1aplicaciones-practi..

Agilent
Solutions
Aplicaciones Prácticas de la
Cromatografía Líquida y la
Espectrometría de Masas en
Investigación y Control de Calidad
Jaume C. Morales
LC-MS Product Specialist
1
Innovación Tecnológica para
Cromatografía Liquida
•
•
•
•
•
•
Amplio Portfolio UHPLC 1220, 1260, 1290
UHPLC - 1290 Infinity Cuaternario.
UHPLC Bio-Inerte
Portfolio de Nuevas Válvulas
FlexCube Online Enrichment
Nuevas Soluciones Multidimensionales
LC x LC
•
Soluciones MaxLight DAD
x10 Sensibilidad UV: “Max-Light High Sensitivity”.
x30 Rango Dinámico: “HDR-DADTechnology”.
•
Emulación ISET
Innovación Tecnológica para
Cromatografía Liquida
•
•
•
•
•
•
Amplio Portfolio UHPLC 1220, 1260, 1290
UHPLC - 1290 Infinity Cuaternario.
UHPLC Bio-Inerte
Portfolio de Nuevas Válvulas
FlexCube Online Enrichment
Nuevas Soluciones Multidimensionales
LC x LC
•
Soluciones MaxLight DAD
x10 Sensibilidad UV: “Max-Light High Sensitivity”.
x30 Rango Dinámico: “HDR-DADTechnology”.
•
Emulación ISET
Pero ¿Que es UHPLC ?
UHPLC es :
• Ultra High Pressure Liquid Chromatography. (≥ 600 bar)
• Cromatografía de alto rendimiento en columnas con relleno de partículas
sub-2-micron (STM) o de superfície porosa.
UHPLC NO es :
• La alta presión NO es ninguna ventaja, sino un efecto colateral indeseado.
¡¡La Alta Presión no separa nada !!
• Cromatografía con columnas de 2.1mm. Cualquier diámetro de columna
puede empaquetarse con partículas de STM. (4.6 , 4.3, 3.0…)
Page 4
¿Que es UHPLC ?
Características de UHPLC
Resolución y Flujo
1. Las partículas más pequeñas permiten una menor altura de
plato teórico mostrando pues una mayor resolución
cromatográfica.
2. La resolución cromatográfica sufre menos al incrementar el
flujo cuanto más pequeña es la partícula
Page 5
¿Que es UHPLC ?
3. Las partículas más pequeñas consiguen
3. Small particles lead to narrower,
picos más estrechos y más altos.
higher peaks.
LC
l
h  dP
150 mm, 5 µm
Toluene
40 mAU
6
50 mm, 1.8 µm
120 mAU
Toluene
Amax
ciVi
 
VR
October 20, 2014
Beneficios de la UHPLC
Las partículas más pequeñas
permiten una menor altura de
plato teórico mostrando pues
una mayor resolución
cromatográfica.
La resolución cromatográfica
sufre menos al incrementar el
flujo cuanto más pequeña es la
partícula
Las partículas más pequeñas
consiguen picos más estrechos
y más altos.
7
¡Mayor resolución!
¡Sin incremento de tiempo de
analisis!
¡Menor tiempo de
analisis!
¡Menor consumo de
disolventes sin perdida de
resolución!
¡Mayor sensibilidad!
Si no se aumenta el flujo
20 de octubre de 2014
Nueva Serie Agilent 1200 Infinity
Elevando el Estandard en UHPLC para el Laboratorio
1220
Infinity LC
1260
Infinity LC
1290
Infinity LC
Integrado
600 bar
80 Hz
Modular
600 bar
80 Hz
2x ó 10x Sensivilidad UV
100% HPLC Compatible
Precio HPLC
Capacidades UHPLC
Modular
1200 bar
160 Hz
El más económico
HPLC y UHPLC
Tecnologia 1260/1290
Máximo rendimiento UHPLC
Máxima Flexibilidad
Coste Servicio HPLC
Page 8
Herramienta transformación métodos
HPLC => UHPLC
“Method Translator and Cost Saving Calculator”
Esta avanzada calculadora le permite
calcular el ahorro en coste del análisis
basado no solo en los costes de
disolventes sino también de los gastos
regulares de un laboratorio.
Utilícela on-line aquí
ó
descárguela para instalarla en su PC.
9
20 de octubre de 2014
Aportaciones de la
UHPLC y MS en el
Análisis
Alimentario
10
October 20, 2014
Aplicaciones UHPLC
Análisis Agro-Alimentario
Pesticidas,
Micotoxinas y
Otros
Contaminantes
Fármacos
Veterinarios
Análisis de
Suelos
Suplementos
Dietéticos,
Compuestos
Naturales y
Aditivos
11
Autentificación
de Alimentos
October 20, 2014
Contenido
Análisis de Suelos
• PAHs in Soil
Suplementos Dietéticos, Compuestos Naturales y Aditivos
•
•
•
•
•
•
•
•
12
Antioxidants in Orange Juice
Total Sugar Content in Maple Sirup
Plant Stanyl Fatty Acid Esters in Margarine by LC-GC coupling
Water-soluble vitamins from multivitamin tablets
Fat-soluble Vitamins from food matrix
Flavonoids in Citrus Fruit
Artificial sweeteners in diet colas
Color additives in sweets
October 20, 2014
Contenido
Fármacos vetrinarios
• Growth Promoters in Animal Feedstuff
Pesticidas, Micotoxinas y otros Contaminantes
•
•
•
•
•
Acaricides in Honey
Sudan Red Compounds in Paprika Powder by online sample clean-up
Bisphenol A leaching from baby bottles
PAHs in Fish
Hormones in Shrimp
Autentificación de Alimentos
• Natural and Artificial Vanilla Preparations
• Melamine in Milk
13
October 20, 2014
PAHs en suelos (Hidrocarburos Poli-Aromáticos)
Análisis de suelos
Agilent Application
Solution
Analysis of PAHs in
soil according
to EPA 8310 method
with UV and
fluorescence
detection
Agilent Application
Note 5990-8414EN
14
October 20, 2014
Background
• Son compuestos de alta toxicidad tanto mutagénica como carcinogénica que ha
llevado a una legislación específica y rigurosa.
• Los PAHs suelen generarse en combustiones incompletas de material orgánico
como los combustibles fósiles. A través de la atmosfera alcanzan el suelo y
sedimentos en áreas apartadas de las industrias, aeropuertos y carreteras.
• Otros factores como fugas de aceites o la falta de cuidado en su manejo
contribuyen también a la contaminación.
15
October 20, 2014
Análisis de la mezcla de Patrones
Column
ZORBAX Eclipse PAH 4.6 x 150 mm, 5 μm
Mobile phase A
Water
Mobile phase B
Acetonitrile
Gradient
at 0 min 40%B, at 20 min 95%B
Flow rate
1.5 mL/min
Col.temp.:
25 °C
Inj. volume
3 µL
Data acq.
230 nm (ref. 400 nm) (DAD), 260 nm (Ex.) 350 nm, 420 nm, 440 nm, 500 nm (Em.) (FLD)
No: Name:
1
Napthalene
2
Acenaphtylene
3
Acenaphtene
4
Fluorene
5
Phenantrene
6
Anthracene
7
Fluoranthene
8
Pyrene
9
Benzo(a)anthracene
10 Chrysene
11 Benzo(b)fl uoranthene
12 Benzo(k)fl uoranthene
13 Benzo(a)pyrene
14 Dibenzo(a,h)anthracene
15 Benzo(g,h,i)perylene
16 Indeno(1,2,3-cd)pyrene
16
October 20, 2014
Cambio a método UHPLC
Ahorro de Tiempo y Disolvente
Ahorro de tiempo: 80 %
Ahorro en disolventes: 88 %
Column
ZORBAX Eclipse PAH RRHT 2.1 x 50 mm, 1.8 μm
Mobile phase A
Water
Mobile phase B
Acetonitrile
Gradient
at 0 min 40%B, at 4 min 95%B
Flow rate
0.85 mL/min
Col.temp.:
25 °C
Inj. volume
0.3 µL
Data acq.
230 nm (ref. 400 nm) (DAD), 260 nm (Ex.) 350 nm, 420 nm, 440 nm, 500 nm (Em.) (FLD)
From :
ZORBAX Eclipse PAH 4.6 x 150 mm, 5 μm
No: Name:
1
Napthalene
2
Acenaphtylene
3
Acenaphtene
4
Fluorene
5
Phenantrene
6
Anthracene
7
Fluoranthene
8
Pyrene
9
Benzo(a)anthracene
10 Chrysene
11 Benzo(b)fl uoranthene
12 Benzo(k)fl uoranthene
13 Benzo(a)pyrene
14 Dibenzo(a,h)anthracene
15 Benzo(g,h,i)perylene
16 Indeno(1,2,3-cd)pyrene
17
October 20, 2014
Rendimiento del método UHPLC
18
Metodo HPLC
October 20, 2014
Antioxidantes en Zumo de Naranja
Suplementos Dietéticos, Compuestos Naturales y Aditivos
Agilent Application
Solution
Analysis of
ascorbic acid,
citric acid and
benzoic acid in
orange juice
Agilent Application
Note 5990-8720EN
19
October 20, 2014
Background
• Los antioxidantes como el ácido ascórbico previenen la oxidación de la matriz
disminuyendo la cantidad de oxígeno disponible. El ácido ascórbico lo lleva a
cabo mediante su propia oxidación a ácido deshidroascórbico (DHA).
• Los conservantes, como el ácido cítrico y benzoico previenen o inhiben el
crecimiento de microorganismos en alimentos.
• Aunque éstos compuestos se encuentran de modo natural en algunas frutas
también se añaden para una mejor conservación de los zumos.
• Existe un cierto temor sobre la liberación del carcinógeno benceno debido a la
posible reacción del ácido benzoico con ácido ascórbico en ciertas condiciones.
• El método oficial para determinar vitamina C es oxidándola primero a DHA y
derivatizando para detectar pro FLD. El benzoico y cítrico se detectan por UV.
O
HO
O
HO
Acido ascórbico
20
HO
O
O
OH
OH
O
HO
Acido cítrico
OH
O
OH
OH
Acido Benzoico
20 de octubre de 2014
Análisis de Patrones
Column
Poroshell 120 EC-C18 4.6 x 100 mm, 2.7 μm
Mobile phase A
20 mM HK2PO4 in water, pH 2.5
Mobile phase B
Acetonitrile/methanol 40 : 60
Gradient
at 0 min 5%B, at 2 min 5%B, at 2.1 min 25%B, at 13 min 25%B, at 13.1 min 90%B, at 18 min 90%B, at 18.1 min 5 % B
Stop time:
25 min
Flow rate
1 mL/min
Col.temp.:
20 °C
Inj. volume
5 µL
Sample therm.:
4 °C
Data acq.
210 nm, 230 nm, 243.5 nm, 10 Hz (DAD)
mAU
2
No: Name:
800
1
Ascorbic acid
2
Citric acid
3
Benzoic acid
600
400
1
200
3
0
2.5
21
5
7.5
10
12.5
min
October 20, 2014
Método UHPLC
Ahorro de tiempo: 80 %
Ahorro en disolventes: 68 %
Ahorro de Tiempo y Disolvente
Column
Poroshell 120 EC-C18 4.6 x 100 mm, 2.7 μm
Mobile phase A
20 mM HK2PO4 in water, pH 2.5
Mobile phase B
Acetonitrile/methanol 40 : 60
Gradient
at 0 min 5%B, at 0.5 min 5%B, at 0.6 min 25%B, at 3 min 25%B, at 3.1 min 70%B, at 3.9 min 70%B, at 4 min 5 % B
Stop time:
5 min
Flow rate
1.5 mL/min
Col.temp.:
20 °C
Inj. volume
4 µL
Sample therm.:
4 °C
Data acq.
210 nm, 230 nm, 243.5 nm, 40 Hz (DAD)
2
mAU
No: Name:
400
1
Ascorbic acid
2
Citric acid
3
Benzoic acid
300
200
1
100
3
0
1
22
2
3
min
October 20, 2014
Vitaminas Hidrosolubles
Suplementos Dietéticos, Compuestos Naturales y Aditivos
Agilent Application
Solution
Analysis of watersoluble vitamins
from multivitamin
tablets for
nutrition labeling
Agilent Application
Note 5990-7950EN
23
October 20, 2014
Compounds & Structure
NH2
OH
HO
O
HO
N
OH
H3C
N
HO
+
N
O
OH
OH
N
S
H3C
CH3
Ascorbic acid
OH
Thiamine chloride
Pyridoxine
O
O
OH
H
N
NH
OH
NH2
HO
CH3 O
H3C
N
Nicotinamide
OH
HO
Nicotinic acid
O
Pantothenic acid
O
O
O
H3C
N
NH
O
NH
H3C
O
OH
OH
N
NH
N
O
OH
NH
H
H
N
N
OH
HO
H2N
N
COOH
S
N
Folic acid
24
HN
Riboflavin
OH
Biotin
Cyanocobalamine not shown
October 20, 2014
Analysis of Standard Mixture
Column
Poroshell 120 EC-C18 3 x 150 mm, 2.7 μm
Mobile phase A
25 mM HK2PO4 in water
Mobile phase B
Acetonitrile
Gradient
at 0 min 1%B, at 5 min 1%B, at 15 min 30%B, at 20 min 30%B, at 20.1 min 1%B
Stop time:
20.1 min
Post time:
5 min
Flow rate
0.45 mL/min
Col.temp.:
35 °C
Inj. volume
5 µL
Sample therm.:
5 °C
Data acq.
205 nm, 214 nm, 220 nm, 232 nm, 266 nm, 280 nm, 20 Hz (DAD)
No: Name:
1
Ascorbic acid
2
Nicotinic acid
3
Calcium pantothenate
4
Pyridoxine
5
Niacinamide
6
Thiamin
7
Folic acid
8
Biotin
9
Cyanocobalamine
10 Riboflavin
25
October 20, 2014
Fast UHPLC Method
Ahorro de Tiempo y Disolvente
Ahorro de tiempo: 90 %
Ahorro en disolventes: 70 %
Column
Poroshell 120 EC-C18 2.1 x 75 mm, 2.7 μm
Mobile phase A
25 mM HK2PO4 in water
Mobile phase B
Acetonitrile
Gradient
at 0 min 1%B, at 0.56 min 1%B, at 1.66 min 30%B, at 2.2 min 30%B, at 2.22 min 1%B
Stop time:
2.22 min
Post time:
1 min
Flow rate
1 mL/min
Col.temp.:
35 °C
Inj. volume
1 µL
Sample therm.:
5 °C
Data acq.
205 nm, 214 nm, 220 nm, 232 nm, 266 nm, 280 nm, 80 Hz (DAD)
From :
Poroshell 120 EC-C18 3 x 150 mm, 2.7 μm
0.45 mL/min
No: Name:
1
Ascorbic acid
2
Nicotinic acid
3
Calcium pantothenate
4
Pyridoxine
5
Niacinamide
6
Thiamin
7
Folic acid
8
Biotin
9
Cyanocobalamine
10 Riboflavin
26
October 20, 2014
LOD/LOQ
Comparable sensitivity
27
Time savings:
90 %
Solvent savings: 70 %
October 20, 2014
Acaricidas en Miel
Pesticidas, Micotoxinas y otros Contaminantes
Agilent Application
Solution
Analysis of
acaricides in
honey
Agilent Application
Note 5990-8717EN
28
October 20, 2014
Analysis of Standard Mixture
Column
ZORBAX Eclipse Plus C18 4.6 x 150 mm, 5 μm
Mobile phase A
Water
Mobile phase B
Acetonitrile
Gradient
at 0 min 40%B, at 15 min 90%B, at 20 min 90%B, at 20.1 min 40%B, at 25 min 40%B
Stop time:
25 min
Flow rate
1 mL/min
Col.temp.:
30 °C
Inj. volume
20 µL
Data acq.
230 nm, 290 nm, 10 Hz (DAD)
4
mAU
3
50
No: Name:
40
30
1
1
Rotenone
2
Coumaphos
3
Bromopropylate
4
Amitraz
2
20
10
0
10
29
12
14
16
18
min
October 20, 2014
Identification of Acaricides
Honey by UV Spectra
Bromopropylate
6
Coumaphos
Rotenone
8
4
Amitraz
mAU
2
0
6
8
10
12
14
16
18
Rotenone
Match factor = 990
30
min
Amitraz
Match factor = 994
October 20, 2014
Fast UHPLC Method
Ahorro de tiempo: 92 %
Ahorro en disolventes: 92 %
Bromopropylate
Ahorro de Tiempo y Disolvente
mAU
120
Column
ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 2.1 x 50 mm, 1.8 μm
Mobile phase A
Water
Mobile phase B
Acetonitrile
Gradient
at 0 min 40%B, at 1.16 min 90%B, at 1.557 min 90%B, at 1.56 min 40%B, at 1.93 min 40%B
Stop time:
1.93 min
Flow rate
0.9 mL/min
Col.temp.:
30 °C
Inj. volume
1.5 µL
Data acq.
230 nm, 290 nm, 40 Hz (DAD)
From :
ZORBAX Eclipse Plus C18 4.6 x 150 mm, 5 μm
20
Amitraz
Bromopropylate
40
Coumaphos
60
Rotenone
80
Amitraz
Rotenone
Coumaphos
100
0
0
31
2
4
6
8
10
12
14
16
18
min
October 20, 2014
Acople LC/MS
•6100 Single Quadrupoles
•6200 TOF
•iFunnel
•6400 Triple Quadrupoles
•DMRM, tMRM
•6500 QTOF
•RapidFire
•Qual/Quan
•MassHunter Software
Dos enfoques de Screening
La determinación de compuestos residuales puede abordarse con dos
enfoques :
• Dirigido. Número acotado de compuestos a confirmar.
•
•
•
•
Más sensible (*)
El nº de compuestos depende principalmente del sistema cromatográfico y de la
velocidad del MS.
Sin capacidad de determinar NO esperados.
Sin capacidad de análisis retrospectivo.
• NO Dirigido. Adquisición indiscriminada de Full Scan y/o MS/MS.
•
•
•
•
El nº de compuestos a detectar es mucho mayor (casi ilimitado).
La detección del compuesto se realiza a través algoritmos de deconvolución.
La acotación de compuestos detectados viene limitada por la base de datos o
librerías de los posibles compuestos a identificar
Menos sensible (*)
(*) Depende del modelo de QQQ y TOF/QTOF
33
Innovation Tour
October 20, 2014
Dos enfoques de Screening
Dirigido
No dirigido
34
Innovation Tour
October 20, 2014
Características del diseño
Triple Cuadrupolo
Capilar dielectrico frio
Celda de colision hexapolar
Cuadrupolos hiperbolicos
Detección Off-axis
Guía de iones octopolar
Una bomba turbo
1º Cuadrupolo
3º Cuadrupolo
Guía de iones octopolar
Celda de colisión (hexapolo)
Q1 sólo deja
pasar el ión
“precursor” 210
pass
Espectro con
iones del
“fondo” (API: ESI,
APCI,…)
210
Detector
Celda Colisión
rompe el ión 210
(y sus productos)
210
Q3 monitoriza sólo
los fragmentos 158 y
191 característicos
del ión 210 para
cuantificar y cualificar
con máx. sensibilidad
222
268
165
170
210
250
158
280
290
190 210
150
191 210
170
190
210
TRANSICIONES (MRM) : 210 -> 158 (Quant) y 210 -> 191 (Qual)
158
160
191
190
MRM dinámico (DMRM)
Optimizer
Mejora de la sensibilidad basado en la
especificidad de la transición a su tiempo
Si no se dispone de Kits de Agilent permite
buscar los valores de adquisición óptimos
para la cuantificación
tMRM
Confirmación espectral de los target sin barrido
ni perdida de sensibilidad
Page 36
Análisis por segmentos vs. MRM dinámico
x105
5
Segmento 1
Segmento 2
4
Segmento 3
Segmento 4
3
2
1
1
MRM
Dinámico:
No7 hay segmentos
5
6
8
9de tiempo
10
11
12
13
Counts
vs.
Acquisition
Time
(min)
La lista de MRM se confecciona de modo dinámico basándose en el RT de los compuestos de interés
2
3
4
Menor tiempo de ciclo/Mejor definición de pico
14
Abundance >>>
MRM dinámico - Simulación
Time >>>
Concurrent
Compounds
Typical results: 10 pg Atrazine on-column using Dynamic MRM
6460A QQQ with Jet Stream Technology
••
Avg. Signal Height: 15,650
•
Avg. Signal Area: 50,966
•
RSD: 3.2 %
•
Estimated LOQ: 100 fg or less
•
•
6-7 data points above FWHM
•
3 sec FWHM, 6 sec @10% valley
20 data points baseline-to-baseline
•
• •
•
3 sec FWHM
•
•
•
10% valley
• •
• • • ••
Dynamic MRM of 300 Pesticides two Transitions Each
Run with 1200-SL LC 2.1 x 100 C18 Eclipse PLUS 1.8 u
Page 40
Fundamentos del tMRM
y aplicaciones
41
Screening Dirigido
Mayor confianza en la confirmación
Innovation Tour
20 de octubre de 2014
Triple Cuadrupolo
Capilar dielectrico frio
Celda de colision hexapolar
Cuadrupolos hiperbolicos
Detección Off-axis
Guía de iones octopolar
Una bomba turbo
1º Cuadrupolo
3º Cuadrupolo
Guía de iones octopolar
Celda de colisión (hexapolo)
Q1 sólo deja
pasar el ión
“precursor” 210
pass
Espectro con
iones del
“fondo” (API: ESI,
APCI,…)
210
Detector
Celda Colisión
rompe el ión 210
(y sus productos)
210
Q3 monitoriza sólo
los fragmentos 158 y
191 característicos
del ión 210 para
cuantificar y cualificar
con máx. sensibilidad
222
268
165
170
210
250
158
280
290
190 210
150
191 210
170
190
210
TRANSICIONES (MRM) : 210 -> 158 (Quant) y 210 -> 191 (Qual)
158
160
191
190
¿Para qué sirve el triggered MRM?
Cuantificación y Confirmación : Fingerprinting
Mayor confianza en la confirmación
Enfoque de barrido:
Barrido de la huella del compuesto
Estrategia tMRM:
Foco en las características (fragmentos)
del compuesto
Dos posibles escenarios:
- Confirmación de positivos con información adicional
(confirmación espectral)
- Eliminación de negativos debido a interferencias de la matriz
43
Innovation Tour
20 de octubre de 2014
“Triggered MRM (tMRM) Data Dependent”: ~“Scan”
Especifico con la Sensibilidad y Rapidez de un MRM
1 MRM de monitorización por compuesto dispara hasta 8 MRM de
confirmación de cada uno de los compuestos detectados
Cuantificar e Identificar con la sensibilidad y rapidez de un MRM
Secondary MRM
Transitions are “Triggered”
Triggered cycle (above threshold)
Primary cycle (below threshold)
Threshold
Muy útil para cuantificación y confirmación masiva de analitos con Triple
Cuadrupolo: análisis multiresiduos, metabolitos …
Página 44
tMRM Product Ion Spectrum
x103
8
7
6
5
4
3
2
1
0
x103
8
7
6
5
4
3
2
1
0
x103
8
7
6
5
4
3
2
1
0
334 > 76
76.0
80
334 > 132
132.1
100
334 > 91
x103
8
7
6
5
4
3
2
1
0
140
91.1
80
100
334 > 145
x103
8
7
6
5
4
3
2
1
0
100
334 > 105
x103
8
7
6
5
4
3
2
1
0
145.0
140
180
105.1
80
100
120
x103
8
7
6
5
4
3
2
1
0
334 > 147
x103
8
7
6
5
4
3
2
1
0
147.0
100
140
180
334 > 117
117.0
80
x103
8
7
6
5
4
3
2
1
0
117.0
91.1 105.1
120
334 > 119
119.0
80
100
334 > 171
171.1
80
100
120
140
160
100
180
132.1
171.1
80
120
tMRM Product Ion
Spectrum
145.0
76.0
100
x103
8
7
6
5
4
3
2
1
0
120
140
160
180
334.2
200
220
240
260
280
300
320
340
tMRM Library Searching
Tebufenpyrad Standard 50 ppb
Library match score: 96.75
tMRM LC/MS Application Kits
Targeted Screening with QQQ
Pesticides
Method
-Test Mix: 253 compounds
-DB: ~700 compounds
-Library: ~250 compounds
Veterinary Drugs
tMRM
Database
Standards
LC/MS
Application
Kits
-Test Mix: 146 compounds
-DB: ~1,000 compounds
-Library: ~140 compounds
Forensic Toxicology
-Test Mix: 139 compounds
-DB: ~2,500 compounds
-Library: ~130 compounds
LC
Column
On Site
Training
Mayor confianza en la confirmación
47
Innovation Tour
20 de octubre de 2014
Muestras Reales– Tebufenpyrad en extracto de
gengibre
+ MRM (14.865-15.031 min, 13 scans) (334.2 -> * …
Counts
Counts
334.2 -> 117.0 , 334.2 -> 145.0
x10 5 Ratio = 46.9 (209.9 %)
1.8
x10 3
1.2
117.0
1
1.6
0.8
1.4
0.6
1.2
0.4
1
0.2
0
0.8
-0.2
0.6
-0.4
91.1 145.0
334.2
57.1
76.0
-0.6
0.4
147.1
-0.8
0.2
-1
117.0
-1.2
0
Reference spectrum
-1.4
14.6
48
Lib Match Score=55.9
14.8
15
15.2
15.4
Acquisition Time (min)
50
100
150
200 250 300
Mass-to-Charge (m/z)
Innovation Tour
20 de octubre de 2014
Muestras Reales– Tebufenpyrad en extracto de
gengibre
Reference spectrum
49
Innovation Tour
20 de octubre de 2014
Muestras reales – Tebuthiuron en extracto de
camamilla
Counts
229.1 -> 172.1 , 229.1 -> 116.0
x10 4 Ratio = 19.8 (100.6 %)
2.2
2
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Reference spectrum
-0.2
9
50
9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8
Acquisition Time (min)
Innovation Tour
20 de octubre de 2014
Compounds at a glance
Eficaz herramienta gráfica y rápida de revisión de resultados
51
Innovation Tour
20 de octubre de 2014
Análisis toxicológico por LC/MS
65 compuestos farmacéuticos y drogas
de abuso en orina en una sola
inyección
Jaume C. Morales
MS Product Specialist
Agilent Technologies Spain
Octubre 2011
MAD/BCN
Listado de Compuestos Target y Metabolitos
estudiados
(en orden de elución cromatográfica)
ates/Opiods
nor-Codeine
Morphine
Oxymorphone
ydromorphone
Tiempo de Retención
hydrocodeine
Opitates/Opiods
ISTDs
nor-Codeine
Morphine
morphine-d6
Oxymorphone
Hydromorphone
hydromorphone-d6
dihydrocodeine
naloxone
naloxone
Codeine
Codeine
codeine-d6
Oxycodone
Oxycodone
naltrexone
naltrexone
Hydrocodone
noacetyl morphine
oxybenzoylecgonine
esmethyltramadol
Hydrocodone
hydrocodone-d6
6-monoacetyl
morphine
6-acetylmorphine-d6
m-hydroxybenzoylecgonine
o-desmethyltramadol
nor-Fentanyl
nor-Fentanyl
norfentanyl-d5
tramadol
Heroin
tramadol-13c-d3
tramadol
Heroin
heroin-d9
tapentadol
tapentadol
tapentadol-d3
esmethyltramadol
Meperidine
Normeperidine
rbuprenorphine
Fentanyl
Trazodone
N-desmethyltramadol
Meperidine
meperidine-d4
Normeperidine
norbuprenorphine
Fentanyl
fentanyl-d5
Trazodone
Sedatives/Hypnotics
ISTDs
Sedatives/Hypnotics
ISTDs
Stimulants
Stimulants
ISTDs
7-aminoflunitrazepam
d-Amphetamine
zolpidem
morphine-d6
MDA
Flurazepam
methamphetamine
Clonazepam
hydromorphone-d6
MDMA
MDEA Nitrazepam
alpha-Hydroxytriazolam
phentermine
Flurazepam
methamphetamine
Clonazepam
mdma-d5MDMAclonazepam-d4
Nitrazepam
MDEA nitrazepam-d5
alpha-Hydroxytriazolam
phentermine
phentermine-d5
Flunitrazepam
Flunitrazepam
codeine-d6
Benzoylecgonine
Benzoylecgonine
benzoylecgonine-d8
alpha-Hydroxyalprazolam
alpha-Hydroxyalprazolam
ritalininc acid
ritalininc
acid
zopiclone lorazepam
hydrocodone-d6
Cocaine oxazepam
lorazepam
zopiclone
zopiclone-d4
oxazepam
Cocaine
cocaine-d3
2-OH-ethylflurazepam methylphenidate-d9
2-OH-ethylflurazepam
6-acetylmorphine-d6
Methylphenidate
Methylphenidate
alpha-Hydroxyethylflurazepam
alpha-Hydroxyethylflurazepam
Cocaethylene
Cocaethylene
cocaethylene-d8
meprobamateTriazolam
NorFludiazepam
norfentanyl-d5
fenfluramine
desalkylflurazepam
tramadol-13c-d3
alpha-hydroxymidazolam
heroin-d9
Alprazolam
tapentadol-d3
Temazepam
Chlordiazepoxide
meperidine-d4
Midazolam
Desmethyl diazepam
Nordiazepam
fentanyl-d5
diazepam
EDDP
eddp-d3
EDDP
eddp-d3
Propoxyphene
propoxyphene-d5
Propoxyphene
propoxyphene-d5
rpropoxyphene
7-aminoflunitrazepam
d-Amphetamine
zolpidem
zolpidem-d6
mda-d5 MDA
norpropoxyphene
Methadone
methadone-d9
Methadone
methadone-d9
Buprenorphine
buprenorphine-d4
Buprenorphine
buprenorphine-d4
Triazolam
meprobamate
NorFludiazepam
fenfluramine
fenfluramine-d10
desalkylflurazepam
Abused/Other
ISTDs
ISTDs
PCP
Verapamil
mda-d5zolpidem-d6
carisoprodol
clonazepam-d4
11-nor-9-carboxy-delta9-thc
mdma-d5
nitrazepam-d5
phentermine-d5
benzoylecgonine-d8
zopiclone-d4
cocaine-d3
methylphenidate-d9
cocaethylene-d8
fenfluramine-d10
alpha-hydroxymidazolam
alprazolam-d5
Alprazolam
alprazolam-d5
Temazepam
chlordiazepoxide-d5
Chlordiazepoxide
chlordiazepoxide-d5
midazolam-d4
Midazolam
midazolam-d4
Desmethyl diazepam
Nordiazepam
diazepam-d5
diazepam
diazepam-d5
>65x Iones
positivos
AbusedI
PC
Verap
car
carisop
11-nor-9-carbo
11-nor-9-ca
Isobáricos – La separación cromatográfica es de
gran ayuda.
Iones de masa Isobárica – “Definidos como iones diferentes que tienen masa idéntica”
Morphine
(C17H20NO3)
[M+H]+ = 286 m/z
Codeine
(C18H22NO3)
[M+H]+ = 300 m/z
Methamhetamine
(C10H16N)
[M+H]+ = 150 m/z
Hydromorphone
(C17H20NO3)
[M+H]+ = 286 m/z
Hydrocodone
(C18H22NO3)
[M+H]+ = 300 m/z
Phentermine
(C10H16N)
[M+H]+ = 150 m/z
hydrocodone
codeine
hydromorphone
morphine
methamphetamine
phentermine
Cromatografía –
Es la Base del Método Analítico
Método HPLC Toxicológico – Screen/Quant
Exhaustivo en 6 min.
Agilent 1260 HPLC series Binary Pump, Well Plate Sampler, Thermostatic Column Compartment
Column:
Injection volume:
Column Temp:
Needle Wash:
Mobile Phase:
Flow rate :
Stop time:
Equilibration time:
Gradient:
Zorbax Poroshell 120 SB C18 (2.1 x 100 mm 2.7µm)
5 µL
55°C (Analytical column)
MeOH (100%)
Pump A = H2O & 5mM NH4 Formate & 0.01% Formic acid
Pump B = Methanol & 0.01% Formic acid
0.5 ml/min
6.0 min
1.5 min
Time (min)
0.0
0.5
3.0
4.0
6.0
%B
10
15
50
95
95
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC:
Poroshell 120 es una opción de columna de alta eficacia y resolución
para mejorar la productividad en LC y LC/MS
Características de las Poroshell 120 :
• 80-90% eficacia de las sub 2um
• A ~40-50% menor presión
• 2X eficacia de 3.5um (totalmente porosa)
Sin el doble de presión de las 3.5um
• Frita de 2um para reducir obturaciones
• Límite de presión de 600 bar para el uso
en HPLC o UHPLC.
•
La partícula porosa está formada por un
núcleo sólido de 1.7um diam. y una capa
porosa exterior con un grosor de difusión
de 0.5um.
0.5um
1.7um
0.5um
Análisis Toxicológico Dirigido (Target) por QQQ
Observaciones :
El potencial de un conjunto tan abundante de compuestos (>65) podría mermar
las posibilidades de un instrumento QQQ, con limitaciones de dwell-time :
•Exhaustivo Barrido y Cuantificación en 6 min.
•Con Patrones Internos ( 20 )
•Curvas de Calibrado con Patrón Externo ( 65 )
•Con éstas condiciones, un método ‘normal’ Multi Reaction Monitoring (MRM) de
MS/MS resultaría muy comprometido debido a la cantidad de analitos (2
transiciones x cada uno) además de los respectivos Patrones Internos
isotópicos.
• El número de MRMs en éste exhaustivo método asciende a >170 en éstas
condiciones.
•Es necesario enfocarlo a un análisis por Dynamic MRM
Dwell-time : tiempo que el QQQ dedica a cada transición en cada ciclo
Listado de algunas Drogas y Metabolitos y sus
condiciones de adquisición
(Dynamic MRM)
Compound Name
Oxymorphone
Oxymorphone
Morphine
Morphine
Hydromorphone
Hydromorphone
Codeine
Codeine
Naloxone
Naloxone
Oxycodone
Oxycodone
Naltrexone
Naltrexone
Hydrocodone
Hydrocodone
6-monoacetyl morphine
6-monoacetyl morphine
d-Amphetamine
d-Amphetamine
methamphetamine
methamphetamine
MDMA
MDMA
ISTD?
























Prec Ion MS1 Res
302.1
Unit
302.1
Unit
286.2
Unit
286.2
Unit
286.2
Unit
286.2
Unit
300.2
Unit
300.2
Unit
328.2
Unit
328.2
Unit
316.2
Unit
316.2
Unit
342.2
Unit
342.2
Unit
300.2
Unit
300.2
Unit
328.2
Unit
328.2
Unit
136.1
Unit
136.1
Unit
150.1
Unit
150.1
Unit
194.1
Unit
194.1
Unit
Prod Ion MS2 Res
284
Unit
227
Unit
165.1
Unit
152
Unit
185
Unit
157
Unit
165.1
Unit
58.1
Unit
310
Unit
211.9
Unit
298.1
Unit
256.1
Unit
324
Unit
55
Unit
199
Unit
128
Unit
165.1
Unit
43.1
Unit
119.1
Unit
91
Unit
119
Unit
91
Unit
163
Unit
105
Unit
Frag (V)
117
117
158
158
159
159
158
158
91
91
143
143
117
117
159
159
158
158
66
66
92
92
97
97
Pain Management
CE (V)
17
29
41
60
29
45
45
29
17
41
17
25
21
41
29
65
41
60
5
17
5
17
9
25
Ret
Ret Time Window
0.8
0.5
0.8
0.5
0.85
0.7
0.85
0.7
1.03505
0.7
1.035667
0.7
1.76505
0.5
1.768633
0.5
1.81
0.5
1.81
0.5
1.911033
0.5
1.911033
0.5
1.99
0.5
1.99
0.5
2.05
0.5
2.05
0.5
2.072517
0.5
2.072517
0.5
2.177967
0.5
2.177967
0.5
2.2718
0.5
2.2718
0.5
2.284667
0.5
2.284667
0.5
Polarity
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Fácil Desarrollo y Personalización del Método
Base de Datos que
contiene más de 200
compuestos.
Cada uno con
mútiples transiciones
MRM para asegurar
una rápida creación y
desarrollo del
método
Find By MRM (Cualitativo)
65 Analitos Toxicológicos /37 ISTDs
(Ionización Positiva)
Revisión de los espectros tMRM
Los espectros MRM pueden buscarse utilizando NIST LC/MS/MS o librerías própias
List of Analytes and ISTDs (a)
(Listed in order of Elution)
Opitates/Opiods
ISTDs
nor-Codeine
Morphine
morphine-d6
Increasing Retention Time
MDA
mda-d5
methamphetamine
hydromorphone-d6
dihydrocodeine
MDMA
mdma-d5
MDEA
naloxone
Codeine
ISTDs
d-Amphetamine
Oxymorphone
Hydromorphone
Stimulants
codeine-d6
phentermine
phentermine-d5
Benzoylecgonine
benzoylecgonine-d8
Oxycodone
ritalininc acid
naltrexone
zopiclone
zopiclone-d4
Hydrocodone
hydrocodone-d6
Cocaine
cocaine-d3
6-monoacetyl morphine
6-acetylmorphine-d6
Methylphenidate
methylphenidate-d9
m-hydroxybenzoylecgonine
Cocaethylene
cocaethylene-d8
o-desmethyltramadol
meprobamate
nor-Fentanyl
norfentanyl-d5
tramadol
Heroin
tramadol-13c-d3
tapentadol
tapentadol-d3
heroin-d9
N-desmethyltramadol
Meperidine
meperidine-d4
Normeperidine
norbuprenorphine
Fentanyl
fentanyl-d5
Trazodone
EDDP
eddp-d3
Propoxyphene
propoxyphene-d5
norpropoxyphene
Methadone
methadone-d9
Buprenorphine
buprenorphine-d4
fenfluramine
fenfluramine-d10
List of Analytes and ISTDs (b)
(Listed in order of Elution)
Sedatives/Hypnotics
ISTDs
7-aminoflunitrazepam
zolpidem
zolpidem-d6
Increasing Retention Time
Flurazepam
Clonazepam
clonazepam-d4
Nitrazepam
nitrazepam-d5
Abused/Other
ISTDs
PCP
pcp-d5
Verapamil
carisoprodol
carisoprodol-d7
11-nor-9-carboxy-delta9-thc
11-nor-9-carboxy-delta9-thc-d9
alpha-Hydroxytriazolam
Flunitrazepam
alpha-Hydroxyalprazolam
lorazepam
oxazepam
2-OH-ethylflurazepam
alpha-Hydroxyethylflurazepam
Triazolam
NorFludiazepam
desalkylflurazepam
alpha-hydroxymidazolam
Alprazolam
alprazolam-d5
Temazepam
Chlordiazepoxide
chlordiazepoxide-d5
Midazolam
midazolam-d4
Desmethyl diazepam
Nordiazepam
diazepam
diazepam-d5
*NB – Not all ISTDs are shown in these slides
Matrices Típicas en el Análisi Toxicológico
Matrices Comunes
• Orine
• Sangre
• Sangre directa
• Plasma
• Suero
Matrices Alternativas
• Fluido Oral
• Sudor
• Pelo
• Meconio
Enfoques en la preparación de muestra (Orine)
•Diluir e inyectar
– Otras opciones incorporando:
•
•
–
–
–
–
Inorganic acid hydrolysis
Glucuronidase hydrolysis
La más rápida preparación
Puede sufrir de efecto matriz (supresión iónica) en muestras de alta carga.
Menor sensibilidad
Posibilidad de un alto numero de Falsos Negativos
•Extracción en Fase Sólida (SPE)
–
–
–
–
–
–
Diferentes técnicas y fases dependiendo de la naturaleza ácida/básica del analito
Un solo protocolo no es necesariamente bueno para todos los analitos en conjunto.
Típicamente mayor tiempo de preparación de muestra
Más caro
Muestras más Limpias
Mayor Sensibilidad
Preparación de muestra. SPE (Compuestos Básicos)
Paso 1: 1ml orina + 100ul de β-glucuronidasa (requiere 6,200 units/ml de orina;
utilizando al menos 10,000 units/ml) 60°C durante 2 horas
[β-glucuronidase usada (≥100,000 units/ml)]
Paso 2:
Plexa DAU (30 mg)
Sample
0.2 mL urine
Sample Pre-treatment
Dilute 0.6 mL 100 mM KH2PO4
SPE-Conditioning
1/
2/
0.5mL MeOH
0.5 mL H2O
SPE-Washes
1/
2/
0.5mL 50% MeOH in H2O
Dry for 5 minutes
Elution
0.5 mL 50:50:5
(EtAc:MeOH:NH3OH)
Las muestras se evaporaron hasta los ~200 μL y se añadieron
100 μL de HCl 0.2% en MeOH. Luego se evaporaron a sequedad y
se reconstituyeron en 100 μL de Ácido Fórmico 0.01%
Preparación de Muestra – Diluir e Inyectar
Paso 1: 1ml orina + 100ul de β-glucuronidasa (requiere 6,200 units/ml de
orina;
utilizando al menos 10,000 units/ml) 60°C durante 2 horas
[β-glucuronidase usada (≥100,000 units/ml)]
ó
1ml orine + 100ul de HCl 5M, 60°C durante 1 hora
Paso 2:
Sample
Sample Pre-treatment
Conditioning
Dilution in Water 1/10
3K filtration @ 12,000 RPM
Centrifuge spin filter
Decant Supernatant into
sampling well or vial.
Resultados de Sensibilidad 6420 QQQ
Diluir/Inyectar (dil. 1/10) versus SPE
6-monoacetyl morphine
buprenorphine
codeine
dihydrododeine
EDDP
fentanyl
heroin
hydrocodone
hydromorphone
meperidine
methadone
morphine
naloxone
naltrexone
N-desmethyltramadol
norbuprenorphine
norfentanyl
normeperidine
norpropoxyphene
o-desmethyltramadol
oxycodone
oxymorphone
propoxyphene
tapentadol
tramadol
trazodone
ULOQ
(ng/ml)
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
Compuesto
Sedantes
Opiáceos
Compuesto
D/Shoot
SPE
LLOQ
LLOQ
(ng/ml) (ng/ml)
10
<1
10
1
25
<1
25
<1
10
<1
1
<1
10
<1
10
<1
5
<1
5
<1
10
<1
5
<1
5
<1
10
<1
10
1
25
3
1
<1
5
<1
5
<1
5
<1
10
<1
5
<1
5
<1
5
<1
1
<1
1
<1
2-OH-ethylflurazepam
7-aminoclonazepam
7-aminoflunitrazepam
alpha-OH-midazolam
alprazolam
a-OH-alprazolam
a-OH-triazolam
chlordiazepoxide
clonazepam
desalkylflurazepam
diazepam
flunitrazepam
flurazepam
lorazepam
midazolam
nitrazepam
nordiazepam
oxazepam
temazepam
triazolam
zolpidem
D/Shoot
LLOQ
(ng/ml)
200
10
5
10
10
20
50
10
25 to 50
20
10
10
5
50
10
25
25
50
25
5
5
SPE
LLOQ
(ng/ml)
5
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
1
<1
1
1
20
<1
5
<1
25
<1
<1
<1
ULOQ
(ng/ml)
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
500
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
Resultados de Sensibilidad 6420 QQQ
Diluir/Inyectar (dil. 1/10) versus SPE (continuación)
Estimulantes
Compound
amphetamine
benzoylecgonine
cocaethylene
cocaine
fenfluramine
MDA
MDEA
MDMA
meprobamate
methamphetamine
methylphenidate
m-hydroxybenzoylecgonine
phentermine
zopiclone
D/Shoot
LLOQ
(ng/ml)
5
5
5
5
1
5
1
5
10
1
5
10
1
5
SPE
LLOQ
(ng/ml)
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
5
<1
<1
<1
<1
<1
Otros
ULOQ
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
Compound
11-nor-9-carboxy-THC
carisoprodol
PCP
ritalinic acid
verapamil
D/Shoot
LLOQ
(ng/ml)
5
1
5
2
SPE
LLOQ
(ng/ml)
25
1
<1
1
<1
ULOQ
1000
1000
1000
1000
Rendimiento de la Poroshell 120
después de 3000 inyecciones (Dil e Iny)
Analito
%RSD
(RT)
Analito
%RSD
(RT)
Analito
%RSD
(RT)
Morphine
0.7
Meperidine
0.4
Triazolam
0
Codeine
0.4
zolpidem
0.3
Naltrexone
0.1
hydrocodone
0.4
Fentanyl
0.1
chlordiazepoxide
0.1
MDMA
0.3
EDDP
0.1
Desmethyl
diazepam
0.1
norFentanyl
0.2
Nitrazepam
0.1
Buprenorphine
0.3
Heroin
0.2
Propoxephine
0.1
Cocaethylene
0.2
Methyl
Phenidate
0.2
Buprenorphine
0.3
11-nor-9-carboxydelta9-thc
0
Muestra de algunos de los analitos en el análisis de 6 min.
N UEVO 6 4 9 5 L C / M S T RIPLE C UADRUPOLO
¡Sensibilidad a niveles de Zeptomol!
Prestaciones máximas en un tamaño más reducido
iFunnel Technology
• Un nuevo paradigma en el muestreo de iones a presión atmosférica
• 30X sensitivity en ESI
• Mejora de la robustez de los ensayos y simplifica la
preparación de muestra
Celda de colisión curvada
• Transmisión muy eficiente; ruido minimizado
• Diseño compacto
Nuevas posibilidades en scan
• Aislamiento del ion precursor a 0.4 m/z precursor,
que reduce interferencias
• Dynamic MRM (DMRM)
• Triggered MRM (tMRM)
iFunnel Technology Captura x10 veces más Iones
Agilent Jet Stream
Hexabore Capillary
Dual Ion Funnel
• Confinamiento térmico
de la pluma de ESI.
• Muy eficiente
desolvatación para crear
iones en fase gaseosa.
• Crea una zona rica en
iones.
• Capilar con 6 entradas.
• Elimina el gas, pero
captura los iones
4-26m
Página
73
• Muestrea x10 más gas
rico en iones de la fuente.
• Elimina el ruido de
neutros
• Captura la mayor parte del
gas de la región de la
• Prolonga la vida útil de
fuente.
la bomba turbo
Ion Funnel de 2 Etapas Desalineadas
1ª Etapa: 8-12 Torr
2ª Etapa: 1-3 Torr
• Elimina una elevada carga de gas
• Reduce neutros
• Mejora la robustez
• Transmite iones muy
eficientemente hacia óptica de Q1
2 etapas desalineadas -----: favorece la transmisión de sólo iones
Página
74
Muchas Gracias
por su
Atención
Mass Spectrometry
Technology
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