4. Preparación de muestras para microscopía óptica

Transcripción

4. Preparación de muestras para
microscopía óptica
4. Preparación de muestras
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Criterios en las técnicas de preparación
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Técnicas para luz transmitida
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Técnicas para luz reflejada
El objetivo de la preparación de muestras para
microscopía óptica es
permitir que las estructuras de los materiales se
revelen con suficiente contraste de modo que las
características de interés sean descritas, grabadas
y caracterizadas en detalles visibles a una escala
menor que la agudeza visual del ojo humano.
La escala última de observación estará limitada por
la resolución del sistema de imagen del
microscopio.
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Asegurar que la muestra a observar es
representativa del material, objeto u organismo de
procedencia que se desea estudiar.
Hacer que las características de interés sean
accesibles al sistema de imagen del microscopio.
Cuando sea necesario, aumentar el contraste entre
los elementos estructurales de los materiales y el
fondo.
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●
Proporcionar las condiciones suficientes para la
estabilidad de las muestras, y suficiente significa
proteger
las
muestras
de
decaimiento,
degradación, corrosión o contaminación dentro de
la escala de tiempo de la observación.
Ajustar la muestra a los requisitos ópticos del
sistema de imagen del microscopio para proveer de
las condiciones óptimas de contraste y resolución,
y evitar artefactos ópticos que pudieran aparecer y
que oscurecerían la imagen o incorporarían falsos
detalles.
Técnicas de preparación para luz transmitida
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Las muestras biológicas pueden ser examinadas
en muchos estados como combinación de los
siguientes:
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vivas o muertas
●
frescas o preservadas/fijadas
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enteras o en secciones
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teñidas o sin teñir
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hidratadas o deshidratadas
●
opacas o aclaradas
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Las muestras lo suficientemente pequeñas como
para ser observadas enteras pueden también ser
observadas vivas, obteniéndose el contraste
mediante dispositivos ópticos tales como contraste
de
fases
o
contraste
interferencial
u,
ocasionalmente, por medio de tintes vivos
(tinciones no tóxicas que tienen afinidad por ciertos
componentes celulares).
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Sin embargo, la mayoría de los organismos, sus
órganos y tejidos, e incluso sus células, son
demasiado grandes para proporcionar información
de alta resolución con los microscopios ópticos
convencionales.
Por ello no pueden ser observados vivos sino que
hay que matarlos y entonces (generalmente) deben
ser deshidratados, incluidos, cortados, teñidos y
montados antes de su examen al microscopio.
Montajes temporales de muestras vivas enteras
●
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Las muestras que son organismos completos o
partes de organismos vivientes requieren un
tratamiento especial, tanto para mantenerlos vivos
durante la observación, como para asegurar que su
muerte no destruya información de interés.
Las muestras examinadas al microscopio mientras
están vivas suelen ser pequeñas: organismos
completos como bacterias, protozoos y pequeños
animales y plantas, o partes discretas de
organismos como células en cultivo, células
sanguíneas, granos de polen, etc.
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Dependiendo de la duración de la observación y de
la naturaleza de la muestra, se debe prestar
atención a la provisión de suficiente oxígeno, al
mantenimiento de la concentración de otras
sustancias (por ejemplo sales y “alimento”), a la
eliminación del CO2 y otros residuos, al control de
la temperatura, a la provisión de luz apropiada, a la
eliminación
de
organismos
extraños
o
depredadores.
●
Las muestras aquí señaladas estarán montadas,
normalmente, en el medio en que se dan
habitualmente o serán cultivadas, por eso las
técnicas de preparación se limitan a montarlas en
un portaobjetos, bajo un cubreobjetos, en una
pequeña gota de medio.
Si la observación va a ser prolongada puede ser
necesario retardar la evaporación sellando los
bordes del cubreobjetos.
Montajes permanentes de muestras no vivas
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Fijación
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Deshidratación e inclusión
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Corte
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Tinción
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Montaje
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Fijación:
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Los organismos de los cuales se van a obtener
montajes permanentes deben estar necesariamente
muertos y se debe tener mucho cuidado en que el
sacrificio se produzca en condiciones humanitarias y
con la menor alteración posible de la estructura.
Tan pronto como sea posible después de la muerte
y, en algunos casos, simultáneamente, los tejidos
deben ser fijados, un proceso que mata las células,
inactiva sus enzimas, y precipita y entrecruza las
moléculas que están en solución o suspensión
dentro de las células.
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Fijación:
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Todas estas acciones estabilizan la estructura frente
a daños en el procesado posterior.
La fijación también debe actuar como preservativo
frente al ataque microbiano y puede mejorar la
afinidad de la muestra por ciertas tinciones.
La fijación se lleva a cabo generalmente por
tratamiento
químico
aunque
en
ciertas
circunstancias se puede usar la fijación física por
calentamiento o por congelación rápida.
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Deshidratación e inclusión:
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A las células les falta rigidez y se les proporciona
artificialmente con el soporte adecuado antes del
corte, convencionalmente por inclusión.
Un medio de inclusión debe ser capaz de infiltrar el
tejido en medio líquido y entonces solidificarse por
enfriamiento o polimerización para dar el soporte
necesario a los pequeños detalles del interior de la
muestra.
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El medio más utilizado para la inclusión es la
parafina, de un grado que funde a unos 56 ºC.
Sin embargo, la parafina no es miscible con los
fluidos acuosos en los que la muestra se encuentra
y requiere que ésta sea deshidratada, generalmente
en pasos a través de concentraciones crecientes de
etanol hasta llegar al absoluto, 100%.
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El etanol es un agente deshidratante muy bueno
pero no es miscible con la parafina fundida, así que
hay que reemplazar el etanol con un fluido de
transición miscible con él y con la parafina: xileno,
tolueno o compuestos menos tóxicos.
Una vez reemplazado el etanol con este fluido, el
tejido se sumerge en parafina fundida un período de
tiempo y ésta infiltra el tejido.
Finalmente el tejido se transfiere a parafina fresca y
se deja que ésta solidifique.
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Corte:
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Puede ser posible cortar secciones a mano, sin
embargo, la mayoría de las secciones se cortan con
la ayuda de un microtomo.
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Corte:
Microtomos
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Corte:
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Con una buena técnica se pueden obtener
secciones de unas 5 µm e incluso menores en
algunos casos.
Durante el corte las secciones forman una fila unas
pegadas a otras que es cómoda de manejar y
montar.
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Corte:
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Los cortes se colocan en un porta de microscopía
limpio, generalmente flotándolos en una gota de
disolución diluida de albúmina, se calienta en una
placa hasta que la parafina se reblandezca (sin
fundir) para eliminar las arrugas en las secciones y
se deja secar en un sitio cálido.
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Tinción:
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A las secciones cortadas en parafina se les debe
eliminar ésta por inmersión en el disolvente
apropiado, tradicionalmente xileno.
Esto se sigue de una sucesión en aumento de
concentración de disoluciones acuosas de etanol
hasta que la muestra está completamente
hidratada, ya que la tinción se suele aplicar en
medio acuoso.
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Tinción:
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Una vez que el soporte de la parafina se ha
eliminado no se debe permitir que la muestra se
seque porque se causarían daños por tensión
superficial.
La tinción explota la afinidad química entre el tinte y
las sustancias presentes en la muestra.
El uso sucesivo o combinado de varios tintes,
incluyendo la hematoxilina o eosina, cada uno con
su afinidad específica, da una coloración tricolor o
más compleja a los diversos componentes tisulares.
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Tinción:
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La hematoxilina es un tinte básico (catiónico)
que se une electrostáticamente a sitios ácidos
(aniónicos) de los ácidos nucleicos (DNA y
RNA).
La eosina es un tinte ácido (aniónico) que se une
a las proteínas, las cuales se vuelven catiónicas
cuando la tinción se lleva a cabo a pH 4-5.
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Tinción:
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En el microscopio, las estructuras ricas en
ácidos nucleicos, como los núcleos celulares,
tienen el color azul de la hematoxilina, mientras
que las regiones ricas en proteínas del
citoplasma muestran la tinción roja de la eosina.
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Tinción:
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Tinción:
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Tinción:
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La forma más específica de tinción se da en la
inmunocitoquímica donde los marcadores se
unen específicamente a moléculas objetivo
dentro de la muestra por reacciones
inmunológicas.
La técnica requiere anticuerpos específicos de la
sustancia en estudio junto con una manera de
localizar el anticuerpo usando un marcador
fluorescente u otro marcador.
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Montaje:
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El paso final en la preparación de una muestra
es montarla en una lámina de vidrio,
generalmente de 25 mm x 76 mm, el
portaobjetos.
El material de montaje utilizado, el montante,
puede ser bálsamo de Canadá, glicerina,
aceites, líquidos acuosos, etc.
Una vez colocada la muestra en el portaobjetos
y con el montante, se cubre con una lámina,
disco o placa de vidrio fino, el cubreobjetos.
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Montaje:
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Montaje:
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El grosor del portaobjetos, el del cubreobjetos y
el índice de refracción del material de montaje y
su adecuación a la muestra, son factores que se
deben tener en cuenta.
El grosor del cubre es convencionalmente 0,17
mm.
El montante debe ser inerte o actuar como
preservativo frente a la degradación de la
muestra dentro de la escala de tiempo de la
observación.
Muestras no biológicas
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Los materiales no biológicos en partículas (como
granos de minerales) no requieren preparación
anterior al montaje.
En situaciones en las que se requiere mantener la
distribución de los granos (arcillas o cerámicas
porosas) la muestra original se debe impregnar con
resina y preparar una lámina delgada.
Las secciones finas de materiales blandos como
polímeros se pueden preparar usando un
microtomo.
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Las secciones finas de materiales duros (minerales,
rocas, cerámicas, cerámicas impregnadas con
resina) se preparan según la secuencia de pasos
siguiente:
1) Se corta una lámina de 1 mm de grosor o se
desprende un fragmento del material original.
2) Se monta la lámina en un porta usando Lakeside
u otro cemento.
3) Se pule un lado de la lámina.
4) Se monta la lámina boca abajo en otro porta y se
retira el primero.
5) Se pule la parte superior hasta el grosor
requerido.
6) Se pega el cubre en la superficie superior.
Técnicas de preparación para luz reflejada
Preparación inicial y montaje:
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Para facilitar el manejo, por un lado, y para
proporcionar una superficie de muestra suficientemente
grande, por el otro, las dimensiones de la muestra
deben ser del orden de 5 a 15 mm en la superficie
preparada y de 1 a 10 mm de grosor.
El corte de esta muestra a partir de una pieza más
grande de roca o de metal, por ejemplo, se debe hacer
con mucho cuidado.
En muchos casos la orientación de la superficie de la
muestra (por ejemplo en relación con la roca origen o el
componente metálico) es importante y debe quedar
registrada.
Preparación inicial y montaje:
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Para el corte de la muestra lo más apropiado y lo que
da lugar a una menor deformación en la superficie de
corte es un abrasivo en húmedo como una rueda de
metal o bakelita impregnada con alúmina, nitruro de
boro, carburo de silicio o diamante.
Pulido:
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El pulido se lleva a cabo a mano usando tiras de papel
abrasivo o utilizando discos abrasivos montados en
una rueda con sucesivos grados de grit cada vez más
finos, normalmente carburo de silicio para los grados
más gruesos, y α- y γ-alúmina y diamante para los
pulidos más finos.
El carburo de silicio se utiliza entre 58 y 15 µm de grit.
En las etapas finales el α-alúmina de 10 a 1 µm y la γalúmina de unos 0,3 µm o bien el diamante de 6 a 1
µm.
Tratamiento superficial:
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Para muchos materiales (como rocas o cerámicas) no
es necesario más tratamiento y las fases
constituyentes pueden estar suficientemente reveladas
por sus diferencias de color, birreflectancia o textura
superficial.
Para los metales y
tratamientos de etching.
aleaciones
se
requieren
En cualquier caso todos los materiales deben
examinarse en las condiciones de recién pulido para
comprobar que no existen artefactos y detectar
inclusiones gruesas o porosidad que puedan influir en
el proceso de etching.
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El etching se puede definir como un ataque selectivo
de los granos o de las fronteras interfase y/o el ataque
selectivo de las propias fases.
Los atacantes son disoluciones acuosas o alcohólicas y
mezclas de sales, ácidos y bases, etc. Cuanto más
resistentes a la corrosión son los metales y las
aleaciones, naturalmente requerirán disoluciones más
agresivas.
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El proceso de etching consiste simplemente en
sumergir la muestra en el atacante, o por electrolisis
hacer de la muestra el ánodo de una cuba electrolítica.
Generalmente se requiere un proceso de pulido final
después del etching.

4. Preparación de muestras para microscopía óptica

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