Memoria Científica - Severo Ochoa
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Memoria Científica - Severo Ochoa
Biología del desarrollo Developmental Biology Biología celular Cell Biology Inmunología y virología Immunology and virology Neurobiología Neurobiology Regulación de la expresión génica Regulation of gene expresion Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) y Universidad Autónoma de Madrid (UAM) Universidad Autónoma de Madrid Cantoblanco 28049 MADRID Tel.: (+34) 91 397 5070 Fax: (+34) 91 397 4799 http: //www.cbm.uam.es Memoria Científica Scientific Report 01 02 Coordinadores de esta Memoria / Report Coordinators José Manuel Cuezva Crisanto Gutierrez Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) y Universidad Autónoma de Madrid (UAM) Universidad Autónoma de Madrid Cantoblanco 28049 MADRID Tel.: (+34) 91 397 5070 Fax: (+34) 91 397 4799 http: //www.cbm.uam.es Comentarios del director Introductory remarks .......4 Personal Personnel Índice Index .......8 A Biología del Desarrollo Developmental Biology B. 6 Tráfico regulado de proteínas de membrana A. 1 Análisis Genético de mecanismos morfogenéticos en Drosophila Regulated membrane protein trafficking Genetic Analysis of morphogenetic mechanisms in Drosophila Antonio García-Bellido .......14 Ignacio V. Sandoval B. 7 Terapia génica experimental A. 2 Mecanismos de señalización en el desarrollo Experimental gene therapy Signalling mechanisms in development Isabel Guerrero .......36 Antonio Talavera .......38 .......16 B. 8 Química de proteínas y proteómica A. 3 Comunicación intercelular en el desarrollo del Drosophila Protein chemistry and proteomics Jesús Vázquez Cell-cell signalling in Drosophila development Fernando Jiménez Díaz-Benjumea .......18 A. 4 Biología molecular del desarrollo Molecular biology of development Juan Modolell .......20 C Inmunología y Virología Immunology and Virology C. 1 Transmisión de señales a través del receptor para el antígeno de células T A. 5 Control genético de la morfogénesis Genetic control of morphogenesis Ginés Morata .......40 .......22 Signal transduction through the T cell antigen receptor Balbino Alarcón B .......44 C. 2 Bases moleculares de la patogenia y del potencial anti-tumoral de los parvovirus Biología Celular Cell Biology Molecular bases of parvovirus pathogenesis and anti-tumour potential José M. Almendral .......46 B. 1 Citoesqueleto y nucleoesqueleto Cytoskeleton and nucleoskeleton Isabel Correas .......26 C. 3 Bases moleculares de la citopatología viral Molecular bases of viral cytopathology Luis Carrasco B. 2 Mecanismos de regulación de la biogénesis mitocondrial y alteración mitocondrial en cáncer C. 4 Variabilidad genética de virus RNA Mechanisms that regulate the biogenesis of mitochondria and mitochondrial alterations in cancer José M. Cuezva .......48 Genetic variability of RNA viruses Esteban Domingo .......50 .......28 C. 5 Activación del sistema inmune B. 3 Terapia génica experimental Activation of the immune system Experimental gene therapy Marta Izquierdo Manuel Fresno C. 6 Estabilidad e ingeniería de proteínas víricas B. 4 Desarrollo neuronal y neurodegeneración Stability and engineering of viral proteins Neuronal development and neurodegeneration Francisco Moreno .......52 .......30 Mauricio García Mateu .......54 .......32 C. 7 Replicación del DNA y ciclo celular B. 5 Señalización celular por PKC atípicas en inmunidad y cáncer DNA replication and cell cycle Crisanto Gutierrez Cell signaling through the atypical PKC pathways in immunity and cancer Jorge Moscat .......34 .......56 C. 8 Inmunología de los antígenos de histocompatibilidad D. 5 Regulación de la expresión génica en enfermedades neurodegenerativas Immunology of histocompatibility antigens Regulation of the gene expression in neurodegenerative diseases José A. López de Castro .......58 Cecilio Giménez E. 6 Mantenimiento y variabilidad del genoma: enzimología de la reparacion del DNA .......86 Genome maintenance and variability: enzymology of DNA repair Luis Blanco D. 6 Bases moleculares de la adaptación al ejercicio y de la plasticidad muscular C. 9 Enzimas retrovirales: análisis estructural y funcional de la retrotranscriptasa del virus de la inmunodeficiencia humana Luis Menéndez Arias Rafael Manso .......60 C.10 Regulación de la expresión génica en endotelio vascular Alberto Martínez Serrano Miguel Angel Rodríguez Marcos Federico Mayor, jr. C.12 Virus de la peste porcina africana .......92 .......94 .......68 Jorgina Satrústegui. E.12 Estructura cromatínica y transcripción Chromatin structure and transcription Enrique Palacián .......124 .......96 Cell envelopes Miguel Angel de Pedro Montalban .......126 Molecular neuropathology of Alzheimer's disease .......70 Fernando Valdivieso. .......98 E.14 Bases moleculares de las enfermedades metabólicas Molecular basis of metabolic diseases Replication and transcription of bacteriophage ø29 Magdalena Ugarte .......72 Neurobiología Neurobiology .......128 E Regulación de la expresión génica Regulation of gene expression D Responsables de Laboratorio Persons in charge of laboratories ....132 E. 1 Parasitología molecular Molecular parasitology Carlos Alonso D. 1 Bases moleculares de la neurotransmisión glicinérgica .......102 E. 2 Expresión génica en linfocitos T Molecular basis of glycinergic neurotransmission Seminarios Seminars ....136 Seminarios “Severo Ochoa”. Avances en Biología Molecular Seminars “Severo Ochoa”. Advances in Molecular Biology .....138 Servicios Técnicos de Apoyo a la Investigación Research and Support Facilities .....140 Lecciones conmemorativas Memorial Lectures .....142 Gene expression in T lymphocytes .......78 D. 2 Función de las proteínas microtubulares en neuronas Miguel A. Alonso .......104 E. 3 Biología molecular de extremófilos (microbiología aplicada) Function of microtubular proteins in neurons Molecular biology of extremophylic microorganisms .......80 D. 3 Transducción de señales. Mecanismos de acción de neuromoduladores e implicaciones farmacológicas Ricardo Amils .......106 E. 4 División celular bacteriana y resistencia a antibióticos Bacterial cell division and antibiotics resistance Signal transduction. Mechanisms of action of neuromodulators and pharmacological implications Juan Alfonso Ayala Serrano .......108 .......82 E. 5 Biotecnología y genética de bacterias termófilas extremas D. 4 Bases moleculares de la plasticidad neuronal Biotechnology and genetics of extreme thermophilic bacteria Molecular basis of neuronal plasticity F. Javier Díez Guerra .......122 E.13 Envolturas celulares C.15 Replicación y transcripción del DNA del bacteriófago ø29 Edgardo Catalán .......120 E.11 Iniciación interna de la traducción en mRNAs eucarióticos Encarnación Martínez-Salas D.11 Neuropatología molecular de la enfermedad de Alzheimer Development of the human lymphohematopoietic system Jesús Avila de Grado Gene expression in yeast and Streptomyces Internal initiation of translation in eukaryotic mRNAs Neurodegeneration and ageing: calcium signalling in mitochondria and insulin/leptin signalling during ageing C.14 Desarrollo del sistema linfohematopoyético humano Carmen Aragón .......118 E.10 Expresión génica en levaduras y Streptomyces D.10 Neurodegeneración y envejecimiento: señalización mitocondrial del calcio y señalización de insulina/leptina en envejecimiento Development of new strategies to control and prevent viral diseases: the foot-and-mouth virus as a model Margarita Salas Protein synthesis and its regulation in eukaryotes César de Haro, José M. Sierra Neurotransmission and development Galo Ramírez. María Luisa Toribio .......90 D. 9 Neurotransmisión y desarrollo .......66 C.13 Desarrollo de nuevas estrategias para el control y prevención de enfermedades virales: el virus de la fiebre aftosa como modelo Francisco Sobrino .......116 E. 9 Síntesis de proteínas y su regulación en eucariontes Antonio Jiménez African swine fever virus María Luisa Salas Juan Pedro García Ballesta G protein-coupled receptors signaling and regulatory mechanisms .......64 .......114 Ribosome structure and function D. 8 Mecanismos de señalización y regulación de receptores acoplados a proteínas G Embryonic development of the lymphohematopoietic system José Luis Castrillo Díez E. 8 Estructura y función del ribosoma Biology of human neural stem cells. Potential for gene therapy in neurodegeneration .......62 C.11 Desarrollo del sistema linfohematopoiético embrionario Regulation of the tissue-specific gene expression .......88 D. 7 Biología de células troncales neurales humanas. Potencial para reposición celular y terapia génica en neurodegeneración Regulation of gene expression in vascular endothelium Juan Miguel Redondo E. 7 Regulación de la expresión génica específica de tejido Molecular bases of the adaptation to exercise and of skeletal muscle plasticity Retroviral enzymes: structural and functional analysis of human immunodeficiency virus reverse transcriptase .......112 José Berenguer .......84 .......110 C O M E N TA R I O S D E L D I R E C T O R W O R D S F R O M T H E D I R E C T O R Próximos a celebrar el 50 aniversario del El esfuerzo de nuestros investigadores descubrimiento de la doble hélice, podemos y personal de apoyo ha sido y es modélico observar lo mucho y bueno que se ha y es la razón fundamental por la que nuestro realizado en estos años en el campo de la Centro tiene un cierto reconocimiento a nivel Biología Molecular. En este último bienio, Internacional. El aumento de recursos es tras haberse determinado la secuencia del muy mejorable. Afortunadamente, tenemos DNA de muchos organismos, incluyendo el la ayuda de nuestros patronos, el CSIC y la ser humano, se han comenzado los estudios UAM, así como el apoyo esencial y de genómica funcional en muchos de esos constante de la Fundación Ramón Areces organismos. Nuevos descubrimientos como (a través de una ayuda institucional a la las moléculas de RNA que pueden prevenir Ciencia que se realiza en nuestro Centro). la expresión génica pueden ser valiosas Igualmente, la valía de nuestros herramientas para estos estudios. Pero no investigadores nos ha permitido obtener solo se han conseguido avances en el área ayudas competitivas de organismos públicos de la expresión génica, sino también en las (fundamentalmente del Ministerio de Ciencia otras áreas de la investigación: Biología del y Tecnología, y del Ministerio de Sanidad y Desarrollo, Virología, Inmunología, Consumo), y también de instituciones Microbiología, Biología Celular, Señalización privadas. Sin embargo, requerimos de más Celular o Neurobiología; todas estas recursos. disciplinas se desarrollan en nuestro Centro. Un problema fundamental del CBMSO Existe pues una gran rapidez de es la carencia de espacio. Por ello las acontecimientos científicos en el campo de Direcciones anteriores (Federico Mayor la Biología Molecular que requiere de Menéndez y Miguel Angel de Pedro) nosotros un gran esfuerzo para ser gestionaron la posible construcción de un competitivos a nivel internacional. nuevo edificio. Gracias a su gestión, hoy en Adicionalmente, cada día aparecen nuevas día tenemos un proyecto para construir una técnicas y equipamientos, lo cual nos hace nueva sede en el Campus de Cantoblanco, depender de recursos materiales para los dentro del Parque Científico de Madrid. que necesitamos cada vez una mayor Tenemos cedida por la UAM una parcela, y subvención, para estar en las mismas (o por actualmente existe un proyecto de lo menos no muy diferentes) condiciones construcción de este nuevo edificio que está que nuestros colegas extranjeros. llevando a cabo la empresa Euroespacios. Con este nuevo edificio se pretende reorganizar el CBMSO. En este reorganizado Centro se piensa aunar las diferentes líneas de trabajo, junto con algún otro nuevo grupo externo, en cuatro áreas de trabajo que hagan más eficiente su funcionamiento. 4 En el bienio 2001-2002 la mundial. En recuerdo a Eladio producción de las diferentes líneas Viñuela, el Instituto de Biología fundamentales para el buen del Centro ha dado lugar a 338 Molecular (CSIC) ha pasado a funcionamiento del CBMSO es su artículos de investigación con un denominarse Instituto de Biología Departamento Técnico. Muchos índice de impacto medio de Molecular “Eladio Viñuela”. Otra de los servicios de este alrededor de 6. El número de novedad relacionada con el Departamento se han consolidado proyectos de investigación personal científico en formación durante este bienio y se ha financiados ha sido de 316 no en plantilla, ha sido la procedido a la instauración de uno incluyendo aquellos instauración de dos premios para nuevo, el Servicio de Citometría subvencionados por instituciones una buena Tesis leída en el Dpto. de Flujo. públicas (del Gobierno Central o de Biología Molecular de nuestra de Comunidades Autónomas, Facultad, y para un buen trabajo De cara al futuro, la mayor fundamentalmente la Comunidad publicado de investigación. Cuidar preocupación es la de tener a las de Madrid, que adicionalmente ha la formación de nuestros personas adecuadas y los medios indicado que hará una valiosa investigadores más jóvenes y necesarios para llevar a cabo una inversión en el desarrollo del nuevo mejorar su modo de trabajar es excelente labor investigadora; para edificio), privadas, y de la Unión de vital importancia. En este ello necesitaremos más Europea. sentido se debe de buscar para subvenciones para plazas y ellos unas mejores condiciones contratos de trabajo, y para contractuales que faciliten su labor. infraestructuras. El CBMSO es un centro Uno de los pilares universitario y por lo tanto cuida la formación científica de sus No menos importante es la Cerca del X aniversario de la miembros más jóvenes de formación de personal técnico muerte de D. Severo Ochoa, acuerdo con las normas altamente capacitado. En este debemos de buscar que nuestro académicas. Desde este punto de sentido, el CBMSO ha mantenido Centro sea un lugar de excelencia vista, y en colaboración con el su colaboración con el INEM, a científica como él deseaba. Dpto. de Biología Molecular, ha través de la Fundación Severo Tenemos un personal creativo y colaborado en algunos aspectos Ochoa, para favorecer la con gran capacidad de trabajo. docentes y se han leído tesis formación de técnicos en la Por ello debemos de encontrar doctorales. Adicionalmente, se ha Escuela-Taller. más recursos para poder realizar el trabajo que deseamos. Estoy mantenido el Master de Biotecnología. Además, se han Otra actividad novedosa ha convencido que con unas buenas llevado a cabo 81 Seminarios, de sido la iniciación de una Escuela condiciones el CBMSO podrá ellos 20 dentro del Ciclo Severo de Periodismo Científico, realizar un trabajo excelente y Ochoa. Se han celebrado también subvencionada por la Fundación competitivo que pueda dar frutos las Lecciones 8ª y 9ª en honor a Española para la Ciencia y la a nuestra sociedad. Severo Ochoa, y la 2ª y 3ª en Tecnología (FECYT), y que ha memoria de Eladio Viñuela, buscado mejorar la capacidad de nuestro pionero de la Biología comunicación de nuestros Molecular, en las que han científicos más jóvenes. participado investigadores de talla 5 Jesús Avila Director WORDS FROM THE DIRECTOR C O M E N T A R I O S D E L Close to the celebration of the 50th anniversary of the discovery of the double helix, we can look back on the breakthroughs in the field of Molecular Biology. In the last two year period, after the determination of the DNA sequence of numerous organisms — including that of the human — functional genomics research has been carried out with many of these organisms. New discoveries such as RNA molecules that can prevent gene expression may become valuable instruments for use in this area of research. Advances have not been restricted to the area of gene expression but include other research areas, such as: Developmental Biology, Virology, Immunology, Microbiology, Cell Biology, Cellular Signalling and Neurobiology; all these disciplines are followed at our Centre. There is rapid progress and change within the field of Molecular Biology; in order to remain competitive internationally we will have to work hard. Additionally, new techniques and systems are developed daily, putting new D I R E C T O R burdens on our resources. If we do not keep up we will lag behind our competitors abroad. The effort of our researchers and support personnel has been and is exemplary. They are the fundamental reason why our Centre has achieved a strong international recognition. But more resources are needed. Fortunately, we are backed by our sponsors — the CSIC (Spanish Board of Scientific Research) and the UAM (Autonomous University of Madrid) — and we enjoy the constant and essential support from the Ramón Areces Foundation. Likewise, the precious skills of our researchers have allowed us to obtain competitive grants from public organisations — mainly from the Department of Science and Technology and the Department of Health and Consumer Affairs — as well as from private institutions (acknowledged in the Lines of Work section of the Memorandum Report). However, in spite of this, we still require more resources. 6 A fundamental problem faced by the CBMSO is the lack of space. Therefore, the formers Directors, Federico Mayor and Miguel Angel de Pedro, have planned the construction of a new building. Thanks to his work, today we have a project for the construction of our new central premises at the Cantoblanco Campus, located in the Scientific Park of of Madrid . We have been given a plot of land by the UAM, and currently there is a project for the construction of this new building carried out by the firm Euroespacios. The aim of this development is to reorganise the CBMSO and gather in this new Centre groups in four areas and to join them with some groups from outside. This will make the running of the Centre much more efficient. In the 2001-2002 period, the production of the Centre’s different teams has led to 338 research papers, with an average impact value of around 6. Financed research projects amounted to 316, including all those projects subsidised by public institutions such as Central or Another new activity was the establishment of a Scientific Journalism School, subsidised by the FECYT (Spanish Science and Technology Foundation) which seeks to improve the capacity for communication of our youngest scientists. Autonomous Governments — mainly the Community of Madrid, which have expressed their interest in investing in the new building development — private institutions and the European Union. The CBMSO is a university centre and, therefore takes care of the scientific training of its youngest members in accordance with academic ordinances. From this point of view, and in collaboration with the Department of Molecular Biology, it has trained many graduate students to PhD level. In addition, we have supported the Masters of Biotechnology studies. Eighty-one seminars have been given, of which twenty were part of the Severo Ochoa Cycle. The 8th and 9th lectures celebrated Severo Ochoa’s, and the 2nd and 3rd were a tribute to Eladio Viñuela, our pioneer in the field of Molecular Biology.These lectures were given by internationally well-known researchers. Also, as a tribute to Eladio Viñuela, the CSIC (Institute of Molecular Biology) has been renamed Institute of Molecular Biology “Eladio Viñuela”. Other news in connection with scientific trainees has been the creation of two awards, one for the best Thesis read at our Faculty’s Department of Molecular Biology, and another for the best peerreviewed piece of research. It is our policy to provide training and support to our youngest researchers, so we must achieve the best contractual terms for them and their work. One of the foundations of the smooth operation of the CBMSO is its Technical Department. Many of the services offered by this Department have been consolidated during this two-year period. Furthermore, a new service, the Flux Cytometry Service has also been set up. As for the future, our main concern is to gather the appropriate people and the necessary means to carry out excellent research work. To achieve this, we will need more subsidies for labour positions and contracts, as well as for infrastructures. Close to the X anniversary of Severo Ochoa’s passing, we must build a Centre that is the place of scientific excellence he envisaged. We have creative and hard working personnel. Therefore, we must find more resources so we can reach the goals set in our work. I am convinced that, under good conditions, the CBMSO will be able to carry out outstanding and competitive work for the benefit of our society. Jesús Avila The training of highly qualified technical personnel is equally important. The CBMSO is continuously collaborating with the INEM (Spanish Employment Office) through the Severo Ochoa Foundation in order to promote the training of technicians at the Workshop School. Director 7 Personal Personnel CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR "SEVERO OCHOA"· A B Dirección / Management Board Personal Científico / Scientific Staff Director / Director CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (CSIC) PROFESORES DE INVESTIGACIÓN / RESEARCH PROFESSORS Jesús Avila de Grado Vicedirector / Vicedirector José Berenguer Carlos Director del Instituto de Biología Molecular "Eladio Viñuela" del CSIC / Director of the Instituto de Biología Molecular "Eladio Viñuela" CSIC Crisanto Gutiérrez Armenta Director del Instituto Universitario de Biología Molecular de la UAM / Director of the Instituto Universitario de Biología Molecular UAM José Manuel Cuezva Marcos Alarcón Sánchez, Balbino Alonso Bedate, Carlos Avila de Grado, Jesús Domingo Soláns, Esteban García Ballesta, Juan Pedro García-Bellido y Gª de Diego, Antonio Gutiérrez Armenta, Crisanto Jimenez Martínez, Antonio López de Castro, José Antonio Modolell Mainou, Juan Morata Pérez, Ginés Moscat Guillén, Jorge Palacián Gil, Enrique Ramírez Ortiz, Galo Ripoll Quintas, Pedro M. Salas Falgueras, Margarita Vicente-Sandoval Rodríguez, Ignacio Gerente / Administrative Director Salvador Fortes Alba Oficina de Relaciones Institucionales / External Relations and Communication Department Rosario Martín Rodríguez INVESTIGADORES CIENTÍFICOS / RESEARCH SCIENTISTS Alonso Lebrero, Miguel Angel Blanco Dávila, Luis Campuzano Corrales, Sonsoles Guerrero Vega, Isabel Haro Castella, César Jesús, de Martínez Salas, Encarnación Nieto López, Antonio Pedro Montalbán, Miguel Angel, de Ramírez Ortiz, Angel Redondo Moya, Juan Miguel Salas Falgueras, José Salas Falgueras, María Luisa Sánchez-Herrero Arbide, Ernesto Sobrino Castello, Francisco Toribio García, María Luisa CIENTÍFICOS TITULARES / TENURED SCIENTISTS Alcamí Pertejo, Antonio Javier Antón Canto, Luis Carlos Ayala Serrano, Juan Alfonso Busturia Jimeno, Ana María Castrillo Díez, José Luis Celis Ibeas, José Felix de Díaz-Meco Conde, Mª Teresa Escarmís Homs, Cristina Gómez Skarmeta, José Luis Jiménez Díaz-Benjumea, Fernando López Carrascosa, Angel L. Lucas Lozano, José Javier Menéndez Arias, Luis Pulido Vega, Diego Revilla Novella, Yolanda Rodríguez Marcos, Miguel A. Ruiz Gómez, Mar Talavera Díaz, Antonio Vázquez Cobos, Jesús Villasante Atienza, Alfredo Wandosell Jurado, Francisco 8 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID (UAM) CATEDRÁTICOS / PROFESSORS Amils Pibernat, Ricardo Aragón Rueda, Carmen Carrasco Llamas, Luis Cuezva Marcos, José Manuel Fresno Escudero, Manuel Giménez Martín, Cecilio Hermoso Nuñez, José Miguel Mayor Menéndez, Federico Mayor Zaragoza, Federico Moreno Muñoz, Francisco Satrústegui Gil-Delgado, Jorgina Sierra Pérez, José Manuel Ugarte Pérez, Magdalena Valdivieso Amate, Fernando PROFESORES TITULARES / ASSOCIATE PROFESSORS Abad Lorenzo, José Pascual Almendral del Río, José Mª Armas Portela, Rosario Berenguer Carlos, José Bogónez Pelaez, Elena Bonay Miarons, Pedro Carrascosa Baeza, Jose Mª Catalán Tobar, Edgardo Correas Hornero, Isabel Díaz Nido, Javier Díez-Guerra, Fco. Javier Fernández Lobato, María Fernández Santarén, Juan Antonio García Mateu, Mauricio García Ruiz, Predestinación Hernández Sánchez, Francisco Izquierdo Rojo, Marta Jiménez Martínez, Juan Salvador López Corcuera, Beatriz López Guerrero, José Antonio Manso Martinez, Rafael Marín Palma, Irma Martínez Serrano, Alberto Montejo de Garcini Guedas, Esteban Remacha Moreno, Miguel Requena Rolania, José Mª Ruiz Gómez, Ana Santamaría Pérez, Francisco Sanz Martín, José Luis Zafra Gómez, Francisco PERSONAL CIENTÍFICO CONTRATADO / Airaksinen, Antero Azpiazu Torres, Natalia Barrio Olano, María Rosa Bravo García, Alicia Bullido Gómez-Heras, Mª Jesús Calleja Requena, Manuel Camacho Pedrero, Ana Campillos González, Mónica Cano López, Eva Mª Castellano Moreno, Mª del Mar Del Pozo Benito, Juan Carlos Desvoyes, Irene Benedicte Fernández Malavé, Edgar García García, Miguel Angel García Muñoz, Mª José Gironés Pujol, Nuria Gorfinkiel Haim, Nicole Hernández López de Munain, Cristina Hernández Pérez, Félix Giménez Mateo, Oscar Giménez Sanz, Carmen Giovinazzo, Giovanna Giovizazo, Giovanna Glavic Mure, ALvaro Gómez -Casero Esteban, Elena Gómez Gómez, Felipe González Barrera, Sergio González Huici, Victor González López, Claudia Guerra García, Susana Gutierrez Rivas, Mónica Haro Castuera, Amparo Herranz Muñoz, Héctor Lamas López, José Ramón Lim, Filip Liste Noya, Isabel Llorca Blanco, Oscar Antonio Lomas López, Rodrigo Lombardia Uria, Manuel López Bueno, Alberto López de Quinto, Sonia López Matas , Mª. Angeles Lorite Arana, Mª. José MadridPérez, Olga Marco Recuenco, Mª Carmen de Maroto López, Beatriz Martín Aparicio, Mª Ester Martín Gordillo, Fernando Martín Ruíz-Jarabo, Carmen Más López, Antonio Molina Balsa, Isabel Morato López, Esperanza Paradela Elizalde, Alberto Perales Viejo, Celia Pérez Martínez, Mª del Mar Quijada Arteaga, Luis Ramírez Parra, Elena Recuero Vicente, María Resino de Castro, Jaime Rodríguez Martínez, Javier Mª Ruiz León, Yolanda Ruiz Olivar, Emilio Sabariegos Jareño, Rosario Sánchez Martínez, Cristina Sánchez Ramón, Silvia Saugar Gómez, Irene Sayas Casanova, Carmen Laura Solorzano Blanco, Karla Speicher, Stephan Truniger, Verónica Vázquez García, Miriam Noemí Villa Díaz, Ana Yunta González, Mónica Iñiguez Peña, Miguel Angel Izquierdo Juárez, José María Lafuente Monasterio, Mª José Lalioti, Vassiliki Lozano Salvatella, Juan José Martín Belmonte, Fernando Martín Fernández, Pilar Martínez Martínez, Sara Meijer, Wilfried Mendieta Gómez, Jesús Merinero Cortés, Begoña Moreno Flores, Mª Teresa Murga Montesinos, Cristina Navarrete López de Soria, Rosa María Núñez garrote, José Ignacio Nusspaumer da Costa, Gretel Pardo Merino, Beatriz Penela Márquez, Petronila Pérez González, Belén Pérez Martín, José Manuel Pérez Martínez, Mª. del Mar Pérez-Cerdá, Celia Ribas Núñez, Catalina Richartd Rodríguez, Eva María Rodríguez Márquez, Antonio Rodríguez Martínez, Javier María Rojo Gozalo, Susana Ruiz Desviat, Lourdes San José Martínez, Esther Santos Tejedor, Cruz Sanz Alonso Laura Schamel, Wolfgang Sevilla Hidalgo, Noemí Soto Alvarez, Manuel Suzanne, Magali POSTDOCTORALES / POSTDOCTORAL FELLOWS Agudo Barriuso, Marta Aldudo Soto, Jesús Alejo Herberg, Ali Alfranca González , Arantzazu Alonso Martínez, María Alvarez Nieto, Gema Andrés Hernández, Germán Baranowski, Eric Barrios Bardavio, Beatriz Beneyto Santonja, Mónica Bonniotti, Beatrice Boskovic, Yasminka Burgos Muñoz, Javier Callejo de Prado, Ainhoa Canellada, Andrea Cañas Montalvo, Benito Carrillo Rosales, Graciela Cavodeassi, Florencia Cebria Gómez, Antonio del Arco Martínez, Araceli Díaz Gallardo, Martha Yadira Díaz Hernández, Miguel Dufour, Emmanuel Durán Cascales, Consuelo Eisembrand, Ralf Excavour, Casandra Frünt, Corinne Frutos de Diego, Sonia Garagorri Ganchegui, Nerea García Escudero, Ramón García García, Miguel Angel García Muñoz, Fernando García Palomero, Esther García Peydró, Marina Garrido Jurado, Juan José Gascón Escobar, Irene Gil Pagés, Diana BECARIOS PREDOCTORALES / GRADUATE STUDENTS Acosta, Federico Adan Padrón, Alexander Alcaide Alonso, Pilar Alcorlo Pagés, Martín Aldaz Casanova, Silvia Alonso Martínez, María Alonso Torres, Pablo Altmutter, Christina Alvarez Gómez, Enrique Aranda Gómez, Juan Francisco Argoñórez, Martín Eduardo Arias Esteban, Armando Arroyo Becerra, Analilia Avila Flores, Juana Avila Flores, Silvia Baena López, Luis Alberto Barrado Guerrero, Patricia Bassy Alvarez, Olga 9 Batista Barcón, Alicia Bejarano León, Fernando Blanco Fuentes, Raquel Blas Galindo, Emilio Bourahi, Redouane Briceño, Verónica Bueno López, Carlos Caballero Mateo, Nuria Cacheiro Llaguno, Cristina Calandria Pérez, Carlos Calles Arenales, Belén Cantó, Carmen Carmona, Pedro Caro Azoy, Eddy Carrasco Rando, Marta Carreira Moreno, Aura Carrillo Terán , Wilman Carrión Herrero, Fco. Javier Cases González, Clara Elisa Castán García, Pablo Castro Reguera, Margarita Cava Valenciano, Luis Felipe Cavero Martínez, Santiago Clavero Villarrubia, Sonia Cobas Pupo, Guillermo Contreras Balsa, Laura Costa, Katyssulla Crespo Alonso, Miguel Cruz Rubio, Cristina Cubelos Alvarez, Beatriz Chattopadhyay, Sharmila Chichón García, Francisco Javier Del Alamo Camuñas, Marta Del Molnar-Darkos Muro, Cristina Ana Delgado Cañaveras, Mª del Pilar Díaz Muñoz, Laura Díaz Portuondo, Emiliano Diaz Triviño, Sara Dominguez Hernández, Francisco Duque Muñoz, Javier Durán Molina, Mª.Angeles Ecay Crespo, Mª. Jesús Elías García, Mónica Engel, Tobias Epifano García, Carolina Escudero Cuadrado, Luis María Fernández Miragal, Olga Ferrer López, Isaac Fornes Chaves, Amparo Foronda Alvaro, David Gandi, Giuditta García Arriaza, Juan Francisco García Briones, Mercedes García de Yébenes Mena, Virginia García Díaz, Miguel García Escudero, Vega García Lievana, Job García Marcos, Alberto Giménez Sáinz, Carmen Gómez Martín, Silvia Gómez Molina, Carmen Patricia Gómez Ramos, Alberto Gómez Sintes, Raquel Gómez Vicente , Violeta González Alonso, Beatriz González García, Inmaculada González Granja, Aitor González Ruiz, Domingo González Santamaría, Patricia González Toril, Elena Grajal Cuervo, Henar Grau Simón, Raquel Grueso Hierro, Mª. Esther Gurzov Amarelo, Esteban Gutiérrez Berzal, Javier Hernández Tiedra, Sonia Herrera Quintana, Mónica Hidalgo Estévez, Alicia María Hurtado Marcos, Carolina Iborra Martín, Salvador Imbaud, Juan Ignacio Isidoro Pacheco, Antonio Izcue Castellvi, Ana Maria Jiménez Mateos, Eva Mª. Juanas Melero, David Juarez Santos, Raquel Köchling, Thorsten Larreta López, Ruth Latorre Muñoz, Eduardo Leo Macías, Alejandra Letizia, Annalisa Longas Torne, Elisa Lopez Ferrer, Daniel Madam Renes, Vanesa Maganto García, Elena Manjón Castro, Cristina Marcilla Goldaracena, Miguel Marín Alberdi, Dolores Martín Aparicio, Esther Marín Palma, Enrique Martín Castro, Francisco Martín Cofreces, Noa Martínez Díez, Marta Martínez Fernández-Yáñez, Laura Martínez García, Ana Martínez García, Angeles Matamoros Grande, Tania Mateo Fernández, Roberto Mena, Marcela Minguet García, Susana Molina Arranz, Susana Molina Polo, Nicolás Segundo Monjas Serrano, Alicia Montserrat Pérez, Verónica Morales García, Mª. Dolores Moreno Albiger, Renata Moustafa, Malki Muñoz Espín, Daniel Muñoz Risueño, Ruth Navarro Galve, Beatriz Navarro Lobato, Mª. de las Nieves Navas Fernández, Luis Fernando de Navascués Melero, Joaquín de Ortega López, Paula Ortega Pérez, Inmaculada Pacheco García, Almudena Pacheco Santos, María Palacios Airado, Lucía Pariente Peñamaría , Nonia Parody de la Fuente, Nuria Pastor Pareja, José Carlos Pastrana Izquierdo, Erika Peregrín Pedrique, Sandra Pérez Fernández, Coralia Pérez Fernández, Jorge Pérez Ferreiro, Carmen Mª Pérez García, Laura Pérez Garijo, Ainhoa Pérez Lorenzo, Mª Jesús Pey Rodríguez, Angel Luis Picher Serantes, Angel Joaquín Pomar Ballestero, Natalia Poyatos Belio, Irene Pozueta Larios, Julio Prado Delgado, Amaya Pulgar Montoro, Manuel Quesada Navidad, Antonio Jesús Qui, Deyi Ramírez Moreno, Carlos Ramos Álvarez-Buylla, Manuel Ramos Martín, Mª del Carmen Rey Martín, Marta Riolobos Santamaría, Laura Rivera Gorrín, Henry Rivero Guedez, Damaríz Rodenstein, Lara María Rodríguez Benito, María José Rodríguez Carrasco, Yolanda Rodríguez García, Irene Rodríguez González, Irene Rodríguez González, Nuria Rodríguez Torres, Angelina Romero Prado, Marina Rubio Muñoz, Daniel Ruiz Pérez, José Salcedo de Haro, Marta Salero Coca, Enrique San Antonio Felipe, Belén Sánchez Díaz, Raquel Sánchez Martínez, Blanca Sánchez Santos, Miguel Angel Sánchez-Valdepeñas , Carmen Mª Santa María Pérez, Ismael Santamaría Núñez, Gema Sarnago Cebada, Susana Serna Rico, Alejandro Serrano, Miguel Angel Serrano Carballal, Elena Serrano de las Heras, Gema Serrano Saiz, Esther Sesma Aguirre, Laura Sierra Aragón, Saleta Sierra Istúniz, Javier Simón Sanz, Diana Tenorio Vela, Raquel Terrados Aguado, Gloria María Valle Benitez, Noelia Vázquez Alvarez, Blanca Vega Mendoza, Daniel Edgar Velasco Ortiz, Lara Vergara Jaúregui, Silvia Vicente Cenzano, Mª. Carmen Vila del Sol, Virginia Villa Cuesta, María Eugenia Villajos Barja, Jesús Zafra Amorós, Olga Zaldivar Notario, Irene Cuadros Catalán, Raquel Dávila Cerrato, Mª Mercedes de Chorro y de Villa-Ceballos, Mª de los Angeles De la Calle Mustianes, Elisa Estella Sagrado, Carlos Fernández Algar, María Fernández Moyano, Mª Carmen Fuertes Villadangos, Miguel A. Fuertes Yebra, Esther García García, Carlos García García, Esther García Mira, José Luis Garriga Fuentes, César Garuti Rodríguez, Helena Mª. Gómez Buendía, Teresa Gómez Mariano, Gema Gómez Medina, Sergio González Herrera, Rosa María González Páramo, Cristina Granda Vega, Carmen Gutierrez Aranda, Julia Gutierrez Luque, Ruth Hermoso Crispín, Carmen Hernández Baeza, María del Rosario Hernández Carrasquilla, Miguel Hernando Bellido, Almudena Ibáñez Pérez, Carmen Jiménez Gallego, Ana Langa Gabriel, Elena Lázaro Bolos, José Mª Lazcano Duque, Juan José Llorens Berzosa, Sergio López Varea, Ana Martín Bermejo, Mª. Jesús Martín Fernández, Mª Paloma Martín Redondo, Mª Asunción Martínez Villarraso, Angeles Mora-Gil Cobo, Mª Victoria Muñoz Fernández, Consuelo Muñoz Sánchez, Angel Luis Navarrete López, Rosa María Nogal Paris, María Luisa Núñez Balbuena, Enrique Ortega Pérez, Inmaculada Pablos Pérez, Beatriz de Parrón Muñoz, Ángela Peñate Santajuana, Silvia Punzón Gálvez, Carmen Reguerra Vidaechea, Juan Javier Reina Alba, Isabel Rodríguez Enríquez, Isabel Saiz Delgado, Eva María Sánchez de la Chica, Ascensión Sánchez Marujo, Vanessa Sánchez Moreno, Antonio Sanz Fernández, Miguel Angel Sanz Rebollo, Paloma Sastre Merlín, Isabel Sesé Cobos, Bárbara Sobrado de Vicente Tutor, Antonio Soto-Largo Dimitrigeff, Santiago Torre Tante, Mª. del Mar, de la Torroja Fungairiño, Carlos Villar García, Laurentino Zamarreño Fernández, Noelia C Personal de apoyo en líneas de Investigación / Technical Assistance Alcalde García, José Alonso Barba, Carmen Álvarez Pérez, Iñaqui Arenas Martínez, Santiago Barat Cascante, Ana Barrero Hervás, Lorena Blanca Benito, Vanesa Bustos Sánchez, Mª José Cabornero Catalá, Ana Isabel Caminero Jiménez, Eva Mª. Campos Trujillo, Ramón Cano Cabezas, Emilio Cantarero Mateo, Angélica Casado García, Mª. del Mar Cava Valenciano, Felipe Cazorla Plaza, María Cerrato Gómez, Antonia Chamorro Bello, Margarita Cisneros González, Nerea D Departamento Técnico / Technical Department GERENTE / ADMINISTRATIVE DIRECTOR: Fortes Alba, Salvador ADMINISTRACIÓN / ADMINISTRATION Jefe/Head: García Martín-Delgado, Jaime Belda San Mateo, Eloy Berciano Ledesma, Juan Del Castillo Tamayo, Milagros Escribano Sánchez, Gloria García Arias, Ramón Gutiérrez García, Natividad Pallarés Vargas, Regina Plaza Diago, Loreto Rueda Cubero, Esteban Villar Pérez, Belén ANIMALARIO / ANIMAL FACILITY Jefe/Head: Palacín Urquijo, Javier Bordallo Martín-Fontecha, Miguel A. Cobeña Chivato, Miguel A. Díaz Riffo, Felipe Andrés García Martínez, Verónica Garuti Rodríguez, Helena Mª González Mella, Marta Méndez Río, Isabel Muñoz Fuentes, Jaime Alberto Pinel Ballesteros, Gema Quintana Fernández, Juan Antonio Revuelta Mayo, Patricia Rodríguez Fernández, Elena Rosco Pulido, Pilar Salgado Muñoz, Hugo Vera Meneses, Mª. Eugenia BIBLIOTECA / LIBRARY Jefe/Head: Gutiérrez García, Rosario Sanz Frías, Angeles COMPRAS Y ALMACÉN / PURCHASE DEPARTMENT Jefe/Head: Blanco Martín, José Luis Celestén Martín, Jose Miguel Corral Díaz, Margarita Fernández Martín, Mª Jose Hernández Sánchez, Lorenzo Madrid del Alamo, Remedios Pedraza Caro, Teodoro Pedraza Fernández, Teodoro CULTIVOS CELULARES / CELL CULTURE Alonso Hernández, Pilar Bustos Sánchez, Juana Gutiérrez García, Alfonso Rebelles Vicente, Juan Antonio 10 DISEÑO / DESIGN Aganzo Mateo, Pedro Belio López, José Ignacio Díaz Dorado, Carmen Galán González, José Mª FERMENTACIÓN / FERMENTATION INFORMÁTICA / COMPUTING Jefe/Head: Pemau Alonso, Pedro E Programa CSIC-INEM Tercera Escuela Taller “Severo Ochoa” de 2001 Técnicos de Antón González, Rocio Ayuela Butragueño, Belén Laboratorio / Cillan Capilla, José Luis Third Workshop Dávila de León , David Hevia Hernández, Elena “Severo Ochoa” for León Fernández, Gabriela López de la Fuente, Clemente Ramón Laboratory Martos Pérez, Carmen Technicians Muñoz Villalba, Pilar Bodas Gómez, Oscar Díaz Rodilla, Diego Díaz Rodríguez, Fidel Pérez García, María Peña Santos Martín, Tomas Ureña Rodríguez, Dionisio FOTOGRAFÍA / PHOTOGRAPHY Jefe/Head: Bautista Torres, Mariano QUÍMICA DE PROTEÍNAS Y PROTEOMICA / PROTEIN CHEMISTRY Jefe/Head: Vázquez Cobos, Jesús Pérez Gracia, José Antonio INSTRUMENTACIÓN / INSTRUMENTS AND EQUIPMENT Jefe/Head: Seguido de la Fuente, Lorenzo Calvo Romero, Manuel González Galán, Jesús González García, Julio Gutiérrez de la Cruz, Francisco Mejías Pozuelo, José Luis Muñoz Maqueda, Fernando Palomo Fernández, Marcos Pozuelo Torrijos, Jesús Zazo Chapinal, Antonio LAVADO Y ESTERILIZACIÓN / WASHING AND STERILIZATION Blanco Ferreras, Angeles Blanco Ferreras, Valentina Carrascal Blanco, Isabel Cobeña Chivato, Concepción Escribano Molina, Josefina Gil Pinto, Africa Martín Bermejo, María Nieves Sánchez Ramos, Montserrat Barahona Nieto, Fernando González-Nicolás Garrido, Josefa Jorge García, Alberto Marina Ramírez, Ana Isabel Ogueta Villarreal, Samuel Rogado Manzanares, Rosana SECUENCIACIÓN DE DNA / DNA SEQUENCING Jefe/Head: Modolell Mainou, Juan / Escarmís Homs, Cristina Cordón Polanco, Pedro Pablo Fernández Arias, Alfonso García Alarcón, Juan Luis González Díaz, Miguel Martín Izquierdo, Tomás Martos Valladares, César Montero Minguez, Emilio Romero Celada, Juan Miguel Zúñiga Parra, Ceferino SEGURIDAD BIOLÓGICA / BIOLOGICAL SAFETY Jefe/Head: Sánchez Sánchez, Angeles Guerra Rodríguez, Milagros Ocaña Romero, Francisca MICROSCOPIA ÓPTICA Y CONFOCAL / OPTICAL AND CONFOCAL MICROSCOPY Jefe/Head: Díez Guerra, Javier 2002 Cañete Parras, Antonia Mª Contreras López, Nieves Garrido, Gema Emilia Guindal Calleja, Susana Hernández Sierra, Rosana Méndez Río, Isabel Pérez Poza, Ludivina Rodera Pérez, Nelly Rodríguez Navas, Mª del Carmen Ruiz Orejón, Mª. Belén Tuero Gil-Delgado, Myriam Valeri Lozano, Paola Valladares Bartolomé, Mª.Cruz Vallejo Zabulegui, Jorge SECRETARIAS / SECRETARIAL Dirección / Management Board Morales Pájaro, Adelaida Gerencia / Administrative Director Condes Cano, Antonia Llaguno Pérez, Reyes General / Pool Horrillo Muñoz, Lucía Navarro Martínez, Carmen Ayuso Moreno, Mª. Luisa Carrasco Ramiro, Fernando Madueño Amor, Encarna MICROSCOPIA ELECTRÓNICA / ELECTRON MICROSCOPY Jefe/Head: Rejas Marco, Mª Teresa Ruiz Bouley, Rosa Mª. Ruiz Ibáñez, Jorge Antonio Sierra Filardi, Elena Urendez Morillas, Francisco RECEPCIÓN / RECEPTION Cabrerizo Las Heras, Luis Gil Marinas, Mª Jesús Ramiro Sánchez, Juan MANTENIMIENTO / MAINTENANCE Jefe/Head: Muñoz Diez, José Antonio F Arribas Arcones, Marisol Caparrós de la Jara, Gema Del Valle Sanz, Aurora Martínez García, Victor M. Ortega Molina, Isabel VIGILANCIA / SECURITY Barajas Marín, Manuel Delgado Rodríguez, Juan Antonio García García, Francisco Hidalgo Checa, Francisco Mirasol Burgos, Francisco Borja Parra García, Joaquín Tirado Morón, Antonio Muñoz Alcalá, Mª Angeles Sánchez Martín, Carlos Villalba Villacorta, Teresa 11 Profesores/Teachers Gutiérrez Erlandsson, Sylvia Ramos Ruiz, Ricardo Valle Sanz, Mercedes del Secretaria/Secretary Herrador Morales, Mercedes Alumnos/Students Alcaín Sánchez, Juan Alcaraz Iglesias, Gema Martínez Villacorta, Angel Manuel Castro Nieto, Jorge Cuesta Mejías, José Manuel Gosalbez López, Altea Gutiérrez Aldea, Modesta Martín-Francés Trigos, Enrique Palmeiro Cuesta, Gema Peralta Cañadas Nuria Pérez Carrero, Oscar Pérez Pulido, Miguel Postigo Haro, Fernando Prieto López, Rubén Ramajo Alonso, Jorge Ruíz García, Desiré Clones de células doble mutantes para patched 14 y dispatched en el disco imaginal de ala teñidos con GFP y con anticuerpos contra las proteinas Patched (azul) y beta-Gal (rojo). Las células mutantes para patched se marcan por la falta de color rojo. Las células mutantes para dispatched por la falta de color verde. Las células doble mutantes tienen una falta completa de color. Las distintas intensidades de verde y rojo corresponden a células silvestres y heterocigóticas para cada una de las mutaciones. 12 A Biología del Desarrollo Developmental Biology Antonio García-Bellido Isabel Guerrero Fernando Jiménez Díaz-Benjumea A.1 Análisis genético de mecanismos morfogenéticos en Drosophila A.1 Genetic analysis of morphogenetic mechanisms in Drosophila A.2 Mecanismos de señalización en el desarrollo A.2 Signalling mechanisms in development A.3 Comunicación intercelular en el desarrollo del Drosophila A.3 Cell-cell signalling in Drosophila development Juan Modolell A.4 Biología molecular del desarrollo A.4 Molecular biology of development Ginés Morata A.5. Control genético de la morfogénesis A.5 Genetic control of morphogenesis Biología del Desarrollo Developmental Biology A.1 Análisis genético de mecanismos morfogenéticos en Drosophila Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Antonio García-Bellido Control del tamaño del ala. Alelos letales e-mail: [email protected] en cinco loci producen autónomamente, en mosaicos genéticos, células más pequeñas y menos células por territorio (l(3)Me10), células más grandes y menos células (gig y cdc2) asi como células más pequeñas y El gen vestigial. Clones de sobreexpresión de vg causan transformaciones hacia tejido ala y expresión génica típica de ala si ocurren en territorios que ya expresan Wg. Los efectos morfogenéticos complejos (responsable de laboratorio) más células (EP(3)622 y ft). Otros fenotipos reflejan que vg está implicado, en combinación con otros genes, en el crecimiento distalizante del primordio de la región de ala propia. José Félix de Celis asociados revelan fallos en comunicación celular y de ahí en la generación local de valores posicionales. Regulación del gen spalt en el ala. Hemos identificado la región reguladora de spalt y Postdoctoral Fellows: Control de la forma del ala. Un análisis caracterizado los sitios de unión de diferentes factores de transcripción. Cassandra Extavour de clones gemelos permite definir donde Alvaro Glavic estaban las células madre del clon. La proliferación de las células del ala es intercalar y las células postmitóticas se Personal Científico / Scientific Staff: Juan Fenández Santarén Enrique Martín-Blanco Rosa Barrio Olano Postdoctorales / Becarios Predoctorales / Graduate Students: Jaime Resino de Castro Luis Alberto Baena López alocan preferentemente en el eje próximodistal o anterior-posterior dependiendo de la región del disco. Proteoma. Se están caracterizando los Eversión del disco. Lo que va a ser el péptidos de geles bidimensionales del disco imaginal de ala como referencia para José Carlos Pastor Pareja Cristina Molnar-Darkos Mª Dolores Morales García Cristina Cruz Rubio borde de contacto entre discos contralaterales e ipsolaterales está Jana Alonso Lorenzo predefinido por células que expresan puc Técnicos de Investigación / (de la ruta de la Jun K) en los discos imaginales. Esta ruta está relacionada con David Juanas Melero Technical Assistance: Almudena Hernando Bellido la relajación del citoesqueleto y la separación de células. La eversión tiene Mª Paloma Martín Fernández lugar por la apertura de agujeros alrededor Ana López Varea del tallo que luego coaslecen y desplazan a las células epidérmicas larvarias. Rosario Hernández Baeza Carmen Alonso Barba Mutagénesis de exceso de función. Hemos mapeado 500 inserciones PUAS cuya sobreexpresión afecta la diferenciación de las venas. Mar Casado García Clones gemelos (rojo y amarillo) en las regiones dorsal (A) y ventral (B) de ala ilustrando que su forma y tamaño depende de cada territorio del disco. 14 detectar cambios mutacionales. Genetic analysis of morphogenetic mechanisms in Drosophila Research summary Publicaciones/Publications: The gene vestigial. Clones of cells over expressing vg lead to ectopic Size control. Lethal alleles in 5 loci transformations to wing blade in territories autonomously cause, in genetic mosaics in the wing, smaller cells and clones that already express wg. The morphogenetic effects are complex, (l(3)Me10), larger cells but small clones (gig y cdc2) and smaller cells but larger territories (EP(3)622 y ft). Other other genes in the distalization of the wing. associated phenotypes reveal failures in cell communication what suggests that growth is determined by the local generation of positional values. Shape control. Twin-clon analysis indicates the position of mother cells and subsequent daughter cell allocation. Cell proliferation in the wing is intercalary and daughter cells allocate preferentially either the proximo-distal or antero-posterior axis depending on the region of the wing. Disc eversion. The prospective border of contact between discs is predefined by the expression of puc (Jun K pathway) a pathway related to the relaxation of the cytoskeleton and loosening of cells. The actual eversion takes place by indicating that vg acts in combination with Regulation of spalt expression in the wing disc. We have identified the DNAregulatory region driving spalt expression in the wing disc, and characterised the binding sites of several transcription factors. Gain of function screening. We have mapped 500 insertions of a PUAS element affecting vein differentiation and wing growth. Proteome. We continue the catalogation and characterization of wing proteins in two-dimensional gels for comparisons between wildtype and mutants. coalescence of holes in the stalk of the Extavour, C., García-Bellido, A. (2001) Germ cell selection in genetic mosaics in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 11341-11346 Mollerau B., Dominguez, M., Webel, R., Colley, N.J., Keung, B., de Celis, J.F., Desplan, C. (2001) Two-step process of photoreceptor formation in the Drosophila eye. Nature 412, 911-913 Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Techanu, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. (2001) Spalt restricts EGFR mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila. Development 128, 711722 López, P.P., Santarén, J.F., Ruiz, M.F., Esponda, P., Sanchez, L. (2001) The Drosophila melanogaster Xlinked mfs(1)6E locus is required for production of normal seminal fulid by the male accessory glands. Exp. Cell Res. 267, 1-12 Rodríguez, J.M., Salas, M.L., Santarén, J.F. (2001) African swine fever virus-induced polypeptides in porcine macrophages and in Vero cells: A high resolution two dimensional analysis. Proteomics 1, 1447-1456 Resino, J., Salama-Cohen, P., García-Bellido, A. (2002) Determining the role of patterned cell proliferation in the shape and size of the Drosophila wing. PNAS 99, 75027507 Rusten, T.E., Cantera, R., Kafatos, F.C., Barrio, R. (2002) The role of TGF- signaling in the formation of the dorsal nervous system is conserved between Drosophila and chordates. Development 129, 3575-3584 Cantera, R. Lüer, K., Rusten, T.E., Barrio, S., Kafatos, F.C., Technau, G.M. (2002) spalt mutations cause a severe but reversible neurodegenerative phenotype in the embryonic central nervous system of Drosophila melanogaster. Development 129, 5577-5586 disc and subsequent elimination of larval epidermal cells. Premios / Awards - Doctor Honoris Causa por la Universidad Miguel Hernández de Alicante, 2001. - Miembro Electo del Neuroscience Institute. USA, 2001. Tesis Doctorales / Doctoral Theses Jaime Resino de Castro. 2002. “Tamaño y Proliferación en el Disco Imaginal de Drosophila melanogaster”. Universidad Autónoma de Madrid. Twins clones (red-yellow pairs) in the dorsal (A) and ventral (B) wing imaginal disc. The size and shape of the clones characteristically varies with the different regions. 15 Biología del Desarrollo Developmental Biology A.2 Mecanismos de señalización en el desarrollo Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Isabel Guerrero e-mail: [email protected] Personal Científico / Scientific Staff: Nicole Gorfinkiel Isabel Rodríguez Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Ainhoa Callejo Graciela Carrillo Verónica Martín Becarios Predoctorales / Graduate Students: Carlos Torroja Javier Sierra Elvira Benitez Estudiantes / Undergraduate Students: Ruth Muñoz Mario Torrado Usue Martínez Técnico de Investigación / Technical Assistance: Carmen Ibañez El desarrollo de las estructuras adultas de de Hh por Ptc no se requiere para la señalización de Hh siendo necesaria esta endocitosis de Hh solo para controlar su Drosophila melanogaster se ha utilizado como sistema modelo para el estudio de la inducción de patrones morfogenéticos. En degradación. Por otra parte, existen varias líneas de evidencia que indican una relación del colesterol y los lípidos con la vía de Hh. cada estructura adulta de la mosca, la proteína Hedgehog (Hh) induce la activación Se ha demostrado que el colesterol se requiere para la respuesta a la vía de Hh. De acuerdo con este requerimiento, en Ptc se ha identificado unas secuencias (dominio de nuevas señales morfogenéticas desde el centro organizador anterior / posterior, tales como los factores de secreción Wingless (WG) y Decapentablegic (DPP), sensible a esterol (SSD)), que presentan homología con las proteínas que controlan pertenecientes a las familias proteicas Wnt and TGF-` respectivamente. Esta cascada de inducción de señales es clave para el desarrollo de todos los apéndices de la mosca. Uno de los problemas mas la homeostasis de colesterol. Nosotros hemos encontrado que mutaciones en el fascinantes actualmente en biología es la proteína mutante de Ptc. entender como este tipo de señales morfogenéticas se secretan y difunden, y como las células las reciben e interpretan. Paralelamente, estamos estudiando la En los últimos años nos hemos centrado en el estudio de los mecanismos de señalización de Hh debido a su importancia en enfermedades humanas (holoprosencefalia, polidactilia, carcinomas de células básales, meduloblastomas, etc.). dominio SSD de Ptc abren constitutivamente la vía de Hh y sin embargo, no impiden el reconocimiento e internalización de Hh por morfogénesis de la genitalia en Drosophila. El disco genital, del cual deriva la terminalia, es desde el punto de vista morfogenético muy interesante ya que para su desarrollo es necesaria la interacción entre los genes de formación de patrón y los genes de determinación sexual. Hasta ahora, hemos establecido los parámetros que intervienen Estudiando el receptor de Hh, Patched (Ptc), hemos identificado dos dominios funcionales en su proteína ya que ciertas en la organización del disco genital y como mutaciones afectan solo a la difusión de Hh y otras solo a la interacción con diferencialmente en el macho y en la hembra por los genes de determinación segundos mensajeros. sexual. Hemos demostrado que la internalización Clones de células doble mutantes para patched 14 y dispatched en el disco imaginal de ala teñidos con GFP y con anticuerpos contra las proteinas Patched (azul) y beta-Gal (rojo). Las células mutantes para patched se marcan por la falta de color rojo. Las células mutantes para dispatched por la falta de color verde. Las células doble mutantes tienen una falta completa de color. Las distintas intensidades de verde y rojo corresponden a células silvestres y heterocigóticas para cada una de las mutaciones. 16 las respuestas a las vías de señalización de Hh, Wg y Dpp están controladas Signalling mechanisms in development Publicaciones/Publications: Research summary The development of the adult structures of Drosophila melanogaster has been used as a model system to study the induction of the morphogenetic processes. In each fly structure, extra-cellular signaling molecules from specialized the internalization of Hh by Ptc is not Mullor, J.L., Guerrero, I. (2000) A gain-of-function mutant required for Hh signaling. However, this Hh internalization is required for Hh degradation to control the Hh morphogenetic gradient. Besides, there are several evidences that indicate a of patched dissects different responses to the Hedgehog relationship of cholesterol and lipids with groups of cells, termed organizers, supply the information for these morphogenetic processes. Thus, Hedgehog protein (Hh) induces from the anterior/ posterior the Hh pathway. It has been demonstrated that cholesterol is required for Hh response in the receiving cells. In this context, a sterol sensing domain (SSD) has been identified in Ptc. Other proteins organizer the activation of new morphogenetic signals, such as Wingless (Wg) and Decapentaplegic (Dpp) that with this SSD domain are involved in the control of cholesterol homeostasis. We have found that mutations in the SSD belong to the super-families Wnt and TGF-` respectively. This signaling cascade is fundamental for the domain constitutively open the Hh gradient. Dev. Biol. 228, 211-224 Sánchez, L., Gorfinkiel, N., Guerrero, I. (2001) Sex determination genes control the development of the Drosophila genital disc modulating the response to Hedgehog, Wingless and Decapentaplegic signals. Development 128, 1033-1043 Martín, V., Carrillo, G., Torroja, C., Guerrero, I. (2001) The sterol-sensing domain of Patched protein seems to control Smoothened activity through Patched vesicular trafficking. Curr. Biol. 11, 1-7 pathway but do not avoid the internalization of Hh by Ptc. Sánchez, L., Guerrero, I. (2001) The development of development of all the fly appendages. One of the most fascinating problems in Simultaneously, we are studying the Gorfinkiel, N., Sánchez, L., Guerrero, I. (2003) biology is to understand how these development of the genitalia in Drosophila. Development of the Drosophila genital disc requires morphogenetic signals are secreted and interactions between its segmental primordia. diffuse and how the receiving cells The development of the genital disc, which gives rise to the genitalia and analia of interpret them. the adult fly, requires the activity of both Due to the importance of Hh signaling patterning and sex determination genes. We have first established the segmental pathway in human diseases organization of the genital disc as well as (holoprosencephaly, polidactily, basalcell-carcinomas, medullablastomas, etc) the expression and requirement of several we are studying the mechanism of Hh signaling. For the last few years, we have patterning genes for the development of the genitalia. Next, we have found that the sex determination genes control the analyzed the function of Patched (Ptc), development of the genital discs the Hh receptor molecular and genetically. We have identified two Ptc functional modulating the responses to Hh, Wg, and Dpp signals. This modulation of the domains because some ptc mutations affect only the Hh diffusion and others signaling pathways by the sex genes is the key mechanism in the development only the interaction of Ptc with second messengers. We have demonstrated that of either male or female structures. 17 the Drosophila genital disc. Bioessays 23, 698-707 Development 130, 295-305 Patente / Patent Application Number PCT/GB01/04891 Method for detecting inhibitors of tumor growth. Biología del Desarrollo Developmental Biology A.3 Comunicación intercelular en el desarrollo del Drosophila Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Fernando Jiménez Díaz-Benjumea El ala de Drosophila se desarrolla por la La especificación de la articulación del ala El suceso más temprano en la organización del eje PD del disco de ala es la e-mail: [email protected] acción combinada de dos diferentes organizadores: el anterior-posterior (AP) y Estudiantes / el dorsal-ventral (DV). Estos dos Undergraduate Students: organizadores se sitúan en el disco en los bordes de expresión de los genes selectores engrailed y apterous, los cuales determinan determinación del destino ala por el gen vestigial (vg) en el desarrollo larvario temprano. Más tarde en el desarrollo, interacciones celulares en el borde del dominio de expresión de vg activan la los compartimentos posterior y dorsal del expresión de una serie de genes que ala respectivamente. Interacciones celulares median la activación de los genes decapentaplegic (dpp) y wingless (wg) en los organizadores AP y DV respectivamente. promueven el desarrollo de la articulación del ala. Nuestro objetivo es identificar los genes involucrados en el desarrollo de la articulación y los componentes de esta ruta de señalización intercelular. David del Álamo Rodríguez Javier Terriente Félix dpp y wg codifican moléculas difusibles que promueven el desarrollo del ala mediante la activación de diferentes genes diana. El eje próximo-distal (PD) del disco no se desarrolla por la acción de un tercer organizador, sino que es la acción combinada de Dpp y Wg la que activa la expresión de una serie de genes que se considera que definen el eje PD. Nuestro trabajo está dirigido al análisis de diferentes aspectos del desarrollo del ala en el eje PD. Patrones de expresión de wingless (rojo) y engrailed (verde) en un disco de ala silvestre (izquierda) y mutante para omb (derecha). En mutantes omb, wingless se expresa ectópicamente en las células anteriores del borde de compartimento AP del ala. 18 La función del gen optomotor-blind (omb) en el desarrollo del ala El gen omb codifica una proteína nuclear con un dominio T-box. Su expresión en el disco de ala es activada por la acción combinada de las rutas de Dpp y Wg. El fenotipo mutante sugiere que omb tiene un papel primordial en el desarrollo del ala, aunque su función real no se conoce. Nuestro objetivo es estudiar la función de omb y de otros genes involucrados en el desarrollo del eje PD del ala. Cell-cell signalling in Drosophila development Publicaciones/Publications: Research Summary The Drosophila wing is patterned by the combined action of two different organizers: the anterior-posterior (AP) and the dorsal-ventral (DV). These two organizers are placed in the disc at the borders of expression of the selector genes engrailed and apterous, which specify the P and the D compartments of the wing respectively. Cell interactions mediate the activation of the genes decapentaplegic (dpp) and wingless (wg) at the AP and DV organizers respectively. The specification of the wing hinge The earliest event in PD patterning in the wing disc is the specification of the wing fate by the gene vestigial (vg) in early larval development. Later in development cell interactions at the border of the vgexpression domain drive the expression of a set of genes that promotes the growth of the wing hinge. Our goal is to identify and to characterize both the genes involved in the development of the wing hinge and the components of this cellsignalling pathway. dpp and wg encode diffusible molecules The function of the gene optomotor- that pattern the disc through the activation of different target genes. blind (omb) in wing development The gene omb encodes a T-box protein. omb expression in the wing disc is The proximal-distal (PD) axis of the disc otherwise the combined action of Dpp activated by the combined action of Dpp and Wg. The omb mutant phenotype suggests that it plays an important role and Wg is required to activated a set of in wing development but its real function genes that, it is considered, defines the PD axis. Our work is focused in different aspects of PD wing patterning: is not known. Our goal is to study the function of omb and of other genes involved in the development of the PD axis of the wing. is not patterned by a third organizer, Wingless (red) and engrailed (green) patterns of expression in wild-type (left) and omb mutant (right) wing discs. In omb wingless is ectopically expressed in the anterior side of the AP compartment boundary of the wing blade. 19 del Alamo Rodríguez, D., Terriente, J., Díaz-Benjumea, F. J. (2002) Spitz-EGFr signalling via the Ras/MAPK pathway mediates the induction of bract cells in Drosophila legs. Development 129, 1975-19822 del Alamo Rodríguez, D., Terriente, J., Galindo, M. I., Couso, J. P., Díaz-Benjumea, F. J. (2002) Different mechanisms initiate and maintain wingless expression in the Drosophila wing hinge. Development 129, 39954004 Biología del Desarrollo Developmental Biology A.4 Biología molecular del desarrollo Resumen de investigación Jefe de Línea / Group Leader: Juan Modolell e-mail: [email protected] Personal Científico / Scientific Staff: Sonsoles Campuzano José-Luis Gómez-Skarmeta Isabel Rodríguez Mar Ruiz-Gómez Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Florencia Cavodeassi Sol Sotillos Becarios Predoctorales / Graduate Students: Marta Carrasco Especificación territorial. Un proceso importante durante el desarrollo es la subdivisión de un epitelio en distintos territorios. La subdivisión que separa el ala (apéndice) del mesotórax (tronco) de Drosophila depende de los genes iroquois Annalisa Letizia María Eugenia Villa Técnicos de Investigación / Technical Assistance: Eva Caminero Elisa de la Calle Paloma Martín caracterizando varias de las secuencias reguladoras (enhancers) responsables de la expresión espacial y temporalmente regulada de los genes Iro-C. (Iro-C) puesto que su ausencia del mesotórax dorsal transforma a éste en ala. Miogénesis. Los músculos de Drosophila son sincitios formados por fusión de mioblastos. Previamente a la fusión, los Hemos demostrado que la señalización del mioblastos se subdivid en subtipos, siendo morfógeno Decapentaplegic, que proviene del territorio de ala, confina la expresión del Iro-C al territorio del tronco, y define por esta segregación fundamental para que progrese la miogénesis. Esto se debe a la tanto la subdivisión entre estos territorios. Se está investigando en la actualidad la función de genes adicionales (msh y islet=tail-up) en estas especificaciones y/o subdivisiones. Joaquín de Navascués Luis María Escudero Control de la expresión de los genes Iro. Hemos identificado y estamos Inhibición lateral. La señalización entre las células de un grupo proneural mediada por el receptor Notch limita el número de células que pueden devenir precursores naturaleza asimétrica de la fusión, que implica dos poblaciones de mioblastos: fundadores y competentes en fusión. Estamos utilizando una combinación de técnicas genéticas, celulares y moleculares para estudiar el control de la miogénesis, centrándonos en el proceso de la diversificación de los mioblastos. Para ello, estamos caracterizando funcionalmente genes específicos de las distintas subpoblaciones. nerviosos (inhibición lateral). En colaboración con el grupo de Jui-Chou Hsu en Taiwan, hemos demostrado la función Función de los genes iro en vertebrados. Hemos comprobado que los genes iro en Xenopus (Xiro) participan en múltiples de la proteína de membrana Echinoid de potenciar la señalización de Notch. procesos del desarrollo. Así, los genes Xiro Función de DaPKC. Los complejos se requieren para la formación del organizador de Spemman y el multiproteicos Par-3/Par-6/aPKC y Crumbs/Discs lost/Stardust se requieren para el establecimiento de la polaridad apicobasal de las células epiteliales en vertebrados e invertebrados. Hemos demostrado que, en Drosophila, ambos complejos interaccionan físicamente, que aPKC fosforila in vitro a Crumbs y que esta fosforilación se require para la actvidad in vivo de Crumbs. En colaboración con el grupo de J. Moscat. La expresión forzada de chn provoca la activación del gen proneural scute (rojo) y la aparición de numerosos órganos sensoriales extra (amarillo). 20 establecimiento del neuroectodermo. Estos procesos tienen lugar a través de la represión de Bmp4 por las proteínas Xiro. Por otro lado, en estadios más tardios, los genes Xiro se requieren para el establecimiento y mantenimiento del organizador secundario localizado entre el cerebro medio y el cerebro posterior, y para coordinar la salida del ciclo celular y la diferenciación de las neuronas primarias. Molecular biology of development Publicaciones/Publications: Research Summary Control of Iro genes expression. We have identified and are in the process of Territorial specification. The subdivision of an epithelium in distinct territories is an important process during development. characterizing several regulatory sequences (enhancers) that govern the spatially and temporally restricted The subdivision that separates a Drosophila appendage (wing) of the trunk (mesothorax) depends on the iroquois expression of the Iro-C genes. (iro) genes, since their removal transforms the dorsal mesothorax into wing hinge. syncytial fibres formed by cell fusion. In Drosophila the subdivision of the We have shown that signaling by the mesoderm into different populations is essential for normal myogenesis and muscle patterning. This is so because Decapentaplegic morphogen, which emanates from the wing territory, confines iro expression to the trunk territory and Myogenesis. Muscles in Drosophila are thereby defines the subdivision between these territories. The function of msh and myoblast fusion is a polar process that involves two kinds of myoblasts: founders and fusion-competent myoblasts. We use islet=tail-up in these specifications and subdivisions is being examined. a combined genetic, cellular and molecular approach to study how myogenesis is regulated and the role of myoblast Lateral inhibition. Notch signaling between cells of a proneural cluster limits the number of its cells that can become diversification in this control. To this purpose, we are functionally characterizing neural precursors (lateral inhibition). In collaboration with Jui-Chou Hsu (Taiwan), populations of myoblasts. we have shown that the trans-membrane Function of vertebrate iro genes. We have found that Xenopus iro genes (Xiro) protein Echinoid potentiates Notch signaling. Function of DaPKC. The multiprotein complexes Par-3/Par-6/aPKC and Crumbs/Discs lost/Stardust are requiered genes specific of the different sub- participate in multiple processes during development. Thus, Xiro genes are required to form the Spemman organizer and the prospective neuroectoderm. These processes take place through Xiro- to stablish apicobasal polarity in epithelial mediated Bmp4 downregulation. In cells, both in vertebrates and in invertebrates. We have shown that both addition, at later stages, Xiro genes are required for the formation and maintenance of the midbrain-hindbrain secondary organizer and for coordinating cell cycle exit and differentiation of primary complexes physically interact, that aPKC phosphorylates Crumbs in vitro and that this phosphorylation is required for the in vivo activity of Crumbs. In collaboration with J. Moscat group. neurons. Benos, P.V., Modolell, J., et al. (2001) From first base: the sequence of the tip of the X chromosome of Drosophila melanogaster, a comparison of two sequencing strategies. Genome Res. 11, 710-730 Campuzano S. (2001) Emc, a negative HLH regulator with multiple functions in Drosophila development. Oncogene 20, 8299-8307 Cavodeassi, F., Modolell, J., Gomez-Skarmeta, J.L. (2001) The Iroquois family of genes: from body building to neural patterning. Development 128, 2847-2855 Culi, J., Martin-Blanco, E., Modolell, J. (2001) The EGF receptor and N signalling pathways act antagonistically in Drosophila mesothorax bristle patterning. Development 128, 299-308 Glavic, A., Gómez-Skarmeta, J.L., Mayor, R. (2001) Xiro1 controls mesoderm patterning by repressing bmp-4 expression in the Spemann organizer. Dev. Dyn. 222, 368-376 Gomez-Skarmeta, J., de La Calle-Mustienes, E., Modolell, J. (2001) The Wnt-activated Xiro1 gene encodes a repressor that is essential for neural development and downregulates Bmp4. Development 128, 551-560 Martin, B.S., Ruiz-Gomez, M., Landgraf, M., Bate, M. (2001) A distinct set of founders and fusion-competent myoblasts make visceral muscles in the Drosophila embryo. Development 128, 3331-3338 Cavodeassi, F., Rodríguez, I., Modolell, J.(2002) Dpp signalling is a key effector of the wing-body wall subdivision of the Drosophila mesothorax. Development 129, 3815-3823 Claveria, C., Caminero, E., Martinez-A , C., Campuzano, S., Torres, M. (2002) GH3, a novel proapoptotic domain in Drosophila Grim, promotes a mitochondrial death pathway. EMBO J. 21, 3327-3336 de la Calle-Mustienes, E., Glavic, A., Modolell, J. GómezSkarmeta, J.L. (2002) Xiro homeoproteins coordinate cell cycle exit and primary neuron formation by upregulating neuronal-fate repressors and downregulating the cell-cycle inhibitor XGadd45- . Mech. Dev. 119, 6980 a de la Calle-Mustienes, E., Modolell, J., Gómez-Skarmeta, J.L. (2002) The Xiro-repressed gene CoREST is expressed in Xenopus neural territories. Mech. Dev. 110, 209-211 Dutta, D., Bloor, J.W., Ruiz-Gomez, M., VijayRaghavan, K., Kiehart, D.P. (2002) Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4UAS-driven expression of GFP fused to the actin-binding domain of moesin. Genesis 34, 146-151 Glavic, A., Gomez-Skarmeta, J.L., Mayor, R. (2002) The homeoprotein Xiro1 is required for midbrain-hindbrain boundary formation. Development 129, 1609-1621 Gómez-Skarmeta, J,L., Modolell, J. (2002) Iroquois genes: genomic organization and function in vertebrate neural development. Curr. Opin. Genet. Dev. 12, 403408 Pena-Rangel, M.T., Rodríguez, I., Riesgo-Escovar, J.R. (2002) A misexpression study examining dorsal thorax formation in Drosophila melanogaster. Genetics 160, 1035-1050 Peter, A., Modolell, J., et al. (2002) Mapping and identification of essential gene functions on the X chromosome of Drosophila. EMBO Rep. 3, 34-38 Ruiz-Gómez, M., Coutts, N., Suster, M.L., Landgraf, M., Bate, M. (2002) myoblasts incompetent encodes a zinc finger transcription factor required to specify fusioncompetent myoblasts in Drosophila. Development 129, 133-141 Forced expression of chn promotes activation of the proneural gene scute (red) and the emergence of many extra sensory organs (yellow). Premios / Awards / Other Activities Juan Modolell, Premio Rey Jaime I de Investigación, 2002 Workshop on Neural Prepatterning and Specification. Fundación Juan March. Junio 2001 21 Biología del Desarrollo Developmental Biology A.5 Control genético de la morfogénesis Resumen de Investigación Jefes de Linea / Group Leaders: Ginés Morata Ernesto Sánchez-Herrero* e-mail: , e-mail: [email protected] En nuestro laboratorio co-existen dos grupos de trabajo, dirigidos por G. Morata y por E. Sánchez-Herrero respectivamente, que desarrollan líneas de investigación independientes dentro del área del control genético del desarrollo de Drosophila.. Personal Científico / Scientific Staff: Natalia Azpiazu Manuel Calleja, Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Hector Herranz Eduardo Moreno Magali Suzanne Becarios Predoctorales / Graduate Students: Silvia Aldaz Carlos Estella Beatriz Estrada David Foronda Francisco Martín Luis de Navas Ainhoa Perez Técnicos de Investigación / Technical Assistance: Angelica Cantarero Rosa González * Jefe de Línea asociado / Associate Group Leader Durante el periodo 2001-2002 el grupo dirigido por G. Morata ha desarrollado tres líneas de trabajo principales: 1) Identificación y estudio de las subdivisiones genéticas en los discos imaginales, 2) Estudio de los genes que delimitan el eje dorsoventral del embrión, y 3) Análisis de los mecanismos de control de tamaño en el ala. Con respecto al primer apartado se están estudiando dos genes que codifican para factores de transcripción con homeodominio y que muestran expresión restringida en el tórax adulto. El gen muscle specific homeobox (msh) funciona en la región torácica lateral, mientras que eyegone (eyg) está activo en la región mas anterior y central del tórax. El estudio de ambos genes se está realizando mediante la inducción de mutaciones y experimentos de expresión dirigida por el método Gal4/UAS. Los resultados demuestran que juegan un papel crítico en el proceso de subdivisión genética del notum. En el caso de eyg se ha demostrado que está activado por los genes iroquois and pannier (pnr) y que media la función torácica de estos. El análisis de la especificación dorsoventral (D/V) del embrión se ha centrado en la función de pnr, buttonhead (btd) y LP1 tres genes que se expresan en regiones específicas a lo largo del eje D/V. Los resultados con pnr indican que este gen tiene una función selectora en el embrión similar a la que ejerce en el adulto, especificando el desarrollo de la región mediodorsal y regulando la actividad de los genes que especifican el desarrollo de zonas dorsales adyacentes. La función de btd en la región ventral está restringida a la formación del Sistema Nervioso y de los primordios de los discos imaginales ventrales, de antena, pata y genital. En ausencia de la función de btd y su gen gemelo D-Sp1 no se forman las estructuras ventrales del adulto. LP1 se expresa en la amnioserosa, la región mas dorsal del embrión y su papel parece estar relacionado con la respuesta a la señal Dpp. 22 El estudio de los mecanismos de control de tamaño es un tema reciente en el laboratorio, pero relacionado con experimentos realizados hace mas de 25 años, cuando se encontró que en los discos imaginales las células de crecimiento lento son eliminadas si co-existen con células que se dividen mas rápidamente. Este fenómeno se denominó “competición celular” e implicaba la existencia de mecanismos de comunicación entre células que distinguen ritmos diferentes de proliferación. Recientemente se ha encontrado en el laboratorio que la eliminación por competición celular se debe a apoptosis originada por niveles diferentes de función de la vía Dpp. En la actualidad se está estudiando la relación funcional entre la actividad de la vía Dpp, el crecimiento del ala y la aparición de apoptosis. Los resultados indican que la función principal de Dpp es activar crecimiento, pero esta función está antagonizada por dos genes que a su vez son regulados por la vía Dpp, daughters against dpp (dad) y brinker (brk). El tamaño del ala de Drosophila parece ser el resultado del compromiso de estas dos funciones antagónicas. El grupo dirigido por E. Sánchez-Herrero estudia los mecanismos por los que los genes Hox confieren especificidad en el eje antero-posterior de Drosophila melanogaster. El gen Hox Abdominal-B es necesario para formar la genitalia y, en su ausencia ésta se transforma en una pata o una antena. Estos dos apéndices comparten con la genitalia una información posicional común, que es modificada por Abdominal-B para la formación de esta estructura. Para ello, Abdominal-B reprime genes característicos de la pata o la antenna. Si bien éstos apéndices son similares en varios aspectos de su desarrollo, hemos caracterizado dos genes adyacentes y con gran similitud de secuencia que no se expresan en la pata pero sí en la antena, además de en el ojo. La expresión ectópica de cualquiera de estos dos genes, que hemos llamado Hernández y Fernández, produce antenas u ojos ectópicos. El que se desarrolle una u otra estructura depende, al menos en parte, de la vía de señalización del gen Notch. Nuestros resultados desarrollan estudios previos sobre la relación de genes Hox y vías de señalización, determinan algunos de los mecanismos por los que se especifican diferentes estructuras en la mosca e identifican dos genes que median la función de genes Hox para la formación de distintos apéndices. Genetic control of morphogenesis Publicaciones/Publications: Research Summary In the laboratory there two research groups, led by G. Morata and E. SanchezHerrero respectively, centered on the genetic control of Drosophila development. During the 2001-2002 period the research work by the Morata group has been focussed in three major lines 1) Identification and study of new genetic subdivisions in the imaginal discs, 2) Study of the genes that establish the dorsal-ventral body axis in the embryo and 3) Analysis of the mechanisms controlling the size of the wing. Regarding the first issue, there are two genes encoding homeodomain transcription factors and that are expressed in restricted domains of the thorax. The muscle specific homeobox (msh) gene functions in the lateral region whereas eyegone (eyg) is active in the anterior central region. The function of the two genes is being studied by inducing mutations and by misexpression experiments with the Gal4/UAS method. The results so far indicate that the two genes play critical roles in the subdivision of the thorax. For eyg it has been shown that it functions downstream the thoracic genes iroquois and pannier (pnr) and mediates their patterning function. In the analysis of the embryonic dorsalventral (D/V) specification, the work focused on three genes, pnr, buttonhead (btd) and LP1, which are expressed in distinct zones along the D/V axis. In the case of pnr the evidence is that it has a selector-like function similar to that reported for the adult structures; it specifies the development of the mediodorsal region and interacts with other genes like iro and spalt responsible for the development of other dorsal regions. In contrast, btd function is restricted to the Nervous System and the ventral discs primordia, antennal, leg and genital. The loss of btd function and of the related gene Dsp-1 the ventral adult structures do not form. The LP1 gene is expressed in the most dorsal zone of the embryo, the amnioserosa, and its function appears to be related with the diffusion and response to the Dpp signal, which in the embryonic development has a dorsalising function. The analysis of the size control mechanisms is a new research topic in the group but related to experiments originated in the laboratory about 27 years ago (Morata and Ripoll, Dev. Biol. 1975). It was found that in the wing disc cells that divide slowly are eliminated if they co-exists in the same polyclone with faster dividing cells. This phenomenon was called “cell competition” and implied the existence of a cell communication process that discriminates cells with different proliferation rates. Recent work in the laboratory has shown that the elimination of slow dividing cells is due to apoptosis triggered by low levels of activity of the Dpp signalling pathway. Experiments under way try to establish a functional connection between Dpp activity, growth of the wing and apoptosis. Preliminary results indicate that the Dpp pathway promotes growth but this activity is antagonised by those of two genes, daughters against dpp (dad) and brinker (brk), which in turn are regulated by Dpp. The final size of the Drosophila wing appears to be the result of these two antagonistic forces. The group headed by E. Sanchez-Herrero is studying the mechanisms responsible for the Hox genes specificity in the determination of the anteroposterior axis in Drosophila. The Hox gene AbdominalB (Abd-B) is required to determine the genitalia and, in its absence, this is transformed into leg or antenna. These two appendages share with the genitalia a common positional information that is modified by Abd-B to form this structure. This is achieved by Abd-B repressing genes characteristic of legs or antennae. These two appendages are similar in many respects, however, we have identified two adjacent genes with a similar sequence that are expressed in the antenna (and the eye) but not in the leg. Ectopic expression of either of these two genes, that we have called Hernández and Fernández, makes ectopic eyes or antenna. Whether one or another structure is made depends in part on the activity of the Notch gene. We have extended previous results as to the relationship of Hox genes and signalling pathways, determined some of the mechanisms to specify fly structures and characterised two genes that mediate Hox information to make different appendages. Morata, G. (2001) How Drosophila appendages develop. Nature Reviews Mol. Cell Biol. 2, 89-97 Morata, G. (2001) La Historia de los genes Homeóticos. Arbor 662, 229-246 Estrada, B., Sánchez-Herrero, E. (2001) The AbdominalB Hox gene of Drosophila antagonizes appendage development. Development 128, 331-339 Morata, G. (2001) Compartmentalization. Encyclopedia of Genetics (Ed. Sydney Brenner and Jeffrey H. Miller) Academic Press, New York pp 426-427 Estrada, B., Sánchez-Herrero, E. (2001) To see or not to see. The ELSO Gazette: http://www.the-elsogazette/magazines/issue5/ mreviews12.asp) Issue 5. Morata, G. (2001) La revolución biológica y el futuro del hombre. En “Las incertidumbres de un mundo en mutación”. Vol. 1. pp 109-117 Forum Deusto, Universidad de Deusto Bilbao Herranz, H., Morata, G. (2001) Different functions of pannier during Drosophila embryogenesis. Development 128, 4837-4846 Moreno, E., Basler, K., Morata, G. (2002) Cells compete for the Decapentaplegic survival factor to prevent apoptosis in Drosophila wing development. Nature 416, 755-759 Calleja, M., Renaud, O., Usui, K., Pistillo, D., Morata, G., Simpson, P. (2002) How to pattern an epithelium: lessons from achaete-scute regulation on the notum of Drosophila” Gene 292, 1-12 Azpiazu, N., Morata, G. (2002) Distinct functions of homothorax in leg development in Drosophila. Mechanisms of Development 119, 55-67 Morata, G. (2002) The blueprints of animals revealed. In “Knowledge from Nature: Twenty-one discoveries that changed the world” Seminal Nature. Garwin, L. and Lincoln, T. (Eds.) pp 189-197 Japanese edition Estrada, B., Casares, F., Busturia, A., Sánchez-Herrero, E. (2002) Genetic and molecular characterization of a novel iab-8 regulatory domain in the Abdominal-B gene of Drosophila melanogaster. Develoment 129, 51955204 Tesis Doctorales / Doctoral Theses Beatriz Estrada. 2001. “Estudio de la regulación y función del gen Hox Abdominal-B de Drosophila melanogaster”. Universidad Autónoma de Madrid. Hector Herranz. 2002. “Estudio de la función del gen pannier en el desarrollo embrionario de Drosophila melanogaster”. Universidad Autónoma de Madrid. Premios / Awards / Other Activities Ginés Morata. Miembro del Comité Científico del Centro de Reuniones Internacionales de Biología de la Fundación Juan March, desde 2001. Ginés Morata. Miembro del Comité Evaluador del Instituto de Investigaciones Bioquímicas de la Fundación Campomar. Buenos Aires (Argentina) Abril, 2001. Ginés Morata. Premio Nacional Santiago Ramón y Cajal de Investigación en Biología 2002. Ginés Morata. Miembro del Scientific Advisory Committee of the European Molecular Biology Laboratory (EMBO), desde 2002. 23 Proliferación (A) y muerte (B) de una célula tumoral. A, Anafase: mitocondrias, verde; cromátidas, azul; microtúbulos del huso acromático, rojo. B, Apoptosis: DNA fragmentado (azul) y mitocondrias hinchadas (verde). Proliferation (A) and death (B) of a tumour cell. A, Anaphase: mitochondria, green; chromatids, blue; microtubules of the mitotic spindle, red. B, Apoptosis: fragmented DNA (blue) and swollen mitochondria (green). 24 B Biología Celular Cell Biology Isabel Correas B.1 Citoesqueleto y nucleoesqueleto B.1 Cytoskeleton and nucleoskeleton José M. Cuezva B.2 Mecanismos de regulación de la biogénesis mitocondrial y alteración mitocondrial en cáncer B.2 Mechanisms that regulate the biogenesis of mitochondria and mitochondrial alterations in cancer Marta Izquierdo B.3 Terapia génica experimental B.3 Experimental gene therapy Francisco Moreno B.4 Desarrollo neuronal y neurodegeneración B.4 Neuronal development and neurodegeneration B.5 Señalización celular por PKC atípicas en inmunidad y cáncer Jorge Moscat Ignacio V. Sandoval Antonio Talavera Díaz Jesús Vázquez B.5 Cell signaling through the atypical PKC pathways in immunity and cancer B.6 Tráfico regulado de proteínas de membrana B.6 Regulated membrane protein trafficking B.7 Terapia génica experimental B.7 Experimental gene therapy B.8 Química de proteínas y proteómica B.8 Protein chemistry and proteomics Biología Celular Cell Biology B.1 Citoesqueleto y nucleoesqueleto Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Isabel Correas e-mail: [email protected] Postdoctoral / Postdoctoral Fellow: Carmen María Pérez-Ferreiro Estudiantes / Undergraduate Students: Altea Gosálbez, Desiderio Ordoño, Elimelec Sendino La proteína 4.1 fue originalmente identificada en el eritrocito humano como un componente de 80 kDa cuya función es el anclaje del citoesqueleto de actina a la membrana plasmática. En células nucleadas de mamífero la situación es más Los objetivos principales que nuestro grupo viene abordando en los últimos años son la caracterización de las señales responsables de la distribución subcelular diferencial de las isoformas de 4.1R y el estudio de las funciones que 4.1R desempeña en las células de mamífero no eritroides. compleja puesto que hay una gran diversidad de isoformas, originadas Los resultados más destacables del bienio mediante splicing alternativo del RNA 2001-2002 han sido, por un lado, la identificación de nuevos dominios precursor, distribuidas en múltiples compartimentos subcelulares y cuya función comienza a caracterizarse. En este sentido, nuestro grupo ha demostrado que 4.1 es un componente nuclear y que juega un papel estructural formando parte del nucleoesqueleto celular al que se anclan componentes de la maquinaria de ‘splicing’. Actualmente a la proteína 4.1 eritroide se la designa 4.1R (red blood cells) para diferenciarla de otras proteínas 4.1 recientemente descritas y codificadas por tres genes diferentes: 4.1N (neuronal), 4.1B (brain) y 4.1G (general). Hay que señalar que la 4.1B es una proteína supresora de tumores específicos. involucrados en la localización núcleocitoplasmática de 4.1R y el establecimiento del orden jerárquico en que éstos actúan. Los datos obtenidos sugieren que las isoformas de 4.1R se distribuyen entre el núcleo y el citoplasma siguiendo, al menos, cuatro mecanismos de transporte diferentes. Además, hemos demostrado que 4.1R participa en el mantenimiento de la arquitectura de los microtúbulos interfásicos mediante su asociación con la tubulina a través de un dominio común a todas las isoformas. Estos resultados están contribuyendo a esclarecer las múltiples funciones que la diversidad de isoformas de 4.1R desempeña en la célula no eritroide así como los mecanismos que regulan su transporte y distribución intracelular. La proteína 4.1R posee una secuencia rica en leucinas capaz de regular su localización núcleocitoplasmática. A. La secuencia rica en leucinas presente en 4.1R se parece a las señales de exportación nuclear ya caracterizadas en otras proteínas. B. Estructura tridimensional de la NES de 4.1R. C. Estructura tridimensional del dominio FERM de 4.1R donde se muestra la señal de exportación nuclear presente en una _-hélice expuesta. Los dos residuos más conservados, Leu34 y Leu36 están indicados en la figura. 26 Cytoskeleton and nucleoskeleton Publicaciones/Publications: Research summary Protein 4.1 was originally identified as an 80 kDa component of the membrane skeleton of human red blood cells. In The main current goals of our group comprise the characterization of the sequence motifs involved in differential targeting of proteins 4.1R and the Perez-Ferreiro, C.M., Luque, C.M., Correas, I. (2001) 4.1R proteins associate with interphase microtubules in human T cells: a 4.1R constitutive region is involved in tubulin binding. J. Biol. Chem. 276, 44785-44791 these cells, 4.1 acts as an stabilizing elucidation of the roles that 4.1 plays in nucleated cells. protein of the spectrin-actin network, linked to the plasma membrane via interactions During the 2001-2002 period, our main with transmembrane proteins. The picture is more complex in nucleated cells, in findings on signals involved in nucleocytoplasmic distribution of 4.1R isoforms which many 4.1R isoforms varying in size suggest that 4.1 is differentially distributed between these two compartments at least de Marco, M.C., Martin-Belmonte, F., Kremer, L., Albar, by four different mechanisms. Our results J.P., Correas, I., Vaerman, J.P., Marazuela, M., Byrne, also indicate that all 4.1R isoforms bind to interphase microtubules in human T cells through a conserved region. All these J.A., Alonso, M.A. (2002) MAL2, a novel raft protein of and intracellular location, have been identified. Little is known about the functional roles that proteins 4.1 are playing in nonerythroid cells. Studies carried out by our group have shown that a specific 4.1 isoform is a component of the nucleoskeleton to which proteins of the splicing machinery attach. Red blood cell protein 4.1 has recently been referred to as 4.1R to distinguish it from three newly described 4.1 proteins which are Perez-Ferreiro, C.M., Luque, C.M., Pérez-González, A., data will contribute to the understanding of the multiple 4.1R functions played in non-erythroid cells as well as to elucidate the mechanisms involved in 4.1R intracellular distribution. Sendino, E., Correas, I. (2001) Nuclear and cytoplasmic localization signals in protein 4.1R. Cell Mol. Biol. Lett. 6,195 the MAL family, is an essential component of the machinery for transcytosis in hepatoma HepG2 cells. J. Cell Biol. 159, 37-44 Tesis doctorales/Doctoral Theses Carmen María Pérez-Ferreiro. 2001. "Secuencias que modulan la distribución subcelular y las interacciones encoded by three other genes. These proteins are named 4.1B (abundant in brain), 4. 1N (abundant in neurons), and de la proteína 4.1R en células no eritroides”. Universidad Autónoma de Madrid. 4.1G (generally distributed). Protein 4.1B functions as a tumor suppressor and its loss is observed in a variety of tumors, including breast and lung cancers as well as meningiomas. A leucine-rich sequence regulates nuclear cytoplasmic localization of protein 4.1R. A. The leucine-rich sequence of 4.1R resembles nuclear export signals (NESs) characterized in a variety of proteins. B. Threedimensional structure of the NES present in protein 4.1R. C. Three-dimensional structure of the FERM domain of 4.1R showing the position of the NES in an exposed _-helix. Two essential residues, Leu34 and Leu36, are shown. 27 Biología Celular Cell Biology B.2 Mecanismos de regulación de la biogénesis mitocondrial y alteración mitocondrial en cáncer Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Trabajos anteriores de nuestro laboratorio han demostrado que la expresión del gen que codifica la subunidad catalítica del e-mail: [email protected] El objetivo fundamental que persigue esta línea de investigación es la caracterización de los mecanismos celulares y moleculares Personal Científico / Scientific Staff: que regulan la biogénesis de las desarrollo y en células tumorales por control de la traducción del mRNA correspondiente. José M. Izquierdo mitocondrias en células de mamífero, esto es, el conjunto de procesos que tienen En este periodo hemos caracterizado los dos elementos de la secuencia del mRNA Postdoctoral / Postdoctoral Fellow: como finalidad el aumento de la dotación y/o de la actividad mitocondrial en la célula. que participan en el control de su traducción, así como las proteínas del hígado que Por la implicación evidente que la mitocondria tiene en múltiples manifestaciones de la patología humana interaccionan con dichos elementos. Por Antonio Isidoro (cáncer, enfermedades neurodegenerativas, envejecimiento, diabetes,…) hacemos colon se produce una alteración de la biogénesis mitocondrial que hemos definido Alvaro Ortega especial hincapié en el estudio de aquellos como “la huella bioenergética del cáncer”. Técnico de Investigación / mecanismos que conducen a la expresión de un fenotipo mitocondrial aberrante. La finalidad de estos estudios es la Esta alteración está íntimamente ligada a la progresión tumoral, de tal forma que la subunidad catalítica de la H+-ATP sintasa constituye un excelente marcador de la supervivencia de pacientes con cáncer de José M. Cuezva Fernando Martín Becarios Predoctorales / Graduate Students: Gema Santamaría Marta Martínez Technical Assistance: Margarita Chamorro caracterización de las moléculas que participan en la manifestación de la complejo H+-ATP sintasa está regulada en otro lado, hemos demostrado que en pacientes con cáncer de hígado, riñón y patología y, eventualmente, el desarrollo de estrategias encaminadas a prevenir la progresión de la enfermedad. En este colon. contexto, nuestros estudios se centran en el complejo de la H+-ATP sintasa, sistema centran a cuatro niveles: (i) el desarrollo de un kit para el análisis de la huella enzimático cuello de botella de la generación de energía biológica, de la generación y organización de la membrana interna bioenergética del cáncer, (ii) el estudio de la huella bioenergética en otros tumores y mitocondrial que, además, está implicada en la ejecución del programa de apoptosis. del mecanismo por el que la H+-ATP sintasa En la actualidad nuestros objetivos se líneas tumorales humanas, (iii) el estudio está implicada en muerte celular y (iv) el análisis del control de la traducción del mRNA de la subunidad catalítica de la H+ATP sintasa en desarrollo y en cáncer. Grupo / Group members: (de izquierda a derecha/from left to right) Gema, Álvaro, Pepe, Marta, Fernando, Margarita, Antonio. Estudiando la dinámica mitocondrial (“gusanitos” verdes en la pantalla del ordenador) en células vivas. Studying mitochondrial (green worm-like structures in the PC screen) dynamics in living cells. 28 Mechanisms that regulate the biogenesis of mitochondria and mitochondrial alterations in cancer Publicaciones/Publications: Research summary Our group is interested in the characterisation of the cellular and molecular mechanisms that regulate the biogenesis of mitochondria in cells of mammals, that is, the set of processes that result in an increase of the number and/or activity of mitochondria within the cell. Because mitochondria is implicated in many manifestations of human pathology (cancer, neurodegenerative diseases, ageing, diabetes,…..) we pay special emphasis to the study of those mechanisms that promote the expression of an aberrant mitochondrial phenotype in the cell. The aim of these studies is the characterisation of the molecules that gene encoding the catalytic subunit of the H+-ATP synthase is regulated at the level of mRNA translation. We have recently characterised the two elements of the mRNA sequence that participate in the control of its translation, as well as the liver proteins that interact with the two RNA elements. On the other hand, we have demonstrated that the alteration of the biogenesis of mitochondria is a cellular hallmark of liver, kidney and colon cancer patients. We have defined this feature as The bioenergetic signature of cancer is intimately related with cancer progression, providing the catalytic subunit of the H+ATP synthase an excellent marker of the survival of the patients with early-stage colorectal carcinomas. development of new strategies aimed at At present time our objectives are focused at four main levels: (i) the development Within this context, our studies are centred on the H+-ATP synthase complex, the enzyme system that is bottle-neck for the generation of biological energy, for the generation and organisation of the inner mitochondrial membrane and that is also implicated in the execution of apoptosis. Previous works from our laboratory have demonstrated that during development Cristobal, S., Rejas, M., Cuezva, J.M., Ochoa, B. (2001) Immunolocalization of erCEH: a novel cholesteryl ester hydrolase localized in the endoplasmic reticulum of murine and human hepatocytes. Hepatology 33, 662-667 Ricart, J., Izquierdo, J.M., Di Liegro, C.M., Cuezva, J.M. (2002) The assembly of the ribonucleoprotein complex containing -F1-ATPase mRNA requires the participation of two distal cis-acting elements and a complex set of cellular trans-acting proteins. Biochem. J. 365, 417-418 “the bioenergetic signature of cancer”. participate in the development of pathology and, eventually, the the prevention of disease progression. Fresnedo, O., López de Heredia, M., Martínez, M.J., of a kit assay for the analysis of the bioenergetic signature of cancer, (ii) the study of the bioenergetic signature in other tumours and tumoral human cells, (iii) the study of the mechanism that implicate the H+-ATP synthase in cell death and (iv) the analysis of the control of the translation of the mRNA encoding the catalytic subunit of the H+-ATP synthase in development and in cancer. and in tumour cells the expression of the Proliferación (A) y muerte (B) de una célula tumoral. A, Anafase: mitocondrias, verde; cromátidas, azul; microtúbulos del huso acromático, rojo. B, Apoptosis: DNA fragmentado (azul) y mitocondrias hinchadas (verde). Proliferation (A) and death (B) of a tumour cell. A, Anaphase: mitochondria, green; chromatids, blue; microtubules of the mitotic spindle, red. B, Apoptosis: fragmented DNA (blue) and swollen mitochondria (green). 29 Cuezva, J.M., Krajewska, M., López de Heredia, M., Krajewski, S., Santamaría, G., Kim, H., Zapata, J.M., Marusawa, H., Chamorro, M., Reed, J.C. (2002) The bioenergetic signature of cancer: a marker of tumor progresión. Cancer Res. 62, 6674-6681 Patentes / Patents Cuezva, J.M. (2002) “Procedimiento para el diagnóstico, análisis de la progresión y prognosis de tumores malignos basado en el estudio de marcadores metabólicos de la célula” Universidad Autónoma de Madrid, OEPM 200201190. PCT (Europe, Canada, USA, Japan) ESO3/00228 Biología Celular Cell Biology B.3 Terapia génica experimental Resumen de Investigación Personal Científico / Scientific Staff: Marta Izquierdo Terapia génica de tumores cerebrales e-mails: malignos. Los glioblastomas son tumores primarios cerebrales, poseen una Becarios Predoctorales / mortandad superior al 90 % considerándose Graduate Students: prácticamente incurables. Los avances y descubrimientos recientes en biología molecular permiten la utilización de nuevas Vega García-Escudero Daniel Muñoz Esteban Gurzov Técnicos de Investigación / Technical Assistance: Nuria Peralta estrategias contra este mal. Una de ellas está basada en un gen vegetal (linamarasa) que transforma el sustrato inocuo linamarina (2-HO isobutyronitrile--D-glucopyranoside) en glucosa y cianuro. Con este sistema hemos logrado erradicar tumores de hasta 1000 mm3 de volumen en la rata Wistar. El efecto colateral debido al cianuro puede Si bien tradicionalmente nuestro grupo ha utilizado la rata Wistar y la línea celular C6 de glioblastoma de rata, en los últimos años hemos constatado repetidamente que un 10% de los animales son capaces de sobrevivir al tumor sin medicación o terapia alguna. Estas curaciones, que enmascaran el éxito de la terapia génica que pudo aplicarse, podrían explicarse como un rechazo no inmediato a un transplante alogénico. Otra nueva estrategia se basa en la utilización de ARN de interferencia (ARNi) compensar los bajos porcentajes de basado en un ARN de doble hebra y dirigido contra algunas proteínas imprescindibles para la progresión del ciclo celular. Se han construido vectores retrovirales portadores infección viral que se estiman en tumores sólidos. Estamos asimismo utilizando el perro, (Beagle) cuyo tamaño de cerebro es intermedio entre la rata y el hombre, como de un ADN que se transcribirá en ARNis pequeños de interferencia y que actuarán contra los ARNs correspondientes al genes potencialmente letales del ciclo celular. modelo experimental. Se pretende caracterizar en profundidad este sistema para su eventual utilización en humanos. 30 Experimental gene therapy Publicaciones/Publications: Research Summary Gene therapy in malignant brain tumors. Glioblatomas are primary brain tumors, having over 90% mortality and being considered virtually incurable. The current new advances in molecular biology, allow the use of new strategies. One of those is based on the plant gene (linamarase) that will hydrolyze the innocuous substrate linamarin (2-HO isobutyronitrile--D-glucopyranoside) into cyanide and glucose. We have successfully used this approach to eradicate tumors up to a volume of 1000 mm3 in the Wistar rat. The bystander effect due to cyanide can compensate the low viral percentages of infection estimated in solid tumors. We are also using the dog (Beagle) as a model system because its brain size is intermediate between that of the rat and humans. Although we have used traditionally the de Felipe, P., Izquierdo, M., Wandosell, F., Lim, F. (2001) Wistar rat and the C6 rat glioblastoma cell line as model systems, in the last few years we found that about 10% of the Integrating retroviral cassette extends gene delivery of HSV-1 expression vectors to dividing cells BioTechniques 31, 394-405 animals were consistently able to eliminate the tumor spontaneously with no help from gene therapy. The spontaneous Izquierdo, M (2001) Ingeniería Genética y Transferencia tumor remision, that would mask the gene Ciafré, S.A., Barillari, G., Bongiorno Borbone, L., therapy treatment applied, might be the result of a graft-host allogenic rejection. Wannenes, F., Izquierdo M., Farace, M.A. (2002) A Génica. Ediciones Pirámide. Madrid 2001 tricistronic retroviral vector expressing natural antiangiogenic factors inhibits angiogenesis in vitro but A second strategy is base in RNA is not able to block tumor progression in vivo Gene interference (RNAi) by double-stranded RNA against targeted cell cycle genes. Therapy 9 297-302 We have constructed constructed vectors based on retroviruses bearing transgenes whose transcription gives rise to small interfering RNAs (siRNAs) specific for the Cortés, M.L., García-Escudero, V., Hughes, M., Izquierdo, mRNAs corresponding to the cell cyclecontroller genes. We are characterizing several aspects of the system in order to be able to apply it in the future to humans. 31 M. (2002) The cyanide bystander effect of the linamarase/linamarin killer-suicide gene therapy system The Journal of Gene Medicine 4 1-8 Biología Celular Cell Biology B.4 Desarrollo neuronal y neurodegeneración Resumen de investigación Jefe de Línea / Group Leader: Francisco Moreno e-mail: [email protected] Personal Científico / Scientific Staff: Francisco Wandosell Juan S. Jiménez María José Benitez Concepción Pérez Martín María Teresa Moreno Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Silvia Sánchez Marta Agudo La morfogénesis neuronal depende de la organización de los diferentes componentes del citoesqueleto, en donde los microtúbulos desempeñan un papel central. Se ha podido demostrar que el grado de fosforilación de ciertas proteínas, por ejemplo, tau puede controlar una serie de procesos tales como el desarrollo neuronal, algunos procesos neurodegenerativos e incluso procesos interaccionan entre si para formar un complejo muy estable. Con el objetivo de contribuir a la elucidación de la forma de interacción de ambos tipos de subunidades, hemos usado un equipo de Resonancia de Plasmón Superficial, desarrollado en nuestro laboratorio, para estudiar la interacción entre las subunidades para formar la holoenzima, así como la forma de interaccionar de cada subunidad con proteínas substrato. oncogénicos. Se tiene un gran interés en conocer como Se han descrito diferentes modificaciones químicas anormales en la proteína tau en enfermos de Alzheimer. Parece ser que afectan los cambios en la actividad de la GSK 3 sobre distintos aspectos del metabolismo en el sistema nervioso. Por esta razón se han usado células de Marta Salcedo fosforilaciones aberrantes son los principales cambios que afectan a su capacidad de unión a microtúbulos, Diana Simon disminuyéndola aunque no afecta a su neuroblastoma y cultivos primarios de neuronas de regiones específicas del cerebro, como modelos experimentales, Olga Varea ensamblaje. Se han implicado varias quinasas en la hiperfosforilación anómala para examinar la expresión de ésta enzima durante la diferenciación neuronal y las de tau entre las que cabe destacar a la GSK3 y CK2, desempeñando importantes posibles implicaciones en la patología Becarios Predoctorales / Graduate Students: Personal Técnico / Technical Assistance: Beatriz García Mª Jesús Martín-Bermejo funciones. La actividad de la GSK3 puede ser regulada a través de interacción con otras proteínas, tales como las proteínas que se unen a la GSK3 (GBPs). Recientemente hemos descrito una nueva GBP que además puede actuar como competidor de tau. La Proteína quinasa CK2 es una quinasa ubiqua, capaz de actuar en mecanismos de señalización, proliferación celular, y expresión génica. Cataliza la fosforilación de restos de serina y treonina en un gran número de proteínas relacionadas con la síntesis de ácidos nucleicos, productos de oncogenes, y las proteínas del citosqueleto. El hecho de que la enzima sea más abundante en cerebro que en otros tejidos, y el gran número de substratos implicados neuronal que se ha descrito en la enfermedad de Alzheimer. Nuestros resultados indican que la GSK 3 desempeña una función destacada en la regulación de la dinámica de los microtúbulos y que la existencia de una mayor expresión del enzima puede ser decisiva en la patología observada en neuronas con esta enfermedad. Estamos interesados también en analizar la respuesta neuronal ante situaciones de estress y/o lesiones del sistema nervioso central. En este sentido , hemos podido comprobar que la proteína de matriz extracelular fibronectina a es parte de la respuesta de estres inducida por el péptido amiloide. en desarrollo, neuritogénesis, transmisión Hemos podido comprobar que la proteína quinasa GSK3/Shaggy se activa tras la sináptica, y supervivencia indican que la enzima tiene un papel importante en inducción de la retracción de axones. Además la inhibición farmacológica de PI3K funciones neuronales. Muchos datos sugieren también su implicación en produce activación de GSK3 y retracción desórdenes debidos a la enfermedad de Alzheimer. La Protein Kinasa CK2 se compone de dos tipos de subunidades catalíticas y de dos subunidades reguladoras. Ambas subunidades 32 neurítica. Esta activación aumenta la expresión de fosfo-epítopos de tau que son característicos de AD, como PHF-1. Además hemos localizado los elementos de la ruta de LPA-Rho responsables del sistema de activación de GSK3/Shaggy. Neuronal development and neurodegeneration Publicaciones/Publications: Research Summary Research Summary Neuronal morphogenesis depends on the organization of cytoskeletal elements among which microtubules play a very important role. Regulation of tau phosphorylation might be one of the key mechanism modulating neuronal development, neurodegenerative process and oncogenic processes. Several abnormal modifications have been described for tau proteins present in the brain of AD patients. Aberrant tau phosphorylation appears to be mainly involved in the regulation of its binding to microtubules, decreasing it but not in facilitating tau assembly. Several kinases mode of interaction of both type of subunits we have used a Surface Plasmon Resonance equipment developed in our laboratory to study the intersubunit interactions to form the whole holoenzyme, as well as the mode of interaction of each subunit with protein substrates. There is a great interest in elucidating how different aspect of neuronal metabolism is altered upon changes in GSK 3 activity. Thus we have used the human neuroblastoma cell and primary cultures of rat cerebellar granule neurons as model systems to study the expression of GSK 3 during neuronal differentiation and the possible implications for neurite pathology in Alzheimer’s disease. have been involved in the anomalous hyperphosphorylation of tau protein and GSK3 and CK2 appear to play important Our results are consistent with an important role for GSK 3 in the regulation roles. The activity of GSK 3 can be regulated through its interaction with of cytoskeletal dynamics during neurite proteins such as GSK 3 binding protein growth and that upregulation of GSK 3 may contribute to cytoskeletal pathology (GBPs). We have described a novel GBP that can act as a competitor with tau. within neurites in AD. We are interested too, in the analysis of brain response after some stress situations of after some Protein Kinase CK2 is a ubiquitous kinase, acting on signaling, cell proliferation, and insults. We reported that fibronectin is gene expression mechanisms. It catalyses the phosphorylation of serine and part of an astroglilal response to betaAmiloide peptide. threonine residues of a large number of proteins related to nucleic acid synthesis, We have further studied the role of GSK3/Shaggy, after the induction of oncogenes products, and cytoskeleton proteins. The enzyme has an important growth cone collapse and neurite retraction. The pharmacological inhibition role in neural functions as indicated by of PI3K produces a growth cone collapse the facts that it is more abundant in brain than in other tissues; and the large amount of enzyme substrates involved in and GSK3 activation. This activation enhanced the phosphorylation of Tau development, neuritogenesis, synaptic transmission, and survival. Many data epitope characteristics of AD brains, such as PHF-1. And more significant, we suggests also its implication in disorders described the elements from LPA-Rho pathway that responsible of GSK3/Shaggy due to Alzheimer’s disease. Protein activation. Kinase CK2 is composed of two types of catalytic subunits and two regulatory We initiated a new study of molecular subunits. It is well known that both catalytic and regulatory subunits bind each other to form a very stable complex. In order to contribute to the elucidation of the mechanism of regeneration based on the capacity of ensheathing glia to promote or redirect neuronal regeneration Agudo, M.Trejo, JL., Lim F., Avila, J., Torres-Aleman, I.,. Diaz-Nido, J., Wandosell, F. (2002) Highly efficient and Specific gene transfer to Purkinje cells in vivo using a Herpes Simplex virus I amplicon. Human Gene Theraphy 13, 665-674 Ávila. J., Lim, Moreno, FJ., Belmonte,. Claudio Cuello, A. (2002) Tau function and dysfunction in neurons. Its role in neurodegenerative disorders. Mol. Neurobiol. 25, 213-231 Benítez, M.J., Cochet, C., Jiménez, J.S. (2001) A surface plasmon resonance study of the interactions between the component subunits of protein kinase CK2 and two protein substrates, casein and calmodulin. Mol. Cell. Biochem. 227, 31-36 Benítez, M.J., Jiménez, J.S.(2002) A method of reversible biomolecular immobilization for the surface-plasmonresonance quantitative analysis of interacting biological macromolecules. Anal. Biochem. 302, 161-168 Diaz-Nido, J., Wandosell, F., Avila, J. (2002) Glycosaminoglycans and beta-Amyloid, Prion and Tau Peptides in Neurodegenerative Diseases. Peptides 23, 1321-1330 de Felipe, P., Izquierdo, M., Wandosell, F. Lim, F. (2001) Integration of a retroviral cassette extends gene delivery of HSV-1amplicon vectors to diving cells. Biotechniques 31, 394-405 González-Billault, C., Engelke, M., Jiménez-Mateos, , EM., Wandosell, F., Cáceres, A., Avila J. (2002) Participation of structural microtubule-associated proteins (MAPs) in the development of neuronal polarity. J. Neurosc. Res 67, 713-719 Hernández, F., Lim, F., Lucas, J.J., Pérez-Martín, C., Moreno, FJ., Avila, J.(2002) Transgenic mouse models of Alzheimer’s disease with tau pathology to test therapeutic agents. Med. Chem. 2, 51-57 Martínez, A., Alonso, M., Pérez-Martín, C., Moreno, FJ.(2002) First non-ATP competitive glycogen synthase kinase 3 beta (GSK 3b) inhibitors: thiadiazolidinones (TDZD) as potential drugs for the treatment of Alzheimer’s disease. J. Med. Chem. 45, 1292-1299 Moreno-Flores, M.T., Martín-Aparicio, E., Salinero, O., Wandosell, F. (2001) Fibronectin modulation by ßA amyloid peptide (25-35) in cultured astrocytes. Neurosci. Lett. 13;314(1-2), 87-91 Moreno-Flores, M.T., Martín-Aparicio, E., Avila, J., DiazNido, D., Wandosell, F. (2002) Ephrin B1 a neural promotor in cerebellar neurons: A novel role in axono and dendritogenesis. Mol. Cell. Neurosci. 20, 428-446 Moreno-Flores, M.T., Diaz-Nido, J., Wandosell, F., Avila, J. (2002) Olfactory ensheathing glia: drivers of axonal regeneration in the central nervous system?. J. Biomed. Biotech. 2, 1-37-43 Pérez-Martín, C., Vazquez, J., Avila, J., Moreno, F. (2002) p24, a glycogen synthase kinase (GSK 3) inhibitor. Biochim. Biophys. Acta 1586, 113-122 Sayas, CL., Lim, F.,.Diaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. (2001) The inhibition of phosphatidylinositil 3-kinase induce neurite retraction and activates GSK3 J. Neurochem. 78, 468-481 Sayas, C.L., Avila, J., Wandosell, F. (2002) Regulation of Neuronal Cytoskeleton by Lysophosphatidic Acid:Role of GSK3/Shaggy. BBA-Mol. and Cell Biol. Of Lipids 15821/3, 144-153 Sayas, CL., Avila, J., Wandosell, F (2002) GSK-3 is activated by Galfa-12 and Galfa-13 by Rho-independent and Rho, dependent mechanism. J. Neurosci. 22, 6863687 Tesis Doctorales / Doctoral Theses Silvia Sánchez. 2001. “Análisis de los mecanismos moleculares que controlan la elongación y retracción axonal: Papel de la PI3-Quinasa”. Univ. Autónoma de Madrid. 33 Biología Celular Cell Biology B.5 Señalización celular por PKC atípicas en inmunidad y cáncer Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Jorge Moscat e-mail: [email protected] Las quinasas son elementos esenciales en los mecanismos de comunicación celular. En particular, numerosos estudios han Personal Científico / Scientific Staff: María Teresa Díaz-Meco María José Lafuente Pilar Martín Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Antonia Avila Carlos Guillén María José Lorite implicado a las PKC atípicas (aPKC), cPKC y h/f PKC, en la activación de NF-gB, que es un factor de transcripción crítico en el crecimiento celular y la respuesta inmune. La alteración de los mecanismos normales que regulan la señalización celular da lugar a la aparición de enfermedades humanas tales como el cáncer, la inflamación o desordenes autoinmunes como el lupus o la artritis reumatoide. En nuestro laboratorio Becarios Predoctorales / Graduate Students: Angeles Durán Raquel Sánchez Técnicos de Investigación / hemos caracterizado recientemente el ratón “knock out” (KO) de cPKC, lo que nos ha permitido concluir que esta quinasa Esther Fuertes Juan José Lazcano Desireé Ruiz de NF-gB, debido al hecho de que cPKC fosforila directamente su subunidad transactivadora, RelA. Por lo tanto, durante estos dos años hemos generado resultados que prueban genéticamente que cPKC es esencial en la activación de NF-gB y en el control de la respuesta inmune. Esto hace de esta quinasa una diana muy atractiva para el descubrimiento de nuevas medicinas anti-inflamatorias y anticancerosas. Las aPKC interaccionan con dos proteínas reguladoras: Par-4 y p62. La primera es pro-apoptótica e inhibidora de las aPKC, y sus niveles se reprimen en efectivamente juega un importante papel en el sistema inmune y especialmente en la función de células B. células tumorales. Así, la falta de cPKC en este tipo celular información de gran interés sobre el papel que esta proteína juega in vivo. Por otra Technical Assistance: Esther Garcia de Peyer. Mecanísticamente, las células de ratones cPKC KO muestran una fuerte inhibición en la activación transcripcional inhibe la proliferación y la supervivencia celulares en respuesta a estímulos del Hemos empezado a caracterizar los ratones KO de Par-4 cuyo fenotipo está revelando parte, p62 es una proteína de andamiaje receptor antigénico, lo que correlaciona con que organiza el complejo de señalización Científicos Visitantes / un defecto en la inducción de varios genes Visiting Scientists: de aPKC en la ruta de NF-gB. La reciente generación, en nuestro laboratorio, de (Auburn University, Alabama) dependientes de NF-gB, como Bcl-xL. Como consecuencia de estos defectos moleculares, los ratones KO para cPKC Nancy Laurin son incapaces de montar una respuesta (L’Université Laval, Quebec) inmune óptima y manifiestan un retraso en el desarrollo de órganos linfoides Marie W. Wooten ratones KO para p62 ayudará a la comprensión de los mecanismos por los que el complejo aPKC/p62 participa en la transducción específica de señales en modelos in vivo. secundarios, especialmente de las placas Microfotografías de marcajes representativos de hematoxilina-eosina de placas de Peyer (arriba) y bazo (abajo) de ratones wild type y KO para cPKC de 2 semanas de edad. Las características estructurales de las Placas de Peyer están alteradas en los ratones KO, mostrando reducción en el número y tamaño de los folículos. La estructura global del bazo de los ratones KO está preservada pero son aparentes los defectos en la zona marginal así como la existencia de folículos B menores en pulpa blanca. 34 Spleen Peyer’s Patches cPKZ +/+ cPKZ -/- Cell signaling through the atypical PKC pathways in immunity and cancer Research Summary Kinases are essential players in the mechanisms of cell communication. In particular, numerous studies have implicated the atypical PKC isoforms (aPKC), cPKC and h/fPKC, in the activation of NF-gB which is critical in the control of cell proliferation and the immune response. The subversion of the normal mechanisms that regulate cell signaling Publicaciones/Publications: Of great interest, cPKC-deficient cells Diaz-Meco, M.T., Moscat, J. (2001) MEK5, a New Target have a severe defect in NF-gB transcriptional activity which is due to the fact that cPKC phosphorylates the NFgB transactivating subunit, RelA. of the Atypical PKCs in Mitogenic Signalling. Mol. Cell. Biol. 21, 1218-1227 Moscat, J., Sanz, L., Sanchez, P., Diaz-Meco, M.T., (2001) Regulation and role of the atypical PKC isoforms in cell Therefore, our results during these two years have genetically established the role of cPKC in NF-gB signaling and in the immune response which makes this kinase an attractive therapeutic target for survival during tumor transformation. Adv. Enzyme Regul. 41, 99-120 Wooten, M., Seibenhener, M.L., Mamidapudi, V., DiazMeco, M.T., Moscat, J. (2001) The Atypical PKC- drug discovery in the areas of inflammation and cancer. Interacting Protein p62 is a Scaffold for NF-B Activation rheumatoid arthritis. We have recently characterized the cPKC knock out (KO) The atypical PKCs interact with two regulatory proteins: Par-4 and p62. The Wooten, M.W., Vandenplas, M.L., Seibenhener, M.L., mice which reveals that this kinase plays an essential role within the immune former is a pro-apoptotic inhibitor of the aPKCs that is down-regulated in tumortransformed cells. We have now started Stimulates multisite tgrosine phosphorglation and leads to various forms of human diseases such as cancer, inflammation or by Nerve Growth Factor. J. Biol. Chem. 276, 7709-7712 autoimmune disorders like lupus or system and specifically in B-cell function. Geetha, T., Díaz-Meco, M.T. (2001) Nerve Growth factor activation of the atgpical Protein kinase C’s via a SRC kinase pahtwag. Mol. Cell. Biol. 21, 8414-8427 to characterize the Par-4 KO mice whose Thus, the loss of cPKC in B-cells impairs survival and proliferation in response to phenotype is revealing extremely interesting information on the role of this Leitges, M., Sanz, L., Martin, P., Duran, A., Braum, U., antigen receptor stimulation which correlates with a defective induction of protein in vivo. P.D., Moscat, J. (2001) Targeted disruption of the PKC several NF-gB-dependent genes, including Bcl-xL. Consistent with these On the other hand, p62 is a scaffold Mol.Cell. 8, 771-780 Ponting, C.P., Ito, T., Moscat, J., Diaz-Meco, M.T., Inagaki, Garcia, J.F., Camacho, F., Diaz-Meco, M.T., Rennert, gene results in the impairment of the NF-B pathway. molecular defects, the cPKC KO mice protein that serves to organize the aPKCs signaling complex in the NF-gB pathway. are unable to mount an optimal immune response and display a delay in the The recent generation, in our laboratory, of the p62 KO will help to understand how development of secondary lymphoid organs, specially the Peyer’s patches. the aPKC/p62 complexes participate in the control of specific signaling events in in vivo models of human diseases. F., Suminoto, H. (2002) OPR, PC and AID: all in the PB1 family. TIBS 27, 10 Moscat, J., Diaz-Meco, M.T. (2002) Specificity in atypical Protein kinase C signaling: the NF-B paradigm. In Protein nd Kinase C, 2 Edition. Lodewijk Dekker ed. (eirekah.com) Martin, P., Duran, A., Minguet, S., Gaspar, M.L., DiazMeco, M.T., Rennert, P., Leitges, M., Moscat, J. (2002) Role of PKC in B-cell signaling and function. EMBO J. 21, 4049-4057 Avila, A., Silverman, N., Diaz-Meco, M.T., Moscat, J. (2002) The Drosophila atypical PKC-Ref(2)P complex constitutes a conserved module for signalling in the Toll Pathway. Mol. Cell. Biol. 22, 8787-8795 Premios / Awards / Other Activities J. Moscat. Premio de la Fundación Carmen y Severo Ochoa J. Moscat. II Ayuda de la Fundación Juan March a la Investigación Básica J. Moscat. Co-organizador Workshop de la Fundación Photomicrographs of representative hematoxilin-eosin stainings of Peyer’s patches (upper panels) and spleen (lower panels) of 2-weeks old cPKC KO and wild type mice. The structural features of individual Peyer’s patches were altered in the KO mice, showing a reduction in the number and size of follicles. The overall structure of the spleens from the cPKC-deficient mice was preserved but a defect in the marginal zone was detected together with smaller B cell follicles in the white pulp. 35 Juan March “Control of NF-gB Signal Transduction in Inflammation and Innate Immunity” (7-9 Octubre, 2002) Biología Celular Cell Biology B.6 Tráfico regulado de proteínas de membrana Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Ignacio V. Sandoval e-mail: [email protected] El principal interés de nuestro grupo consiste en entender los mecanismos moleculares que regulan el secuestro intracelular de Personal Científico / Scientific Staff: Diego Pulido, Vassiliki Lalioti Postdoctoral / Postdoctoral Fellow: Beatriz Barrios Becarios Predoctorales / Graduate Students: proteínas de membrana en las proximidades del aparato de Golgi y su translocación a la membrana plasmática en respuesta a estímulos que demandan su funcionamiento en ésta. Trabajamos con el transportador de glucosa Sonia Hernández sensible a insulina, GLUT4, y los transportadores de cobre, ATP7A y ATP7B, Sharmila Chatopadhyay centrándose nuestros estudios en la Eduardo Silles caracterización morfológica y molecular de los compartimentos de la red trans del Golgi en donde son almacenados y desde donde son transportados a la membrana Silvia Vergarajauregui plasmática. 36 Doscientos millones de personas padecen diabetes de tipo II, enfermedad en la que la función transportadora de GLUT4 está impedida, y doscientas cincuenta mil sufren las graves toxicosis provocadas por la disfunción de ATP7A y ATP7B. Perseguimos identificar los sensores que responden a insulina y cobre activando la translocación de GLUT4 y de ATP7A y ATP7B, respectivamente, así como caracterizar las correspondientes maquinarias de retención y transporte que operan sobre ellos. Regulated membrane protein trafficking Publicaciones/Publications: Research Summary toxicosis produced by the dysfunction of Palacios, S. Lalioti, V., Martínez-Arca, S., Chattopadhyay, S., Sandoval, I.V. (2001) Recycling of the insulin-sensitive The aim of our research is to advance ATP7A and ATP7B are suffered by two hundred and fifty thousand people. the knowledge of the Golgi-based mechanisms that operate in the Significant contributions of our studies to is mediated by the Phe5-Gln7-Ile8 motif. J. Biol. Chem. the understanding of the cellular trafficking 276, 3371-3383 of GLUT4 were the characterization of four distinct signals of transport: one, RXXXLL490 implicated in its transport from Leber, R., Silles, E., Sandoval, I.V., Mazon, M.J. (2001) the Golgi cisternae to its storage targeting of aminopeptidase I to the yeast vacuole. J. compartment (GSC); two, Y502 y PDEND509, involved in its retention and Biol. Chem. 276, 29210-29217 release from the GSC; and, a forth one, FQQI8 , which operates in its recycling from endosomes to the GSC, upon the fall in the insulin levels. More recently we Holman, G.H., Sandoval, I.V. (2001) Moving the insulin- respond to increases in the levels of insulin and copper by promoting their translocation to the cell surface, as well have characterized the physical Lalioti, V., Vergarajauregui, S., Sandoval, I.V. (2001) interaction between Daxx and JNK1 with the N and C-cytoplasmic domains of Targeting motifs in GLUT4. Mol. Membrane Biol. 18, 257- as to characterize the machineries of retention and transport that act upon them. GLUT4, and cloned using the yeast two hybrid system and the thirty terminal Lalioti, V., Vergarajauregui, S., Sandoval, I.V. (2002) The amino acids of GLUT4 as bait, KIS, a insulin-sensitive glucose transporter GLUT4, interacts Two hundred million people suffer type II diabetes, a disease produced by the new membrane protein lodged in the Golgi that appears to have the capacity to signal physically with Daxx: two proteins with capacity to bind peripheral resistance to insulin and the ill-functioning GLUT4. The often lethal both intra and extracellularly. 264 intracellular sequestering and translocation to the plama membrane of proteins that modify its functioning in a regulated fashion. Subjects of our studies are: the insulin regulated glucose transporter, GLUT4, and the copper transporters, ATP7A and ATP7B. We seek to identify the sensors that glucose transporter GLUT4. Access of surface internalised GLUT4 molecules to the perinuclear storage compartment Yol082p, a novel CVT protein involved in the selective regulated glucose transporter GLUT4 into and out of storage. Trends in Cell Biology 11, 173-179 264 Ubc9 and conjugated to SUMO1. J. Biol. Chem. 18, 257- Tesis Doctorales / Doctoral Theses Eduardo Martínez Díaz. 2002. “Transport of pAPI from the cytoplasm to the vacuole of yeast”. Universidad de la Habana, Cuba. 37 Biología Celular Cell Biology B.7 Terapia génica experimental Resumen de Investigación Personal Científico / Scientific Staff: Antonio Talavera Díaz e-mail: [email protected] La utilidad de los vectores retrovirales en la terapia génica radica en la estabilidad del gen terapéutico transducido, inserto en Humberto Sánchez González el genoma celular mediante el proceso de integración proviral. No obstante, y como ha quedado en evidencia recientemente, Laura Fuentes Sánchez los éxitos de esta técnica pueden quedar Leticia Alda Herrán Villalaín ensombrecidos por la aparición de efectos secundarios debidos a integraciones Becarios Predoctorales / Graduate Students: inadecuadas de los vectores. Con los vectores así obtenidos hemos logrado corregir, en un modelo celular, un gen testigo a niveles compatibles con su uso clínico. La segunda modificación consistió en la adición, en el esqueleto del vector retroviral, de dos elementos que permitiesen su establecimiento como episoma replicativo extracromosómico: el origen de replicación del virus SV40 y la región de unión a la matriz nuclear (región MAR) del gen del interferón ` humano. Hemos confirmado que estos elementos contribuyen al mantenimiento En el caso de la terapia génica sustitutiva la integración no es, sin embargo, necesaria, ya que el efecto perseguido no es la expresión del gen transducido, sino la extracromosómico del DNA proviral en las células transducidas, ya que el gen selector transducido no aparecía en el DNA de alto peso molecular, pudiendo, en cambio, ser reparación de un gen endógeno mediante su recombinación homóloga con una rescatado de la fracción extracromosómica. secuencia del DNA transducido. Con el fin Hemos observado, sin embargo, reorganizaciones inesperadas en los DNAs de adaptar los vectores retrovirales a la terapia génica sustitutiva, hemos introducido dos modificaciones en el sistema. transducidos que, aunque en principio no La primera consistió en abolir su capacidad deberían interferir con el proceso de reparación génica, consideramos conveniente minimizar o abolir, para lo cual integrativa, bien delecionando secuencias hemos abordado su caracterización. del provirus necesarias para su reconocimiento y procesamiento por la integrasa, o bien utilizando un sistema empaquetador desprovisto de integrasa funcional. Modelo celular de reparación génica. El gen tk contiene una mutación de cambio de fase, y está unido en fase con el gen egfp. El conjunto es seleccionable con higromicina, ya que el gen de resistencia a dicho antibiótico esta separado del gen de fusión por una secuencia de entrada ribosomica interna (IRES). La reparación del gen de fusión recupera tanto la actividad timidina kinasa como la sintesis de proteina verde fluorescente. Las celulas curadas pueden ser seleccionadas tanto por fluorometria como por su resistencia en medio HAT. 38 Experimental gene therapy Publicaciones/Publications: Research Summary The modified vectors have allowed us to Fuentes, L., Sánchez, H (2001) Comentario "La repair, in a model system, a reporter gene importación al núcleo del genoma del VIH-1 está mediada The usefulness of retroviral vectors in at levels compatible with their clinical use. por una solapa central del DNA" al artículo homónimo gene therapy is related to the stability of the transduced therapeutic gene, that remains linked to the cell genome by The second modification was the addition, in the retroviral backbone, of two elements Virología 8, 37-38 virtue of the process of proviral that lead to its establishment as a Fuentes, L. (2001) Comentario "La transducción estable integration. replicative episome: the SV40 replication origin and a matrix attachment region (MAR) of the human `<interferon gene. de células proliferativas puede ser mediada por un nuevo However, as evidenced by recent reports, the success of gene therapy may be obscured by unwanted results caused by de V. Zennou y col. [Cell 101, 173-185]. vector adenoepisomal" al artículo homónimo de H. Lebois y col. [Mol. Ther. 1, 314-321] Virología 8, 73-74 We have proved that these elements contribute to the extrachromosomal permanence of the proviral DNA in the Talavera, A., Sánchez, H. (2001) El virus del SIDA: inadequate integration of the vectors used. Nevertheless, substitutive gene therapy does not require integration as, in this transduced cell, as in most instances the transduced reporter gene was absent Biopress, nº 1. instance, the action sought for is the rapair of a defective endogenous gene by from the high molecular weight DNA Tesis Doctorales / Doctoral Theses fraction, being readily rescued from the extrachromosomal fraction. Laura Fuentes Sánchez. 2001. "Nuevas adaptaciones homologous recombination between this and a sequence in the transduced DNA, rather than the expression of the incoming gene. In order to adapt retroviral vectors to substitutive gene therapy, we have introduced two modifications in the vector system. First, we abolished integration by deleting proviral sequences recognised, bound, un retrovirus patógeno como agente terapéutico. de vectores retrovirales para terapia génica". Universidad We have observed, however, unexpected Autónoma de Madrid. rearrangements in the transduced DNAs which, although should not, in principle, Humberto Sánchez González. 2001. “Modelos celulares interfere with the process of gene repair, their origin and mechanism of formation para el estudio de la sustitución génica mediada por should be characterised, in order to Universidad Autónoma de Madrid. minimise or altogether prevent their occurrence. and processed by the integrase or, alternatively, by using a packaging system devoid of the enzyme. Esquema de las interacciones de las secuencias MAR con la matriz nuclear. Los lazos de DNA constituyen dominios del genoma transcripcionalmente independientes. 39 vectores retrovirales defectivos en integración". Biología Celular Cell Biology B.8 Química de proteínas y proteómica Resumen de Investigación Nuestro grupo está actualmente estudiando la regulación del promotor del gen APOE en el contexto de la patogénesis de la fisiológica mediante purificación por afinidad Enfermedad de Alzheimer (EA). Hemos buscado nuevos factores que regulen la en tándem (“TAP”). La mayoría de estos desarrollos han sido aplicados con éxito en actividad del promotor mediante técnicas de espectrometría de masas y Proteómica. varios trabajos biomédicos y biotecnológicos. Jefe de Línea / Group Leader: Jesús Vázquez e-mail: [email protected] Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: José Ramón Lamas Miguel Angel García Mónica Campillos Benito Cañas nuevas técnicas. Estamos trabajando en métodos para la caracterización de modificaciones posttraduccionales y la identificación de factores de relevancia Estos factores podrían generar nuevas pistas para entender los mecanismos de la EA y para identificar nuevas dianas terapéuticas. Hemos demostrado que el Una de las técnicas emergentes más prometedoras (“shotgun Proteomics”) se basa en el análisis a gran escala de las Daniel López oncogen DEK modula el efecto de AP-2, Técnico de Investigación / un activador del promotor específico de cerebro. También hemos encontrado que complejas mezclas de péptidos generadas a partir de proteomas no sometidos a separación previa. Las herramientas Becarios Predoctorales / Graduate Students: Technical Assistance: Alberto Monteagudo la proteína hnRNPA1 modula específicamente la actividad de la forma –219T del promotor de APOE. Nuestros Científicos Visitantes / bioinformáticas actuales sólo permiten descifrar de forma parcial la enorme cantidad de información sobre resultados demuestran que hnRNPA1 juega un papel fisiológico en la actividad diferencial de las dos isoformas –219 del promotor, y fragmentación de péptidos que se genera desarrollado en nuestro laboratorio Silvia Lorenzo permiten proponer un mecanismo molecular para explicar la asociación existente entre la isoforma –219T y el aumento en el riesgo (Universidad de Santiago Compostela) de desarrollar la enfermedad. secuenciación automática de péptidos. Estamos probando y tratando de mejorar Nuestro laboratorio también está trabajando las prestaciones de este algoritmo para en el emergente campo de la Proteómica. Esta tecnología se basa principalmente en técnicas de espectrometría de masas y de mejorar la fiabilidad de la identificación de péptidos a gran escala, y para el análisis automático de mutaciones, modificaciones bioinformática, que todavía no se han posttraduccionales, y proteomas de desarrollado plenamente. Estamos por ello concentrando nuestros esfuerzos en la especies poco representadas en las bases de datos. Visiting Scientists: Fernando Martín (ThermoFinnigan, CA, USA) Carmen Piñeiro (Instituto Investigaciones Marinas Vigo) implementación y desarrollo de estas Caracterización de sitios de fosforilación mediante espectrometría de masas en tándem de trampa iónica. Characterization of phosphorylation sites by ion trap tandem mass spectrometry. 40 mediante estas técnicas. Estamos trabajando en un nuevo algoritmo (comercializado por Thermo Finnigan bajo el nombre de “DeNovoX”), para la Protein chemistry and proteomics Publicaciones/Publications: Research Summary Our group is currently studying the regulation of APOE gene promoter in the context of the pathogenesis of Alzheimer’s Disease (AD). Using mass spectrometry and Proteomics, we have searched for novel factors which regulate promoter activity. These factors may provide new clues to understand the mechanisms underlying AD, as well as for the identification of novel therapeutic targets. We have demonstrated that the oncogene DEK modulates the effect of AP-2, a brainspecific activator of the promoter. We have also found that the protein hnRNPA1 specifically modulates the activity of –219T isoform of APOE promoter. Our results demonstrate that hnRNPA1 plays a physiological role in the differential activity of the two –219 APOE promoter isoforms, and provide a molecular mechanism to explain the association of the –219T form with an increased risk for AD. Our laboratory is also working in the emerging field of Proteomics. This technology relies mainly in mass spectrometry and bioinformatic efforts in the implementation and development of novel techniques. We are working in methods for characterization of postranslational modifications and identification of interacting factors of physiological relevance by tandem affinity purification (TAP). Most of these approaches have been successfully applied in several works in the fields of biomedicine and biotechnology. One of the most promising techniques is the so-called “shotgun Proteomics”, which is based in the large-scale analysis of the peptide pools generated from unseparated proteomes. The vast amounts of peptidefragmentation information generated by these approaches are only partially deciphered by current bioinformatic tools. We are working with a novel algorithm developed in our laboratory (marketed by Thermo Finnigan under the name of “DeNovoX”) for automated “de novo” sequencing of peptides. We are testing and improving the performance of this algorithm for increasing the confidence of large-scale peptide identification, and for the automated analysis of mutations, postranslational modifications and approaches, which are not fully developed proteomes from species poorly yet. We are therefore concentrating our represented in databases. Piñeiro, C., Vázquez, J., Marina, A., Barros-Velázquez, J., Gallardo, J.M. (2001) Characterization and partial sequencing of species-specific sarcoplasmic polypeptides from commercial hake species by mass spectrometry following two dimensional electrophoresis. Electrophoresis 22, 15451552 López, J.L., Mosquera, E., Fuentes, J., Marina, A., Vázquez, J., Alvarez, G. (2001) Two-dimensional gel electrophoresis of Mytilus galloprovincialis. Differences in protein expression between intertidal and cultured mussels. Marine Ecology Progress Series 224, 149-156 Yagüe, J., Marina, A., Vázquez, J., López de Castro, J.A. (2001) Major histocompability complex class I molecules bind natural peptide ligands lacking the amino-terminal binding residue in vivo. J.Biol.Chem. 276, 43699-43707 Alvarez, I., Martí, M., Vázquez, J., Camafeita, E., Ogueta, S., López de Castro, J.A. (2001) The Cys67 residue of HLAB27 influences cell surface stability, peptide specificity and T-cell antigen presentation. J. Biol. Chem. 276, 48740-48747 Pérez Martín, C., Vázquez, J. Avila, J., Moreno, F.J. (2002) P24, a glycogen synthase kinase 3 (GSK 3) inhibitor. Biochim. Biophys. Acta 1586, 113-122 Pineda-Molina, E., Klatt, P., Vázquez, J., Marina, A., García de Lacoba, M., Pérez-Sala, D., Lamas, S. (2002) Glutathionylation of the p50 subunit of NF-B: a mechanism for redox-induced inhibition of DNA-binding. Biochemistry 40, 14134-14142 Sesma, L., Montserrat, V., Lamas, J.R., Marina, A., Vázquez, J., López de Castro, J.A. (2002) The peptide repertoires of HLA-B27 subtypes differentially associated to spondyloarthropathy (B*2704 and B*2706) differ by specific changes at three anchor positions. J. Biol. Chem. 277, 16744-16749 López, J.L., Marina, A., Vázquez, J. and Alvarez, J. (2002) A proteomic approach to the study of the marine mussels, Mytilus edulis and Mytilus galloprovincialis Marine Biology 141, 217-223 García, M.A., Koonrugsa, N., Toda, T. (2002) Spindlekinetochore attachment requires the combined action of Kin I-like Klp5/6 and Alp14/Dis1-MAPs in fission yeast. EMBO J. 21, 6015-6024 Montes, C., Zuñiga, E.I., Vázquez, J., Arce, C., Gruppi, A. (2002) Trypanosoma cruzi mitochondrial malate dehydrogenase triggers polyclonal B-cell activation. Clin. Exp. Immunol. 127, 27-36 Ramos, M., Paradela, A., Vázquez, M., Marina, A., Vázquez, J. López de Castro, J.A. (2002) Differential association of HLA-B*2705 and B*2709 to ankylosing spondylitis correlates with limited peptide subsets but not with altered cell surface stability. J. Biol. Chem. 277, 28749-28756 Fuentes, J., López, J.L., Mosquera, E., Vázquez, J., Villalba, A. Alvarez, G. (2002) Growth, mortality, pathological conditions and protein expresion of Mytilus edulis and Mytilus galloprovincialis crosses cultured in the Ría de Arousa (NW of Spain). Aquaculture 213, 233-251 Enseñat, R., Martín, F., Barahona, F., Vázquez, J., Soria, B., Reig, J.A. (2002) Direct visualization by confocal fluorescent microscopy of the permeation of mirystoilated peptides through the cellular membrane. IUBMB Life 54, 33-36 López, J.L., Marina, A., Alvarez, G., Vázquez, J. (2002) Application of proteomics for fast identification of speciesspecific peptides from marine species. Proteomics 2, 16581665 Alexa, A., Schmidt, G., Tompa, P., Ogueta, S., Vázquez, J., Kulcsar, P., Kovacs, J., Dombradi, V., Friedrich, P. (2002) The phosphorylation state of threonine-220, a uniquely phosphatase-sensitive protein kinase A site in microtubuleassociated protein MAP2c, regulates microtubule binding and stability. Biochemistry 41, 12427-12435 Esquema de la identificación de péptidos a gran escala mediante los motores actuales de búsqueda en las bases de datos (Sequest), o mediante interpretación automática de secuencia utilizando el programa DeNovoX. Este último permite la identificación de mutaciones y de modificaciones posttraduccionales. Urzainqui, A., Serrador, J.M., Viedma, F., Yáñez-Mó, M., Corbí, A.L., Alonso-Lebrero, J.L., Luque, A., Vázquez, J., Sánchez-Madrid, F. (2002) ITAM-based interaction of ERM proteins with Syk mediates signaling by the leukocyte adhesion receptor PSGL-1. Immunity 17, 401-412 Scheme of large-scale peptide identification using current database searching engines (Sequest), or by automated sequence intepretation using DeNovoX software. The latter allows the identification of mutations and posttranslational modifications. Rey, M., Vicente-Manzanares, M., Viedma, F., Yáñez-Mó, M., Urzainqui, A., Barreiro, O., Vázquez, J., Sánchez-Madrid, F. (2002) Association of the Motor Protein Nonmuscle Myosin Heavy Chain-IIA with the C-terminus of the chemokine receptor CXCR4 in T Lymphocytes. J. Immunol. 169, 5410-5414 41 Microscopía electrónica del VPPA. (A) Viriones maduros intracelulares. (B) Cápsidas vacías generadas en células infectadas con el virus recombinante v220i inducible en la poliproteína pp220, en condiciones restrictivas. c, cápsida; ie, envuelta interna; cs, dominio intermedio; n, nucleoide. Electron microscopy of ASFV. (A) Intracellular mature virions. (B) Empty capsids generated in cells infected with the recombinant virus v220i inducible in polyprotein pp220, under restrictive conditions. c, capsid; ie, inner envelope; cs, core shell; n, nucleoid. 42 C.1 Transmisión de señales a través del receptor para el antígeno de células T Balbino Alarcón José M. Almendral Luis Carrasco Esteban Domingo Manuel Fresno C Inmunología y Virología Mauricio García Mateu Crisanto Gutierrez José A. López de Castro C.1 Signal transduction through the T cell antigen receptor C.2 Bases moleculares de la patogenia y del potencial anti-tumoral de los parvovirus C.2 Molecular bases of parvovirus pathogenesis and anti-tumour potential C.3 Bases moleculares de la citopatologia viral C.3 Molecular bases of viral cytopathology C.4 Variabilidad genética de virus RNA C.4 Genetic variability of RNA viruses C.5 Activación del sistema inmune C.5 Activation of the immune system C.6 Estabilidad e ingeniería de proteínas víricas C.6 Stability and engineering of viral proteins C.7 Replicación del DNA y ciclo celular C.7 Dna replication and cell cycle C.8 Inmunología de los antígenos de histocompatibilidad C.8 Immunology of histocompatibility antigens Immunology and Virology Luis Menéndez Arias Juan Miguel Redondo Miguel Angel Rodríguez Marcos María Luisa Salas Francisco Sobrino María Luisa Toribio C.9 Enzimas retrovirales: análisis estructural y funcional de la retrotranscriptasa del virus de la inmunodeficiencia humana C.9 Retroviral enzymes: structural and functional analysis of human immunodeficiency virus reverse transcriptase C.10 Regulación de la expresión génica en endotelio vascular C.10 Regulation of gene expression in vascular endothelium C.11 Desarrollo del sistema linfohematopoiético embrionario C.11 Embryonic development of the lymphohematopoietic system C.12 Virus de la peste porcina africana C.12 African swine fever virus C.13 Desarrollo de nuevas estrategias para el control y prevención de enfermedades virales: el virus de la fiebre aftosa como modelo C.13 Development of new strategies to control and prevent viral diseases: the foot-andmouth virus as a model C.14 Desarrollo del sistema linfohematopoyético humano C.14 Development of the human lymphohematopoietic system C.15 Replicación y transcripción del dna del bacteriófago ø29 Margarita Salas C.15 Replication and transcription of bacteriophage ø29 Inmunología y Virología Immunology and Virology C.1 Transmisión de señales a través del receptor para el antígeno de células T Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Balbino Alarcón e-mail: [email protected] Personal Científico / Scientific Staff: Edgar Fernández Ester San José Postdoctoral / Postdoctoral Fellow: Wolfgang Schamel Becarios Predoctorales / Graduate Students: Diana Gil Pilar Delgado Alicia Monjas Irene Zaldívar Manuel Pulgar Ruth M Risueño realizado una contribución más significativa El receptor para el antígeno de los linfocitos T (TCR) está compuesto de 6 subunidades: TCR_, TCR`, CD3a, CD3b, CD3¡ y CD3c. Mientras que las dos primeras son en el pasado bienio. Hicimos una búsqueda de ligandos intracelulares de CD3¡ por un responsables del reconocimiento del antígeno, las demás están encargadas de la transmisión de señales al interior celular. por tirosinas fosforiladas, ya conocidos. Uno El TCR no actúa como un simple interruptor sino que es capaz de dar distintas respuestas dependiendo de ligeras modificaciones en el antígeno. En nuestro laboratorio, estamos dedicados al estudio de los mecanismos que regulan la formación de este complejo multiproteíco y de cómo se transmiten las señales de activación al interior de la célula. En líneas generales, los objetivos de nuestra línea de investigación son los siguientes: Personal Técnico / Technical Assistance: Maite Gómez Toñi Cerrato Es en este último objetivo dónde hemos método de dos híbridos con el fin de encontrar efectores distintos a los reclutados de los ligandos encontrados fue Nck, un adaptador implicado en la reorganización del citoesqueleto de actina. Descubrimos que la interacción Nck-CD3¡ es importante para la polimerización de actina inducida por el TCR y así, un mutante dominantenegativo de Nck la bloquea (figura 1). Pero lo que es más importante, Nck es reclutado al TCR de forma inducible en lo que constituye una prueba de que en este receptor se produce un cambio conformacional como mecanismo de señalización. En el momento presente seguimos investigando sobre el mecanismo de - Dilucidar la estequiometría del TCR. - Estudiar los mecanismos de ensamblaje y retención intracelular. - Discernir entre los papeles específicos y redundantes de cada una de las subunidades del TCR. Inducción de "spreading" en linfocitos T transfectados con una construcción dominante negativa para Nck (DN-Nck) o con el vector vacío (control) y estimulados sobre cubreobjetos recubiertos de anti-CD3. Las células están teñidas con Texas Red-faloidina que permite la visualización de F-actina. 44 regulación de la interacción TCR-Nck y en la caracterización de nuevos ligandos de CD3¡ y de las demás subunidades. Signal transduction through the T cell antigen receptor Research summary Publicaciones/Publications: It is in this last objective where we have made the most significant progress in the Gil, D, Gutiérrez, D., Alarcón, B. (2001) Intracellular The T cell antigen receptor (TCR) is composed of 6 subunits: TCR_, TCR`, last two-year period. We made a twohybrid-based screening for intracellular chain of the T cell receptor complex. J. Biol. Chem. 276, CD3a, CD3b, CD3¡ and CD3c. While the first two subunits are responsible for antigen recognition, the others are ligands of CD3¡, aiming to find cytoplasmic ¡ redistribution of nucleolin upon interaction with the CD3 11174-11179 effectors different to the well-characterized tyrosine phosphorylation-dependent ligands. One of the new ligands was Nck, Borroto, A., San José, E., Monjas, A., Roumier, A., an adapter protein involved in reorganization of the actin cytoskeleton. receptor. Inmunologia 20, 119-129 We found that the Nck-CD3¡ interaction is important for the TCR-induced actin Teixeiro, E., Fuentes, P., Galocha, B., Alarcón, B., to the study of the mechanisms that polymerization and, thus, a dominant- transduction controlled by the beta chain transmembrane regulate the formation of this multiproteic complex as well as the signal transduction negative Nck mutant blocked it (figure 1). But, more important, Nck is recluted to the TCR in an inducible manner in what domain: apoptosis-deficient cells display unbalanced responsible for signal transduction. The TCR does not act as a simple switch but is able to produce different responses depending on slight modifications of the antigen. In our laboratory we are dedicated mechanisms. Our general research objectives are the following: - To elucidate the stoichiometry of the TCR. - To study the mechanisms of assembly and intracellular retention. - To investigate the existence of redundant Gutiérrez, D., Martí, M., Terhorst, C., Alcover, A., Alarcón, B. (2001) All-or-none downregulation of the T cell antigen Bragado, R. (2002) T cell receptor-mediated signal mitogen-activated protein kinases activities upon T cell receptor engagement. J. Biol. Chem. 277, 3993-4002 constitutes a hallmark of an undergoing conformational change in the TCR as a signaling mechanism. We are at present studying the mechanisms that regulate the TCR-Nck interaction as well as trying Sancho D., Montoya M.C., Monjas A., Gordon-Alonso to characterize further ligands of CD3¡ and other CD3 subunitis. APC Interface Independently of Pyk2 Activity and in an and specialized roles in signal transduction for each TCR subunit. M., Katagiri T., Gil D., Tejedor R., Alarcon B. SanchezMadrid F.(2002) TCR Engagement Induces Proline-Rich Tyrosine Kinase-2 (Pyk2) Translocation to the T Cell- Immunoreceptor Tyrosine-Based Activation MotifMediated Fashion. J. Immunol. 169, 292-300 Gil, D., Schamel, W., Montoya, M., Sánchez-Madrid, F., ¡ Alarcón, B. (2002) Recruitment of Nck by CD3 reveals a ligand-induced conformational change essential for T cell receptor signaling and synapse formation. Cell 109, 901-912 Premios / Awards Balbino Alarcón fue galardonado con el IX Premio Carmen y Severo Ochoa en 2002. Balbino Alarcón was awarded with the IX Carmen and Severo Ochoa Prize in 2002. Tesis Doctorales / Doctoral Theses Diana Gil Pagés. 2002. "Caracterización de ligandos ¡ citoplásmicos para la cadena CD3 del TCR implicados en la activación de linfocitos T". Universidad Autónoma de Madrid. Induction of cell spreading in T cells transfected with a dominant negative Nck construct (DN-Nck) or with empty vector (control) and stimulated on anti-CD3-coated coverslips. Cells were stained with Texas Redphalloidin to visualize F-actin. 45 Inmunología y Virología Immunology and Virology C.2 Bases moleculares de la patogenia y del potencial anti-tumoral de los parvovirus Resumen de Investigación Jefe de Línea/ Group Leader: José M. Almendral e-mail: [email protected] Personal Científico / Scientific Staff: Juan Carlos Ramírez Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Cristina Sánchez La dependencia de la replicación de los parvovirus por funciones moduladas por la proliferación, diferenciación y transformación celular, confiere a estos virus icosaédricos de ADN de banda sencilla unas propiedades biológicas de especial interés. Aspectos recientes de nuestra investigación con la especie prototipo del género, el virus diminuto del ratón (MVM), son los siguientes. Alberto López-Bueno Noelia Valle Patogenia y evolución. La cepa MVMi induce en ratones inmunodeficientes una leucopenia severa consecuencia de su Laura Riolobos capacidad de infectar precursores Esther Grueso Macarena Sierra hematopoyéticos comprometidos y primitivos, incluyendo células madre con potencial de reconstitución hematopoyética Estudiantes / de larga duración. El MVM muestra en su Undergraduate Students: hospedador natural una alta frecuencia de Elena Merino mutación sorprendente para un virus ADN, que permite la selección en un sólo individuo de variantes virulentos con alteración en la Becarios Predoctorales / Graduate Students: Técnicos de Investigación / Technical Assistance: Vanesa Sánchez Silvia Peñate José M. Cuesta Transporte nuclear y morfogénesis. Las subunidades de proteínas de la cápsida del MVM forman complejos citoplasmáticos que se traslocan al núcleo mediante señales de localización nuclear, localizadas en la secuencia N-terminal de VP1 y en una lámina beta de la región común de VP1/VP2. Mutaciones sencillas en VP1 que alteran el transporte determinan que estos complejos formen estructuras anulares subvirales asociadas a ubiquitina (Figura 2), un fenómeno que puede participar en la regulación de la permisividad celular a los parvovirus. La cápsida de las partículas virales que maduran en el núcleo está fosforilada fundamentalmente en tres serinas del extremo N-terminal de VP2, que conforman una señal de transporte a través de la membrana nuclear en células transformadas. Oncotropismo. El tropismo del MVM hacia células de glioblastomas humano lo unión al receptor primario, y la emergencia de mutantes patogénicos resistentes a encontramos regulado a nivel de la replicación del genoma, y en funciones desconocidas requeridas para la transmisión anticuerpos monoclonales en respuesta a una inmunoterapia pasiva. Los virus entre células que mapean en la región de las proteínas no-estructurales. Estamos resistentes a la neutralización poseen cambios puntuales de amino ácidos situados construyendo virus oncotrópicos por manipulación de estas funciones y de ciertos dominios expuestos en la superficie de la en la espícula de la cápsida (Figura 1). cápsida, para conferir a estos virus una mayor especificidad por receptores de células transformadas que pudiera permitir su uso como vectores selectivos en terapias anti-cáncer. Localización de los cambios de amino ácido en la superficie de la cápsida de MVM (en rojo), que permiten al virus evadir una terapia con anticuerpos neutralizantes en ratones inmunodeficientes. Localization of the amino acid changes on MVM capsid surface in red allowing viral evasion of a neutralizing antibody therapy in immunodeficient mice. 46 Molecular bases of parvovirus pathogenesis and anti-tumour potential Research summary The dependence of parvovirus replication on functions modulated by proliferation, differentiation and cellular transformation confers to these icosahedral singlestranded DNA viruses some biological properties of special interest. Recent issues of our research on the type species of the genus, the minute virus of mice Publicaciones/Publications: Nuclear transport and morphogenesis. Rubio, M.P., Guerra, S., Almendral, J.M. (2001) Genome The MVM capsid protein subunits form replication and post-encapsidation functions mapping to cytoplasmic complexes that are translocated to the nucleus by nuclear the non-structural gene restrict the host range of a murine localization signals placed at the VP1 Nterminal sequence and in a beta strand of the VP1/VP2 common region. Single parvovirus in human cells. J. Virol. 75, 11573-11582 Rommelaere, J., Almendral, J.M., Cornelis, J., Nuesbch, J. (2001) Parvovirus (Parvoviridae, Parvovirinae). En: mutations disrupting VP1 transport determine that these complexes form ring- The Springer Index of Viruses. A. Tidona, G. Darai (ed.) shaped subviral structures associated to ubiquitine (Figure 2), a phenomenon that may participate in the regulation of cell Lombardo, E., Ramírez, J.C., García, J., Almendral, J.M. (MVM), are the followings. Pathogenesis and evolution. The MVMi strain induces in immunodeficient mice a severe leukopenia as a consequence of permissiveness to parvoviruses. The capsid of the viral particles maturing within the nucleus is phosphorylated mainly in virus of mice during assembly and onset of infection. J. its capacity to infect committed and three serine residues of VP2 N-terminus, that conform a signal for the transport of Tesis Doctorales / Doctoral Theses the virions across the nuclear membrane of transformed cells. Alberto López-Bueno. 2002. “Cambios de aminoácidos primitive hemopoietic precursors, including stem cells with long-term hemopoietic reconstitution potential. The MVMi shows in the natural host a striking high mutant (2002) Complementary roles of multiple nuclear targeting signals in the capsid proteins of the parvovirus minute Virol. 76, 7049-7059 en la superficie de la cápsida del parvovirus MVM determinan la adaptación, el tropismo y el escape a frequency for a DNA virus, that allows the Oncotropism. The MVM tropism toward anticuerpos neutralizantes, en un hospedador selection in a single individual of virulent variants with alteration in the binding to the primary receptor, and the emergence human glioblastoma cells was found to inmunodeficiente”. Universidad Autónoma de Madrid. be regulated at the level of genome replication, and by unknown functions required for intercellular spreading Noelia Valle Benítez. 2002. “Mecanismos de salida mapping to the non-structural proteins por la kinasa Raf-1 en células transformadas humanas”. passive immunotherapy. The neutralization resistant viruses harbor punctual changes region. We are constructing oncotropic viruses by the manipulation of these Universidad Autónoma de Madrid. in amino acids placed at the spike of the capsid (figure 1). functions as well as certain domains exposed at the capsid surface, to endow of pathogenic mutants resistant to monoclonal antibodies in response to a these viruses with a higher specificity for transformed cells receptors that could allow their use as selective vectors for anti-cancer therapies. Conjugación de ubiquitina con proteínas de la cápsida de MVM. El genoma de MVM mutado en la región N-terminal de VP1 fue transfectado en células permisivas y analizado por microscopía confocal con (A) un suero anti-cápsida de MVM, y (B) un anticuerpo monoclonal que reconoce ubiquitina conjugada. Ubiquitine conjugation to MVM capsid proteins. MVM genome mutated in the VP1 N-terminal region was transfected in permissive cells and analyzed by confocal microscopy with a (A) MVM capsid antiserum and (B) a monoclonal antibody recognizing conjugated ubiquitine. 47 nuclear del parvovirus MVM: fosforilación de la cápsida Inmunología y Virología Immunology and Virology C.3 Bases moleculares de la citopatología viral Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Luis Carrasco e-mail: [email protected] La infección de células animales por virus produce toda una serie de alteraciones en numerosas funciones celulares. A lo largo genómico retroviral es capaz de traducirse en estas condiciones, debido a la presencia de una estructura tipo IRES. Se está analizando si esta capacidad para reconocer e hidrolizar el eIF4G ocurre también con las proteasas de otras especies de Ivan Ventoso de los años se han descrito numerosas modificaciones tanto morfológicas como funcionales en las células infectadas por Becarios Predoctorales / virus. Nuestra investigación en estos últimos de la traducción en células humanas Graduate Students: años se ha enfocado hacia el análisis de los cambios inducidos por la infección viral de la maquinaria de traducción de los mRNAs, poniendo especial atención en el infectadas por miembros de la familia retroviridae. La estrategia descrita basada en la modificación del complejo de iniciación factor de iniciación eIF4G. Por otro lado, hemos continuado con el estudio de las proteínas virales conocidas como del virus más eficaz. Postdoctoral / Postdoctoral Fellow: Celia Perales Carlos Calandria Raquel Blanco Enrique Alvarez Susana Molina Maria Vanesa Madam Vanesa Rojas Alfredo Castelló Marta Ramos Patricia García. viroporinas, que están implicadas en el aumento de la permeabilidad de la membrana plasmática que tiene lugar después de la replicación del genoma viral. Miguel Angel Sanz Rebeca Galisteo Carmen Hermoso eIF4F conduce a una expresión genética Las viroporinas. Nuestro grupo propuso hace años la existencia de esta nueva familia de proteínas virales, capaces de formar poros en las membranas de las células Modificación del factor de iniciación de la traducción eIF4G. Existen algunas infectadas. Estas proteínas son de pequeño tamaño, muy hidrofóbicas, que oligomerizan e interaccionan con membranas. La función principal de las viroporinas, aunque no especies de virus dentro del grupo de los única, es la de facilitar la salida de las picornavirus que contienen una proteasa capaz de hidrolizar el eIF4G en dos mitades, inactivando a este factor para la traducción partículas virales de las células infectadas, aumentando la gemación de los virus que poseen cubiertas lipídicas. En estos dos de mRNAs celulares sintetizados de novo. Se ha pensado que esta hidrólisis era últimos años hemos asistido a un Técnicos de Investigación / Technical Assistance: retrovirus. Estos estudios abren nuevas perspectivas en el campo de la regulación específica de estas especies de picornavirus. Notablemente hemos encontrado que el virus VIH, responsable de causar el SIDA en humanos, utiliza un mecanismo análogo. La proteasa del VIH es capaz de hidrolizar el eIF4G en dos posiciones, dividiéndolo en los tres dominios funcionales descritos para este factor. Esta hidrólisis inactiva el eIF4G para traducir los mRNAs celulares, mientras que el RNA Dominios y sitios de corte de diversas proteasas sobre el factor de iniciación de la traducción eIF4G. Domains and cleavage sites of several virus proteases on the initiation factor of translation eIF4G. 48 incremento notable en el conocimiento de este grupo de proteínas por parte de varios grupos de investigación. Un descubrimiento de interés ha sido la constatación de la formación de poros en membranas modelo por las viroporinas de picornavirus y de togavirus. Futuros estudios sobre las viroporinas darán lugar a un mayor conocimiento de la estructura y función de esta familia de proteínas virales. Molecular bases of viral cytopathology Publicaciones/Publications: Research summary Viral infection of animal cells provokes a variety of alterations in several cell functions. Throughout the years a number of morphological and biochemical modifications have been described in virus infected cells. Our research in the last few years has focused in the analysis of the changes of the translational machinery that takes place after viral infection, with particular interest in the initiation factor of translation eIF4G. On the other hand, we have continued the study of viral proteins known as viroporins, that are involved in the enhancement of plasma membrane permeability that occurs after virus genome replication. Modification of the initiation factor of translation eIF4G. Some species of picornaviruses encode a protease able to bisect eIF4G, inactivating this factor to This hydrolysis inactivates eIF4G to translate cellular mRNAs, while the González, M.E., Carrasco, L. (2001) Human genomic retroviral RNA is translated due virus glycoprotein processing and enhances membrane to the presence of an IRES structure. The capability of other retroviral PRs to cleave eIF4G is being tested. These studies open new perspectives in the field of the permeabilization. Virology 279, 201-209 regulation of translation in human cells infected by members of the retroviridae family. The strategy based in the modification of the eIF4F complex leads to a more efficient viral gene expression. Biochemistry 40, 3589-3600 immunodeficiency virus type 1 Vpu protein affects Sindbis Irurzun, A., Carrasco, L (2001) Entry of poliovirus into cells is blocked by valinomycin and concanamycin A. Sanz, M.A., Carrasco, L. (2001) A Sindibis virus variant with a deletion in the 6K gene shows defects in glycoprotein processing and trafficking. Lack of complementation by a wild-type 6K gene in trans. J. Virol. The viroporins. Several years ago we advanced the idea of the existence of this group of viral proteins, which are able to form pores at membranes of the infected 75, 7778-7784 cells. These virus- encoded proteins are cap-dependent translation. Proc. Nat. Acad. Sci. USA of small size, very hydrophobic, that oligomerize and interact with membranes. The main function of viroporins, amongst 98, 12966-12971 others, is to facilitate viral exit, increasing L. (2002) Antipoliovirus flavonoids from Psiadia dentata. budding in enveloped viruses. In the last Antiviral Chemistry and Chemotherapy 12, 283-291 Ventoso, I., Blanco, R., Perales, C., Carrasco, L. (2001) HIV-protease cleaves eukaryotic factor 4G and inhibits Robin, V., Irurzun, A., Amoros, M., Boustie, J., Carrasco, translate de novo synthesized cellular two years we have witnessed a mRNAs. It has been thought that this mechanism only occurred with some picornavirus species. Notably, we have significative increase in our knowledge of this group of proteins carried out by Agirre, A., Barco, A., Carrasco, L., Nieva, J.L. (2002) several groups. A notable finding has formation by non-structural poliovirus 2B protein. J. Biol. found that the HIV, that causes AIDS in humans, uses an analogous strategy. The been to analyze pore formation by picornavirus and togavirus viroporins in Chem. 277, 40434-40441 HIV PR has the ability to hydrolyze eIF4G model membranes. Future work about viroporins will add further insights in our understanding of this protein family. Carrasco, L., Guinea, R., Irurzun, A., Barco, A. (2002) at two positions, rendering the three domains described for this factor. Viroporin-mediated membrana permeabilization: pore Effects of viral replication on cellular membrane metabolism and function. In: Molecular Biology of Picornaviruses. B.L. Semler y E. Wimmer (eds.) ASM Press, Washington pp. 337 354 Tesis Doctorales / Doctoral Theses Celia Perales Viejo. 2002. "Regulación de la traducción de los ARNm de gag y env del virus de la inmunodeficiencia humana”. Universidad Autónoma de Madrid. Calificación: Apto cum laude. Carlos Calandria Pérez. “Citotoxicidad de las proteasas 2A y 3C del virus de la polio”. Universidad Autónoma de Madrid. Representación esquemática de las estructuras formadas por las viroporinas en membranas biológicas. Schematic representation of the structures formed by viroporins in biological membranes. 49 Inmunología y Virología Immunology and Virology C.4 Variabilidad genética de virus RNA Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Esteban Domingo e-mail: [email protected] Personal Científico / Scientific Staff: Cristina Escarmís Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Antero Airaksinen Eric Baranowski Claudia González El objetivo del grupo es entender la dinámica de cuasiespecies virales para definir mecanismos de adaptación de los virus y diseñar nuevas estrategias para controlar enfermedades víricas. Empleamos como modelo el virus de la fiebre aftosa (VFA), el virus de la coriomeningitis linfocítica del ratón (VCML), el prototipo de los arenavirus, y el virus de la inmunodeficiencia humana tipo-1 (VIH-1). Antonio Mas Noemí Sevilla Eloisa Yuste Los principales resultados han sido: (i) Caracterización de la memoria molecular en cuasiespecies víricas. (ii) Medidas de la extinción a pesar de una acumulación lineal de mutaciones. Se ha desarrollado un modelo teórico que es coherente con los resultados experimentales obtenidos. En cambio, mediante mutagenesis incrementada se obtiene una extinción eficiente del virus que va acompañada de aumentos de complejidad de los espectros de mutantes. La extinción es tanto más efectiva cuanto menores son la carga viral y la eficacia biológica del virus. Resultados sobre extinción de VCML en cultivos celulares fueron coherentes con los obtenidos con VFA. (iii) Hemos participado en un proyecto de colaboración para seguimiento de cuasiespecies de VIH-1 en pacientes sometidos a tratamiento antiretroviral altamente agresivo (HAART). Armando Arias frecuencia de extinción de variantes del VFA al someter el virus bien a acumulación de mutaciones asociadas a cuellos de Juan Francisco García Arriaza botella poblacionales o a mutagenesis Estos trabajos se han realizado con el apoyo Mónica Herrera incrementada mediante análogos de base mutagénicos, empleados aisladamente o del Ministerio de Ciencia y Tecnología, la Becarios Predoctorales / Graduate Students: Nicolás Molina Nonia Pariente Carmen Martín Ruíz-Jarabo Saleta Sierra en combinación con inhibidores antivíricos. Al someter virus a cuellos de botella sucesivos se ha documentado un descenso Estudiantes / Undergraduate Students: bifásico de valores de eficacia biológica y una considerable resistencia del VFA a la Comunidad Autónoma de Madrid, la Unión Europea y la Fundación FIPSE. El grupo ha colaborado con varios grupos de investigación tanto españoles como extranjeros, cuyas contribuciones se recogen en la lista de publicaciones. Yvonne Avalos Eric Louis Miller Allyson Norman Samuel Ojosnegros Técnicos de Investigación / Technical Assistance: Jorge Castro Mercedes Dávila Gema Gómez-Mariano Científicos Visitantes / Visiting Scientists: Ana Grande Tesis Doctorales / Doctoral Theses Saleta Sierra Aragón. 2001. "Caracterización de la respuesta del virus de la fiebre aftosa a mutagénesis química". Universidad Autónoma de Madrid. Carmen Martín Ruíz-Jarabo. 2002. "Coevolución de antigenicidad y tropismo celular del virus de la fiebre aftosa y descripción de memoria genética en cuasiespecies víricas". Universidad Autónoma de Madrid. Otras Actividades / Other Activities Esteban Domingo, Director del CISA-INIA. Miembro del Consejo Editorial de Virology. Vocal del Consejo Rector del Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA). Colaborador Honorífico del Departamento de Patología Animal I (Sanidad Animal) de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid. 50 Genetic variability of RNA viruses Publicaciones/Publications: Research summary The objective of the group is to understand quasispecies dynamics to define mechanisms of virus adaptation and to design new strategies to control viral disease. As model systems we use footand-mouth disease virus (FMDV), lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) and human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). The main results have been: (i) Characterization of quasispecies memory. (ii) Measurements of frequency of FMDV extinction associated either with accumulation of mutations upon serial bottleneck transfers or to enhanced mutagenesis by base analogues, used alone or in combination with antiviral inhibitors. A bifasic fitness decrease and a remarkable resistance to extinction have been observed upon subjecting FMDV to repeated bottlenecks, despite a linear accumulation of mutations. A theoretical model coherent with experimental results has been developed. In contrast, enhanced mutagenesis led to efficient viral extinction, associated with increases in mutant spectrum complexity. Low viral load and low fitness favour virus extinction. Results of extinction of LCMV in cell culture were in agreement with the results using FMDV. (iii) We have been involved in a collaborative project on quasispecies analyses of HIV-1 samples of patients Arias, A., Lázaro, E., Escarmís, C., Domingo, E. (2001) Molecular intermediates of fitness gain of an RNA virus: characterization of a mutant spectrum by biological and molecular cloning. J. Gen. Virol. 82, 1049-1060 Baranowski, E., Ruiz-Jarabo, C. M., Domingo, E. (2001) Evolution of cell recognition by viruses. 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(2002) Molecular indertermination in the transition to error catastrophe. Systematic elimination of lymphocytic chriomeningitis virus through mutagenesis does not correlate linearly with large increases in mutant spectrum complexity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 12938-12943 Domingo, E., Biebricher, C., Eigen, M., Holland, J.J. (2001) Quasispecies and RNA Virus Evolution: Principles and Consequences. Landes Bioscience, Austin Domingo, E., Mas, A., Yuste, E., Pariente, N., Sierra, S., Gutiérrez-Rivas, M., Menéndez-Arias, L. (2001) Virus population dynamics, fitness variations and the control of viral disease: an update. Prog. Drug Res. 57, 79-115 Fares, M.A., Moya, A., Escarmís, C., Baranowski, E., Domingo, E., Barrio, E. (2001) Evidence of positive selection in the capsid-protein coding region of the foot-and-mouth disease virus (FMDV) subjected to experimental passage regimens. Mol. Biol. Evol. 18, 10-21 Mas, A. (2001) Molecular mechanism in HIV-1 RT resistance to inhibitors. 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Domingo, E., Baranowski, E., Escarmis, C., Sobrino, F. (2002) Foot-and-mouth disease virus. Comp. Immunol. Microbiol. and Infections Diseases 25, 297-308 Domingo, E., Baranoswki, E., Escarmís, C., Sobrino, F., Holland, J.J. (2002) Error frequencies of picornavirus RNA polymerases: evolutionary implications for virus populations. In: Semler, B.L. and Wimmer, E. (eds.) Molecular Biology of Picornaviruses. ASM, Washington, DC, pp. 285-298 Núñez, J.I., Baranowski, E., Molina, N., Ruiz-Jarabo, C.M., Sánchez, C., Domingo, E., Sobrino, F. (2001) A single amino acid substitution in nonstructural protein 3A can mediate adaptation of foot-and-mouth disease virus to guinea-pig. J. Virol. 75, 3977-3983 undergoing highly active antiretroviral Emergence and selection of RNA virus variants: memory and extinction. Virus Res. 82, 39-44 Quer, J., Hershey, C.L., Domingo, E., Holland, J.J., Novella, I.S. (2001) Contingent neutrality in competing viral populations. J. 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A. 51 Inmunología y Virología Immunology and Virology C.5 Activación del sistema inmune Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Manuel Fresno e-mail: [email protected] Personal Científico / Scientific Staff: Pedro Bonay Miarons Miguel Angel Iñiguez Peña La activación del linfocito T induce la expresión de ciclooxigenasa-2 (COX-2), implicada en la síntesis de prostaglandinas, cuya expresión y función en linfocitos T no habían sido descritas. La inducción de COX2 tiene lugar mediante la activación del factor de transcripción NFAT. Además, COX- Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Iñigo Angulo Barturen Núria Gironès Pujol Belén San Antonio de Felipe Elena Gómez Casero Becarios Predoctorales / 2 juega un papel importante en la activación del linfocito T, y está inducida por Cot kinasa y PCKc que regula la activación transcripcional de NF-B via PI3K y de NFAT (Fig1). COX-2 via NFAT juega también un papel fundamental en angiogénesis y en metástasis tumoral. Graduate Students: Pilar Alcaide Alonso La infección de linfocitos T por HIV-1 induce Javier Duque Muñoz la expresión de iNOS, que sintetiza NO cual Raquel Grau Simón activa NF-B y la replicación viral. Además, la proteína tat de HIV afecta la activación del linfocito T, uniéndose a los factores de Carmen Punzón Galvez Carmen Mª Sánchez Valdepeñas Virginia Vila del Sol Elena Maganto García Camino Menéndez García de la Infanta Alicia Hidalgo Estévez transcripción, c-rel y AP-1 impidiendo su El protozoo Trypanosoma cruzi causa de la enfermedad de Chagas que cursa con una inmunosupresión en la fase aguda y autoinmunidad en la fase crónica. Hemos caracterizado una mucina, AgC10 de T. cruzi, responsable de la inhibición de la transcripción de IL-2 en la fase aguda. Además, hemos descrito la existencia de 2 mecanismos de inmunosupresión en la fase aguda, uno mediado por AgC10, y otro por inducción de células inmunosupresoras mieloides inmaduras Gr1+Mac1+ que secretan NO que inhibe la activación T. Estas se inducen también en infeciones por Candida. Además, hemos demostrado claramente que la autoinmunidad juega un papel importante en la patología de la fase crónica. Hemos identificado un nuevo autoantígeno, Cha, que presenta reacción cruzada con 2 proteínas de T. cruzi. Un epítopo es reconocido por linfocitos T y otro por linfocitos B. Además, la transferencia asociación, conduciendo a una inhibición de células T autoreactivas es capaz de inducir patología similar a la causada por de la transcripción de IL-2. la infección (Fig2). Cristina Cacheiro Llaguno Henar Cuervo Grajal Técnicos de Investigación / Technical Assistance: María Cazorla Plaza Mª de los Angeles de Chorro y de VillaCeballos Gema Alcaraz Iglesias Regulation of NF-kB and NFAT transactivation. Several signals: T cell receptor (TCR) activation, tumor promoters (TPA), TNF. VEGF, etc, stimulate NF-kB or NFAT nuclear translocation viaI KK or calcineurin activation respectively. We have found that full activation of these factors requires the induction of a path way that involves the Cot/PKCç axis leading to the phosphorylation of the transactivation domains. Antinflammatory compounds as glucocorticoids and PGJ2 inhibit this path way. 52 Activation of the immune system Publicaciones/Publications: Research summary T cell activation induces cyclooxygenase2 (COX-2) expression, involved in protaglandin synthesis. COX-2 expression and function had not been previously described in T cells. Besides, COX-2 plays a very important role in T cell activation. COX-2 induction takes place through activation of NFAT transcription factor which in turn is activated by Cot kinase and PCKc which also regulates transcriptional activation of NF-B and TNF via PI3K (Fig1). COX-2 induction via NFAT also plays an essential role in angiogenesis and tumor metastasis. HIV-1 infection of T lymphocytes induce iNOS expression which synthesize NO that activates NF-B and viral replication. Besides, HIV-1 tat protein alters T cell activation, being able to bind to c-rel and AP-1 transcription factors, preventing their association, leading to IL-2 transcription The protozoan parasite, Trypanosoma cruzi, causes Chagas’ disease characterized by immunosupression in the acute phase and autoimmunity in the chronic phase. We have characterized AgC10, a mucin, responsible for the inhibition of IL-2 transcription in the acute phase. Besides, we have identified 2 mechanism of immunosuppression: one mediated by AgC10 and another that involves the induction of Gr1+Mac1+ immature myeloid cells that secrete NO that in turns inhibits T cell activation. Those cells are also induced in other infections, as Candida. Besides, we have clearly demostrated the role of autoimmunity in the pathology of the chronic phase. Thus, we have identified a new autoantigen, named Cha, that has crossreactivity with 2 T. cruzi proteins. One crossreactive epitope is recognized by T cells and the other by B cells. Adoptive transfer of T cells to naive recipients causes a disease similar to infected mice (Fig2). inhibition. Tesis Doctorales / Doctoral Theses Belén San Antonio Felipe. 2001. "Papel de la isoforma z de la proteína quinasa C en procesos de supervivencia y activación del linfocito T". Universidad Autónoma de Madrid. José Luis Jiménez Fuentes. 2002. "Efecto de la fosfodiesterasa tipo 4 en la activación del sistema inmune y en la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1": Universidad Complutense de Madrid. Romaris, F., Escalante, M., Lorenzo, S., Bonay, P., Garate, T., Leiro, J., Ubeira, F.M. (2002). Monoclonal antibodies raised in Btk(xid) mice reveal new antigenic relationships and molecular interactions among gp53 and other Trichinella glycoproteins. Mol. Biochem. Parasitol. 125, 173-183. Bonay, P., Gonzalez, L.M., Benitez, L., Foster, M., Harrison, L.J., Parkhouse, R.M., Garate, T. (2002). Genomic and functional characterisation of a secreted antigen of Taenia saginata oncospheres. Mol. Biochem. Parasitol.121, 269-273. Bonay, M., Bancal, C., Crestani, B. (2002). Benefits and risks of inhaled corticosteroids in chronic obstructive pulmonary disease. Drug Saf..25, 57-71. Fernandez-Fernandez, M.R., Camafeita, E., Bonay, P., Mendez, E., Albar, J.P., Garcia, J.A. (2002). 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(2002) African Swine Fever Virus IAP-Like Protein Induces the Activation of Nuclear Factor Kappa B. J Virol. 76, 3836-3942 Punzón C., Resino S., Bellón J.M., Muñoz-Fernández, M.A., Fresno, M. (2002) Analysis of the systemic immune response in HIV-1-infected patients suffering from opportunistic Candida infection. Eur Cytokine Netw 13, 215-23 San-Antonio, B., Iñiguez, M.A., Fresno, M. (2002) Protein kinase C phoshorylates nuclear factor of activated T cells and regulates its transactivating activity. J. Biol. Chem. 277, 27073-27080 Goñi, O., Alcaide, P., Fresno, M. (2002) Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: Involvement of Ly6G(Gr1+)CD11b+ immature myeloid suppressor cells. Int Immunol, 14, 1125-1134 Angulo, I, Fresno, M. (2002) Cytokines in the Pathogenesis of and Protection against Malaria. Curr. Diag. Lab. Immunol. 9, 1145-1152 Angulo, I., Jiménez-Díaz, M.B., García-Bustos, J.F., Gargallo, D., Gómez de las Heras, F., Muñoz-Fernández, M.A., Fresno, M. (2002). Candida albicans infection enhances immunosuppression induced by cyclophosphamide by selective priming of suppressive myeloid progenitors for NO production. Cell. Immunol. 218, 46-58 Kierszenbaum, F., Fresno, M., Sztein, M.B. (2002) The Trypanosoma cruzi membrane glycoprotein AGC10 inhibits human lymphocyte activation by a mechanism preceding translation of both, interleukin-2 and its highaffinity receptor subunits. Mol. Biochem. Parasitol. 125, 91-101 Adoptive transfer of purified T cells from chronically infected mice triggers myocarditis in syngeneic recipient naive mice. Key: black arrow, subendocardial lymphocytic cumulus; black star, limited myocarditis zone; white star, general edema. Scale bar 1/4 25 mm. Lara-Pezzi, E., Gómez-Gaviro, Mª V., Gálvez, B.G., Mira, E., Iniguez, M.A., Fresno, M., Martínez-A, C., Arroyo, A.G., López-Cabrera, M. (2002) The hepatitis B virus X protein promotes tumor cell invasion by inducing membrane-type matrix metalloproteinase-1 and cyclooxygenase-2 expression. J. Clin. Invest. 110, 18311838 53 Inmunología y Virología Immunology and Virology Jefe de Línea / Group Leader: C.6 Estabilidad e ingeniería de proteínas víricas Resumen de Investigación Mauricio García Mateu e-mail: [email protected] Becarios Predoctorales / Graduate Students: Roberto Mateo Fernández Marta del Álamo Camuñas Aura Carreira Moreno Nuestra investigación se centra en el estudio de los determinantes moleculares del ensamblaje y estabilidad de cápsidas víricas, utilizando técnicas de ingeniería de proteínas, y de sus aplicaciones para el diseño de vacunas y antivirales. Actualmente llevamos a cabo tres proyectos relacionados, utilizando como modelos el virus de la fiebre preparación) han facilitado una estrategia para intentar la construcción de una cápsida termoestable de VFA con potencial como vacuna mejorada. 2) Efecto de inserciones de epítopos sobre la estabilidad de una cápsida. Hemos construido cápsidas de MVM que contienen inserciones peptídicas en los aftosa (VFA), el virus diminuto del ratón (MVM) y el virus de la inmunodeficiencia bucles presumiblemente más tolerantes. Los resultados (Carreira y col., para ser enviado) sugieren un papel crítico de incluso Visiting Scientists: humana (HIV), en colaboración con diversos grupos, incluyendo los de J.M. Almendral (CBMSO), J.L. Neira (CBMC) y M. los bucles más expuestos en el ensamblaje y estabilidad, que deberá tenerse en cuenta en el diseño de vacunas quiméricas. José Luis Neira Menéndez (IQFR). Técnico de Investigación / Technical Assistance: Juan Reguera Vidaechea Científicos Visitantes / 3) Disección termodinámica de una (Centro de Biología Molecular y Celular, Universidad Miguel Hernández) 1) Disección del papel estructural y funcional de residuos e interacciones en las interfases entre subunidades de interfase entre subunidades de la cápsida. Hemos realizado la primera disección termodinámica de una interfase una cápsida. Hemos truncado las cadenas laterales implicadas en todas o la mayoría de interacciones entre subunidades de las proteína-proteína en una cápsida vírica, la implicada en dimerización de la proteína cápsidas de VFA o MVM, y analizado los efectos sobre infectividad y/o ensamblaje (Del Álamo y col., en preparación) han revelado la contribución energética de cada y estabilidad. Los resultados (Mateo y col., para ser enviado; Reguera y col., en residuo y nos ayudan en la construcción de un inhibidor del ensamblaje de HIV. Estructura de uno de 12 pentámeros en la cápsida de VFA. Se indican los residuos interfásicos más críticos para la infectividad (violeta) o tolerantes a mutación a alanina (verde). Structure of one of 12 pentamers in the FMDV capsid. Interfacial residues most critical for infectivity (violet) or tolerant to ala mutation (green) are indicated. 54 de la cápsida (CA) de HIV. Los resultados Stability and engineering of viral proteins Publicaciones/Publications: Research summary Research in our group is focused on the molecular determinants of assembly and stability of viral capsids using protein engineering, and on possible applications for the design of vaccines and antiviral agents. We are currently undertaking three related projects using foot-and-mouth disease virus (FMDV), minute virus of mice (MVM) and human immunodeficiency virus (HIV) as models, of a thermostable FMDV capsid, potentially useful in the development of an improved vaccine. Neira, J.L., Mateu, M.G. (2001) Hydrogen exchange of the tetramerization domain of the human tumour suppressor p53 probed by denaturants and temperature. Eur. J. Biochem. 268, 4868-4877 2) Effect on capsid stability of epitope insertions. We have engineered MVM capsids with peptide insertions at the presumably most tolerant surface loops. The results (Carreira et al., to be submitted) suggest a critical role of even the most exposed loops on assembly and stability, and the need to compensate for in collaboration with several groups including those of J.M.Almendral (CBMSO), J.L.Neira (CBMC) and such effects in the design of chimeric vaccines. M.Menéndez (IQFR). 3) Thermodynamic dissection of an interface between capsid subunits. 1) Dissection of the structural and We have carried out the first functional role of residues and interactions at the interfaces between thermodynamic dissection of a proteinprotein interface involved in assembly of capsid subunits. We have truncated the side chains involved in all or most interactions between subunits in the FMDV a viral capsid. Analyses of the dimerization interface of the capsid protein (CA) of HIV or MVM capsids and assessed their individual relevance for viral infectivity the energetic contribution of each residue to CA stability and dimerization and are and/or capsid assembly and stability. The results (Mateo et al., to be submitted; Reguera et al., in preparation) has led us of help in the engineering of a modified (Del Álamo et al., in preparation) revealed CA domain with strong inhibitory activity on HIV assembly. to a strategy to attempt the engineering Estructura del dominio C-terminal de la proteína CA de HIV. Los residuos en la interfase de dimerización se indican en colores de acuerdo a su contribución energética a la asociación, de mayor a menor: rojo, naranja, amarillo, verde. Los residuos en violeta dificultan la dimerización. Structure of the C-terminal domain of protein CA from HIV. Residues at the dimerization interface are indicated in colours according to their energetic contribution to association, from highest to lowest. Residues in violet actuallly impair dimerization. 55 Mateu, M.G. (2002) Equilibrium unfolding of dimeric and monomeric forms of the C-terminal domain of the HIV1 capsid protein. J.Mol. Biol. 318, 519-531 Inmunología y Virología Immunology and Virology Jefe de Línea / Group Leader: C.7 Replicación del DNA y ciclo celular Resumen de Investigación Crisanto Gutierrez e-mail: [email protected] Personal Científico / Scientific Staff: Juan Carlos del Pozo Benito Postdoctoral / Postdoctoral Fellow: M. Beatrice Boniotti María del Mar Castellano Moreno Bénédicte Desvoyes Corinne Fründt María de los Angeles López-Matas Elena Ramírez-Parra Becarios Predoctorales / Graduate Students: María del Mar Castellano Moreno Sara Díaz Triviño La salida y entrada del ciclo celular junto con la duplicación del material genético y su coordinación con el ciclo celular son procesos cruciales para la proliferación celular y con implicaciones en diferenciación celular y desarrollo. La estrategia general de control de las transiciones del ciclo celular parece estar mecanísticamente conservada en eucariontes. Sin embargo, existen diferencias fundamentales en los elementos reguladores, en especial en organismos multicelulares. En plantas, que poseen características únicas de crecimiento y desarrollo, un balance correcto entre división celular, diferenciación y desarrollo es fundamental, ya que la organogénesis es un proceso post-embrionario. Técnicos de Investigación / Technical Assistance: Sergio Llorens Berzosa del ciclo celular para producir una variedad de patrones de crecimiento y desarrollo (Fig. 2). Trabajamos con la planta modelo Arabidopsis thaliana que nos permite realizar abordajes de tipo bioquímico, molecular, celular, genético y de genómica funcional, y con los geminivirus. Recientemente hemos identificado los complejos CDK/ciclina responsables de la fosforilación de RBR en G1/S, estudiado la regulación de los factores E2F a nivel transcripcional y post-traduccional por el proteasoma, identificado una serie de genes regulados por E2F, dilucidado el mecanismo de reclutamiento del complejo RFC al origen de replicación de geminivirus por la proteína de iniciación Rep, y analizado el papel de proteínas de los complejos pre-replicativos (CDC6 y ORC) en endoreplicación y durante el desarrollo. La reactivación de la división celular (transición G0/G1) y la iniciación del período Uno de nuestros mayores retos futuros es S (transición G1/S) son puntos de control críticos que integran señales intra- y entender cómo la regulación de la proliferación celular se integra con los Manuela Nájera extracelulares. Nuestro grupo está estudiando dos de las principales rutas de procesos de diferenciación celular, crecimiento y desarrollo así como cuál es (UNAM, Mexico) control a este nivel: la de retinoblastoma el papel de la ruta de retinoblastoma/E2F/DP Analilia Arroyo (RBR)/E2F/DP y las fases iniciales de la replicación del DNA (Fig. 1), que transducen señales hormonales y ambientales a través en diferenciación y en la biología de las células progenitoras (stem cells). Nerea Cisneros González Científicos Visitantes / Visiting Scientists: (IB, Cuernavaca, México) Leyre Agreda (Universidad de Navarra) Expresión del gen CDC6 en células proliferantes del meristemo radicular (A; flecha) y endoreplicantes (B; tricomas, flechas) de Arabidopsis. La división celular y el desarrollo de las hojas de plantas de tipo salvaje (C; flecha) se inhibe por la expresión ectópica de E2Fc (D; flecha). Expression of CDC6 gene in proliferating root meristem (A; arrow) and endoreplicating (B; trichomes, arrows) Arabidopsis cells. Cell division and leaf development in wild type plants (C; arrow) is inhibited by ectopic expression of E2Fc (D; arrow). 56 DNA replication and cell cycle Publicaciones/Publications: Research summary Cell cycle entry and exit together with duplication of the genetic material and its coordination with cell cycle progression are crucial processes for cell proliferation with enormous implications in cell differentiation and development. The general strategy for controlling cell cycle transitions seems to be mechanistically well conserved among eukaryotes. However, fundamental differences exist in the regulatory networks, in particular in multicellular organisms. In plants, with unique growth and developmental properties, a correct balance between cell division, differentiation and development is crucial since organogenesis is a continuous post- environmental signals, through the cell cycle machinery, to produce a variety of Castellano, M. M., del Pozo, J. C., Ramirez-Parra, E., growth and developmental patterns (Fig. 2). We use the model plant Arabidopsis of Arabidopsis CDC6 is associated with endoreplication. thaliana that allows us to combine biochemical, molecular, cellular, genetic and functional genomic approaches. Recently, we have identified the CDK/cyclin complexes that phosphorylate RBR at G1/S, studied the regulation of E2F transcription factors at the transcriptional and post-translational level through the proteasome, identified a collection of E2F-regulated genes, Brown, S., Gutierrez, C. (2001) Expression and stability Plant Cell 13, 2671-2686 Boniotti, M. B., Gutierrez, C. (2001) A cell cycle-regulated kinase activity phosphorylates plant retinoblastoma protein and contains, in Arabidopsis, a CDKA/cyclin D complex. Plant J. 28, 341-350 Blanchard, F., Rusiniak, M. E., Sharma, K., Sun, X.-L., Todorov, I., Castellano, M. M., Gutierrez, C., Heintz, N. H., Baumann, H., Burhans, W. C. (2002) Targeting of initiation of DNA replication by cell death pathways in mammals and yeast. Mol. Biol. Cell 13, 1536-1549 dilucidated the mechanism to recruit the RFC complex to the origin of geminivirus Boniotti, M. B., Griffith, M. E. (2002) Cross-talk between DNA replication by the initiator protein Rep, and analyzed the role of components 14, 11-17 cell division cycle and development in plants. Plant Cell of pre-replication complexes (pre-RC), such as CDC6 and ORC, in endoreplication and during plant growth Sánchez, M. P., Torres, A., Boniotti, M. B., Gutierrez, C., embryonic process. Reactivation of cell division (G0/G1 and development. Plant. Mol. Biol. 50, 167-175 transition) and initiation of S-phase (G1/S) are checkpoints that integrate intra-and One of our major challenges ahead is to extracellular signals. Our laboratory is studying two of the main control pathways at this level: the retinoblastoma (RBR)/E2F/DP pathway and the initial stages of DNA replication (Fig. 1), both of which transduce hormonal and understand how cell proliferation is integrated with cell differentiation, cell Vázquez-Ramos, J. M. (2002) PCNA protein associates to Cdk-A type protein kinases in germinating maize. Gutierrez, C. (2002) Strategies for geminivirus DNA replication and cell cycle interference. Physiol. Plant Mol. Biol. 60, 219-230 growth and development, as well as what is the relevance of the RBR/E2F/DP Gutierrez, C., Martínez-Salas, E. (2002) DNA plant and pathway for stem cell biology. London, Nature Publishing Group, pp. 555-564 animal virus replication. Encyclopedia of Life Sciences, Luque, A., Sanz-Burgos, A., Ramirez-Parra, E., Castellano, M. M., Gutierrez, C. (2002) Interaction of geminivirus Rep protein with replication factor C and its potential role during geminivirus DNA replication. Virology 302, 83-94 Gutierrez, C., Ramirez-Parra, E., Castellano, M. M., del Pozo, J. C. (2002) G1 to S transition: more than a cell cycle engine switch. Curr. Opin. Plant Biol. 5, 480-486 del Pozo, J. C., Boniotti, M. B.., Gutierrez, C. (2002) Arabidopsis E2Fc functions in cell division and is degraded by the ubiquitin-SCFAtSKP2 – pathway in response to light. Plant Cell 14, 3057-3071 Tesis Doctorales / Doctoral Theses María del Mar Castellano Moreno: 2002. “Iniciación de la replicación del DNA en Arabidopsis: regulación de los componen tes CDC6, CDT1 y ORC1 del complejo prereplicativo". Universidad Autónoma de Madrid. Otras Actividades / Other Activities Rutas implicadas en la transición G1/S en Arabidopsis y su integración con la salida del ciclo celular. - Miembro del EMBO Fellowship Committee - Miembro del Advisory Board de Plant Journal Pathways involved in the G1/S transition and their integration with cell cycle exit. Simposios organizados / Symposia organized - C. Gutierrez, Co-organizer "Cross talk between cell division and development in plants". Fundación Juan March, 2001. 57 Inmunología y Virología Immunology and Virology C.8 Inmunología de los antígenos de histocompatibilidad Resumen de Investigación e-mail: [email protected] Base molecular de la asociación de HLA- de HLA-B27 que es presentado selectivamente por los subtipos de este antígeno asociados a enfermedad. Dicho Personal Científico / Scientific Staff: B27 con espondiloartritis. Los antígenos HLA de clase I presentan péptidos derivados ligando presenta alta homología con una secuencia de Chlamydia trachomatis, una del procesamiento proteasómico del proteoma celular a los linfocitos T citotóxicos. La supresión de la tolerancia inmunológica bacteria artritogénica. El correspondiente Jefe de Línea / Group Leader: José A. López de Castro Luis Antón Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Mercè Martí Alberto Paradela Miriam Vázquez Jesús Yagüe Becarios Predoctorales / Graduate Students: Iñaki Alvarez Patricia Gómez Violeta Gómez Miguel Marcilla Verónica Montserrat Manuel Ramos Laura Sesma Técnicos de Investigación / Technical Assistance: María del Mar de la Torre hacia péptidos propios, por ejemplo como consecuencia de una estimulación antigénica externa, puede desembocar en autoinmunidad. En nuestro laboratorio se estudia el posible papel de la presentación peptídica por HLA-B27 en la patogenia de la espondilitis anquilosante (EA) y otras espondiloartropatías. Se han desarrollado métodos, basados en el análisis estructural por espectrometría de masas, para el análisis comparativo de los repertorios péptido bacteriano se une in vitro a HLAB27 con la misma eficiencia que el ligando endógeno homólogo y es generado por el proteasoma 20S a partir de un precursor sintético con la secuencia de la proteína bacteriana parental. Estos resultados demuestran que es posible, a través del análisis de repertorios peptídicos endógenos, identificar ligandos naturales de HLA-B27 que posean las características esperables de posibles péptidos artritogénicos. peptídicos presentados constitutivamente por subtipos de HLA-B27 asociados diferencialmente a enfermedad. Estos Mecanismos de procesamiento estudios permiten correlacionar la se inicia la vía de procesamiento de asociación a EA con subconjuntos de antígeno. Es entonces cuando tiene lugar péptidos y definir algunas características comunes a estos subconjuntos, entre ellas la presencia de tyrosina C-terminal. la selección de substratos de esta vía, siendo el proteasoma la principal proteasa implicada en este proceso. Nuestro trabajo Complementariamente a esta aproximación, se centra en los mecanismos de esta que persigue la identificación de péptidos con potencial artritogénico, hemos utilizado antigénico. La degradación proteolítica en núcleo y citosol marca el punto en el que la digestión in vitro de substratos sintéticos selección, planteándonos el estudio del papel potencial de estructuras celulares relacionadas con degradación proteolítica, con el proteasoma 20S para la predicción e identificación de ligandos naturales de así como la identificación de diferentes proteínas, ya sean chaperonas, HLA-B27. En el curso de estos estudios se ha identificado un ligando natural endógeno cochaperonas u otras proteasas, que Vista lateral, desde la hélice 2 hacia la hélice 1, del modelo molecular de B*2705 (superficie blanca) en complejo con los péptidos B27 (309-320), en color azul, y DNA primasa (211-222) de Chlamydia trachomatis, en color amarillo. Se muestran los residuos de los péptidos que sobresalen de la superficie de B*2705 (Ramos et al. 2002. J. Biol. Chem. 277: 37573-37581). Side view, from the 2- towards the 1-helix, of a molecular model of B*2705 (white in complex with peptides B27 (309-320), blue, and DNA primase (211-222) from Chlamydia trachomatis, yellow. Protruding peptide residues are indicated (Ramos et al. 2002. J. Biol. Chem. 277: 37573-37581). 58 regulen este proceso. Immunology of histocompatibility antigens Publicaciones/Publications: Research summary Molecular basis of the association of HLA-B27 with spondyloarthritis. HLA class I molecules present peptides derived from the proteasomal processing of the cell proteome to cytolytic T lymphocytes. Abrogation of immune tolerance towards selectively presented by diseaseassociated subtypes. This peptide had high homology with a protein sequence from Chlamydia trachomatis, an arthritogenic bacteria. The chlamydial peptide bound HLA-B27 in vitro with the same efficiency as its homologous natural ligand, and was generated by the 20S self-peptides, for instance as a consequence of external antigenic proteasome from a synthetic precursor with the sequence of the parental bacterial challenge, may lead to autoimmunity. In protein. These results show that it is possible, through the analysis of endogenous peptide repertoires, to our laboratory we are addressing the possible role of HLA-B27-mediated peptide presentation in the pathogenesis of ankylosing spondylitis (AS) and other spondyloarthropathies. We have developed mass spectrometry-based methods for the comparative analysis of peptide repertoires constitutively identify natural HLA-B27 ligands with features expected from putative arthritogenic peptides. Mechanisms of antigen processing. Proteolytic degradation in both cytosol presented for HLA-B27 subtypes differentially associated to disease. These studies allowed us to correlate association and nucleus lies at the core of substrate selection in the MHC class I antigen to AS with limited peptide subsets, and with structural features of these peptides, constitutes the main source of peptide substrates supplied to the pathway. Our such as the presence of C-terminal Tyr. research is focused on the mechanisms behind this selection, aiming at both the Besides this approach, which aims at identifying putative arthritogenic peptides, processing pathway. The proteasome cellular structures involved and the in vitro digestion of synthetic substrates with 20S proteasome was used to predict identification of proteins, such as molecular chaperones and cochaperones and identify novel natural ligands of HLA- or additional proteases, which may B27. Within these studies, we identified an endogenous HLA-B27 ligand that was regulate this process. Purcell, A.W., Gorman, J. J., García-Peydró, M., Paradela, A., Burrows, S. R., Talbo, G. H., Laham, N., Peh, C.A., Reynolds, E.C., López de Castro, J.A., McCluskey, J. (2001) Quantitative and qualitative influence of tapasin on the class I peptide repertoire. J. Immunol. 166, 10161027 Ramos, M., Alvarez, I., García-del-Portillo, F., López de Castro, J.A. (2001) Minimal alterations in the HLA-B27bound peptide repertoire induced upon infection of lymphoid cells with Salmonella typhimurium. Arthritis Rheum. 44, 1677-1688 Reinelt, S., Martí, M., Dédier, S., Reitinger, T., Folkers, G., López de Castro, J.A., Rognan D. (2001) -amino acid scan of a class I MHC-restricted alloreactive T-cell epitope. J. Biol. Chem. 276, 24525-24530 Alvarez, I., Sesma, L., Marcilla, M., Ramos, M., Martí, M., Camafeita, E., López de Castro, J.A. (2001) Identification of novel HLA-B27 ligands derived from polymorphic regions of its own or other class I molecules based on direct generation by 20S proteasome. J. Biol. Chem. 276, 32729-32737 Yagüe, J., Marina, A., Vázquez, J., López de Castro, J.A. (2001) Major Histocompatibility Complex class I molecules bind natural peptide ligands lacking the amino-terminal binding residue in vivo. J. Biol. Chem. 276, 43699-43707 Alvarez, I., Martí, M., Vázquez, J., Camafeita, E., Ogueta, S., López de Castro, J.A. (2001) The Cys-67 residue of HLA-B27 influences cell surface stability, peptide specificity, and T-cell antigen presentation. J. Biol. Chem. 276, 48740-48747 Martí, M., Alvarez, I., Montserrat, V., and López de Castro, J.A. (2001). Large sharing of T-cell epitopes and natural ligands between HLA-B27 subtypes (B*2702 and B*2705) associated with spondyloarthitis. Tissue Antigens 58, 351-362 Antón L. C., Bennink J. R., Yewdell J. W. (2001) Use of proteasome inhibitors to examine processing of antigen for MHC class I presentation. In: Antigen Processing and Presentation Protocols, (Methods in Molecular Biology, v. 156). Ed. J.C.Solheim. Humana Press, Totowa, NJ, USA. pp. 17-31 Tesis Doctorales / Doctoral Theses Iñaki Alvarez Pérez. 2001. "Generación proteasómica de ligandos naturales de HLA-B27 y modulación del repertorio peptídico por posibles factores patogenéticos". Universidad Autónoma de Madrid. Sesma, L, Montserrat, V., Lamas, J. R., Marina, A., Vázquez, J., López de Castro, J.A. (2002) The peptide repertoires of HLA-B27 subtypes differentially associated to spondyloarthropathy (B*2704 and B*2706) differ by specific changes at three anchor positions. J. Biol. Chem. 277, 16744-16749 Ramos, M., Paradela, A., Vázquez, M., Marina, A., Vázquez, J., López de Castro, J.A. (2002) Differential association of HLA-B*2705 and B*2709 to ankylosing spondylitis correlates with limited peptide subsets but not with altered cell surface stability. J. Biol. Chem. 277, 28749-28756 Ramos, M., López de Castro, J.A. (2002) HLA-B27 and the pathogenesis of spondyloarthritis. Tissue Antigens 60, 191-205 Microscopía electrónica de transmisión (x15000) de células linfoides C1R-B*2705 infectadas con Salmonella typhimurium. Las bacterias se observan como cuerpos oscuros, rodeados de membranas vacuolares (Ramos et al. 2001. Arthritis Rheum. 44: 1677-1688). May, E., Dulphy, N., Frauendorf, E., Duchmann, R., Bowness, P., López de Castro, J. A., Toubert, A., MärkerHermann, E. (2002) Conserved TCR chain usage in reactive arthritis. Evidence for selection by a putative HLA-B27-associated autoantigen. Tissue Antigens 60, 299-308 Transmission electron microscopy (x 15000) of the lymphoid C1R-B*2705 cells infected with Salmonella typhimurium. The bacteria are observed as dark bodies surrounded by vacuolar membranes (Ramos et al. 2001. Arthritis Rheum. 44: 1677-1688). Ramos, M., Alvarez, I., Sesma, L., Logean, A., Rognan, D., López de Castro, J.A. (2002) Molecular mimicry of an HLA-B27-derived ligand of arthritis-linked subtypes with chlamydial proteins. J. Biol. Chem. 277, 3757337581 59 Inmunología y Virología Immunology and Virology C.9 Jefe de Línea / Group Leader: Enzimas retrovirales: análisis estructural y funcional de la retrotranscriptasa del virus de la inmunodeficiencia humana Resumen de Investigación podido demostrar el papel que juega la Tyr- e-mail: [email protected] El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un retrovirus que infecta 115 en la discriminación entre ribonucleótidos (rNTPs) y dNTPs, y también su influencia sobre la fidelidad de copia de Becarios Predoctorales / preferentemente a células del sistema la enzima. Nuestros trabajos han puesto Graduate Students: inmune, y provoca el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). de manifiesto el papel de otros residuos, como la Met-230, situados fuera del sitio Actualmente, el tratamiento de la infección por el VIH en países desarrollados implica la utilización de inhibidores de enzimas de unión del dNTP y que también contribuyen de forma importante a la virales como la retrotranscriptasa (RT) y la proteasa. Estos fármacos han mostrado una gran eficacia clínica pero la aparición de virus resistentes, la existencia de potencialmente útiles para el diseño de nuevas estrategias y fármacos antirretrovirales. reacciones cruzadas entre ellos y los efectos secundarios que producen son factores que hipotecan su utilidad a largo plazo. Otros proyectos en curso tienen como objetivo la caracterización bioquímica de Luis Menéndez Arias Clara E. Cases González Tania Matamoros Grande Blanca Mª Vázquez Álvarez Técnicos de Investigación / Technical Assistance: César Garriga Fuentes La retrotranscriptasa del VIH es una enzima clave en la replicación del RNA que fidelidad de la enzima. Estos estudios son variantes de la RT de relevancia clínica. Por ejemplo, RTs portadoras de inserciones que exhiben resistencia a múltiples constituye el material genético del virus. Se trata de una enzima heterodimérica, que fármacos antirretrovirales, y cuyo mecanismo de resistencia demostramos en estudios previos; o RTs resistentes a posee actividad DNA polimerasa nevirapina y otros inhibidores no dependiente de RNA y de DNA, además nucleosídicos, que aparecen en aislados del VIH-1 de grupo O y que se encuentran de actividad endonucleasa (ribonucleasa H). Nuestro trabajo se ha centrado en el análisis del papel que juegan distintos aminoácidos del sitio de unión de alejadas filogéneticamente de las variantes predominantes en Europa y Norteamérica. desoxirribonucleótido (dNTP) en la reacción Junto a estos estudios, nuestro grupo está de síntesis de DNA, con particular énfasis en el estudio de los determinantes implicado en la puesta a punto de una Base de Datos de secuencias de virus de moleculares de la especificidad de nucleótido. Fruto de estos estudios hemos pacientes infectados por el VIH y tratados en hospitales españoles. Estructura cristalográfica de la retrotranscriptasa del VIH-1. Crystal structure of HIV-1 reverse transcriptase. 60 Retroviral enzymes: structural and functional analysis of human immunodeficiency virus reverse transcriptase Research summary have shown that Tyr-115 plays a critical role in discrimination between The human immunodeficiency virus (HIV) is a retrovirus that infects cells of the immune system, and causes the acquired ribonucleotides (rNTPs) and dNTPs, and also influences the copying fidelity of the RT. In addition, the role of residues immunodeficiency syndrome (AIDS). Nowadays, treatment of HIV-infection in developed countries involves the use of outside of the dNTP-binding pocket (e.g. Met-230) in fidelity of DNA synthesis has also been demonstrated. These studies inhibitors of retroviral enzymes such as are potentially useful for the design of novel therapeutic strategies and the reverse transcriptase (RT) and the protease. These drugs have been rather successful in the clinic, but the emergence of resistant viruses, the observed crossreactivity between the inhibitors, and unwanted secondary effects are major antiretroviral drugs. Other current projects include the biochemical characterization of clinicallyrelevant variant RTs. For example, hurdles towards their long-term efficacy. multidrug-resistant RTs carrying a twoamino acid insertion in their “fingers” The HIV reverse transcriptase plays a subdomain, whose resistance mechanism was elucidated in our laboratory; or pivotal role in the replication of the viral genomic RNA. It is a heterodimeric enzyme that possesses RNA- and DNA- nevirapine-resistant RTs found in group dependent DNA polymerase activity as well as endonuclease (ribonuclease H) O HIV-1 variants, which are viruses phylogenetically distant from those predominant in Europe and North activity. Our recent work has been America. devoted to the analysis of the role of different residues that form the Together with those studies, our group is deoxynucleotide (dNTP)-binding site in the DNA synthesis reaction, with particular emphasis on their role in determining the also involved in the establishment of a Database collecting nucleotide sequences of HIV clinical isolates from patients nucleotide specificity of the enzyme. We treated in Spanish hospitals. Publicaciones/Publications: Menéndez-Arias, L., Abraha, A., Quiñones-Mateu, M.E., Mas, A., Camarasa, M.-J., Arts, E.J. (2001) Functional characterization of chimeric reverse transcriptases with polypeptide subunits of highly divergent HIV-1 group M and O strains. J. Biol. Chem. 276, 27470-27479 Zakharenko, A.L., Kolpashchikov, D.M., Khodyreva, S.N., Lavrik, O.I., Menéndez-Arias, L. (2001) Investigation of the dNTP-binding site of HIV-1 reverse transcriptase using photoreactive analogs of dNTP. Biochemistry (Moscow) 66, 999-1007 Gutiérrez-Rivas, M., Menéndez-Arias, L. (2001) A mutation in the primer grip region of HIV-1 reverse transcriptase that confers reduced fidelity of DNA synthesis. Nucleic Acids Res. 29, 4963-4972 Quiñones-Mateu, M.E., Tadele, M., Parera, M., Mas, A., Weber, J., Rangel, H.R., Chakraborty, B., Clotet, B., Domingo, E., Menéndez-Arias, L., Martínez, M.A. (2002) Insertions in the reverse transcriptase increase both drug resistance and viral fitness in a human immunodeficiency virus type 1 isolate harboring the multi-nucleoside reverse transcriptase inhibitor resistance 69 insertion complex mutation. J. Virol. 76, 10546-10552 Mas, A., Vázquez-Álvarez, B. M., Domingo, E., MenéndezArias, L. (2002) Multidrug-resistant HIV-1 reverse transcriptase: Involvement of ribonucleotide-dependent phosphorolysis in cross-resistance to nucleoside analogue inhibitors. J. Mol. Biol. 323, 181-197 Domingo, E., Mas, A., Yuste, E., Pariente, N., Sierra, S., Gutiérrez-Rivas, M., Menéndez-Arias, L. (2001) Virus population dynamics, fitness variations and the control of viral disease: an update. En: Jucker, E. (ed.) Progress in Drug Research., vol. 57. Birkhäuser-Verlag, Basilea (Suiza), págs. 77-115 Menéndez-Arias, L., Domingo, E. (2002) Amino acid substitutions associated with resistance to HIV-1 reverse transcriptase, protease inhibitors, and other antiretroviral drugs. En: Clotet, B., Menéndez-Arias, L., Ruiz, L., Tural, C., Brun-Vezinet, F., Loveday, C., Burger, D., Schapiro, J., Boucher, C., D’Aquila, R., Richman, D.D. (eds.) Guide to management of HIV drug resistance and pharmacokinetics of antiretroviral therapy, 2ª Edición. Editorial Taisa, S.L., Barcelona, España, págs. 37-112 Menéndez-Arias, L. (2002) Sensitivity to reverse transcriptase and protease inhibitors of recombinant HIV clones harboring resistance mutations: In vitro studies. En: Clotet, B., Menéndez-Arias, L., Ruiz, L., Tural, C., Brun-Vezinet, F., Loveday, C., Burger, D., Schapiro, J., Boucher, C., D’Aquila, R., Richman, D.D. (eds.) Guide to management of HIV drug resistance and pharmacokinetics of antiretroviral therapy, 2ª Edición. Editorial Taisa, S.L., Barcelona, España, págs. 113-202 Menéndez-Arias, L., Martínez-Picado, J., Domingo, E. (2002) Drug resistance-associated mutations and their effects in viral fitness. En: Clotet, B., Menéndez-Arias, L., Ruiz, L., Tural, C., Brun-Vezinet, F., Loveday, C., Burger, D., Schapiro, J., Boucher, C., D’Aquila, R., Richman, D.D. (eds.) Guide to management of HIV drug resistance and pharmacokinetics of antiretroviral therapy, 2ª Edición. Editorial Taisa, S.L., Barcelona, España, págs. 203-222. Localización estructural de la Tyr-115 y la Met-230 en relación al sitio de unión del dNTP, en el complejo ternario formado por la retrotranscriptasa, el dNTP entrante y un molde-iniciador DNA/DNA. Structural location of Tyr-115 and Met-230 within the dNTP-binding pocket of HIV-1 reverse transcriptase in the ternary complex containing a DNA/DNA template-primer. Menéndez-Arias, L. (2002) Molecular basis of fidelity of DNA synthesis and nucleotide specificity of retroviral reverse transcriptases. Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 71, 91-147 Menéndez-Arias, L. (2002) Targeting HIV: Antiretroviral therapy and development of drug resistance. Trends Pharmacol. Sci. 23, 381-388 61 Inmunología y Virología Immunology and Virology Jefe de Línea / Group Leader: C.10 Regulación de la expresión génica en endotelio vascular Resumen de Investigación Juan Miguel Redondo e-mail: [email protected] Nuestro interés científico se centra en el estudio de la regulación de la expresión Personal Científico / Scientific Staff: génica en la activación de células Eva Cano endoteliales. Antonio Rodríguez exportación al citoplasma. La efectividad de algunas drogas inmunosupresoras que inhiben la actividad de calcineurina proviene de su acción inhibitoria de NFAT. La disección de los mecanismos de regulación de NFAT permitirían desarrollar estrategias para reemplazar estos inmunosupresores En estos modelos celulares estamos analizando los mecanismos que integran la transducción de señales extracelulares por drogas con menores efectos secundarios. con la activación de factores de transcripción, a su vez encargados de regular programas específicos de inducción En células endoteliales estamos analizando Inmaculada Ortega génica. Parte de nuestros objetivos están dirigidos al estudio de la regulación de la Antonio J Quesada. familia de factores de transcripción NFAT. respuesta a VEGF (factor de crecimiento del endotelio vascular), un potente factor mitogénico y angiogénico. Recientemente Técnicos de Investigación / Esta familia está implicada en procesos de importancia biológica tales como activación hemos determinado que la respuesta endotelial a VEGF conduce a la activación de NFAT, lo que se requiere para la Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Arantzazu Alfranca Sara Martínez Becarios Predoctorales / Graduate Students: Technical Assistance: Dolores López Felipe Were las rutas de señalización y el papel de distintos factores de transcripción en la linfocitaria, morfogénesis de válvulas cardiacas y en el desarrollo de sinapsis. Al menos 4 miembros de la familia residen en expresión de Ciclooxigenasa-2 y que la inhibición de NFAT por Ciclosporina A el citoplasma en células en reposo y se por VEGF. Estos resultados nos han conducido a investigar el efecto de eicosanoides y NFAT en modelos in vitro e translocan al núcleo en respuesta a aumentos intracelulares de calcio, en un proceso que conlleva la desfosforilación de produce inhibición selectiva de angiogénesis NFAT mediada por calcineurina. Al cesar las señales de calcio, quinasas nucleares in vivo de patologías que cursan con neovascularización mediada por VEGF, actualmente en estudio en nuestro poco caracterizadas median su re- laboratorio. 62 Regulation of gene expression in vascular endothelium Research summary Publicaciones/Publications: substituted. These mutants are now being Hernández, G. L., Volpert, O. V., Iñiguez, M. A., Lorenzo, E., Martínez-Martínez, S., Grau, R., Fresno, M., Redondo, We are investigating the mechanisms that couple extra-cellular signals to the used in transient transfection experiments to define the influence of individual phosphorylated residues on the activation of the transcription factors that transactivating activity and subcellular roles of the nuclear factor of activated T cells and regulate specific programmes of gene induction during endothelial cell activation. localization of NFAT family members. The effectiveness of immunosuppressive cyclooxygenase 2. J. Exp. Med. 193, 607-620 drugs that inhibit calcineurin arises from their blockade of NFAT. This research programme is allowing us to dissect the Lorenzo, E., Ruiz-Ruiz, C., Quesada, A.J., Hernández, Our efforts are directed towards the study of NFAT (nuclear factor of activated Tcells). NFAT is implicated in such important biological processes as lymphocyte activation, heart valve morphogenesis, mechanisms of NFAT regulation, and carries with it the potential for developing strategies to replace drugs in current use expression in human primary endothelial cells through and the development of synaptic connections. Members of this large family that have unwanted side effects. of transcription factors are activated by We are also investigating signalling Rodríguez, A. (2002) Transcription initiation sites and the calcium-sensitive phosphatase calcineurin, Deactivation is effected by poorly-defined nuclear kinases that pathways and transcription factors activated by VEGF (vascular endothelial growth factor), potent mitogenic and promoter structure of the human TRAIL-R3 gene. FEBS rephosphorylate NFAT and initiate its return to the cytosol. There is strong evidence to support a role for MAP angiogenic agent. We recently Carretero, M., Gómez-Gonzalo, M., Lara-Pezzi, E., demonstrated that activation of NFAT is required for VEGF–induced expression Benedicto, I., Aramburu, J., Martínez-Martínez, S., kinases in these processes, including our of Cyclooxygenase-2. As COX-2 activity Hepatits B virus X protein binds to and activates the previous work that demonstrated a plays an important role in angiogenesis, we are studying the actions of eicosanoids NH2-termial transactivation domain of nuclear factor of physical association of p38 MAPK with NFAT. We are using mass spectrometry and phospho-peptide mapping to identify NFAT residues phosphorylated by kinases such as p38 and JNK. We have generated J. M. (2001) Selective inhibition of vascular endothelial growth factor-mediated angiogenesis by cyclosporin A: G., Rodríguez, A., López-Rivas, A., Redondo, J.M. (2002) Doxorubicin induces apoptosis and CD95 gene a p53-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 17,1088310892 Ruiz de Almodóvar, C., López-Rivas, A., Redondo, J.M., Lett. 531, 304-308 Redondo, J.M., and López-Cabrera, M. (2002) The activated T-cells-1. Virology 299, 288-300 and NFAT in in vitro and in vivo models of angiogenesis and pathologies Urzainqui, A., Serrador, J.M., Viedma, F., Yáñez-Mó, M., characterised by neovascularisation Rodríguez, A., Corbí, A.L., Alonso-Lebrero, J.L., Luque, mediated by VEGF. A., Deckert, M., Vázquez, J., Sánchez-Madrid, F. (2002) mutants in which these residues are ITAM-based interaction of ERM proteins with Syk mediates signaling by the leucocyte adhesion receptor PSGL-1. Immunity 17, 1-20 Tesis Doctorales / Doctoral Theses Elisa Lorenzo Álvarez. 2002. “Estudio de la regulación transcripcional de genes en respuesta a VEGF y Doxorrubicina en células endoteliales. Efecto apoptótico de Doxorrubicina”. Universidad Autónoma de Madrid. Premios / Awards Juan Miguel Redondo: Premio Iñigo Alvarez de Toledo 2002 a la Investigación Básica. 63 Inmunología y Virología Immunology and Virology C.11 Jefe de Línea / Group Leader: Desarrollo del sistema linfohematopoiético embrionario Resumen de Investigación Miguel Angel Rodríguez Marcos e-mail: [email protected] El sistema hematopoiético adulto se Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Gracia Morales Kucharski Ana Izcue Castellví Becario Predoctoral / Graduate Student: Susana Minguet García mantiene en un equilibrio dinámico entre la diferenciación de células tronco inician la diferenciación linfoide B, y una población de precursores B-específicos es detectable. Dichos precursores son fácilmente establecidos in vitro en cultivos multipotenciales y el recambio celular de los estadios maduros. En el embrión estromales + IL7 a largo plazo, donde maduran a linfocitos B maduros y secretores de Igs y, lo que es más interesante, pueden reconstituir el sistema adulto B funcional. postgastrulación, los progenitores hematopoiéticos emergen de novo de hemangioblastos y/o endotelios (B) En el SV inicial, además de los eritrocitos nucleados y células mieloides, existen hemogénicos, y experimentan altas tasas de proliferación/expansión en nichos primarios (saco vitelino –SV- y pequeñas poblaciones de eritrocitos adultos, megacariocitos, mastocitos y progenitores de microglia. Estamos caracterizando una esplanchnopleura paraaórtica –P/Sp-) y nueva población de precursores T/NK que emerge in situ a día 9 de la gestación del ratón,, y que podría ser relevante en el secundarios (hígado, bazo, sangre). Investigaciones recientes, incluidas de nuestro grupo, han establecido un escenario con dos compartimientos autónomos (SV, establecimiento de la tolerancia madre-feto. P/Sp) que dan lugar a una onda transitoria (C) El hígado es la estación central de la de mieloeritropoiesis embrionaria y a la linfohematopoiesis definitiva, respectivamente. En condiciones hematopoiesis fetal, donde conviven precursores hepatoepiteliales que generarán experimentales, sin embargo, ambos tipos en respuesta a señales del microambiente. Estamos interesados en los mecanismos progenitores linfohematopoiéticos de origen extrínseco. Hemos caracterizado una nueva población de progenitores hepatoepiteliales bipotenciales (c-KitdullCD45-TER119-), capaces de diferenciarse in vitro en sistemas genéticos y celulares que condicionan los específicos. Co-cultivos de progenitores de destinos celulares de progenitores embrionarios, así como en evaluar sus potenciales de regeneración in vivo. ambos sistemas revelan la existencia de de progenitores pueden expresar un amplio espectro de potenciales de diferenciación, hepatocitos y células biliares, con influencias mutuas, a través de interacciones celulares directas y factores solubles (A) Los primeros tres días del desarrollo específicos (SCL, OSM, HGF, etc.). Estamos explorando el posible papel de estos linfoide B. Un día después de su progenitores embrionarios en modelos de especificación, las células tronco de la P/Sp regeneración hepática in vivo. Organización celular del desarrollo de novo, recambio celular y regeneración tras daño tisular. 64 Embryonic development of the lymphohematopoietic system Research summary Publicaciones/Publications: of B-restricted precursors is detected. These cells are easily established in vitro Izcue, A., Morales, G., Minguet, S., Sánchez-Movilla, A., In the adult steady state, the hematopoietic complex is balanced between the differentiation of on long-term stromal cell cultures + IL7, Both B and TCR ab+ lymphocytes regulate superantigen- where they mature to functional, Igsecreting B lymphocytes and, more dependent selection of TCR _`+ lymphocytes in an hematopoietic stem cells and the mature cell turnover. In the postgastrulation embryo, hematopoietic progenitors interestingly, they are able to reconstitute an efficient B-cell compartment in the adult. 31, 2811- 2817 emerge de novo from hemangioblasts Martínez, J.A., Gaspar, M.L., Marcos, M.A.R. (2001) opposite and complementary manner. Eur. J. Immunol. Martínez, J.A., Minguet, S., Gonzalo, P., Soro, P.G., De Andrés, B., Ízcue, A., Marcos, M.A.R., Gaspar, M.L. and/or hemogenic endothelia, and show high rates of proliferation/expansion in 2) Besides the nucleated erythroid and myeloid cells, other subsets of adult (2001) Long-lived polyclonal B-cell lines derived from primary (yolk sac –YS- and paraaortic splanchnopleura –P/Sp-) and secondary niches (liver, spleen, blood). Recent findings from our and other groups have erthrocytes, megakaryocytes, mast cells progenitors reconstitute adult immunodeficient mice. and microglial precursors are present in the starting YS. We are characterizing a Blood 98, 1862-1871 novel population of T/NK precursors emerging in situ at day 9 of gestation that De Andrés, B., Gonzalo, P., Minguet, S., Gómez Soro, could be relevant for the establishment The first three days of B cell development in the mouse of the mother/fetus tolerance. embryo. Blood 100, 4073- 4081 3) The liver becomes the central organ Tesis Doctoral / Doctoral Theses defined a scenario with two autonomous compartments (YS, P/Sp) giving rise to both the transient wave of embryonic myeloerythropoiesis and definitive lymphohematopoiesis, respectively. In experimental conditions, however, both midgestation mouse embryo lymphohematopoietic P., Martínez, J.A, Marcos, M.A.R., Gaspar, M.L. (2002) of fetal hematopoiesis. There, types of progenitors can express a wider spectrum of differentiation potentials in hepatoepithelial precursors for both Susana Minguet García. 2002. “Una población de células hepatocytes and biliary cells are intimately tronco-hepáticas en los estadios iniciales de la response to microenvironment-derived linked to extrinsic hematopoietic progenitors. We have characterized a novel population of hepatoepithelial bipotential progenitors (c-KitdullCD45TER119-) that differentiate in vitro. Co- morfogénesis del hígado embrionario de ratón”. signalings. We are interested in the dissection of the genetic and cellular mechanisms constraining the cell fates of embryonic progenitors, as well as in elucidating their in vivo regeneration potentials. 1) The first three days of B cell development. One day after the specification of P/Sp hematopoietic progenitors, their differentiation to B-cell lineages begins, and a small population cultures of both types of liver progenitors have revealed processes of hematopoietic/hepatoepithelial cross-talk through direct cell interactions and soluble factors (SCL, OSM, HGF, etc.). We are exploring the putative role of these embryonic hepatoepithelial progenitors in in vivo hepatic regeneration. Hepatocitos y células biliares en la diferenciación in vitro de progenitores embrionarios. (A) Hepatocitos secretores de glucógeno (tinciones de PAS); (B) Expresión de citoqueratinas (8, 18, 19) y albúmina en precursores comunes (CK19+ALB*, amarillos), hepatocitos (CK19-ALB+, verdes) y colangiocitos (CK19+ALB-, rojos). 65 Universidad Autónoma de Madrid, Fac. de Ciencias. Inmunología y Virología Immunology and Virology Jefe de Línea / Group Leader: C.12 Virus de la peste porcina africana Resumen de Investigación María Luisa Salas formación del dominio central del virus (“core”), constituido por el nucleoide que Uno de los objetivos de nuestra línea es el estudio del sistema de reparación del DNA del virus de la peste porcina africana contiene el DNA y el dominio intermedio Yolanda Revilla (VPPA), que puede ser esencial para el mantenimiento de la integridad del genoma viral en el ambiente oxidativo y en la poliproteína pp220, uno de los componentes mayoritarios del dominio intermedio. La represión de la síntesis de Javier M. Rodríguez potencialmente genotóxico del macrófago. Postdoctorales / El sistema de reparación por excisión de bases (BER) del VPPA está constituido por la pp220 en este sistema tiene un efecto dramático sobre la morfogénesis del virus, generándose cápsidas vacías, que carecen e-mail: [email protected] Personal Científico / Scientific Staff: José Salas Ángel L. Carrascosa Postdoctoral Fellows: Alí Alejo Germán Andrés Ramón García Becarios Predoctorales / Graduate Students: Carolina Epifano Aitor González Javier Gutiérrez Carolina Hurtado Irene Rodríguez Técnicos de Investigación / una AP endonucleasa, una DNA polimerasa reparativa, designada pol X, y una DNA ligasa. La fidelidad de inserción de la pol X es comparable a la de la DNA polimerasa beta reparativa humana, lo que apoya su participación en la reparación de un daño en el DNA viral debido a alteraciones en María Luisa Nogal del “core” central. Estas estructuras, que no son infectivas y que contienen los determinantes antigénicos presentes en la capa externa de la partícula viral, podrían constituir una herramienta útil para el desarrollo de una vacuna eficaz contra la peste porcina africana, así como para el las bases. Por otra parte, la actividad liasa que posee la pol X sobre intermedios reparativos que contienen un sitio abásico diagnóstico de la enfermedad. sugiere la existencia de una ruta alternativa para el BER viral. los mecanismos que utiliza el virus para controlar la apoptosis y la respuesta inmune Nuestros estudios tienen también como finalidad comprender los procesos de del huésped. Nuestros estudios indican que la apoptosis se induce durante la desencapsidación del virus y que no se ensamblaje de la partícula viral y los mecanismos implicados en la diseminación requiere la replicación de éste para activar el proceso apoptótico. Hemos demostrado, del virus. Utilizando un recombinante del por otra parte, que el gen viral homólogo VPPA que expresa induciblemente la proteína de la cápsida p14.5, hemos demostrado que esta proteína es necesaria al IAP celular, además de bloquear la activación de la caspasa-3, activa al NFkB para la diseminación del virus, estando implicada en el transporte mediado por microtúbulos del VPPA desde las factorías kinasa (IKK). Esto representa una nueva estrategia para evadir la respuesta del huésped, no descrita previamente para virales hasta la membrana plasmática. La otros virus animales. Technical Assistance María José Bustos que rodea a éste, se investigó caracterizando un recombinante inducible Microscopía electrónica del VPPA. (A) Viriones maduros intracelulares. (B) Cápsidas vacías generadas en células infectadas con el virus recombinante v220i inducible en la poliproteína pp220, en condiciones restrictivas. c, cápsida; ie, envuelta interna; cs, dominio intermedio; n, nucleoide. Electron microscopy of ASFV. (A) Intracellular mature virions. (B) Empty capsids generated in cells infected with the recombinant virus v220i inducible in polyprotein pp220, under restrictive conditions. c, capsid; ie, inner envelope; cs, core shell; n, nucleoid. 66 Otro objetivo de nuestro trabajo es investigar mediante la inducción de actividad IkB African swine fever virus Publicaciones/Publications: Research summary constituted by the DNA-containing Andrés, G., Alejo, A., Simón-Mateo, C., Salas, M. L. nucleoid and the core shell that surrounds (2001) African swine fever virus protease: A new viral One objective of our research line is the study of the African swine fever virus (ASFV) DNA repair system, which may it, was investigated by characterizing a recombinant inducible in polyprotein pp220, one of the main components of member of SUMO-1-specific protease family. J. Biol. be essential to maintain the integrity of the viral genome in the oxidative and potentially genotoxic environment of the the core shell. Repression of pp220 synthesis using this system causes a dramatic effect on virus morphogenesis, Nogal, M. L., González de Buitrago, G., Rodríguez, C., macrophage. The ASFV base excision with the generation of “empty capsids” lacking the virus core. These structures, caspase activation and promotes cell survival in repair (BER) system is constituted by an AP endonuclease, a reparative DNA Chem. 276, 780-787 Cubelos, B., Carrascosa, A. L., Salas, M. L., Revilla, Y. (2001) African swine fever virus IAP homologue inhibits mammalian cells. J. Virol. 75, 2535-2543 which are non-infectious and contain the polymerase, designated pol X, and a DNA ligase. The insertion fidelity of pol X is comparable to that of the human reparative DNA polymerase beta, antigenic determinants of the particle external layer, may provide a useful tool for the investigation of effective vaccines Andrés, G., García-Escudero, R., Viñuela, E., Salas, M. against ASFV infection and for the from the assembly sites to the plasma membrane but supporting its participation in the repair of a viral DNA damage due to alterations in the bases. On the other hand, pol X development of ASF diagnostic tests. not for infectivity. J. Virol. 75, 6758-6768 Another objective of our work is to Rodríguez, J. M., Salas, M. L., Santarén, J. F. (2001) possesses a lyase activity on reparative intermediates containing an abasic site, suggesting the existence of an alternative investigate the mechanisms used by the African swine fever virus-induced polypeptides in porcine virus to control the apoptosis and the alveolar macrophages and in Vero cells: Two-dimensional gel analysis. Proteomics 1, 1447-1456 viral BER pathway. immune response. Our studies indicate that apoptosis is induced during virus uncoating and that virus replication is not Our studies are also directed to required to activate the apoptotic process. J. M. (2002) Repression of African swine fever virus understand the assembly processes of the viral particle and the mechanisms involved in virus dissemination. Using an On the other hand, we have demonstrated that the viral gene homologous to cellular polyprotein pp220-encoding gene leads to the assembly L., Rodríguez, J. M. (2001) African swine fever virus structural protein pE120R is essential for virus transport Andrés, G., García-Escudero, R., Salas, M. L., Rodríguez, of icosahedral core-less particles. J. Virol. 76, 2654-2666 IAP, in addition to its effect in preventing caspase-3 activation, is able to activate NFkB through a mechanism that involves Rodríguez, C. I., Nogal, M. L., Carrascosa, A. L., Salas, demonstrated that this protein is necessary for virus dissemination, being involved in the microtubule-mediated the induction of IkB kinase (IKK) activity. virus IAP-like protein induces the activation of nuclear This represents a new strategy to evade the host’s immune response, not factor kappa B. J. Virol., 76, 3936-3942 transport of ASFV from the viral factories described previously for mammalian Carrascosa, A. L., Bustos, M. J., Nogal, M. L., González to the plasma membrane. The formation of the virus central “core” domain, viruses. de Buitrago, G., Revilla, Y. (2002) Apoptosis induced by ASFV recombinant inducibly expressing the capsid protein p14.5, we have M. L., Fresno, M., Revilla, Y. (2002) African swine fever an early step of African swine fever virus (ASFV) entry into Vero cells does not require virus replication. Virology, 294, 372-382 Bustos, M. J., Nogal, M. L., Revilla, Y., Carrascosa, A. L. (2002) Plaque assay of African swine fever virus on swine macrophages. Arch. Virol., 147, 1453-1459 Andrés, G., Alejo, A., Salas, J., Salas, M. L. (2002) African swine fever virus polyproteins pp220 and pp62 assemble into the core shell. J. Virol. 76, 12473-12482 Modulación de NFkB por genes del VPPA homólogos a IkB (gen A238L) e IAP (gen A224L). El IkB viral es un inhibidor del NFkB, mientras que el homólogo del IAP activa a este factor de transcripción por un mecanismo que implica la activación de las IKKs. Modulation of NFkB by ASFV genes homologous to IkB (gene A238L) and IAP (gene A224L). The viral IkB is an inhibitor of NFkB, while the IAP homologue activates this transcription factor by a mechanism involving IKKs activation. 67 Inmunología y Virología Immunology and Virology Investigador responsable / Scientist in charge: Francisco Sobrino Becarios Postdoctorales / Postdoctoral fellows: José Ignacio Núñez Becarios Predoctorales Nicolás Molina Diana Belén de la Morena Científicos Visitantes Visiting Scientists: Lliliane Ganges (CENSA, Cuba) Judith Villén (U. Pompeu Fabra, Barcelona) C.13 Desarrollo de nuevas estrategias para el control y prevención de enfermedades virales: el virus de la fiebre aftosa como modelo Resumen de Investigación esencial para la replicación del virus en cultivos celulares y en modelos animales. El virus de la fiebre aftosa (VFA) constituye un interesante modelo, de gran importancia económica, para entender como las Así mismo, se ha demostrado la implicación de la NSP 3A en el rango de hospedador interacciones entre un virus con gran capacidad de variación y sus diferentes hospedadores naturales, condicionan el única sustitución de aminoácido en esta proteína confiere al VFA la capacidad de producir lesiones vesiculares en cobaya. del virus, habiéndose identificado que una control de la enfermedad que produce. Se está caracterizando la respuesta inmune Finalmente, se ha trabajado en el desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico celular que induce el VFA y sus vacunas convencionales en un importante hospedador natural, el cerdo. Se participa, serológico y en la optimización de la secuenciación y análisis filogenético del VFA y otros virus RNA. también, en el diseño de nuevas vacunas y en el análisis de su inmogenicidad en modelos animales. Se han identificado epítopos T cooperadores en proteínas no estructurales (NSP) del VFA que son eficientemente reconocidos por linfocitos de cerdos domésticos. Estos epítopos están Parte de este trabajo ha sido desarrollado en el laboratorio BSL3 del que se dispone en el CISA-INIA. Se ha colaborado activamente con: D. Andreu (U. Pompeu Fabra), E. Domingo (CBMSO), E. Giralt (U. siendo empleados en la formulación de vacunas peptídicas, cuya inmunogenicidad Barcelona), V. Ley (INIA), E. Martínez-Salas (CBMSO), E.L Palma (INTA, Argentina), M. Sáiz (CISA-INIA), A. Villaverde (U.A. está siendo estudiada. Barcelona), y dentro de los proyectos de la UE: FAIR CT97-3665 y CT96 1317. Se trabaja, también, en el análisis funcional de elementos reguladores del RNA y en el papel de NSP en la patogenia producida por el VFA. La 3’NCR del RNA viral es Representación esquemática de la respuesta inmune específica inducida por el VFA. Reconocimiento de epítopos virales por linfocitos B y T CD4 (cooperadores) y CD8 (citotóxicos, CTL). La inducción de anticuerpos neutralizantes frente al VFA se asocia con protección frente a la infección viral. El papel de la respuesta CTL en la protección frente al VFA es poco conocido, lo que se indica con un interrogante. Schematic representation of the specific immune response induced by FMDV. Recognition of viral epitopes by B and T CD4 (helper) and T CD8 (CTL) lymphocytes. Induction of viral neutralizing antibodies correlates with protection to viral infection. The role of the CTL response in FMD protection is not well established and this is indicated by a question mark. 68 New strategies for prevention and control of viral diseases: foot-and-mouth disease virus as a model. Research summary Publicaciones/Publications: essential for virus replication in cell culture and in animal models. We have also Sáiz, M., Gómez, S., Martínez-Salas, E., Sobrino, F. Foot-and-mouth disease virus (FMDV) is one of the major concerns for animal health. It is also an interesting model demonstrated the implication of NSP 3A in viral host range. A single amino acid abrogates infectivity and viral replication. J. Gen. Virol. system for understanding the interactions of a highly variable virus and its natural hosts and the implications of these adaptation of foot-and-mouth disease virus to guinea-pig. interactions on disease control. We are involved in the characterization Finally, we have worked on the development of methods for serological diagnosis and for optimization of of the cellular immune response to FMDV and its conventional vaccines in pigs. We are also participating in the design of new nucelotide sequencing and phylogenetic analyses of FMDV and other RNA viruses. Part of these activities has been carried vaccines and the analysis of their immunogenicity in animal models. T cell epitopes that are efficiently recognized by porcine lymphocytes have been out in the BSL3 laboratory that F. Sobrino utilizes at CISA-INIA. An important part of the results have been obtained in collaboration with D. Andreu (U. Pompeu identified on FMDV non-structural proteins Fabra), E. Domingo (CBMSO), E. Giralt (NSP). These epitopes are being included in the formulation of peptide vaccines (U. Barcelona), V. Ley (INIA), E. Martínez- Núñez, J.I., Baranowski, E., Molina, N., Ruiz-Jarabo, C., Salas (CBMSO), E.L Palma (INTA, Argentina), M. Sáiz (CISA-INIA) y A. Domingo, E., Sobrino, F. (2001) A single amino acid Villaverde (U.A. Barcelona), and as a adaptation of foot-and-mouth disease virus to guinea- result of the participation in the EU projects: FAIR CT97-3665 y CT96 1317. Highlights Section of ASM News, como uno de los seis whose immunogenicity is under study. We are also analyzing the functional role of RNA regulatory elements and FMDV NSP. The 3’NCR of FMDV RNA is (2001) Deletion or substitution of the aphthovirus 3'NCR 82, 93-101 substitution in this protein can mediate Sobrino, F., Sáiz, M., Jiménez-Clavero, M.A., Núñez, J.I., Rosas, M.F., Baranowski, E., Ley, V. (2001) Foot-andmouth disease virus: a long known virus, but a current threat. Vet. Res. 32, 1-30 Núñez, J.I., Martín, M.J., Piccone. M.E., Carrillo, E., Palma, E.L., Dopazo, J., Sobrino, F. (2001) Identification of optimal regions for phylogenetic studies on VP1 gene of foot-and-mouth disease virus: analysis of types A and O Argentinean viruses. Vet. Res. 32, 31-45 Blanco, E., García-Briones, M., Sanz-Parra, A., Chiva, C., Andreu, D., Ley, V., Sobrino, F. (2001) Identification of T cell epitopes in non-structural proteins of foot-andmouth disease virus. J. Virol. 75, 3164-3174 substitution in non-structural polypeptide 3A can mediate pig. J. Virol. 75, 3977-3983 Seleccionado por la Journal mejores artículos del mes. Sobrino, F., Domingo, E. (2001) Foot-and-mouth disease Otras actividades y reconocimientos científicos / Other scientific activities and awards in Europe. EMBO reports 2, 459-461 F. Sobrino: J.I. Núñez: Miembro del Comité de Redacción y del Consejo Seleccionado como Experto internacional en Editorial de la Revista Oficial de la Sociedad Diagnóstico y Epidemiología Molecular cuantitativa Española de Virología. (1999- ). por la FAO en el proyecto TCP/CUB/8926(A) Feliu, J.X, Ferrer-Miralles, N., Blanco, E., Sobrino, F., “Epidemiología molecular del virus de la peste Villaverde, A. (2002) Enhanced response to antibody porcina clásica”. 2000-2001. binding in engineered -galactosidase enzymatic sensors. Miembro del Editorial Board de Veterinary Reserach (Elsevier). (1998- ). Miembro del Scientific Panel of the Action Access to Research Infrastructures, HPRI-CT2001-00131, of the EU Improving Human Potential Programme. CISA-INIA. (2002 - ). Sobrino, F. (2001) La fiebre aftosa y su control. Pequeños Seleccionado como Experto por la Oficina de Rumiantes. Publicación de la Sociedad Española de Ovinotecnia y Caprinotecnia. 2, 8-15 Biochem. Biophys. Acta. 36605, 1-13 Alimentación y Veterinaria de la Comunidad Sobrino, F., Blanco, E., Núñez, J.I., Jiménez-Clavero, Europea (UE) en la Comisión de seguimiento y M.A., Ley, V. (2002) Cellular immune response to foot- evaluación de la fiebre aftosa en Brasil y Uruguay and-mouth disease virus. Mod. Asp. Immunobiol. 2, 166- . Enero-febrero 2001. 168 Distinción a la labor científica durante los años Sáiz, M., Jiménez-Clavero, M.A., Núñez, J.I., Baranowski, académicos 98-99 y 99-00 por el Instituto de E., Sobrino, F. (2002) Foot-and-mouth disease virus: Miembro del Comité Científico Técnico del Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA) del INIA, MCYT. ( Feb 2002 - Mayo 2002). Investigaciones Agrarias y Alimentarias INIA, 23 prospective for disease control. Microb. Infect. 4, 183- de marzo de 2001. 1192 Coordinador del Curso Internacional de Domingo, E., Baranowski, E., Escarmís, C., Sobrino, F. Epidemiología molecular y enfermedades (2002) Foot-and-mouth disease virus. Comp. Immunol. Director del XI Curso Internacional sobre transfronterizas de los animales domésticos, Microbiol. 25, 297-308 enfermedades Exóticas Animales (AECI-INIA). organizado por la FAO. CENSA- San José de las CISA-INIA, Valdeolmos, Madrid. Noviembre 2002. Lajas, Cuba, mayo de 2001 Miembro de Comité Asesor a la Dirección del Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA) del INIA, MCYT.(Junio 2002 - ). López de Quinto, S., Sáiz, M., de la Morena, D., Sobrino, F., Martínez-Salas, E. (2002) FMDV IRES-driven translation is stimulated separately by the viral 3’NCR Colaboraciones con la industria / Collaborations with Industry and poly (A) sequences. Nucleic Acids Res. 30, 4398- Colaboración con la empresa Tecnología para el Domingo, E., Baranowski, E., Escarmís, C., Sobrino, F., Diagnóstico e Investigación (TDI, SA), para el Holland, J.J. (2002) Error frequencies of picornavirus desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico y RNA polymerases-evolutionary implications for virus caracterización de virus. populations. In: Wimmer, E., Semler, B. (eds.) ASM Press. 4405 pp. 285-298 69 Inmunología y Virología Immunology and Virology Jefe de Línea / Group Leader: C.14 Desarrollo del sistema linfohematopoyético humano Resumen de Investigación 2) Regulación de la expresión del preTCR durante el desarrollo linfoide T. María Luisa Toribio e-mail: [email protected] Nuestro trabajo se centra en el estudio de Personal Científico / Scientific Staff: Gretel Nusspaumer los programas madurativos que determinan la especificación de diferentes linajes celulares a partir de un precursor Susana Rojo hematopoyético multipotencial. En concreto, TCR se regula a nivel transcripcional, existiendo una expresión diferencial de las formas pT_a y pT_b de procesamiento Postdoctorales / hemos identificado las rutas madurativas que determinan la generación in vivo de alternativo del mRNA de pT_ durante el desarrollo intratímico. Además, sólo pT_a linajes hematolinfoides alternativos (linfocitos T, células dendríticas -DC-, o células NK), a partir de los progenitores que colonizan es capaz de expresarse en la membrana formando parte del complejo CD3-pre-TCR, mientras que pT_b se asocia con la cadena TCR` y la retiene intracelularmente, lo que Postdoctoral Fellows: Marina García Peydró Almudena Rodríguez Ramiro Becarios Predoctorales / Graduate Students: Virginia García de Yébenes María de las Nieves Navarro Yolanda Rodríguez Carrasco el timo humano. Nuestro objetivo final es definir la contribución de genes concretos en la especificación celular para identificar los mecanismos implicados en la generación de patologías asociadas al desarrollo linfohematopoyético. Técnico de Investigación / Technical Assistance: Angel Manuel Martínez Durante el bienio 2001-2002, nuestros estudios han incidido en tres aspectos: 1) Ontogenia de las DCs intratímicas. La expresión estadio-específica del pre- sugiere que pT_b también participa en la regulación de la expresión en superficie del pre-TCR. 3) Mecanismos moleculares de control de los niveles de expresión del pre-TCR. Hemos demostrado que la limitada expresión del pre-TCR en la superficie celular está regulada por la cadena pT_ y es independiente de la composición La identificación en el timo humano de una bioquímica del módulo CD3/c. La cadena nueva población de DCs, generadas in vivo a través de un progenitor intermediario pT_ induce la internalización y degradación mieloide, cuestiona la idea aceptada de que las DCs intratímicas tienen origen linfoide y demuestra que el timo se coloniza por progenitores inmaduros que retienen ambas potencialidades, linfoide y mieloide. Acumulación intracelular y colocalización de las subunidades pT_ y TCR` del pre-TCR humano con la proteína PDI residente en el retículo endoplásmico (ER). Intracellular accumulation and colocalization of pT_ and TCR` subunits of the human pre-TCR with the ER-resident PDI protein. 70 constitutiva del pre-TCR y su región citoplásmica posee una función de retención en el retículo endoplásmico. Ambos mecanismos contribuyen a la regulación de los niveles de expresión en superficie del pre-TCR. Development of the human lymphohematopoietic system Research summary Publicaciones/Publications: 2) Regulation of pre-TCR gene Carrasco, Y.R., Ramiro, A.R., Trigueros, C., de Yébenes, V.G., García-Peydró, M., Toribio, M.L. (2001) Identification Our work aims at understanding the expression and function during T cell development. maturation programs that lead to lineage specification from hematopoietic stem cells. Particularly, we have contributed to Expression of pT_a and pT_b mRNA spliced products is differentially regulated the identification of the developmental along intrathymic development, pathways that specify the generation of alternative hematolymphoid lineages (T, suggesting that stage-specific expression of the pre-TCR is regulated at the Ramiro, A.R., Navarro, M.N., Carreira, A., Carrasco, Y.R., dendritic –DCs-, and NK cell lineages) from the earliest thymic precursors. Our final aim is to determine the contribution transcriptional level. In addition, we found that only pT_a is capable of inducing surface expression of a CD3-associated pre-TCR, while pT_b pairs with and B., Toribio, M.L. (2001) Differential developmental of particular genes to critical cell-fate choices, in order to identify pathogenetic events linked to lymphohematopoietic development. of an endoplasmic reticulum retention function for the cytoplasmic tail of the human pre-T cell receptor (TCR) retains TCR` intracellularly. Thus, pT_b may also contribute to the regulation of surface pre-TCR _ chain: A possible role in the regulation of cell-surface pre-TCR expression levels. J. Exp. Med. 193, 1045-1057 de Yébenes, V.G., Carrillo, G., San Millán, J.L., Rubin, regulation and functional effects on pre-TCR surface expression of human pT_a and pT_ b spliced isoforms. J. Immunol. 167, 5106-5114 Rubin B., Alibaud L., Huchenq-Champagne, A., Arnaud, J., Toribio, M.L., Constans, J. (2002) Some hints concerning the shape of T-cell receptor structures. Scand has focused on three main topics: 3) Molecular mechanisms that control surface pre-TCR expression levels. 1) Developmental origin of intrathymic Our studies showed that low surface DCs. expression of the human pre-TCR is The identification in our lab of a novel independent of the biochemical composition of the CD3/c modules, but population of intrathymic DCs that develop depends on the pT_ chain itself. We found in vivo through an intermediate myeloidrestricted progenitor challenges the that the pT_ cytoplasmic tail serves an endoplasmic reticulum retention function, current view that all intrathymic DCs are lymphoid-derived, and provide evidence and propose that pT_ plays a direct role in promoting constitutive internalization and degradation of the pre-TCR. Both During the years 2001-2002 , our work J Immunol. 55, 111-118 Ichimiya S., Kojima, T., Momota, H., Kondo, N., Ozaki, that precursors seeding the human thymus are actually uncommitted progenitors that retain the potential to develop into both lymphoid- and T., Nakagawara, A., Toribio, M.L., Imamura, M., Sato, N. (2002) p73 is expressed in human thymic epithelial cells. J. Histochem. Cytochem. 50, 455-462 de Yébenes, V.G., Carrasco, Y.R., Ramiro, A.R., Toribio, M.L. (2002) Identification of a myeloid intrathymic pathway of dendritic cell development marked by expression of the GM-CSF receptor. Blood 99, 2948-2956 Carrasco, Y.R., Navarro, M.N., Ramiro, A.R., Toribio, M.L. (2002) Regulation of surface expression of the human mechanisms may thus contribute to the pre-TCR. Semin. Immunol. 14, 325-334 regulation of surface pre-TCR expression levels. de Yébenes, V.G., García-Peydró, M., Toribio, M.L. (2002) myelomonocytic-lineage cells. Lymphoid developmental potential of human hematopoietic progenitors transduced with retroviral vectors. Inmunología 21, 121-128 Patentes / Patents Toribio, M.L., Carrillo, G., Ramiro, A.R., de Yébenes, V.G., Carrasco, Y.R.(2001). “Pre-receptor de las células T (pre-TCR): Caracterización y regulación de su expresión durante el desarrollo de las células T en humanos”. CSIC. PCT/ ES02/ 00387 (España, Europa, USA, Canadá, Japón). Tesis Doctorales / Doctoral Theses Yolanda Rodríguez Carrasco. 2001. “Mecanismos moleculares que regulan la expresión del complejo preTCR en la membrana: implicación del dominio intracitoplásmico de la proteína pT_. Universidad Autónoma de Madrid. Localización subcelular de las isoformas pT_a y pT_b. Patrón de expresión intracelular (A) y de superficie (B) de proteínas quiméricas pT_a-GFP y pT_b-GFP en transfectantes estables de células pre-T. Virginia García de Yébenes Mena. 2002. “Plasticidad de Subcellular localization of pT_a and pT_b isoforms. Intracellular (A) and surface (B) expression patterns of chimeric pT_a-GFP and pT_b-GFP proteins in pre-T cell stable transfectants. desarrollo de sistemas de modificación genética para el los progenitores hematopoyéticos del timo humano: estudio de la diversificación de linajes celulares”. Universidad Autónoma de Madrid. 71 Inmunología y Virología Immunology and Virology C.15 Jefe de Línea / Group Leader: Replicación y transcripción del DNA del bacteriófago ø29 Resumen de Investigación a 26, son esenciales para la oligomerización de la proteína y para su funcionalidad. Margarita Salas e-mail: [email protected] Replicación del DNA de ø29 Personal Científico / Scientific Staff: Hemos continuado el estudio del Alicia Bravo mecanismo de iniciación de la replicación del DNA de ø29 mediante proteína terminal Por mutagénesis dirigida hemos Ana Camacho José Miguel Hermoso Wilfried J.J. Meijer Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Ana Abril Belén Calles Emmanuelle Dufour Ralf Eisenbrandt Irene Gascón Víctor González-Huici José A. Horcajadas Alejandro Serna-Rico Verónica Truniger Becarios Predoctorales / Predoctoral Students: Martín Alcorlo Elisa Longás determinado que el motivo “coiled-coil” de la proteína p1 de ø29 está implicado en la formación de láminas bidimensionales in (TP), así como el de otras proteínas implicadas en replicación. vitro. La proteína p1 también forma estructuras multiméricas in vivo asociadas a la membrana bacteriana, lo que sugiere Los residuos Tyr59, His61 y Phe69 de la DNA polimerasa de ø29, localizados en el dominio N-terminal, son esenciales para la que la p1 suministra un sitio de anclaje para interacción con la TP. En el dominio C- La p16.7 de ø29 es una proteína dimérica integral de membrana que se une al DNA de cadena simple, forma multímeros e interacciona con la TP. Hemos propuesto terminal, la Lys392, conservada en DNA polimerasas que inician con TP, localizada a continuación del motivo Kx3NSxYG, es importante para la unión correcta del nucleótido en la iniciación de la replicación. Por otra parte, la Lys371, que precede al motivo Kx3NSxYG, conservada en las DNA polimerasas de tipo eucariótico, está implicada en la unión del nucleótido entrante la replicación del DNA de ø29. que la función de p16.7 es la unión de los intermedios replicativos a la membrana bacteriana mediante la interacción con la TP y con el DNA de cadena simple. Transcripción del DNA de ø29 en las reacciones de iniciación y polimerización. Hemos completado la secuencia del DNA Irene Rodríguez La función de la proteína p6 de ø29 in vivo del fago GA-1, y se ha realizado un análisis de los promotores tempranos del mismo. Gemma Serrano requiere la formación de dímeros. Por otra Daniel Muñoz Laura Pérez parte, la p6 se une in vivo preferentemente Estudiantes / Undergraduate Students: Blanca Manzano a los extremos del DNA de ø29, lo que confirma resultados obtenidos in vitro. Se ha demostrado que la represión del promotor C2 temprano de ø29 por la proteína p6 se debe a un defecto en la Además, la unión de la p6 al DNA in vivo aumenta ~30 veces en presencia de formación del complejo cerrado. novobiocina, que disminuye el La proteína p6 coopera con la proteína José Mª. Lázaro superenrollamiento negativo del DNA. Estos resultados sugieren que el DNA de ø29, reguladora p4 de ø29 en el control del cambio de la transcripción temprana a Ángeles Martínez aunque no está cerrado covalentemente, tardía. La formación de un complejo Laurentino Villar tiene restricción topológica in vivo. nucleoprotéico de ambas proteínas con el DNA de ø29 da lugar a represión de los promotores tempranos A2b y A2c y Patricia Pérez Técnicos de Investigación / Technical Assistance: La proteína p17, en forma dimérica, interacciona con la p6 in vitro y favorece la unión de ésta a los extremos del DNA de ø29. activación del promotor tardío A3. La represión del promotor A2c se debe a la inhibición de la formación del complejo de demostrado que la región N-terminal de la transcripción abierto. La formación estable del complejo nucleoprotéico requiere la interacción entre la p6 y la región C-terminal proteína SSB del fago GA-1, relacionado de la p4. Mediante mutagénesis de deleción hemos con ø29, en concreto los aminoácidos 19 Análisis mutacional en la proteína p1 del fago ø29 Mutational analysis in the phage ø29 protein p1 72 Replication and transcription of bacteriophage ø29 DNA Research summary Publicaciones/Publications: essential for the oligomerization and Meijer, W.J.J. Serna-Rico, A., Salas, M. (2001) functionality of the protein. Characterization of the bacteriophage ø29-encoded Replication of ø29 DNA protein p16.7: a membrane protein involved in phage By site-directed mutagenesis we have DNA replication. Mol. Microbiol. 39, 731-746 We have continued with the studies of shown that the coiled-coil motif of ø29 the mechanism of ø29 DNA initiation of replication primed by the TP, as well as of others proteins involved in replication. Residues Ty59, His61 and Phe69 of ø29 protein p1, is involved in the in vitro formation of bidimensional sheets. Protein p1 also forms multimeric structures in vivo associated to the bacterial the phage ø29 late A3 promoter. J.Mol.Biol. 307, 487- DNA polymerase located at the N-terminal membrane, suggesting that p1 provides an anchoring site for ø29 DNA replication. 497 domain are essential for the interaction with the TP. At the C-terminal domain, Lys392, conserved in DNA polymerases that use TP as primer, located adjacent to motif Kx3NSxYG, is important for correct binding of the templating nucleotide during initiation of ø29 DNA replication. On the other hand, Lys371, that precedes motif Kx3NSxYG, conserved in eukaryotic-type DNA C-terminal domain of the RNA polymerase alpha subunit plays a role in the stability of open complexes formed at Meijer, W.J.J., Horcajadas, J.A., Salas, M. (2001) The The ø29 dimeric protein p16.7 is an integral membrane protein that binds to ø29-family of phages. Microb.Mol.Biol.Rev. 65, 261-287 single-stranded DNA (ssDNA), forms multimers and interacts with the TP. We have proposed that p16.7 function is the Bravo, A., Serrano-Heras, G., Salas, M. (2001) A single attachment of the replicative intermediates to the bacterial membrane through the dimensional sheets to filamentous structures. amino acid substitution within a coiled-coil motif changes the assembly of a 53-amino-acid protein from two- J.Biol.Chem. 276, 21250-21256 interaction with the TP and with ssDNA. polymerases, is involved in the binding of the incoming nucleotide in initiation and Calles, B., Monsalve, M., Rojo, F. , Salas, M. (2001) The Brenkman, A.B. Heideman, M.R., Truniger, V., Salas, M., Transcription of ø29 DNA polymerisation reactions. van der Vliet, P.C. (2001) The "YXGG/A" motif of adenovirus DNA polymerase affects template DNA We have completed the sequence of GA- binding and the transition from initiation to elongation. 1 DNA and analysed its early promoters. J.Biol.Chem. 276, 29846-29853 On the other hand, p6 interacts in vivo We have shown that the repression of the Camacho, A., Salas, M. (2001) Repression of preferentially with the ø29 DNA ends, confirming in vitro results. In addition, p6 ø29 early promoter C2 by protein p6 is due to impairment of closed complex bacteriophage ø29 early promoter C2 by the viral protein binding to DNA in vivo increases ~30 fold formation. J.Biol.Chem. 276, 28927-28932 decreases the negative supercoiling of Ø29 protein p6 cooperates with the Camacho, A., Salas, M. (2001) Mechanism for the switch DNA. These results suggest that ø29 DNA, although it is not covalently closed, regulatory protein p4 in the switch from early to late transcription. The formation of ø29 DNA early to late transcription by regulatory is topologically constrained in vivo. of a multiprotein complex of both proteins 6060-6070 with ø29 DNA leads to repression of the early promoters A2b and A2c and Horcajadas, J.A., Meijer, W.J.J., Rojo, F., Salas, M. activation of the late promoter A3. (2001) Analysis of early promoters of the Bacillus Repression of promoter A2c results from inhibition of open complex formation. The stable formation of the nucleoprotein bacteriophage GA-1 J.Bacteriol. 183, 6965-6970 Salas, M. (2002) Genus ø29-like viruses (Podoviridae). complex requires interaction between p6 The Springer Index of Viruses. Springer-Verlag. pp. 798- and the C-terminal region of p4. 803 In vivo studies have shown that formation of p6 dimers are required for its function. p6 is due to the impairment of the closed complex. in the presence of novobiocin, that Protein p17 dimers interact with p6 in vitro and favor p6 binding to the ø29 DNA ends. By deletion mutagenesis we have shown that the N-terminal region of the SSB protein of the ø29-related phage GA-1, protein p4 and histone-like portein p6. EMBO J. 20, specifically amino acids 19 to 26, are Serna-Rico, A., Salas, M., Meijer, W.J.J. (2002) The Bacillus subtilis phage ø29 protein p16.7, involved in ø29 DNA replication, is a membrane-localizaed singlestranded DNA-binding protein. J.Biol.Chem. 277, 67336742 Truniger, V., Lázaro, J.M., Blanco, L., Salas, M. (2002) A highly conserved lysine residue in ø29 DNA polymerase is important for correct binding of the template strand during initiation of ø29 DNA replication. J.Mol.Biol. 318, 83-96 73 Replicación y transcripción del DNA del bacteriófago ø29 Publicaciones cont./Publications cont.: Tesis Doctorales / Doctoral Theses Premios / Awards / Other Activities Truniger, V., Lázaro, J.M., Esteban, F.J., Blanco, L., Irene Gascón Escobar. 2001. “Caracterización Salas, M. (2002) A positively charged residue in DNA estructural y funcional de las SSBs de los fagos Nf y polymerases from families A and B, is involved in binding GA-1. Estudio comparativo con la SSB de ø29”. Nombrada Asturiana del Siglo XX por El Comercio. the incoming nucleotide. Nucl.Acids.Res. 30, 1483- Universidad Autónoma de Madrid. Diario de Información (2001). Margarita Salas 1492 Víctor González-Huíci. 2001. “Reconocimiento del origen Elegida entre las 100 Mujeres del Siglo XX que abrieron Eisenbrandt, R., Salas, M., de Vega, M. (2002) ø29 de replicación del DNA del bacteriófago ø29”. el camino a la igualdad en el Siglo XXI por el Consejo DNA polymerase residues Tyr59, His61 and Phe69 of Universidad Autónoma de Madrid. de la Mujer de la Comunidad de Madrid (2001). interaction with the terminal protein. Nucl.Acids.Res. Belén Calles Arenales. 2002. “Regulación de la Nombrada Patrona de la Fundación Foro Jovellanos 30,1379-1386 transcripción de los promotores A3 y A2c del del Principado de Asturias (2001- ). the highly conserved ExoII motif, are essential for bacteriófago ø29 de Bacillus subtilis. Función de las Gascón, I., Carrascosa, J.L., Villar, L., Lázaro, J.M., proteínas p4 y p6”. Universidad Autónoma de Madrid. Miembro del Colegio Libre de Eméritos (2001– ). Salas, M. (2002) Importance of the N-terminal region of the phage GA-1 SSB for its self-interaction ability Miembro Electo de la Real Academia de la Lengua and functionality. J.Biol.Chem. 277, 22534-22540 (2001- Abril, A.M., Salas, M., Hermoso, J.M. (2002) The in vivo Miembro del Patronato de la Fundación ICO (2001- ). ). function of phage ø29 nucleoid-associated protein p6 requires formation of dimers. Gene 296, 187-194 Co-dirigió el curso: "Procesos moleculares básicos de los organismos y su patología" de la Escuela de Biología Calles, B., Salas, M., Rojo, F. (2002) The ø29 Molecular "Eladio Viñuela". Universidad Internacional transcriptional regulator contacts the nucleoid protein Menéndez Pelayo (2001). p6 to organize a repression complex. EMBO J. 21, 6185-6194 Member of The Novartis Foundation Scientific Advisory Panel (2002– ). Premio Isabel Ferrer de la Generalitat Valenciana (2002). Medalla de Oro de la Comunidad de Madrid (2002). Doctora Honoris Causa por la Universidad de Extremadura (2002). Co-dirigió el curso “Nuevas perspectivas en Biomedicina y Biotecnología“ de la Escuela de Biología Molecular “Eladio Viñuela”. Universidad Internacional Menéndez Pelayo (2002). 74 Distribución regional de los transportadores GLYT1 (verde) y v-GLUT (rojo) en el área CA3 en hipocampo de cerebro de rata. 76 Carmen Aragón D.1 Bases moleculares de la neurotransmisión glicinérgica D.1 Molecular basis of glycinergic neurotransmission Jesús Avila de Grado D.2 Función de las proteínas microtubulares en neuronas D.2 Function of microtubular proteins in neurons D Neurobiología Neurobiology Edgardo Catalán F. Javier Díez Guerra Cecilio Giménez D.3 Transducción de señales. Mecanismos de acción de neuromoduladores e implicaciones farmacológicas D.3 Signal transduction. Mechanisms of action of neuromodulators and pharmacological implications D.4 Bases moleculares de la plasticidad neuronal D.4 Molecular basis of neuronal plasticity D.5 Regulación de la expresión génica en enfermedades neurogegenerativas D.5 Regulation of the gene expression in neurodegenerative diseases Rafael Manso D.6 Bases moleculares de la adaptación al ejercicio y de la plasticidad muscular D.6 Molecular bases of the adaptation to exercise and of skeletal muscle plasticity Alberto Martínez Serrano Federico Mayor, jr. D.7 Biología de células troncales neurales humanas. Potencial para reposición celular y terapia génica en neurodegeneración D.7 Biology of human neural stem cells. Potential for gene therapy in neurodegeneration D.8 Mecanismos de señalización y regulación de receptores acoplados a proteínas G D.8 G protein-coupled receptors signaling and regulatory mechanisms Galo Ramírez Jorgina Satrústegui Fernando Valdivieso D.9 Neurotransmisión y desarrollo D.9 Neurotransmission and development D.10 Neurodegeneración y envejecimiento: señalización mitocondrial del calcio y señalización de insulina/leptina en envejecimiento D.10 Neurodegeneration and ageing: calcium signalling in mitochondria and insulin/leptin signalling during ageing D.11 Neuropatología molecular de la enfermedad de alzheimer D.11 Molecular neuropathology of alzheimer's disease Neurobiología Neurobiology D.1 Bases moleculares de la neurotransmisión glicinérgica Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Hemos eliminado los cuatro sitios de glicosilación del segundo bucle extracelular de GLYT2 mediante mutagénesis dirigida, Carmen Aragón* La glicina es un neurotransmisor inhibidor e-mail: [email protected] en la médula espinal y en el tallo cerebral de vertebrados que interviene en el Personal Científico / Scientific Staff: procesamiento de la información sensorial lo que nos ha permitido demostrar que las cadenas de oligosacáridos constituyen señales de inserción y distribución Beatriz López-Corcuera y motora de actividades como el movimiento, visión y audición. Así mismo, asimétrica del transportador en la membrana apical de células polarizadas. la glicina tiene un papel excitador como coagonista del glutamato sobre receptores Las propiedades dinámicas del bucle Postdoctoral / Postdoctoral Fellow: Arjan Geerlings Becarios Predoctorales / Graduate Students: Amparo Fornés Lara Rodenstein Pablo Alonso Técnico de Investigación / Technical Assistance: Enrique Núñez *Jefe de línea asociado NMDA en corteza e hipocampo. Los transportadores específicos de glicina de la membrana plasmática de las terminales presinápticas y de los procesos gliales, denominados GLYT1 y GLYT2, desempeñan un papel importante en la finalización de la transmisión glicinérgica, manteniendo concentraciones extracelulares de glicina bajas y elevados niveles en el interior celular. Las alteraciones en la actividad de GLYT1 y GLYT2 podrían estar implicadas en patologías relacionadas con la actividad muscular esquelética y con un tipo de esquizofrenia asociada a una extracelular 1(EL1) de GLYT1 y GLYT2 han sido estudiadas mediante técnicas bioquímicas y electrofisiológicas utilizando mutaciones puntuales y transportadores quiméricos. Nuestros resultados sugieren que EL1 es una fuente de heterogeneidad estructural entre la familia de transportadores de neurotransmisores y que funciona a modo de una visagra que fluctúa entre diferentes conformaciones secuenciales durante el ciclo de transporte. En cuanto a la regulación de estas hipofunción de los receptores NMDA. Los proteínas, hemos demostrado la existencia de un mecanismo regulador mediado por transportadores de glicina son, por tanto, proteínas del complejo SNARE que considerados actualmente como dianas de futuros compuestos con acción terapéutica. aumenta la expresión en membrana de GLYT2 durante la neurosecreción de glicina. Mediante la aplicación de técnicas de El objetivo de nuestro grupo es el estudio microscopía electrónica y detección inmunológica con oro coloidal a una a nivel molecular de la estructura, mecanismo funcional y regulación de GLYT1 preparación de vesículas sinápticas purificadas hemos localizado GLYT2 en y GLYT2, con el objeto de profundizar en la fisiología y patología de la estos orgánulos, lo que sugiere que a través neurotransmisión glicinérgica. del tráfico intracelular del transportador existe una estrecha coordinación entre la liberación de neurotransmisor y su recaptura por los transportadores en la sinapsis. 78 Molecular basis of glycinergic neurotransmission Publicaciones/Publications: Research summary Glycine is an inhibitory neurotransmitter in the spinal cord and the brain stem of vertebrates that participates in the processing of motor and sensory information and is involved in several functions like movement, vision, and audition. In addition, glycine acts as an necessary coagonist of glutamate, the main excitatory neurotransmitter in the brain, on NMDA receptors. Two specific glycine transporters, GLYT1 and GLYT2, located at the plasma membrane of presynaptic nerve terminals or surrounding glial processes, play a major role in the final step of synaptic transmission maintaining a low extracellular and high intracellular concentration of glycine. Dysfunctions of GLYT1 or GLYT2 could be involved in pathologies dealing with disturbed musculoskeletic activity, and a kind of schizophrenia related to NMDA hypofunction. Therefore, glycine transporters are now considered as targets of future therapeutic drugs. López-Corcuera, B., Geerlings, A., Aragón, C. (2001) By site-directed mutagenesis of the four N-glycosylation sites located in the second extracellular loop of GLYT2, we have Glycine neurotransmitter transporters: an update. Mol. identified the carbohydrate moiety as Martínez-Maza, R., Poyatos, I., López-Corcuera, B., signals for targeting and sorting to apical membrane when this neuronal transporter Núñez, E., Giménez, C. Zafra, F., Aragón, C. (2001) is expressed in polarized cells. membrane and sorting of the neuronal glycine transporter Membr. Biol. 18, 13-20 The role of N-glycosylation in transport to the plasma GLYT2. J. Biol. Chem. 276, 2168-2173 The dynamic properties of the extracellular loop1 (EL1) domain of glycine transporters have been studied by biochemical and Geerlings, A., Núñez, E., López-Corcuera, B., Aragón, electrophysiological methods with chimeric and point mutant transporters. Our results suggest that EL1 is a source the neuronal glycine transporter GLYT2. J. Biol. Chem. of structural heterogeneity among the family of neurotransmitter transporters and acts as a fluctuating hinge undergoing Roux, M. J., Martínez-Maza, R., Le Goff, A., López- sequential conformational changes during the transport cycle. reactivity to sulfhydryl reagents. J. Biol. Chem. 276, We have reported the existence of a SNARE-mediated regulatory mechanism López-Corcuera, B., Aragón, C. and Geerlings, A. (2001). that controls the surface expression of GLYT2 in a brain-derived preparation. Under conditions that stimulate vesicular . 29, 742-745 C. (2001) Calcium and syntaxin1 mediated trafficking of 276, 17548-17590 Corcuera, B., Aragón, C., Supplisson, S. (2001) The glial and the neuronal glycine transporters differ in their 17699-17705 Regulation of Glycine Transporters. Biochem. Soc. Trans López-Corcuera, B., Núñez, E., Martínez-Maza, R., glycine release, GLYT2 is rapidly traffics first toward the plasma membrane and Geerlings, A., Aragón, C.(2001) loop one in the glycine transporter GLYT2. J. Biol. Chem. regulation characteristics, with the aim to then internalized. This coordinated regulation of glycine neurosecretion and glycine reuptake has been also supported understand the physiology and pathology of glycine-mediated neurotransmission. by GLYT2 localization on synaptic vesicles by immunogold electron microscopy. Geerlings, A., Núñez, E., Rodenstein, L., López-Corcuera, Our group is studying the molecular properties of GLYT1 and GLYT2, mainly structure-function relationship and Substrate-induced conformational changes of extracellular 276, 43463- 43470 B., Aragón, C. (2002) Glycine transporter isoforms show differential subcellular localization in PC12 cells. J. Neurochem. 82, 58-65 79 Neurobiología Neurobiology D.2 Función de las proteínas microtubulares en neuronas Resumen de Investigación Jefe de línea / Group Leader: Jesús Avila de Grado e-mail: [email protected] Nuestro trabajo ha continuado en el estudio de la función de las proteínas microtubulares, fundamentalmente la En experimentos en cultivos celulares se ha logrado observar la formación de agregados de tau hiperfosforilado, habiéndose encontrado que la fosforilación de tau por la proteína GSK3 puede facilitar dicho ensamblaje. Javier Díaz-Nido proteína asociada a los microtúbulos MAP1B, en el desarrollo de la forma neuronal; la implicación de la proteína María Teresa Moreno-Flores asociada a los microtúbulos, tau, en Félix Hernández procesos de degeneración neuronal que cursan con la aparición de agregados un ratón transgénico condicional que sobreexpresa GSK3. En este ratón, tau está hiperfosforilado, su asociación a los Personal Científico / Scientific Staff: José Javier Lucas Filip Lim Mar Pérez En base a los resultados anteriores se aisló aberrantes de dicha proteína, y el análisis de la regeneración neuronal. microtúbulos está disminuida, pero no forma agregados aberrantes. Sin embargo, el estudio de su comportamiento sugiere Sobre la implicación de la proteína MAP1B Miguel Díaz en el desarrollo de la forma neuronal hemos encontrado que MAP1B juega un importante defectos en su memoria. También, el ratón presentaba unas características patológicas similares a las encontradas en enfermos Becarios Predoctorales / papel en el proceso de elongación axonal y que puede complementar a otras proteínas de Alzheimer. Adicionalmente, se aisló un ratón transgénico que sobreexpresa tau Graduate Students: como MAP2 y tau para la determinación Alberto Gómez de la forma neuronal. Para estos análisis se ha utilizado un ratón deficiente en humano conteniendo alguna de las mutaciones que se encuentran en la demencia frontotemporal asociada al MAP1B, y en estudios de cultivos de neuronas se han utilizado oligonucleótidos cromosoma 17 (FTDP-17). La caracterización de este ratón indicó la antisentido para inhibir la expresión de presencia en su cerebro de agregados aberrantes de tau. Tanto en este ratón como Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Christian González-Billault Ester Martín Eva-María Jiménez Erika Pastrana Tobías Engel Raquel Gómez Alfredo Giménez Olga Abbad MAP2 y tau. Técnicos de Investigación / La agregación aberrante de tau ha sido Technical Assitance: Raquel Cuadros estudiada a tres niveles; in vitro, en cultivos celulares, y en ratones transgénicos. utilizados como modelos para estudiar alguna de las características patológicas que tienen lugar en la enfermedad de Elena Langa Experimentos in vitro han determinado la Alzheimer. Chus Martín región de la molécula de tau, fundamentalmente implicada en el proceso de autoasociación. También, mediante Sobre la regeneración axonal hemos continuado estudiando las células de glía experimentos in vitro, se ha observado que envolvente y hemos observado que en la proteína tau cambia su conformación durante el proceso de su polimerización. procesos de regeneración axonal hay un aumento en la expresión de la proteína MAP1B fosforilada. en el que sobreexpresa GSK3 podrían ser Santiago Soto-Largo Tesis Doctorales / Doctoral Theses Ester Martín Aparicio. 2002. “Caracterización del modelo transgénico condicional de la enfermedad de Huntington: estudios in vivo y en cultivos primarios”. Premios / Awards Premio de la Comunidad de Madrid, 2001. / Prize from the Comunidad de Madrid, 2001. Premio de la Fundación Pfizer, Envejecimiento y Calidad de Vida, 2001. / Prize of Fundación Pfizer, 2001. Premio de la Fundación Pfizer, Envejecimiento y Calidad de Vida, 2002. / Prize of Fundación Pfizer, 2002. Premio de la Fundación Lilly en Investigación Biomédica, 2002. / Prize of Fundación Lilly on Biomedical Research, 2002. 80 Function of microtubular proteins in neurons Publicaciones/Publications: Research summary transgenic mouse overexpressing human We have continued in our analysis of the function of a microtubule associated protein, MAP1B, in the development of tau containing those mutations that are found in some patients with frontotemporal dementia linked to chromosome 17 (FTDP-17). neuron morphology; in the study of the role of other microtubule associated protein, tau, in neurological disorders The characterization of this mouse showed the presence, in its brain, of (tauopathies) characterized by the appearance of aberrant aggregates of aberrant aggregates of tau. Thus, this mouse and that one overexpressing GSK3 that protein; and in the analysis of axonal may be used as models for some regeneration in damaged neurons. pathological features that take place in Alzheimer´s disease. About the function of MAP1B in neuron morphogenesis we have found that this protein plays an important role on the process of axonal elongation. Together About axonal regeneration we have with other microtubule associated proteins like MAP2 and tau, MAP1B could during nerve regeneration is an increase of MAP1B in phosphorylated form. continued the characterization of ensheating glia cells and we found that determine the neuron shape. For these oligonucleotides. We have studied the aberrant tau aggregation at three different levels; in vitro, in cell culture and by using transgenic mice. In vitro analysis has indicated the region, in tau molecule, involved in selfassociation. Additional in vitro experiments indicated that tau protein modifies its conformation when it polymerizes into filaments. By using cellular cultures, some conditions were developed to allow the formation of hyperphosphorylated tau aggregates. Moreover, it was shown that the Perry, G., Taddeo, M. A., Nunomura, A., Zhu, X., ZentenoSavin, T., Drew, K. L., Shimohama, S., Avila, J., Castellani, R. J., Smith, M. A. (2002) Comparative biology and pathology of oxidative stress in Alzheimer and other neurodegenerative diseases: beyond damage and response. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 133, 507-513 Gonzalez-Billault, C., Owen, R., Gordon-Weeks, P. R., Avila, J. (2002) Microtubule-associated protein 1B is involved in the initial stages of axonogenesis in peripheral nervous system cultured neurons. Brain Res. 943, 56-67 Perry, G., Nunomura, A., Cash, A. D., Taddeo, M. A., Hirai, K., Aliev, G., Avila, J., Wataya, T., Shimohama, S., Atwood, C. S., Smith, M. A. (2002) Reactive oxygen: its sources and significance in Alzheimer disease. J. Neural. Transm. Suppl. 69-75 Perry, G., Nunomura, A., Hirai, K., Zhu, X., Prez, M., Avila, J., Castellani, R. J., Atwood, C. S., Aliev, G., Sayre, L. M., Takeda, A., Smith, M. A. (2002) Is oxidative damage the fundamental pathogenic mechanism of Alzheimer's and other neurodegenerative diseases? Free Radic. Biol. Med. 33, 1475-1479 Based in the previous results, a transgenic mouse overexpressing GSK3, in a Perez, M., Hernandez, F., Gomez-Ramos, A., Smith, M., Perry, G., Avila, J. (2002) Formation of aberrant phosphotau fibrillar polymers in neural cultured cells. Eur. J. Biochem. 269, 1484-1489 mouse, tau is in hyperphosphorylated form, this modified tau shows a lower microtubule binding capacity, but it does Sanchez, M. P., Gonzalo, I., Avila, J., De Yebenes, J. G. (2002) Progressive supranuclear palsy and tau hyperphosphorylation in a patient with a C212Y parkin mutation. J. Alzheimers Dis. 4, 399-404 not form aberrant aggregates. However, some memory deficits were observed by Sayas, C. L., Avila, J., Wandosell, F. (2002) Glycogen synthase kinase-3 is activated in neuronal cells by Galpha12 and Galpha13 by Rho-independent and Rhodependent mechanisms. J. Neurosci. 22, 6863-6875 found in Alzheimer´s disease patients. Additionally, we isolated another Alvarez, G., Munoz-Montano, J. R., Satrustegui, J., Avila, J., Bogonez, E., Diaz-Nido, J. (2002) Regulation of tau phosphorylation and protection against beta-amyloidinduced neurodegeneration by lithium. Possible implications for Alzheimer's disease. Bipolar Disord. 4, 153-165 Diaz-Nido, J., Wandosell, F., Avila, J. (2002) Glycosaminoglycans and beta-amyloid, prion and tau peptides in neurodegenerative diseases. Peptides 23, 1323-1332 Sadqi, M., Hernandez, F., Pan, U., Perez, M., Schaeberle, M. D., Avila, J., Munoz, V. (2002) Alpha-helix structure in Alzheimer's disease aggregates of tau-protein. Biochemistry 41, 7150-7155 doing behavioural tests, and it presents some pathological features similar to those Agudo, M., Trejo, J. L., Lim, F., Avila, J., Torres-Aleman, I., Diaz-Nido, J., Wandosell, F. (2002) Highly efficient and specific gene transfer to Purkinje cells in vivo using a herpes simplex virus I amplicon. Hum. Gene Ther. 13, 665-674 Moreno-Flores, M. T., Martin-Aparicio, E., Avila, J., DiazNido, J., Wandosell, F. (2002) Ephrin-B1 promotes dendrite outgrowth on cerebellar granule neurons. Mol. Cell. Neurosci. 20, 429-446 modifications of tau protein by GSK3 could facilitate its aggregation. conditional way, was isolated. In this Avila, J., Lucas, J. J., Lim, F., Pérez, M., Hernández, F., Arrasate, M., Armas, R., Perry, G., Smith, M.A., Díaz Nido, J. (2001) Phosphorylation, microtubule binding and aggregation of tau in Alzheimer’s disease. In: K. Iqbal, S. S. Sisodia and B. Winblad. (eds.) Alzheimer´s Disease: Advances in Etiology, Pathogenesis and Therapeutics. John Wiley and Sons. Ltd. Ch. 55. 601-607 Avila, J., Lim, F., Moreno, F., Belmonte, C., Cuello, A. C. (2002) Tau function and dysfunction in neurons: its role in neurodegenerative disorders. Mol. Neurobiol. 25, 213231 analyses we have used a mouse lacking MAP1B and neuron cultures where the expression of MAP2 and tau has been prevented by addition of antisense Perry, G., Nunomura, A., Avila, J., Pérez, Rottkamp, C. A., Atwood, C. S., Zhu, X., Aliev, G., Cash, A. D., Smith, M. A. (2001) Oxidative damage and antioxidant responses in Alzheimer´s disease. In: K. Iqbal, S. S. Sisodia and B. Winblad. (eds.) Alzheimer´s Disease: Advances in Etiology, Pathogenesis and Therapeutics. John Wiley and Sons. Ltd. Ch. 34. 371-377 Sayas, C. L., Avila, J., Wandosell, F. (2002). Regulation of neuronal cytoskeleton by lysophosphatidic acid: role of GSK-3. Biochim. Biophys. Acta 1582, 144-153. Wataya, T., Nunomura, A., Smith, M. A., Siedlak, S. L., Harris, P. L., Shimohama, S., Szweda, L. I., Kaminski, M. A., Avila, J., Price, D. L., Cleveland, D. W., Sayre, L. M., Perry, G. (2002) High molecular weight neurofilament proteins are physiological substrates of adduction by the lipid peroxidation product hydroxynonenal. J. Biol. Chem. 277, 4644-4648 81 Gonzalez-Billault, C., Engelke, M., Jimenez-Mateos, E. M., Wandosell, F., Caceres, A., Avila, J. (2002) Participation of structural microtubule-associated proteins (MAPs) in the development of neuronal polarity. J. Neurosci. Res. 67, 713-719 Guasch, A., Aloria, K., Perez, R., Avila, J., Zabala, J. C., Coll, M. (2002) Three-dimensional structure of human tubulin chaperone cofactor A. J. Mol. Biol. 318, 1139-1149 Hartzler, A. W., Zhu, X., Siedlak, S. L., Castellani, R. J., Avila, J., Perry, G., Smith, M. A. (2002) The p38 pathway is activated in Pick disease and progressive supranuclear palsy: a mechanistic link between mitogenic pathways, oxidative stress, and tau. Neurobiol. Aging 23, 855-859 Hernandez, F., Perez, M., Lucas, J. J., Avila, J. (2002) Sulfo-glycosaminoglycan content affects PHF-tau solubility and allows the identification of different types of PHFs. Brain Res. 935, 65-72 Hernandez, F., Borrell, J., Guaza, C., Avila, J., Lucas, J. J. (2002) Spatial learning deficit in transgenic mice that conditionally over-express GSK-3beta in the brain but do not form tau filaments. J. Neurochem. 83, 1529-1533 Hernandez, F., Lim, F., Lucas, J. J., Perez-Martin, C., Moreno, F., Avila, J. (2002) Transgenic mouse models with tau pathology to test therapeutic agents for Alzheimer's disease. Mini Rev. Med. Chem. 2, 51-58 Hoenicka, J., Arrasate, M., de Yebenes, J. G., Avila, J. (2002) A two-hybrid screening of human Tau protein: interactions with Alu-derived domain. Neuroreport 13, 343-349 Martin, C. P., Vazquez, J., Avila, J., Moreno, F. J. (2002) P24, a glycogen synthase kinase 3 (GSK 3) inhibitor. Biochim. Biophys. Acta 1586, 113-122 Martin-Aparicio, E., Avila, J., Lucas, J. J. (2002) Nuclear localization of N-terminal mutant huntingtin is cell cycle dependent. Eur. J. Neurosci. 16, 355-359 Moreno-Flores, M. T., Diaz-Nido, J., Wandosell, F., Avila, J. (2002) Olfactory Ensheathing Glia: Drivers of Axonal Regeneration in the Central Nervous System? J. Biomed. Biotechnol. 2, 37-43 Neurobiología Neurobiology D.2 Función de las proteínas microtubulares en neuronas Function of microtubular proteins in neurons Jefe de línea / Group Leader: Jesús Avila de Grado e-mail: [email protected] Publicaciones/Publications: Agudo, M., Trejo, J. L., Lim, F., Avila, J., Torres-Aleman, I., Diaz-Nido, J., Wandosell, F. (2002) Highly efficient and specific gene transfer to Purkinje cells in vivo using a herpes simplex virus I amplicon. Hum. Gene Ther. 13, 665-674 Alvarez, G., Munoz-Montano, J. R., Satrustegui, J., Avila, J., Bogonez, E., Diaz-Nido, J. (2002) Regulation of tau phosphorylation and protection against beta-amyloidinduced neurodegeneration by lithium. Possible implications for Alzheimer's disease. Bipolar Disord. 4, 153-165 Avila, J., Lim, F., Moreno, F., Belmonte, C., Cuello, A. C. (2002) Tau function and dysfunction in neurons: its role in neurodegenerative disorders. Mol. Neurobiol. 25, 213231 Avila, J., Lucas, J. J., Lim, F., Pérez, M., Hernández, F., Arrasate, M., Armas, R., Perry, G., Smith, M.A., Díaz Nido, J. (2001) Phosphorylation, microtubule binding and aggregation of tau in Alzheimer’s disease. In: K. Iqbal, S. S. Sisodia and B. Winblad. (eds.) Alzheimer´s Disease: Advances in Etiology, Pathogenesis and Therapeutics. John Wiley and Sons. Ltd. Ch. 55. 601-607 Bonay, P., Avila, J. (2001). Apolipoprotein E4 stimulates sulfation of glycosaminoglycans in neural cells. Biochim. Biophys. Acta 1535, 217-220 Diaz-Nido, J., Wandosell, F., Avila, J. (2002) Glycosaminoglycans and beta-amyloid, prion and tau peptides in neurodegenerative diseases. Peptides 23, 1323-1332 Gonzalez-Billault, C., Avila, J., Caceres, A. (2001). Evidence for the role of MAP1B in axon formation. Mol. Biol. Cell 12, 2087-2098 Gonzalez-Billault, C., Owen, R., Gordon-Weeks, P. R., Avila, J. (2002) Microtubule-associated protein 1B is involved in the initial stages of axonogenesis in peripheral nervous system cultured neurons. Brain Res. 943, 56-67 Gonzalez-Billault, C., Engelke, M., Jimenez-Mateos, E. M., Wandosell, F., Caceres, A., Avila, J. (2002) Participation of structural microtubule-associated proteins (MAPs) in the development of neuronal polarity. J. Neurosci. Res. 67, 713-719 Guasch, A., Aloria, K., Perez, R., Avila, J., Zabala, J. C., Coll, M. (2002) Three-dimensional structure of human tubulin chaperone cofactor A. J. Mol. Biol. 318, 1139-1149 Hartzler, A. W., Zhu, X., Siedlak, S. L., Castellani, R. J., Avila, J., Perry, G., Smith, M. A. (2002) The p38 pathway is activated in Pick disease and progressive supranuclear palsy: a mechanistic link between mitogenic pathways, oxidative stress, and tau. Neurobiol. Aging 23, 855-859 Hernandez, F., Perez, M., Lucas, J. J., Avila, J. (2002) Sulfo-glycosaminoglycan content affects PHF-tau solubility and allows the identification of different types of PHFs. Brain Res. 935, 65-72 Hernandez, F., Borrell, J., Guaza, C., Avila, J., Lucas, J. J. (2002) Spatial learning deficit in transgenic mice that conditionally over-express GSK-3beta in the brain but do not form tau filaments. J. Neurochem. 83, 1529-1533 Sustituye las publicaciones del grupo del Dr. Jesús Ávila de Grado (pag.81) Hernandez, F., Lim, F., Lucas, J. J., Perez-Martin, C., Moreno, F., Avila, J. (2002) Transgenic mouse models with tau pathology to test therapeutic agents for Alzheimer's disease. Mini Rev. Med. Chem. 2, 51-58 Hoenicka, J., Arrasate, M., de Yebenes, J. G., Avila, J. (2002) A two-hybrid screening of human Tau protein: interactions with Alu-derived domain. Neuroreport 13, 343-349 Lim, F., Hernandez, F., Lucas, J. J., Gomez-Ramos, P., Moran, M. A., Avila, J. (2001). FTDP-17 mutations in tau transgenic mice provoke lysosomal abnormalities and Tau filaments in forebrain. Mol. Cell. Neurosci. 18, 702-714 Lopez-Fanarraga, M., Avila, J., Guasch, A., Coll, M., Zabala, J. C. (2001). Review: postchaperonin tubulin folding cofactors and their role in microtubule dynamics. J. Struct. Biol. 135, 219-229 Lorio, G., Avila, J., Diaz-Nido, J. (2001). Modifications of tau protein during neuronal cell death. J. Alzheimers Dis. 3, 563575 Lucas, J. J., Hernandez, F., Gomez-Ramos, P., Moran, M. A., Hen, R., Avila, J. (2001). Decreased nuclear beta-catenin, tau hyperphosphorylation and neurodegeneration in GSK3beta conditional transgenic mice. EMBO J. 20, 27-39. Martin, C. P., Vazquez, J., Avila, J., Moreno, F. J. (2002) P24, a glycogen synthase kinase 3 (GSK 3) inhibitor. Biochim. Biophys. Acta 1586, 113-122 Martin-Aparicio, E., Avila, J., Lucas, J. J. (2002) Nuclear localization of N-terminal mutant huntingtin is cell cycle dependent. Eur. J. Neurosci. 16, 355-359 Martin-Aparicio, E., Yamamoto, A., Hernandez, F., Hen, R., Avila, J., Lucas, J. J. (2001). Proteasomal-dependent aggregate reversal and absence of cell death in a conditional mouse model of Huntington's disease. J. Neurosci. 21, 87728781. Moreno-Flores, M. T., Diaz-Nido, J., Wandosell, F., Avila, J. (2002) Olfactory Ensheathing Glia: Drivers of Axonal Regeneration in the Central Nervous System? J. Biomed. Biotechnol. 2, 37-43 Moreno-Flores, M. T., Martin-Aparicio, E., Avila, J., Diaz-Nido, J., Wandosell, F. (2002) Ephrin-B1 promotes dendrite outgrowth on cerebellar granule neurons. Mol. Cell. Neurosci. 20, 429-446 Moreno-Herrero, F., Valpuesta, J. M., Perez, M., Colchero, J., Baro, A. M., Avila, J., Montejo De Garcini, E. (2001). Characterization by atomic force microscopy and cryoelectron microscopy of tau polymers assembled in Alzheimer's disease. J. Alzheimers Dis. 3, 443-451 Perry, G., Taddeo, M. A., Nunomura, A., Zhu, X., ZentenoSavin, T., Drew, K. L., Shimohama, S., Avila, J., Castellani, R. J., Smith, M. A. (2002) Comparative biology and pathology of oxidative stress in Alzheimer and other neurodegenerative diseases: beyond damage and response. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 133, 507-513 Perry, G., Nunomura, A., Cash, A. D., Taddeo, M. A., Hirai, K., Aliev, G., Avila, J., Wataya, T., Shimohama, S., Atwood, C. S., Smith, M. A. (2002) Reactive oxygen: its sources and significance in Alzheimer disease. J. Neural. Transm. Suppl. 69-75 Perry, G., Nunomura, A., Hirai, K., Zhu, X., Prez, M., Avila, J., Castellani, R. J., Atwood, C. S., Aliev, G., Sayre, L. M., Takeda, A., Smith, M. A. (2002) Is oxidative damage the fundamental pathogenic mechanism of Alzheimer's and other neurodegenerative diseases? Free Radic. Biol. Med. 33, 1475-1479 Perez, M., Arrasate, M., Montejo De Garcini, E., Munoz, V., Avila, J. (2001). In vitro assembly of tau protein: mapping the regions involved in filament formation. Biochemistry 40, 5983-5991 Perez, M., Hernandez, F., Gomez-Ramos, A., Smith, M., Perry, G., Avila, J. (2002) Formation of aberrant phosphotau fibrillar polymers in neural cultured cells. Eur. J. Biochem. 269, 1484-1489 Perry, G., Avila, J., Espey, M. G., Wink, D. A., Atwood, C. S., Smith, M. A. (2001). Biochemistry of neurodegeneration. Science 291, 595-597 Perry, G., Nunomura, A., Avila, J., Pérez, Rottkamp, C. A., Atwood, C. S., Zhu, X., Aliev, G., Cash, A. D., Smith, M. A. (2001) Oxidative damage and antioxidant responses in Alzheimer´s disease. In: K. Iqbal, S. S. Sisodia and B. Winblad. (eds.) Alzheimer´s Disease: Advances in Etiology, Pathogenesis and Therapeutics. John Wiley and Sons. Ltd. Ch. 34. 371-377 Sadqi, M., Hernandez, F., Pan, U., Perez, M., Schaeberle, M. D., Avila, J., Munoz, V. (2002) Alpha-helix structure in Alzheimer's disease aggregates of tau-protein. Biochemistry 41, 7150-7155 Sanchez, M. P., Gonzalo, I., Avila, J., De Yebenes, J. G. (2002) Progressive supranuclear palsy and tau hyperphosphorylation in a patient with a C212Y parkin mutation. J. Alzheimers Dis. 4, 399-404 Sanchez S, Sayas CL, Lim F, Diaz-Nido J, Avila J, Wandosell F. (2001) The inhibition of phosphatidylinositol3-kinase induces neurite retraction and activates GSK3. J Neurochem. 78, 468-481 Sayas, C. L., Avila, J., Wandosell, F. (2002) Glycogen synthase kinase-3 is activated in neuronal cells by Galpha12 and Galpha13 by Rho-independent and Rhodependent mechanisms. J. Neurosci. 22, 6863-6875 Sayas, C. L., Avila, J., Wandosell, F. (2002). Regulation of neuronal cytoskeleton by lysophosphatidic acid: role of GSK-3. Biochim. Biophys. Acta 1582, 144-153 Vecino, E., Avila, J. (2001). Distribution of the phosphorylated form of microtubule associated protein 1B in the fish visual system during optic nerve regeneration. Brain Res. Bull. 56, 131-137 Wataya, T., Nunomura, A., Smith, M. A., Siedlak, S. L., Harris, P. L., Shimohama, S., Szweda, L. I., Kaminski, M. A., Avila, J., Price, D. L., Cleveland, D. W., Sayre, L. M., Perry, G. (2002) High molecular weight neurofilament proteins are physiological substrates of adduction by the lipid peroxidation product hydroxynonenal. J. Biol. Chem. 277, 4644-4648 Neurobiología Neurobiology D.3 Transducción de señales. Mecanismos de acción de neuromoduladores e implicaciones farmacológicas Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Edgardo Catalán e-mail: [email protected] Becario Predoctoral / Graduate Student: Eduardo Latorre Técnicos de Investigación / Technical Assistance: probablemente tiene lugar por mediación El objetivo principal del proyecto de investigación lo constituye el estudio de los de la activación de fosfolipasa C. Estos resultados confirman la modulación por PAF de sistemas de transducción mecanismos de transducción implicados intranuclear y la existencia de receptores en la acción de neuromoduladores, en particular endotelina (ET) y factor activante de plaquetas (PAF), así como la implicación de agentes farmacológicos específicos. Los nucleares específicos. Por otra parte, se ha demostrado que el PAF aumenta la fosforilación en tirosina de las proteínas p125FAK y p130Cas mediante la producción objetivos particulares de este proyecto han de NO en hipocampo, hecho que valida del todo su papel en la funcionalidad del sistema sido: María Victoria Mora-Gil nervioso. a) Estudio del mecanismo de acción de la ET. Los estudios llevados a cabo han confirmado que el mecanismo de acción de la ET implica la fosforilación de proteínas y la participación de mediadores lipídicos; en este sentido, se ha establecido la relación entre el neuropéptido y el sistema de esfingolípidos como otro posible mecanismo de transducción. Por otra parte, el análisis c) Estudio de la participación de mediadores lipídicos. El estudio en particular del sistema de esfingolípidos como vía de transducción implicada en la acción de neuromoduladores, ha señalado el papel de la PI3-quinasa en la translocación nuclear de la PKC c por acción de la ceramida, así como el papel de derivados como del papel de la ET en estados fisiológicos relacionados con alteraciones patológicas ha sido analizado, demostrándose cambios esfingosina-1-P en el metabolismo nuclear. en los perfiles lipídicos en vasos y cerebelo, así como un descenso en la sensibilidad a a nivel de sistemas de transducción. Se la acción de ET. acción de la ET modulando el sistema de b) Estudio del mecanismo de acción del esfingolípidos, en particular de esfingosina-1-P. d) Estudio de la barrera hematoencefálica han obtenido nuevos datos acerca de la PAF. Nuestros estudios han demostrado que el PAF, a través de sitios de unión específicos, produce un incremento de diacilglicerol en el núcleo, lo que 82 e) Estudio de sistemas de transducción mediante agentes farmacológicos. Signal transduction. Mechanisms of action of neuromodulators and pharmacological implications Publicaciones/Publications: Research summary The main goal of this project is to study the biochemical mechanisms at the transduction level involved in the action of neuromodulators, in particular endothelin (ET) and platelet activating factor (PAF) and the involvement of new pharmacological agents. In this regard, the particular objectives are: The changes are due to the activation of the phospholipase C. These data confirm a modulation by PAF of intranuclear signal Miguel, B.G., Calcerrada, M.C., Martín, L., Catalán, R.E., transduction and the existence of specific nuclear PAF receptors. On the other hand, rat liver nuclei. Prostag. Other Lipid Mediat. 65, 159-166 PAF causes an increase on the tyrosine phosphorylation of two phosphoproteins which were identified as the focal adhesion Miguel, B.G., Calcerrada, M.C., Catalán, R.E., Martínez, Martínez , A.M. (2001) Increase of phosphoinositide hydrolysis and diacylglycerol production by PAF in isolated A.M. (2001) Sphingolipid derivatives modulate intracellular Ca2+ in rat synaptosomes. Acta Neurobiol. Exp. 61, 113- kinase p125FAK and p130Cas. PAF 117 increased the tyrosine phosphorylation by the production of NO in hippocampus, Calcerrada, M.C., Catalán, R.E., Martínez, A.M. (2002) a) Study of the mechanism of action of ET. Our studies have confirmed that the mechanism of action of ET involves the protein phosphorylation and some lipid mediators; in this regard, the relationship suggesting that PAF may play role in the functioning of the nervous system. between the neuropeptide and the sphingolipid system has been established. On the other hand, the role of ET in some transduction system has indicated the involvement of PI3-kinase in the nuclear PKC c translocation after ceramide Fernández, I., Delgado, J., Catalán, R.E., Megías, A. physiological conditions related to physiopathological states has been treatment as well as a role of sphingosine- rats. Lipids 37, 43-52 PAF-stimulated protein tyrosine phosphorylation in hippocampus: involvement of NO synthase. Neurochem. Res. 27, 313-318 c) Study of the involvement of lipid mediators. The study of the sphingolipid Latorre, E., Morán, M., Aragonés, M.D., Saborido, A., (2002) Exercise training-induced changes in sensitivity to endothelin-1 and aortic and cerebellum lipid profile in 1-P on the nuclear metabolism. analyzed and changes in both vascular Calcerrada, M.C., Miguel, B.G., Martín, L., Catalán, R.E., and cerebellar lipid profiles and a decrease sensitivity to ET action have d) Functioning of the blood-brain barrier mainly at the transduction level. New data Martínez, A.M. (2002) Involvement of phosphatidylinositol- been observed. about the modulation of sphingolipids, in induced by C2-ceramide in rat hetapocytes. FEBS Letters particular sphingosine-1-P, by ET have 514, 361-365 b) Study of the mechanism of action of been observed. PAF. We have demonstrated that PAF increases diacylglycerol in the nuclei e) Modulation of the transduction systems through specific nuclear PAF-binding sites. by pharmacological agents 83 3-kinase in nuclear translocation of protein kinase C c_ Neurobiología Neurobiology D.4 Bases moleculares de la plasticidad neuronal Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: F. Javier Díez Guerra e-mail: [email protected] en el contexto de la señalización intracelular Las proteínas de la familia GMC (GAP-43, Neurogranina, MARCKS, MacMARCKS y CAP-23) comparten, entre otras Postdoctoral / Postdoctoral Fellow: Noa Martín Cófreces Becarios Predoctorales / Graduate Students: Técnico de Investigación / Technical Assistance: Carmen Granda Vega relacionada con el dinamismo del citoesqueleto de actina, la aparición de lamelipodios y filopodios, la polarización, características, una estructura filamentosa, su interacción con calmodulina y fosfolípidos la adhesión y la motilidad celular. y una expresión elevada en tejido nervioso de mamíferos, especialmente en las primeras etapas del desarrollo. Utilizamos técnicas convencionales de mutagénesis dirigida y fusión con proteínas fluorescentes que nos permiten analizar la Su funcionalidad se relaciona con el dinamismo morfológico y la motilidad neuronal, ambos procesos fundamentales en el marco de la plasticidad neuronal y relevancia funcional de dominios estructurales y sitios de fosforilación o acilación en proteínas GMC, realizar seguimientos “in vivo” de su traslocación entre compartimentos subcelulares y Patricia Molina Ortiz Irene Domínguez González proteínas y/o lípidos. Este estudio se realiza reorganización sináptica típicas del desarrollo. El trabajo de nuestro grupo de investigación se orienta hacia el esclarecimiento de los mecanismos de acción de estas proteínas en el ámbito molecular y celular, y su estudio como “dianas moleculares” en el desarrollo de agentes activos para la regeneración neuronal y la prevención de neurodegeneración. analizar “in situ” su interacción con otras proteínas mediante técnicas de microscopía de transferencia resonante de fluorescencia (FRET). Nuestro interés en conocer el modo de acción de las proteínas GMC se fundamenta en su potencial como “dianas moleculares” para modular localmente la plasticidad neuronal. Este conocimiento contribuirá al diseño de nuevos agentes farmacológicos con acción Para ello, estudiamos la expresión, localización subcelular y modificaciones post-traduccionales de las proteínas GMC, así como sus interacciones con otras Célula Swiss-3T3 tratada (90 min) con el péptido Ant-IQ(Nrg) biotinilado y visualizado con estreptavidina-TxRed. Observar la afinidad del péptido por vesículas endocíticas. 84 sobre la regeneración neuronal post-lesión acoplada a recuperación funcional y la prevención de neurodegeneración masiva asociada con episodios epilépticos. Molecular basis of neuronal plasticity Publicaciones/Publications: Research summary GMC proteins (GAP-43, Neurogranin, MARCKS, MacMARCKS and CAP-23) signal transduction and actin cytoskeleton dynamics, lamelipodia and filopodia Sánchez, C., Arellano, J.I., Rodríguez-Sánchez, P., Avila, formation, and cellular polarity, adhesion and motility. associated protein 2 phosphorylation is decreased in share, among other features, an elongated structure, their ability to interact with calmodulin and phospholipids and their high expression in mammalian nervous tissue, particularly during the earlier stages of development. Their functionality is associated with cellular morphology dynamics and also cellular motility, both of them fundamental processes central to neuronal plasticity and synaptic reorganization during potential sites for phosphorylation or acylation, carry out time-lapsed “in vivo” imaging demonstrating their translocation among subcellular compartments and “in situ” analyze their interaction with other proteins using fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy. and cellular level, and their potential use mode of action of GMC proteins is backed by their potential as appropriate “molecular treatments designed to enhance neuronal regeneration and prevent neurodegeneration. the human epileptic temporal lobe cortex. Neuroscience 107, 25-33 We use conventional site-directed mutagenesis and generation of fusion quimeras with fluorescent proteins to study the functional relevance of structural domains of GMC proteins and their development. Our research group focuses its work on the understanding of the GMC proteins mode of action at the molecular as “molecular targets” of new agents and J., DeFelipe, J., Díez-Guerra, F:J. (2001) Microtubule- Our interest in disclosing the molecular targets” to modulate neuronal plasticity locally. This would help to design new pharmacological agents with specific Thus, we currently study GMC proteins expression, subcellular localization, post- action on post-lesion neuronal regeneration and functional recovery and the prevention of massive translational modifications and interactions neurodegeneration associated to epileptic with other proteins or lipids. This study is carried out in the context of intracellular episodes. Experimento de seguimiento “in vivo” de la adhesión y extensión sobre sustrato de células Swiss-3T3 transfectadas con GAP-43-GFP. Se observan dos células una transfectada y otra no. La primera ralentiza su extensión sobre el sustrato al tiempo que extiende gran cantidad de filopodios. 85 Paglini, G., Peris, L., Díez-Guerra, F.J., Quiroga, S. Cáceres, A. (2001) The cdk5-p35 kinase associates with the Golgi apparatus and regulates membrane traffic. EMBO Rep. 2, 1139-1144 Tesis Doctorales / Doctoral Theses Noa Beatriz Martín Cófreces. 2002. “Fisiología Molecular de GAP-43: una proteína implicada en guía y extensión axonal”. Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias. Neurobiología Neurobiology D.5 Regulación de la expresión génica en enfermedades neurogegenerativas Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: no-canónica del tipo E-box. e-mail: [email protected] El interés del grupo se centra, en primer lugar, en el estudio de los mecanismos que regulan la expresión de la apolipoproteína Personal Científico / Scientific Staff: E en células nerviosas. Cecilio Giménez promotor, la cual contiene una secuencia Francisco Zafra El segundo objetivo del grupo sigue siendo el estudio de la sinápsis glicinérgica, centrado en la relación estructura función y regulación de los transportadores de ApoE, además de jugar un papel importante en el metabolismo de las lipoproteínas plasmáticas, está involucrada en procesos glicina GLYT1 y GLYT2 de células nerviosas. mantener bajos niveles de glicina en el espacio sináptico regulando así la actividad de la neurotransmisión glicinérgica. Estudiantes / de mantenimiento y reparación de células nerviosas. ApoE4, una de las isoformas de la proteína, es un factor de riesgo importante para la enfermedad de Alzheimer tardía. Aunque es conocido el hecho de que se Undergraduate Students: producen cambios en la producción de Vanesa de Mingo desórdenes neuromusculares y en algún tipo de esquizofrenia. Technical Assistance: ApoE en respuesta a lesiones degenerativas en zonas como el hipocampo, o en respuesta a mediadores inflamatorios, los mecanismos de regulación del gen que Enrique Núñez codifica esta proteína son bastante En este periodo hemos estudiado la distribución subcelular de las isoformas de GLYT1 y de GLYT2 en células polarizadas desconocidos. MDCK y en neuronas de hipocampo. Becarios Predoctorales / Graduate Students: Irene Poyatos Enrique Salero Beatríz Cubelos Inma González Técnico de Investigación / Estas proteínas son las responsables de Alteraciones en la actividad de GLYT1 y de GLYT2 pueden estar involucradas en Mediante mutagénesis dirigida hemos Nuestro grupo ha demostrado que los factores de transcripción AP-2, Zic1 y Zic2 se unen y transactivan al promotor del gen de ApoE en células de glia. Más recientemente hemos demostrado que el factor de transcripción USF 1, perteneciente a la familia de proteínas bHLH con cremallera de leucina, activa al promotor de ApoE uniéndose a la región URE3 del Distribución regional de los transportadores GLYT1 (verde) y v-GLUT (rojo) en el área CA3 en hipocampo de cerebro de rata. Regional distribution of GLYT1 (green) and v-GLUT (red) transporters in the CA3 of rat brain hippocampus. 86 identificado señales de localización basolateral y/o apical en los extremos amino y carboxilo de GLYT1. Por otro lado, hemos demostrado que los sitios de glicosilación de GLYT2 son responsables de su localización apical en células polarizadas. Regulation of the gene expression in neurodegenerative diseases Research summary The main interest of the group is, firstly, focussed in the study of the regulatory mechanisms involved in the expression of the apolipoprotein E by nerve cells. ApoE, apart of playing a key role in the metabolism of plasma lipoproteins, has been demonstrated to be involved in neuronal maintenance and repair. ApoE4, one of the four existing isoforms of the protein, is an important risk factor for late-onset Alzheimer´s disease. Although has been demonstrated changes Publicaciones/Publications: into the regulatory element URE3 to a Salero, E., Pérez-Sen, R., Aruga, J., Giménez, C., Zafra, region which contains a functional noncanonical E-box motif. F. (2001) Transcription factors Zic1 and Zic2 bind and transactivate the apolipoprotein E gene promoter. J. Biol. Chem. 276, 1881-1888 The second objective of the group is the study of the glycinergic synapse, focused on the structure-function and the Martínez-Maza, R., Poyatos, I., López-Corcuera, B., Núñez, E., Giménez, C., Zafra, F., Aragón, C. (2001) The regulation of the glycine transporters GLYT1 and GLYT2 from nerve cells. These role of N-glycosylation in transport to the plasma proteins are responsible to maintain low levels of glycine in the synaptic cleft during glycine-mediated neurotransmission. Dysfunctions of the activity of GLYT1 or GLYT2 could underlay to some GLYT2. J. Biol. Chem. 276, 2168-2173 musculoskeletical disorders or to some 746-750 membrane and sorting of the neuronal glycine transporter Zafra, F., Giménez, C. (2001) Molecular determinants involved in the asymmetrical distribution of glycine transporters in polarised cells. Biochem. Soc. Trans. 29, in ApoE production in response to types or schizophrenia. neurodegenerative insults in the hippocampus, or in responds to inflammatory mediators, the regulation of the gene encoding for this protein remains During this period we have studied the asymmetrical subcellular distribution of of a non-canonical E-box motif as a regulatory element the GLYT1 isoforms, and of GLYT2 in gene. Biochem. J. 20021142 polarised MDCK cells and in neurons from the hippocampus. Tesis Doctorales / Doctoral Thesis largely unknown. Salero, E., Giménez, C., Zafra, F. (2002) Identification Previous studies of our group By using site directed mutagenesis we demonstrated that transcription factors AP-2, Zic1 and Zic2 bind and transactivate have been able to identify signals for basolateral/somatodendritic localisation the apolipoprotein E gene promoter in in the amino and carboxyl tail of GLYT1. glioblastoma cells. More recently, we have identified transcription factor USF 1, a protein that belongs to the bHLH family Moreover, we have shown the N- which also contains a leucine zipper, activates the apoE promoter by binding glycosylation sites of GLYT2 are involved in the apical localisation of this protein in polarised cells. 87 in the proximal promoter region of the apolipoprotein E Enrique Salero. 2001. “Identificación de los factores Zic1, Zic2 y USF como reguladores transcripcionales del gen de la apolipoproteína E”. Universidad Autónoma de Madrid. Neurobiología Neurobiology D.6 Bases moleculares de la adaptación al ejercicio y de la plasticidad muscular Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Rafael Manso e-mail: [email protected] Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Beatriz González Alonso Pilar Negredo Madrigal María Jesús Pérez Lorenzo El interés científico general del laboratorio se ha dirigido a la caracterización de señales y rutas de transducción que median cambios adaptativos inducidos por el ejercicio. Se ha estudiado la implicación de las HSPs en la respuesta hepática al ejercicio ya que su expresión incrementada permite entender como se puede conseguir tolerancia a ejercicio más intenso y a otras situaciones de estrés celular, al mismo tiempo. Utilizando como modelo la rata ejercitada en tapiz rodante se puso de manifiesto una peso molecular HSP25 en la respuesta hepática al ejercicio. Se han cubierto aspectos relativos a las cinéticas de inducción de la proteína y del mRNA, así como a la modificación post-traduccional asociada a la respuesta en diversas etapas del post-ejercicio Un segundo aspecto de interés investigador se refirió a la caracterización de la diversidad molecular de las cadenas ligeras reguladoras de la miosina (rMLCs) en el músculo estriado de mamífero. Se han analizando los patrones de variantes en respuesta compleja tras un golpe agudo de ejercicio que se inició con la inducción temprana, bajo control transcripcional, de diversas HSPs. A ésta siguió una acumulación transitoria de HSP72, que es músculo esquelético rápido y lento y en aurícula y ventrículo de diversas especies, el antecedente de al menos otras dos ondas contracción-relajación muscular de acumulación en el post-ejercicio tardío estableciendo una posible correlación entre que tuvieron lugar en ausencia de niveles detectables del mensajero. Se ha estudiado el papel del estrés oxidativo como señal ellas y las isoformas conocidas de las cadenas pesadas de miosina. Se han utilizado aproximaciones de proteómica inductora de la respuesta hepática de las para caracterizar los mecanismos HSPs tras el ejercicio. La correlación directa entre los niveles de HSP72 acumulada durante el post-ejercicio temprano y los de moleculares responsables de la generación de variantes y se han analizado las TBARS conjugadas, puso de manifiesto la existencia de un mecanismo muy sensible para ajustar la amplitud de esta respuesta para entender el papel que las diferentes isoformas de las rMLCs y sus estados fosforilados pueden tener en el ciclo de transiciones que tienen lugar durante la remodelación de fibras rápidas a lentas que se induce por estimulación eléctrica de baja frecuencia. en función del estrés oxidativo. Un tercer aspecto de interés investigador Se han identificado variantes de carga de las HSP70 citosólicas en el hígado. Para entender su relevancia para la actividad biológica o estabilización de niveles incrementados, se ha estudiado su presencia y abundancia relativa durante el periodo temprano y en los picos de las se refiere a la influencia de factores neurales y hormonales en la expresión de proteínas contráctiles y de estrés en músculo esquelético. Para ello se han utilizado modelos animales de ratas ejercitadas, ondas de acumulación de HSP72 en el post-ejercicio tardío. Se ha realizado también cordotomizadas y estimuladas eléctricamente a través del nervio y, en colaboración con el Departamento de Cirugía Ortopédica, modelos de lesión del un estudio paralelo para caracterizar la ligamento cruzado anterior en gato. implicación de la proteína de estrés de bajo Diversidad molecular de las cadenas ligeras reguladoras de miosina en músculo esquelético de rata y cambios en su expresión durante el remodelado del músculo rápido EDL inducido por estimulación eléctrica crónica de baja frecuencia (s, f, isoformas lenta y rápida; E1, 7, 21, 30, días de estimulación eléctrica del EDL) 88 Molecular bases of the adaptation to exercise and of skeletal muscle plasticity Research summary The overall research interest of the laboratory concerned the characterization of signals and transduction pathways involved in adaptive changes in response to exercise. The increased expression of heat-shock proteins (HSPs) provides a conceptual framework to understand how exercise could increase tolerance to physical activity of growing intensity and to a variety of other stressors at the same time. To get a better understanding of whole organism adaptation to chronic exercise one of the research aims was to characterize the involvement of HSPs in understand the role of the small heatshock protein HSP25 in the hepatic exercise response. This study covered induction kinetics of synthesis and González, B., Negredo, P., Hernando, R., Manso, R. accumulation of protein and mRNA during Eur. J. Physiol. 443, 377-386 early and late post-exercise, as well as post-translational modifications associated with the exercise response. Tesis Doctorales / Doctoral Theses A second area of interest was the characterization of the molecular diversity of the regulatory myosin light chains (rMLCs) in mammalian striated muscle. A comparative study of two-dimensional patterns of rMLCs in fast and slow skeletal single exercise bout was observed. It was muscle types an in atrium and ventricle of different mammals was performed to understand the role of the different rMLCs and of their phosphorylated products in the contraction-relaxation cycle of skeletal initiated by an early, transcriptionally- muscle and to establish a possible controlled induction of the synthesis and accumulation of HSP70s and other HSPs, followed by at least two further waves of correlation between them and the known isoforms of the myosin heavy chains. The molecular mechanism involved in HSP72 accumulation that took place over generating the diversity of variants of the next 48 h in the absence of detectable levels of mRNA. The role of oxidative stress as the initiating signal of this rMLCs, considering the possibility of multiple phosphorylation, was investigated the hepatic exercise response. Using treadmill-exercised rats as a model a complex hepatic response of HSPs to a response was also investigated. The positive correlation between levels or protein-bound TBARS and accumulated HSP72 during the early post-exercise period (in the absence of statistically significant increases in either free or using a proteomic approach. The relevance of rMLC variants in defining muscle contractile properties was investigated following their transitions during fast-twitch muscle remodelling induced by low-frequency electrical stimulation. protein-bound TBARS), indicated the existence a sensitive mechanism capable of adjusting the amplitude of the stressresponse to exercise according to perceived oxidative stress. Cytosolic HSP70s displayed isoelectric point variants in the liver. The relevance of these variants for biological activity or stabilization of increased HSP70-levels was studied by analysing their presence and relative abundance in the liver in the Publicaciones/Publications: A third research interest was aimed at understanding the implication of neural and hormonal activity in defining the expression of contractile and stress proteins in skeletal muscle. Models of exercise, spinal cord transection and electrical stimulation in rats and a model of lesions of the anterior cruciate ligament (in collaboration with the Department of Orthopaedic Surgery) have been used. peaks of the HSP72 accumulation waves during early and late post-exercise. A parallel study was performed to Molecular diversity of myosin regulatory light chains in rat skeletal muscle and changes in their expression levels during remodelling of the fast-twitch EDL muscle induced by low-frequency electrical stimulation (s, f, slow and fast isoforms; E1, 7, 21, 30, days of electrical stimulation of EDL muscle) 89 (2002) Protein variants of skeletal muscle regulatory myosin light chains: prevalence in mammals, generation and transitions during muscle remodelling. Pflügers Arch- Beatriz González Alonso. 2002. “Inducción y estabilización de los niveles de expresión de proteínas de estrés en el hígado en respuesta al ejercicio agudo y crónico”. Universidad Autónoma de Madrid. Neurobiología Neurobiology D.7 Biología de células troncales neurales humanas. Potencial para reposición celular y terapia génica en neurodegeneración Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Alberto Martínez Serrano e-mail: [email protected] Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Ana Villa 2. Potencial para reposición celular en el cerebro dañado. La actividad de nuestro grupo se centra en: i) el estudio de la biología básica de células neurales troncales (preferentemente de origen humano), y ii) el estudio de su potencial para el desarrollo de estrategias En esta línea de trabajo estamos caracterizando cuál es el potencial de supervivencia, integración, migración y diferenciación de lineas de células neurales de reposición celular (neuronal y glial) y de transferencia génica en situaciones de neurodegeneración. troncales humanas, una vez transplantadas al cerebro adulto, principalmente en estriado 1. Biología básica de células troncales neurales de origen humano. 3. Desarrollo de nuevas estrategias de Utilizando células neurales troncales Florian Mayrhofer Nuestro trabajo se centra en parte en el desarrollo de métodos de expansión y perpetuación de estas células, cuyo Técnicos de Investigación / crecimiento en cultivo es muy lento y está limitado, de forma similar a lo que ocurre Technical Assistance: con otras células humanas mortales. En cabo knock-in, y así, mediante recombinación homóloga, modificar genéticamente estas células de la mejor Inmaculada Ocaña años anteriores hemos desarrollado Isabel Liste Milagros Ramos Becarios Predoctorales / Graduate Students: Francisco Javier Rubio y sustancia negra. transferencia génica. Carlos Bueno Beatriz Navarro Matthew Sledenbroek herramientas genéticas para la perpetuación de estas células. En previsión de la necesidad de retirar los genes humanas, estamos desarrollando los procedimientos necesarios para llevar a manera hoy en día posible. En teoría, esta estrategia nos permitirá llevar a cabo transferencia génica al cerebro adulto de inmortalizadores de las células, para su forma controlada, eficiente y completamente segura, por un tiempo ilimitado, y también potencial uso en el ser humano, estamos ya utilizando construcciones donde éstos ofrece la posibilidad de regulación fisiológica de los transgenes. están flanqueados por sitios loxP. Además, tenemos interés en determinar el potencial de diferenciación a linajes neurales de estas líneas celulares, in vitro e in vivo, y los factores epigenéticos y genéticos que controlan estas decisiones. Neuronas dopaminérgicas humanas (aquéllas que degeneran en la enfermedad de Parkinson), generadas a partir de una línea establecida de progenitores humanos de mesencéfalo ventral. Human dopaminergic neurons (those that degenerate in Parkinson’s disease), generated from a established cell line of neuronal progenitors of ventral mesencephalic origin. 90 Biology of human neural stem cells. Potential for gene therapy in neurodegeneration Research summary Our research is focused in the study of: i) the basic biology of neural stem cells (preferably of human origin), and ii) their potential for therapeutic intervention in human neurodegenerative conditions, in cell replacement or gene therapy 2. Cell replacement potential in the damaged brain. Publicaciones/Publications: Villa, A., Rubio, J.F., Navarrro B, Bueno, C., MartínezSerrano, A. (2001) Human neural stem cells in vitro. A focus on their isolation and perpetuation. Biomed. In this line of work we are characterizing Pharmacother. 55, 1-5 the survival, integration, migration and differentiation properties of human neural stem cell lines, once grafted to the adult Martínez-Serrano, A., Rubio, F.J., Navarro, B., Bueno, Cells: In vitro and in vivo properties, and potential for modalities. mammalian brain, mainly in the striatum and substantia nigra. 1. Basic biology of human neural stem cells. 3. Development of new gene therapy strategies. Our work is focused on the development Using human neural stem cell lines, we Lenzlinger, P.M., Sinson, G., Grady, M.S., McIntosh, T.K. of expansion and perpetuation procedures for these cells, which normally grow very are developing knock-in procedures (based on homologous recombination), on the assumption that this is the best available way of genetically modifying (2001) Neuroprotective and behavioral efficacy of nerve C., Villa, A. (2001) Human Neural Stem and Progenitor gene therapy and cell replacement in the CNS. Curr. Gene Ther. 1, 279-299 Philips, M.F., Mattiasson, G., Wieloch, T., Bjorklund, A., Johansson, B.B., Tomasevic, G., Martinez-Serrano, A., slowly and for a limited time, since we are dealing with cells with mortal properties. As a result of previous work, we have developed genetic tools for the perpetuation of these cells. Since the presence of an oncogene or protooncogene in the cells might hamper or limit their use in the clinical setting (even when the cells are not transformed, just cells nowadays. In principle, this strategy will allow for ex vivo gene transfer to the adult mammalian brain in a controlled, efficient and safe manner, and for unlimited time. It will also provide means growth factor-transfected hippocampal progenitor cell transplants after experimental traumatic brain injury. J Neurosurg. 94, 765-774 Martínez-Serrano, A. (2002) Células troncales neurales de origen humano: Investigación básica, aplicada, y perspectivas terapéuticas para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. En “Etica y clonación: for the physiological control of transgene Realidades y exageraciones”. Fundación Valenciana de expression. Estudios Avanzados established), we have already developed lines in which the perpetuating gene is floxed (flanked by loxP sites for site Villa, A., Navarro, B., Martinez-Serrano, A. (2002) Genetic specific recombination), to allow for its cells (HNSCs): cellular properties and therapeutic removal before transplantation of the cells. potential. Brain Res. Bull. 57, 789-794 In addition, we have the interest to determine the differentiation potential of Villa, A., Martinez-Serrano, A. (2002) Strategies for the these immortal neural stem cells towards different neural lineages, both in vitro and be used in the clinics: Scientific and bio-ethic implications. perpetuation of in vitro expanded human neural stem generation of human dopaminergic neurons that could J. Int. Soc. Bioethics (SIBI) 8, 71-82 in vivo, as well as to explore the role of epigenetic and genetic factors influencing cell fate decisions. Rueda, D., Navarro, B., Martínez-Serrano, A., Guzmán, M., Galve-Roperh, I. (2002) The endocannabinoid anandamide inhibits neuronal development through attenuation of the Erk pathway. J. Biol. Chem. 277, 4664546650 Astroglia (GFAP, verde) y neuronas (-III-tubulina, rojo) humanas diferenciadas a partir de una línea de células troncales neurales humanas. Human astroglia (GFAP stain, green) and neurons (-III-tubulin stain, red) differentiated from a cell line of human neural stem cells. 91 Neurobiología Neurobiology D.8 Mecanismos de señalización y regulación de receptores acoplados a proteínas G Resumen de Investigación Los receptores acoplados a proteínas G inflamatorios como la artritis reumatoide. Sin embargo, no se conoce en detalle cómo esos cambios alteran la señalización por (GPCR) median las acciones de diversos mensajeros que desempeñan un papel esencial en la función del sistema GPCRs y contribuyen al desencadenamiento y/o progresión de estas patologías, lo que podría ser de gran interés para identificar nuevas estrategias Catalina Ribas cardiovascular o del sistema inmune. Además de con proteínas G heterotriméricas, los GPCR activados Petronila Penela interaccionan con quinasas de receptores Jefe de Línea / Group Leader: Federico Mayor, jr. e-mail: [email protected] Personal Científico / Scientific Staff: Ana Ruiz-Gómez Cristina Murga Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Esperanza Morato Becarios Predoctorales / Graduate Students: diagnósticas y terapéuticas. En este contexto, nuestro grupo se plantea los siguientes objetivos generales: a) acoplados a proteínas G (GRKs) y con las proteínas moduladoras denominadas arrestinas. Estas dos familias de proteínas profundizar en los mecanismos de control desempeñan un papel clave en la rápida descritos en situaciones patológicas; b) contribuir a definir el conjunto de modulación de la funcionalidad y la dinámica intracelular de receptores tras la activación de la función, expresión y estabilidad de GRKs y su relación con los cambios interacciones e interconexiones funcionales Ana Elorza por ligandos, así como permiten el reclutamiento y regulación de otras M. Carmen Jiménez proteínas celulares, iniciando nuevas vías Sandra Peregrín de señalización, por lo que son tanto moduladores como componentes esenciales de la transducción de señales arrestinas sobre vías de señalización y mediada por GPCR. Los niveles y de quimioquinas. Finalmente, nuestro grupo funcionalidad de algunas GRKs están colabora con otros laboratorios del Centro alteradas en situaciones patológicas como en el estudio de la relación entre sistemas el fallo cardiaco congestivo, la hipertrofia cardiaca, la hipertensión o procesos de señalización y la enfermedad de Susana Sarnago Antonio Sobrado Alicia Salcedo Carlota García-Hoz Estudiantes / Undergraduate Students Helena Holguín Técnico de Investigación / Technical Assistance: Ana Molina Consecuencias funcionales de la fosforilación de GRK2 por la tirosina quinasa c-Src Functional consequences of GRK2 phosphorylation by c-Src 92 (“interactoma”) de las GRKs y c) estudiar el efecto de cambios en la expresión/funcionalidad de GRKs y procesos celulares modulados por GPCR del sistema cardiovascular o por receptores Alzheimer. G protein-coupled receptors signaling and regulatory mechanisms Research summary Publicaciones/Publications: known in detail how these changes alter GPCR signal transduction and contribute to the ethiology and/or progression of Penela, P., Elorza, A., Sarnago, S., Mayor, jr., F. (2001) these diseases. This would be relevant for the identification of new diagnostic and therapeutic strategies. In this context, Penela, P., Barradas, M., Alvarez-Dolado, M., Muñoz, functions. Activation of GPCR leads to its interaction with at least two kinds of proteins: heterotrimeric G proteins and the main objectives of our group are: a) levels in rat liver, lung and heart. Endocrinology 142, GRKs (G protein-coupled receptor degradation of GRKs and their relevance in promoting changes in their levels in different pathological conditions; b) to investigación biomédica. En: Investigación y Siglo XXI. contribute to identify the network of functional conexions and interactions of GRKs with other cellular proteins (the Mayor, F., (2001) Genética molecular de la enfermedad GRKs “interactome”); and c) to investigate editores). Masson, Barcelona, pp. 105-110 proteins, thus triggering new signaling pathways. Therefore, GRKs and arrestins the effect of changes in the expression/functionality of GRKs and Ribas, C., Takesono, A., Sato, M., Hildebrandt, J.D, can be considered as both regulators and arrestins on key signal transduction of the heterotrimeric G-proteins Gi/Go by the NG108-15 key components of GPCR signal transduction pathways. Alterations in the levels and functionality of GRKs have pathways and cellular functions mediated by cardiac GPCR or chemokine receptors. G-protein activator. J Biol Chem. 277, 50223-50225 Murga, C., Zohar, M., Teramoto, H., Gutkind, J.S.. (2002) Finally, our group collaborates with other Rac1 and RhoG promote cell survival by the activation been related to congestive heart failure, cardiac hypertrophy or hypertension, and to inflammatory processes such as laboratories of this Center in the study of relationships between signalling cascades of PI3K and Akt, independently of their ability to stimulate and Alzheimer’s disease. Ribas, C., Sato, M., Hildebrandt, J.D., Lanier, S.M. (2002) G protein-coupled receptors (GPCR) mediate the actions of a variety of messengers that are key regulators of cardiovascular or immune system kinases), which in turn promote the binding of arrestins. GRKs and arrestins play different important roles: they uncouple GPCR from G proteins, promote GPCR internalization and recycling; and allow the recruitment of other cellular to better understand the mechanisms governing function, expression and rheumatoid arthritis. However, it is not ß-arrestin and c-Src-dependent degradation of G-proteincoupled receptor kinase 2. EMBO J. 20, 5129-5138 A., Mayor, jr., F. (2001) Effect of hypothyroidism on G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) expression 987-991 Mayor, F., (2001) La Biología Molecular y los retos de la Fundación José Casares Gil. Real Academia de Farmacia, pp. 95-118 de Alzheimer. En: Alzheimer XXI: Ciencia y Sociedad (J.M. Martínez-Lage, Z.S. Khachaturian, J.J. Artells, F. Guillén, J.J. López-Ibor, F. Mayor, jr y J.M. Segovia, Lanier, S.M. (2002) Pertussis toxin-insensitive activation JNK and NF-kappaB" Oncogene. 21, 207-216 Analysis of signal transfer from receptor to Go/Gi in different membrane environments and receptorindependent activators of brain G protein. Methods Enzymol. 344, 140-152 Murga, C., Barber, D.F. (2002) Molecular mechanisms of pre-T cell receptor-induced survival J Biol Chem 277, 39156-39162 Mayor, F., Rodes, J., (2002) La investigación biomedica básica y clínica en España. En: Reflexiones sobre la Ciencia en España. El caso particular de la Biomedicina (J.A. Gutiérrez-Fuentes y J.L. Puerta López-Cózar, eds) Medicina Stm. Editores, Barcelona, pp. 225-244 Lombardi, M.S., Kavelaars, A., Penela, P., Scholtens, EJ., Roccio, M., Schmidt, R.E., Schedlowski, M., Mayor, Jr., F. & Heijnen, C.J. (2002) Oxidative stress decreases G protein-coupled receptor kinase 2 in lymphocytes via a calpain-dependent mechanism” Mol. Pharmacol. 62, 379-388 Tesis Doctorales / Doctoral Theses Susana Sarnago Cebada. 2001. “Mecanismos de regulación de la quinasa de receptores acoplados a proteínas G GRK2”. Ana Elorza Moreno. 2001. “Degradación de la quinasa de receptores acoplados a proteínas G, GRK2: un nuevo Modelo para la activación y translocación a la membrana de GRK2 mecanismo de la regulación de su función”. Proposed model for GRK2 activation and membrane translocation. In the absence of modulators, an equilibrium would exist between the active “open” (B) and inactive “closed” (A) conformation. It would be displaced towards the inactive conformation through stabilization by intramolecular interactions involving N- and C-terminal domains of GRK2. C.- In vitro, the substitution of such interactions by the addition of kinase fragments would allow the disruption of the constrained conformation and favor a more active state of GRK2. A similar mechanism would explain the in vitro effects on GRK2 activity of modulators (G `a subunits, phospholipids, receptor domains) able to bind to N- and C-terminal domains of GRK2. D.- In vivo the concerted interaction of such intracellular ligands with different GRK2 domains would simultaneously lead to the disruption of the inhibitory intramolecular associations and to the targeting of GRK2 to the plasma membrane, where the RGS domain would also be free to interact with G_q subunits. PIP2, Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate; ßa, G protein ßa subunits; circled P, putative GRK2 phosphorylation sites in the receptor. Maria del Carmen Jiménez Sainz. 2001. “Mecanismos de señalización y regulación de receptores de quimioquinas”. Otras Actividades / Other Activities Federico Mayor: Miembro del Consejo Asesor de Sanidad / Member of the Advisory Board of the Minister of Health (2001- ). Miembro del Consejo de Dirección de la Fundación Española para la Ciencia y la Tecnología (FECYT) / Member of the Executive Board of the Spanish Foundation 93 for Science and Technology (2001- ). Neurobiología Neurobiology D.9 Neurotransmisión y desarrollo Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Galo Ramírez Interacción de los nucleótidos de una hipótesis sobre los cambios conformacionales que acompañan a la interacción agonista/receptor y la guanina con los receptores ionotrópicos de glutamato consiguiente generación de un poro/canal iónico asociada a una perturbación específica del residuo Glu209 (1). A Los objetivos de esta nueva etapa del proyecto se centran en el diseño, mediante modelización molecular, la síntesis y el continuación, hemos analizado, con la Jesús Mendieta Científicos Visitantes/ ensayo biológico de una nueva línea de convencionales, como el DNQX, y el propio GMP. A diferencia del primero, que impide el cambio conformacional que tiende a e-mail: [email protected] Personal Científico / Scientific Staff: Ana Barat Visiting Scientists: Marcos Frizzo Cintia Roehrig Universidad Federal de Río Grande del antagonistas de glutamato que interaccionarían con los iGluRs de la misma forma que lo hace el GMP. Sur, Brasil. La primera etapa, el diseño, necesitaba Técnicos de Investigación / Technical Assistance: José Luis García-Mira previamente de la validación de un modelo estructural de receptor ionotrópico de glutamato basado en datos cristalográficos, en lugar de los modelos derivados de las conocidas analogías entre estos receptores y las proteínas periplásmicas bacterianas (implicadas en el transporte de aminoácidos) y de los datos de mutagénesis dirigida. Partiendo del modelo reducido de Gouaux y colaboradores, hemos estudiado, mediante técnicas de dinámica molecular misma metodología, la interacción con el receptor de antagonistas competitivos cerrar los segmentos S1 y S2 del receptor sobre los agonistas, el GMP permite ese cierre pero no activa el receptor (no se genera el canal iónico) al no interaccionar el GMP con el residuo Glu209, actuando pues como un falso agonista, lo que explica su antagonismo funcional y su carácter neuroprotector/antiexcitotóxico (enviado para publicación). Finalmente hemos continuado nuestra exploración de los efectos moduladores de otros derivados purínicos de la guanina en ordenador, la interacción del glutamato sobre la captación neuronal y glial del glutamato (2), y los estudios sobre la y del kainato con el sitio activo del receptor GluR2 de AMPA/kainato y hemos propuesto presencia de elementos purinérgicos y sus metabolitos en el LCR (3). 94 Neurotransmission and development Publicaciones/Publications: Research summary receptor, and we have furthermore Mendieta, J., Ramírez, G., Gago, F. (2001) Molecular proposed a new hypothesis to explain the conformational changes associated to dynamics simulations of the conformational changes of of glutamate and kainate. Proteins (Structure, Function The molecular design, organic synthesis the agonist-receptor interaction, including the opening of a ionic channel specifically triggered by contact with Glu209 (1). Next, and biological assay of a new line of compounds, interacting with the iGluRs in the same way as GMP, were among we have analyzed, with the same methods, the interaction of the receptor model with conventional competitive Lara, D.R., Schmidt, A.P., Frizzo, M.E.S., Burgos, J.S., the tasks defined for future work at the beginning of this last two-year period. Concerning design, we first needed to establish a structural/functional model of antagonists (e.g., DNQX) and GMP. Whereas DNQX sterically blocks the by glutamatergic agents. Brain Res. 912, 176-180 closing movement of the S1 and S2 Portela, L.V.C., Oses, J.P., Silveira, A.L., Schmidt, A.P., Lara, D.R., Battastini, A.M.O., Ramírez, G., Vinadé, L., the iGluRs on the basis of crystallographic data, rather than early models based on segments, GMP allows such closure without interacting with Glu209 so that pore opening does not take place: GMP analogies among the receptors and then behaves as a false agonist, a Res. 950, 74-78 bacterial periplasmic proteins (amino acid transporters), and on the results of directed mutagenesis of selected functional competitive antagonist and an efficient neuroprotector/antiexcitotoxic Tesis Doctorales / Doctoral Theses Interaction of guanine nucleotides with ionotropic glutamate receptors molecular dynamics simulations to analyze the interaction of glutamate and kainate with the GluR2 AMPA/kainate Ramírez, G., Souza, D.O. (2001) Effect of orally administered guanosine on seizures and death induced Sarkis, J.J.F., Souza, D.O. (2002) Guanine and adenine nucleotidase activities in rat cerebrospinal fluid. Brain Javier S. Burgos. 2000. “Interacción de los nucleótidos Finally, we have continued our studies on of Gouaux and coworkers we have used and Genetics) 44, 460-469 agent (submitted). residues. Starting with the compact receptor model the glutamate receptor ligand-binding core in the presence the modulatory effects of other purine derivatives of guanine on neuronal and glial glutamate uptake (2), and on the presence of purinergic compounds and their metabolites in the CSF (3). 95 de guanina con los receptores ionotrópicos de glutamato”. Universidad Autónoma de Madrid. Neurobiología Neurobiology D.10 Neurodegeneración y envejecimiento: señalización mitocondrial del calcio y señalización de insulina/leptina en envejecimiento Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Jorgina Satrústegui e-mail: [email protected] Personal Científico / Scientific Staff: Elena Bogónez Jose M. Carrascosa dominios de unión de Ca2+ de aralar1, la Nuestro laboratorio está interesado en el estudio de los mecanismos moleculares de señalización por calcio en mitocondrias y su implicación en envejecimiento y neurogengeneración, y en el estudio de la señalización por insulina y leptina en la vejez. Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Milagros Ramos Beatriz Pardo Becarios Predoctorales / Graduate Students: Yasmin Fermín Santiago Cavero transducción de energía en la célula y también controla la fase de ejecución de la muerte apoptótica. En células neurales, la entrada de Ca2+ en mitocondrias es importante para la señalización por Ca2+, ya que activa a deshidrogenasas de la Patricia Mármol asocia con disfunción mitocondrial y muerte Carmen Galián Javier Traba Arancha Delgado toxicidad del glutamato o de la proteína beta-amiloide, el péptido de las placas seniles características de la enfermedad de Alzheimer. matriz mitocondrial; sin embargo, la persistencia de Ca2+ en la mitocondria se Estudiantes / Students: isoforma de AGC de células neurales, en la activación del AGC. También, el papel de aralar1 en la maduración neuronal y en la supervivencia a situaciones como la La mitocondria se encarga de la Laura Contreras Coralia Perez Estamos estudiando la función de los celular. Por ello, estamos interesados en el estudio de sistemas de señalización mitocondrial de Ca2+ que no requieran la entrada de Ca2+ en la mitocondria. Hemos El envejecimiento en roedores y humanos está asociado a la presencia de resistencia a la insulina. El interés de nuestro grupo se centra en desentrañar los mecanismos responsables de dicha resistencia, habiendo identificado algunas alteraciones en la cascada de señalización de la hormona en adipocitos. Recientemente describimos la presencia de hiperleptinemia en ratas viejas y estamos investigando actualmente la posible relación entre hiperleptinemia y desarrollo de la resistencia a la insulina. Dado que las ratas viejas presentan identificado a aralar1 y citrina, los primeros transportadores mitocondriales regulados por Ca2+ conocidos, como isoformas del resistencia central a la leptina, postulamos Bárbara Sesé transportador de aspartato-glutamato mitocondrial (AGC), un transportador podría jugar un papel en la aparición de la Científicos Visitantes / importante en la lanzadera de NADH malato-aspartato. Los AGCs se activan por Ca2+ en la cara externa de la membrana Técnico de Investigación / Technical Assistance: Visiting Scientists: Araceli del Arco (Universidad de Castilla-la-Mancha) mitocondrial interna, lo que permite su estimulación por Ca2+ sin necesidad de la entrada de calcio en la mitocondria. 96 que una interacción directa de la leptina con sus receptores en tejidos periféricos resistencia global a la insulina en animales viejos. Estamos interesados también en explorar la reversibilidad de la resistencia a leptina y a insulina por medio de la restricción calórica. Neurodegeneration and ageing: calcium signalling in mitochondria and insulin/leptin signalling during ageing Research summary Our laboratory is interested in the study of the molecular mechanisms of calcium signal transduction in mitochondra in ageing and neurodegeneration, and in the study of insulin and leptin signaling in ageing. Mitochondria are the main sites for energy transduction and the controllers of the execution phase of apoptotic cell death. In neural cells, Ca2+ entry in mitochondria is important in cell Ca2+ signaling, as it calcium entry in mitochondria. We are Carrascosa, J.M., Molero, J.C. Fermín, Y. Martínez, C. currently studying the function of the Ca2+- Andrés A., Satrústegui, J. (2001) Effects of chronic treatment binding motifs of aralar1, the main AGC isoform in neural cells, in AGC activation. with acarbose on glucose and lipid metabolism in obese We are also studying the role of aralar1 in neuronal maturation and survival to insults such as glutamate excitotoxicity and exposure to beta-amyloid, the peptide from senile plaques characteristic of Alzheimer's disease. Insulin resistance is associated with aging in rodents and humans. We are interested in elucidating the mechanisms responsible activates dehydrogenases in the mitochondrial matrix; however, its for this resistance after having identified a number of alterations in the insulin signal persistence in mitochondria is also associated with mitochondrial dysfunction and neuronal death. Thus, we are cascade of adipose cells. Recently we reported the presence of hyperleptinemia in aged rats and we are currently interested in the study of systems for Ca2+ signaling in mitochondria that don't require Ca2+ entry in the organelle. We have investigating the possible association between elevated levels of leptin and the development of insulin resistance. As identified aralar1 and citrin, the first known calcium regulated mitochondrial carriers, aged rats manifest central leptin resistance as two isoforms of the aspartateglutamate transporter (AGC) in mitochondria, a carrier important within the malate-aspartate NADH shuttle. The AGCs are activated by Ca2+ at the outer face of the inner mitochondrial membrane, allowing for Ca2+-stimulation without Publicaciones/Publications: we postulate that direct interaction of leptin with its receptors in peripheral diabetic wistar rats. Diabetes, Obesity & Metabolism 3, 240-248 Palmieri, L., Pardo, B., Lasorsa, F.M., Del Arco, A., Kobayashi, K., Iijima, M., Runswick, M.J., Walker, J.E., Saheki, T., Satrústegui, J., Palmieri, F. (2001) Citrin and 2+ aralar1 are Ca stimulated aspartate/glutamate transporters in mitochondria. EMBO J. 20, 5060-5069 Cruz, F., Villalba, M., García-Espinosa, M.A., Bogónez, E., Satrústegui, J., Cerdán, S. (2001) Intracellular compartmentation of pyruvate in primary cultures of cortical 13 neurons as detected by C NMR spectroscopy with 13 multiple C labels. J. Neurosci. Res. 66, 771-781 Satrústegui, J. Alvarez, G., Ramos, M., Bogónez, E. (2001) Calcio y muerte neuronal. En Alzheimer XXI: Ciencia y Sociedad. Editores J.M. Martínez Lage & Z.S. Khachaturian. Masson Barcelona. 187-192 Fernández-Galaz C., Fernández-Agulló T., Campoy, F., Arribas, C., Gallardo, N., Andrés, A., Ros, M., Carrascosa, J.M. (2001) Decreased leptin uptake in hypothalamic nuclei with ageing in Wistar rats. J. Endrocinol. 171, 23-32 Alvarez, G., Muñoz-Montaño, J.R., Satrústegui, J., Avila, tissues could play a role in the overall insulin resistance of aged animals. We J., Bogónez, E., Diaz-Nido, J. (2002) Regulation of tau are also interested in exploring the neurodegeneration by lithium. Possible implications for possible reversion of leptin and insulin resistance by means of caloric restriction. phosphorylation and protection against -amyloid-induced Alzheimer's disease. Bipolar Disorders 4, 1-13 Begum, L., Abdul Jalil, Md., Kobayashi, K., Iijima, M., Li, MX, Yasuda, T., Horiuchi, M., Del Arco, A., Satrústegui, J., Saheki, T. (2002) Expression of three mitochondrial solute carriers, citrin, aralar1 and ornithine transporter in relation to urea cycle in mice. Biochim. Biophys. Acta 1574, 283292 del Arco, A., Morcillo, J., Martínez-Morales JR, Galián C., Martos V., Bovolenta P., Satrústegui J. (2002) Expression of the aspartate-glutamate mitochondrial carriers aralar1 and citrin during development and in adult rat tissues. Eur. J. Biochem. 269, 3313-3320 Fernández-Galaz, C., Fernández-Agulló, T., Pérez, C., Peralta, S., Arribas, C., Andrés, A., Carrascosa, J.M., Ros, M. (2002) Long-term food restriction prevents ageingassociated central leptin resistance in wistar rats. Diabetologia 45, 997-1003 Molero, J.C., Pérez, C., Martínez, C., Villar, M., Andrés, A., Fermín, Y., Carrascosa, J.M. (2002) Activation of MAP kinase by insulin and vanadate in adipocytes from young and old rats. Mol. Cell. Endocrinol. 189, 77-84 Peralta, S., Carrascosa ,J.M., Gallardo, N., Ros, M., Arribas, C. (2002) Ageing increases SOCS-3 expression in rat hypothalamus: effects of food restriction. Biochem. Biophys. Res. Commun. 296, 425-428 Tesis Doctorales / Doctoral Theses Yasmín Fermín: 2002. “Cambios en la sensibilidad a la insulina durante el envejecimiento de la rata Wistar. Alteraciones de las vías lipogénicas y lipolíticas en el tejido adiposo perirrenal” Universidad Autónoma de Madrid. 97 Neurobiología Neurobiology D.11 Neuropatología molecular de la enfermedad de alzheimer Resumen de Investigación genes silenciados o sobreexpresados, para La enfermedad de Alzheimer (EA) es un analizar los mecanismos responsables de su participación en la muerte celular. e-mail: [email protected] proceso neurodegenerativo resultado de la interacción entre genes y factores Mediante esta estrategia hemos identificado polimorfismos en dos genes implicados en Personal Científico / Scientific Staff: ambientales. Mutaciones en los genes de señalización adrenérgica, que modifican la Maria Jesús Bullido la proteína precursora del péptido amiloide (APP) y las presenilinas causan la EA monogénica. El alelo 4 de la apolipoproteína susceptibilidad para la EA y los niveles de cAMP en neuronas, sugiriendo que el estrés adrenérgico participa en el desarrollo de la E (APOE4) es el factor de susceptibilidad genética más relevante para la EA esporádica. Además, el riesgo de EA. neurodegeneración asociado a factores ambientales como el traumatismo craneal o ciertos procesos infecciosos aumenta en implicación del virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) en procesos neurodegenerativos utilizando modelos celulares y animales de Becarios Predoctorales / presencia de factores genéticos como infección. Estudios en células sugieren que Graduate Students: APOE4. HSV-1 puede modificar la fosforilación de tau e iniciar un proceso de apoptosis Ana Martínez García Para estudiar los mecanismos patogénicos neuronal. En un modelo murino de infección Julio Pozueta Larios de la EA, hemos desarrollado una estrategia basada en la identificación y análisis hematógena, hemos encontrado que la funcional de genes utilizando modelos celulares y animales. Los genes candidatos neuroinvasividad del HSV-1, estableciendo un posible vínculo funcional entre estos dos factores, uno genético y otro ambiental, de Jefe de Línea / Group Leader: Fernando Valdivieso José A. López Guerrero Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Jesús Aldudo Soto Gema Alvarez Nieto María Recuero Vicente Javier Burgos Muñoz María Alonso Martínez Carlos Ramírez Moreno María del Carmen Ramos Martín Marta Rey Martín Elena Serrano Carballal Esther Serrano Saiz se detectan en "microarrays" de expresión Por otra parte, estamos estudiando la dosis alélica de APOE modula la de modelos neuronales sometidos a estímulos inductores de estrés; sobre estos riesgo para EA. candidatos: a) realizamos estudios de Nuestros resultados inciden en la idea del Technical Assistance: asociación genética como indicador de su implicación real en la patogénesis, y b) carácter multifactorial de la EA, a la que contribuyen genes de susceptibilidad y Isabel Sastre Merlín generamos modelos neuronales con dichos agresiones de índole no genética. Raquel Tenorio Vela María del Carmen Vicente Cenzano Técnico de Investigación / 98 Molecular neuropathology of alzheimer's disease Publicaciones/Publications: Research summary models by silencing or overexpressing the candidate, to analyze the mechanisms Martín, D., Salinas, M., López-Valparaiso, R., Serrano, Alzheimer's disease (AD) is a mediating its participation in the proccess (2001) Effect of the Alzheimer amyloid fragment neurodegenerative disorder produced by the interactions among genes and of cell degeneration. Using this strategy we have identified polymorphisms in two genes involved in adrenergic signaling; Abeta(25-35) on Akt/PKB kinase and survival of PC12 gene coding for the amyloid precursor protein (APP) and in the presenilins cause monogenic AD. The allele 4 of these polymorphisms change the Alonso, M., Dimitrijevic, A., Recuero, M., Serrano, E. susceptibility for AD and the cAMP levels in cultured neurons, suggesting that Valdivieso, F., López-Guerrero, J.A. (2001) Interaction apolipoprotein E (APOE4) is the main genetic susceptibility factor for sporadic AD. Moreover, the risk for adrenergic stress participates in AD pathogenesis. neuronal cells. J. Neurovirol. 7, 556-563 neurodegeneration associated to enviromental factors such as major trauma or certain infectious processes increase in the presence of genetic factors as On the other hand, we are studying the Wang, J.C., Bullido, M.J., Harris, J.M., Artiga, M.J., involvement of herpes simplex virus type 1 (HSV-1) in neurodegenerative processes. Our studies in cell models Hernandez, D., Kwon, J.M., Frigard, B., Petersen, R.C., APOE4. suggest that HSV-1 modifies tau phosphorylation and initiates a neuronal apoptosis process. In a murine model of D.M., Wavrant DeVrieze, F., Ezquerra-Trabalon, M., hematogenous infection we have found (2002) Contribution of APOE promoter polymorphisms based on the identification and functional that the allelic dose of APOE modulates to Alzheimer’s disease risk. Neurology 59, 59-66 analysis of candidate genes using cell and animal models. The candidate genes the neuroinvasivity of HSV-1, pointing to enviromental factors. Mutations in the To study the pathogenic mechanisms of the AD, we have developed a strategy E., Recuero, M., Cuadrado, A. cells. J. Neurochem. 78,1000-1008 of alpha-2-macroglobulin and HSV-1 during infection of Lambert, J-C., Goumidi, L., Myllykangas, L., Ellis, C., Cumming, A.M., Pasquier, F., Sastre, I., Tienari, P.J., Frank, A., Sulkava, R., Morris, J. C., Clair, D. St, Mann, Amouyel, P., Hardy, J., Haltia, M., Valdivieso, F., Goate, A.M., Pérez-Tur, J., Lendon, C.L., Chartier-Harlin, M-C. the existence of a functional link between these two factors, one genetic and the Burgos, J.S., Ramírez, C., Tenorio, R., Sastre, I., Bullido, analysis of cultured neuronal cells subjected to different treatments inducing stress; with each candidate: a) we perform other enviromental, of risk for AD. Thus, time PCR parameters. Mol. Cel. Probes all our results are in agreement with the idea that AD is a multifactorial process, 16, 257-260 genetic association case-control studies, with contribution of genes and non-genetic Frank García, A., Ramos, M.C., Bullido, M.J. Genética as indicators of its actual implication in pathogenesis, and b) we generate cell injuries. y deterioro cognitivo severo. are detected by expression microarray M.J. (2002) Influence of reagents formulation on real- (2002) Neurología 17 (supl.7) 56-62 Bullido, M.J., Fariñas, F., Sastre, I., Gil, P. (2002) Deterioro cognitivo y funcional asociado a polimorfismos de ApoE y A2M. Revista Española de Geriatría y Gerontología 37, 111-119 Martínez García, A., Bullido, M.J. (2002) Enfermedad de Alzheimer. Genes y mecanismos moleculares. BioPress.net 5 Burgos, J.S., Ramírez, C., Sastre, I., Bullido, M.J., Valdivieso, F. (2002) Involvement of Apoliprotein E in the Hematogenous Route of Herpes Simplex Virus Type 1 to the Central Nervious Systems. J. Virol. 76, No.23, 12394-12398 Frank, A., Díez-Tejedor, E., Bullido, M.J., Valdivieso, F., Barreiro, P. (2002) APOE genotype in cerebrovascular disease and vascular dementia. J. Neurol. Sci. 203-204, 173-176 99 Representación del sitio activo de polimerización de la Pol ß humana, en la que se indican una serie de residuos implicados en la catálisis y fidelidad de inserción del nucleótido entrante (en amarillo), en base a la complementariedad con un nucleótido molde (en verde). Los residuos coloreados en marrón son invariantes entre Pol ß y Pol l. La falta de conservación de Lys280, Asp276 y Ala185 sugiere importantes diferencias entre la Pol ß y la Pol l. La figura ha sido realizada con los programas GRASP, MOLSCRIPT y RASTER3D, utilizando el fichero 1BPY del banco de datos PDB. The active polymerization site of human Pol ß, indicating the sites involved in catalysis and incoming nucleotide insertion fidelity (yellow), based on the complementarity with a template nucleotide (green). Brown-colored residues are invariant in Pol ß and Pol l. The lack of conservation in Lys280, Asp276 and Ala185 suggests important differences between Pol ß and Pol l. The figure has been prepared using GRASP, MOLSCRIPT and RASTER3D software, using the 1BPY file and the PDB database. 100 Carlos Alonso Miguel A. Alonso E.1 Parasitología molecular E.1 Molecular parasitology E.2 Expresión génica en linfocitos T E.2 Gene expression in T lymphocytes E.3 Biología molecular de extremófilos (microbiología aplicada) Ricardo Amils E Juan Alfonso Ayala Serrano Regulación de la expresión génica E.3 Molecular biology of extremophylic microorganisms E.4 División celular bacteriana y resistencia a antibióticos E.4 Bacterial cell division and antibiotics resistance E.5 Biotecnología y genética de bacterias termófilas extremas José Berenguer E.5 Biotechnology and genetics of extreme thermophilic bacteria E.6 Mantenimiento y variabilidad del genoma: enzimología de la reparacion del DNA Luis Blanco José Luis Castrillo Díez Regulation of gene expresion Juan Pedro García Ballesta César de Haro, José M. Sierra E.6 Genome maintenance and variability: enzymology of DNA repair E.7 Regulación de la expresión génica específica de tejido E.7 Regulation of the tissue-specific gene expression E.8 Estructura y función del ribosoma E.8 Ribosome structure and function E.9 Síntesis de proteínas y su regulación en eucariontes E.9 Protein synthesis and its regulation in eukaryotes E.10 Expresión génica en levaduras y streptomyces Antonio Jiménez Encarnación Martínez-Salas E.10 Gene expression in yeast and streptomyces E.11 Iniciación interna de la traducción en mRNAs eucarióticos E.11 Internal initiation of translation in eukaryotic mRNAs Enrique Palacián E.12 Estructura cromatínica y transcripción E.12 Chromatin structure and transcription Miguel Angel de Pedro Montalban E.13 Envolturas celulares E.13 Cell envelopes Magdalena Ugarte E.14 Bases Moleculares de las Enfermedades Metabólicas E.14 Molecular basis of metabolic diseas 101 Regulación de la expresión génica Regulation of gene expression E.1 Parasitología molecular Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: e-mail: [email protected] Las especies de Leishmania son protozoos parásitos, agentes etiológicos de las Leishmaniosis, un grupo de enfermedades Personal Científico / Scientific Staff: que afectan a la población de 88 países. Jose Mª Requena, Manuel Soto Se estima que se producen 2 millones de casos nuevos cada año, existiendo unos 400 millones de personas en riesgo de Carlos Alonso Postdoctoral / Postdoctoral Fellow: Luis Quijada Becarios Predoctorales / Graduate Students: Ana Isabel Rico Ruth Larreta Nuria Parody Salvador Iborra Javier Carrión Technical Assistance: Miguel A. Fuertes se están realizando en tres sistemas animales: el ratón, el hámster dorado y el perro (este último en colaboración con el Dr. Luis Carlos Gómez-Nieto (Facultad de Veterinaria, Universidad de Extremadura, Cáceres). contraer la enfermedad. La leishmaniosis visceral causada por Leishmania infantum Otra parte de nuestra actividad investigadora es una enfermedad severa, fatal si no es tratada, que es común en la región Mediterránea y en Latinoamérica. Los perros son el principal reservorio y la molecular de L. infantum. Este parásito presenta características muy peculiares de seroprevalencia entre la población canina oscila entre el 10 y el 30%. Cristina Folgueira Técnico de Investigación / proteínas son mitógenos de linfocitos B de ratón. Los estudios de inmunoprotección La principal actividad investigadora de nuestro grupo se dirige hacia la caracterización de las propiedades inmunoprofilácticas de una serie de se desarrolla en el campo de la biología regulación de la expresión génica, forzado por la carencia de secuencias promotoras en sus genes. En particular, estamos estudiando los mecanismos de regulación post-transcripcional, utilizando como modelo los genes de histonas y de las proteínas de choque térmico. Información adicional sobre la actividad investigadora de nuestro antígenos de L. infantum. Hemos identificado grupo se puede obtener en la dirección: http://www2.cbm.uam.es/cx- a proteínas evolutivamente conservadas 203/PAGINA1.htm como antígenos prominentes de Leishmania que son específicamente reconocidos por los sueros de humanos y perros con Nuestro grupo está colaborando con los leishmaniasis visceral (LV). Algunas de estas proteínas (p. ej., las proteínas de choque térmico HSP70 y HSP83) tienen características inmunoestimuladoras. En particular, hemos demostrado que estas Leishmania tiene dos formas morfológicas, el promastigote móvil (izquierda) y el amastigote no móvil (derecha). 102 Drs. Carmen Navarro-Ranninger y Jose Manuel Pérez (Departamento de Química Orgánica, UAM) en la identificación de las vías bioquímicas por las que algunos compuestos metálicos ejercen su actividad antitumoral. Molecular parasitology Publicaciones/Publications: Research summary properties. In particular, we have demonstrated that these proteins are mitogens for mouse B lymphocytes. The Fuertes, M.A., Perez, J.M., Soto, M., Lopez, M.C., Alonso, J. Biol. Inorg. Chem. 6, 107-117 by a group of diseases that affects the experiments directed to analyse the potential protection provided by these antigens is carried out in three model population in 88 countries. It has been estimated that there are about 2 million systems: mouse, hamster and dog. The protection experiments with dogs are new cases every year and that there are about 400 million people at risk of getting done in collaboration with Dr. Luis Carlos Gómez-Nieto (Facultad de Veterinaria, Universidad de Extremadura, Cáceres). Leishmaniae are protozoan parasites that are the etiological agents of Leishmaniosis. Leishmaniosis is formed the disease which is very severe and fatal when not treated. This form of the disease is common in the Mediterranean area and in Latinoamérica. Dogs are the main reservoir of the parasite. The prevalence is the canine population varies form 10 to 30%. The research activity of our group is aimed to the characterisation of a series of L. infantum antigens and to the determination of the immune-prophylactic properties of these antigens. We have identified several L. infantum proteins that panantigens in Leishmania. Trends Parasitol. 17, 64 Gonzalez, V.M., Fuertes, M.A., Alonso, C., Perez, J.M. (2001) Is cisplatin-induced cell death always produced by apoptosis? Mol. Pharmacol. 59, 657-663 Echeverria, P., Dran, G., Pereda, G., Rico, A.I., Requena, J.M., Alonso, C., Guarnera, E., Angel, S.O. (2001) Analysis of the adjuvant effect of recombinant Leishmania analyse the regulation of the expression Lett. 76, 107-110 of several genes of L. infantum since it presents several characteristics due to the absence of promoter sequences. In Thomas, M.C., Longobardo, M.V., Carmelo, E., Marañon, particular we are studying mechanisms of post-tanscriptional regulation using as models the histone and heat shock genes. Further information on the activity of the group may be found in: http://www2.cbm.uam.es/cx203/PAGINA1.htm. Our group is also collaborating with Drs. affected by visceral leishmaniosis (LV) that are evolutionary conserved. Some of Carmen Navarro-Ranninger and José Manuel Pérez (Departamento de Química Orgánica, UAM) on the identification of proteins have also immuno-stimulatory Requena, J.M., Alonso, C., Soto, M. (2001) More infantum Hsp83 protein as a tool for vaccination. Immunol. confronted with human and dog sera mention the HSP70 and HSP83). These Leishmania infantum kinetoplastid membrane protein-11. Our research efforts are also directed to behave as prominent antigens when these proteins belong to the group of heat shock proteins (as an example we can C. (2001) Calcium-induced conformational changes in metabolic pathways which can be manipulated to enhance the anti tumour activity of certain metallic compounds. C., Planelles, L., Patarroyo, M.E., Alonso, C., Lopez, M.C. (2001) Mapping of the antigenic determinants of the T. cruzi kinetoplastid membrane protein-11. Identification of a linear epitope specifically recognized by human Chagasic sera. Clin. Exp. Immunol. 123, 465-471 Jansen, B.A., Perez, J.M., Pizarro, A., Alonso, C., Reedijk, J., Navarro-Ranninger C. (2001) Sterically hindered cisplatin derivatives with multiple carboxylate auxiliary arms: synthesis and reactions with guanosine-5'monophosphate and plasmid DNA. J. Inorg. Biochem. 85, 229-235 Planelles, L., Thomas, M.C., Alonso, C., Lopez, M.C. (2001) DNA immunization with Trypanosoma cruzi HSP70 fused to the KMP11 protein elicits a cytotoxic and humoral immune response against the antigen and leads to protection. Infect. Immun. 69, 6558-6563 Viñuelas, J., Garcia-Alonso, M., Ferrando, L., Navarrete, I., Molano. I., Miron, C., Carcelen, J., Alonso, C., Nieto, C.G. (2001) Meningeal leishmaniosis induced by Leishmania infantum in naturally infected dogs. Vet. Parasitol. 31, 23-27 Fuertes, M.A., Perez, J.M., Gonzalez, V.M., Alonso, C. (2001) A kinetic model for the B-Z transition of poly[d(GC)].poly[d(G-C)] and poly[d(G-m5C)].poly[d(G-m5C)]. J. Biol. Inorg. Chem. 6, 675-682 Tesis Doctorales / Doctoral Theses Ana Isabel Rico Errazquin. 2002. “Propiedades inmunoestimuladoras de las proteínas de choque Perez-Alvarez, M.J., Larreta, R., Alonso, C., Requena, J.M. (2001) Characterisation of a monoclonal antibody recognising specifically the HSP70 from Leishmania. Parasitol. Res. 87, 907-910 térmico HSP70 y HSP83 de Leishmania infantum”. Universidad Autónoma de Madrid. Larreta, R., Guzman, F., Patarroyo, M.E., Alonso, C., Requena, J.M. (2002) Antigenic properties of the Leishmania infantum GRP94 and mapping of linear Bcell epitopes. Immunol. Lett. 80, 199-205 Perez, J.M., Cerrillo, V., Matesanz, A.I., Millan, J.M., Navarro, P., Alonso, C., Souza, P. (2001) DNA interstrand cross-linking efficiency and cytotoxic activity of novel cadmium(II)-thiocarbodiazone complexes. Chembiochem. 2, 119-123 Iniesta, V., Gomez-Nieto, L.C., Molano, I., Mohedano, A., Carcelen, J., Miron, C., Alonso, C., Corraliza, I. (2002) Arginase I induction in macrophages, triggered by Th2- There are two developmental forms of Leishmania, the motile promastigote (left) and the amotile amastigote (right). type cytokines, supports the growth of intracellular Leishmania parasites. Parasite Immunol. 24, 113-118 Rico, A.I., Girones, N., Fresno, M., Alonso, C., Requena, J.M. (2002) The heat shock proteins, Hsp70 and Hsp83, of Leishmania infantum are mitogens for mouse B cells. Cell Stress & Chaperones 7, 339-346 103 Regulación de la expresión génica Regulation of gene expression E.2 Expresión génica en linfocitos T Resumen de Investigación Las membranas celulares parecen estar Con la hipótesis de que la familia MAL de proteínas podría desempeñar funciones importantes en procesos de transporte, e-mail: [email protected] compartimentalizadas en microdominios o balsas lipídicas implicados en procesos de nuestro grupo ha caracterizado BENE y MAL2, dos miembros inéditos de la familia Personal Científico / Scientific Staff: transporte intracelular y señalización. Para Cristina Hernández-Munain que las balsas sean operativas necesitan una maquinaria proteica especializada que las organice y las dote de las funciones MAL presentes también en las balsas lipídicas. Nuestros resultados recientes indican que BENE participa en el transporte Jefe de Línea / Group Leader: Miguel A. Alonso Alicia Llorente Fernando Martín-Belmonte de colesterol en células endoteliales, requeridas. El principal objetivo de nuestro laboratorio ha sido la identificación la mientras que MAL2 es un componente esencial de la maquinaria para la ruta maquinaria de transporte que interviene en las balsas lipídicas, investigar las rutas en las que esta maquinaria está implicada, y indirecta o transcitótica que transporta proteínas desde la membrana basolateral a la membrana apical en hepatocitos y en caracterizar su mecanismo de actuación. células epiteliales. Nuestros resultados sitúan a la familia MAL de proteínas en un Sergio Gómez La proteína MAL ha sido caracterizada Noelia Zamarreño como el primer componente integral de membrana de la maquinaria necesaria para lugar central en la regulación del tráfico intracelular de proteínas. Becarios Predoctorales / el transporte directo de proteínas mediado Graduate Students: por balsas lipídicas a la superficie apical en células epiteliales MDCK. El hecho de Una línea de trabajo adicional en el laboratorio consiste en el estudio de las bases moleculares para la regulación de la que MAL se exprese también en linfocitos expresión de los genes de los receptores T nos ha llevado a demostrar la existencia para antígeno en linfocitos T por enhancers mediante el estudio de la localización Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Jaime Millán Mª del Carmen de Marco Técnicos de Investigación / Technical Assistance: Alicia Batista Juan Francisco Aranda de una ruta semejante que transportaría proteínas al urópodo, un subdominio de membrana presente en los linfocitos T polarizados. nuclear de estos genes y la caracterización de los complejos multiprotéicos ensamblados en los enhancers durante el desarrollo. La ruta directa de transporte de proteínas a la superficie apical está controlada por la proteína MAL en células epiteliales polarizadas, mientras la proteína MAL2 dirige la ruta indirecta o transcitótica tanto en células epiteliales como en hepatocitos. 104 Gene expression in T lymphocytes Publicaciones/Publications: Research summary Cellular membranes appear to be comparmentalized in glycolipid and cholesterol-enriched microdomains, referred as to lipid rafts, involved in membrane trafficking and signaling. Rafts require specialized protein machinery to be functional. The main goal of our lab is the identification of protein elements of the machinery involved in raft-mediated membrane trafficking processes. The MAL protein was characterized has the first integral membrane component of the machinery for the raft-mediated route of direct transport to the apical surface in epithelial MDCK cells. The fact that MAL is also expressed in T lymphocytes prompt us to demonstrate the existence of a similar route involved in the trafficking of proteins to the uropod protrusion, a membrane subdomain found at the rear of migrating T lymphocytes. of proteins might play a general role in de Marco, M. C., Kremer, L., Albar, J. P., Martínez- membrane trafficking we have characterized BENE and MAL2, two Menárguez, J. A., Ballesta, J., García-López, M.A., unedited members of the MAL family also present in rafts. Our studies indicate that BENE is involved in cholesterol transport in endothelial cells, whereas MAL2 plays an essential role as a component of the machinery for the indirect of transcytotic Marazuela, M., Puertollano, R., Alonso, M. A. (2001) BENE, a novel raft-associated protein of the MAL proteolipid family, interacts with caveolin-1 in human endothelial-like ECV304 cells. J. Biol. Chem. 276, 2300923017 Martín-Belmonte, F., Arvan, P., Alonso M. A. (2001) MAL mediates apical transport of secretory proteins in polarized epithelial Madin-Darby canine kidney cells. J. Biol. Chem. route that transport proteins from the basolateral to the apical surface in hepatocytes and polarized epithelial cells. 276, 49337-49342 The MAL family plays, therefore, a central place in the regulation of the intracellular traffic. motif in the carboxyl terminus of MAL is required for In addition, we are also interested in the molecular basis for regulation of gene Alonso, M. A., Millán, J. (2001) The role of lipid rafts in expression at the T-cell receptor genes by enhancers through the study of nuclear localization of these genes and characterization of the multiprotein complexes assembled on their enhancers during cell development. With the hypothesis that the MAL family Puertollano, R., Martínez-Menárguez, J. A., Batista, A. Ballesta, J., Alonso, M. A. (2001) An intact dilysine-like normal apical transport of the influenza virus hemagglutinin cargo protein in epithelial Madin-Darby canine kidney cells. Mol. Biol. Cell 12, 1869-1883 signalling and membrane trafficking in T lymphocytes. J. Cell Sci. 114, 3957-3965 Bouchon, A., Hernandez-Munain, C., Cella, M., Colonna, M. (2001) A DAP12-mediated pathway regulates expression of CC chemokine receptor 7 and maturation of human dendritic cells. J. Exp. Med. 194, 1111-1122 Millán, J., Qaidi, M., Alonso, M.A. (2001) Segregation of costimulatory components into specific T-cell surface lipid rafts. Eur. J. Immunol. 31, 467-473 Martín-Belmonte, F., Millán, J. (2001) Estructura y función de las balsas lipídicas (“rafts”), dominios de membrana ricos en esfingolípidos y colesterol. Inmunología 20, 216224 Copie-Bergman, C., Plonquet, A., Alonso, M. A., Boulland, M.-L., Marquet, J., Divine, M., Möller, P., Leroy, K., Gaulard, P. (2002) MAL expression in lymphoid cells: further evidence for MAL as a distinct molecular marker of primary mediastinal large B-cell lymphomas. Mod. Tesis Doctorales / Doctoral Theses Fernando Martín-Belmonte. 2001. “Función del proteolípido MAL en el transporte polarizado de proteínas en células epiteliales”. Universidad Autónoma de Madrid. Pathol. 15, 1172-1180 Tracey, L., Villuendas, R., Ortiz, P., Dopazo, A., Spiteri, I., Rodríguez-Peralto, J.L., Fernández-Herrera, J., Hernández, A., Fraga, J., Lombardia, L., Dominguez, . O., Herrero, J., Alonso, M.A , Dopazo, J., Piris, M. A. (2002) Identification of genes involved in resistance to María del Carmen de Marco. 2002. “Caracterización _-interferon in cutaneous T-cell lymphoma. Am. J. Pathol. de BENE y MAL2, dos nuevos miembros de la familia 161, 1825-1837 MAL de proteínas, como elementos de la maquinaria de tráfico de membranas”. Universidad Autónoma de Madrid. Hernández-Munain C., Krangel, M. S. (2002) Distinct roles for c-Myb and core binding factor/polyoma enhancerbinding protein 2 in the assembly and function of a multiprotein complex on the TCR b enhancer in vivo. J. Immunol. 169, 4362-4369 Sánchez-Pulido, L., Martín-Belmonte, F., Valencia, A., Alonso, M. A. (2002) MARVEL: a conserved domain involved in membrana apposition events. Trends Biochem. Sci. 27, 599-601 Millán, J., Montoya, M. C., Sancho, D., Sánchez-Madrid, F., Alonso, M. A. (2002) Lipid rafts mediate biosynthetic transport to the T cell uropod subdomain and are necessary for uropod integrity and function. Blood 99, MAL mediates the direct pathway to the apical surface in polarized epithelial cells, whereas MAL2 directs the indirect transcytotic route both in epithelial cells and hepatocytes. 978-984 de Marco, M. C., Martín-Belmonte, F., Kremer, L., Albar, P. J., Correas, I., Vaerman, J. P., Marazuela, M., Byrne, J. A., Alonso, M. A. (2002) MAL2, a novel raft protein of the MAL family, is an essential component of the machinery for transcytosis in hepatoma HepG2 cells. J. Cell Biol. 159, 37-44 105 Regulación de la expresión génica Regulation of gene expression E.3 Biología molecular de extremófilos (microbiología aplicada) Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Ricardo Amils El grupo de Biología Molecular de e-mail: [email protected] Microorganismos Extremófilos posee distintas líneas de investigación cuyos Personal Científico / Scientific Staff: objetivos principales se resumen a Irma Marín continuación: Francisco Santamaría José Luis Sanz Biohidrometalurgia, ecología, biología Francisco Hernández molecular y biotecnología de microorganismos que se desarrollan en Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Elena González Toril Angeles Aguilera Felipe Gómez ambientes ácidos, con especial énfasis en los aspectos aplicados de los mismos: biominería, biodesulfuración de carbones, secuestro específico de metales pesados, fitorremediación. Becarios Predoctorales / Graduate Students: Enrique Marín Javier Chichón Eva Lospitao Emiliano Díaz Moustafa Malki Eva Mejía Antonio García Ecología microbiana de ambientes extremos terrestres como modelos de vida de interés astrobiológico: geomicrobiología del Río Tinto y de las lagunas hipersalinas de la Mancha (Tirez). Este trabajo se hace en colaboración con el laboratorio de Extremofilia del Centro de Metanogénesis: i) caracterización microbiana de las formas de desarrollo de la biomasa anaerobia (lodo granular y biopelículas): identificación, cuantificación, formación y estudio de la estructura del gránulo y distribución espacial de las diferentes poblaciones; ii) toxicidad y biodegradación de alquilbenceno sulfonatos (LAS) en sistemas anaerobios: caracterización microbiológica de sedimentos marinos, rutas degradativas, etc.; iii) biorremediación de compuestos azufrados en efluentes industriales; iv) ecología molecular microbiana de ambientes extremos anaerobios (ácidos e hipersalinos). En todos los casos se aplican técnicas moleculares: hibridación in situ con sondas fluorescentes (FISH), electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) y clonación. Dinoflagelados marinos: i) desarrollo de métodos inmunológicos y moleculares para la detección de toxinas DSP y los Astrobiología (INTA-CSIC). organismos productores y ii) identificación y clonación de proteínas relacionadas con Thorsten Köchling Caracterización estructural y funcional la producción de toxinas PSP por diferentes Alberto Fernández Fairen Erik Zettler de chaperonas de haloarqueas: purificación, identificación de los genes especies del género Alexandrium comparando: a) cepas tóxicas y no tóxicas, Técnicos de Investigación / codificantes y clonación, estudios estructurales al microscopio electrónico, su b) a lo largo del ciclo celular, c) sus bacterias simbiontes. Actualmente se está iniciando Technical Assistance: papel en la reconstitución de ribosomas, un proyecto relacionado con la sus aplicaciones en nanotecnología. secuenciación del genoma de Dinophysis acuminata. Lucía Palacios Nuria Fernández Nuria Rodríguez Juan Francisco Morales Modesta Gutierrez Científicos Visitantes / Visiting Scientists: Antonio Lazcano (U. Nacional de México) Ana Mª Amaro (U. de Chile) Linda Amaral (MBL Woods Hole) Erik Zettler (MBL Woods Hole) Modelo de la geomicrobiología del río Tinto. 106 Molecular biology of extremophylic microorganisms Publicaciones/Publications: Research summary The objectives of the Extremophiles group are the following: Biohydrometallurgy: ecology, molecular biology, and biotechnology of acidophilic microorganisms, with special emphasis in their potential application: biomining, bioremediation, specific metal sequestering, fitoremediation. Microbial ecology of terrestrial extreme environments as models of astrobiological interest: geomicrobiology of the Tinto River and hypersaline ponds from la Mancha (Tirez). In colaboration with the Centro de Metanogenesis: I) microbial López-Archilla, A.I., Marín, I., Amils, R. (2001) Microbial characterization of the biomass present in an anaerobic reactor (granular sludge, Community Composition and Ecology of an Acidic Aquatic biofilms): identification, quantification, formation, structural studies of the granules and space distribution of the microbial populations; ii) toxicity and biodegradation of alkylbencen sulfonates (LAS) in anaerobic systems: microbial characterization of marine sediments, degradative pathways, etc.; iii) bioremediation of sulfur compounds from industrial effluents, iv) molecular ecology of anaerobic extreme environments (acidic and hypersaline). Molecular ecology techniques are used in all the projects: fluorescence in situ hybridization (FISH), denaturating gradient gel electrophoresis (DGGE) and cloning. González-Toril, E., Gómez, F., Rodríguez, N., FernándezRemolar, D., Zuluaga, J., Marín, I., Amils, R. (2001) Geomicrobiology of the Tinto River, a model of interest for biohydrometallurgy. En “Biohydrometallurgy: fundamentals, technology and sustainable development”, Vol. B, Ciminelli, V.S.T. y García, O. (eds.), Elsevier, Amsterdam, pp. 639-650 Durán, C., Sargeant, C., Rodríguez, N., Amils, R. (2001) Specific Cr(III) sequestering using an acidophilic fungal isolate. En “Biohydrometallurgy: fundamentals, technology and sustainable development”, Vol. B, Ciminelli, V.S.T. y García, O. (eds.), Elsevier, Amsterdam, pp. 237-246 Culubret, E. N,, Luz, M., Rojas, P., Amils, R., Sanz, J.L. (2001) Biodegradation of 1,1,1,2-Tetrachloroethane under methanogenic conditions. Water Science and Technology 44, 117-122 Marín, I., Aguilera, A., Reguera, B., Abad, J.P. (2001) Preparation of DNA suitable for PCR amplification from Astrobiología (INTA-CSIC) characterization of haloarchaeal chaperons: purification, gen identification, Marine dinoflagellates: i) development of inmunological and molecular methodologies for the detection of DSP toxins and producing microorganisms and cloning, structural studies at the electron ii) identification and cloning of proteins microscope, role in the reconstitution of ribosomes, application in nanotechnology related with the production of PSP toxins by different species of the genus Structural and functional Environment: The Tinto River, Spain. Microb. Ecol. 41, 20-35 Alexandrium comparing: a) toxic and non toxic strains, b) cellular cycle, c) symbiotic fresh or fixed single dinoflagellate cells. BioTechniques 30: 88-93 Amaral-Zettler, L., Gómez, F., Zettler, E., Keenan, B.G., Amils, R., Sogin, M.L. (2002) Heavy metal, acid loving eukaryotes from Spain`s “River of Fire”. Nature 417, 137 Margot, H., Acebal, C., Toril, E., Amils, R., Fernández Puentes, J.L. (2002) Consistent association of crenarchaeal Archaea with sponges of the genus Axinella. Marine Biol. 140, 739-745 Gómez, F., Amils, R. (2002) Life as an environmental bactetia. A project related with the genome transformer. Astron. Soc. Pacif. Conf. Series 269, 339- sequencing of Dinophysis acuminata is starting. 352 Gómez, F., Amils, R. (2002) Evolution of microbial energy conservation: from chemolithotrophy to photosynthesis. Astron. Soc. Pacif. Conf. Series 269, 217-226 Gómez, F., González-Toril, E., Rodríguez, N., Fernández- Tesis Doctorales / Doctoral Theses Remolar, D., Aguilera, A., Malki, M., Amils, R. (2002) The Tinto River, an extreme environment under control Elena González Toril. 2002. “Ecología molecular de la of iron. En “Proceedings of the Second European comunidad microbiana de un ambiente extremo: el Workshop on Exo/Astrobiology”, H. Lammer (ed.), ESA Río Tinto”. Universidad Autónoma de Madrid. SP-518, pp. 457-458 Platas, G., Meseguer, I., Amils, R. (2002) Purification and biological characterization of halocin H1 from Haloferax mediterranei M2a. Int. Microbiol. 5, 15-19 Marín, I., Aguilera, A., González-Gil, S., Reguera, B., Abad, J.P. (2002) Genetic analysis of three species of Dinophysis causing diarrhetic shellfish outbreaks in Galicia (NW Spain). En “Harmful Algal Blooms 2000”. UNESCO Publishers. pp. 222-225 Sanz, J.L., Díaz, E.E., Amils, R. (2002) Molecular ecology of anaerobic granular sludge grown at different conditions. En “VII Taller y Seminario Latinoamericano de Digestión Anaerobia”, A. Noyola (ed.), UNAM, México, pp. 73-80 Sanz, J.L. (2002) Metodos analiticos de biologia molecular en digestión anaerobia. En “VII Taller y Seminario Latinoamericano de Digestión Anaerobia”, A. Noyola El rio Tinto en la zona anóxica de Berrocal. (ed.), UNAM, México, pp. 1-20 Marín, E. (2002) La legislación actual de los transgénicos, un reto para el futuro. AgroAlimentaria, 70, 8-9 Marín, E. (2002) Nueva regulación de Organismos Modificados Genéticamente. Vida Rural 19, 14-16 Marín, E. (2002) Nueva normativa para los Organismos Modificados Genéticamente. Cultura Biotec. 2, 5. 107 Regulación de la expresión génica Regulation of gene expression E.4 División celular bacteriana y resistencia a antibióticos Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Juan Alfonso Ayala Serrano e-mail: [email protected] Becarios Predoctorales / Graduate Students: Guillermo Cobas Pupo Daniel Edgar Vega Mendoza Estudiantes / Undergraduate Students: Ana Rosa Villaroya Moreno Rachel Ruíz Fernando López Gallego Amelie Borges Ingrid Dunn-Stanley Técnicos de Investigación / Technical Assistance: Susana Dominguez Santos Carmen Panadero Alvarez Nuria Salas Científicos Visitantes / Visiting Scientist: Vanina Romanello, Universidad de Rosario, Argentina Juan Francisco Almenares, Universidad de Oriente, CEBI, Cuba Prof. Jean van Heijenoort, Universite de Paris-Sud, Francia Dr. Gabriel Guntkind, Universidad Buenos Aires, Argentina Dr. Kuvat T. Momynaliev, Institute of Physico-Chemical Medicine, Moscow, Russia Los objetivos de nuestro grupo son el estudio desde un punto de vista molecular del proceso de crecimiento y división bacteriana y de los diversos mecanismos de resistencia a los antibióticos `-lactámicos, que se han desarrollado por los microorganismos patógenos de origen clínico. La mayor parte de los enzimas implicados en el proceso de división bacteria se encuentran agrupados en el cluster dcw (division and cell wall), muy conservado en la evolución y donde se incluyen, entre otros, los genes pbpB, ftsW y ftsZ. El estudio de la funcionalidad de FtsW en Escherichia coli ha sido uno de los aspectos que hemos desarrollado en este periodo. Los mecanismos de resistencia a los antibióticos desarrollados por las bacterias patógenas son muy complejos y incluyen entre otros, transmisión horizontal de determinantes de resistencia, modificación de la permeabilidad de la membrana y expresión de bombas de eflujo. En este periodo hemos caracterizado una nueva `-lactamasa (CTX-M-2) transmisible en un nuevo integrón, así como la influencia de la longitud de cadena del antígeno-O en la invasividad de Shigella flexneri. Además, estamos caracterizando las proteínas de membrana externa de Pseudomonas aeruginosa de origen clínico. Tras la publicación de la secuencia completa del genoma de Salmonella Typhi se ha hecho patente la presencia de genes parálogos para las PBPs no previamente identificados por estudios bioquímicos. Dos de estos genes codifican para parálogos cromosomales de pbpA y pbpB, que no están presente en Escherichia coli. Estamos analizando estas proteínas desde el punto de vista genético, enzimático y fisiológico, y encontrando evidencias de su implicación en los procesos de invasión y proliferación intracelular. El peptidoglicano lateral durante la elongación bacteriana se sintetiza esencialmente por la proteína PBP1b. Esta proteína presenta una actividad transpeptidasa (crosslinking) asociada al dominio C-terminal, y una actividad transglicosilasa (elongación de cadena) en el dominio N-terminal. A pesar de los esfuerzos de varios grupos para la cristalización y determinación de la estructura de esta proteína, aun no se han conseguido resultados positivos. No obstante hemos avanzado en el conocimiento de la interacción con el antibiótico inhibidor de la transglicosilación, moenomicina A, y en la funcionalidad de cada dominio de la proteína. La proteína FtsZ es un componente esencial del anillo septal para la división bacteriana. Este anillo, con estructura que presenta analogías al citoesqueleto eucariota, parece ser un componente universal para el mecanismo de división. Dado que Mycoplasma hominis tiene todas las características de la célula procariota mínima y algunos de los procesos de las bacterias con envoltura, es un modelo prometedor para el estudio de los principios básicos del proceso de división. En este periodo hemos iniciado el estudio de esta proteína en este microorganismo y en mutantes de origen clínico. Los logros esenciales en los dos últimos años han sido: 1.-Estudio de la distribución de cadenas de antígeno O durante el crecimiento exponencial e intracelular de Shigella flexneri, 2.- La caraterización topológica en la membrana para la proteína esencial FtsW implicada en división celular en Escherichia coli, 3.- Descripción de un nuevo integrón de Clase 1 (InS21) portador del gen de resistencia blaCTX-M-2 en Salmonella enterica Serovar Infantis. 4.Análisis por Resonancia de Plasma Superficial (SPR) de la interacción entre el antibiótico Moenomicina A con la PenicillinBinding Protein 1b de Escherichia coli, 5.Caracterización del gen ftsZ de Mycoplasma hominis y la variabilidad de secuencia en mutantes clínicos de Mycoplasma. Topología de FtsW en la membrana interna de Escherichia coli, derivada de la actividad AP y la resistencia a `-lactámicos de fusiones génicas. La secuencia aminoacídica se muestra con el código de una letra y rodeadas por círculos, cuadrados o rombos. Se muestran las posiciones conservadas en al menos 60% (cuadrados) o en mas de 90% (rombos) de los homólogos a FtsW. Las posiciones de las fusiones PhoA y Bla están colocadas en el modelo (caracteres blancos) de acuerdo con la actividad AP o resistencia a Bla, con fondo oscuro (activas o resistentes) o fondo gris (inactivas o sensibles). Los residuos conservados entre las secuencias de FtsW de E. coli y S. pneumonia están resaltados por una línea gruesa y fondo blanco. PER, periplasma. CM, membrana citoplásmica, CYT, citoplasma. Membrane topology model of FtsW from Escherichia coli derived from AP activity and `-lactam resistance of fusion proteins. The primary amino acid sequence is given in the single-letter code and in black characters surrounded by a circle, a square or a diamond. Conserved position in at least 60% (squares) or in more than 90% (diamonds) of the FtsW homologues are indicated. The positions of the PhoA and BlaM fusions are superimposed to the model (in white characters) according to the AP activity or Bla resistance as black (active or resistant) or grey (inactive or sensitive) background. Conserved residues among the sequence of FtsW from E. coli and S. pneumonia are highlighted by a bold line and white background. PER, periplasm. CM, cytoplasmic membrane, CYT, cytoplasm. 108 Bacterial cell division and antibiotics resistance Publicaciones/Publications: Research summary The objectives of our group is the analysis under diverse molecular approaches of the bacterial growth and cell division, and to study the mechanisms of resistance to the `-lactam antibiotics, that have been developed by pathogens of clinical origin. Most of the gene coding for the enzymes involved on cell division processes are grouped in the dcw cluster (division and Lateral peptidoglycan during cell elongation is synthesized mainly by the Varela, G., Schelotto, F., diConza, J., Ayala, J. A. (2001) Analysis of the O-antigen chain length distribution during penicillin-binding protein PBP1b. This protein holds the transpeptidase activity (crosslinking) in the C-terminal domain, and the transglycosylase activity (chain elongation) in the N-terminal domain. In exponential and intracellular growth of Shigella flexneri. spite of the big effort of several groups to crystallize and to determine the 3D structure of this protein, there are no FtsW. FEMS Microbiology Letters 216, 23-32 Microbial Pathogenesis 31, 21-27 Lara, B., Ayala, J.A. (2002) Topological characterization of the essential Escherichia coli cell division protein Stembera, K., Buchynskyy, A., Vogel, S., Knoll, D., Osman, positive results. However, we have advanced on the knowledge of the A. A., Ayala, J.A., Welzel, P. (2002) Moenomycin-mediated interaction with the transglycosylase- the genes pbpB, ftsW and ftsZ. The study of functional characterization of the FtsW protein has been developed during this ChemBioChem. 3, 332-340 inhibitor antibiotic moenomycin and the functionality of each domain of the protein. Di Conza, J., Ayala, J.A., Power, P., Mollerach, M., period. The FtsZ protein is an essential component of the bacterial cell division Gutkind, G. (2002) Novel Class 1 integron (InS21) carrying ring. This cytoskeleton-like ring is believed to be the universal way of bacterial Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46, 2257-2261 cell wall), highly conserved during evolution and including, among others, The molecular mechanisms that have been developed by pathogens are very complex, including, horizontal affinity purification of penicillin-binding protein 1b. the blaCTX-M-2 in Salmonella enterica Serovar Infantis. division. Mycoplasma hominis possesses Stembera, K., Vogel, S., Buchynskyy, A., Ayala, J.A., transmission of resistance determinants, all features of the minimal cell and some Welzel, P. (2002) A Surface Plasmon Resonance Analysis change of membrane permeability and traits of cell-wall bacteria and seems to of the Interaction between the Antibiotic Moenomycin A expression of efflux pumps. In this period we have characterize a new `-lactamase (CTX-M-2) transmissible by a new be a promising object for study of basic principles of the bacterial division process. 559-565 integron InS21, and also the influence of O-antigen length on virulence of Shigella flexneri. We are also characterizing the outer membrane proteins in clinical isolate of Pseudomonas aeruginosa. After the complexion of the Salmonella Typhi genome sequence, it has become apparent that some paralogous PBP genes have not been identified previously by the biochemical methods. Two of these genes code for chromosomal pbpA and pbpB paralogues, which are not present in Escherichia coli. We are analyzing these proteins from the genetic, enzymatic and physiological point of view, and we have found evidence for involvement on the cellular invasion and proliferation processes. In this period we have started the analysis of this protein in this model microorganism, and variant forms of clinical origin. Our main achievements in the last two years were: 1.- O-antigen chain length distribution during exponential and intracellular growth of Shigella flexneri, 2.- Topological characterization of the essential Escherichia coli cell division protein FtsW, 3.- Description of a novel Class 1 integron (InS21) carrying the blaCTX-M-2 in Salmonella enterica Serovar Infantis, 4.- Surface Plasmon Resonance analysis of the interaction between the antibiotic moenomycin A with Penicillin-Binding Protein 1b of Escherichia coli, and 5.- Characterization of the Mycoplasma hominis ftsZ gene and its sequence variability in the Mycoplasma clinical isolates. 109 with Penicillin-Binding Protein 1b. ChemBioChem. 3, Momynaliev, K. T., Smirnova, O. V., Lazyrev, V. N., Akopian, T. A., Chelysheva, V. V., Ayala, J.A., Simankova, A. N., Borchsenius, S. N., Govorun, V. M. (2002) Characterization of the Mycoplasma hominis ftsZ Gene and Its Sequence Variability in the Mycoplasma Clinical Isolates..Biochem. Biophys. Research Comm. 293, 155-162 Di Conza, J., Mollerach, M., Ayala, J.A., Gutkind, G. (2002) Estudio de integrones clase 1 en Salmonella aisladas en Santa Fe, Argentina. Revista FABICIB 6, 163-169 Regulación de la expresión génica Regulation of gene expression E.5 Biotecnología y genética de bacterias termófilas extremas Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: José Berenguer e-mail: [email protected] Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Jasminka Boskovic Celia Perales Becarios Predoctorales / Graduate Students: Cristina Vallés Pablo Castán Renata Moreno Felipe Cava Olga Zafra Eddy Caro Emilio Blas Técnico de Investigación / Technical Assistance: Margarita Sánchez pesar de ser exportada al periplasma (C. Nuestro grupo utiliza aislados del género Vallés, Tesis Doctoral). En el segundo aspecto, hemos demostrado que la Thermus como organismo termófilo modelo, tanto para estudios de carácter básico acerca de su biología, como en su vertiente maduración y unión a la membrana de las subunidades mayores de la nitrato reductasa respiratoria requiere la presencia de un más aplicada para su utilización como "factoría celular" para la producción de enzimas termoestables. A nivel básico, los citocromo C periplásmico en T. thermophilus. objetivos fundamentales en los dos últimos años han sido el análisis de la regulación empleado por primera vez en termófilos extremos dos genes trazadores, codificantes transcripcional y traduccional del componente mayoritario de la capa proteica cristalina (capaS) que envuelve a esta de una `-galactosidasa y una fosfatasa bacteria, y la caracterización de las enzimas implicadas en la respiración anaeróbica de nitrato. En el primer aspecto, hemos una enzima periplásmica que utiliza el recientemente descrito sistema de demostrado la existencia de un espacio periplásmico en Thermus a través del aislamiento de mutantes de deleción de la región 5'UTR (transcrita pero no traducida) del gen de la capa S(slpA), y hemos para su secreción en E. coli. Adicionalmente, hemos empleado el promotor de la nitrato reductasa respiratoria para la construcción de los primeros analizado in vivo la función de SlrA, una proteína que ejerce una fuerte actividad Thermus, utilizándolos para demostrar in vivo la termoestabilidad de una ribozima del parásito Schistosoma mansoni. represora sobre la transcripción de slpA, a A nivel aplicado, hemos descrito y alcalina (AP), ambas con óptimos de actividad en torno a los 80 ºC. La AP es transporte Tat (Twin Arginine Transporter) vectores de expresión controlada en Termoestabilidad in vivo de la ribozima SM_1 de Schistosoma mansoni. En regiones repetitivas del genoma de S. mansoni (A) se encuentra codificada una ribozima (SM_1) capaz de producir la ruptura (en trans) de un RNA blanco (Syn) y la suya propia (en cis) (B). Ambos genes fueron clonados en T. thermophilus en direcciones opuestas, bajo el control de un promotor inducible (Pnar) y otro constitutivo (Ps), respectivamente (C). Tras la inducción de Pnar se analizó la actividad en cis y en trans de la ribozima a distintas temperaturas (50-80 ºC) mediante Northern blot (D) con sondas contra el RNA blanco (Osyn) y la ribozima (Orib1 y Orib2). Nótese como ambas actividades máximas tienen lugar a 70 ºC. In vivo thermostability of the ribozyme SM_1 from Schistosoma mansoni. Within the repetitive DNA sequences of Schistosoma mansoni (A) a ribozyme (SM_1) is encoded, which is able to catalyze its self-cleavage (in cis) and the cleavage (in trans) of a target RNA (Syn) (B). Both genes were cloned divergently in T. thermophilus HB8 under the control of inducible (Pnar) and constitutive (Ps) promoters, respectively (C). After induction of Pnar, cis and trans activities were analyzed by Northern blot at different temperatures (50-80 ºC), with specific probes against the target RNA (Osyn) and the ribozyme (Orib1 y Orib2). Note how both activities reached their maximum at 70 ºC. 110 Biotechnology and genetics of extreme thermophilic bacteria Research summary Our research group uses isolates belonging to the genus Thermus as models of thermophilic microorganisms, both for basic research on their biology , and, from an applied point of view, for their use as "cell factories" to produce thermostable enzymes. At the basic research level, the main objectives during the last two years have been the analysis of the transcriptional and traductional regulation of the main component of the crystalline protein layer (S-layer) that surrounds this bacteria, and the characterization of the enzymes implicated on the anaerobic respiration of nitrate. On the first topic, we have demonstrated the existence of a periplasmic space in Thermus through the isolation of mutants in which the 5'UTR (untranslated region) region of the S-layer gene (slpA) was deleted. We also have analyzed in vivo the function of SlrA, a Publicaciones/Publications: transcription of slpA, despite being Sanchez, M., Vicente, M. F., Cercenado, E., de Pedro, secreted to the periplasm (C. Vallés, PhD. Thesis). On the nitrate respiration topic, we have demonstrated that the maturation M. A., Gomez, P,, Moreno, R., Morón, R., Berenguer, J. and membrane binding of the major dependent way to reach high levels of penicillin resistance. subunit of the respiratory nitrate reductase requires the presence of a periplasmic Int. Microbiol. 4, 217-222 cytochrome C in T. thermophilus. Castán, P., de Pedro, M. A., Risco, C., Vallés, C., (2001) Diversity among clinical isolates of penicillinresistant Streptococcus mitis: indication for a PBP1- Fernández-Herrero, L. A., Schwarz, H., Berenguer, J. At the applied level, we have described and used for the first time in extreme thermophiles two gene reporters, coding for a `-galactosidase and a alkaline phosphatase (AP), both with optimum activities around 80 ºC. Interestingly, the (2001) Multiple Regulatory Mechanisms Act on the 5’ periplasmic AP uses the recently described Tat (twin arginine transporter) system for its secretion in E. coli. In addition, we have used the promoter of the respiratory nitrate reductase to Thermus thermophilus alkaline phosphatase via the twin- construct the firsts vectors for the controlled expression in Thermus, using them to demonstrate in vivo the thermostability of a ribozyme from the parasite Schistosoma mansoni. protein which strongly repress the Untranslated Region of the S-layer Gene from Thermus thermophilus HB8. J. Bacteriol. 183, 1491-1494 Angelini, S., Moreno, R., Gouffi, K., Santini, C-L., Yamagishi, A., Berenguer, J., Wu, L-F. (2001) Export of arginine translocation pathway in Escherichia coli. FEBS Letters 506, 103-107 Vázquez-Tello A., Castán, P., Moreno, R., Smith, J. M., Berenguer, J., Cedergren, R. (2002) Efficient transcleavage by the Schistosoma mansoni SM_1 hammerhed ribozyme in the extreme thermophile Thermus thermophilus. Nucleic Acid Research 30, 1606-1612 Castán, P., Zafra, O., Moreno, R., de Pedro, M. A., Vallés, C., Cava, F., Caro, E. A., Schwarz, H., Berenguer, J. (2002) The periplasmic space in Thermus thermophilus: evidences from a regulation-defective S-layer mutant overexpressing an alkaline phosphatase. Extremophiles 6, 225-232 Zafra, O., Ramírez, S., Castán, P., Moreno, R., Cava, F., Vallés, C., Caro, E., Berenguer, J. (2002) A cytochrome c encoded by the nar operon is required for the synthesis of active respiratory nitrate reductase in Thermus thermophilus FEBS Letters 523,99-102 Vallés, C., Castán, P., Berenguer, J. (2002) Microorganismos termófilos y sus aplicaciones. Colección "Becas de Investigación" . Ed: Obra Social y Cultural de Caja Segovia. I.S.B.N.: 84-89711-91-7 Patentes / Patents Zafra, O., Moreno, R., Berenguer, J. (2001) Proceso de obtención y purificación de una fosfatasa alcalina recombinante altamente termoestable. OEPM: 200100725 Corte fino de células del mutante 6UTRslpA de Thermus thermophilus HB8. Obsérvese la existencia de una envoltura externa común a un grupo de 14 células. La barra corresponde a 0,5 µm. Moreno, R., Zafra, O., Berenguer, J. (2001) Vector Thin section of cells from the 6UTRslpA mutant of Thermus thermophilus HB8. Note the presence of a common external envelope surrounding a group of 14 cells. Bar corresponds to 0,5 µm. Tesis Doctorales / Doctoral Theses plasmídico para la expresión controlada de proteínas en bacterias termófilas extremas genéticamente modificadas. OEPM: 200101224. Cristina Vallés. 2002. “Caracterización funcional de la proteína SlrA de Thermus thermophilus HB8”. Universidad Autónoma de Madrid. 111 Regulación de la expresión génica Regulation of gene expression E.6 Mantenimiento y variabilidad del genoma: enzimología de la reparacion del DNA Resumen de Investigación Estamos llevando a cabo un análisis Hemos identificado dos nuevas DNA estructura-función de la fidelidad de síntesis y de la capacidad de dislocación de ambos polimerasas eucarióticas, denominadas Pol h (32% de identidad de aminoácidos enzimas. En el caso de la Pol h humana, se intentará correlacionar diferencias de Personal Científico / Scientific Staff: con la Pol ß) y Pol µ (42% de identidad de fidelidad con la expresión preferencial de Antonio Rodríguez Fernández de aminoácidos con TdT). En una primera fase hemos determinado sus principales actividades enzimáticas: polimerización de una variante alélica en muestras de tumores. Varias isoformas de Pol h, expresadas específicamente o más abundantemente DNA y actividad dRP liasa (Pol h); polimerización de DNA y actividad transferasa terminal (Pol µ). Nuestros datos muestran el potencial enzimático de Pol h para participar en la reparación de daño en muestras de tumores podrían reparación de DNA, estudiando la respuesta Miguel García Díaz oxidativo en el DNA por un mecanismo de excisión de base (“base excision repair”, ó BER), uno de los procesos más frecuentes de reparación, que elimina bases modificadas y sitios abásicos. Por otro lado, Raquel Juárez Santos las propiedades de la Pol µ son idóneas dominio BRCT presente en ambos enzimas para ser el enzima implicado en la reparación de dobles roturas de cadena de DNA que son procesadas por un mediante análisis de dos híbridos de levadura. Finalmente, se analizarán los modelos murinos (knock-out) deficientes mecanismo de reunión de extremos no en Pol h y Pol µ que hemos generado en colaboración con otros grupos de Jefe de Línea / Group Leader: Luis Blanco e-mail: [email protected] Henestrosa Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Tomas Kirchhoff Rosario Sabariegos Jareño Esther García Palomero Sergio González Barrera Becarios Predoctorales / Graduate Students: José Ruiz Pérez Estudiantes / Undergraduate Students: Angel Picher Serantes Gloria Terrados Aguado homólogos (NHEJ). representan variantes “mutadoras” del enzima que pudieran contribuir al proceso de tumorogénesis. Se intentará demostrar la participación de Pol h y Pol µ en a diversos tipos de daño en el DNA de líneas celulares sobreproductoras de Pol h (ambos alelos) o de Pol µ. Se buscarán interacciones específicas a través del investigación nacionales e internacionales. Funciones propuestas para la Pol µ, en base a los datos de expresión (hipermutación somática y recombinación VDJ) y en la capacidad del enzima para alinear cadenas de DNA parcialmente complementarias (reparación de dobles roturas de cadena de DNA vía NHEJ). Functions proposed for Pol µ, based on data derived from expression (somatic hypermutation and VDJ recombination) and the ability of the enzyme to align partially complementary DNA strands (double-stranded DNA repair through NHEJ). 112 Genome maintenance and variability: enzymology of DNA repair Research summary We have identified two novel eukaryotic DNA polymerases, named Pol h, (32% amino acid identity with Pol ß) and Pol µ (42% amino acid identity with TdT). In a preliminar characterization, we described their main enzymatic activities: DNA polymerization and dRP lyase (Pol h); DNA polymerization and terminal transferase (Pol µ). Our data demonstrate the enzimatic potential of Pol h to participate in the repair of oxidative damage by a mechanism named base excision repair (BER), a very active pathway that deals with modified bases and abasic sites. On the other hand, the peculiar properties of Pol µ make this enzyme the most suitable candidate to repair double strand breaks (DSBs) by a mechanism referred to as nonhomologous end-joining (NHEJ). Publicaciones/Publications: We are carrying out a structure-function Ruiz, J.F., Dominguez, O., Lain de Lera, T., García-Diaz, analysis of the intrinsic fidelity and dislocation capacity of both enzymes. For M., Bernad, A., Blanco, L.(2001) DNA polymerase mu, human Pol h, fidelity differences that could B. Biol. Sci. 356, 99-109 imply a mutator phenotype will be correlated with allelic variants preferentially expressed in tumoral samples. Various García, M., Bebenek, K., Kunkel, T., Blanco, L. (2001) a candidate hypermutase? Philos. Trans. R. Soc. Lond. Identification of an intrinsic dRP lyase activity in human Pol h isoforms, specifically and/or abundantly expressed in tumoral samples could be “mutator variants” with an implication in tumorogenesis. The involvement of Pol h in a base excission DNA polymerase lambda: a possible role in base excision repair (BER) mechanism to relieve oxidative damage in DNA, and the nomenclature. J. Biol. Chem. 276, 43487-43490 involvement of Pol µ in double-strand break repair via NHEJ will be studied by testing damage responsiveness of cell lines overproducing Pol h (each of both Taladriz, S., Hanke, T., Ramiro, M.J., García-Diaz, M., allelic variants) or Pol µ. Specific Nucleic Acids Res. 29, 3822-34 interactions, proposed to occur through the BRCT domain present in both García-Díaz, M., Bebenek, K., Sabariegos, R., repair. J. Biol. Chem. 276, 34659-34663 Burgers, P.M.J., Koonin, E. V., Blanco, L. et al. (2001) Eukaryotic DNA polymerases: proposal for a revised García De Lacoba, M., Blanco, L., Larraga, V.. (2001) Nuclear DNA polymerase beta from Leishmania infantum. Cloning, molecular analysis and developmental regulation. enzymes, will be studied by yeast twohybrid analysis. Finally, murine KO models Domínguez, O., Rodríguez, J., Kirchhoff, T., García- of Pol h and Pol µ deficiency, generated T.A., Blanco, L. (2002) DNA Polymerase Lambda, a in collaboration with other research laboratories, will be studied. Novel DNA Repair Enzyme in Human Cells. J. Biol. Palomero, E., Picher, A.J., Juárez, R., Ruiz, J.F., Kunkel, Chem. 277, 13184-13191 Truniger, V., Lázaro, J.M., Blanco, L., Salas, M. (2002) A highly conserved lysine residue in phi29 DNA polymerase is important for correct binding of the templating nucleotide during initiation of phi29 DNA replication. J. Mol. Biol. 318, 83-96 Duvauchelle, J.-B., Blanco, L., Fuchs, R. P. P., Cordonnier, A. M. (2002) Human DNA polymerase mu (Pol µ) exhibits an unusual replication slippage ability at AAF lesion. Nucleic Acids Res. 30, 2061-2067 Truniger, V., Lázaro, J.M., Esteban, F.J., Blanco, L., Salas, M. (2002) A positively charged residue of phi29 DNA polymerase, highly conserved in DNA polymerases from families A and B, is involved in binding the incoming nucleotide. Nucleic Acids Res. 30, 1483-1492 Maga, G., Villani, G., Ramadan, K., Shevelev, I., Tanguy Le Gac, N., Blanco, L., Blanca, G., Spadari, S., Hübscher, U. (2002) Human DNA polymerase lambda functionally and physically interacts with proliferating cell nuclear antigen in normal and translesion DNA synthesis. J. Biol. Chem. 277, 48434-48440 Representación del sitio activo de polimerización de la Pol ß humana, en la que se indican una serie de residuos implicados en la catálisis y fidelidad de inserción del nucleótido entrante (en amarillo), en base a la complementariedad con un nucleótido molde (en verde). Los residuos coloreados en marrón son invariantes entre Pol ß y Pol h. La falta de conservación de Lys280, Asp276 y Ala185 sugiere importantes diferencias entre la Pol ß y la Pol h. La figura ha sido realizada con los programas GRASP, MOLSCRIPT y RASTER3D, utilizando el fichero 1BPY del banco de datos PDB. The active polymerization site of human Pol ß, indicating the sites involved in catalysis and incoming nucleotide insertion fidelity (yellow), based on the complementarity with a template nucleotide (green). Brown-colored residues are invariant in Pol ß and Pol h. The lack of conservation in Lys280, Asp276 and Ala185 suggests important differences between Pol ß and Pol h. The figure has been prepared using GRASP, MOLSCRIPT and RASTER3D software, using the 1BPY file and the PDB database. 113 Regulación de la expresión génica Regulation of gene expression E.7 Regulación de la expresión génica específica de tejido Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: José Luis Castrillo Díez e-mail: [email protected] Becarios Predoctorales / Graduate Students: Silvia Avila Flores Olga Bassy Alvarez Job García Liévana Juan Ignacio Imbaud Angelina Rodríguez Torres Técnico de Investigación / Technical Assistance: restricción de expresión específica de tejido, así como la purificación de los factores de El objetivo general de nuestra línea de investigación es el estudio a nivel molecular de la expresión génica específica de tejido transcripción que las regulan. en células humanas. Nuestro sistema modelo principal lo constituye el gen línea de investigación, es la puesta a punto de técnicas de análisis de expresión humano HGH-N que se transcribe específicamente en la hipófisis anterior y que se localiza en el cromosoma 17q23.3 diferencial de mRNAs: "Differential Display RT-PCR" y DNA Microarrays" que nos ha permitido establecer dos nuevos objetivos: dentro del locus "HGH-HPL". A este locus pertenecen genes que comparten una gran homología de secuencia pero que se (1) Identificación y clonaje de genes específicamente expresados en tumores transcriben en tejido placentario: HGH-V, Otra área de desarrollo dentro de nuestra hipofisarios humanos, que nos permitirán profundizar en los mecanismos moleculares de expresión génica hipofisaria, así como en el desarrollo de nuevos marcadores de progresión tumoral hipofisaria. Estela Bastos HPL-3 y HPL-4. Asimismo, hemos iniciado el estudio de los mecanismos de restricción especifica de tejido de otro locus génico humano: "HLH-HCG", localizado en el cromosoma 19q13.3 y que también (ICETA-UTAD, Portugal) presenta un patrón de expresión tisular (2) Identificación y caracterización de genes Ivan Delgado semejante: hipófisis vs placenta. Para ello se están analizando las regiones promotoras y enhancers de estos genes, específicamente expresados en tejido endometrial humano durante la "ventana" de implantación, para clonar nuevos genes marcadores de implantación embrionaria. Enrique Martín-Francés Científicos Visitantes / Visiting Scientists: (UANL, México) identificando los elementos que confieren Microscopía Confocal del Factor de Transcripción GHF1/Pit1 (verde) y de la Hormona de Crecimiento hGH (rojo), en células hipofisarias. Confocal Microscopy of GHF1/Pit1 transcripción factor (green) and growth hormone GH (red), in pituitary cells. 114 Regulation of the tissue-specific gene expression Publicaciones/Publications: Research summary The overall goal of this project is to study at molecular level the tissue-specific gene expression in human cells. Our working model is the human growth hormone gene (HGH-N) specifically transcribed in the anterior pituitary and mapped at A new area of research and development Martin, J., Avila, S., Jiménez, O., Pellicer, A., Castrillo, in our laboratory, is to set-up new approaches to study differential expression of mRNAs: DD-RTPCR and J.L., Simon, C. (2001) Detection of novel genes DNA Microarrays techniques. We are involved in two new goals: associated to high versus low endometrial receptivity status. J. Soc. Gynecol. Invest. 8,115-118 Avila, S., Castrillo, J.L. (2002) Terapia Génica. In: Hernandez, E., Simon, C. (ed.) Biología Molecular (1) Identification and cloning of genes specifically expressed in human pituitary tumours. This approach can lead us to improve our understanding of pituitary gene-expression control, and use this en Medicina Reproductiva. FIVIER Press, España, knowledge to develop new therapeutic agents. Receptivity: Gene Regulation. J. Rep. Immunol. 55, HCG" locus, located at chromosome 19q13.3, and also expressed in pituitary (2) Identification of genes diferentially expressed in receptive versus non- Tesis Doctorales / Doctoral Theses or placenta tissues. We are analyzing the promotor and enhancer regions, receptive human endometrium. Using two cell lines with extreme receptive phenotype and screening genome-wide Marina Romero Prado. 2002. “Mecanismos de regulación gene expression using DNA Microarrays and DD-RTPCR, we are finding new genes involved in the receptive or non- V): efectos de la glucosa y estados de metilación del chromosome 17q23.3 in the "HGH-HPL" locus. This is a gene-cluster with other four closely related genes (HGH-V, HPL3 y HPL-4), but specifically transcribed in placenta tissue. In addition, we started the study of the tissue-specific transcriptional control of the human "HLH- identifying the cis-DNA elements, and cloning the transcription factors involved in the tissue-specific transcriptional control. pp 200-210 Martín, J., Domínguez, F., Avila, S., Castrillo, J.L., Remohí, J., Pellicer, A. Simon, C. (2002) Human Endometrial 131-139 transcripcional de los genes humanos de las hormonas de crecimiento hipofisaria (hGH-N) y placentaria (hGH- DNA sobre su expresión”. Universidad Autónoma de Madrid. receptive status. This approach can lead us to improve our understanding of endometrial receptivity and use this knowledge to optimize it in infertility Martha Y. Díaz Gallardo. 2002. “Identificación de proteínas coactivadoras del factor transcripcional PIT1/GHF1”. Universidad Autónoma de Madrid. patients or to alter it as an interceptive procedure. Otras Actividades / Other Activities ORGANIZACIÓN CURSOS ESPECIALIZACIÓN CSIC: "Cursos Prácticos de Regulación Transcripcional y Expresión Génica": Septiembre-2001 y 2002. Differential Display (DD-RTPCR) gel. Differential Display (DD-RTPCR) gel. 115 Regulación de la expresión génica Regulation of gene expression E.8 Estructura y función del ribosoma Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Juan Pedro García Ballesta e-mail: [email protected] Personal Científico / Scientific Staff: Miguel Remacha Antonio Jiménez Díaz Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Cruz Santos Gretel Nusspaumer Sonia Zúñiga Becarios Predoctorales / Graduate Students: Pilar Parada Patricia González Santamaría Jorge Pérez Fernández De-yi Qiu Alberto García Marcos Verónica Briceño Estudiantes / Undergraduate Students: Arancha Sánchez Ruben Hervás Técnicos de Investigación / Technical Assistance: Mari Carmen Fernández Moyano, Rebeca Galisteo Juan Luis Alberruche Científicos Visitantes / Visiting Scientists: Prof. David Jameson, Dept. Biología Molecular, Universidad de Hawaii, USA Dra. Sophia Kouyanou, Dept. Biología, Universidad de Atenas, Grecia Prof. Wanxiang Xu, Fudan University, Shanghai, R.P. China B) Síntesis y ensamblaje del tallo Regulación de la traducción en células eucarióticas. Papel del tallo ribosómico ribosómico. La acumulación de los componentes del tallo está regulada por degradación por un sistema diferente al Nuestros estudios previos indican que el tallo ribosómico puede regular la traducción proteasoma y la vacuola. Se está abordando el estudio de este desconocido sistema degradativo caracterizando las eucariótica. Este nuevo mecanismo de control de la expresión génica puede jugar un papel clave en la traducción de proteínas señales de degradación e intentando identificar las proteasas implicadas. relacionadas con determinadas condiciones de estrés. El objetivo último de nuestro trabajo es aclarar este mecanismo de C) Identificación de mRNAs cuya traducción responde a alteraciones del tallo ribosómico. Se obtendrá información de la comparación regulación usando como modelo del “transcriptoma” y del “traductoma” Saccharomyces cerevisiae, cuyo tallo ribosómico esta constituido por las proteínas P0, P1_, P1`, P2_, P2` y L12. Como objetivos inmediatos nos proponemos: (mRNas en polisomas) de mutantes con alteraciones en el tallo ribosómico. Igualmente se identificarán mediante microarrays los mRNAs asociados a A) Caracterizar las interacciones entre los distintos componentes del tallo y de éste polisomas en ensayos de traducción in vitro derivados de los mismos mutantes. Se caracterizarán elementos en cis y en trans con los factores solubles de la síntesis de proteínas, en especial del factor EF-2. Se aplican técnicas de “doble híbrido”, puenteo que afecta su traducción preferente. químico, etiquetado de proteínas con la sordarina afectan directamente la función del tallo ribosómico. Se están identificando genes que afectan a la actividad inhibidora diferentes marcadores, incluyendo la GFP. La técnica “Fluorescence Correlation Spectroscopy” (FCS) utilizando un microscopio de fluorescencia de dos fotones nos permite estudiar estas interacciones en el interior de la célula (Colaboración con Dr. E. Gratton). Aumento de la fluorescencia intrinseca de S. cerevisiae en un microscopio de fluorescencia de dos fotones 116 D) Compuestos antifúngicos derivados de y que pueden relacionarse con la función ribosómica. Ribosome structure and function Publicaciones/Publications: Research summary Regulation of translation in eukaryotic cells. Role of the ribosomal stalk Our previous studies have indicated that the ribosomal stalk may regulate translation in eukaryotes. This new genetic expression control mechanism can play B) Synthesis and assembly of the ribosomal stalk. The cellular accumulation of stalk components is regulated by proteolysis through a system that is different from the proteasome and the vacuole. We are studying this unknown degradation pathway by characterizing the protein degradation signals and trying to identify the proteases involved in the Gómez, E. B., Medina, G., Ballesta, J. P. G., Levin, M.J., Téllez-Iñón, M.T. (2001) Acidic ribosomal P proteins are phosphorylated in Trypanosoma cruzi. Int. J. Parasitol. 31, 1032-1039 Guarinos, E., Remacha, M., Ballesta, J.P.G. (2001) Asymmetric interactions between the acidic P1 and P2 proteins in the Saccharomyces cerevisiae ribosomal stalk. J. Biol. Chem. 276, 32474-32479 a key role in the translation of proteins related to some stress conditions. The process. final objective of our project is to understand this regulatory mechanism using as a model Saccharomyces cerevisiae, whose stalk is formed by C) Identification of mRNAs whose stalk components in the resistance of Aspergillus translation is affected by ribosomal stalk alterations. Information will be gathered fumigatus to the sordarin antifungals. Mol. Microbiol. Santos, C., Ballesta, J.P.G. (2002) Role of the ribosomal L12. As short term objectives we intend: from comparison of the “transcriptome” and the “translatome” (mRNAs in polysomes) from mutants having stalk A) Characterizing the interactions between alterations. Similarly, mRNAs in polysomes from in vitro translation systems derived the different stalk components as well as from the same mutants are being identified between the stalk and the translation soluble factors, especially EF2. The two- using microarrays. Cis and trans acting factors, which affect these mRNAs hybrid method, chemical cross-linking, translation will be characterized. proteins P0, P1_, P1`, P2_, P2` and protein tagging using different tags, like GFP, are being used for in vitro studies. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and two-photon fluorescence microscopy are allowing us to study these interactions inside the cell (collaboration with Dr. E. Gratton). 43, 227-237 Lalioti, V.S., Pérez-Fernández, J., Remacha, M., Ballesta, J.p.g. (2002) Characterization of interaction sites in the Saccharomyces cerevisiae ribosomal stalk components. Mol. Microbiol. 46, 719-729 Lázaro, E., Sanz, E., Remacha, M., Ballesta, J.P.G. (2002) Characterization of sparsomycin resistance in Streptomyces sparsogenes. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 2914-2919 D) Antifungal sordarin derivatives directly affect the stalk function. New genes that affect the sordarin inhibitory activity, and consequently can be related to the stalk function, are being identified. Tesis Doctorales / Doctoral Theses Pilar Parada Valdecantos. 2001. “Estudios bioquímicos, biofísicos y celulares de la estructura del tallo ribosómico se Saccharomyces cerevisiae”. Patricia González Santamaría. 2002. “Rpn6 es una proteína esencial para mantener la estructura y actividad del proteasoma 26S de Saccharomyces cerevisiae”. 117 Regulación de la expresión génica Regulation of gene expression E.9 Síntesis de proteínas y su regulación en eucariontes Resumen de Investigación Jefes de Línea / Group Leaders: César de Haro, José M. Sierra e-mail: [email protected] Control de la traducción por las eIF-2_ quinasas (C. de Haro) Regulación del crecimiento y diferenciación celular durante el desarrollo embrionario a nivel de la unión del mRNA al ribosoma (J.M. Sierra) e-mail: [email protected] Becarios Predoctorales / Graduate Students: Natalia Pomar Damariz Rivero Mónica Elías Isabela Alonso Técnico de Investigación / Technical Assistance: José Alcalde Cuatro proteínas quinasas diferentes regulan la síntesis de proteínas en respuesta a varias situaciones de estrés. Estas son, el inhibidor regulado por hemina (HRI), la proteína kinasa inducible por interferón y activada por dsRNA (PKR), la quinasa asociada al retículo endoplásmico (PERK) y el GCN2. Clonamos el primer miembro de esta familia de embriones de Drosophila (Santoyo et al. JBC, 272, 12544-50, 1997). Ahora, hemos caracterizado la segunda eIF2_ quinasa de Drosophila, un homólogo de PERK (Pomar et al. EJB, 270, 293-306, 2003). La expresión de DPERK está regulada durante el desarrollo embrionario. También, hemos identificado el primer homólogo de GCN2 en mamíferos (MGCN2) (Berlanga et al. EJB, 265, 75462, 1999). Estudios recientes han demostrado que ratones desprovistos del gen Pkr, muestran una respuesta antiviral casi normal; lo cual sugiere la existencia de otra eIF2_ quinasa(s) que compense la pérdida de función de la PKR. Existe la posibilidad de que el MGCN2 juegue ese papel, por ello, estudiaremos la función y los mecanismos de control de MGCN2 en las células de mamífero. Estos estudios nos permitirán profundizar en la importancia de las eIF2_ quinasas y su papel en el control del crecimiento celular y la respuesta antiviral. 118 Las proteínas eIF (eukaryotic initiation factor) 4E, eIF4G, eIF4A y eIF4B forman parte de un complejo proteico implicado en el reconocimiento y unión del mRNA al ribosoma. Resultados previos de nuestro laboratorio permitieron el aislamiento y caracterización de estas proteínas a partir de embriones de Drosophila melanogaster, la clonación de los genes correspondientes, y el estudio de su expresión durante el desarrollo embrionario. Actualmente estamos interesados en encontrar evidencias que apoyen el papel de alguno de estos genes en la regulación del crecimiento y diferenciación celular durante el desarrollo. Para ello, disponemos de mutantes defectivos en alguno de estos genes así como moscas transgénicas que los sobreexpresan. También nos proponemos identificar mRNAs cuya traducción se active preferentemente en respuesta a un aumento en los niveles activos de estas proteínas. De esta manera esperamos identificar genes importantes en el crecimiento y proliferación celular cuya expresión esta regulada a nivel de la traducción. Protein synthesis and its regulation in eukaryotes Publicaciones/Publications: Research Summary Translational control by eIF-2_ kinases Regulation of cell growth and differentiation during embryonic development at the level of mRNA (C. de Haro) binding to the ribosome (J.M. Sierra) Four distinct eIF2_ kinases regulate The proteins eIF (eukaryotic initiation protein synthesis in response to various environmental stresses. These are the hemin-regulated inhibitor (HRI), the factor) 4E, eIF4G, eIF4A y eIF4B are part of a protein complex involved in the recognition and binding of the mRNA to interferon-inducible dsRNA-dependent the ribosome. Previous results from our laboratory led to the isolation and characterization of these proteins from Tesis Doctorales / Doctoral Theses Natalia Pomar Ballestero. 2001. “Regulación de la iniciación de la traducción en Drosophila melanogaster: Caracterización del factor eIF2B y de una nueva eIF2_ kinase (PKR), the endoplasmic reticulumresident kinase (PERK) and the GCN2 quinasa”. Universidad Autónoma de Madrid. Simposios Organizados / Organized Symposia César de Haro protein kinase. We found the first member of this family, from Drosophila melanogaster embryos (Santoyo et al. Drosophila melanogaster embryos, the Co-organizer: “Translational Control in Development and cloning of the corresponding genes, and the study of their expression during Neurobiology”, a joint Serono Foundation- EMBO JBC, 272, 12544-50. 1997). Recently, we have characterized the second eIF2_ kinase found in Drosophila, a PERK embryonic development. At present, we are interested to find evidences supporting the role of some of these genes in the homologue (Pomar et al. EJB, 270, 293306, 2003). Expression of DPERK is developmentally regulated. We also found regulation of cell growth and differentiation during development. To this end, we have mutants lacking some of these genes as the first mammalian GCN2 homologue (MGCN2) (Berlanga et al. EJB, 265, 754- well as transgenic flies overexpressing 62, 1999). Recent studies demonstrated whose translation is preferentially that mice lacking Pkr, show a nearly normal antiviral response after interferon treatment, suggesting the existence of increased in response to a rise in the them. We also intend to identify mRNAs active levels of these proteins. In this way we hope to identify critical genes in cell another eIF2_ kinase(s) that must growth and differentiation whose compensate for loss of PKR function. It is a possibility that the function of MGCN2 expression is regulated at the translational level. could explain some of the open questions raised by these findings. Thus, we will try to understand the function and the mechanisms of control of MGCN2. These studies would allow further elucidation of the importance of eIF2_ kinases and their role in control of cell growth and anti-viral response. 119 Workshop, Palma de Mallorca, 2002. Regulación de la expresión génica Regulation of gene expression E.10 Expresión génica en levaduras y streptomyces Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Antonio Jiménez Se han obtenido levaduras industriales e-mail: [email protected] amilolíticas que contienen DNA derivado exclusivamente de levaduras. La Personal Científico / Scientific Staff: transformación se realizó mediante una estrategia integrativa dirigida a una región María Fernández-Lobato (responsable de laboratorio) Investigador Visitante / adyacente al locus ILV2, determinante de resistencia a sulfometuron. El estudio llevado a cabo sobre la regulación de la expresión un polipéptido altamente hidrofóbico (SCR1) con 14 dominios transmembrana, que presenta una alta homología de secuencia con proteínas de levaduras pertenecientes a la familia MDR, que confieren resistencia a diferentes antifúngicos. Sin embargo, SCR1 confiere resistencia únicamente a cyh y no a agentes como el benomilo o el metotrexato. Se propone un nuevo del gen SWA2 de Schwanniomyces occidentalis en Saccharomyces cerevisiae ha permitido localizar las secuencias mecanismo de resistencia ribosomal donde los ribosomas de las levaduras que expresan SCR1 podrían sufrir un cambio conformacional durante el transporte desde Postdoctoral Fellows: promotoras de este gen, ubicadas entre las posiciones -223 y +15, implicadas en el núcleo al citoplasma que mermaría el efecto del antibiótico. Eloísa Sanz Martínez repression catabólica, activación por etanol Irene Saugar y modulación por cAMP. Becarios Predoctorales / Se ha aislado y estudiado el repressor Graduate Students: catabólico SoMIG1 de la levadura Schwanniomyces occidentalis. El gen codificaría para una hipotética proteína de caracterización de la ruta de biosíntesis del antibiótico puromicina en el organismo 458 aminoácidos que muestra una alta estudio del cluster ata de la ruta de biosíntesis del antibiótico A201A. Éste es un aminonucleósido similar a puromicina. Visiting Researcher: María Josefa Elena Fernández-Fernández Postdoctorales / Dolores Marín Alberdi María Blanca Sánchez Martínez Patricia Barrado Guerrero Laura Martínez Fernández Yáñez María José Rodríguez Benito Sara Mesa García. homología de secuencia con los homólogos a Mig1 y CreA descritos en distintos organismos. El dominio de unión al DNA y el efector de las proteínas de Schw. En relación a Streptomycetes, se ha continuado el análisis de varios pasos enzimáticos para completar la productor. También se ha continuado el Technical Assistance: occidentalis y S. cerevisiae presentan Su organismo productor (Streptomyces capreolus) no pudo ser transformado, por lo que no fue posible iniciar el análisis Asunción Martín Redondo identidades de un 71% y 15%, respectivamente. El gen SoMIG1 genético y bioquímico de este cluster. Sin embargo, se ha logrado integrar ata en Técnicos de Investigación / complementa la mutación mig1 de S. cerevisiae. Se ha estudiado el gen SCR1 de Schw occidentalis que induce resistencia a cicloheximida (cyh), a nivel ribosomal, en S. cerevisiae. El gen dirigiría la síntesis de 120 Streptomyces lividans lo que se espera permita el estudio de los genes y los enzimas implicados en la biosíntesis de A201A. Gene expression in yeast and streptomyces Publicaciones/Publications: Research summary to cyh but not to benomyl or metothrexate. Marin, D., Jiménez A., Fernández Lobato. M. (2001) Construction of an efficient amylolytic industrial yeast Amylolytic industrial yeast strain of So, these findings would disclose a novel ribosomal resistance mechanism where Saccharomyces cerevisiae contains DNA derived exclusively from yeast were the ribosomes of yeast cells expressing SCR1, would undergo a conformational FEMS Microbiol. Lett. 201, 249-253 obtained. Yeast transformation was carried change during transport from the nucleus Carmona, T. A., Barrado, P. Jiménez, A., Fernández out by an integrative process targeted to a dispensable upstream region of the ILV2 locus, which determines to the cytoplasm, which lowers their affinity for cyh-binding. Lobato, M. (2002) Molecular and functional analysis of sulfometuron resistance. Expression in S. cerevisiae of the SWA2 gene from Schwanniomyces occidentalis was Concerning Streptomycetes, the study of studied. Deletion analyses (-223 to +15) permitted the identification of different fragments involved in glucose repression, ethanol activation and cAMP regulation. continued in order to end its characterisation. strain containing DNA exclusively derived from yeast. a MIG1 homologue from the yeast Schwanniomyces occidentalis. Yeast 19, 459-465 a number of enzymatic steps of the puromycin biosynthetic pathway was Carmona, T. A., Jiménez, A., Fernández Lobato. M. (2002) Analysis of the Schwanniomyces occidentalis SWA2 gene promoter in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol. Lett. 207, 69-73 The study of the A201A biosynthetic gene (ata) cluster was also continued. This antibiotic contains, in addition to an Hoenicka, J., Fernández Lobato, M. Marín, D. Jiménez, aminonucleoside moiety identical to that which confers ribosomal resistance to cycloheximide. putative protein of 458 amino acid that of puromycin,.a polyketide and two Yeast 19, 735-743 showed a high homology with Mig1 and CreA analogues from different organisms. monosaccharide moieties. This complexity A glucose repressor MIG1-homologue (SoMIG1) was isolated from the yeast Schw. occidentalis. The gene encodes a A. (2002) The SCR1 gene from Schwanniomyces occidentalis encodes a highly hydrophobic polypeptide, is a stimulus to dig into its biosynthetic and genetic systems. However, Saugar, I., Sanz, E., Jiménez, A. (2002) Identification of The DNA binding and effector domains of this protein showed an identity of 71% transformation of Streptomyces capreolus, aminonucleoside moiety of antibiotic A201A from and 15%, respectively, to those of the Mig1 protein from S. cerevisiae. The SoMIG1 gene complemented a mig1 the producing organism, was not achieved. This handicap did not permitted to initiate a gene inactivation program in 5535 mutant of this yeast. order to isolate intermediates an characterise enzymatic steps. The SCR1 gene from Schw occidentalis Nevertheless, the whole ata cluster was that induce ribosomal resistance to isolated in the model Streptomyces lividans, which will most probably permit cycloheximide (cyh) in S. cerevisiae has been studied. It would encode a highly a straightforward study of these subjects. hydrophobic polypeptide (SCR1) with 14 transmembrane domains, highly similar to a variety of yeast proteins of the multidrug-resistance (MDR) family. However, SCR1 only conferred resistance 121 a set of genes involved in the biosynthesis of the Streptomyces capreolus. Eur. J. Biochem. 169, 5527- Regulación de la expresión génica Regulation of gene expression E.11 Iniciación interna de la traducción en mRNAs eucarióticos Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Encarnación Martínez-Salas e-mail: [email protected] Postdoctorales / Postdoctoral Fellows: Ricardo Ramos Ruiz Sonia López de Quinto Sandrine Reigadas Becarios Predoctorales / Graduate Students: Olga Fernández Miragall Almudena Pacheco García Paula Serrano Pérez-Nievas Personal Técnico / Technical Assistance: Emilio Cano Cabezas Jorge Ramajo Alonso Científicos Visitantes / Visiting Scientists: Jordi Gómez Castilla H. Vall d´Hebrón, Barcelona La iniciación de la traducción de mRNAs para la actividad del IRES. La interacción de eIF4B es más fuerte que la de eIF4G aunque accesoria. Sin embargo, ni eIF4G eucarióticos que codifican proteínas necesarias en etapas en las que la iniciación dependiente de cap está inhibida (apoptosis, infecciones virales, etc.) está dirigida por ni eIF4B interaccionan con el IRES de HCV. La diversidad de interacciones RNA-proteína observada en distintos IRES no permite elementos IRES (sitios de entrada interna del ribosoma). La comparación de IRES muestra gran diversidad de secuencias y todos ellos (Figura 1). El desciframiento de la estructura terciaria del IRES, todavía estructuras secundarias del RNA. Nuestro grupo se ha centrado en el estudio de regiones estructurales del IRES del virus establecer un modo de acción común a desconocida, es uno de los requisitos necesarios para entender el mecanismo de iniciación interna de la traducción. Con este de la fiebre aftosa (FMDV) y hepatitis C (HCV) esenciales para su actividad. La fin, estamos estudiando motivos estructurales GNRA y RAAA como candidatos para organizar la estructura relevancia funcional de estas regiones tridimensional del IRES (Figura 2). proviene de su participación en interacciones RNA-proteína así como RNARNA estabilizadoras de la arquitectura del La región 3´ no traducida del RNA de FMDV IRES. Por otro lado, debido a su capacidad de funcionar independientemente del contexto genético que los rodea, los IRES son herramientas para la construcción de estimula la actividad IRES, aún en situación de rotura de eIF4G e inactivación del puente RNA-proteína con PABP. Estamos interesados en identificar los factores vectores de expresión policistrónicos en implicados en esta estimulación, que podría generar una pseudocircularización del RNA células animales. (Figura 1), además de la búsqueda de Hemos identificado el sitio de interacción proteínas de interacción con RNA que contribuyan a la modulación de la actividad de los factores de iniciación de la traducción eIF4B, eIF4G y eIF3 en el IRES de FMDV, siendo la interacción de eIF4G esencial Diversidad de interacciones RNA-proteína implicadas en la iniciación de la traducción. Diversity of RNA-protein interactions involved in translation initiation. 122 del IRES en función de su concentración o su modificación postraduccional en distintas líneas celulares. Internal initiation of translation in eukaryotic mRNAs Publicaciones/Publications: Research summary activity, that of eIF4B seems to be López de Quinto, S., Lafuente, E., Martínez-Salas, E. (2001) IRES interaction with translation initiation factors: Initiation of translation in eukaryotic mRNAs encoding proteins required at dispensable. However neither eIF4G nor eIF4B interacts with the HCV IRES. The pattern of RNA-protein interaction times when cap-dependent translation is observed in different IRES suggests a inhibited (apoptosis, viral infections, etc.) occurs internally, under the control of a region named IRES (internal ribosome diversity of strategies to recruit the ribosome internally (Figure 1). To date, the tertiary structure of IRES elements is Martínez-Salas, E., Ramos, R., Lafuente, E., López de entry site). The primary sequence of the growing list of IRES elements is not conserved, neither their predicted still unknown. Structural elements in the FMDV IRES including GNRA and RAAA J. Gen. Virol. 82, 973-984 motifs which are candidates to mediate Schneider, R., Martínez-Salas, E. et al. (2001) New ways secondary structure shows a significant degree of homology. We have focused our work to understand the relationship in tertiary folding of the RNA structure, have been shown to be essential for IRES activity. Therefore, experimental analysis of initiating translation in eukaryotes? Mol. Cell. Biol. 21, between structural organization and activity of the IRES of foot-and mouth disease virus (FMDV) and hepatitis C is in progress to investigate their structure Sáiz, M., Gómez, S., Martínez-Salas, E., Sobrino, F. (Figure 2). (2001) Deletion or substitution of the aphthovirus 3´ NCR (HCV). The relevance of these regions is We have shown IRES-translation stimulatory effect of FMDV 3´ noncoding 82, 93-101 likely related to their contribution in RNAprotein and RNA-RNA interactions, functional characterization of novel RNA contacts with eIF3, eIF4B, and eIF4GII. RNA 7, 1213-1226 Quinto, S. (2001) Functional interactions in internal translation initiation directed by viral and cellular IRES" 8238-8246 abrogates infectivity and viral replication. J. Gen. Virol. regions in cells where eIF4G was Martínez-Salas, E. (2001) Los sitios de entrada interna determinant of IRES spatial organization. Moreover, IRES are unique tools to construct policistronic biosafe expression proteolyzed, thus, independent of the PABP-eIF4G RNA circularization. We are therefore interested in the identification del ribosoma (IRES) y sus aplicaciones en vectores de vectors. Because of their capacity to work of factors responsible for such stimulation, which may lead to the generation of a Lafuente, E., Ramos, R., Martínez-Salas, E. (2002) Long- functional bridge connecting the 5´ and of the hepatitis C virus internal ribosome entry site 3´ ends of the mRNA (Figure 2). In element. J. Gen. Virol. 83, 1113-1121 efficiently independently of the genetic background, they are instrumental to control gene expression in animal cells. expresión. Virología 8, 1-11 range RNA-RNA interactions between distant regions addition, we are interested in the study During the last years we have characterized the biological role of initiation factors eIF4G, eIF4B and eIF3 in FMDV IRES activity. Whereas eIF4G- of RNA-binding proteins likely contributing to modulate IRES activity in different cells as a function of their concentration or Martínez-Salas, E., López de Quinto, S., Ramos, R., their posttranslational modification state. 84, 755-763 Fernández-Miragall, O. (2002) IRES elements: features of the RNA structure contributing to their activity. Biochimie binding is essential for FMDV IRES López de Quinto, S, Sáiz, M; de la Morena, D, Sobrino, F, Martínez-Salas, E. (2002) IRES-driven translation is stimulated by the FMDV 3´NCR and poly(A) sequences. Nuc. Acids Res. 30, 4398-4405 Gutiérrez, C., Martínez-Salas, E. (2002) DNA plant and animal virus replication. Encyclopedia of Life Sciences London, Nature Publishing Group pp. 556-564 Diferencias en la estructura secundaria del RNA causadas por la substitución del motivo GNRA por UNCG. Secondary RNA structure changes induced by UNCG substitution at the GNRA motif. 123 Regulación de la expresión génica Regulation of gene expression E.12 Estructura cromatínica y transcripción Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Enrique Palacián e-mail: [email protected] Personal Científico / Scientific Staff: Francisco Hernández Becario Predoctoral / Graduate Student: Lara Velasco Técnicos de Investigación / Technical Assistance: Santiago Arenas Miguel Ángel Sánchez Durante estos dos años hemos continuado el estudio de las relaciones básicas entre estructura y función en moldes oligonucleosómicos definidos, empleando como ensayo funcional la transcripción con RNA polimerasa del bacteriófago T7. Se ha completado la investigación de los tres niveles en que la histona H5 podría afectar a la síntesis de RNA : nucleosomas a la fibra de 30 nm, producida al incorporarse una molécula de histona H5 por cada unidad nucleosómica, no tiene ningún efecto sobre la velocidad de elongación de las cadenas de RNA. Sin embargo, la unión de dos moléculas de H5 por nucleosoma sí va acompañada por inhibición de la elongación. Por último, la asociación de oligonucleosomas que tiene lugar en presencia de iones magnesio produce agregados de alto peso molecular individuales, fibra de 30 nm y agregados de las cadenas oligonucleosómicas. Para alcanzar este objetivo, se han determinado que no permiten la síntesis de RNA. paralelamente el grado de compactación, plegamiento de la cromatina para formar la fibra de 30 nm, estabilizado por la histona H5, no ofrece ningún obstáculo al la eficiencia transcripcional y la velocidad de elongación de las cadenas de RNA. Los resultados muestran que, a nivel de nucleosomas individuales, la incorporación de una molécula de H5 por cada elemento nucleosómico no afecta la síntesis global Nuestros resultados indican que el funcionamiento de una maquinaria biosintética sencilla como es la T7 RNA polimerasa. Este comportamiento básico contrasta con la explicación, generalmente ni la elongación del RNA. En oligonucleosomas con elementos admitida, según la cual el efecto represor de las histonas H1/H5 se produciría como regularmente espaciados, la estabilización consecuencia del plegamiento de la cromatina al nivel de la fibra de 30 nm. del nivel de compactación correspondiente 124 Chromatin structure and transcription Publicaciones/Publications: Research summary In these two years we have continued the study of the basic structure-function relationships in well-defined oligonucleosome templates using as a molecule of histone H5 per nucleosome element, does not affect the rate of elongation of RNA chains. However, binding of two molecules of H5 per nucleosome causes significant inhibition of elongation. In addition, the functional probe transcription by RNA polymerase from bacteriophage T7. Research on the effects of histone H5 on oligonucleosome self-association that takes place in the presence of magnesium RNA synthesis has been completed at three different levels: individual nucleosomes, 30-nm fiber, and weight aggregates, is accompanied by complete loss of RNA synthesis. oligonucleosome aggregates. To accomplish this goal, compaction level, transcriptional efficiency, and rate of elongation of RNA chains have been Our results indicate that the stabilized folding of chromatin by histone H5 to form the 30-nm fiber is no obstacle whatsoever ions, with formation of high-molecular- determined in a parallel way. The results show that, at the level of individual to the function of a simple biosynthetic machinery like T7 RNA polymerase. This basic behavior is in contrast with the nucleosomes, incorporation of one generally admitted assumption according molecule of histone H5 per nucleosome has no effect on the overalll RNA synthesis or chain elongation. In oligonucleosomes to which the repressor role of histones H1/H5 would be achieved by the induced with regularly-spaced nucleosomes, nm fiber. chromatin folding to the level of the 30- stabilization of the compaction level corresponding to the 30-nm fiber, which is produced by incorporation of one 125 Regulación de la expresión génica Regulation of gene expression E.13 Envolturas celulares Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Miguel Angel de Pedro Montalban e-mail: [email protected] Nuestro tema de estudio es la biología de la envoltura celular bacteriana como elemento morfogenético, de relación con el Postdoctoral / Postdoctoral Fellow: Silvia Gutiérrez Erlandsson Katysulla Costa Miguel Angel Serrano Melgar Técnicos de Investigación / Technical Assistance: María Teresa Villalba Villacorta estructurales radicales durante las primeras etapas del proceso de colonización de células eucarióticas, fenómeno base de la medio y con otros organismos. Nuestro trabajo se centra en dos aspectos patogenia de dicho organismo. Estamos estudiando la participación en dichos procesos de enzimas relacionadas con el principales: metabolismo del sáculo. Recientemente a) Morfogénesis de Escherichia coli ; hemos obtenido información que indica que las N-acetil-muramil-L-ala amilasas, de las Continuamos nuestros estudios sobre la generación y función de regiones topológicamente diferenciadas en el sáculo cuales existen al menos tres (amiA, amiB y amiC), en S. typhimurium, afectan a la capacidad de proliferación intracelular que y en la membrana externa de la bacteria. Durante este periodo hemos demostrado es mayor en el caso de mutantes sencillos y dobles. También hemos obtenido información que indica que una infección abortiva por mutantes autolíticos de S. Becarios Predoctorales / Graduate Students: celular de S. typhimurium sufre cambios la implicación de la penicillin binding protein 5 en la diferenciación de sitios de síntesis activa y de regiones inertes. Estamos estudiando las bases estructurales y metabólicas de las heterogeneidades así typhimurium induce una fuerte protección en la célula huésped frente a una segunda infección. En estos momento estamos como su relevancia en la morfogénesis bacteriana mediante métodos de marcaje trabajando en caracterizar la influencia de las proteínas morfogenéticas PBP1B, la específico y microscopía de alta resolución. principal actividad mureín sintasa, y BolA b) Implicación de la pared celular en la uno de los componentes de respuesta a estrés que regula la expresión de las PBPs colonización de células eucarióticas por Salmonella typhimurium. La envoltura 5 y 6, en el proceso de colonización intracelular en células cultivadas. 126 Cell envelopes Publicaciones/Publications: Research summary investigating the influence of macromolecular murein metabolism on Castán, P., de Pedro, M.A., Risco, C., Valles, C., the ability of S. typhimurium to invade and Multiple regulatory mechanisms act on the 5’ untranslated replicate inside host eukaryotic cells. Information indicating that the Nacetylmuramyl-L-alanine amidases (amiA, Region of the S-layer gene from Thermus thermophilus amiB, and amiC) modulate intracellular replication of S. typhimurium has been recently gathered. Single and double de Pedro, M.A., Donachie, W.D., Höltje, J.-V., Schwarz, a) Morphogenesis of Escherichia coli; we continue our investigations on the mutants do replicate to a higher extent than wild type, indicating that amidase morphogenetic proteins RodA and penicillin-Binding generation and function of topologically differentiated regions in the bacterial sacculus and outer membrane. A direct deficiencies interfere with cellular Our research topic is the molecular biology of the bacterial cell envelope as a morphogenetic element, and as an element mediating interaction with the environment and other organisms. Our work is focused on two main directions: implication of PBP5 in the differentiation of active synthesis and inert regions has been demonstrated. At present we are investigating the structural and metabolic basis for the generation of heterogeneities in the cell envelope s by means of specific labeling and high resolution microscopy. b) Involvement of the bacterial envelope in eukaryotic cell colonization by Salmonella typhimurium. The cell envelope of the intracellular pathogen S. Fernández, L.A., Schwarz, H., Berenguer, J. (2001) HB8. J. Bacteriol. 183,149-1494 H. (2001) Constitutive septal murein synthesis in Escherichia coli with impaired activity of the protein 2. J. Bacteriol.183, 4115-4126 mechanisms restrictive for bacterial proliferation. Evidence showing that an abortive infection with S. typhimurium Heidrich, C., Templin, M.F., Ursinus, A., Merdanovic, autolytic mutants triggers a strong amidases in cell separation and antibiotic induced protective response in the host cells against a second challenge with a fully virulent strain has been obtained. The autolysis of Escherichia coli. Mol. Microbiol. 41, 167-178 detailed molecular mechanisms underlying this protective response are Pedro,M.A., Gómez, P., Moreno, R., Morón, R., under investigation. At present we are penicillin-resistant Streptococcus mitis: indication for a also investigating the roles of the morphogenetic proteins PBP 1B, the main PBP-1-dependent way to reach high levels of penicillin M., Berger, J., Schwarz, H., de Pedro, M.A., Höltje, J.-V. (2001) Involvement of N-acetylmuramyl-L-alanine Sánchez, M., Vicente, M.F., Cercenado, E., de Berenguer, J. (2001) Diversity among clinical isolates of resistance. Int. Microbiol. 4, 217-222 murein synthase activity, and BolA a typhimurium is modified early in member of the stress response system controlling expression of PBPs 5 and 6, eukaryotic cell colonization, a key process for pathogenesis. We are currently in S. typhimurium intracellular proliferation and persistence in cultured cells. Castán, P., Zafra, O., Moreno, R., de Pedro, M.A., Vallés, C., Cava, F., Schwarz, H., Berenguer, J. (2002)The periplasmic space in Thermus thermophilus: Evidences from a regulation-defective S-layer mutant overexpressing an alkaline phosphatase. Extremophiles 6, 225-232 de Pedro, M.A., Höltje, J.-V., Schwarz, H. (2002) Fast lysis of Escherichia coli filament cells requires differentiation of potential division sites. Microbiology 148, 79- 86 Santos, J.M., Lobo, M., Matos,A.P.A., de Pedro, M.A., Arraiano, C.(2002) The gene bolA regulates dacA (PBP5), dacC (PBP6) and ampC (AmpC), promoting normal morphology in Escherichia coli.Mol. Microbiol. 45,17291740 Tesis Doctorales / Doctoral Theses Katysulla Costa. 2002. “The Peptidoglycan of Helicobacter pylori”. Universidade do Porto, Portugal. 127 Regulación de la expresión génica Regulation of gene expression E.14 Bases Moleculares de las Enfermedades Metabólicas Resumen de Investigación Jefe de Línea / Group Leader: Magdalena Ugarte e-mail: [email protected] El objetivo de nuestro trabajo es el diagnóstico de enfermedades metabólicas y la identificación y caracterización de los enfermedades cardiovasculares y con el riesgo de tener hijos afectados con Síndrome de Down. Asimismo, se ha iniciado el estudio del metabolismo mitocondrial de cobalaminas mediante una aproximación proteómica. Mª José García Muñoz genes implicados en algunas de ellas, así como el análisis funcional y estructural de Begoña Merinero las diferentes proteínas mutantes. En 3-metilcrotonilglicinuria, se han En los dos últimos años, se ha ampliado el caracterizado estructural y funcionalmente, tanto a nivel genómico como de cDNA, los Personal Científico / Scientific Staff: Belén Pérez Celia Pérez-Cerdá Eva Mª Richard Pilar Rodríguez-Pombo Lourdes Ruiz Desviat Pedro Ruiz Sala Becarios Predoctorales / número de técnicas diagnósticas para la identificación de pacientes con defectos de la ß-oxidación mitocondrial de ácidos genes nucleares que codifican para las dos subunidades de la proteína MCC, usando grasos, enfermedades peroxisomales, defectos congénitos de glicosilación, de datos de EST y HTGS. Asimismo, se han identificado mutaciones causantes de enfermedad en ambos genes. Sonia Clavero defectos de la biosíntesis del colesterol y defectos del metabolismo de purinas y Mª Angeles Martínez pirimidinas. Graduate Students: herramientas bioinformáticas y las bases Para el análisis del efecto estructural y Angel Luis Pey funcional de las diferentes variantes alélicas En los aspectos básicos, se han estudiado las bases moleculares de la fenilcetonuria causada por defectos en el gen de la en las patologías en estudio, se han desarrollado diferentes sistemas de expresión, analizando el efecto de fenilalanina hidroxilasa (PAH), así como las mutaciones PKU, PCC y MCC sobre la bases moleculares de la acidemia propionica y la 3-metilcrotonilglicinuria actividad, oligomerización y estabilidad de la proteína en sus correspondientes Rosa Navarrete debidas a defectos en los genes nucleares que codifican para las proteínas compartimentos subcelulares. Los resultados sugieren que, en general, la Ascención Sánchez heteroméricas mitocondriales propionil-CoA mayoría de las mutaciones son estructurales Paloma Sanz y que su actividad puede ser modulada in vivo por el sistema de control celular Lorena Velazquez carboxilasa (PCC) y metilcrotonil-CoA carboxilasa (MCC), respectivamente. Recientemente, se ha iniciado el análisis Gema Palmeiro de SNPs funcionales de genes del terapias mas individualizadas. Técnicos de Investigación / Technical Assistance: Nuria Caballero Margarita Castro Mª Jesús Ecay Isaac Ferrer Silvia Pizarro Fátima Leal Científicos Visitantes / Visiting metabolismo del folato y su relación con Scientists: Enna Gutierrez Cezary Zekanowski Estructura de la fenilalanina hidroxilasa humana, localización y conservación de residuos implicados en mutaciones expresadas, causantes de fenilcetonuria. El modelo ha sido generado mediante un cálculo de variabilidad tras el alineamiento de proteínas ortólogas de diferentes organismos. El grado de variabilidad se representa por un código de colores. 128 proteico, sentando las bases de nuevas Molecular basis of metabolic diseases Publicaciones/Publications: Research summary metabolism and cardiovascular disease and with the risk of having a child with The goal of our work is the diagnosis of inborn errors of metabolism the characterization and identification of the Down syndrome. We have also started a proteomic approach to study cobalamin mitochondrial metabolism. genes involved, as well as the functional and structural analysis of the different mutant proteins. In 3-methylcrotonylglicinuria we In the last two years, we have included more diagnostic techniques aimed at the characterized structurally and functionally, at genomic and cDNA levels, the nuclear genes encoding both MCC subunits, using bioinformatic tools and the EST and HTGS identification of patients with mitochondrial ß-oxidation defects, peroxisomal diseases, congenital glycosylation defects, databases. We have also identified disease-causing mutations in both genes. cholesterol biosynthesis defects and purine and pyrimidine metabolism disorders (). For the analysis of the structural and functional effects of the different allelic We have studied the molecular basis of phenylketonuria caused by defects in the variants of the disorders studied, we have developed different expression systems, analyzing the effect of PKU, PCC and MCC mutations on activity, oligomerization phenylalanine hydroxylase (PAH) gene and of propionic acidemia and 3methylcrotonylglycinuria caused by and stability of the protein in its cellular defects in the propionyl-CoA carboxylase structural properties of the enzyme, and the activity can be modulated in vivo by (PCC) and methylcrotonylCoA carboxylase (MCC) genes, respectively. compartment. The results reveal that the majority of the mutations affect the the quality control system, being the basis Recently, we are analyzing the association to apply new therapies tailored to each between SNPs in genes involved in folate patient. Publicaciones/Publications: Gallardo, M.E., Desviat, L.R., Rodriguez, J.M., EsparzaGordillo, J., Perez-Cerda, C., Perez, B., RodriguezPombo, P., Criado, O., Sanz, R., Morton, D.H., Gibson, M.K., Le, T.P., Ribes, A., Rodriguez de Cordoba, S., Ugarte, M., Peñalva, M.A. (2001) The molecular basis of 3-methylcrotonylglycinuria, a disorder of leucine catabolism. Am. J. Hum. Genet. 68 Desviat, L.R., Perez, B., Gutierrez, E., Sánchez, A., Barios, B., Ugarte, M. (2001) Molecular basis of phenylketonuria in Cuba. Hum Mutat. Mutation in Brief #440 online. Campeau, E., Desviat, L.R., Leclerc, D., Wu, X., Perez, B., Ugarte, M., Gravel, R. (2001) Structure of the PCCA gene and distribution of mutations causing propionic acidemia. Mol. Genet. and Metab. 74, 238-247 Muro, S., Perez, B., Desviat, L.R., Rodriguez-Pombo, P., Perez-Cerda, C., Clavero, S., Ugarte, M. (2001) Effect of PCCB gene mutations on the heteromeric and homomeric assembly of Propionyl-CoA Carboxylase”. Mol. 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Pediatr. 56, 337-341 Merinero, B. (2002) Caracterización clínica, bioquímica y molecular de la deficiencia de piruvato carboxilasa. An. Esp. Pediatr. 57, suplem 2, 9-11 Tesis Doctorales / Doctoral Theses Alejandra Gámez Abascal. 2002. “Fenilcetonuria: Análisis genético de la hiperfenilalaninemia benigna y efecto de mutaciones en la proteína fenilalanina hidroxilasa”. 130 Responsables de Laboratorio Persons in charge of laboratories 131 Responsables de Laboratorio Persons in charge of laboratories Regulación del mantenimiento de la expresión de los genes homeóticos de Drosophila melanogaster Maintenance of homeotic gene expression in Drosophila melanogaster Ana de Busturia, Publicaciones / Publications: Busturia, D., Lloyd, A., Bejarano, F., Zavortnik, M., Xin, S., Sakonju, S. (2001) The MCP silencer of the Drosophila Abd-B gene requires both Pleihomeotic and GAGA factor for the maintenance of repression. Development 128, 2163-2173 Estrada, B., Casares, F., Busturia, A., Sanchez-Herrero, E. (2002) Genetic and molecular characterization of a novel iab-8 regulatory domain in the Abdominal-B gene of Drosophila melanogaster. Development 129, 5195-204 Estudio de la regeneración del sistema osteocondral a partir de células pluripotenciales humanas. Bone and articular cartilage regeneration from human pluripotent mesenchymal cells Predestinación García Ruiz, Publicaciones / Publications: Ogueta, S., Muñoz, J., Obregón, E., Delgado-Baeza, E., García-Ruiz, J.P. (2002) Prolactin is a component of the human sinovial fluid and modulates the growth and chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Mol Cell Endocrinol 190, 51-63 Manso, M., Ogueta, S., Herrero-Férnandez, P., Vázquez, J., Langlet, M., García-Ruiz, J.P. (2002) Biological evaluation of aerosol-gel derived hydroxiapatite coatings with human mesenchymal stem cells. 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Jr. (2001) CAFASP2: the second critical assessment of fully automated structure prediction methods. Proteins Suppl 5, 171-183 Perez, C., Ortiz, A.R. (2001) Evaluation of docking functions for protein-ligand docking. J. Med. Chem. 44, 3768-3785 Kmunicek, J., Luengo, S., Gago, F., Ortiz, A.R., Wade, R.C., Damborsky, J. (2001) Comparative binding energy analysis of the substrate specificity of haloalkane dehalogenase from Xanthobacter autotrophicus GJ10. Biochemistry 40, 8905-8917 Fabrega, C., Farrow, M.A., Mukhopadhyay, B., de Crecy-Lagard, V., Ortiz, A.R., Schimmel, P. (2001) An aminoacyl tRNA synthetase whose sequence fits into neither of the two known classes. Nature 411, 110-114 Ortiz, A.R., Strauss, C.E., Olmea O. (2002) MAMMOTH (matching molecular models obtained from theory): an automated method for model comparison. Protein Sci. 11, 2606-2621 De Las Rivas, J., Lozano, J.J., Ortiz, A.R. 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Genesis 34, 146-151 133 Seminarios Seminars Servicios Apoyo a la investigación Research and Support Facilities Lecciones Conmemorativas Memorial Lectures Seminarios Seminars 2001 2002 12 de Enero 11 de Enero Dr. Eugenio Santos (Centro de Investigación del Cáncer, Salamanca) Juan Valcárcel (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg) “Activación de proteínas Ras por intercambio de nucleótidos” "Regulación del procesamiento alternativo de ARN mensajeros" 25 de Enero 1 de Febrero Dr. Francisco Sánchez - Madrid (Hospital de la Princesa, Madrid) Jorge Galán (Yale School of Medicine, New Haven) “Estudio dinámico de la polaridad celular del linfocito durante la migración y las interacciones inmunes” "Mimetismo estructural y funcional durante la patogénesis por Salmonella" 8 de Marzo 2 de Marzo Dr. Jim Smith (National Institute for Medical Research, Londres) “Making mesoderm: upstream and downstream of Brachyury” José Ramón Naranjo (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid) “Regulación transcripcional por DREAM: vías, dianas y dominantes negativos” 22 de Marzo Severo Ochoa Avances en Biología Molecular 16 de Marzo Dr. Kim Nasmyth (Institute of Molecular Pathology, Viena) “Does a common mechanism trigger the segregation of chromosomes during mitosis and meiosis?” Michael Rossmann (Department of Biological Sciences, Purdue University, West Lafayette, U.S.A.) “Structure of Dengue Virus: Implications for Flavivirus maturation and fusion” 5 de Abril 6 de Abril Dr. Victor de Lorenzo (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid) “Regulación transcripcional en Pseudomonas: promotores en el tubo de ensayo y en el medio ambiente” Matthias Hentze (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg) “Principles of translational control, the interface between ‘Genomics’ and ‘Proteomics’ ” 26 de Abril 20 de Abril Dr. Richard Jackson (Department of Biochemistry, University of Cambridge) “Internal initiation of hepatitis C virus and picornavirus RNA translation: contrasts with capped mRNA translation” John Diffley (ICRF Clare Hall Laboratories, South Mimms, Inglaterra) “DNA replication and cancer: lessons from budding yeast” 10 de mayo 4 de Mayo Michael Bate (Department of Zoology, University of Cambridge) Dr. Salvador Moncada (The Wolfson Institute for Biomedical Research, Londres) “Making sense of developing behaviour in Drosophila” “NO and the physiology and pathophysiology of cell respiration” 24 de Mayo 25 de Mayo Reinhard Jahn (Max Planck Institut fuer Biophysikalische Chemie, Goettingen) Dr. Tony Kouzarides (Wellcome/CRC Institute and Department of Pathology, Cambridge) “Molecular mechanisms of membrane fusion in the secretory pathway” “Histone methylation in transcriptional control” 24 de Octubre 21 de Junio Dr. Alain Fischer (Hôpital Necker Enfants malades, Paris) “Severe combined immunodefiencies, models for the studies of T lymphocyte development and gene therapy” 27 de Noviembre Dr. Hans Clevers (University Medical Center, Utrecht) “Wnt signaling establishes boundaries in the gut” 136 Raúl Andino (University of California, San Francisco, USA) “The interactions of poliovirus with the host cell during replication” 22 de Noviembre Lisardo Boscá (Instituto de Bioquímica, CSIC-Universidad Complutense, Madrid) “Resolución de los procesos inflamatorios” 2001 Affolter, Markus (Zellbiologie, Biozentrum der Universitat Basel, Suiza) “Novel tools to study cell migration in development” Antón, Luis (Instituto de Salud Carlos III, Madrid) “Estructuras celulares implicadas en la degradación de proteínas por el proteasoma” Bárcena Alicia (Department of Surgery, University of California, San Francisco, USA) “Distribución de precursores de células NK en hígado fetal humano” Bustelo, Xosé R. (Centro de Investigación del Cáncer, Salamanca) “Mecanismos de activación y señalización de las oncoproteínas VAV” Castelli-Gair, James (Departamento de Zoología, Universidad de Cambridge, Reino Unido) CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA" “Control de la morfogénesis de Drosophila por genes ‘Downstream’ de abdominal-B” Colaço, Camilo (Immunolobiology Dpt., Babraham Bioincubator, Cambridge. U.K.) “CDs, HSPS and the integration of innate and acquired immunity” Desvoyes, Bénédicte (University of Bordeaux 1, Francia and Texas A&M University, College Station, USA) “Translation regulation and movement of Tombusviridae” Diez del Corral, Ruth (Universidad de Dundee, Escocia, RU) “Regulación del inicio de la diferenciación neural en la médula espinal por el mesodermo paraxial y FGPs” Elliot, David (The Victor Chang Cardiac Research Institute, Darlinghurst, Australia) “Analysis of cardiac NK-2 proteins from mice, men and octopuses” Fain, Jhon N. (Department of Biochemistry, Un of Tennesse, Memphis, USA) “Hormonal regulation of leptin release by human adipose tissue” Fasiolo, Franco (IBMC Estrasburgo, Francia) “A novel yeast EF-2 like GTPase is required for ribosome export and a late cytoplasmic step of ribosomal assembly” 137 Franze-Fernández, Mª Teresa (Centro de Virología Animal, CONICET, Buenos Aires, Argentina) “Un sistema reconstituido de transcripción y replicación basado en RNAs y proteínas de virus tacaribe expresados por plásmidos” Gómez, Jordi (Hospital Valle de Hebrón, Barcelona) “Corte específico del genoma del virus de la hepatitis C por la ribonucleasa P humana” González Reyes, Acaimo (Instituto de Parasitología y Biomedicina López Neyra, Granada) “Diferenciación celular durante la oogénesis de ‘Drosophila’” Guzmán, Manuel (Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Facultad de Biología, Universidad complutense, Madrid) “Cannabinoides como posibles agentes antitumorales” Knust, Elisabeth (Heinrich-Heine Universitaet Duesseldorf, Institut fuer Genetik, Germany) “Protein scaffold and cell polarity in drosophila” Lever, Andrew M.L. (Addenbrooke’s Hospital, University of Cambridge, Departement of Medicine, Cambridge, UK) “Understanding how retroviruses package their RNA genomes: Implications for lentiviral (HIV) based vectors” Paro, Renato (ZMBH, Universidad de Heidelberg, Alemania) “Chromosomal elements conferring epigenetic inheritance” Puertollano, Rosa (Cell Biology and Metabolism Branch, National Institutes of Health, Bethesda, USA) “GGAs: una nueva familia de adaptadores de clatrina implicada en el transporte de los receptores de manosa-6-fosfato” Rheinberger, Hans-Jörg (Director del Instituto Max Planck de Historia de la Ciencia, Berlin, Alemania) “Gene concepts: perspectives from the history of molecular biology” Roch, Fernando (Centre de Biologie du Developpement, Universite Paul Sabatier, Toulouse, Francia) “La señal de EGFR llega al núcleo: función del represor CIC en el ala de Drosophila” Seminarios Seminars CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA" Sevilla, Noemí (Dept. of Neuropharmacology, Division of Virology, The Scripps Research Institute, La Jolla, California, USA) Conway, Everly (Department of Biomedical Sciences, School of Public Health, University at Albany, NY, USA) “Mecanismos virales de inmunosupresión y persistencia mediante la infección de células dendríticas” "Transcription of stress genes in archaea: prokaryotes with eukaryotic factors" Simpson, Pat (Department of Zoology, University of Cambridge, England) "Visualizing T cell recognition" “Gene duplication and the development and evolution of bristle patterns in diptera” Viguera, Enrique (Centro de Astrobiología (INTA), Torrejón, Madrid) “Análisis del error de replicación por deslizamiento de hebra” Villarreal, Luis (Director, Center for Virus Research, University of California, Irvine, USA) “The role of polyomavirus oncogenes in differentiating tissue: evaluation in scid mice” Davis, Mark (Stanford University, California, USA) Finley, Daniel (Department of Cell Biology, Harvard Medical School, Boston, USA) "The proteasome and its associated proteins" Franco, Rafael (Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Barcelona, Barcelona) "Interacciones proteína-proteína y regulación de receptores acoplados a proteínas G" Galbiati, Laura (International Center for Genetic, Engineering and Biotechnology, Triestre, Italy) "p300/CBP promotes acetylation and ubiquitination of transcription factor E2F-1" García-García, María Jesús (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, USA) 2002 2002 Borlongan, César V. (Department of Neurology and Institute of Molecular Medicine and Genetics, School of Medicine, Medical College of Georgia, Augusta, USA) "Immunosuppression and neural transplantation for Parkinson's disease" Canelles, Matilde (Laboratory of Molecular and Cellular Immunology, National Institute of Immunology and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, USA) "Señalización por TCR durante la decisión CD4/CD8 en el timo" Casal, José (Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK) "Polaridad planar en Drosophila: una aproximación" Cohen, Philip (University of Dundee, MRC Protein Phosphorylation Unit, School of Live Sciencies, Scotland, U.K.) "How to cure diabetes without causing cancer?: a signal transduction approach" Coll, Miquel (Instituto de Biología Molecular, CSIC, Barcelona) "Procesamiento y transporte del ADN en la conjugación bacteriana" 138 "Estudio de la gastrulación mediante mutagénesis con ENU: caracterización de la mutación Lazy Mesoderm, un nuevo componente de la vía FGF" Goldberg, Alfred L. (Professor of Cell Biology, Harvard Medical School, USA) "The role of the proteasome in protein degradation and antigen presentation" Gotte, Matthias (McGill University AIDs Centre Montreal, Canada) "The translocation equilibrium of HIV-1 reverse transcripatse and implications for enzymatic functions" Gubb, David (Department of Genetics, University of Cambridge) "Drosophila Necrotic mutations activate the innate immune response to fungal infections and mirror human variants associated with serpin polymer diseases" Ingham, Philip (MRC Intercellular Signalling Group, Centre for Developmental Genetics, School of Medicine and Biomedical Sciencie, University of Sheffield, U.K.) "Mechanisms and roles of hedgehog signalling in vertebrate development" Inzé, Dirk (Department of Plant Genetics, VIB, University of Ghent, Belgium) "How do plants coordinate cell division and development" Jiménez, Gerardo (Centro de Investigación y Desarrollo, CSIC, Barcelona) Regan, John W. (Prof. of Pharmacology and Toxicology, University of Arizona, EEUU) "Control materno del desarrollo de Drosophila mediante señales extracelulares y represión génica" "Prostaglandin receptor signaling: novel interactions of G protein-coupled receptors with elements of the Wnt/betacatenin signaling pathway" Kappes, Dietmar (Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, USA) "Control of T cell development by CD3delta and HD genes" Reiner, Orly (Weizmann Institute, Rehovot, Israel) "Interaction of LIS-1 with microtubules" Kavelaars, Annemieke (Wilhelmina Children Hospital, Utrecht, Holanda) Tercero, José Antonio (Imperial Cancer Research Fund, UK) "G protein coupled receptor kinases in the inmune system: a role in autoimmunity?" "Regulación de la replicación cromosómica en respuesta al daño en el DNA" Kokaia, Zaal (Section of Restorative Neurology, Wallenberg Neuroscience Center, Lund. Sweden) Thome, Margot (Universidad de Lausanne, Suiza) "Neural stem cells and brain insults" Lawrence, Peter FRS (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, Inglaterra) "Polarity and compartments in Drosophila development" Macario, Alberto (Wadsworth Center, Department of Biomedical Sciences, The University at Albany, NY, USA) "Molecular biology of stress genes in archaea: lessons from experimental data and genome analysis" Martín-Bermudo, Dolores (Instituto de Parasitología y Biomedicina "López Neyra", CSIC, Granada)"Integrinas: moléculas clave en morfogénesis" Martínez Menárguez, José Angel (Departamento de Biología Celular, Histología y Embriología General, Facultad de Medicina, Universidad de Murcia) "Tráfico de membranas en la vía secretora temprana" Medina, Miguel (Instituto Cavalieri Ottolenghi Scientific, Universidad de Turin, Italia) "Análisis funcional de la interacción entre presenilinas y cateninas" Muñoz, Emilio (Instituto de Estudios Sociales Avanzados, CSIC, Madrid) "Nuevas estrategias para la formación en Biotecnología" Pedersen, Irene M. (The Burnham Institute, La Jolla, USA) "Induction of apoptosis in CLL (Chronic Lymphocytic Leukemia) B-cells" Prehn, Jochen H. M. (Westphalian Wilhelms University, Faculty of Medicine, Ctr Interdisciplinary Clinical Res (IKF), Muenster, Germany) "Mitochondrial function/dysfunction during apoptosis" 139 "CARMA 1, a lipid-associated protein involved in T-cell activation" Van Den Heuvel, Marcel (MRC Functional Genetics Unit, Department of Human Anatomy and Genetics, University of Oxford, U.K.) "Hedgehog signalling and HDL receptor proteins: a possible link" Villarreal, Luis P. (Department of Molecular Biology and Biochemistry, Center for Virus Research 3232, Biological Science 2, University of California, Irvine, USA) "Study of human papillomavirus in human cervical tissues transplanted into scid mice" von Kobe, Cayetano (Laboratory of Molecular Gerontology, National Institutes on Aging, NIH, Baltimore, USA) "La proteína del síndrome de envejecimiento prematuro deWerner: localización, proteínas de interacción y papel en respuesta a estrés oxidativo" Yewdell, Jonathan W. (Laboratory of Viral Diseases, NIAID, HIH, Bethesda, MD, USA) "Generation of MHC-Peptide complexes in vitro and in vivo" Servicios Técnicos de Apoyo a la Investigación Los servicios del CBMSO disponen de los siguientes equipamientos y técnicas como apoyo directo a los grupos de investigación. Animalario Microscopía Electrónica Producción y mantenimiento de rata y ratón. Preparación convencional de muestras para microscopía electrónica de transmisión: fijación química e inclusión en Epon. Producción y mantenimiento de estirpes transgénicas y genéticamente modificadas de ratón. Manipulación animal con equipo de anestesia y campanas de gases. Laboratorio para infección experimental con patógenos nivel P-2. Celdas para trabajo con diversas especies animales. Laboratorio de criopreservación de embriones y semen. Criofijación en propano o etano líquidos. Criosustitución e inclusión a baja temperatura en Lowicryl (K4M, HM20). Ultramicrotomía convencional. Crioultramicrotomía. Inmunomarcado post-inclusión con oro coloidal. Hibridación “in situ” a nivel ultraestructural. Fermentación Tinción negativa. Equipo para cultivo y recolección de microorganismos aerobiosanaerobios (fermentadores Chemup de 20 1 y Braun de 30 1). Microscopía de ácidos nucléicos. Equipo para cultivo y recolección de microorganismos extremófilos (Airlift de 100 1 y un reactor agitado STR). Criosecado y criofractura. Microscopía óptica y confocal Microscopía de Luz Transmitida. Equipo para fraccionamiento celular de microorganismos. Microscopía de fluorescencia. Microscopía confocal y espectral. Microscopía de células vivas. Química de Proteínas FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Síntesis de péptidos. Control de calidad de péptidos sintéticos madiante HPLC y espectrometría de masas. Secuenciación de Edman de péptidos y proteínas. FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching). Procesamiento y deconvolución de imágenes. Construcciones de proteínas fluorescentes. Digestión de proteínas y aislamiento de péptidos mediante HPLC. Análisis de péptidos y proteínas mediante espectrometría de masas tipo MALDI-TOF. Análisis y secuenciación de péptidos mediante espectrometría de masas tipo nanospray-trampa iónica. 140 Secuenciación de DNA Equipo para secuenciación (Applied Biosystems), PCR y análisis de secuencia. Research and Support Facilities The following facilities and techniques are regularly provided by the Central Services of the CBMSO in direct support of research teams. Animal Facility Electron Microscopy Breeding and maintenance of rat and mouse. Conventional processing of samples for “check spelling” of transmission electron microscopy. Breeding and maintenance of transgenic and genetically modified mice. Plunge cryofixation in liquid propane or ethane. Animal surgery and manipulation under anesthesia. Freeze-substitution and cryoembedding in Lowicryls. Laboratory for experimental infection with P-2 level pathogens. Conventional ultramicrotomy. Cryoultramicrotomy. Embryo and sperm criopreservation facility. Postembedding immunogold electron microscopy. Ultrastructural “in situ” hybridization. Fermentation Negative staining. Facilities for medium-scale growth and harvesting of aerobic microorganisms (Fermentors 20 1 Chemup and 30 1 Braun). Electron microscopy of nucleic acids. Freeze-drying and freeze fracture. Facilities for large scale growth and and harvesting of extremophiles (100 1 Airlift Optical and Confocal Microscopy and a STR stirred reactor) Transmitted light microscopy. Cellular fractionation of microorganisms. Fluorescence microscopy. Confocal and spectral microscopy. Microscopy with living cells. Protein Chemistry Peptide synthesis. FRET (Fluorescence Resonance energy Transfer). Quality control of synthetic peptides by HPLC and mass spectrometry. FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching). Peptide and protein Edman sequencing. Image processing and deconvolution. Protein digestion and HPLC peptide purification. Construction of fluorescent proteins plasmids. Peptide and protein analysis by MALDI-TOF mass spectrometry. DNA sequencing Peptide and protein analysis and sequencing by nano-spray ion trap mass spectrometry. 141 Equipment for DNA sequencing (Applied Biosystems) and PCR analysis. Lecciones Conmemorativas Memorial Lectures 2001-2002 CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA" VIII Lección Conmemorativa Severo Ochoa Dr. Bruce Stillman (Director of Cold Spring Harbor Laboratory) “Duplication of the genome: Cell cycle and control of genome duplication” 30 de Noviembre de 2001 IX Lección Conmemorativa Severo Ochoa Dr. Nahum Sonenberg (Department of Biochemistry, McGill University, Montreal, Canada) “Signaling to translation initiation factors: effects on cell growth and proliferation” 8 de Noviembre de 2002 II Lección Conmemorativa Eladio Viñuela Prof. Charles Weissmann (Imperial College School of Medicine, London) “Prions, mad cows and transgenic mice” 15 de Febrero de 2001 III Lección Conmemorativa Eladio Viñuela Sir Aaron Klug (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK)) “The use of zinc finger peptides for the regulation of gene expression” 25 de Febrero de 2002 142