitación:
Muestra la diferente intensidad de la luz de emisión
máxima a diferentes longitudes de onda de
excitación.
emisión
fluorescencia
excitación
λ
Fluorescencia
Espectro de emisión:
Muestra la intensidad relativa de emisión a
diferentes longitudes de onda al excitar con la
longitud de onda máxima.
emisión
fluorescencia
λ excitación máxima
λ
Fluorescencia
Espectros de excitación y emisión: Fluoresceína
pH = 9
pH = 13
Fluorescencia
Disminución de la fluorescencia:
Una molécula del fluorocromo puede tener varios
ciclos de excitación-emisión.
Pero bajo condiciones de iluminación de alta
intensidad hay una destrucción irreversible del
fluorocromo
fotoblanqueado
excitado
que
(photobleaching)
detección de fluorescencia.
se
denomina
limitando
la
Fluorescencia
Fluorescencia
Fading, decoloración
Puede ser por dos procesos:
1) Photobleaching: Descomposición irreversible de
las moléculas de los fluorocromos.
Está directamente relacionado con la intensidad de
la excitación y con el tiempo durante el cual estamos
excitando la muestra.
Para evitar este efecto se debe trabajar en
condiciones de mínima iluminación posible.
Fluorescencia
2) Quenching: Disminución de la intensidad de la
emisión debida a condiciones de temperatura o
presión elevada, agentes oxidantes y algunas sales.
También puede ser debida a interacciones entre
moléculas de fluorocromo, por lo que aumentar la
concentración de éste no siempre supone un
aumento de fluorescencia.
Se debe trabajar con agentes secuestradores de
oxígeno.
Fluorescencia
Uso de la microscopía de fluorescencia:
1) El objetivo principal es la identificación de una
sustancia específica observando sus propiedades
características de emisión cuando se ilumina con
radiación de longitud de onda apropiada.
2) Un objetivo difícil es la determinación de
parámetros específicos inherentes a la muestra, o
que son resultado de la preparación de la misma,
que influyen en la fluorescencia de un fluorocromo
específico en un material dado.
Fluorescencia
Uso de la microscopía de fluorescencia:
3) Un tercer objetivo incluye la medida de la
intensidad de la fluorescencia y una comparación de
esta intensidad con estándares de fluorescencia
bien establecidos.
4) El cuarto objetivo es el barrido localizado de una
muestra para determinar la distribución de los
fluorocromos que contiene, que es la microscopía de
barrido confocal.
Instrumentación: Epi-iluminación
La gran mayoría de los microscopios trabajan
en modo de luz incidente, epi-iluminación,
aunque algunos todavía lo hacen en modo de
luz transmitida.
Instrumentación: Fuentes de luz
●
La elección de la fuente de luz es función del
fluorocromo
específico
que
se
investiga,
sus
requisitos de excitación y su eficiencia cuántica.
●
Para excitar la fluorescencia de un fluorocromo se
necesita una fuente de luz intensa que suministre las
longitudes de onda de excitación del fluorocromo en
uso.
Lámparas de mercurio a alta presión:
●
●
Son las más utilizadas.
Exhiben máximos discretos sobre un fondo continuo que
proporcionan excitación en el rango del ultravioleta así
como en las regiones azul y verde.
Lámparas de mercurio a alta presión:
●
●
●
●
Estas lámparas son caras, requieren unidades de
encendido especiales y el coste de funcionamiento es
elevado.
La salida de la luz se va reduciendo con el tiempo
debido al ennegrecimiento del envoltorio de cuarzo.
Nunca deben utilizarse más tiempo del recomendado
por el fabricante ya que existe riesgo de explosión que
dañaría el microscopio y llenaría la habitación de
vapores de mercurio.
Generalmente llevan un contador de horas incorporado.
Lámparas de xenon a alta presión:
●
●
Se caracterizan por un flujo luminoso estable y regular.
Muestran un continuo de elevada intensidad con algunos
máximos irregulares entre longitudes de onda de 800 y
1.000 nm.
Esta fuerte intensidad en el infrarrojo cercano debe ser
eliminada con filtros.
●
●
Suministran suficiente radiación azul-verde en la región
de 440 - 540 nm donde las lámparas de mercurio no son
muy útiles, sin embargo son deficientes en el
ultravioleta.
Su vida media es más larga que las de mercurio.
Lámparas de xenon a alta presión:
Lámparas halógenas de wolframio:
●
●
●
●
También se conocen como lámparas de yoduro de
cuarzo.
Son del tipo de fuente de filamento incandescente que
tienen un espectro de radiación continuo.
Dan poca emisión en el rango del ultravioleta pero es
aceptable en las regiones azul y verde.
Permiten un apagado y encendido con frecuencia lo que
acortaría la vida de las de mercurio.
●
●
Son más baratas y más seguras que las de mercurio
pero sólo son apropiadas en técnicas donde se espere
tener una elevada fluorescencia ya que tienen una
menor energía de excitación.
Si el trabajo requiere fluorescencia de dos colores o se
necesitan elevados aumentos o la fluorescencia es
tenue se prefieren las lámparas de vapor de mercurio.
Instrumentación: Filtros
Filtro de
excitación
Filtro
barrera
●
●
●
Con el filtro de excitación seleccionamos la parte del espectro
que utilizaremos para excitar la muestra.
La muestra emite fluorescencia en un espectro distinto al de
excitación y al mismo tiempo refleja parte del espectro
utilizado para la excitación.
El filtro barrera se encarga de eliminar la parte del espectro
reflejado y nos permite visualizar el espectro de emisión
correspondiente al fluorocromo.
Filtro de
excitación
Filtro
barrera
●
●
●
Filtro de excitación: Selecciona el espectro de excitación.
Espejo dicroico: Refleja la parte del espectro necesaria para
la excitación y transmite el resto.
Filtro barrera: Deja pasar la parte de la emisión de la muestra
que nos interesa.
Filtro barrera
Filtro de excitación
Espejo dicroico
Muestra
●
●
Los fabricantes suelen proporcionar bloques de filtros que
son combinaciones de filtros de excitación y de emisión con
los apropiados espejos dicroicos.
Los filtros se describen utilizando letras y números:
BP600/30, LP490, DD488/543, ...
●
Filtros de excitación y barrera:
BPxxx - Filtro Pasa Banda (Band Pass): Deja pasar una
banda determinada del espectro y bloquea el resto.
BP460-580: BP significa filtro pasa banda y los números
indican la luz que bloquea por debajo, 460 nm, y la que
bloquea por encima, 580 nm.
460
580
●
BPxxx - Filtro Pasa Banda (Band Pass): Deja pasar una
banda determinada del espectro y bloquea el resto.
BP600/30: Deja pasar una banda cuyo máximo es 600 nm
con una anchura de 30 nm.
30nm
600
●
SP600: SP significa filtro pasa bajos (short pass).
Deja pasar el espectro por debajo de un valor determinado,
en este caso 600 nm, y bloquea lo que está por encima de
ese valor.
600 nm
●
LP490: LP significa filtro pasa altos (long pass).
Deja pasar el espectro por encima de un valor determinado,
en este caso 490 nm, y bloquea lo que está por debajo de
ese valor.
490 nm
●
La combinación de filtros SP y LP permite recortar el espectro
por debajo del valor de SP y por encima del valor de LP
consiguiendo bandas muy estrechas.
●
Espejos dicroicos:
También se describen con números y letras:
●
●
●
RSPxxx: Espejo dicroico Reflexión Pasa Bajos, refleja por
debajo del valor indicado (xxx) y transmite el resto.
DDxxx/yyy: Espejo doble dicroico, tiene dos picos en los que
refleja (xxx, yyy) y en el resto transmite.
TDxxx/yyy/zzz: Espejo triple dicroico, refleja la luz en tres
picos (xxx, yyy, zzz) y transmite en el resto
●
Espejos dicroicos:
RSP490: refleja por debajo de 490 nm y transmite el resto.
490
Filtro de
excitación
Filtro
barrera
Espejo
dicroico
Fuente
de
emisión
Muestra
1.La lámpara emite luz en todo el espectro.
2.El filtro de excitación sólo deja pasar la parte del
espectro necesaria para excitar la muestra.
3.El espejo dicroico refleja hacia la muestra la
excitación correspondiente.
4.La muestra se excita con la luz que le llega y emite
en un espectro superior al de la excitación.
5.El espejo dicroico transmite la emisión de la
muestra.
6.El filtro barrera hace una selección exacta del
espectro de emisión que nos interesa.
Filtro de
excitación
Filtro
barrera
Espejo
dicroico
Fuente
de
emisión
Muestra
Instrumentación: Objetivos
●
Casi las mismas consideraciones se aplican a la
evaluación de los objetivos cuando se requieren
para microscopía de fluorescencia o de campo claro.
●
La capacidad del objetivo para captar la luz juega un
papel esencial en la microscopía de fluorescencia.
●
Para obtener una intensidad de la señal óptima se
debe emplear una apertura numérica elevada y el
menor aumento posible.
●
Por otro lado, el tipo de vidrio que se utilice requiere
una buena transmisión de la longitud de onda que se
use, por eso, los más utilizados son los de fluorita o
los apocromáticos.
●
También
se
deben
utilizar
objetivos
autofluorescencia extremadamente baja.
con
●
Puede ocurrir que aunque estén todos los factores
anteriores optimizados exista un ruido de fondo.
Éste se debería a la propia muestra debido a la
fijación, la autofluorescencia o a un proceso de
tinción inadecuado.
Luz transmitida vs luz incidente
●
Luz transmitida:
Los microscopios de fluorescencia antiguos eran
poco eficaces en luz transmitida.
Los lugares de fluorescencia débil eran difíciles de
observar entre la radiación que no era específica de
la fluorescencia.
●
Luz transmitida:
El problema se solventó parcialmente utilizando
condensadoras de fondo oscuro.
La luz incidente sobre la muestra queda restringida a
un
área
que
no
entra
en
el
objetivo.
Consecuentemente sólo la radiación que surge de la
dispersión o de la fluorescencia se recoge en la
lente objetivo. Los lugares de fluorescencia débil se
observan sobre un fondo oscuro.
●
Luz transmitida:
Este sistema es más útil en aumentos bajos de
aproximadamente 40X y tiene la ventaja de que el
contraste es alto.
Una desventaja es que se requiere aceite de
inmersión no fluorescente o glicerol entre la parte
superior de la lente condensadora y la lente objetivo
para evitar pérdidas de luz de excitación.
●
Luz incidente:
Con el desarrollo del espejo dicroico aumentó el
número de aplicaciones de la microscopía de
fluorescencia ya que hay muchas muestras que no
se pueden observar por transmisión.
El espejo dicroico lleva la radiación a través del
objetivo para la excitación y se usa de nuevo para
permitir la observación de la radiación fluorescente.
●
Luz incidente:
De esta manera el objetivo funciona también como
condensadora y la intensidad de la fluorescencia es
inversamente proporcional a la cuarta potencia de
los aumentos.
El brillo máximo se obtiene con un ocular de
aumento mínimo y el objetivo de apertura numérica
máxima.
●
Luz incidente:
Las ventajas son que la luz de excitación pasa a
través de menos superficies de vidrio y así se pierde
menos luz en el camino debido a absorción interna.
Como la lente objetivo también es condensadora el
área observada es la misma que el área iluminada.
Además no hace falta aceite de inmersión en la
condensadora.
Aplicaciones
●
Se aplica a la determinación cuantitativa de
aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos y muchos
fluorocromos celulares (para ello se utiliza un
fotómetro que mide la intensidad de la fluorescencia
de una región específica de la muestra).
Aplicaciones
●
También es útil en el estudio de diferentes clases de
celulosa,
tejidos
vegetales,
alimentos
y
medicamentos, fibras animales, minerales en polvo,
detección de impurezas en mezclas homogéneas y
heterogéneas, polímeros, resinas, cristales líquidos,
telas,
fibras,
petróleo,
madera,
papel,
cemento,
semiconductores,
ciencia
carbón
vidrio,
forense,
restauración de arte, biología y medicina.
mineral,
cerámica,
farmacia,

5. Microscopía de fluorescencia y epifluorescencia

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