MANUAL PARA EL CULTIVO DE MICROALGAS Bi LOGO
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MANUAL PARA EL CULTIVO DE MICROALGAS Bi LOGO
UNIVERSIDAD AUT NOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR `REA INTERDISCIPLlNARIA DE CIENCIAS DEL MAR DEPARTAMENTO DE BIOLOG A MARINA MANUAL PARA EL CULTIVO DE MICROALGAS MEMORIA T CNICA DE UN TRABAJO PROFESIONAL QUE COMO UNO DE lOS REQUISITOS PARA OBTENER El Bi LOGO T TULO DE MARINO PRESENTA ABRIL KARIM ROMO PI ERA la Paz B C S diciembre de 2002 f 1 y 0 t OTEC 054616v rTE I 26G3 I I L v AUT NOMA UNI TERSIDAD I BAJA CALJFORNli SlJR Ap 1J1J lit Co lo Posl o I L I dJ RicA I TUmiSl ll DE D k 1ll 1110 T h Illi l IJ I j d 12li 0 132 ItC S bx In os 01 In 10 RL CIE CL S DI 1111 1I1 I l I 119 11 1JI 23lJliO L R 11ngiJ tri n 1 F ccha BIOL lAR EMELIO BAIUAlJ GONZAL 2 0 Z BIOLOG A JEFE DEL DEPARTAMENTO DE bu iL t 2 3 1 lARINA PRESF NTE firmantes comunicamos abajo realiz el ron la pas Con el Titulo lIItc 1Q J Q J e R o C l C C c rJ Dilœ1 p Il1kr 1 1 1 r eld Sf c T i L J h i l n Q0 Nombre C Completo D r uLtr J 1œ 1 el C I I 1 11111 ti L l1ciJ SI CRET RIO 1 OC 111 1 I I ok Sll ll ll Firll1J SUPLE7 TE c Id I Z Completo il hlllri 1 I 1 Completo IllkIJ 1 j t Nombre 1 d r BG h R Nombre ec l a l ttv c 1C eje rllx qut a cr pjF Completo Q hf O i RQt de Tesis Trabajo t@A l Jt ve J ˙ Numbrl CO llpkt U f LOlhvo s lclo el J uL o lf L irt lŁ Cl mpklO Nombre ´ jJ e1 pQ it ombI que habiendo A6 LJ Ot 5 C rr u rr Usted 1 u Los Itr s DIRECTOR DEDICATORIA A Dios A Osmar por existir por su amor A Daniel comprensi n por su amor y por ser lo mejor compaæ a de mi vida y apoyo siempre y en todos aspectos A mis padres Laura y Francisco por su cariæo confianza y apoyo vida A mis hermanos Paco Laura y Yazm n por su cariæo en toda mi AGRADECIMIENTOS Muy especialmente a Erika por su amistad ayuda y enseæanza tanto profesional como personalmente por las revisiones ideas correcciones y demÆs inicio Al cosas en Doc hechas a este documento Østa Ærea Gracias Rangis por ayuda que me A los demÆs su amistad ha brindado integrantes amigocha Jefe del sus ademÆs de ahora si quedo ser enseæanzas iPor fin aqu la persona que me listo las comidas y esta la tesis por toda la proyecto Cultivo de Pteridos Hector Hugo Champ tambiØn la y Alex a quien agradezco ademÆs del acomodo de grÆficas ayuda en la revisi n ndices fotograf as etc de este documento A mis compaæeros de generaci n X el Ofelia y Carlitos con quienes logre ademÆs de un trabajo en equipo una gran amistad En especial a Marichu por su cariæo y bastantes platicas y parrandas junto a Ella al Negrito por su amistad y a ambos gracias por adoptar a mi hijo como su sobrino y en la impresi n de este trabajo A mis compaæeros de trabajo en la Unidad Don Cuiti por sus dulces y platicas A Micke por la ayuda elØctrica e hidrÆulica en el laboratorio a Edgar por su ayuda para los cultivos masivos a Esther por sus platicas ademÆs de su ayuda con los anÆlisis bacteriol gicos a Efra n por su amistad por darme una mano cuando necesitaba ayuda y por ser nano de mi hijo cuando lo he necesitado Gracias tambiØn a Marco Cadena por que a Roberto Carmona por la ayuda parte de mi comitØ revisor al igual la parte estad stica de este trabajo ser en Romo Piæera Abril UABCS Karim 2001 Manual para el cultivo de mieroalgas Memoria tØcnica profesional 50pp NDICE PRO LOGO 1 G LO SARIO 2 1 3 mTRO D Ue el o N 2 o BJETIV o 9 3 CONTROL DE LOS REQUERIMIENTOS F˝SICOS Y QU˝MICOS EN EL LADO RA TO RIO 9 3 1 PARAM ETROS FISICOS 9 3 2 PARAM ETROS QUI M ICOS 11 4 12 EQUIPO DE TRABAJO 4 1 AREA DE GAS I N ETE 12 4 2 AREA H U M ED A 18 4 2 1 TRATAMIENTO DEL AGUA UTILlZADA 18 20 2 2 CULTIVOS MASIVOS 4 5 ASPECTOS IMPORTANTES DEL CULTIVO DE MICROALGAS 5 1 CONT AMINA e 10 N 5 1 11NDICADORES DE 5 1 2 INDICADORES DE 22 CONTAMINACi N QU MICA CONTAMINACi N BIOL GICA 5 2 CONTROL DE LA CALIDAD DEL AGUA 5 3 I N oe u LO MARINA 23 23 25 5 1 SIEMBRA EN LIQUiDO 4 28 S LIDO BACTERI OL G ICOS 4 2 SIEMBRA EN 5 AN`LI S IS 23 24 5 4 NIVEL CEP ARIO 5 5 22 30 33 6 EVALUA CIO N DE LA BIOMASA 6 1 HEMA TOCIT METRO O C`MARA 35 DE NEUBAUER 6 2 E SPECTo FOTO METR O 35 37 2 1 CURVAS DE 6 38 CALIBRACi N Romo Piæera UABCS Abril Karim 2001 Manual para el cultivo de mieroalgas Memoria tØcnica profesional 50pp 7 IES ESPEC EXISTENTES EN EL LEAP 44 r Bm LIOG RAFIA ANEXO I 45 FORMULACI N PARA LA PREPARACI N DEL MEDIO DE CULTIVO F 2 DE GuaLARD y RYTHER 1973 47 ANEXO n BIT` CORAS DE APARA TOS 49 r BITAeoRA AUTOCLAVE 50 r BITAeo RA MICROSCO PIo 51 BITAeo RA BALANZA 52 BITAeo RA DESTILADOR 53 BIT`CORA SISTEMA DE FILTRACI N ANEX O ID CRIS TALERIA E IRRADIACI N DE AGUA INVENTARIO 54 MARINA 55 ANEXO IV PROTOCOLO DE USO DEL SISTEMA DE FILTRACION E RAD lACIO N D E AGUA MARINA IR NDICE Figura Figura Figura Figura 56 DE FIGURAS Y TABLAS 1 Curva representativa de crecimiento de un cultivo estÆtico de Material utilizado para cultivos estÆticos 3 Autoclave para esterilizaci n de material 4 Campana de flujo laminar Utilizada para siembras y elaboraci n de vitaminas esterilizadas Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura 2 Cristaler a 5 Destilador de agua 6 Sistema de filtraci n 7 e irradiaci n de agua marina Sistema hidrÆulico plÆstico montada 10 Estante con a en nivel el sistema de cepario columpio y cultivos estÆticos en la campana de flujo laminar colocados sobre una pipeta de 5 mL agar Sembrado en zig zag sobre agar 13 Tubos 14 cultivos con cepario 19 21 precisi n 12 Siembra del 16 20 marino 9 Bolsa de Horno de 15 18 8 Cultivos masivos 11 8 microalgas 13 21 25 27 28 31 32 11 Romo Piæera UABCS Abril Karim 2001 Manual para el cultivo de mieroalgas Memoria tØcnica profesional 50pp Figura 15 Diiluci n del cultivo para la toma de muestra en un anÆlisis bacteriol gico 34 Figura un 16 CÆmara de conteo Neubauer Utilizada para cultivo conocer la concentraci n de 35 Figura 18 Tendencia de la regresi n entre la absorbancia y la densidad de Isochrysis galbana en cultivos de 1 OOL Figura 19 Tendencia de la regresi n entre la absorbancia y la densidad de Monochrysis luther en cultivos de 1 OOL Figura 20 Tendencia de la regresi n Dunalliela tertiolecta Figura 21 en 39 39 entre la absorbancia y la densidad de cultivos de 1 OOL 40 Tendencia de la Chaetoceros gracilis regresi n entre la absorbancia y la densidad de en cultivos de 1 OOL 41 entre la absorbancia y la densidad de Figura 22 Tendencia de la regresi n Isochrysis galbana en cultivos de 400L Figura 23 Tendencia de la regresi n entre la absorbancia y la densidad de Monochrysis luther en cultivos de 400L Figura 24 Tendencia de la regresi n entre la absorbancia y la densidad de Dunalliela tertiolecta Figura en cultivos de 400L 42 42 43 25 Tendencia de la Chaetoceros gracilis Tabla 1 Relaci n de Tabla 11 regresi n entre la absorbancia y la densidad de en cultivos de 400L interruptores y Tiempos de irradiaci n para los 1O lÆmparas 14 matraces Tabla 111 Relaci n del volumen de agua marina yagua destilada Tabla IV Proporci n de vitaminas y silicatos de acuerdo al valumen 44 26 a 29 utilizar ili Romo Piliera UABCS Abril Karim 2001 Manual para el cultivo de microalgas Memoria tØcnica profesional 50pp PR LOGO La Unidad ubica en junto al Pichilingue de la Universidad Aut noma de Baja California Sur el km 16 de la carretera La Paz La mar Unidad en un Ærea concesionada depende acadØmica Coordinaci n de Ciencias del Mar debido a y administrativamente de la la naturaleza de las actividades que la acuacultura y la pesca Para el aæo de 1993 el Laboratorio Experimental de Acuacultura de la Unidad se desarrollan Pichilingue se Pichilingue como son LEAP de la Universidad Aut noma de Baja California Sur inicia sus nivel superior y la investigaci n actividades para respaldar la docencia a teniendo como l neas prioritarias el cultivo de moluscos y el cultivo de peces marinos Siendo tambiØn sede de la Maestr a en Ciencias en Acuacultura del Programa Regional de Posgrado El LEAP consta de laboratorio seco Æreas donde en Acualcultura especializadas se localizan las divididas Æreas de en dos secciones Histolog a El Qu mica Microbiolog a y Microalgas El laboratorio hœmedo donde se encuentran las Æreas de Cultivo de Microalgas Cultivo de Moluscos Cultivo de Peces Planta de Alimentos Balanceados y Ærea de Temperatura Controlada Todas las Æreas tienen como principio dar respaldo a las labores docentes y de investigaci n en particular para la realizaci n de prÆcticas capacitaci n y entrenamientos para el asesoramiento continuo de los trabajos de tesis para los estudiantes de licenciatura maestr a y doctorado tanto de nuestra Instituci n como de las Instituciones de educaci n superior o investigaci n espec ficos con las que se as como tengan convenios vigentes 1 Romo Piiera Abril Karim UABCS 2001 Manual para el cultivo de Memoria tØcnica microalgas profesional 50pp GLOSARIO AGAR Polisacarido extra do como AISLAMIENTO agente de Gelidium y otras algas marinas utilizado en medios de cultivo solidificante Obtenci n de cultivos monoalgales a partir de muestra de una agua ASEPSIA Estado libre de BACTERIA Procariota unicelular CEPA Cultivo puro de COSECHA Extracci n de alcanzado ESTERILIZACi N una especie microalgas una Destrucci n microorganismos pat genos del determinada de recipiente microorganismos de cultivo una vez que han densidad deseada total de todos los organismos que viven en un volumen de agua FOTOAUT TROFOS FOTos NTESIS Organismo capaz de sintetizar su sustancias inorgÆnicas usando la luz Proceso de s ntesis propio como de carbohidratos carbono yagua utilizando energ a clorofila en las cØlulas vegetales fuente de partir Organismo INOCULAR Procedimiento de transferencia de a partir en de captada por compuestos orgÆnicos complejos microalgas de energ a de bi xido radiante de la luz HETER TROFOS que necesita fuente de carbono a alimento la como los diferentes niveles del cultivo MEDIO DE CULTIVO Soluci n MIXOTR FICOS Organismo u otro substrato utilizado para cultivar de capaz reproducirse en microorganismos luz u pueda utilizarse en presencia de oscuridad NUTRIENTE TØrmino genØrico para cualquier sustancia los procesos metab licos de pH Logaritmo negativo virtud de la cual se un ser que vivo de la concentraci n del ion expresa el grado de acidez o hidr geno por alcalinidad de un l quido SOLUCi N STOCK Soluci n fÆcil que contiene el medio de cultivo concentrado para su manejo 2 Romo Piflera UABCS Abril Karim 2001 Manua para el cultivo de mieroagas Memoria tØcnica profesional 50pp INTRODUCCi N 1 El cultivo de considerando conocido microalgas en cultivos de apoyo como esta definici n tambiØn al cultivo de desarrollo de los cultivos esto principales en su suministro de medio de biomolØculas energ a por transformados complejos travØs a la mayormente contribuyen a reservorios de estos pilares La posici n producci n por estos Hoff y Snell 2001 se han sustituir podido larvaria aporte como de primordial es microalgas son las Estas en los ocØanos ciclo encargadas microalgas el en su sintetizadas de elementos de biomasa organismos Es as como Las de la fotos ntesis bases de Østas debido al o zooplancton anexos para los moluscos durante todo es de vida crustÆceos y peces etapa cultivos o del menos las que son estuarios lagos y dentro de las redes tr ficas forman los de las biomolØculas sintetizadas energ a hasta el momento estos fuente nutricional para microorganismos cualquier organismo en no cultivo Caæizares et al 1994 El tØrmino otros microalga pigmentos se refiere fotosintØticos sentido taxon mico alguno a aquellos microorganismos que contienen clorofila y capaces de realizar fotos ntesis y dentro del mismo se Este tØrmino incluyen organismos con no tiene dos tipos celulares distintos cianobacterias que tienen estructura celular procariota y las restantes microalgas con estructura celular eucariota Pese fisiol gicamente ambos tipos metabolismo fotosintØtico generalmente los de microalgas procariotas cianobacterias con tiempos y de 8 a las grandes diferencias eucariota y similar al de las por divisi n binaria a procariota plantas superiores de duplicaci n 24 horas o de son La una estructurales similares con un reproducci n hora o menos mÆs para las eucariotas es para Carpenter 1979 Dawes 1991 stos organismos de biomolØculas sintetizadas primarios a energ a composici n qu mica de su Son pared otras caracter sticas puedan fotosintetizadores seleccionar a organismos celular el tipo son partir considerados de la transformaci n de unicelulares de clorofila utilizadas para clasificarlas aquellas que puedan como los y de cuales productores energ a luminosa dependiendo pigmentos accesorios permiten que cultivarse los Carpenter de entre de tal diversidad 1979 la se Hoff y Snell 2001 3 Romo Pinera Abril Karim UABCS 2001 No todas las requieren Æcidos de pueden reproducirse microalgas igual en heterotr ficamente luminosa y sustancias otras de energ a Memoria tØcnica microalgas profesional alga de luz de nutrientes Aœn cuando especies se la algunas al que no los azœcares y es que Hoff y Snell 2001 encuentran virtualmente cada clase en de obtener la capacidad en energ a la utilizaci n de la utilizando bi xido de carbono as qu mica obligados de este grupo se con base a anÆlisis en experimentaci n especies pueden de estas cuando los niveles de nutrientes como a mixotr ficas esto son la oscuridad algunos integrantes Ufotoaut trofos tales necesidades alternando a explic como se 1974 orgÆnicas Oroop como o en sus transformaci n que fotoaut trofas compuestos orgÆnicos fotoaut trofa tiene la dependiendo su son verdaderas heter trofas debido son forma muchas otras presencia El Cabe mencionar etiquetados este grupo en heter trofas y mixotr ficas taxon mica del grupo energ a algunas de luz y toman la orgÆnicos Las incluidas especies de esta secci n principio como Manual para el cultivo de SOpp transformarse encuentran sustancialmente arriba han sido con en heter trofas por o niveles de debajo de las condiciones naturales Gladue 1991 El crecimiento crecimiento mieroalgal aquel es microalga de tolerancia de una Es por la fluctœa para un Caæizares conocer potencial en el cultivo de crecimiento crecimiento activo es del como en depende salinidad y Al igual influencia que en intervalo de como cualquier conseguir para in culo Caæizares otro el crecimiento de la temperatura de carbono y energ a ox geno y los l mites parÆmetros Ahora cambian cuando un mencionar que mÆs que la influencia de de mieroalgas m nimo y f sicas su en suministro de luz aireaci n vivo las condiciones f sicas Cada especie presenta preferencias espectrales de un cultivo qu micas desarrollar pueden 1994 microalga producci n un viable de tamaæo organismo intensidad de luz para la critico tanto de la concentraci n de que las cØlulas nutrientes y microelementos adecuadas condiciones temperatura al m nimo ptimas las condiciones parÆmetro generalmente grado un pr ximas 1994 Por tanto I ecesario decir el factor Iimitante del el mayor nœmero de o En el cultivo masivo el rendimiento alcanzado las cØlulas es cantidades mÆs en para todos l mites o del m nimo ley importante microalga estas condiciones segundo parÆmetro rige que estÆ presente necesario para la bien se un solo tienen gran un salinidad bi xido mÆximo crecimiento TambiØn parÆmetro es el particular conjunto de se debe parÆmetros 4 Romo Pilera UABCS lo que Abril Karim Manual para al cultivo de 2001 Memoria tØcnica microa gas profesional 50pp determinadas crea el crecimiento de las en respuestas microalgas Caæizares 1994 Como de convertir la encargadas de periodos sus discontinuos o luminosa energ a Østa a en pueden las microalgas ser continuos dentro del cultivo distribuci n de la luz a las cØlulas activas evitando que se su para previene y 1986 la mejor aprovechamiento mejora que permanezcan fotosintØticamente asegurando sedimenten tambiØn de oscuridad de las cØlulas y los nutrientes homogØnea dejÆndolos disponibles y mediante luz artificial periodos con el ciclo natural d a y noche Richmond la distribuci n fotoaut trofas son metab lica por medio de la fotos ntesis de iluminaci n alternados asegura La aireaci n La luz consideran se exposici n periodos luz artificial con f sicos parÆmetros estratificaci n tØrmica una Richmond 1986 En el caso generalmente que su ptimo de la crecimiento de 240C sin microalga cultivo su para no son microalgas las consideradas sufre alteraciones Bajas temperaturas embargo puede arriba de 350C las temperatura provocar an una se estÆ a debido 270C presentando el intervalo anterior con interesado especies tropicales no disminuci n de crecimiento de las mayor a como las que intervalo de 16 referencia en provocar que la en un en matan a un a la temperaturas Hoof y Snell microalgas colapsaran 2001 El intervalo de salinidad Generalmente salin dad el el cultivo en presente control parÆmetro Dentro de los microalgas en en en Otro en importante un requerimientos qu micos encuentran se nutrientes a o en el cultivo se A balde et al necesarios para otras invariablemente controlado y exterior la salinidad microalga es un cosas se maneja convierte la en 1995 buen crecimiento de las el balance Un desbalance se se en manifiesta ya entre la los proporci n sea como la disminuci n de la fuente de nutrientes cultivo y como denominados cultivos masivos Provasoli et al Por macronutrientes a no es especie un hasta la detenci n del mismo Hoof y Snell 2001 considerqr limitativo parÆmetro entre de la microalga dependerÆ y los micronutrientes espec ficos el crecimiento aspecto En mar el crecimiento de la suministrada de estos descenso una para interiores este el agua de cultivo macronutrientes a ptimo control de calidad nutricional respecto factor en los 1957 consideran la fuente de nitratos fosfatos y diatomeas la adici n de silicatos Con como a los micronutrientes en son el caso aquellos de las que se 5 Romo Pil era Abril Karim 2001 Manual para el cultivo de Memoria tØcnica microalgas profesional UABCS 50pp suministran por ello no pero metales tetracØtico comparaci n Se sabe que importantes menos se tales microalgas Kaplan microalgas auxotr ficas para obtener cerca de cianocobalamina 812 a mejor crecimiento La marinas sin es al mayor a una microalgas la cianocobalamina 812 y la biotina mayor a microalgas Spotte de las de todas las 1979 es necesario enriquecerfa pero todos coinciden con en una con nutrientes Los medios fuente principal de nitr geno soluci n de quelante y vitaminas Provasoli et 1973 diversas formulaciones de medios de cultivo han formulado medios se provasoli et al se realicen diversas 1957 ademÆs modificaciones microalgas La tasa de es algunos de estos han sido bi xido de carbono prÆctica algunas especies para comœn que hasta que se a partir de satisfagan investigaci n Myers un los en o de la la circulaci n Mejorando bicarbonato de sodio exponencial conteniendo mÆs del 5 el cultivo poblaci n Sin puede de bi xido de carbono puede o igual microalgas medio formulado requerimientos de puede prolongaci n el bombear aire tener un convertirse la adici n adecuada de provocarse la embargo de De 1962 y bi xido de carbono suministrado al cultivo ox geno factor limitativo espec ficos emp ricamente utilizadas para en un crecimiento De microalgas planct nicas requieren seleccionados de diferentes laboratorios y utilizados durante muchos aæos forma son medio de cultivo ideal para el crecimiento de las un mezcla de metales traza 1957 Stein Existen de las requeridas son Snell 2001 embargo de cultivo son muy diversos f sforo y del 70 Hoffy El agua marina microalgas disponibles estos nutrientes se debe seleccionar el medio de cultivo que se va proporcionar utilizar soluci n haciØndolos esto es que no son capaces de sintetizar todas las vitaminas necesarias y hecho se ha estimado que Para Acido Etilen diamino el EDT A y micronutrientes existen otras sustancias que consideradas esenciales para la son algunos et al 1986 tienen que asimilarlas del medio La tiamina 81 86 soluciones alcalinas en en los anteriores mencionados con como utilizan para mantener los metales AdemÆs de los mÆcr por las en precipitan agentes quelantes se para las poca cantidad trazas en a del los cultivos efecto inhibitorio Hoff y Snell 2001 El bi xido de carbono y el bicarbonato de sodio que Øste debe Como se ser revisado ha mencionado las peri dicamente microalgas pueden afectar el para mantenerlo en pH del cultivo as condiciones ptimas utilizan bi xido de carbono para la fotos ntesis 6 Romo Pinera Abril Karim 2001 UABCS y liberan ox geno durante los de luz Sin periodos Un alta baja o provocando excesiva baja una el en incrementarse el en el crecimiento de la de las de luz y periodos nitr geno en los cultivos una suministrado al cultivo microalgas selectiva mente tomaran el ion amonio Si los iones nitratos el pH pero usualmente controlado por suministro de bi xido de pH embargo eliminados por el son si el bi xido de carbono es Iimitante el Si el cultivo es mantenido microalgas durante el bajo por el microalga no es controlando los ciclos de luz oscuridad o inyectado es cultivos utilizados para acuacultura pH disminuye elevarse hasta 11 matando de ambiente los en mayor a carbono del cultivo Sin puede profesional suficiente Hoff y Snell 2001 es sal de amonio la a embargo de muchos procesos celulares Si el rompimiento tiende Memoria tØcnica microalgas escala comercial el bi xido de carbono a aireaci n moderada como Manual para el cultivo de 50pp periodo se alga en condiciones observa elevado de oscuridad tendiendo a del cultivo pH pH durante balancear el pH Hoff y Snell 2001 AdemÆs de los factores fisico qu importante considerar a crecimiento se y costosas de mejor observar se da en asociaci n sabe que En el cultivo de crecimiento de cada o fase de pudiendo Exponencial Se ha parece ser a la que muchas microalga Hoffy llegar a una vez el aumento cultivada se reconoce un Fogg y En donde disminuir en adaptadas nœmero de Thake de microalgas se ha podido 812 que lleva nœmero a incremento con respecto a nuevas microalgas se de la estÆndar de crecimiento patr n al medio de cultivo lugar Independientemente 1987 figura no ocurre que la divisi n da en mejor hace necesario el conocimiento de la cinØtica de cada determinado volumen fases las Snell 2001 especie es especies los que esto casos en se en con que el sugerido de cianocobalamina producci n aspecto condiciones que s n dif ciles microalgas multiplicarse puesto dividirse la a proporciona adaptaci n Ya la asociaci n de estas es entendida las bacterias En los debe se siguientes incluso microalgas mejor ser embargo con y el volumen al que indicado por las Lag Sin conseguir en a otro mencionados anteriormente cultivos libres de bacterias axØnicos cabo la bacteria y que la especie el cultivo de la cual comienza bacterias crecen en micos 1 en el nœmero de cØlulas al inoculo inicial las microalgas cØlulas que comienzan son a capaces de acelera continuamente en forma exponen cial De declinaci n relativa de crecimiento En este se da una disminuci n de nutrientes cambios de caso pH conforme el cultivo va creciendo y alteraci n de otros factores como 7 Romo lera Pil UABCS 50pp Abnl Karim 2001 Manual para el cultivo de consecuencia del incremento de la tasa de de ah poblaci n Memoria tØcnica profesional microa gas que las microalgas disminuyan su divisi n celular Estacionaria Cuando ya de cØlulas alcanzado no se aprecia divisi n celular neta esto una mantiene constante por cierto se balance entre la natalidad y la mortalidad que De muerte Las cØlulas aunque lo mÆs normal pueden es durar en que comiencen presenta la periodo poblaci n fa fase anterior a que el nœmero debido al tiempo en cultivo semanas e es entonces morir de es cuando incluso se meses presenta esta fase 4 Densidad celular Tiempo Figura 1 Curva representativa de crecimiento de un cultivo estÆtico de microalgas Modificado Fogg y Thake 1987 1 Fase de adaptaci n 2 Fase de crecimiento exponencial 3 de Fase de declinaci n relativa de crecimiento 4 Fase estacionaria 5 Fase de muerte La medici n de la biomasa recuento directo de la como son el conteo celular mØtodos mÆs un comunes espectrofot metro tiempo es y concentraci n radica en curva de poblaci n un a es celular y se travØs de en el cultivo de puede una hacer de alta de c1orofilas a ventaja de travØs de un que la concentraci n de clorofila ptica poder fluor metro a no para tener un travØs de diferentes mØtodos o este es uno de los absorbancia con leer varias muestras El mØtodo precisi n a microalgas cÆmara de conteo La medici n de la densid d que tiene la mØtodo importante de fluorometr a la desventaja ayuda de en un corto que mide la de este mØtodo permanece constante durante toda la crecimiento del alga por lo que los valores no son constantes Otro mØtodo es 8 Romo Pitlera Abnl Karim 2001 UABCS Manual para el cultivo de Memoria tØcnica m croalgas profesional 50pp el de la cuantificaci n de la biomasa L pez muy utilizado travØs del peso a este mØtodo tambiØn seco es 1993 et al 2 OBJETIVO Este manual contiene utilizadas para informaci n el cultivo de respaldadas microalgas y presenta este documento consiste en y su base con aplicaci n con base en a en proporcionar el las tØcnicas a respecto por investigadores versados probadas metodolog as con mŁtodolog as mÆs comunes propuestas ya el tema El formato el cual en se te rico de dichas tØcnicas y marco las caracter sticas de la infraestructura que presenta el Laboratorio Experimental de Acuacultura de la Unidad Pichilingue LEAP de la Universidad Aut noma de Baja Este laboratorio de cultivo de investigaci n cualquiera la existencia de de informaci n sino tambiØn para 3 Sin embargo a procedimientos su elaboraci n realiz no solo para la considerar durante el cultivo de estas aportar mÆs allÆ que una receta a REQUERIMIENTOS F SICOS CONTROL DE LOS para fundamental para es se como especies al lector los elementos bÆsicos necesarios para realizar de objetivo utilizado tanto para docencia es manual de bibliogrÆfica proporcionar esta actividad con el microalgas un de las dos actividades compilaci n California Sur seguir QU MICOS Y EN EL LABORATORIO 3 1 PAR`METROS F SICOS LUZ Se utiliza luz artificial constante tipo cool white tolvas fux 250O de 400 L balastras Østas en Estas per odos todos los niveles de cultivo lÆmparas estÆn en la pared momento de de cada trabajar lÆmpara se con lÆmparas se de cepario del hasta las respectivas sus seguridad hace necesaria adhiere a Østas debido al agua de los cultivos de detectando de 1 interruptor Tabla a lÆmparas que se exterior al cuarto de cultivo Para efecto de mantenimiento de las semanal de la sal que desde el conectadas por pares a su vez se conectan a un encuentra localizado de 24 horas por medio de manera igual mar que una llegase a limpieza salpicar al forma el verificar las condiciones de uso preventiva la presencia de coloraci n oscura la 9 Romo Pif era Abnl Karim Manual para el cultivo de 2001 Memoria tØcnica profesional microa gas UABCS 50pp cual es indicativo de que la esta lÆmpara pr xima fundirse y tomar las medidas a necesarias Tabla 1 Relaci n de interruptores y lÆmparas No de Serie de Interruptor 1 Tolvas 100 L 400 L 1 2 3 y 4 2 Tolvas 400 L 5 6 agitan Al cepario con el Bolsas 20 L 5 Cultivo estÆtico y estante central homogenizar manualmente para realice diariamente 4 cultivos estÆticos o objeto cØlulas reciban la luz durante dependerÆ cultivo de el su no se el cultivo de evitar que se ninguna manera supere los 5 d as proporciona sugiere Se aireaci n y s lo se agitaci n se que esta permitir que todas las de duraci n de estos cultivos tiempo prepararon cambios de volumen de cultivo o le sedimenten y se crecimiento El de los fines para los cuales mantenimiento y7 Tolvas 400 L 8 9 y 10 3 AIREACi N lÆmparas ya sea procurando que para cambios recambio de cepas el tiempo en volumen mÆximo de y de 7 d as para cepario En el con caso ayuda de de los cultivos masivos un compresor conectado al Ærea de cultivo a blower PVC dentro del cual TEMPERATURA integral una como Esta se En se utiliza aireaci n constante de 1 2 hp utilizan air Iift que constan de se se disminuya a reventarse encuentra tuber a flotante de PVC encuentra conectada mantiene constante por medio de verano el cual de mayo a octubre se a un tubo delgado de calidad es decir debido al brusco incremento en un aire acondicionado sugiere mantener el Ærea a que la de la salida de aire de 24 i 1 oC para tratar de evitar que al momento de utilizar la alimento Østa comiencen se de 20 L baja presi n una la manguera que va de 3 toneladas temperatura de travØs de Para las tolvas de 100 Y 400 L partir a sus paredes temperatura microalga celulares que presenta el 10 Romo Pit era Abnl Karim 2001 UABCS 50pp cultivo principal cultivo Para el 21 t 10C a temperatura periodo Se tiene del laboratorio cualquier cambio en el medidas de Manual para el cultivo de microalgas Memoria tØcnica de invierno un tenn se recomienda hacer estÆticos debido a el 15 el cepario mantener el para ir verificando la bitÆcora para efectos de detectar integral y partir a llevar acabo las se de 20 L el agua marina utilizada su disminuirÆ salinidad En el la salinidad caso de agua temperatura a es de los cultivos de 35 ups de agua destilada del volumen del agua marina que al aumentar la evaporaci n sugiere seguridad correspondientes incluyendo agregando una funcionamiento del aire acondicionado irradiada sin necesidad de disminuir e se metro de mÆximos y m nimos SALlNIDAD Para los cultivos masivos filtrada noviembre abril profesional a 30 ups preparar Esto al momento de la esterilizaci n existe por lo que aumenta la salinidad y esta debe mantenerse una en 35 base en ups 3 2 PAR`METROS QU MICOS NUTRlENTES la formulaci n El medio de cultivo utilizado sugerida se enumeran en BI XIDO a lo mÆs axØnico su cu cuya elabora preparaci n En el laboratorio no se con y especificaciones suministra bi xido de carbono ASOCIACi N CON LAS MICROALGAS a los En los cultivos estÆticos hasta el volumen de 1 500 mL matraz Fernbach posible procurando mantenimiento do 1973 se que el suministro de aire ha sido suficiente para estos hasta la fecha BACTERIAS Y SU cepario Ryther Øste laboratorio el ANEXO 1 DE CARBONO cultivos debido del nivel por Guillard y en tener todas las condiciones En los cultivos masivos se encuentran bajo riguroso bolsa 20 L sistema de asepsia se mantienen cultivos asØpticas requeridas tolvas de 100 y 400 L no se en aun consideran axØnicos 11 Romo Pif era Abril Karim 2001 UABCS 4 de equipo de requisitos microalgas a donde esterilizaci n gabinete y cubre los primera principalmente en cumplir los m nimos con el cultivo lograr que cultivan se as el material serÆ trabaje se microalgas de diverso cuenta se con de requerimientos principales microorganismos sistema de filtraci n desag e 2 Æreas de nutrientes preparaci n cristaler a y Ærea de mantenimiento del material La segunda Ærea cultivo canal de En la Ærea hœmeda cabo el cultivo de estos a basa se cabo del Ærea Ærea de espec ficas lleva utilizar facilidad y maniobrabilidad adecuados para lleve se a de los laboratorios donde mayor a La trabajo limpieza Dependiendo se Memoria tØcnica profesional microa gas EQUIPO DE TRABAJO El de Manual para el cultivo de 50pp y consta de una toma irradiaci n de agua de e es donde de agua para aireaci n mar luz y contenedores para cultivo 4 1 `REA sta DE GABINETE Ærea superficie con una necesario para el cultivo En este matraces microscopio compuesto y caso y m es la que generalmente tubos de ensaye probetas pipetas mantenimiento de reactivos de 6x6 proporciona cuenta vasos de con lo todo el material precipitado refrigerador autoclave horno de microondas campana de balanza as bitÆcoras para registrar el cristaler a siguiente uso laminar flujo de cada para aparato se encuentran en el ANEXO 11 AdemÆs de estanter a tubos de vidrio para el material del almacØn y material accesorio pipetas probetas alcohol agua de mar CRISTALER˝A La cristaler a principalmente cepario que por los se selladora de bolsas polietileno guantes yagua destilada utilizada requerimientos y cultivos estÆticos cristaler a bolsas de como son tienen en en en el del usuario Ærea de figura volœmenes de 10 mL a 2 gabinete estÆ El nivel al que determinada se utiliza es 2500 mL Los diferentes Øste laboratorio se encuentran enlistados en tipos en de el ANEXO 11I 12 Abril Romo Piæera Karim Manual para el cultivo de mieroalgas 2001 Memoria tØcnica profesional UABCS 57pp Figura Debido es a que el uso de la cristaler a necesario que antes de utilizarla limpieza sugerido El matraz deberÆ 2 Con 4 Lavar 5 Dar enjuagarse con con un jab n œltimo lave exige con un da medidas de de estrictas limpieza El mØtodo de piseta limpiar las anticipaci n con agua de la llave clorh drico al 10 no queden contenido en una residuos de materia orgÆnica abundante agua de la llave libre de fosfatos enjuague con NOTA El Æcido utilizado para previo se del matraz para asegurarse que Enjuagar el cultivo en siguiente soluci n de Æcido una paredes el es 1 3 Material utilizado para cultivos estÆticos 2 Cristaler a de los matraces con enjuagar con y agua destilada y limpieza es abundante agua de la llave dejar secar escurriendo reutililizable de tal forma que agua de la llave para desechar cualquier se sugiere residuo de un enjuague y poder soluci n HCI microalga reutilizar el Æcido Para el al 10 caso de los tubos de ensaye serÆ necesario m nimo por 24 desengrasada primeramente rutinaria y luego esterilizada REFRIGERADOR El h Cuando con en se utilice sumergirlos cristaler a hidr xido de sodio al 10 Y en esa esta nueva despuØs debe lavada de ser manera autoclave refrigerador con el que se cuenta en modelo SR 458DV Se recomienda que toda soluci n que el laboratorio sea guardada es un ah SAMSUN contenga los 13 Romo Piflera Abril Karim 2001 UABCS datos nombre de la sustancia y siguientes da Manual para el cultivo de microalgas Memoria tØcnica profesional 50pp mes y aæo que al tØrmino de manera de caducidad fecha de elaboraci n usuario y elaborador Es recomendable que cada usuario de tal tiempo de verificar caducidad en de 1 4 Kw de correspondiente sustancias aqu almacenadas o se aparato de las sustancias les dØ el destino El laboratorio cuenta Este potencia su uso se las soluciones HORNO DE MICROONDAS responsabilice se con un SAMSUNG para efectos modeloMW8610T para esterilizaci n principalmente usa preparadas de matraces aunque su utilizaci n se encuentra cuestionada por el hecho de la existencia del autoclave Sin bacteriol gico en embargo su uso es recipientes Tabla 11 de recipiente existe un Tiempos No tiempo Volumen Tiempo en la mÆxima potencia 75mL 6min 12 Erlenmeyer 4 500 mL 10 min Fembach 1 1500 mL 13 min de cultivo as aparato figura como 100 se encuentra en 3 nos por lo cual se 150 mL el laboratorio pennite el material utilizado anÆlisis Para cada 11 Tabla de irradiaci n para los matraces Erlenmeyer El que un determinado de irradiaci n 12 STMEL Este 1210C realiz Erlenmeyer AUTOCLAVE a se el laboratorio que avala los resultados de esterilizaci n volumen y nœmero de Tipo recomendable pues ya en necesita vapor 8min es una esterilizar con MARKET FORGE modelo mayor los cultivos estÆticos a presi n de 15 Ib seguridad los medios Se utiliza calor hœmedo pulg2 para esta lograr temperatura Este aparato tenn metro y 1 un consta de un instruments Slow y 2 Se libera la para el control de la temperatura indicador de nivel de agua Presenta dos Fast aparato reloj presi n recomienda Iiquids utilizada para utilizar humedezcan los tapones de cuya diferencia radica man metro un para esterilizar en la fonna en que el lograr la temperatura requerida capuchones algod n opciones un de papel encerado para evitar que de los matraces Dadas las caracter sticas se de la 14 Romo Piæera UABCS del autoclave puerta evitar Abril Karim es accidente al momento de algœn considerar es con cerrar objeto ningœn profesional Memoria tØcnica el del material dentro de la misma para aparato con o se de presi n sustancias esterilizadas de tal forma que para el necesario presi n control de para la eliminaci n de agar en utilizara el se placas una vez no caso a puesto se Otro aspecto a el nivel indicado trabajar Cuando dispositivo propiedades de instrumentos en donde de de las no es Al utilizar el autoclave Fast derrame motivo ningœn utilizarÆ el afecte las dispositivo no se uso sobrepasando recomienda meterlas se para efectos de que el agar disuelto posteriormente en su prepare agar para cultivo para efectos de que la liberaci n ese no agua deberÆ por no se tiempo modo descuidar el mismo esterilicen medios de cultivo plÆstico microalgas de ahorrar el verificar el llenado correcto para el cilindro y de Slow la distribuci n importante sobrellenarlo de matraces se Manual para el cultivo de 2001 57pp en en un recipiente el aparato y de obstruya el drenado del agua h iG o Figura Se sugiere operaci n 1 utilizar agua destilada del aparato L1enarlo con nivel indicado 4 L en es 3 Seleccionar el reloj la o agua de garraf n para el llenado del aparato La debajo del siguiente aproximadamente de agua de garraf n o destilada por el cilindro 2 Introducir el material 4 Activar el 3 Autoclave para esterilizaci n de material a esterilizar y dispositivo cerrar la de liberaci n de puerta presi n select exhaust 15 minutos 15 Romo Piæera UABCS El 2001 Abril Karim Manual para el cultivo de microalgas Memoria tØcnica profesional 57pp dispositivo de temperatura las presenta siguientes opciones 230oF 110oC 240oF 1180C y 250oF 121 oC utilizar esta œltima para esterilizaci n CAMPANA DE FLUJO LAMINAR Es aqu tubos de ensaye de los cultivos estÆticos travØs de un filtro de fibra de vidrio mantenimiento y que laboratorio Para su figura utilizaci n ayuda EstÆ se provista el cual debe de los mecheros ser realiza la siembra de matraces y de un ventilador que verificado cada 3 crea un arroja meses aire para a su ambiente aislado del resto del 4 se recomienda lo Limpiar 2 Prender los mecheros 3 Encender la campana y esperar cinco minutos antes de iniciar en su el Ærea de totalidad siguiente 1 limpiar el Ærea con donde trabajo con alcohol DespuØs de su uso nuevamente Unidad de Figura 4 Campana de flujo laminar Utilizada para siembras y elaboraci n de vitaminas esterilizadas 16 Romo Pif era Abril Karim 2001 UABCS Manual para el cultivo de Memoria tØcnica microa gas MICROSCOPIO OPTICAL El microscopio el cual consta observaciones del œltimo BALANZA 2842 de de 4 objetivo La balanza que 160g de se utilizado es objetivos de tipo compuesto 4X 10X que tiene en este laboratorio es de 2 Pesado Se tipo anal tica Sartorius pesado Ærea de son A 1 histolog a a 9 g a 150 recomienda utilizar la se del laboratorio B 10 a 150 g Y E denominado bloqueo El proceso de pesado previo es el suma siguiente del contenedor de la sustancia se anota bot n de inicio a regresa utilizando para las aceite de inmersi n se encuentra en el Los botones utilizados para bot n de AMERICAN Se recomienda utilizarta para pesar sustancias de 1 capacidad balanza anal tica marca 40X y 100X g Para pesar vitaminas metales traza EDTA y cloruro fØrrico 1 profesional 50pp El bot n E se mueve hacia abajo y se el peso observado la cantidad del peso observado del contenedor mas el de la sustancia a pesar EJEMPLO Contenedor Cantidad Total a 2 9 pesar 77 9 75 9 Con los botones A y B 3 Se enciende la balanza y se va se coloca la cantidad agregando a cantidad balanza marque las dØcimas de gramo observadas al 4 Una vez alcanzado el peso deseado se regresa a pesar correspondiente hasta que la pesado previo a ceros la balanza con los botones A yB DESTILADOR DE AGUA Jen ons instalado siguiente serpent n El laboratorio consta de conectado al agua corriente del laboratorio en un el cuarto anexo dispositivo un destilador de agua Autostill figura al laboratorio de cultivo de 5 El aparato microalgas suavizador de agua por medio de iones se encuentra y consiste en water softenerj lo un de vidrio y calentador de agua 17 Romo Piæera Abril Karim Manual para el cultivo de 2001 mieroalgas Memoria tØcnica profesional UABCS 57pp i h y l r f i I l 5 Destilador de agua Figura Este aparato funciona de manera enciendan los calentadores controla la entrada del entonces es el contenedor que necesario que Estos tienen de Østa evaporaci n agua y la desborde el resto lo realiza el sta s lo 2 botones de encendido estar verificando 4 2 AREA automÆtica a llenar se conecte y un sensor con por lo que serÆ el cual necesario agua destilada con se no se automÆticamente aparato H MEDA Ærea presenta acabo los cultivos temperatura una Esta de 6x9 superficie provista controlada Debido cuenta normas y medidas de a comprende aquella m de agua marina la importancia limpieza canal de de Østa Ærea de las cuales se donde es hablarÆ llevan a aireaci n y recomendable tomar en desag e luz se posteriormente 4 2 1 TRATAMIENTO DEL AGUA UTILIZADA El tratamiento del agua de desarrollo de los cultivos Toda ser tratada para bacterias y dependiendo remover ciertos utilizada aquella materia metales mar es de vital agua utilizada para el cultivo de particulada protozoarios disueltos importancia El tratamiento otras puede microalgas especies ser un para de simple ptimo debe microalgas o complejo de la fuente de agua utilizada 18 Romo Piæera UABCS Abril Karim FILTRACi N SISTEMA DE en Manual para el cultivo de 2001 mieroalgas Memoria tØcnica profesional 57pp E IRRADIACi N este laboratorio consta de cuatro 120 W lo que da una capacidad cuatro filtros de cartucho que protocolo su uso se UV de 30 W cada El sistema utilizado de esterilizaci n de 258 5 Lmin de 15 Ilm encuentra en 10 Ilm dando una un ademÆs 5 IJm y hasta 1 IJm total de presenta Figura 6 El el ANEXO 111 o para van lÆmparas DE AGUA MARINA ti il 1 f 1 llt i I r tl l Figura HIDR`ULICO SISTEMA denominado vierte arena se arena figura e MARINO canal de llamada serie de decantadores filtraci n 6 Sistema de filtraci n 7 en despuØs El el cual e irradiaci n de agua marina agua presenta llegando irradiaci n una longitud del canal el agua pasa dos contenedores de donde finalmente al Ærea de agua marina El de proviene es a la bah a de 200 travØs de bombeada a m de travØs largo y del una primer filtro de segundo filtro de un un a hœmeda donde pasa por el sistema de protocolo para su uso se encuentra en el ANEXO 111 19 Romo Piæera Abril Karim Manual para el cultivo de 2001 mieroalgas Memoria tØcnica profesional UABCS 57pp iIJ6I l T c 7 Figura Sistema hidrÆulico marino 4 2 2 CULTIVOS MASIVOS Definiremos as objetwo de permitir espec ficamente organismo El reemplazo permitiendo A partir cultivos los cuales en se suministra aire reciban la misma intensidad microorganismos regular de Øste es en este nivel requerimientos de con raz n de diluci n de nutrientes microalgas utilizados de forma son de los por la remoci n como que los de cultivo utilizado dependiendo el los cultivos de directa alimento como de la el con de luz y de especie cultivo en tipo a un de el denominado Semicontinuo producci n Un cultivo semicontinuo volumen estÆndar de cultivo medio nuevo a dependiendo te ricamente el crecimiento es aquel en masivos figura 8 A Østos se les se Continuo caracteriza lo que tiempo y se conoce donde la cosecha y renovaci n microalga Lo anterior continuo del cultivo de las bolsas de 20 L hasta las tolvas de 400 L como original de la tasa de divisi n de la exponencial o ciertos intervalos de para obtener el volumen Un cultivo continuo constante es proporciona consideraremos agua de mar a tratada estos con el sistema anteriormente mencionado luz constante y aireaci n 20 Romo Piæera Abril Karim 2001 Manual para el cultivo de Memoria tØcnica microalgas profesional UABCS 57pp 111 1 8 t 1 44 I Vi A tr Figura PrÆcticamente con cultivo estÆtico el inicio de los cultivos masivos de 3 a 5 d as a su vez Del rollo de plÆstico 2 Con la selladora forma de un ojal columpios de 50 cm previamente en uno se realiza siendo sembrada dependiendo El proceso de elaboraci n de las bolsas 1 1 8 Cultivos masivos Bolsas de 20 L Y tolvas de 400 L para 20 L esta capacidad I se de ancho de la especie realiza de la se corta a a y el extremo partir serÆ sellado en su un matraz Fernbach manera la bolsa de 120 calentada esperar 5 minutos opuesto de polietileno cultivar siguiente de los extremos de la bolsa para que la bolsa de con cm de largo de encenderla despuØs pueda colgar se totalidad figura en se el sistema 9 Columpio Ojal Sello Sello 50 cm Figura 9 Bolsa de plÆstico montada en el sistema de columpio 21 054616 Romo Pilera Abril Karim 2001 UABCS La permanencia dependiendo La de la aæadiendo especie pero no de cultivo deberÆ exceder de este tiempo es la tolva ya de fibra de vidrio translœcido las cuales 80 L de agua marina y los nutrientes de duraci n tiempo de estos cultivos de 100 sea siembran se de los dependerÆ este sistema lo anterior para asegurar la calidad de la como 400 L Son tolvas la bolsa con correspondientes utilizaci n Se recomienda que los cultivos semicontinuos servir Memoria tØcnica profesional microalgas de este volumen de cultivo bolsas de 20 L serÆ de entre 3 y 5 d as siguiente etapa cilindroc nicas El Manual para el cultivo de 50pp no requerimientos pasen de microalga medida de seguridad para el control de las condiciones a mas para de 15 d as su en utilizar ademÆs de higiØnicas asØpticas y del Ærea Se hace necesario que enjuague caso con de que enjuaga agua dulce y doro quedasen mÆs 24 horas con restos de e terminadas de utilizar las tolvas cada usuario las cepillando microalgas las en paredes el para evitar daæar el contenedor agua dulce por y usarla Antes de lIenarla filtrada una vez con se dejan cono Una reposar por lo el agua de cultivo se y el se vez cono deje con Se sugiere que en doro yagua por no transcurrido este menos tiempo se 24 horas antes de volver sugiere enjuagarla con agua de a mar irradiada 5 ASPECTOS IMPORTANTES DEL CULTIVO DE MICROALGAS Si bien menci n manera es un los de hecho que lo anteriormente escrito aspectos contemplados puntualizarlos ya que se en presenta esta secci n del texto consideran como parte una se importancia tomaron en en su cuenta a medular dentro del cultivo de microalgas 5 1 CONTAMINACi N La contaminaci n de los cultivos de sin embargo Fluede afectar de manera microalgas puede ser biol gica qu mica particular o ser una o f sica combinaci n de estos tres tipos 22 Romo Pirera Abnl Karim 2001 UABCS Memoria tØcnica microalgas profesional CONTAMINACi N QU MICA 5 1 1INDICAOORES DE Existen diversos ha Manual para el cultivo de 50pp ca do indicativos de este patrones alta disminuci n conservando Østa su poca circulaci n cambio o en el nœmero color natural el repentino de se crecimiento se sembrada la deberse a la En este temperatura si el cultivo caso se microalga composici n del agua las cØlulas estÆn vivas agitaci n disueltos qu micos conserva un puede reciØn toma blanco dentro de las 24 h de sembrado debe al cloro residual y otros Si el cultivo de contaminaci n celular problema podr a y deben reponerse incrementando la Cuando el cultivo tipo color claro se el agua en despuØs deber a que la fuente de luz probablemente es de 3 poca 4 d as o existe observando poco un desbalance en los nutrientes Cultivos de 15 viejos se toman generalmente o mÆs d as de cultivo que inician turbios y algunos una deficiencia en nutrientes otros levemente claros Esfuerzos por recobrar estos cultivos ya carentes de nutrientes son inœtiles CONTAMINACi N BIOL GICA 5 1 2INDICADORES DE los mÆs tipos bacterias otras d as comunes de contaminaci n microalgas protozoarios cambia de color y eventualmente se o biol gica macroalgas aclara la causa Si son un por protozoarios Excesivo crecimiento de bacterias turbia crecimiento y colapso del cultivo mÆs comœn provocada bajo excesivos niveles de se despuØs se de 3 7 debe considerar manifiesta como agua cultivo 5 2 CONTROL DE LA CALIDAD DEL AGUA MARINA Como ya filtraci n e se mencion irradiaci n a en la secci n 4 2 1 en este laboratorio el agua travØs de rayos ultravioleta teniendo la es tratada con seguridad que es suficiente para asegurar agua marina de buena calidad Otra manera neutralizÆndola desee realizar para tratar el agua despuØs se hace a con puede tiosulfato de sodio partir de la se para neutralizar agrega el tiosulfato de sodio Sin embargo El procedimiento n de la misma n caso de que se bolsa de 20 la las tolvas de 400 lagregando 1 ml de cloro por cada 5 litros de agua marina y ml de cloro utilizado mediante la c10ra ser deja con en una aireaci n hasta el d a siguiente concentraci n de 1 5 g por cada 4 el tratar el agua con luz UV y filtraci n ha sido 23 Romo Pit era Abril Karim 2001 UABCS Manual para el cultivo de microalgas Memoria tØcnica profesional 50pp suficiente y eficiente para efectos del cultivo Se recomienda de posible ser utilizar no cloro para preparar el agua de cultivo Un a aspecto importante considerar para evitar los usuarios que mientras estØn tal que manera diluido que pueda introducir los encuentra se trabajando pies en en un cualquier contaminaci n recipiente necesario entonces que al regreso del cuarto de bombas y despuØs pisen el recipiente No es posible permitir cultivo esto a es con la bacterizaci n a de conteniendo cloro plÆstico enjuaguen Ærea hœmŁdel Es calzado con agua su cloro que los cultivos para evitar que pedir el laboratorio utilicen botas de hule de las entradas al laboratorio de cultivo a es cualquier nivel pasen del que estos cultivos estØn una vez puedan ser foco a tiempo estricto de sean propensos viejos y de infecci n para otras tolvas Se hace necesario que el usuario marque las mangueras utilizadas para cosecha de tal forma que se hagan responsables de su mantenimiento y limpieza y fuente de contaminaci n Se deberÆn enjuagar con que estas no agua dulce y sean secar antes de guardarlas Se recomienda Ærea que esta enjuagada harÆ necesaria la caso se 5 3 sea de las cosechas de las tolvas despuØs con agua dulce y secada limpieza con o con un de haber trabajado trapeador limpio en en el algœn cloro IN CULO Una vez que se tiene evaluada la cinØtica de crecimiento de la tomar en cuenta que la viables pero no en una cultivo de donde de las cØlulas inoculadas mayor a sembradas condici n de dividirse inmediatamente proviene el in culo cultivo madrej inactivas y las concentraciones de metabolitos es pueden viejo microalga se pueden espec ficamente las enzimas decrecer a debe pueden ser si el estar niveles insuficientes para la divisi n celular Caæizares et al 1994 Se sabe que existe esto es inoculo una relaci n entre la la duraci n de la fase sea lag tomado durante la fase en longitud de la fase el cultivo iniciado serÆ exponencial del lag y la edad del inoculo menor mientras que el cultivo madre Fogg y Thake 1987 24 i Romo P æera UABCS Abril Karim 2001 Manual para el cultivo de mieroalgas Memoria tØcnica profesional 57pp 5 4 NIVEL CEPARIO En esta y de cultivo etapa hace necesaria la mayor se control y verificaci n de las condiciones de la en 15 d as a las microalgas con Matraces Cajas Agar a utilizar a nivel en medidas asØpticas Se deberÆ observar cada microalga para verificar las condiciones de cultivo Los volœmenes recomendados Tubos precauci n figura 10 cepario son 10 mL de medio de cultivo de 75 mL de medio de cultivo Erlenmeyer de Petri con agar inclinado Figura 10 Estante con cultivos nivel a cepario estÆticos ESTERILIZACi N previamente con utiliza HCI al 10 Los matraces 100 mL Se o tubos estrictamente tal cual se tubos matraces llenan se describi con con con el 10 mL y matraces mL autoclave y 75 mL y cultivos el material debe estar anteriormente el volumen de medio 150 mL Se recomienda tener ya con 1500 preparada agua de requerido 10 mL 75 mL mar filtrada con nutrientes e irradiada con medio de cultivo macronutrientes y micronutrientes El agua utilizada salinidad Esto volumen que es en este nivel antes de de 35 ups que se va a presenta a ser preparada 30 ups con agua destilada baja en dependiendo del se preparar Tabla 111 25 Romo Pif era Abnl Karim UABCS El agua de cultivo a mayor 2001 Manual para el cultivo de microalgas Memoria tØcnica profesional 50pp 15 d as se este nivel preparada para puede refrigerada por un tiempo ser recomienda entonces al momento de su no elaboraci n fechar el contenedor Una vez introducen para el los al autoclave caso tubos que los matraces ya contienen el agua de con el medio de cultivo de diatomeas por 15 minutos matraces y para el de caso el preparada excepci n a en mar nutrientes se de las vitaminas y silicatos slow dispositivo la con liquids de agar preparaci n esto se es para descæbirÆ pqsteriormente Tabla 111 Relaci n del volumen de agua marina yagua destilada Volumen NOTA se a Preparar Agua destilada 1700 mL 300 mL 1000 mL 850 mL 150 mL 500 mL 425 mL 75mL recomienda mantenerlo lejos del sol en e irradiada este caso se sin nutr entes guarda duraci n de esta agua viable dependerÆ de la temporada esto no mas de 10 d as Agua 2000 mL tener agua de mar filtrada puede marina es en en un contenedor de 20 1 el estante del laboratoæo en el tiempo de inviemo puede durar 20 dlas Se recomienda durante cada Denado del contenedor lavar y enjuagar se en verano previamente el recipiente VilAMINAS Las vitaminas evitar que se se desnaturalicen deben estar esterilizadas a colocan hasta el momento con el calor y la travØs de una presi n en que se va a sembrar para del autoclave por lo que Østas unidad de filtraci n Figura 4 26 Romo Piæera Abril Karim 2001 Manual para el cultivo de Memoria tØcnica mieroalgas profesional UABCS 57pp Modo de preparaci n 1 Todo el proceso deberÆ realizarse 2 Se coloca un una 3 Se manguera procede a la campana de filtro whatman GFC de 25 cual estarÆ conectada de en laminar de diÆmetro matraz kitasato de 250 mL que a un a una mm flujo en la unidad de filtraci n a su vez se conecta a la travØs bomba de vac o encender la bomba de vac o y comienza se a filtrar la soluci n primaria de vitaminas 4 Una vez terminada de filtrar la para hacer la soluci n de trabajo 5 Ya lista la soluci n de trabajo esterilizado y guardarse IMPORTANTE horno a una en el soluci n temperatura vierte el agua destilada necesaria en un tubo o frasco previamente refrigerador de 800C durante 6 horas en se esta deberÆ colocarse Todo el material utilizado deberÆ deberÆ estar esterilizada estar Figura previamente 11 SILlCATOS Los silicatos tambiØn se 11 Horno de esterilizan del resto de los nutrientes debido a esterilizado en el el agua destilada tambiØn el autoclave y estar fr a al momŁnto de Figura separado primaria usarse precisi n en el autoclave la tendencia que en un tubo de ensaye por presentan a precipitarse 27 Romo Piæera UABCS SIEMBRA cultivo 1 Abril Karim 2001 Manual para el cultivo de La siembra lleva se Limpiar con a cabo o inoculaci n de los matraces tubos con el siguiente alcohol el Ærea de figura proceso profesional Encender el interruptor Figura cajas o agar inclinado para 12 trabajo 2 Prender ambos mecheros de la campana de 4 Memoria tØcnica microalgas 57pp laminar flujo de la campana y esperar 5 minutos 12 Siembra del cepario en la campana de flujo laminar 5 4 1 SIEMBRA EN LIQUIDO Los volœmenes que se siembran matraces Fernbach de 1500 mL asegurarse que el agua donde que las dejar microalgas de las que los matraces o transferirÆ la en tomando en en la campana de matraces las vitaminas y los silicatos y proporciones desde tubos de 10 mL hasta van microalga tomara el in culo tubos ya esterilizados momento de la siembra Las la campana Previo al sembrado de los tubos y matraces se se en despuØs Para estÆ lograr a la misma lo anterior el Ærea de cultivo flujo laminar se hay temperatura se recomienda Al Ærea hœmeda agregan que primero a los el cultivo de vitaminas y silicatos serÆn segœn cuenta la formulaci n del medio f 2 de Guillard y el volumen Ryther tabla IV 1973 de Q 5mUL de vitaminas y 1 mUL de silicatos 28 Romo Pil era Abril Karim 2001 UABCS Manual para el cultivo de Tabla IV de vitaminas y silicatos de acuerdo al volumen Proporci n VITAMINAS utilizar a PROPORCi N VOLUMEN mL 10 5lJL 10 10lJL 75 0 0375 75 0 075 100 0 050 100 0 100 150 0 075 150 0 150 1500 0 75 1500 1 5 Para agregar estas cantidades frasco de vidrio para autoclave plÆstico de las resistentes al calor el de 1 puntas se mL abrirÆn para El in culo mismos Si se se primero en en para un puntas el autoclave la campana de este y tipo sembrar Si s lo a sembrara 1 mL de Al realizar la siembra que las microalgas se se agitar la con en activas Para las especies misma manera a diferencia que la permanencia menor pero la vez colocan en un cajas de o en segundo para el a caso esterilizar y del dependerÆ como en prop sito volumen respaldos se vez superficie microalgas de estas sin en utilizarÆ el 5 para los matraces y 0 5 mL a de los en trabajos de los tubos 3 minutos para hecho esto con la para asegurarse de flagelo funciona de la la columna de agua es suficiente para realizar las inoculaciones que se abra pasarÆ con laminar la muestra de la de se los matraces la columna de agua Una se toma Eppendorff el fondo muestra y esperar de 2 microalgas muestra se I Y el en los tomar pipeta automÆtica requiere microalgas deberÆ distribuyan se de la vez de 100 de volœmenes ayuda Cada en junto flujo puntas algod n estÆ transfiriendo el cultivo para aumentarlo se a automÆtica pipeta una tapadera con meten su uso en utilizado del volumen investigaci n utiliza se esterilizadas Para la esterilizaci n de las puntas previamente 10 profesional SILICATOS PROPORCi N VOLUMEN mL solo Memoria tØcnica microalgas 50pp un tubo o la boca de cada matraz antes y uno despuØs de tomar por la flama del mechero o como depositar la medida de seguridad El tiempo de cultivo de estos volœmenes es de mÆximo 7 d as para los matraces de 75 100 y 150 mL y de 15 d as para los tubos de 10 mL 29 Romo Pinera Abril Karin 2001 UABCS 5 4 2 SIEMBRA EN Este del tipo de Se cepario profesional S LIDO rutina se pueden disponibilidades 1 Manual para el cultivo de microalgas Memoria tØcnica 50pp realiza para tener tener de Petri cajas en o medio s lido las de especies tubos de ensaye todo microalgas de las dependerÆ del laboratorio Se utiliza agar utilizando 14 5 g por cada litro de agua marina bacteriol gico a preparar 2 Al agua marina filtrada microondas proporci n 3 se agita para que 4 Cuando la mezcla 15 Ib pulg2 un en pegue observe el en micros y silicatos en desee preparar se encuentre se en el matraz transparente inmediatamente se mete el autoclave a a 1210C por 15 minutos 5 Antes de sacario del autoclave un macros poco hasta observar que toda la soluci n no se se 3 minutos calentada previamente y los nutrientes la cantidad de medio que La mezcla suspensi n irradiada y le agrega el agar se a e cambio brusco de es temperatura necesario abrir que afecte a parcialmente la mezcla Østa la puerta para evitar presentarÆ un color amarillo cristalino 6 Esperar aproximadamente temperatura adecuada para de 15 a 20 minutos para poder manejaria y llenar las que la cajas mezcla de Petri o baje de los tubos de ensaye 7 Antes de iniciar el llenado se deben de agregar las vitaminas 8 Es importante etiquetar tanto las cajas como los tubos con en el agar el nombre de la especie y la fecha de siembra LLENADO DE LAS CAJAS DE PETRI 1 Se realiza en la campana de flujo laminar 2 Se vierte la mezcla dentro de la caja en un volumen de 30 mL esto aproximadamente c es sin pasar del 3 La caja enfr e un 4 Una que semicerrada borde de la se coloca caja en un J lugar dentro de la campana esperando a que poco para evitar condensaci n vez se primer terminado de llenar las solidifiquen estas cajas columnas se van no poniendo deberÆn una ser sobre otra para mayores de 5 dejarias cajas 30 Romo Piftera Abril Karim UABCS Memoria tØcnica microalges profesional 50pp 1 h durante este aproximadamente los mecheros 5 Al d a se es a tiempo apagan ya solidificadas siguiente incubadora 6 No 2001 Manual para 81 cultivo de se revisan las cajas œnicamente la campana se y si guardan en el se dejarÆ encendida refrigerador alguna presenta condensaci n se mete a la 300C por 4 horas recomendable utilizar aquellas cajas donde la condensaci n no se elimine por en una proporci n completo LLENADO TUBOS DE ENSAYE AGAR INCLINADO 1 La mezcla se vierte de entre 9 y 10 mL 2 DespuØs 3 Una se vez los tubos en meten en de 10 mL el autoclave para la esterilizaci n esterilizados colocan se 4 Se dejan solidificar hasta el d a caso ayuda de una pipeta aproximadamente obtiene colocando los tubos sobre 5 En con de condensaci n Figura se 13 Tubos una el Ængulo pipeta de 5 de inclinaci n figura 13 que se mL siguiente meten con en a la incubadora agar colocados sobre a 300C por 4 horas una pipeta de 5 ml 31 Romo Piæera UABCS Abril Karim 2001 Manual para el cultivo de mieroa gas Memoria tØcnica profesional 57pp SEMBRADO EN AGAR 1 Se realiza en la campana de flujo laminar bacteriol gica 2 Se utiliza un asa 3 El pasa por el mechero hasta el asa se 4 Se abre la 5 El asa se caja o tubo enfr a 1 es en zig respectivo segundo de donde las en vivo rojo se sembrara de la paredes caja o tubo y se toma la muestra de microalga 6 El 7 rayado DespuØs de en zag el descargar la asa caja el tubo o en esta se figura 14 pasa por el mechero hasta rojo vivo antes de iniciar otra siembra 8 Las cajas de Petri se sellan con papel parafilm el lado del agar hacia la fuente de luz 9 Los tubos se colocaran en la Figura en de gradilla 14 el Ærea del manera Sembrado Los resultados de crecimiento en se en placa zig se cepario invertida se pueda detectar si presentan alguna indicativo de contaminaci n l quido y generalmente su La coloraci n aspecto es el tap n hacia abajo observaran entre los 7 y 10 d as alteraci n dependerÆ brilloso y con zag sobre agar sembrado Se deberÆ observar el crecimiento de cada que colocaran para cultivo invertidas una en de las colonias de el color o forma del color de la manera esto ser a microalga en de tal un medio homogØneo 32 Romo Piftera Abril Kaæm UABCS 2001 Se el sugiere para encuentren al final del menor El va Manual para el cultivo de Memoria tØcnica mcros gas profesional 50pp escoger las colonias que sembrado de transferencia de la rayado placa el tubo o pues estas una presentan se carga de bacterias tiempo de 15 a de cultivo de las 20 d as placa en en microalgas y hasta 1 mes en s lido depŁnderÆ tubo dependiendo de de la especie pero este la carga bacteriana del cultivo Una meten Øste pasado vez la autoclave a gradilla caso el con recuperar solo 5 5 de cajas lavan cajas en un de Petri si recipiente y estas aparato de cajas se de Petri de vidrio y los tubos de ensaye hacia arriba siguiendo es el el mismo procedimiento son plÆstico plÆstico se para evitar desechan colocados en una Estas pueden procedimiento de de se mencionado limpieza ya AN`LISIS BACTERlOL GICOS Se recomienda que presente 3 de las caso dentro del se escurra tap n se el Fast Instrumenf 10 min que el material diluido En el en tiempo 4 en realicen monitoreos se los cultivos de microalgas peri dicos de la bacteriana poblaci n En el laboratorio se realizan estos una vez cada meses Estos anÆlisis realizan se dos diferentes medios general y TCSS travØs del mØtodo de extensi n bacteriol gicos agar en presencia utilizando superficie marino para la observaci n de bacterias Citrato Sales Siliares Sacarosa DIFCO 065 Tiosulfato observar si existe la a 01 2 en para Vibrio MEDIO DE AGAR MARINO 1 El agar marino previamente se prepara utilizando 55 1 g de este por cada litro de agua destilada calentada a luego preparar se s lido para la esterilizaci n y llenado de las 2 Para el sembrado diluciones de 10 nœmero 1 se 1 placa hasta 10 10 qu— Del tubo nœmero cuidadosamente con se es decir le coloca 1 ml de la el tubo nœmero 2 y as 3 en cajas realiza se microalga ayuda de va en el procedimiento del sembrado en secci n 5 4 2 la campana de flujo laminar se hacen cada tubo tendrÆ 9 ml de agua destilada al tubo de este tubo sucesivamente hasta 10 sigue a una llegar tomar 0 1 pipeta se toma 1 ml que al tubo nœmero 10 ml que serÆ se figura colocado coloca en 15 en la placa automÆtica 33 Romo Pit era Abnl Karim 2001 UABCS 4 Manual para el cultivo de doblada en un dejando que se de 900 enfr e mientras completamente absorba observe que en no en Ængulo se mL de cultivo el agar este queda l quido 5 A continuaci n las 20C 1 28 profesional 50pp Este 0 1 mL serÆ distribuido que Memoæa tØcnica microa gas placas la placa mojada se en gira la el in culo se con alcohol y placa de ayuda con Es decir una varilla de vidrio estØril luego pasada la mano una vez extenderÆ por toda la placa por el mechero y simultÆneamente hasta ha colocado el 0 1 que se con la varilla hasta que se sobre el agar sembradas se invierten y prosigue al conteo de colonias colocando las son colocadas en la incubadora a por 48 h 6 Transcurrido el tiempo se placas en un contador de colonias Quebec 1m n Se toma 0 1 mL para el anÆlisis 11 l C aa a i CD tJ Q o Figura t o o lo 1 o o o o G G G 15 Diluci n del cultivo para la toma de muestra en un o anÆlisis bacteriol gico MEDIO DE Teas 1 Se utilizan 89 9 por cada litro de agua ebullici n a 2 Se enfriar un poco deja preparar NO 3 A continuaci n partir del punto se se sigue estilada previamente calentada hasta la utiliza el autoclave aproximadamente la misma 15 minutos metodolog a para el llenado de las placas que para el medio de agar marino a nœmero 2 34 Romo Pitlera Abril Karim 2001 UABCS 6 Manual para el cultivo de EVALUACi N los a cultivos principales necesario es concentraci n de biomasa que presentan los cultivo de la profesional DE LA BIOMASA Para alimentar es Memoria tØcnica mictoa gas 50pp de alimento que proporci n laboratorio para medir biomasa 6 1 HEMA TOCIT METRO O Presenta dos cÆmaras canales existen longitudinales un y se cuadr cula mÆs fina Figura microalgas para as describen a la es saber cual suministrar Los mØtodos utilizados se va a en este continuaci n C`MARA DE NEUBAUER En la cara superior del portaobjetos canal transversal central dos cuadros de 9 grabados cual conocer mm2 de a superficie se encuentran cuatro cuyos lados superior subdivididos inferior e a su vez en una 16 Canallat8nll Canal nInII D FIgura 16 CÆmara de conteo Neubauer Utilizada para Al colocar el cubreobjetos encima de la cuadr cula existe entre ellos cuadr cula y de 0 1 misma que viene indicada mm muestra 1 0 problema mm2 X 0 1 en uno de los cuadros 0 1 mm en mm3 conocer la donde superficie cubreobjetos el portaobjetos grandes concentraci n de de 1 una se encuentra distancia 1000 que como 10 000 X 0 1 ya se vio es mm3 siempre grabada mm2 de superficie serÆ igual Las tØcnicas de conteo consideran el nœmero entonces 1 mL de 0 1 10 000 la Por lo tanto el volumen de la nœmero de individuos por cada mililitro Ya que 1 mL mm3 cultivo fija profundidad individuos presentes en la muestra de volumen determinado y comœnmente como un veces cm3 1000 se a de expresan mm3 y como el volumen de la muestra mm3 35 Romo Pinera Abril Karim 2001 UABCS Manual para el cultivo de Memoria tØcnica profesional microa gas 50pp Vamos a se suponer que hizo conteo de cØlulas un el cuadro central de la en cuadr cula obteniØndose la cifra de 320 cØlulas Para expresar el nœmero de cØlulas por mililitro multiplica 1mL El se 320 X 10 000 ya que 10 000 X 0 1 procedimiento 1000 mm3 para el conteo El resultado es el vivo esto tiene observa el se es en mm3 y 0 1 de 3 200 000 cØlulas I mL una en un tubo microscopio objetivo verificar las como 320 las cØlulas existentes siguiente 1 Se toman dos muestras de 1 mL cada 2 Una de las muestras son sin de ensaye fijar para condiciones de la efecto de observarta in microalga NOTA ESTO SE DEBE HACER CADA SEMANA CON EL CEPARIO SOLO PARA EFECTOS DE REVISi N DEL CULTIVO 3 La otra muestra fija se lugol con 1 gota ellugol puede preparado ser de la siguiente forma soluci n tipo 1 soluci n tipo 2 1 1 1 4 Tinci n Gram Dependiendo Qugol 1 5 agua destilada Iugol de la densidad del cultivo la cÆmara de conteo y si el nœmero de es mayor a 100 se mL de agua marina filtrada diluci n 5 6 mL y as cuadr culas 1 rejillas La f rmula No se puede Cuando microalgas a se en uno a usar se localizadas observara la muestra en diluir la muestra Por los cuadros de 4 ejemplo es si se x en 4 de agregan 5 de f d factorde utiliza en el laboratorio es por cualquiera de los de ellos hasta que la muestra pase al otro lado y se de la cÆmara en nœmero la cÆmara de cØlulas contadas I No Figura de cØlulas 15 esto los cuadros 4L por mililitro se dependerÆ de las es de cuadros contados d I No de cuadrantes contados se cuentan o hacer diluci n de la muestra para 1mL de muestra la diluci n irradiada para obtener el utilizadas contadas f el laboratorio sucesivamente canales laterales iniciando 6 e procede El llenado de la cÆmara que cubran ambas en formol agua destilada efecto de conteo Para la determinaci n de la diluci n la cÆmara utilizada 10 000 de cØlulas No 10 000 dividirÆ entre 4 esto por cada una de las rejillas de la cÆmara 2 No de cØlulas contadas esto cuando 3 se cuenta solo No de cØlulas contadas 10 000 un No de cØlulas contadas f d 10 000 cuadro L 10 000 5 No de cØlulas contadas fd 10 000 5 36 Romo Piæera UABCS Abril Karim 2001 Manual para el eultivo de cuando conteo se cuenta el cuadro del centro de la realiza se Nannochloropsis para Este tipo de las microalgas Micromonas sp 6 2 ESPECTRO FOT poder calibraci n para cada menores de densidad basarse especie que Para la lectura de la muestra el homogeniza las 4E rejilla a E central 8 este tipo Nannochloris Jlm de sp METRO metodolog a Para rÆpidamente Se profesional pusilla la determinaci n de biomasa de las 1 Memoria tØcnica mieroalgas 57pp la muestra y absorbancia o microalgas presentando en se este mØtodo es la es muy utilizado para ventaja de necesario realizar poder leer curvas de desee medir procedimiento se ptica toma un es el siguiente volumen de aproximadamente 20 mL en un recipiente 2 Se nm procede donde no 3 Se calibra a leer en el espectrofot metro exista interferencia por con un se registra 17 a una longitud de onda de 750 pigmentos blanco de agua de 4 Se lee la muestra y figura mar filtrada e irradiada a O de absorbancia la absorbancia 4 1 i 11 i ft I lIECIlM4I Figura 17 S Espectrofot metro Utilizado para medir biomasa a travØs de longitudes de onda 37 Romo Pit era Abril Karim 2001 UABCS Las curvas utilizadas Memoria tØcnica profesional CALIBRACi N de calibraci n que en se dan a el este laboratorio tertiolecta y Chaetoceros gracilis masivo que en estas mictoalgas 50pp 6 2 1 CURVAS DE mas Manual para el cultivo de se mantiene Isochrysis galbana Monochrysis en cultivos semicontinuos este laboratorio Es importante deben mantener las condiciones de curvas se presente continuaci n fueron hechas para las ya que especies lutheri Dunallie a es el cultivo tipo recalcar que para utilizar ya mencionadas cultivo en el manual Para obtener las volœmenes de 100 y 400 celulares con el Tanto espectrofot metro cuadruplicado de calibraci n se L se los cuales realizaron cultivos semicont nuos mantuvieron hematocit metro los conteos A los datos obtenidos obtener la ecuaci n se se utilizarÆn para lecturas y las como les realiz de la recta para cada ecuaciones son las que un Y 15 y 13 d as se hicieron regresi n en el por lineal para y volumen de cultivo la concentraci n con Estas ceVmL del cultivo independiente bx a Donde y variable absorbancia anÆlisis de especie conocer de mediciones utilizando la lectura de absorbancia como nuestra variable ECUACi N durante en Diariamente fueron tomadas muestras de los cultivos para hacer respectivamente conteos curvas dependiente cØlulas mL a ordenada al origen b pendiente x variable independiente absorbancia CULTIVOS DE 100 L Isochrysis galbana Donde a 580680 943 b 7069008 38 x absorbancia 38 Romo Piftera Abril Karim 2001 UABCS Manual para el cultivo de microalgas Memoæa tØcnica profesional 57pp Isochrysis galbana 2500000 200000O O 1500000 E i 3 1000ooo c 500000 o 0 02 o 0 04 0 06 0 08 Absorbaocia I Figura 18 Tendencia de la regresi n 0 12 01 0 14 0 16 0 18 om datos obsenedos modelo I entre la absorbancia y la densidad de Isochrysis cultivos de 100L galbana en Monochrysis luthen Donde 534024 34 a b 7355434 98 absorbancia x Af onochrysis lutheri 2500000 200000O 0 lIS 2E 1500000 i31000000 c 500000 o O 0 02 0 04 0 06 0 08 01 Absorbaocia I Figura 19 Tendencia de la datos obsenados regresi n 0 12 0 14 0 16 0 18 om modelo I entre la absorbancia y la iadde densi Monochtysis lutheri en cultivos de 100L 39 xabsorbancia40 Romo Piflera Abril Karim 2001 UABCS Manual para el cultivo de microalgas Memoria tØcnica profesional 57pp Dunallie a tertiolecta Donde a 161737 936 b 2738972 75 x absorbancia Dunalliela tertiolecta 500000 450000 400000 35 al oo 300000 E 250000 200000 u CD e a 150000 10 oo 50000 O O 0 02 0 04 0 06 0 08 01 0 12 0 14 0 16 0 18 Absoranci nro datos I obsen modelo IFigura 20 Tendencia de la regresi n edos entre la absorbancia y la densidad deDunaTtela tertiolecta en cuftivos de100L Chaetoceros gracilis Donde a 354705 199 b 6228837 89 Romo Pif era Abril Karim UABCS 2001 Manual para el cultivo de microaJgas Memoria tØcnica profesional 57pp Chaetoceros gracilis 1600000 1400000 1200000 i 1000ooo 2 E lA c 4D 4D Q 800000 600000 400000 200000 O O 0 02 0 04 0 06 0 08 01 Absorbancia I Figura 21 Tendencia de la regresi n datos observados 0 12 0 14 0 16 0 18 nro modelo I entre la absorbancia y la densidad de Chaetoceros gracilis en cultivos de 100L CULTIVOS DE 400 L Isochrysis galbana Donde a 100504 156 b 10189981 4 x absorbancia 41 Romo Pil era Abril Karim 2001 UABCS Manual para el cultivo de microa gas Memoria tØcnica profesional 57pp lsochrysis galbana 1600000 1400000 1200000 g J 1000ooo Œ c el el o 0 800000 600000 400000 200000 O O 0 02 0 04 0 06 0 08 Absorbancia I Figura 22 Tendencia Monochrysis Donde 0 12 01 0 14 nm datos obsenedos modelo de la regresi n entre la absorbancia y galbana en cultivos de 400L I la densidad de Isochrysis lutheri 172093 1 a b 10066436 1 x absorbancia Monochrysis lutheri 1600000 1400000 1200000 g J 1000ooo si E e CD CD 2 0 800000 600000 400000 200000 O O 0 02 0 04 0 06 0 08 Absorbancia I Figura 23 Tendencia de la datos obsenedos regresi n lutheri en 0 12 01 0 14 nm modelo I entre la absorbancia y la densidad de Monochrysis cultivos de 400L 42 Romo Pitlera Abril Karim 2001 UABCS Manual para el cultivo de microalgas Memoria tØcnica profesional 57pp Dunalliela tertiolecta Donde a 56111 3817 b 1807414 9 x absorbancia Dunalliela tertiolecta 160000 140000 120000 i 100000 g 80000 c 60000 40000 20000 O o 0 02 0 04 0 06 0 08 Absorbancia I Figura 24 Tendencia de la 0 12 0 14 nm datos obsenados regresi n 01 modelo I entre la absorbancia y la densidad de Dunaliela terlioJecta en cultivos de 400L Chaetoceros Donde a gracil s 74429 724 b 11035287 6 x absorbancia 43 Romo Pinera Abril Karim 2001 Manual para el cultivo de UABCS 57pp Chaetoceros microalgas grad Memoria tØØnica profesional is 1600000 1400000 1200000 i 1000ooo g E 800000 I c Q i u 600000 c 400000 200000 O O 0 02 0 04 0 06 0 08 Absorbancia I Fgura 25 Tendencia de la datos observados 01 0 12 0 14 nm modelo I entre la absorbancia y la densidad de Chaetoceros en cultivos de 400L regresi n gracilis 7 ESPECIES EXISTENTES EN EL LEAP El laboratorio consta de 8 especies de microalgas las cuales se enlistan a continuaci n El origen de estas cepas esta indicado por el sub ndice Isochrysis galbana Monochrysis ISOC Pavlova lutheri Dunaliella tertiolecta Tetrase mis suecica Tetraselmis tetrathe Chaetoceros 1 gracilis DUT2 3 TESAt 4 TETE e CHGRA 3 Chaetoceros calcitrans CHCl Chaetoceros sp Phaeodactylum 1 Centro de CHX 1 3 3 tricomotum PHAEOT 4 Investigaciones Biol gicas 2 Acuacultores de la Pen nsula 3 Centro Investigaci n Cient fICa 4 desconocido no Origen 2 MONO del Noroeste CIBNOR S A APSA existe y de Educaci n Superior de Ensenada CICESE registro 44 Romo Pinera Abril Karim 2001 UABCS Manual para el cultivo de Memoria tØcnica mictoalgas profesional 57pp BIBUOGRAF A Cid A Abalde J V R O C Casas C microa gas IPN Carpenter Departamento and B Dom nguez de Biotecnolog a y Microalgas Cultivo y O 44 pp Bioingenieria MØxico Monographs vol CINVESTAV Biotecnolog a 518 pp 671pp of carbono En W O O Stewart Biochemistry Botanical y Voltolina L 1994 Las Ed Interamericana MØxico Microbiolog a Herterotrophy 1995 210 pp Espaæa BotÆnica Marina Ed Umusa MØxico 1991 M R 1974 Droop A R C la acuacuHura Cuadernos sobre en p L 1982 Dawes C J E y Herrero Universidad de Coruæa Aplicaciones Caæizares P Torres Fidalgo Ed gae A physiology 10Univ OfCalif Press 53559 pp Fogg G E and B Thake 1987 University ofWiscoinsin Gladue R 1991 CuHures and Algae Phytoplancton Ecology Press Third Edition E U A 126 pp for Heterotophic microalgae production potential feeds aquaculture The En Rotifer and Microalgae CuHure Systems application to The Oceanic Inst Hawaii 275286 pp Guillard R R Ly invertebrates En Culture of 1973 Ryther Smith W L y M for phytoplankton H Eds Chanley Invertebrates Anima s Plenium Press E U A 60 26 feeding marine CuHure of Marine pp Hoff F and T Snell 2001 P1ankton cuHure manual Florida Aqua Farm Inc E A 162 U pp Kaplan O A E Richmond Richmond A Oubinsky Ed and S Aronson 1986 Handbook of microalgal Algal mass nutrition 147 198 En culture CRC Press Inc EU A L pez E BÆez de O y Huerta microalgas tecnol gicas Mart nez CICTUS del centro de investigaciones Universidad de Sonora MØxico Nannochloris sp Muller 1786 J Departamento aplicadas al cultivo cient ficas y 74 pp F E 1998 Medios alternativos y evaluaci n de los costos para el cultivo de la microalga Myers A 1993 Manual de tØcnicas anal ticas 1962 Tesis de Maestr a Laboratory R Lewin Ed como cultures 615 595 alimento del rot fero Brachionus plicatilis UABCS 90 pp En Physiology and biochemistry of gae a Academic Press E U A 45 Romo Pit era Abnl Karim 2001 UABCS Provasoli L J A McLaughin and for marine Richmond algae MR Arch Fur 1957 The Droop profesional Microbiologie 25 development of artifICial S H Handbook of microalgal mass 6999 En Richmond culture CRC Press Inc 1979 Seawater aquariums the captive media 428 392 A 19868 Cel response to environmental factors Ed Spotte Manual para el cultivo de mictoalgas Memoæa tØcnica 57pp environment E U AU S Wiley A A Interscience E U A U S A 413 pp Stein J R 1973 Handbook measurements o Phycological Cambridge University Methods Culture methods and growth Press USA 446 pp 46 Romo Pilera Abnl Karim UABCS 2001 Manual para el cultivo de ANEXO I Formulaci n para la y Memoria tØcnica microa gas profesional 57pp preparaci n del medio de cultivo f 2 de Gulllard Ryther 1973 MACRONUTRlENTES l Reactivo Nitrato de sodio Fosfato de sodio NaN 3 Na2H2P04 H20 i en 1 litro de agua destilada Soluci n de Usar 1 mL por cada Iftro de aqua marina Jara cultivo Disolver los reactivos trabajo SILlCATOS Reactivo Silicato de sodio 3 9H20 NaSi reactivo en 1 litro de agua destilada en un recipiente por separado Usar 1 mL por cada Iftro de agua marina Jara cultivo Silicatos se les considera parte de los macronutrientes pero solo se utilizan para las diatomeas Disolver el MICRONUTRJENTES Reactivo Soluci n Sulfato Cantidad g1 L stock de metales traza cœprico CUS04 Sulfato de zinc 5 H20 Znso4 7 HzO 0 98 2 2 Cloruro de cobalto CoCh 6HzO Cloruro de man aneso Molibdato de sodio MnCh 4HzO NazMo04 2HzO 1 0 18 0 0 63 Disolver en 100 mL de agua destilada cada uno de los reactivos por separado para re arar las soluciones stock de metales traza Conservarlas en el refri erador Cloruro fØrrico FeCb 6 H2 EDTA dis dica Na2EOTA 3 15 4 36 Para preparar la soluci n de trabajo de micronutrientes primero disolver en su totalidad el EDT A dis dica agregar el cloruro fØrrico hasta que se disuelv finalmente agregar 1 mL de cada una de las soluciones stock de metales traza aforando Usar 1 mL de esta soluci n JOr cada litro de aqua marina Jala a 1000 mL de agua destilada cultivo 47 Romo Pillera Abril Karim UABCS 2001 Manual para el cultivo de microalgas Memoria tØcnica profesional 57pp VITAMINAS Reactivo Soluci n stock de vitaminas Cantidad 8iotina B6 0 1 disolver en 100 ml de Cianocobalamina 0 1 g disolver en 100 ml de agua destilada a ua destilada 812 Pesar hacer soluciones se aradas de cada Tiamina 81 una Conservarse en refri eraci n 0 2 Para preparar la soluci n de trabajo de vitaminas se disuelve la tiamina y se adiciona 1 ml de la soluci n stock de B6 y 1ml de 812 y aforar a 1 Utro de agua destilada Usar 0 5 roL f Or litro de aaua marina para cultivo NOTA Para la preparaci n de vitaminas este laboratorio utiliza vitaminas provenientes de una soluci n comercial inyectable de complejo 8 El procedimiento para elaborar la soluci n con base a las concentraciones requeridas para el medio de cultivo f 2 es el siguiente Disolver dos ampolletas de 8EOOYECTAMR 80 mg de 812 Aforar a 1 lde agua destilada y se hace la soluci n primaria tomaran 10 ml en 19 8 g de 81 De esta soluci n 1 l de agua destilada para hacer la soluci n de tomaran 0 5 ml por litro de agua marina a trabajo primaria se de la cual se utilizar para cultivo OTRA VIA ES Disolver dos ampolletas de OOXEMINASuR GenØrico Intercambiable 900 mg de 812 1989deB1 Aforar a 1 ml en 1 l de agua destilada para preparar la soluci n primaria De Østa soluci n tomar 1 lde agua destilada para la soluci n de trabajo de la cual se tomaran 0 5 ml por litro de agua marina a utirlzar para cultivo 48 Romo Pilera Abril Karim 2001 UABCS Manual para el cultivo de microalgas Memoria tØcnica profesional 57pp ANEXO 11 BIT ACORAS DE APARATOS BIT`CORA HORNO DE MICROONDAS FECHA USUARIO TEIMPO DE USO OBSERVACIONES 49 i Romo Pinera Abril Karim 2001 Manual para el cultivo de microalgas Memoria tØcnica profesional UABCS 57pp BIT`CORA AUTOCLAVE FECHA USUARIO TIEMPO DE USO OBSERVACIONES 50 Romo Piftera Abril Karim 2001 UABCS Manual para el cultivo de microalgas Memoria tØcnica profesional 57pp BIT`CORA MICROSCOPIO FECHA USUARIO TIEMPO DE USO OBSERVACIONES 51 Romo Pitiera Abril Karim 2001 Manual para el cultivo de UABCS microalgas Memoria tØcnica profesional 57pp BIT`CORA BALANZA FECHA USUARIO REACTIVO QUE TIEMPO DE PESO USO OBSERVACIONES ˛ 52 Romo Pinera Abril Karim UABCS 2001 Manual para el cultivo de microa gas Memoria tØcnica profesional 57pp BIT`CORA DESTILADOR FECHA USUARIO TEIMPO DE USO OBSERVACIONES 53 Romo P f era Abril Karim 2001 UABCS Manual para el cultivo de microa1gas Memoria tØcnica profesional 57pp BIT`CORA SISTEMA DE FILTRACi N E IRRADIACi N DE AGUA MARINA FECHA USUARIO INICIO TERMINO TOTAL DE MINUTOS 54 Romo Piftera Abnl Karim 2001 UABCS Manual para el cultivo de microalgas Memoria tØcnica profesional 57pp ANEXO 11I CRlSTALERIA INVENTARIO MATRAZ CANTIDAD Atorado 1000 ml 2 Atorado 500 ml 8 Atorado 100 ml Bola de fondo 1 plano 1000 ml Bola de fondo plano 250 ml Erlenmeyer 1000 ml Erlenmeyer 125 Erlenmeyer 225 12 23 ml 56 mL 36 Erlenmeyer 4 L Erlenmeyer 11 500 mL 6 1 Erlenmeyer Kitasato 1000 mL 14 Fembach 2800 mL 41 PROBETAS 2000 mL de plÆstico 1 1000 mL de 500 mL de plÆstico plÆstico 6 1 500 mL 1 100 mL De plÆstico 4 100 rol 2 50mL 9 25mL 4 10ml 2 VASOS DE PRECIPITADO 2 1000 mL De De plÆstico plÆstico 1000 mL 1 600 mL 1 500 ml 1 250 mL 11 100 mL De plÆstico 3 100 mL 1 OTROS Embudo de vidrio 1 Embudo de plÆstico 2 55 Romo Pii era Abril Karin 2001 Manual para el cultivo de mictoalgss Memoria tØcnica UABCS 57pp ANEXO IV DE PROTOCOLO USO DEL SISTEMA DE profesional FIL TRACION E IRRADIACION DE AGUA MARINA 1 Colocar los filtros de cartucho la entrada del agua al en orden descendiente 15 10 5 1 J 1rT1 con referencia en aparato II Conectar las mangueras de entrada y salida de agua 11I Abrir la llave de desag e 11I ubicada dentro del Ærea fr a desfogue colocando la manguera de Ir al cuarto de bombas Conectar y encendidas encender las Importante se lÆmparas de luz Ultravioleta recuerda que para que este Revisar que Østas procedimiento necesario haber encendido la bomba para la filtraci n por se lleve a el arena siguiendo uso apagar las estØn cabo es protocolo conespondiente IV Anotar hora de inicio anotarse V en la bitÆcora Al tØrmino aparato quitando primero e ir a apagar la bomba los filtros de cartucho desconectar la manguera de entrada de agua de dejar vac o se que de su lÆmparas y la bitÆcora Desconectar el aparato en salga el Enjuagar debe poner a aparato inclinando un mar en orden de 15 luego quitar la poco el sistema para que la manguera y los filtros de cartucho secar en cuarto de bombas una vez a Desarmar el 11Jm despuØs manguera de salida y quede completamente enjuagada la manguera esta la toma de aire del Ærea hœmeda 56 Romo Piftera Abril Karin 2001 Manual para el cufivo de microalgas Memoria tØcnica profesional UABCS 57pp PROTOCOLO DE USO DEL SISTEMA DE BOMBEO Y FILTRACION POR ARENA DE AGUA MARINA 1 Verificar que hay en agua el dep sito o cisterna 11 Verificar que el filtro por arena tenga conectadas y las mangueras de salida y aseguradas entrada de agua 111 Verificar que la bomba estØ conectada al filtro por arena y enchufada primer bomba y filtro ubicados entrando al cuarto de bombas IV Iniciar antes que nada el RETROLAVADO reloj hacia donde dice hacia el V Apagar dice filter VI desag e backwash Encender el interruptor de Al tØrmino de interruptor su uso hacia donde dice Closed la llave a favor de las manecillas del verificar que la manguera de la bomba Iniciar el FllTRAOO y encender el mover este conectada la bomba y esperar 2 minutos primeramente de la bomba apagar el desfogue interruptor moviendo la llave hacia donde etiquetado microalgasj de la bomba acto seguido Desconectar la manguera de salida del filtro y mover la llave quitar el tap n del filtro para vaciarto 57