IN0013F-01 Rev. F.qxd

Transcripción

5/23/2011
9:11 AM
Page A1
AMPLIFIED MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS DIRECT TEST
(bioMérieux ref. 39006/Gen-Probe Cat. No. 301001/1001F)
AMPLIFIED MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS DIREKTTEST
(bioMérieux Best. Nr. 39006/Gen-Probe Kat. Nr. 301001/1001F)
TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES MYCOBACTERIES DU COMPLEXE
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
(bioMérieux réf. 39006/Gen-Probe Cat. No. 301001/1001F)
TEST AMPLIFIED PARA LA DETECCION DIRECTA DEL COMPLEJO
TEST AMPLIFIED PER L’IDENTIFICAZIONE DIRETTA DEI
MICOBATTERI DEL MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX
(bioMérieux cod. 39006/Gen-Probe Cat. N. 301001/1001F)
TESTE AMPLIFIED PARA A DETECÇÃO DIRECTA DAS MICOBACTÉRIAS DO COMPLEXO
5/23/2011
9:11 AM
Page A2
5/23/2011
9:11 AM
Page 1
English
AMPLIFIED MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS DIRECT TEST
For In Vitro Diagnostic Use
50 Test Kit
(bioMérieux ref. 39006 / Gen-Probe Cat. No. 301001/1001F)
INTENDED USE
The GEN-PROBE AMPLIFIED Mycobacterium Tuberculosis Direct (MTD) Test is a target-amplified nucleic
acid probe test for the in vitro diagnostic detection of Mycobacterium tuberculosis complex rRNA in sediments
prepared from sputum (induced or expectorated), bronchial specimens (e.g., bronchoalveolar lavages or
bronchial aspirates) or tracheal aspirates.
WARNINGS
The efficacy of this test has not been demonstrated for the direct detection of M. tuberculosis rRNA using
other clinical specimens (e.g., blood, urine, or stool). Performance of the MTD test has not been established
for sediments processed in a different fashion than described, or stored for different time periods or
temperatures than specified in this Package Insert.
Positive sediments must be cultured to determine if Mycobacterium other than tuberculosis complex (MOTT)
are present in addition to M. tuberculosis complex and to perform antimycobacterial susceptibility testing.
Culture for AFB should also be performed to determine which subspecies of the M. tuberculosis complex
(e.g., M. bovis) is present.
Although specimens from pediatric patients, HIV positive patients, and patients with MOTT infections were
tested during the clinical evaluations, total numbers were insufficient to definitely conclude that there were no
statistical performance differences in these specific patient populations.
The MTD test has not been studied for use with specimens from patients being treated with antituberculous
agents to determine bacteriologic cure or to monitor response to such therapy.
Specimens that are grossly bloody should not be tested with the MTD test.
PRECAUTIONS
A. For In Vitro Diagnostic Use.
B. The MTD test is specific for, but does not differentiate among, members of the M. tuberculosis complex,
i.e., M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti and M. canetti (13). M. celatum
and M.terrae-like organisms will cross-react if present at concentrations higher than 30 colony forming
units (CFU) per test. However, M. celatum and M. terrae-like organisms are rare clinical isolates.
C. A negative test does not exclude the possibility of isolating an M. tuberculosis complex organism from the
specimen. Test results may be affected by specimen collection and transport, specimen sampling
variability, laboratory procedural errors, sample misidentification, and transcriptional errors.
D. Use only for the detection of members of the M. tuberculosis complex using sediments prepared following
the NALC-NaOH or NaOH procedures recommended by the Centers for Disease Control (CDC)7. This
test may only be used with concentrated sediments prepared from sputum (induced or expectorated),
tracheal aspirates, or bronchial specimens (e.g., bronchoalveolar lavages or bronchial aspirates). Care
must be taken when resuspending the sediment in phosphate buffer to ensure that the phosphate concen1
5/23/2011
9:11 AM
Page 2
tration is 67 mM7.
E. Avoid contact of Detection Reagents I and II with skin, eyes, and mucous membranes. Wash with water if
contact with these reagents occurs. If spills of these reagents occur, dilute with water before wiping dry.
F.
Use universal precautions when performing this test4. Preparation of digested and decontaminated
iments, and MTD procedures should be done using Biosafety Level 2 practices5.
sed-
G. Use only supplied or specified disposable laboratory ware.
H. Work surfaces, pipettors, and equipment must be decontaminated of RNA amplicon with a 1:1 dilution of
household bleach. Work surface may be wiped with water after 15 minutes to remove the bleach.
I.
Positive displacement pipettors or air displacement pipettors with hydrophobically plugged tips must be
used when performing this test. When transferring lysate from Lysing Tube to Amplification Tube,
extended length hydrophobically plugged tips must be used. A separate disposable tip must be used for
each reaction tube. Waving of a pipette tip containing specimen over the rack of tubes should be avoided.
Spent pipette tips must be immediately discarded in an appropriate biosafety waste container.
J.
When using repeat pipettors for reagent addition, after the lysate has been added to the tube, avoid
touching the tube with the pipette tip in order to minimize the chance of carryover from one tube to
another. The reagent stream should be aimed against the interior wall of the test tube to prevent
splashing. Careful pipetting is important to avoid carryover contamination.
K. Separate pipettors must be used for steps that precede amplification and those that follow amplification.
L. After reading reaction tubes in the luminometer, decontaminate and carefully dispose of them as described
in the TEST PROCEDURE and PROCEDURAL NOTES in order to avoid contamination of the laboratory
environment with amplicon.
M. Sealing cards or snap caps should be disposed of in an appropriate biosafety waste container immediately
after removing them from reaction tubes. Fresh sealing cards or snap caps should always be used to
avoid cross-contamination. These materials should NEVER be reused from a previous step. Sealing
cards should be firmly fixed to the top of all reaction tubes.
N. Do not cover water bath during incubations, especially when using snap caps. (Condensation from the
cover may be a possible source of contamination.)
O. Adequate vortexing after addition of Selection Reagent is necessary to achieve accurate assay results.
P. A segregated area for the Hybridization Protection Assay (HPA) step is recommended to minimize
amplicon contamination in the assay. This dedicated area should be separated from the specimen and
reagent preparation and amplification areas.
Q. To help prevent lab areas from becoming contaminated with amplicon, the laboratory area should be
arranged with a uni-directional workflow. For example, proceed from specimen and reagent preparation to
amplification and then to HPA areas. Specimens, equipment, and reagents should not be returned to the
area where a previous step was performed. Also, personnel should not move back into previous work
areas without proper anti-contamination safeguards. It is strongly recommended that the biosafety cabinet
used for specimen processing not be used for performing the MTD test.
SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST
The MTD test utilizes Transcription-Mediated Amplification (TMA) and the Hybridization Protection Assay
(HPA2) to qualitatively detect M. tuberculosis complex ribosomal ribonucleic acid (rRNA). The MTD test will
detect rRNA from both cultivable and non-cultivable organisms. Organisms of the M. tuberculosis complex
include M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti and M. canetti (12,13). The MTD
test will detect all organisms within the M. tuberculosis complex. However, M. microti infects only animals,
M. bovis is uncommonly transmitted from infected animals to humans, and M. africanum causes pulmonary
disease in humans in tropical Africa12. M. tuberculosis is by far the most common member of the complex
that is responsible for human disease worldwide. The CDC has recently reported a rise in the incidence of
2
5/23/2011
9:11 AM
Page 3
Conventional culture methodologies can detect tuberculosis growth as early as 1 week, but may take up to 8
weeks7,10. Comparatively, the MTD test provides detection of M. tuberculosis complex rRNA within 2.5 to 3.5
hours after beginning the test procedure. Thus, while the MTD test cannot ascertain drug susceptibility, it can
result in rapid and reliable detection of M. tuberculosis. This could lead to more appropriate use of isolation
facilities, more appropriate initiation of therapy, and earlier detection and containment of infected contacts3.
PRINCIPLES OF THE PROCEDURE
The MTD test is a two-part test in which amplification and detection take place in a single tube. Initially,
nucleic acids are released from mycobacterial cells by sonication. Heat is used to denature the nucleic acids
and disrupt the secondary structure of the rRNA. The Gen-Probe Transcription-Mediated Amplification (TMA)
method, using a constant 42°C temperature, then amplifies a specific mycobacterial rRNA target by
transcription of DNA intermediates, resulting in multiple copies of mycobacterial RNA amplicon.
M. tuberculosis complex-specific sequences are then detected in the RNA amplicon using the Gen-Probe
Hybridization Protection Assay (HPA) method2. The Mycobacterium Tuberculosis Hybridization Reagent contains a single-stranded DNA probe with a chemiluminescent label. This probe is complementary to M. tuberculosis complex-specific sequences. When stable RNA:DNA hybrids are formed between the probe and the
specific sequences, hybridized probe is selected and measured in a GEN-PROBE LEADER luminometer.
(50 TEST KIT)
REAGENTS
Reagents for the MTD test are provided as follows:
Reagent Name
Volume
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS AMPLIFICATION TRAY
Mycobacterium Specimen Dilution Buffer (SDB)
1 x 2.5 mL
Tris buffered solution containing < 3% detergent
Mycobacterium Tuberculosis Amplification Reagent (A)
1 x 3 mL
Nucleic acids lyophilized in tris buffered solution containing 5% bulking agent
Mycobacterium Amplification Buffer (AB)
(when reconstituted)
1 x 3 mL
Aqueous solution containing preservatives
Mycobacterium Oil Reagent (O)
1 x 10 mL
Silicone Oil
Mycobacterium Enzyme Reagent (E)
1 x 1.5 mL
Reverse transcriptase and RNA polymerase lyophilized in HEPES
buffered solution containing
< 10% bulking agent and > 15 mM N-acetyl-L-cysteine
Mycobacterium Enzyme Dilution Buffer (EDB)
1 x 1.5 mL
Tris buffered solution containing a surfactant and glycerol
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS HYBRIDIZATION TRAY
Mycobacterium Tuberculosis Hybridization Reagent (H)
< 100 ng/vial non-infectious DNA probe with a chemiluminescent label
lyophilized in succinate buffered solution containing bulking agent and detergent
Mycobacterium Hybridization Buffer (HB)
1 x 6 mL
1 x 6 mL
3
English
tuberculosis associated with AIDS, foreign-born cases, and increased transmission in higher risk
populations6,9. There has also been a rise in the number of M. tuberculosis strains that are resistant to one or
more than one antituberculous drugs11. The public health implications of these facts are considerable.
5/23/2011
9:11 AM
Page 4
Succinate buffered solution containing < 4% detergent
Mycobacterium Selection Reagent (S)
1 x 15 mL
Borate buffered solution containing surfactant
Mycobacterium Lysing Tubes (LT)
2 x 25 Tubes
Glass Beads, Bulking Agent
STORAGE AND HANDLING REQUIREMENTS
A. The following liquid or unreconstituted components must be stored at 2° to 8°C and are stable until the
expiration date indicated:
The reconstituted Mycobacterium Tuberculosis Amplification Reagent (A) is stable for 2 months at 2° to 8°C.
The Mycobacterium Tuberculosis Hybridization Reagent (H) and the Mycobacterium Enzyme Reagent (E) are
stable for 1 month at 2° to 8°C after reconstitution, or for 2 months at -20°C or colder if stored as frozen
aliquots on the day of initial reconstitution. Frozen aliquots must be used on the day thawed. Frost-free
freezers must not be used.
B. The following kit components are stable when stored at 2° to 25°C until the expiration date indicated.
SPECIMEN COLLECTION, STORAGE, TRANSPORT, AND PROCESSING
Specimen Collection and Storage:
Specimens must be collected in sterile plastic containers, and stored at 2° to 8°C until transported or
processed. Specimens included in the clinical trial were stored for no more than 4 days (generally less than
24 hours) prior to processing.
Transport:
Transport specimens to the laboratory as soon as possible according to appropriate regulations.
Processing (Decontamination and Concentration):
Specimens that are grossly bloody should not be tested with the MTD test. The MTD test is designed to
detect rRNA from members of the M. tuberculosis complex using sediments prepared from generally accepted
current adaptations of the NALC-NaOH or NaOH decontamination protocols described by the CDC using 1%
to 1.5% NaOH for 15 to 20 minutes and centrifugation at > 3,000 x g 7.
Processed Sediment Storage:
Sediments may be stored at 2° to 8°C for up to 3 days prior to testing. Sediments may also be stored frozen
at -20° or -70°C for up to 6 months. Frost-free freezers must not be used.
4
5/23/2011
9:11 AM
Page 5
50 Tests
1 x 2.5 mL
1 x 3 mL (when reconstituted)
1 x 3 mL
1 x 10 mL
1 x 1.5 mL (when reconstituted)
1 x 1.5 mL
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS HYBRIDIZATION TRAY
1 x 6 mL (when reconstituted)
1 x 6 mL
1 x 15 mL
2 x 25 Tubes
Sealing Cards
1 package
B. Materials Required But Not Provided
Micropipettes capable of dispensing 25 μL, 50 μL, 100 μL, 200 μL, 300 μL, and 450 μL
Vortex mixer
Sterile water (filtered or autoclaved)
Culture tubes
Sterile 3 mm glass beads
Screw cap microcentrifuge tubes
Amplification Positive Cell Controls (e.g., M. tuberculosis, ATCC 25177 or ATCC 27294)
Amplification Negative Cell Controls (e.g., M. gordonae, ATCC 14470, or M. terrae, ATCC 15755)
Household bleach (5.25% hypochlorite solution)
Plastic-backed laboratory bench covers
1000 μL pipette tips with hydrophobic plugs
C. Additional Materials Available From Your Gen-Probe Distributor:
GEN-PROBE LEADER 50i Luminometer (bioMérieux ref. 39400 / Gen-Probe Cat. No. 103100i/3100i)
GEN-PROBE Ultrasonic Water Bath (bioMérieux ref. 39409 / Gen-Probe Cat. No. 901104/T460)
GEN-PROBE Detection Reagent Kit (bioMérieux ref. 39300 / Gen-Probe Cat. No. 201791/1791)
GEN-PROBE MTD Amplification Controls (bioMérieux ref. 39223/Gen-Probe Cat. No. 301043F/1043F)
GEN-PROBE Dry Heat Bath A (42° ± 1°C, 60° ± 1°C, and 95° ± 5°C) (bioMérieux ref. 39405, 39406,
39407 / Gen-Probe Cat. No. 3396, 3397, 3398)
5
English
MATERIALS
A. Materials Provided
(bioMérieux Ref. No. 39006 / Gen-Probe Cat. No. 301001/1001F)
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS AMPLIFICATION TRAY
5/23/2011
9:11 AM
Page 6
GEN-PROBE Ultrasonic Water Bath Rack (bioMérieux ref. 39313 / Gen-Probe Cat. No. 104027/4027)
Test tube racks (bioMérieux ref. 39311 / Gen-Probe Cat. No. 3994)
Extended length pipette tips with hydrophobic plugs (1250 μL) (bioMérieux ref. 39315 / Gen-Probe
Cat. No. 104316/4316)
Tubes, polypropylene, 12 x 75 mm (bioMérieux ref. 39308 / Gen-Probe Cat. No. 102440/2440)
Snap top polypropylene caps for 12 x 75 mm tubes (bioMérieux ref. 39320 / Gen-Probe Cat. No. 400713)
TEST PROCEDURE
Controls
Cells used for the Amplification Positive Cell Control should be a member of the M. tuberculosis complex,
such as avirulent H37Ra (ATCC 25177) or virulent H37Rv (ATCC 27294). Cells used for the Negative Cell
Control should be MOTT, such as M. gordonae (ATCC 14470) or M. terrae (ATCC 15755). Controls must be
prepared prior to sample testing.
Cell controls must contain 25 - 150 CFU per 50 μL so that a final concentration of 1 - 10 CFU per assay is
achieved. This concentration should be verified by culture. These cell controls will be utilized in the preparation of Specimen Processing Controls. (See Sample Preparation.)
1.
Suggested Preparation of Cell Controls
a. Place 3 to 5 sterile 3 mm glass beads in a clean culture tube.
b. Add 1-2 mL sterile water. Add several 1 μL loopfuls of growth from the appropriate culture. Cap the
tube and vortex repeatedly at high speed.
c.
Allow the suspension to settle for 15 minutes.
d. Transfer the supernatant to a clean culture tube. Adjust turbidity to the equivalent of a #1 McFarland
nephelometer standard using a McFarland reference.
e. Make a 1:100 dilution of the suspension by placing 100 μL of the #1 McFarland suspension into 10
mL sterile water. Cap and vortex. This is Dilution 1.
f.
Make a second 1:100 dilution by placing 100 μL of Dilution 1 into 10 mL sterile water. Cap and vortex.
This is Dilution 2. This dilution should contain approximately 25 - 150 CFU per 50 μL.
Aliquotting and Storage of Cell Controls
a. The dilutions must be aliquotted into clean 1.5 mL screw cap microcentrifuge tubes as single use
aliquots (500 μL) and stored frozen at -20°C for 6 months or -70°C for 1 year. Frost-free freezers
must not be used.
Testing of the recommended M. tuberculosis cell positive control will monitor for substantial reagent failure
only. The positive control is designed to monitor effect of reagents used during processing for interference
from excess NaOH and phosphate buffer. Procedural variations in timing or temperatures that may affect efficiency of amplification or adequacy of selection time may not be detected using the recommended cell controls. Additional controls may be tested according to guidelines or special requirements.
2. Specimen Inhibition Controls
If the MTD test is negative and the physician strongly suspects that the patient has tuberculosis, it is possible to check for specimen inhibition using the following procedure:
a. Place 50 μL Specimen Dilution Buffer into 2 Mycobacterium Lysing Tubes (LT) (seeded and unseeded).
b. Add 50 μL Amplification Positive Cell Control and 450 μL sediment to 1 tube (seeded). Add 450 μL sediment to the second tube (unseeded). Proceed with the testing as usual.
6
5/23/2011
2:11 PM
Page 7
3. Laboratory Contamination Monitoring Control
To monitor for laboratory contamination with amplicon or M. tuberculosis cells, the following procedure can
be performed:
a. Place 1 mL of sterile water in a clean tube. Wet a sterile polyester or dacron swab with sterile water.
b. Wipe area of bench or equipment to be tested.
c. Place the swab in the water and swirl gently. Remove the swab while expressing it along the side of
the tube. Discard the swab into a container containing a 1:1 dilution of household bleach.
d. Add 25 μL of the water containing the expressed swab material into an Amplification Tube containing
50 μL Amplification Reagent and 200 μL Oil Reagent.
e. Follow the TEST PROCEDURE for amplification and detection.
Interpretation
If the results are > 30,000 RLU, the surface is contaminated and should be decontaminated by treating
with a bleach as recommended in TEST PROCEDURE, Equipment Preparation. If contamination of the
water bath is suspected, 25 μL of water bath water can be amplified as described for the expressed swab
material providing no antimicrobials are used in the water bath.
Equipment Preparation
1. For optimal transfer of sonic energy in an ultrasonic water bath, water must be thoroughly degassed
according to the following procedure prior to each run:
a. Add enough ambient temperature tap water to fill the ultrasonic water bath to within 1/2 inch of the top
of the tank.
b. Run the ultrasonic water bath for 15 minutes to thoroughly degas the water.
2. Adjust 1 dry heat bath to 95°C, 1 dry heat bath or water bath to 60°C and another dry heat bath or water
bath to 42° ± 1°C.
3. Wipe down work surfaces, equipment, and pipettors with a 1:1 dilution of household bleach prior to starting. Bleach must be in contact with the surface for at least 15 minutes. Work surfaces may be wiped with
water to remove the bleach. Cover the surface on which the test will be performed with plastic-backed
laboratory bench covers.
4. Prepare the GEN-PROBE LEADER Luminometer for operation. Make sure there are sufficient volumes of
Detection Reagents I and II to complete the tests and ensure that the reagent lines are primed. Refer to
the Instrument Operator’s Manual for further instructions on loading of Detection Reagents. (Detection
Reagents are sold separately).
Reagent Preparation
Reconstitute the vial (50 tests) of lyophilized Mycobacterium Tuberculosis Amplification Reagent (A) with
3.0 mL Mycobacterium Amplification Buffer (AB). Vortex until the solution is mixed. Let reconstituted reagent
sit at room temperature until clear. The reconstituted Mycobacterium Tuberculosis Amplification Reagent may
be stored at 2° to 8°C for 2 months. The reconstituted Mycobacterium Tuberculosis Amplification Reagent
should be allowed to come to room temperature before use.
7
English
Interpretation
If the RLU value of the seeded tube is > 30,000, then the sample does not inhibit amplification and there
apparently was no target available for amplification. If the RLU value of the seeded tube is below 30,000,
then the sample inhibits amplification and another sample should be evaluated. If the repeat testing of the
unseeded specimen is positive, the MTD test result may be reported as positive. The most likely explanation for this type of result is random sampling variability; i.e., that the first aliquot did not contain target for
amplification, while the second aliquot did. The RLU value of the unseeded tube may be either positive or
negative because the aliquot of sediment may or may not contain M. tuberculosis rRNA.
5/23/2011
2:11 PM
Page 8
Sample Preparation
1. Label a sufficient number of Mycobacterium Lysing Tubes (LT) to test the samples and 1 each of either the
Amplification Cell Positive and Negative or the Specimen Processing Positive and Negative Controls.
Remove and retain the caps.
2. Pipette 50 μL Mycobacterium Specimen Dilution Buffer (SDB) into all Mycobacterium Lysing Tubes (LT).
Follow the directions in A or B below for controls and in C for specimens.
A. Specimen Processing Controls:
For each control, add 1 mL of the NALC/NaOH solution and 3 mL of phosphate buffer used to process
sputum with 1 mL of sterile water to a sample processing tube.
i. Vortex to mix.
ii. Transfer 450 μL of the NALC/NaOH/phosphate buffer solution and 50 μL Cell Control dilution to
the correspondingly labeled Mycobacterium Lysing Tube (LT).
B. If Amplification Cell Controls are being used, transfer 450 μL Amplification Cell Control from its container to the correspondingly labeled Mycobacterium Lysing Tube (LT).
C. Specimen: Transfer 450 μL decontaminated well-vortexed specimen from its container to the correspondingly labeled Mycobacterium Lysing Tube (LT).
3. Recap the Mycobacterium Lysing Tubes (LT) after addition of each sample.
4. Vortex 3 seconds.
Sample Lysis
1. Push the Mycobacterium Lysing Tubes (LT) through the ultrasonic water bath rack so that the reaction mixture in the bottom of the tube is submerged but the caps are above water. Place ultrasonic water bath
rack on ultrasonic water bath. DO NOT ALLOW THE TUBES TO TOUCH THE BOTTOM OR SIDES OF
THE ULTRASONIC WATER BATH.
2. Place rack on ultrasonic water bath for 15 minutes but no more than 20 minutes. Samples and controls
that have been sonicated are now referred to as “lysates”. DO NOT VORTEX LYSATES.
Amplification
1. Label amplification tubes (12 x 75 mm polypropylene tubes) near the top of the tube with numbers that correspond to those used on the Mycobacterium Lysing Tubes (LT). Also label amplification tubes for each of
the Amplification Cell Positive and Negative Controls. If RNA controls are being used, label amplification
tubes to correspond to Negative and Positive Controls.
2. Add 50 μL reconstituted Mycobacterium Tuberculosis Amplification Reagent to the bottom of each
amplification tube using a repeat pipettor. Add 200 μL Mycobacterium Oil Reagent (O) to each amplification tube using a repeat pipettor.
3. DO NOT VORTEX LYSATE. Transfer 25 μL lysate to the bottom of the appropriately labeled amplification
tube using a separate extended length hydrophobically plugged pipette tip for each transfer. Remaining
lysate may be stored at 2° to 8°C for up to 7 days or stored frozen at -20°C or below for up to 1 month.
Frost-free freezers must not be used. If additional testing is to be performed on patient specimen lysates,
bring stored lysate to room temperature. DO NOT VORTEX LYSATE.
4. Incubate the tubes at 95°C for 15 minutes, but no more than 20 minutes, in the dry heat bath.
5. Prepare the enzyme mix by adding 1.5 mL Mycobacterium Enzyme Dilution Buffer (EDB) to the lyophilized
Mycobacterium Enzyme Reagent (E). Swirl to mix. Do not vortex. The reconstituted Enzyme Reagent is
stable for 1 month at 2° to 8°C or for 2 months at -20°C or colder if stored as frozen aliquotsB on the day of
initial reconstitution. If testing with frozen enzyme aliquots, first bring frozen aliquot to room temperature;
do not thaw aliquots at elevated temperatures. To mix aliquot after thawing, gently aspirate and expel mixture with repeat pipettor before adding to amplification tubes.
8
5/23/2011
9:11 AM
Page 9
7. Add 25 μL enzyme mix to each amplification tube using a repeat pipettor while tubes are at 42° ± 1°C.
Shake to mix. Incubate at 42°C for 30 minutes, but no more than 60 minutes. Sealing cards or snap caps
should be used during this incubation step. DO NOT COVER THE WATER BATH.
8. Tubes may be covered and placed at 2° to 8°C for up to 2 hours or at -20°C overnight after the 30 minute
incubation. If stored at -20°C overnight, tubes must be completely thawed at room temperature or no
greater than 60°C prior to the Hybridization step. If held overnight, snap caps rather than sealing cards
should be used.
Hybridization
1. Reconstitute lyophilized Mycobacterium Tuberculosis Hybridization Reagent (H) with 6 mL Mycobacterium
Hybridization Buffer (HB). Mycobacterium Tuberculosis Hybridization Reagent (H) and Mycobacterium
Hybridization Buffer (HB) must be at room temperature prior to reconstitution. If Mycobacterium
Hybridization Buffer (HB) has been refrigerated, warm at 60°C while swirling gently to ensure that all the
components are in solution. Vortex until the solution is clear (this could take up to 1 minute) to ensure that
all components are in solution. The reconstituted Hybridization Reagent is stable for 1 month at 2° to 8°C
or for two months at -20°C or colder if stored as frozen aliquotsC on the day of initial reconstitution. If the
reconstituted Hybridization Reagent has been refrigerated or frozen, warm at 60°C while swirling gently to
ensure that all components are in solution.
2. Add 100 μL reconstituted Hybridization Reagent to each tube using a repeat pipettor. Cover tubes with
sealing cards or snap caps. Vortex 3 times for at least 1 full second each timeD at medium speed. To
achieve proper mixing in reaction tube(s), maintain tubes in an upright position and allow reaction mixture
to reach upper half of tube wall throughout vortexing procedure. (To avoid possible contamination do not
allow reaction mixture to come in contact with sealing cards or caps.) After adequate vortexing, the reaction mixture should be uniformly yellow.
3. Incubate at 60°C for 15 minutes, but no more than 20 minutes, in a dry heat bath or water bath.
Selection
1. Mycobacterium Selection Reagent (S) must be at room temperature prior to starting the test. Remove
tubes from the 60°C water bath or dry heat bath and add 300 μL Mycobacterium Selection Reagent (S)
using a repeat pipettor. Cover tubes with sealing cards or snap caps. Vortex 3 times for at least 1 full
second each timeD at medium speed. To achieve proper mixing in reaction tube(s), maintain tubes in an
upright position and allow reaction mixture to reach upper half of tube wall throughout vortexing procedure.
(To avoid possible contamination do not allow reaction mixture to come in contact with sealing cards or
caps.) After adequate vortexing the reaction mixture should be uniformly pink.
2. Incubate tubes at 60°C for 15 minutes, but no more than 16 minutes, in a dry heat bath or water bath.
3. Remove tubes from the water bath or dry heat bath. Cool tubes at room temperature for at least 5 minutes
but not more than 1 hour. Remove sealing cards or caps just prior to detection.
Detection
1. Select the appropriate protocol from the menu of the luminometer software. Use a 2 second read time.
2. Using a damp tissue or lint-free paper towel, wipe each tube to ensure that no residue is present on the
outside of the tube, and insert the tube into the luminometer according to the instrument directions. Tubes
must be read within 1 hour of Selection Step 3.
3. When the analysis is complete, remove the tube(s) from the luminometer.
4. After reading the reaction tubes, carefully fill them to the top with a 1:9 dilution of household bleach using a
squirt bottle. Allow tubes to sit with solution for a minimum of 1 hour before discarding. This will help to
prevent contamination of the laboratory environment with amplicon.
9
English
6. Transfer the tubes to the 42° ± 1°C dry heat bath or water bath and allow them to cool for 5 minutes. DO
NOT ALLOW THE TUBES TO COOL AT ROOM TEMPERATURE. DO NOT COVER THE WATER BATH.
5/23/2011
9:11 AM
Page 10
5. Test tube racks, including racks used for the specimens and tests, should be decontaminated by complete
immersion in a 1:1 dilution of household bleach for a minimum of 15 minutes. The bleach should then be
rinsed off with water and the racks should be wiped dry or allowed to air dry.
6. Decontaminate the laboratory surfaces and equipment using a 1:1 dilution of household bleach.
Repeat Testing
1. If additional testing is to be performed on patient specimen lysates, bring prepared lysate to room
temperature. DO NOT VORTEX LYSATE.
2. Follow TEST PROCEDURE protocol as outlined, beginning with the Amplification step.
PROCEDURAL NOTES
A. Reagents
1. Enzyme Reagent should not be held at room temperature for more than 15 minutes after it
is reconstituted.
2. Mycobacterium Hybridization Buffer (HB) may precipitate. Warming and mixing the Mycobacterium
Hybridization Buffer (HB) or reconstituted Hybridization Reagent at 60°C will dissolve the precipitate.
B. Temperature
1. The amplification, hybridization and selection reactions are temperature dependent; ensure that the
water bath or dry heat bath is maintained within the specified temperature range.
2. The tubes must be cooled at 42°C for 5 minutes before addition of enzyme mix for optimal amplification
performance.
3. The temperature is critical for the amplification (42° ± 1°C).
C. Time
It is critical that the time limits specified in the TEST PROCEDURE be followed.
D. Water Bath
1. The level of water in the water bath should be maintained to ensure that the entire liquid reagent
volume in the reaction tubes is submerged, but the level must not be so high that water gets into the
tubes.
2. During the Amplification step, water bath covers should not be used to ensure that condensate cannot
drip into or onto the tubes.
E. Vortexing
It is important to have a homogeneous mixture during the Hybridization and Selection steps, specifically
after the addition of the reconstituted Mycobacterium Tuberculosis Hybridization Reagent (H) (the reaction
mixture will be uniformly yellow) and Mycobacterium Selection Reagent (S) (the reaction mixture will be
uniformly pink).
Vortexing is the manipulation of a solution to produce a uniform suspension. When the reagents are
placed into a test tube and supplied with an external energy source, a rapid rotation of the solution about
the tube axis is produced. The output of this rapid rotation is the production of a uniform test suspension.
During vortexing the tubes should be held in an upright, vertical position and supported by the top portion
of the tube to ensure that adequate vortexing is achieved. If an adequate vortexing motion is achieved,
the suspension rotates in a circular motion at a rate capable of lifting the solution to a height within the
upper half of the tube. During the Hybridization and Selection steps, this manipulation is applied
sequentially 3 times and the vortex maintained for at least 1 full second each time.
TEST INTERPRETATION
The specimen result when tested using the GEN-PROBE AMPLIFIED Mycobacterium Tuberculosis Direct
(MTD) Test is interpreted based on an initial negative result (< 30,000 RLU), an initial positive result
10
5/23/2011
9:11 AM
Page 11
A. Quality Control Results and Acceptability
Controls should produce the following values:
Amplification Cell Negative Control < 20,000 RLU
Amplification Cell Positive Control > 500,000 RLU
Specimen Processing Negative Control < 20,000 RLU
Specimen Processing Positive Control > 1,000,000 RLU
Patient test results must not be reported if the MTD test control values do not meet the criteria above. See
TROUBLESHOOTING section for further information.
Target values for controls should be determined in each laboratory using test results for each batch of prepared controls.
B. Patient Test Results
If the controls do not yield the expected results, test results on patient specimens in the same run must not
be reported.
Results:
> 500,000 RLU positive for M. tuberculosis complex rRNA
< 30,000 RLU negative for M. tuberculosis complex rRNA
30,000 to 499,999 RLU probable M. tuberculosis complex rRNA positive; repeat to verify results:
Repeat > 30,000 RLU positive for M. tuberculosis complex rRNA
Repeat < 30,000 RLU negative for M. tuberculosis complex rRNA
REPORTING OF RESULTS
Results from the MTD test should be interpreted in conjunction with other laboratory and clinical data available
to the clinician. Based upon the degree of clinical suspicion, testing of an additional specimen should be
considered.
If the initial MTD test result is positive at > 500,000 RLU, or the repeat MTD test result is positive at > 30,000
RLU, then report the following:
Report:
Mycobacterium tuberculosis complex rRNA detected. AFB
smear (positive or negative).
Additional Information:
AFB culture pending. Specimen may contain both MOTT
and M. tuberculosis or M. tuberculosis alone. This test
should not be the sole basis for diagnosing tuberculosis.
The positive predictive value for a smear negative patient
is lower than for a smear positive patient. This is particularly important in test populations where the prevalence of
tuberculosis is low and the positive predictive values of
diagnostic methods are correspondingly reduced.
11
English
(> 500,000 RLU), or an initial equivocal result (30,000 to 499,999 RLU). The MTD test should be repeated
from the reserved lysate when an initial test result is equivocal. A repeat result from the lysate > 30,000 is
considered positive.
5/23/2011
9:11 AM
Page 12
If the initial or the repeat MTD test result is negative at <30,000 RLU, then report the following:
Report:
No Mycobacterium tuberculosis complex rRNA detected.
AFB Smear (positive or negative).
Additional Information:
No Mycobacterium tuberculosis complex rRNA detected.
AFB culture pending. Specimen may not contain M. tuberculosis, the result may be falsely negative due to low numbers of M. tuberculosis in the presence or absence of
MOTT, or the result may be falsely negative due to assay
interference by specimen inhibitors. Testing of another
patient specimen is recommended if active tuberculosis is
clinically suspected or specimen inhibition is suspected.
LIMITATIONS
Use only for the detection of members of the M. tuberculosis complex using sediments prepared following the
NALC-NaOH or NaOH procedures recommended by the CDC7. This test may only be used with sediments
prepared from sputum (induced or expectorated), tracheal aspirates, or bronchial specimens (e.g., bronchoalveolar lavages and bronchial aspirates).
The MTD test is specific for, but does not differentiate among, members of the M. tuberculosis complex, i.e.,
M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti and M. canetti and M. terrae-like organisms
will cross-react if present at concentrations higher than 30 CFU per test. However, M. celatum and M. terraelike organisms are rare clinical isolates.
Test results may be affected by specimen collection and transport, specimen sampling variability, laboratory
procedural errors, sample misidentification, and transcriptional errors. A negative test does not exclude the
possibility of isolating an M. tuberculosis complex organism from the specimen.
EXPECTED VALUES
A. Range of Control Values Observed in the Clinical Studies
The RLU range for the controls observed in a 7 site clinical study was:
12
5/23/2011
9:11 AM
Page 13
B. Range of RLU Values for Clinical Specimens
For the 577 MTD test negative specimens, the range of values was 573 to 19,176 RLU.
The frequency distribution of the RLU values for all these specimens after discrepant resolution is shown
below: Discrepant resolution is based on the presence of other culture positive specimens from the same
patient and/or attending physician’s final diagnosis.
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
A. Clinical Evaluation
The original MTD test was evaluated in studies at 6 sites comparing AFB smear results to mycobacterial
culture results in 6,079 specimens from 2,609 patients. Of these, 4,000 specimens were collected from
1,898 patients not on antituberculous therapy. The 6 study sites were geographically diverse: 5 were
large metropolitan hospital centers with tuberculosis treatment centers and one was a state public health
laboratory.
The current MTD test format was evaluated in a separate study at 7 sites comparing the MTD test results to
mycobacterial culture results. The 7 study sites were geographically diverse; 6 sites were large metropolitan
hospital centers with tuberculosis treatment centers and one was also a national mycobacteriology laboratory.
13
English
The range of RLU values for the 127 specimens that were MTD test positive was 35,777 to > 2,000,000 RLU.
5/23/2011
9:11 AM
Page 14
The seventh site was a public health laboratory. Specimens from patients not on therapy were tested. Of these,
132 were culture positive for M. tuberculosis complex. MTD detected 119 of these culture positive specimens; 7
specimens grew MOTT in addition to M. tuberculosis.
Patients with suspected active pulmonary tuberculosis and not on therapy were enrolled in this study. The
overall prevalence of patients that were culture positive for M. tuberculosis was 20.5%.
The overall MTD test sensitivity by patient was 93.3% and specificity by patient was 99.1% compared to
culture results. The overall MTD test sensitivity by specimen was 90.6% and specificity by specimen was
99.6% compared to culture results. Results from the 7 sites for sensitivity, specificity, Positive Predictive
Value (PPV), and Negative Predictive Value (NPV) are shown in the following table, along with the 95%
confidence intervals for the performance estimates. All data are shown subsequent to discrepant
resolution based on the presence of other culture positive specimens from the same patient and/or attending physician’s final diagnosis.
Of the 564 specimens that were culture and MTD negative for M. tuberculosis complex, 114 specimens
grew MOTT on culture, 64 were from patients with other cultures positive for MOTT, and 169 were from
patients with negative mycobacterial cultures.
14
5/23/2011
9:11 AM
Page 15
Because there was no significant site-to-site or day-to-day variability observed, the data from all 3 sites
were combined and are presented below. The RLU values measured are limited by the luminometer
photomultiplier tube. Therefore, values greater than 2,000,000 RLU are truncated. No standard deviation
or % CV values are given.
C. Reproducibility
The reproducibility panel consisted of 25 samples with Amplification Negative Controls interspersed
between each sample for a total of 50 samples. The Reproducibility Panel was tested at 4 sites.
Overall, 100% (120/120) of the negative samples yielded the expected results and 98.8 % (79/80) of the
positive samples yielded the expected results.
D. Analytical Specificity
Specificity of the MTD test was assessed using bacteria, fungi, and viruses. For bacteria and fungi,
specificity testing included 160 strains (151 species from 62 genera) of closely related mycobacteria, other
organisms causing respiratory disease, and normal respiratory flora or organisms representing a
cross-section of phylogeny. Type strains were obtained from the American Type Culture Collection
(ATCC), and 5 isolates were obtained from clinical laboratories. Lysates prepared from actively growing
cultures (or rRNA in 3 cases) were evaluated in the MTD test according to the TEST PROCEDURE.
Approximately 5 x 107 CFU per reaction were tested. Only strains of the M. tuberculosis complex yielded
positive results, with the exception of M. celatum and M. terrae-like strains.
At concentrations higher than 30 CFU per test, M. celatum and some M. terrae-like strains will yield
positive MTD test results. At a level of 30 CFU per test, M. celatum yielded 26,772 RLU and M. terrae-like
ranged from 19,470 to 49,976 RLU.
E. Limits of Detection
Thirty (30) strains of M. tuberculosis from a wide geographic distribution, including representative
drug-resistant and drug-sensitive strains, were detected with the MTD test. The MTD test detected 1 CFU
per test of all 30 strains.
F. Recovery
Twenty-five (25) fg Mycobacterium tuberculosis rRNA (equivalent to 5 CFU per test) were tested in the
presence of approximately 540,000 CFU per test (450 μL) of the following relevant non-target organisms:
Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa,
15
English
B. Precision Studies
Precision panels, consisting of 2 negative samples, 2 low positive samples (ª 100 CFU/test) and 2
moderately high positive samples (ª 1000 CFU/test) were tested at 3 sites. The positive samples were
prepared by spiking a contrived moderately inhibitory sediment pool with known amounts of
M. tuberculosis. The samples were tested in triplicate twice a day for 3 days at the 3 sites. Positive and
negative amplification controls were included in each run.
5/23/2011
9:11 AM
Page 16
Mycobacterium gordonae, M. avium, M. kansasii, M. terrae, Nocardia asteroides, N. otitidis-caviarum,
Corynebacterium pseudotuberculosis, C. diphtheriae, Gordona sputi, and Rhodococcus bronchialis. All test
results were positive for M. tuberculosis rRNA in the presence of these non-target organisms.
TROUBLE SHOOTING
OBSERVATION
Elevated Amplification Cell
Negative Control or Specimen
Processing Negative Control
(> 20.000 RLU)
POSSIBLE CAUSES
• Insufficient mixing or volume
added after addition of the
Mycobacterium Selection
Reagent (S).
• Insufficient care taken during
set up of the reactions and
the resultant amplification of
contaminating materials
introduced at that time.
• Skipped 5 minute cool down
step.
• Contamination of lab surface
or reagents.
• Failure to wipe tubes prior to
reading in the luminometer.
Low Amplification Cell Positive
Control or Specimen Processing
Positive Control
(< 500.000 RLU)
• Performed the amplification
step outside the recommended temperature range.
• Added Amplification Reagent
to the side instead of to the
bottom of the tube.
• Insufficient mixing after addition of the reconstituted
Mycobacterium Tuberculosis
Hybridization Reagent.
• Added too much Selection
Reagent.
• Allowed the Selection step to
go over the recommended
time limit.
• Allowed the tubes to cool
down below 42°C after the
95°C incubation.
• Detection Reagent lines
clogged.
16
RECOMMENDED ACTIONS
Achieve complete mixing.
Ensure correct volume is
added. Visually verify a uniformly pink solution after vortexing.
Exercise extreme care when
pipetting. The spent reaction
tubes must be decontaminated
with a 1:9 dilution of household
bleach as described in the
TEST PROCEDURE section.
Laboratory bench surfaces, dry
heat bath, water baths and
pipettors must be decontaminated with a 1:1 dilution of
household bleach as described
in the TEST PROCEDURE.
Tubes must be wiped with a
damp tissue or lint-free paper
towel prior to reading in the
luminometer.
Check water bath and/or dry
heat bath temperature and
adjust as necessary to achieve
the temperature ranges specified in procedure.
Carefully vortex as specified.
(See Hybridization, Step 2.)
Visually verify solution is yellow
after vortexing.
Check pipettor volume setting.
Carefully time the 60°C incubation in the Selection step to be
15 minutes.
Transfer tubes directly from the
95°C dry heat bath to the 42°C
water bath/dry heat bath.
Perform warm water flushes as
described in the Instrument
Operator’s Manual.
5/23/2011
9:11 AM
Page 17
NOTES
17
English
A Heating blocks must have wells properly sized for 12 x 75 mm tubes. Use of GEN-PROBE dry heat bath
is recommended.
B Screw-capped microcentrifuge tubes are recommended for storage of frozen aliquots. Individual frozen
aliquots may be frozen and thawed for use no more than once. Frost-free freezers must not be used.
C 5 mL cryovials are recommended for storage of frozen aliquots. Individual frozen aliquots may be frozen
and thawed for use no more than once. Frost-free freezers must not be used.
D Due to vortexing equipment differences and set speed variations, a longer vortex time may be required
depending on individual vortexing equipment. Adjust vortexer speed and follow vortex handling procedures
as described under PROCEDURAL NOTES, Section E, to allow reaction mixture to reach and maintain a
height within the upper half of the tube. Adequate vortexing as described is necessary to achieve accurate
assay results. Times may be increased up to a total of 15 seconds without affecting assay results.
5/23/2011
9:11 AM
Page 18
18
5/23/2011
9:11 AM
Page 19
Packung mit 50 Tests
(bioMérieux Best.Nr. 39006 / Gen-Probe Kat. Nr. 301001/1001F)
VERWENDUNGSZWECK
Der GEN-PROBE AMPLIFIED Mycobacterium Tuberculosis Direkttest (MTD) ist ein NukleinsäureAmplifizierungstest für den in vitro Nachweis von rRNA aus dem Mycobacterium tuberculosis Komplex in
Sedimenten, die aus Sputum (induziert oder expektoriert), Bronchialmaterial (Bronchiallavage oder
Bronchialaspirate) oder Trachealsekret gewonnen wurden.
WARNHINWEISE
Dieser Test wurde nicht für den direkten Nachweis von M. tuberculosis rRNA aus anderen klinischen Proben
(z.B. Blut, Urin oder Stuhl) evaluiert. Die Performance des MTD-Tests wurde nur für solche Proben ermittelt,
die gemäß den in dieser Packungsbeilage beschriebenen Verfahren gewonnen und gemäß den angegebenen
Lagerungsbedingungen aufbewahrt wurden.
Positive Sedimente müssen kultiviert werden, um festzustellen, ob die Probe neben M. tuberculosis Komplex
auch atypische Mykobakterien (MOTT) enthält und um eine Resistenztestung durchzuführen. Desweiteren
sollten Kulturen angelegt werden, um zu bestimmen, welche M. tuberculosis Subspezies (z.B. M. bovis) vorliegt.
Obwohl im Verlauf klinischer Evaluierungen auch Probenmaterialien von Kindern, HIV-positiven Patienten und
Personen mit MOTT-Infektionen getestet wurden, sind die Gesamtzahlen nicht ausreichend, um daraus
schließen zu können, daß es keine statistischen Performanceunterschiede in diesen besonderen
Patientengruppen gibt.
Hinsichtlich einer Verlaufskontrolle oder eines Therapieerfolgs bei antituberkulotisch therapierten Patienten
wurde der MTD-Test nicht evaluiert.
Für den MTD-Test sollten keine blutigen Untersuchungsmaterialien verwendet werden.
VORSICHTSMASSNAHMEN
A. Nur für die in vitro Diagnostik verwenden.
B. Der MTD weist spezifisch Mykobakterien des M. tuberculosis Komplexes nach, d.h. M. tuberculosis, M.
bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti und M. canetti (13). Er ermöglicht jedoch keine
Differenzierung innerhalb dieser Spezies. M. celatum und M. terrae-ähnliche Mykobakterien können zu
Kreuzreaktionen führen, wenn sie in Konzentrationen über 30 KBE (Kolonie-bildenden Einheiten) pro Test
vorhanden sind. M. celatum und M. terrae-ähnliche Mykobakterien werden jedoch selten aus klinischen
Proben isoliert.
C. Ein negatives Ergebnis schließt nicht aus, daß die Probe Keime des M. tuberculosis Komplex enthält. Die
Testergebnisse werden durch Probenentnahme und Transport, Variabilitäten bei der Probenabnahme,
technische Fehler des Labors, Fehler bei der Probenidentifikation und durch Fehler bei der Übermittlung
der Ergebnisse beeinflußt.
D. Der Test ist nur für den Nachweis von Spezies des M. tuberculosis Komplex aus Proben bestimmt, die
19
Deutsch
AMPLIFIED MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS DIREKTTEST
5/23/2011
9:11 AM
Page 20
gemäß der vom Centers for Disease Control (CDC)7 empfohlenen NALC-NaOH oder NaOH Methode
behandelt wurden. Dieser Test darf nur mit konzentrierten Sedimenten aus Sputum (induziert oder expektoriert), Trachealsekreten oder Bronchialmaterial (z.B. Bronchiallavagen, Bronchialaspirationen) verwendet
werden. Es muß darauf geachtet werden, daß die Phosphatkonzentration nach der Resuspension der
Probe mit Phosphatpuffer 67 mM7 beträgt.
E. Vermeiden Sie jeden Kontakt der Detektionsreagenzien I und II (bioMérieux Best.Nr. 39300 / Gen-Probe
Kat. Nr. 201791/1791) mit der Haut, den Augen oder den Schleimhäuten. Bei eventuellem Kontakt sofort
mit Wasser spülen. Beim Verschütten einer dieser Reagenzien, die Flüssigkeit vor dem Aufwischen mit
Wasser verdünnen.
F. Beachten Sie bei der Durchführung dieses Tests die allgemein gültigen Vorsichtsmaßnahmen4. Bei der
Vorbereitung der Sedimente, sowie bei den einzelnen Arbeitsschritten des MTD-Tests sollten die mikrobiologischen Vorschriften für den Sicherheitsbereich 2 beachtet werden 5.
G. Verwenden Sie nur die mitgelieferten oder empfohlenen Einweg-Labormaterialien.
H. Die Arbeitsflächen, Pipetten und das Material müssen, wie im Abschnitt „TESTDURCHFÜHRUNG“
beschrieben, mit einer 1:1 verdünnten Chlorbleichlösung (ein Teil Bleiche, ein Teil Wasser) dekontaminiert
werden. Die Bleichlösung 15 min einwirken lassen und anschließend mit Wasser spülen und abwischen.
I. Verwenden Sie für die Durchführung dieses Tests Pipetten mit Spitzen, die einen hydrophoben Filter
enthalten. Für den Transfer des Lysats aus den Lyseröhrchen in die Amplifizierungsröhrchen müssen extra
lange Spitzen mit hydrophobem Filter verwendet werden. Für jedes Reaktionsröhrchen muß eine neue
Pipettenspitze verwendet werden. Pipettenspitzen mit Probenmaterial sollten nicht über den Ständer mit
den Reaktionsröhrchen geführt werden. Die Pipettenpitzen müssen nach Gebrauch sofort in einen dafür
vorgesehenen Abfallbehälter entsorgt werden.
J. Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, achten Sie beim Pipettieren der Reagenzien mit der
Repetierpipette bitte darauf, daß nach der Lysatzugabe in die Röhrchen, die Pipettenspitze nicht mit den
Röhrchen in Kontakt kommt. Zur Vermeidung von Spritzern sollten die Reagenzien gegen die innere
Röhrchenwand pipettiert werden. Vorsichtiges Pipettieren ist wichtig, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
K. Für die Arbeitsschritte vor und nach der Amplifizierung müssen separate Pipetten verwendet werden.
L. Nach Messung der Proben im Luminometer, dekontaminieren Sie die Röhrchen und entsorgen Sie diese
wie im Abschnitt „TESTDURCHFÜHRUNG“ und „ANMERKUNGEN“ beschrieben, um
Laborkontaminationen mit Amplifikaten zu vermeiden.
M. Selbstklebefolien und Stopfen sollten nach dem Abnehmen von den Reaktionsröhrchen sofort in einen
dafür vorgesehenen Abfallbehälter entsorgt werden. Sie dürfen AUF KEINEN FALL wiederverwendet werden. Bei der Verwendung von Selbstklebefolie ist darauf zu achten, daß alle Röhrchen gut abgedichtet
sind.
N. Die Wasserbäder während der Inkubationen nicht abdecken, insbesondere wenn Stopfen verwendet werden (Kondenswasser am Deckel ist eine mögliche Quelle für Kontaminationen).
O. Für die Erzielung akkurater Ergebnisse ist es wichtig, nach der Zugabe des Selektionsreagenzes ausreichend zu vortexen.
P. Zur Minimierung des Kontaminationsrisikos durch Amplikons wird empfohlen, den HPA (Hybridization
Protection Assay)-Testschritt in einem separaten Arbeitsbereich durchzuführen. Dieser Arbeitsbereich sollte
von den Arbeitsplätzen für Proben- und Reagenzvorbereitung sowie der Amplifizierung deutlich getrennt
sein.
Q. Um Laborkontaminationen mit Amplikons zu vermeiden, sollten die Arbeitsabläufe in einer Richtung organisiert sein, z.B. von der Proben- und Reagenzvorbereitung zur Amplifizierung und anschließend zum HPA.
Proben, Geräte und Reagenzien sollten nicht wieder in einen Bereich zurückgebracht werden, in denen
ein vorheriger Arbeitsschritt durchgeführt wurde. Desweiteren sollte das Laborpersonal nicht in vorherige
Arbeitsbereiche zurückgehen, ohne entsprechende Sicherheitsmaßnahmen zur Vermeidung von
20
5/23/2011
9:11 AM
Page 21
Konventionelle Kulturmethoden können das Wachstum von Tuberkulose-Bakterien innerhalb von 1 bis 8
Wochen nachweisen7,10. Der MTD-Test dagegen ermöglicht den rRNA Nachweis von Mykobakterien des M.
tuberculosis Komplexes innerhalb von 2,5 bis 3,5 Stunden. Auch wenn der MTD-Test keine Aussage hinsichtlich der Empfindlichkeit gegen Antibiotika macht, so weist er doch M. tuberculosis zuverlässig und schnell
nach. Dadurch könnten die Isolierstationen der Krankenhäuser besser eingesetzt und schneller mit einer
adäquaten Therapie begonnen werden. Die Isolierung von möglicherweise infizierten Kontaktpersonen könnte
rechtzeitig vorgenommen werden3.
PRINZIP
Der MTD-Test ist ein Test, bei dem Amplifizierung und Detektion in ein und demselben Röhrchen durchgeführt
werden. Zunächst werden die Nukleinsäuren der Mykobakterien durch Ultraschall freigesetzt. Unter
Hitzeeinwirkung werden die Nukleinsäuren denaturiert und die Sekundärstruktur der rRNA aufgebrochen.
Mittels der Gen-Probe TMA Methode wird dann bei einer konstanten Temperatur von 42°C ein spezifischer
Abschnitt der Mykobakterien rRNA amplifiziert. Dabei kommt es in einem Zwischenschritt durch Transkription
zur Bildung von DNA, aus der wiederum sehr viele RNA Amplikons gebildet werden.
Die M. tuberculosis Komplex spezifischen Sequenzen der rRNA Amplikons werden anschließend mit der GenProbe HPA Methode nachgewiesen2. Das Mycobacterium Tuberculosis-Hybridisierungsreagenz enthält eine
einzelsträngige DNA-Sonde, an die ein Chemiluminiszenzmarker gekoppelt ist. Diese Sonde ist zu den M.
tuberculosis spezifischen Sequenzen komplementär. Die Sonde bildet mit diesen spezifischen Sequenzen
stabile RNA-DNA Hybride. Nach einem Selektionsschritt wird das von den hybridisierten Sonden abgegebene
Lichtsignal mit dem GEN-PROBE LEADER Luminometer detektiert.
REAGENZIEN
(Packung mit 50 Tests)
Die Reagenzien des MTD-Tests werden folgendermaßen angeboten:
Reagenz-Bezeichnung
Volumen
REAGENZIEN FÜR DIE AMPLIFIZIERUNG
Probenverdünnungspuffer (SDB) ....................................................................................................1 x 2,5 ml
Tris-Pufferlösung mit < 3 % Detergenz
Amplifizierungsreagenz (A) ................................................................................................................1 x 3 ml
Lyophilisierte Nukleinsäuren in Tris Pufferlösung mit 5 % Bindemittel
(nach Auflösung)
Amplifizierungspuffer (AB) ..................................................................................................................1 x 3 ml
Wässrige Lösung mit Konservierungsstoffen
Ölreagenz (O)....................................................................................................................................1 x 10 ml
Silikonöl
21
Deutsch
Kontaminationen getroffen zu haben. Es wird dringend empfohlen, die Laminar Flow Box, die für die
Probenbehandlung verwendet wurde, nicht zur Durchführung des MTD Tests zu verwenden.
EINFÜHRUNG
Der MTD-Test verwendet die Techniken TMA (Transcription-Mediated Amplification) und HPA (Hybridization
Protection Assay)2 zum qualitativen Nachweis von ribosomaler Ribonukleinsäure (rRNA) von Mykobakterien
des M. tuberculosis Komplexes. Der MTD-Test weist sowohl die rRNA von kultivierbaren als auch von nicht
kultivierbaren Organismen nach. Der M. tuberculosis Komplex umfaßt die Subspezies M. tuberculosis, M.
bovis, M. bovis BCG, M. africanum M. microti und M. canetti (12, 13). Der MTD-Test weist alle
Mikroorganismen des M. tuberculosis Komplex nach. M. microti ist nur für Tiere infektiös, M. bovis wird selten
vom Tier auf den Menschen übertragen und M. africanum ist für die Lungentuberkulose im tropischen Afrika
verantwortlich12. M. tuberculosis ist der häufigste Erreger, der Tuberkulose. Das CDC hat kürzlich über einen
Anstieg der Tuberkulose-Inzidenz bei AIDS-Patienten und Einwanderern und über eine Zunahme der
Krankheitsübertragungen innerhalb von Hochrisikogruppen berichtet6,9. Außerdem wird ein Anstieg der
Ausbildung von resistenten bzw. multiresistenten Stämme gegenüber Antituberkulotika beobachtet11. Die
Konsequenzen im Bereich der öffentlichen Gesundheit sind beträchtlich.
5/23/2011
9:11 AM
Page 22
Enzymreagenz (E)............................................................................................................................1 x 1,5 ml
Reverse Transkriptase und RNA-Polymerase, lyophilisiert, in HEPES-Pufferlösung
(nach Auflösung)
mit < 10 % Bindemittel und > 15 mM N-Acetyl-L-Cystein
Enzymverdünnungspuffer (EDB)......................................................................................................1 x 1,5 ml
Tris Pufferlösung mit oberflächenaktiver Substanz und Glyzerin
HYBRIDISIERUNGS-REAGENZIEN
Hybridisierungsreagenz (H) ................................................................................................................1 x 6 ml
Nicht-infektiöse Chemiluminiszenz-markierte DNA-Sonde, < 100 ng/Ampulle,
lyophilisiert, in Succinat-Pufferlösung mit Bindemittel und Detergenz
(nach Auflösung)
Hybridisierungspuffer (HB) ..................................................................................................................1 x 6 ml
Succinat-Pufferlösung mit < 4 % Detergenz
Selektionsreagenz (S) ......................................................................................................................1 x 15 ml
Borat-Pufferlösung mit oberflächenaktiver Substanz
Lyseröhrchen (LT)..................................................................................................................2 x 25 Röhrchen
Glaskügelchen, Bindemittel
LAGERUNG
A. Die folgenden Lösungen bzw. nicht gelösten Bestandteile müssen bei 2° - 8°C gelagert werden und sind
bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar:
Probenverdünnungspuffer (SDB)
Amplifizierungsreagenz (A)
Amplifizierungspuffer (AB)
Enzymreagenz (E)
Enzymverdünnungspuffer (EDB)
Hybridisierungsreagenz (H)
Das aufgelöste Amplifizierungsreagenz (A) ist 2 Monate bei 2° - 8°C haltbar. Das Hybridisierungsreagenz (H)
und das Enzymreagenz (E) sind nach der Auflösung 1 Monat bei 2° - 8°C haltbar oder 2 Monate bei einer
Temperatur < -20°C, wenn sie am Tag der Auflösung portioniert und eingefroren werden. Die eingefrorenen
Aliquots müssen an dem Tag, an dem sie aufgetaut werden, verbraucht werden. Tiefkühlgeräte mit automatischer Abtauvorrichtung dürfen nicht verwendet werden.
B. Folgende Bestandteile müssen bei 2° - 25°C gelagert werden und sind bis zum angegebenen
Verfallsdatum haltbar:
Ölreagenz (O)
Hybridisierungspuffer (HB)
Selektionsreagenz (S)
Lyseröhrchen (LT)
ENTNAHME, LAGERUNG, TRANSPORT UND VERARBEITUNG DER PROBEN
Probenentnahme und Lagerung:
Die Proben müssen in sterilen Plastikbehältern gesammelt und bis zum Transport bzw. bis zur Verarbeitung
bei 2° - 8°C gelagert werden. Die für klinische Studien verwendeten Proben wurden bis zur Verarbeitung nicht
länger als 4 Tage gelagert (im allgemeinen weniger als 24 Stunden).
22
5/23/2011
9:11 AM
Page 23
Transport:
Die Proben sollten so schnell wie möglich ins Labor gebracht werden.
Verarbeitung (Dekontamination und Konzentration):
Stark bluthaltige Materialien sollten nicht mit dem MTD-Test getestet werden. Dieser Test ist für den Nachweis
der rRNA von Mykobakterien des M. tuberculosis Komplex in solchen Proben bestimmt, die gemäß den allgemein anerkannten Verfahren mit NALC-NaOH oder NaOH (mit 1 % bis 1,5 % NaOH) 15 bis 20 min dekontaminiert und bei > 3000 x g zentrifugiert wurden 7.
Packungsinhalt (bioMérieux Best.Nr. 39006 / Gen-Probe Kat. Nr. 301001/1001F) 50 Tests
AMPLIFIZIERUNGSREAGENZIEN
Probenverdünnungspuffer (SDB)
1 x 2,5 ml
Amplifizierungsreagenz (A)
1 x 3 ml (nach Auflösung)
Amplifizierungspuffer (AB)
1 x 3 ml
Ölreagenz (O)
1 x 10 ml
Enzymreagenz (E)
1 x 1,5 ml (nach Auflösung)
Enzymverdünnungspuffer (EDB)
1 x 1,5 ml
HYBRIDISIERUNGSREAGENZIEN
Hybridisierungsreagenz (H)
1 x 6 ml (nach Auflösung)
Hybridisierungspuffer (HB)
1 x 6 ml
Selektionsreagenz (S)
1 x 15 ml
Lyseröhrchen (LT)
2 x 25 Röhrchen
Selbstklebefolien
1 Packung
B. Zusätzlich erforderliches Material:
Mikropipetten für 25 μl, 50 μl, 100 μl, 200 μl, 300 μl und 450 μl
Repetierpipette
Vortex
Steriles Wasser (filtriert oder autoklaviert)
Kulturröhrchen
Sterile Glaskügelchen 3 mm
Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluß
Ständer für Reaktionsröhrchen
Pipettenspitzen mit Filter (1 000 μl)
Positive Amplifizierungskontrolle (z.B. M. tuberculosis, ATCC 25177 oder ATCC 27294)
Negative Amplifizierungskontrollen z.B. M. gordonae, ATCC 14470 oder M. terrae, ATCC 15755)
Bleichlösung (Hypochloritlösung 5,25 %)
23
Deutsch
Lagerung der behandelten Proben:
Das Sediment kann vor der Testung bis zu 3 Tage bei 2° - 8°C gelagert werden. Bei -20°C oder -70°C kann es
bis zu 6 Monate gelagert werden. Tiefkühlgeräte mit automatischer Abtauvorrichtung dürfen nicht verwendet
werden.
MATERIAL
A. Lieferumfang
5/23/2011
9:11 AM
Page 24
Plastik-Abdeckfolien für die Arbeitsflächen
C. Zusätzlich lieferbare Materialien:
GEN-PROBE Ultraschallbad (bioMérieux Best.Nr. 39409 / Gen-Probe Kat.Nr. No. 901104/T460)
GEN-PROBE Heizblöcke (42°C ± 1°C, 60°C ± 1°C, 95°C ± 5°C)A (bioMérieux Best.Nr. 39405, 39406,
39407 / Gen-Probe Kat.Nr. 3396, 3397, 3398)
GEN-PROBE LEADER 50i Luminometer (bioMérieux Best.Nr. 39400 / Gen-Probe Kat.Nr. 103100i/3100i)
GEN-PROBE Detektionsreagenzien-Kit (bioMérieux Best.Nr. 39300 / Gen-Probe Kat.Nr. 201791/1791)
GEN-PROBE MTD Amplifizierungskontrollen (bioMérieux Best.-Nr. 39223 / Gen-Probe Kat.Nr. 301043F/
1043F)
GEN-PROBE Röhrchenständer für das Ultraschallbad (bioMérieux Best.Nr. 39313 / Gen-Probe Kat.Nr. 104027/
4027)
Ständer für Reaktionsröhrchen (bioMérieux Best.Nr. 39311 / Gen-Probe Kat.Nr. 3994)
Lange Pipettenspitzen mit Filter (1250 μl) (bioMérieux Best.Nr. 39315 / Gen-Probe Kat.Nr. 104316/4316)
Polypropylenröhrchen, 12 x 75 mm (bioMérieux Best.Nr. 39308 / Gen-Probe Kat.Nr. 102440/2440)
Polypropylenstopfen für Röhrchen mit 12 x 75 mm (bioMérieux Best.Nr. 39320 / Gen-Probe Kat.Nr. 400713)
TESTDURCHFÜHRUNG
Kontrollen
Die Stämme für die Amplifizierungs-Positivkontrolle müssen zum M. tuberculosis Komplex gehören, wie z.B.
der avirulente H37Ra (ATCC 25177) Stamm oder der virulente H37Rv (ATCC 27294) Stamm. Die Stämme für
die Negativkontrolle sollten zu den atypischen Mykobakterien (MOTT) gehören, z.B. M. gordonae (ATCC
14470) oder M. terrae (ATCC 15755). Die Kontrollen müssen vor der Testung der Probe vorbereitet sein.
Die Kontrollen müssen 25 – 150 KBE pro 50 μl enthalten, so dass eine Endkonzentration von 1 – 10 KBE pro
Test erreicht wird. Diese Konzentration sollte kulturell überprüft werden. Diese Kontrollen werden für die
Vorbereitung der Probenbehandlungskontrollen verwendet (siehe Probenvorbereitung).
1. Empfohlenes Verfahren zur Vorbereitung der Kontrollen
a. Geben Sie 3 bis 5 sterile Glaskügelchen (Durchmesser 3 mm) in ein sauberes Kulturröhrchen.
b. 1 bis 2 ml steriles Wasser zugeben. Nehmen Sie mehrere Impfösen (1 μl) von der entsprechenden
Kultur ab und geben Sie diese in das vorbereitete Röhrchen. Das Röhrchen verschließen und
mehrmals bei hoher Geschwindigkeit vortexen.
c. Suspension für 15 min stehen lassen.
d. Überführen Sie den Überstand in ein sauberes Kulturröhrchen. Stellen Sie die Trübung mit einem
Nephelometer auf McFarland Standard 1 ein.
e. Verdünnen Sie die Suspension 1:100, indem Sie 100 μl der auf McFarland 1 eingestellten Suspension
in 10 ml steriles Wasser geben. Das Röhrchen verschließen und vortexen. Dies ist die Verdünnung 1.
f. Anschließend eine zweite 1:100 Verdünnung herstellen. Geben Sie hierfür 100 μl der Verdünnung 1 in
10 ml steriles Wasser. Das Röhrchen verschließen und vortexen. Dies ist die Verdünnung 2. Diese
Verdünnung sollte ca. 25 – 150 KBE pro 50 μl enthalten.
Portionierung und Lagerung der Kontrollen
a. Die Verdünnungen müssen à 500 μl in saubere 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluß
pipettiert werden. Diese Aliquots sind für den einmaligen Gebrauch bestimmt und können 6 Monate bei
24
5/23/2011
9:11 AM
Page 25
–20°C oder 1 Jahr bei –70°C aufbewahrt werden. Verwenden Sie kein Tiefkühlgerät mit automatischer
Abtauvorrichtung. Die Testung der empfohlenen M. tuberculosis Positivkontrolle dient nur zum
Nachweis eines wesentlichen Qualitätsverlustes der Reagenzien. Mit der Positivkontrolle wird die
Einwirkung durch überschüssiges NaOH und Phosphatpuffer auf die Reagenzien kontrolliert. Zeit- und
Temperaturschwankungen im Test, welche die Amplifizierung oder Selektionszeit beeinflussen, können
mit der empfohlenen Kontrolle nicht nachgewiesen werden. Weitere Kontrollen können den Richtlinien
oder besonderen Anforderungen entsprechend getestet werden.
2. Inhibitionskontrollen
a 50 μl des Probenverdünnungspuffers in 2 Mykobakterien Lyseröhrchen (LT) pipettieren (angereichert
und nicht angereichert).
b. In ein Röhrchen 50 μl der Positivkontrolle und 450 μl der Probe geben (angereicherte Probe). In das
zweite Röhrchen nur 450 μl Probe pipettieren (nicht angereichert). Führen Sie den MTD-Test wie
gewohnt durch.
Interpretation
Beträgt der RLU Wert (Relative Light Units) in der angereicherten Probe > 30.000 RLU, enthält die Probe
keinen Amplifizierungsinhibitor und offensichtlich keine Zielsequenz für die Amplifikation. Liegt der RLU
Wert der angereicherten Probe unter 30.000 RLU, enthält die Probe einen Amplifizierungsinhibitor. Fordern
Sie in diesem Fall neues Untersuchungsmaterial an. Ergibt sich bei der erneuten Testung der nicht
angereicherten Probe ein positives Ergebnis, kann das MTD-Ergebnis als positiv bewertet werden. Die
wahrscheinlichste Erklärung für diesen Reaktionstyp sind Schwankungen bei der Probengewinnung; d.h.
im Gegensatz zur zweiten Probe enthielt die erste Probe keine Zielsequenz für die Amplifikation. Der RLUWert der nicht angereicherten Probe kann entweder positiv oder negativ sein, abhängig davon, ob das verwendete Aliquot aus dem Sediment M. tuberculosis Komplex rRNA enthielt oder nicht.
3. Kontaminationskontrolle des Labors
Zur Überprüfung des Labors auf Kontamination mit M. tuberculosis Amplikons sollte folgendes Verfahren
angewendet werden:
a. Geben Sie 1 ml steriles Wasser in ein sauberes Röhrchen. Befeuchten Sie einen sterilen Wattetupfer
aus Polyester oder Dacron mit sterilem Wasser.
b. Wischen Sie mit diesem Tupfer über den Labortisch oder die verwendeten Geräte.
c. Den Tupfer in das Röhrchen geben und sorgfältig mischen. Den Tupfer herausnehmen und an der
Röhrchenwand ausdrücken. Verwerfen Sie den Tupfer in einem Behälter, der 1:2 verdünnte
Bleichlösung (1 Teil Bleiche, 1 Teil Wasser) enthält.
d. 25 μl der so erhaltenen Lösung in ein Amplifizierungsröhrchen geben, das 50 μl Amplifizierungsreagenz
und 200 μl Ölreagenz enthält.
e. Folgen Sie den Anleitungen im Abschnitt „TESTDURCHFÜHRUNG“.
Interpretation
Bei Ergebnissen > 30.000 RLU ist die Oberfläche kontaminiert und muß mit Bleichlösung dekontaminiert
werden, wie im Abschnitt „TESTDURCHFÜHRUNG: Vorbereitung des Materials“ angegeben. Bei Verdacht
auf eine Kontamination des Wasserbads, testen Sie 25 μl Wasser aus dem Wasserbad wie oben
beschrieben, vorausgesetzt das Wasserbad enthält keine Antiseptika.
Gerätevorbereitung
1. Für eine optimale Energieübertragung im Ultraschallbad muß das Wasser vor jedem Betrieb des Gerätes
entgast werden:
25
Deutsch
Bei negativem MTD-Testergebnis und gleichzeitigem starken klinischen Verdacht auf das Vorliegen einer
Tuberkulose besteht die Möglichkeit, die Probe auf Inhibitoren zu untersuchen. Gehen Sie hierfür folgendermaßen vor:
5/23/2011
9:11 AM
Page 26
a. Füllen Sie das Ultraschallbad bis ca. 1 cm unter den Rand mit Leitungswasser bei Raumtemperatur.
b. Schalten Sie das Ultraschallbad für 15 min. ein, um das Wasser zu entgasen.
2. Einen Heizblock auf 95°C, einen Heizblock oder ein Wasserbad auf 60° ± 1°C und einen Heizblock oder
ein Wasserbad auf 42° ± 1°C einstellen.
3. Vor der Testdurchführung müssen die Arbeitsflächen, das Material und die Pipetten mit einer 1:2
verdünnten Bleichlösung (1 Teil Bleiche, 1 Teil Wasser) gereinigt werden. Die Bleichlösung sollte
mindestens 15 min. einwirken. Die Arbeitsfläche zur Entfernung der Bleichlösung mit Wasser abspülen. Die
Oberfläche, auf der der Test durchgeführt wird, mit einer Plastikunterlage abdecken.
4. Das GEN-PROBE LEADER Luminometer vorbereiten. Vergewissern Sie sich, daß für die Durchführung
des Tests ausreichend Detektionsreagenz I und II vorhanden ist und die Schläuche angeschlossen sind.
Zum Nachfüllen der Detektionsreagenzien beachten Sie bitte die Hinweise im Handbuch des
Luminometers (diese Reagenzien sind separat zu beziehen).
Reagenzvorbereitung
Das Amplifizierungsreagenz (A) (50 Tests) mit 3 ml Amplifizierungspuffer (AB) aufnehmen. Vortexen bis das
Reagenz gelöst ist. Das aufgelöste Reagenz solange bei Raumtemperatur stehen lassen, bis die Lösung klar
wird. Das aufgelöste Amplifizierungsreagenz ist bei 2° - 8°C 2 Monate haltbar. Vor Gebrauch sollte die Lösung
auf Raumtemperatur gebracht werden.
Probenvorbereitung
1. Beschriften Sie eine ausreichende Zahl an Mycobacterium Lyseröhrchen (LT) für die Testung der Proben
und entweder jeweils ein Röhrchen für die Amplifizierungs-Positivkontrolle bzw. -Negativkontrolle oder die
Positiv- bzw. Negativkontrolle für die Probenbehandlung. Entfernen Sie die Stopfen und bewahren Sie
diese auf.
2. Pipettieren Sie 50 μl Mycobacterium Probenverdünnungspuffer (SDB) in alle Mycobacterium Lyseröhrchen
(LT). Gehen Sie gemäß den folgenden Anweisungen (A oder B für die Kontrollen und C für die Proben)
vor.
A. Kontrollen für die Probenbehandlung
Pipettieren Sie für jede Kontrolle 1 ml der NALC/NaOH Lösung und 3 ml des Phosphatpuffers, die für
die Behandlung des Sputums verwendet wurden, mit 1 ml sterilem Wasser in ein
Probenbehandlungsröhrchen.
I. Vortexen.
II. Überführen Sie 450 μl der NALC/NaOH/Phosphatpuffer Lösung und
50 μl Kontrollverdünnung in die entsprechend beschrifteten
Mycobacterium Lyseröhrchen (LT).
B. Testung der Amplifizierungskontrollen: Überführen Sie 450 μl Amplifizierungskontrolle in die
entsprechend beschrifteten Mycobacterium Lyseröhrchen (LT).
C. Proben: Überführen Sie 450 μl dekontaminierte gut gevortexte Probe in die entsprechend
beschrifteten Mycobacterium Lyseröhrchen (LT).
3. Verschließen Sie die Mycobacterium Lyseröhrchen (LT) nach Zugabe jeder Probe.
4. Vortexen Sie 3 Sekunden.
Lysieren der Proben
1. Die Lyseröhrchen in den Röhrchenständer des Ultraschallbads stellen, so daß das Probenmaterial am
Boden der Röhrchen ins Wasser eintaucht, die Deckel jedoch über dem Wasser sind. DIE RÖHRCHEN
DÜRFEN DEN BODEN ODER DIE WÄNDE DES ULTRASCHALLBADS NICHT BERÜHREN.
26
5/23/2011
9:11 AM
Page 27
2. Die Proben für 15 min beschallen, jedoch nicht länger als 20 min. Die so behandelten Proben und
Kontrollen werden nun als Lysate bezeichnet. LYSATE NICHT VORTEXEN.
Amplifizierung
1. Beschriften Sie die Amplifizierungsröhrchen (Propylenröhrchen, 12 x 75 mm) am oberen Rand
entsprechend der Numerierung der Lyseröhrchen (LT). Markieren Sie auch die Amplifizierungsröhrchen für
die Positiv- und Negativkontrolle Wenn RNA-Kontrollen eingesetzt werden, beschriften Sie die
entsprechenden Amplifizierungsröhrchen als Positiv- bzw. Negativkontrollen. .
3. LYSATE NICHT VORTEXEN. 25 μl Lysat auf den Boden der entsprechenden beschrifteten
Amplifizierungsröhrchen pipettieren. Verwenden Sie für jedes Lysat eine neue lange Pipettenspitze mit
hydrophobem Filter. Übrig gebliebenes Lysat kann für 7 Tage bei 2° - 8°C aufbewahrt oder 1 Monat bei
einer Temperatur < -20°C eingefroren werden. Tiefkühlgeräte mit automatischer Abtauvorrichtung dürfen
nicht verwendet werden. Wenn das Lysat für weitere Tests benötigt wird, sollte es vor Gebrauch auf
Raumtemperatur gebracht werden. LYSATE NICHT VORTEXEN .
4. Die Röhrchen im Heizblock bei 95°C für 15 min inkubieren, jedoch nicht länger als 20 min.
5. Herstellung der Enzymlösung: Lösen Sie das lyophilisierte Enzymreagenz (E) mit 1,5 ml
Enzymverdünnungspuffer (EDB). Leicht mischen. NICHT VORTEXEN. Das aufgelöste Enzymreagenz ist 1
Monat bei 2° - 8°C haltbar oder 2 Monate bei < -20°C, wenn es am Tag der Rekonstitution portioniert und
eingefroren wird. Wenn Sie den Test mit eingefrorenen Enzymaliquots durchführen, sollten diese vor
Gebrauch auf Raumtemperatur gebracht werden; die AliquotsB nicht durch Inkubieren bei hohen
Temperaturen auftauen. Die aufgetauten Aliquots sollten vor der Zugabe in die Amplifizierungsröhrchen mit
einer Repetierpipette durch vorsichtiges Aspirieren und wieder Abgeben homogenisiert werden.
6. Die Röhrchen bei 42° ± 1°C in den Heizblock oder das Wasserbad stellen und 5 min abkühlen lassen. DIE
RÖHRCHEN NICHT AUF RAUMTEMPERATUR ABKÜHLEN LASSEN UND DAS WASSERBAD NICHT
ABDECKEN.
7. Nach Abkühlung der Röhrchen auf 42° ± 1°C geben Sie in jedes Röhrchen mit einer Repetierpipette 25 μl
Enzymreagenz. Die Röhrchen durch leichtes Schütteln mischen. Inkubieren Sie bei 42°C für 30 min,
jedoch nicht länger als 60 min. Für diesen Inkubationsschritt sollten Selbstklebefolien oder Stopfen verwendet werden. DAS WASSERBAD NICHT ABDECKEN.
8. Nach 30-minütiger Inkubation können die abgedeckten Röhrchen bei 2° - 8°C 2 Stunden oder bei -20°C
bis zum nächsten Tag aufbewahrt werden. Nach einer Lagerung bei -20°C müssen die
Amplifizierungsröhrchen vor der Hybridisierung vollständig aufgetaut werden (bei Raumtemperatur oder bei
einer Temperatur von maximal 60°C ). Die Röhrchen sollten in diesem Fall besser nicht mit
Selbstklebefolie sondern mit den Stopfen abgedeckt werden.
Hybridisierung
1. Das lyophilisierte Hybridisierungsreagenz (H) mit 6 ml Hybridisierungspuffer (HB) aufnehmen. Das
Hybridisierungsreagenz (H) und der Hybridisierungspuffer (HB) müssen vor der Rekonstitution auf
Raumtemperatur gebracht werden. Gekühltes Hybridisierungsreagenz (HB) sollte vor Gebrauch unter vorsichtigem Schütteln auf eine Temperatur von 60°C gebracht werden, um zu gewährleisten, daß alle
Bestandteile gelöst sind. Die Lösung solange vortexen, bis sie klar wird (dies kann bis zu 1 Min. dauern).
Die Haltbarkeit des aufgelösten Hybridisierungsreagenzes beträgt 1 Monat bei 2° - 8°C oder 2 Monate bei
< -20°C, wenn es am Tag der Auflösung portioniertC und eingefroren wird. Wenn das aufgelöste
Hybridisierungsreagenz gekühlt oder eingefroren wurde, erwärmen Sie es vor Gebrauch unter vorsichtigem Schütteln auf 60°C, um zu gewährleisten, daß alle Bestandteile gelöst sind.
2. 100 μl aufgelöstes Hybridisierungsreagenz mit einer Repetierpipette in jedes Röhrchen pipettieren. Die
Röhrchen mit Selbstklebefolien oder Stopfen abdecken. Vortexen Sie die Röhrchen anschließend bei mit27
Deutsch
2. Pipettieren Sie 50 μl des aufgelösten Amplifizierungsreagenzes mit einer Repetierpipette auf den Boden
der Amplifizierungsröhrchen. Anschließend mit einer Repetierpipette in jedes Amplifizierungsröhrchen
200 μl Ölreagenz (O) pipettieren.
5/23/2011
9:11 AM
Page 28
tlerer Geschwindigkeit 3 Mal für mindestens 1 SekundeD. Um eine gute Homogenisierung des
Reaktionsmediums zu erreichen, sollten die Röhrchen aufrecht stehen und die Reaktionsmischung
während des Schüttelvorgangs sollte die obere Hälfte der Röhrchen erreichen (um Kontaminationen zu vermeiden, sollte die Reaktionsmischung nicht mit den Selbstklebefolien bzw. Stopfen in Kontakt kommen).
Nach der Homogenisierung sollte die Reaktionsmischung eine einheitlich gelbe Farbe aufweisen.
3. Inkubieren Sie im Heizblock oder Wasserbad bei 60°C für 15 min, jedoch nicht länger als 20 min.
Selektion
1. Das Selektionsreagenz (S) muß vor der Testung auf Raumtemperatur gebracht werden. Die Röhrchen aus
dem 60°C Wasserbad oder dem Heizblock nehmen und mit einer Repetierpipette 300 μl Selektionsreagenz
(S) zugeben. Die Röhrchen mit Selbstklebefolie oder Stopfen abdecken. Vortexen Sie die Röhrchen
anschließend bei mittlerer Geschwindigkeit 3 Mal für mindestens 1 SekundeD. Um eine gute
Homogenisierung des Reaktionsmediums zu erreichen, sollten die Röhrchen aufrecht stehen und die
Reaktionsmischung sollte während des Schüttelvorgangs die obere Hälfte des Röhrchens erreichen (um
Kontaminationen zu vermeiden, sollte die Reaktionsmischung nicht mit den Selbstklebefolien bzw. Stopfen
in Kontakt kommen). Nach der Homogenisierung sollte die Reaktionsmischung eine einheitlich rosa Farbe
aufweisen.
2. Inkubieren Sie im Heizblock oder Wasserbad bei 60°C für 15 min, jedoch nicht länger als 16 min.
3. Die Röhrchen aus dem Wasserbad oder dem Heizblock nehmen. Mindestens 5 min, jedoch nicht länger als
1 Stunde auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Die Selbstklebefolien bzw. Stopfen kurz vor der Detektion
abnehmen.
Detektion
1. Wählen Sie auf dem Luminometer das geeignete Programm mit einer Ablesezeit von 2 Sekunden.
2. Zur Säuberung der Röhrchenaußenwand, sowie zur Vermeidung von elektrostatischen Einflüssen während
der Messung durch das Röhrchenmaterial selbst, sollten diese vor der Messung mit einem feuchten Tuch
bzw. Papier abgewischt werden. Stellen Sie die Röhrchen gemäß den Angaben im Handbuch in das
Luminometer. Die Röhrchen müssen innerhalb einer Stunde nach der Selektion gemessen werden.
3. Nehmen Sie die Röhrchen nach der Messung aus dem Luminometer.
4. Nach dem Ablesen füllen Sie die Röhrchen vorsichtig mit einer 1:10 verdünnten Bleichlösung (1 Teil
Bleiche, 9 Teil Wasser) aus einer Waschflasche Die Bleichlösung mindestens 1 Stunde einwirken lassen,
bevor Sie die Röhrchen verwerfen, um Kontaminationen des Labors mit Amplikons zu vermeiden.
5. Die Röhrchenständer müssen zur Dekontamination mindestens 15 min vollständig in 1:2 verdünnte
Bleichlösung getaucht (1 Teil Bleiche, 1 Teil Wasser) werden. Die Ständer danach mit Wasser abspülen und
abtrocken oder an der Luft trocken lassen.
6. Labor und Material mit einer 1:2 (1 Teil Bleiche, 9 Teil Wasser) verdünnten Bleichlösung dekontaminieren.
Testwiederholung
1. Wenn der Test wiederholt werden muß, sollten die Lysate auf Raumtemperatur gebracht werden. LYSATE
NICHT VORTEXEN!
2. Gehen Sie gemäß den im Abschnitt TESTDURCHFÜHRUNG beschriebenen Schritten vor und beginnen
Sie mit der Amplifizierung.
HINWEISE
A. Reagenzien
1. Das Enzymreagenz darf nach der Auflösung nicht länger als 15 min bei Raumtemperatur stehen
bleiben.
2. Im Hybridisierungspuffer (HB) können sich Präzipitate bilden. Zur Auflösung des Niederschlags, den
Hybridisierungspuffer (HB) oder das aufgelöste Hybridisierungsreagenz auf 60°C erhitzen und schütteln.
28
5/23/2011
9:11 AM
Page 29
B. Temperatur
1. Die Amplifizierung, Hybridisierung und Selektion sind temperaturabhängige Reaktionen; die Temperatur
der verwendeten Heizsysteme (Heizblock oder Wasserbad) muß deshalb präzise im angegebenen
Temperaturbereich gehalten werden.
2. Vor Zugabe des Enzymreagenzes die Röhrchen 5 min abkühlen lassen, so daß sie eine Temperatur
von 42°C erreichen. Die Amplifizierungsreaktion verläuft bei dieser Temperatur optimal.
C. Zeit
Die im Abschnitt „TESTDURCHFÜHRUNG“ angegebenen Zeiten müssen unbedingt eingehalten werden.
D. Wasserbad
1. Ein gleichbleibend hoher Wasserstand ist wichtig, so daß die gesamte Reaktionslösung im Wasser
steht, es muß jedoch darauf geachtet werden, daß kein Wasser von oben in die Röhrchen eindringen
kann.
2. Während der Amplifizierung darf das Wasserbad nicht abgedeckt werden, um Kondensationen auf oder
in den Röhrchen zu vermeiden.
E. Vortexen
Bitte achten Sie unbedingt darauf, daß das Reaktionsgemisch für die Hybridisierung und die Selektion
absolut homogen ist, insbesondere nach Zugabe des aufgelösten Hybridisierungsreagenzes (H) (die
Mischung wird einheitlich gelb) und des Selektionsreagenzes (S) (die Mischung wird einheitlich rosa).
Durch Vortexen erhält man homogene Suspensionen. Wenn Reagenzien in ein Reaktionsröhrchen
gegeben werden und einer externen Kraft ausgesetzt werden, findet eine schnelle Rotation der Lösung um
die Achse des Röhrchens statt. Dadurch entsteht eine homogene Suspension. Um eine korrekte
Homogenisierung auf dem Vortex zu erreichen, müssen die Röhrchen in aufrechter, senkrechter Position
gehalten werden. Das Reaktionsgemisch muß während des Schüttelvorgangs die obere Hälfte der
Röhrchen erreichen. Während des Hybridisierungs- und des Selektionsschrittes wird dieser Mischvorgang
3 Mal in Folge für jeweils mindestens 1 Sekunde durchgeführt.
TESTINTERPRETATION
Die Ergebnisse des GEN-PROBE AMPLIFIED Mycobacterium Tuberculosis Direct Tests (MTD) werden auf
der Basis eines negativen (< 30.000 RLU), eines positiven (> 500.000 RLU) oder eines zweifelhaften
Erstbefundes (30.000 bis 499.999 RLU) interpretiert. Bei zweifelhaften Ergebnissen sollte der MTD Test mit
dem verbliebenen Lysat wiederholt werden. Ist das Ergebnis des wiederholten Tests > 30.000 RLU gilt die
Probe als positiv.
A. Qualitätskontrolle und Validierung der Ergebnisse
Die Kontrollen sollten folgende Werte ergeben:
Amplifizierungs-Negativkontrolle < 20.000 RLU
Amplifizierungs- Positivkontrolle > 500.000 RLU
Negativkontrolle Probenbehandlung < 20.000 RLU
Positivkontrolle Probenbehandlung > 1.000.000 RLU
Wenn die Werte der MTD Kontrollen nicht in den oben genannten Sollbereichen liegen, dürfen die
Ergebnisse der Patientenproben nicht verwendet werden. Weitere Informationen entnehmen Sie bitte dem
Abschnitt FEHLERSUCHE.
Jedes Labor sollte aus den Ergebnissen der einzelnen Kontrollserien seine eigenen Sollwerte für die
Kontrollen festlegen.
29
Deutsch
3. Das Einhalten der Temperatur ist für die Amplifizierungsphase von entscheidender Bedeutung
(42° ± 1°C).
5/23/2011
9:11 AM
Page 30
B. Ergebnisse der Patientenproben
Bei einer Abweichung der Kontrollen von den Sollwerten, können die Ergebnisse der Patientenproben aus
dieser Testserie nicht verwendet werden.
Ergebnisse:
> 500.000 RLU
positiv für M. tuberculosis Komplex rRNA
< 30.000 RLU
negativ für M. tuberculosis Komplex rRNA
30.000 bis 499.999 RLU wahrscheinlich positiv für M. tuberculosis Komplex rRNA, wiederholen Sie den
Test, um die Ergebnisse zu überprüfen.
Testwiederholung: > 30.000 RLU: positiv für M. tuberculosis Komplex rRNA
Testwiederholung < 30.000 RLU: negativ für M. tuberculosis Komplex rRNA
BEFUNDÜBERMITTLUNG
Die Ergebnisse des MTD Tests sollten in Zusammenhang mit anderen verfügbaren Laborergebnissen und
unter Berücksichtigung der Klinik des Patienten interpretiert werden. In Abhängigkeit des Grades des klinischen Verdachtes sollte die Testung einer weiteren Probe in Erwägung gezogen werden.
Wenn das Ergebnis des ersten MTD Tests mit > 500.000 RLU oder der wiederholte MTD Test mit > 30.000
RLU positiv ist, protokollieren Sie das Ergebnis wie folgt:
Befund:
Mycobacterium tuberculosis Komplex rRNA nachgewiesen.
Direktpräparat auf säurefeste Stäbchen (positiv oder
negativ).
Zusatz- information
Das Kulturergebnis liegt noch nicht vor. Die Probe kann
sowohl MOTT und M. tuberculosis oder nur M. tuberculosis
enthalten. Dieser Test sollte nicht die einzige Grundlage für
die Diagnose einer Tuberkulose sein. Der positive
Vorhersagewert (PPV) für einen Kultur-negativen Patienten
ist geringer als der für einen Kultur-positiven Patienten.
Dies ist besonders wichtig für Testpopulationen, in denen
die Tuberkulose-Prävalenz gering und der positive
Vorhersagewert für diagnostische Verfahren entsprechend
reduziert ist.
Wenn das Ergebnis des ersten oder des wiederholten MTD Tests mit < 30.000 RLU negativ ist, protokollieren
Sie das Ergebnis wie folgt:
Befund:
Mycobacterium tuberculosis Komplex rRNA nicht
nachgewiesen. Direktpräparat auf säurefeste Stäbchen
(positiv oder negativ).
Zusatz- information:
Keine Mycobacterium tuberculosis Komplex rRNA
nachgewiesen.
Das Kulturergebnis liegt noch nicht vor. Die Probe enthält
wahrscheinlich keine M. tuberculosis Bakterien. Das
Ergebnis kann aber aufgrund zu geringer M. tuberculosis
Keimzahlen in An- oder Abwesenheit von atypischen
Mykobakterien falsch negativ sein. Ebenso können
Inhibitoren in der Probe zu einem falsch negativen
Ergebnis führen. Bei klinischem Verdacht auf eine aktive
Tuberkulose oder auf Vorliegen von Inhibitoren in der
Probe ist die Testung einer weiteren Patientenprobe
empfehlenswert.
30
5/23/2011
9:11 AM
Page 31
LIMITIERUNGEN
Der Test ist nur für den Nachweis von Spezies des M. tuberculosis Komplex aus Proben bestimmt, die gemäß
der vom Centers for Disease Control (CDC)7 empfohlenen NALC-NaOH oder NaOH Methode behandelt wurden. Dieser Test darf nur mit konzentrierten Sedimenten aus Sputum (induziert oder expektoriert),
Trachealsekreten oder Bronchialmaterial (z.B. Bronchiallavagen, Bronchialaspirationen) verwendet werden.
Die Testergebnisse werden durch Probenentnahme und Transport, Variabilitäten bei der Probenabnahme,
technische Fehler des Labors, Fehler bei der Probenidentifikation und durch Fehler bei der Übermittlung der
Ergebnisse beeinflußt. Ein negatives Ergebnis schließt nicht aus, daß die Probe Keime des M. tuberculosis
Komplex enthält.
NORMALWERTE
A. Kontrollwertebereich in klinischen Studien
Folgender Wertebereich für die Kontrollen (RLU) wurde in klinischen Studien von 7 Laboratorien ermittelt:
B. Wertebereich der klinischen Proben
Die RLU-Werte von 127 MTD-positiven Proben lagen zwischen 35.777 und > 2.000.000 RLU.
Die RLU-Werte von 577 MTD-negativen Proben lagen zwischen 573 und 19.176 RLU.
Folgende Tabelle gibt Aufschluß über die Häufigkeitsverteilung der RLU-Werte für alle untersuchten Proben
nach der Diskrepanzanalyse: Die Diskrepanzanalyse orientiert sich am Vorhandensein anderer kulturpositiver Proben desselben Patienten bzw. an der abschließenden Diagnose des Klinikers.
31
Deutsch
Der MTD-Test erfaßt spezifisch Mykobakterien des M. tuberculosis Komplex, d.h. M. tuberculosis, M. bovis, M.
bovis BCG, M. africanum, M.microti und M.canetti., er ermöglicht jedoch keine Differenzierung innerhalb dieser
Spezies. M. celatum und M. terrae-ähnliche Mykobakterien können in Konzentrationen von mehr als 30 KBE
pro Test zu Kreuzreaktionen führen. M. celatum und M. terrae- ähnliche Mykobakterien werden jedoch selten
aus klinischen Proben isoliert.
5/23/2011
9:11 AM
Page 32
PERFORMANCE
A. Klinische Evaluierung
Die ursprüngliche MTD-Test Version wurde in 6 Studien evaluiert und mit mikroskopischen und kulturellen
Ergebnissen von 6.079 Proben von 2.609 Patienten verglichen. Von diesen stammten 4.000 Proben von
1.898 Patienten, die keiner Tuberkulosetherapie unterworfen waren. Die 6 Studien wurden an geographisch verschiedenen Orten durchgeführt: Bei 5 dieser Orte handelte es sich um große
Krankenhauszentren in amerikanischen Städten mit angeschlossenen Tuberkulosebehandlungszentren, bei
einem handelte es sich um ein staatliches Labor des öffentlichen Gesundheitswesens.
Die Performance des aktuellen MTD-Tests wurde in einer ergänzenden Studie in 7 Laboratorien mit
mykobakteriellen Kulturresultaten verglichen. Die 7 Studienorte lagen in geographisch unterschiedlichen
Regionen. 6 Labors waren in großen städtischen Krankenhauszentren mit
Tuberkulosebehandlungszentren, eines dieser 6 Zentren war zusätzlich nationales Referenzzentrum für
Tuberkulosediagnostik. Der 7. Studienort war ein Labor des öffentlichen Gesundheitswesens. Es wurden
ausschließlich Proben von Patienten ohne Therapie untersucht. Von diesen waren 132 kulturpositiv für den
M. tuberculosis Komplex. Der MTD konnte 119 dieser kulturpositiven Proben nachweisen. Aus 7 Proben
konnten neben M. tuberculosis nicht tuberkulöse Mykobakterien nachgewiesen werden.
32
5/23/2011
9:11 AM
Page 33
Deutsch
Diese Studie enthält Proben von Patienten, bei denen der Verdacht auf eine aktive Lungentuberkulose vorlag und die nicht therapeutisch behandelt wurden. Die gesamte Prävalenz der Patienten mit positiver
Kultur für M. tuberculosis betrug 20,5%.
Die mittlere Sensitivität des MTD-Tests betrug bei jedem Patienten im Vergleich zur Kultur 93,3%, die mittlere
Spezifität 99,1%. Für die Proben wurde eine mittlere Sensitivität von 90,6% und eine mittlere Spezifität von
99,6% im Vergleich zur Kultur ermittelt. In der folgenden Tabelle sind die Sensitivität, die Spezifität, der positive Vorhersagewert (PVW) sowie der negative Vorhersagewert (NVW) mit den Vertrauensbereichen von 95%
für die Performance-Beurteilung aufgeführt. Es handelt sich dabei jeweils um Daten nach Diskrepanzanalyse.
Die Diskrepanzanalyse orientiert sich am Vorhandensein anderer kulturpositiver Proben desselben Patienten
bzw. an der abschließenden Diagnose des Klinikers.
Von den 564 Proben, die in der Kultur und im MTD negativ für M. tuberculosis Komplex waren, enthielten
114 Proben atypische Mykobakterien, die in der Kultur nachgewiesen wurden. 64 stammten von Patienten,
bei denen in anderen Proben atypische Mykobakterien in der Kultur isoliert werden konnten. 169 stammten
von Patienten, bei denen keine Mykobakterien in der Kultur isoliert wurden.
B. Präzision
Präzisionspanels, bestehend aus 2 negativen Proben, 2 schwach positiven Proben (ca. 100 KBE/Test) und
2 mittelmäßig positiven Proben (ca. 1000 KBE/Test) wurden in 3 Laboratorien getestet. Die positiven
Proben wurden mittels eines artifiziellen, schwach hemmenden Sedimentpools durch Zugabe einer
definierten Menge an M. tuberculosis hergestellt. Die Proben sowie die positiven und negativen
Amplifizierungskontrollen wurden in allen 3 Laboratorien über 3 Tage zweimal täglich im Dreifachansatz
bestimmt.
33
5/23/2011
9:11 AM
Page 34
Da keine signifikante, ortsabhängige bzw. tagesabhängige Variation in den Ergebnissen festzustellen war,
wurden die Resultate aller 3 beteiligten Laboratorien in untenstehender Tabelle zusammengefaßt. Die
gemessenen RLU-Werte sind durch die Photomultipliermeßeinheit des Luminometers begrenzt. Deshalb
wurden Werte über 2.000.000 RLU auf den Grenzwert 2.000.000 RLU herabgesetzt.
Standardabweichungen und Variationskoeffizienten sind nicht angegeben.
C. Reproduzierbarkeit
Das Panel für die Bestimmung der Reproduzierbarkeit bestand aus 25 Proben, wobei zwischen jede Probe
eine negative Amplifizierungskontrolle gesetzt wurde, so daß ingesamt 50 Tests durchgeführt wurden.
Dieses Panel wurde in 4 verschiedenen Laboratorien getestet.
Insgesamt entsprachen 100 % (120/120) der negativen Proben und 98,8 % (79/80) der positiven Proben
den erwarteten Ergebnissen.
D. Analytische Spezifität
Die Spezifität des MTD-Tests wurde mit Bakterien, Pilzen und Viren überprüft. Für die Spezifitätstestung
mittels Bakterien und Pilzen wurden 160 Stämme (151 Arten aus 62 Gattungen) von nah verwandten
Mykobakterien, anderen Erregern von Erkrankungen des Respirationstraktes und der normalen
Respirationsflora, sowie von phylogenetisch repräsentativen Organismen verwendet. Typstämme wurden
von der ATCC bezogen. 5 Isolate stammten von klinischen Laboratorien. Lysate aus aktiv wachsenden
Kulturen (bzw. in 3 Fällen: rRNA) wurden gemäß der Arbeitsanleitung mit dem MTD-Test evaluiert.
Annähernd 5 x 107 KBE pro Reaktion wurden eingesetzt. Nur Stämme des M. tuberculosis Komplex lieferten positive Resultate, mit Ausnahme der M. celatum und M. terrae-ähnliche Stämme.
Bei Konzentrationen über 30 KBE pro Test kommt es bei M. celatum und einigen M. terrae-ähnlichen
Stämmen zu positiven Ergebnissen (26.772 RLU für M. celatum und 19.470 bis 49.976 RLU für M. terraeähnliche Mykobakterien).
E. Nachweisgrenze
30 M. tuberculosis Stämme aus geographisch sehr unterschiedlichen Gebieten, darunter sowohl resistente
als auch sensitive Stämme, wurden mit dem MTD-Test nachgewiesen. Die Nachweisgrenze lag für alle 30
untersuchten Stämme bei 1 KBE/Test.
F. Wiederfindung
25 fg rRNA von Mycobacterium tuberculosis (entspricht 5 KBE pro Test) wurden in Gegenwart von annähernd 540.000 KBE pro Test (450 μl) relevanter, Organismen, die nicht zu den Zielspezies gehörten,
getestet: Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas
aeruginosa, Mycobacterium gordonae, M. avium, M. kansasii, M. terrae, Nocardia asteroides, N. otitidiscaviarum, Corynebacterium pseudotuberculosis, C. diphtheriae, Gordona sputi und Rhodococcus
bronchialis. Alle Testergebnisse waren in Gegenwart dieser nicht spezifischen Organismen, die nicht zu
den Zielspezies gehörten positiv für M. tuberculosis rRNA und zeigten somit keine Interferenzen.
34
5/23/2011
9:11 AM
Page 35
EMPFEHLUNGEN
Erhöhte AmplifizierungsNegativkontrolle oder
Negativkontrolle
Probenbehandlung
(> 20.000 RLU)
z Ungenügendes Mischen
nach Zugabe des
Selektionsreagenzes (S) oder
zu geringes Volumen des
Selektionsreagenzes.
Mischvorgang korrekt wiederholen. Die angegebenen
Volumina beachten. Nach dem
Vortexen muß eine einheitliche
rosa Färbung sichtbar werden.
z Mangelnde Sorgfalt bei der
Abarbeitung der Reaktionen
und bei der Vermeidung von
Kontaminationen.
Das Pipettieren muß mit
größter Sorgfalt ausgeübt werden. Die verwendeten
Röhrchen müssen mit einer
1:10 verdünnten Bleichlösung
dekontaminiert werden, siehe
Abschnitt
„TESTDURCHFÜHRUNG“. Die
Arbeitsflächen, Heizblöcke,
Wasserbäder und Pipetten
müssen wie im Abschnitt
„TESTDURCHFÜHRUNG“
beschrieben mit einer 1:2
verdünnten Bleichlösung
dekontaminiert werden.
Die Röhrchen müssen vor der
Messung im Luminometer mit
einem feuchten Tuch oder
holzfreiem Papier abgewischt
werden.
Wasserbad und/oder HeizblockTemperatur überprüfen und einstellen.
z 5-minütige Abkühlungszeit
nicht eingehalten.
z Kontamination von
Laboroberflächen oder
Reagenzien.
z Die Röhrchen wurden vor
der Messung nicht abgewischt.
Erniedrigte AmplifizierungsPositivkontrolle oder
Positivkontrolle Probenbehandlung
(< 500.000 RLU)
z Die Amplifizierungsreaktion
wurde nicht im geforderten
Temperaturbereich durchgeführt.
z Das Amplifizierungsreagenz
wurde an die Röhrchenwand
und nicht auf den Boden pipettiert
z Ungenügendes Mischen
nach Zugabe des aufgelösten
Hybridisierungsreagenzes.
z Es wurde zuviel
Selektionsreagenz zugegeben.
z Die Inkubationszeit des
Selektionsschrittes war zu lang.
z Abkühlung der
Amplifizierungsröhrchen auf
42°C nach der Inkubation bei
95°C.
z Die Pumpenschläuche der
Detektionsreagenzien am Gerät
sind verstopft.
35
Das Reagenz auf dem Vortex
sorgfältig mischen (siehe
Abschnitt Hybridisierung, Punkt
2). Das Reagenz sollte nach
dem Mischen eine homogene
Gelbfärbung zeigen.
Einstellung der
Pipettenvolumina überprüfen.
Die 15-minütige Inkubationszeit
bei 60°C bei der Selektion einhalten.
Die Reaktionsröhrchen müssen
direkt und ohne Verzögerung
vom 95°C Heizblock in den
42°C Heizblock bzw. das
Wasserbad überführt werden.
Das Pumpsystem mit heißem
Wasser durchspülen (siehe
Handbuch).
Deutsch
FEHLERSUCHE- UND BESEITIGUNG
FEHLER
MÖGLICHE URSACHE
5/23/2011
9:11 AM
Page 36
HINWEISE
A Die Heizblöcke müssen für 12 x 75 mm Röhrchen geeignet sein. Es wird daher empfohlen, die
GEN-PROBE Heizblocksysteme zu verwenden.
B Zur Lagerung der tiefgefrorenen Aliquots empfiehlt es sich, Mikrozentrifugenröhrchen mit
Schraubverschluß zu verwenden. Tiefgefrorene Aliquots dürfen nur einmal aufgetaut werden. Verwenden
Sie kein Tiefkühlgerät mit automatischer Abtauvorrichtung.
C Zur Lagerung der tiefgefrorenen Aliquots empfiehlt es sich, Kryoröhrchen für 5 ml zu verwenden.
Tiefgefrorene Aliquots dürfen nur einmal aufgetaut werden. Verwenden Sie kein Tiefkühlgerät mit automatischer Abtauvorrichtung.
D Wegen der unterschiedlichen Ausführung der einzelnen Vortex-Geräte müssen die Mischzeiten gegebenenfalls angepaßt werden. Stellen Sie die Geschwindigkeit des Gerätes gemäß den Hinweisen im §
„TESTDURCHFÜHRUNG“ Abschnitt E“ so ein, daß das Reaktionsgemisch die obere Hälfte der Röhrchen
erreicht. Um präzise Ergebnisse zu erhalten, ist eine einwandfreie Homogenisierung unbedingt erforderlich. Die Mischzeiten können bis zu 15 sec verlängert werden, ohne daß die Ergebnisse dadurch beeinflußt werden.
36
5/23/2011
9:11 AM
Page 37
TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES MYCOBACTERIES DU
COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Coffret de 50 tests
(bioMérieux réf. 39006/Gen-Probe Cat. No. 301001/1001F)
Les échantillons donnant des résultats positifs doivent être mis en culture pour déterminer la présence
éventuelle de mycobactéries autres que celles du complexe M. tuberculosis ou mycobactéries atypiques. Des
tests de sensibilité aux agents anti-mycobactériens doivent également être effectués. Des cultures pour la
recherche de bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR) doivent être réalisées afin de préciser quelle sousespèce du complexe M. tuberculosis (M. bovis, par exemple) est présente.
Au cours des essais cliniques, des prélèvements réalisés sur des enfants, des patients VIH-positifs et des
patients infectés par des mycobactéries atypiques ont été soumis au test. Toutefois, le nombre de ces essais
n’a pas permis de comparer statistiquement les performances du test pour ces différents groupes.
Les performances du test sur des prélèvements provenant de patients sous traitement anti-tuberculeux, dans
le but de réaliser un suivi thérapeutique ou de confirmer une guérison, n’ont pas été évaluées.
Les échantillons à forte concentration sanguine ne doivent pas être testés avec le coffret MTD.
PRÉCAUTIONS D’UTILISATION
A. A usage diagnostic in vitro seulement.
B. Le test MTD est spécifique des mycobactéries du complexe M. tuberculosis, à savoir M. tuberculosis, M.
bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, et M.canetti, mais ne différencie pas ces espèces entre
elles. M. celatum et M. terrae-like peuvent provoquer des réactions croisées s’ils sont présents à des concentrations supérieures à 30 UFC (Unités Formant Colonie) par test. Toutefois M. celatum et M. terrae-like
sont rarement isolées en clinique.
C. Un résultat négatif n’exclut pas la présence d’une mycobactérie du complexe M. tuberculosis dans l’échantillon. La qualité des résultats est liée à la qualité du prélèvement et de son transport, à la variabilité de la
prise d’échantillons, aux erreurs techniques du laboratoire, aux erreurs d’identification des échantillons et
37
Français
UTILISATION
Le test AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS (MTD) est un test utilisant une sonde d’acide nucléique dirigée contre une cible
amplifiée permettant la détection in vitro des acides nucléiques des mycobactéries du complexe
Mycobacterium tuberculosis. Ce test est réalisé à partir d’échantillons provenant de crachats (induits ou
expectorés), de prélèvements bronchiques (lavages broncho-alvéolaires ou aspirations bronchiques) ou
d’aspirations trachéales.
AVERTISSEMENT
L’efficacité de ce test n’a pas encore été démontrée pour la détection directe d’ARNr de M. tuberculosis à partir d’autres échantillons cliniques (sanguins, urinaires ou coprologiques par exemple). Les performances du
test MTD n’ont été étudiées que pour des échantillons traités selon la technique décrite et conservés pour des
durées et aux températures spécifiées dans la présente notice.
5/23/2011
9:11 AM
Page 38
aux erreurs de transcription des résultats.
D. Le test est réservé à la détection des mycobactéries du complexe M. tuberculosis, à partir d’échantillons
préparés selon les méthodes NALC-NaOH ou NaOH qui sont recommandées par les Centers for Disease
Control (CDC)7. Ce test doit être utilisé uniquement pour des échantillons concentrés préparés à partir de
crachats (induits ou expectorés), d’aspirations trachéales ou de prélèvements bronchiques (lavages broncho-alvéolaires ou aspirations bronchiques). Lors de la remise en suspension de l’échantillon dans la solution de tampon phosphate, vérifier que la concentration de phosphate soit de 67 mM7.
E. Eviter tout contact des Réactifs de Détection I et II (bioMérieux réf. 39300 / Gen-Probe Cat. No. 201791/
1791) avec la peau, les yeux et les muqueuses. En cas de contact, rincer à l’eau. Si ces réactifs sont renversés, les diluer avec de l’eau avant d’essuyer.
F. Prendre les précautions habituelles lors de la réalisation de ce test4. La préparation des échantillons
digérés et décontaminés ainsi que les étapes du test MTD doivent être réalisées en respectant les règles
de sécurité microbiologique de niveau 2 5.
G. N’utiliser que le matériel fourni ou du matériel de laboratoire à usage unique.
H. Les paillasses, les pipettes et le matériel doivent être décontaminés avec une solution d’eau de Javel
diluée au 1 / 2 (moitié eau de Javel, moitié eau), comme décrit dans le paragraphe « MODE OPERATOIRE ». Laisser l’eau de Javel en contact pendant 15 minutes, puis rincer à l’eau et essuyer pour éliminer les traces d’eau de Javel.
I. Des pipettes à déplacement positif ou des pipettes à déplacement d’air équipées de pointes munies d’un
filtre doivent être utilisées pour réaliser ce test. Lors du transfert du lysat des tubes de lyse aux tubes
d’amplification, des pointes extra-longues doivent être utilisées. Changer de pointe entre chaque étape.
Eviter de passer au-dessus des autres tubes du portoir. Les pointes usagées doivent être immédiatement
jetées dans un récipient destiné aux déchets biologiques.
J. Lors de l’utilisation d’une pipette répétitive pour la distribution des réactifs, après l’introduction du lysat
dans les tubes, éviter de toucher le tube avec la pointe de la pipette afin de réduire les risques de contamination entre tubes. Les réactifs doivent être distribués contre la paroi du tube afin d’éviter les projections.
Le soin apporté à la distribution des réactifs permettra de réduire les risques de contamination croisée.
K. Ne pas utiliser les mêmes pipettes pour les étapes précédant l’amplification et les étapes suivant l’amplification.
L. Après la lecture des résultats à l’aide du luminomètre, décontaminer les tubes et les jeter comme décrit
dans les paragraphes « MODE OPERATOIRE » et « REMARQUES » afin d’éviter la contamination du
laboratoire par les amplicons.
M. Ne JAMAIS réutiliser les feuilles autocollantes et les bouchons utilisés au cours d’une précédente étape.
Les bouchons doivent être jetés dans un récipient approprié immédiatement après leur retrait pour éviter
toute contamination croisée. Les feuilles autocollantes doivent être fermement appliquées sur le haut des
tubes réactionnels.
N. Ne pas couvrir le bain-marie pendant les incubations, particulièrement si des bouchons sont utilisés (la
condensation sur le couvercle peut être une source de contamination).
O. Une bonne homogénéisation à l’aide d’un Vortex est nécessaire après l’addition du Réactif de Sélection
pour obtenir des résultats précis.
P. Il est recommandé de sélectionner un endroit pour l’étape HPA (Hybridization Protection Assay) pour minimiser la contamination par les amplicons. Cet endroit doit être différent de celui des préparations des
échantillons et des réactifs et de l’étape d’amplification.
Q. Pour prévenir les contaminations par amplicons au laboratoire, les emplacements doivent être organisés
pour un travail à sens uni-directionnel. Par example, procéder à la préparation des échantillons et des
réactifs puis à l’étape d’amplification et ensuite passer à l’étape HPA. Les échantillons, le matériel et les
réactifs ne doivent pas retourner dans les endroits ou a eu lieu l’étape précédente. De même le personnel
38
5/23/2011
9:11 AM
Page 39
ne doit pas retourner dans les aires de travail sans des précautions d’anticontamination. Il est fortement
recommandé que la hotte utilisée pour la préparation des échantillons ne soit pas utiliser pour réaliser le
test MTD.
INTRODUCTION
Le test MTD utilise les méthodes TMA (Transcription-Mediated Amplification) et HPA (Hybridization Protection
Assay)2 pour détecter qualitativement l’ARN ribosomal (ARNr) des mycobactéries du complexe M. tuberculosis. Le test MTD détecte l’ARN des organismes cultivables et non cultivables. Le complexe M. tuberculosis
comprend les sous-espèces M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, et M. canetti(12, 13). Le test MTD détecte tous les microorganismes du complexe M. tuberculosis. Toutefois, M. microti n’infecte que les animaux, M. bovis est rarement transmis des animaux infectés aux humains. M. africanum,
quant à lui, est responsable de tuberculose pulmonaire en Afrique tropicale12. M. tuberculosis est de loin le
membre le plus commun, responsable d’une morbidité importante dans le monde entier. Le CDC a récemment fait état d’une augmentation des cas de tuberculose chez les patients atteints de SIDA et les immigrés,
et d’une augmentation de la transmission de la maladie au sein des populations à haut risque6,9. On observe
également l’augmentation du nombre de souches résistantes, voire multi-résistantes aux anti-tuberculeux11.
Les conséquences sont considérables dans le domaine de la santé publique.
Les séquences de l’amplicon d’ARNr, spécifiques des mycobactéries du complexe M. tuberculosis, sont
ensuite détectées grâce à la méthode d’hybridation d’acides nucléiques Gen-Probe HPA2. Le Réactif
d’Hybridation du test MTD contient une sonde ADN monocaténaire conjuguée à un marqueur chimiluminescent. Cette sonde est complémentaire des séquences d’ARN spécifiques des mycobactéries du complexe M.
tuberculosis. La sonde forme avec ces séquences spécifiques des hybrides stables ARN:ADN. Après l’étape
de sélection, le signal lumineux émis par les sondes hybridées est mesuré à l’aide du luminomètre GENPROBE LEADER.
(Coffret de 50 tests)
RÉACTIFS
Les réactifs pour le test MTD sont fournis comme suit :
Nom du réactif
Volume
PRESENTOIR DES REACTIFS POUR AMPLIFICATION
Tampon de Dilution des Echantillons (SDB) .................................................................................. 1 x 2,5 ml
Solution tampon Tris contenant < 3 % de détergent
Réactif d’Amplification (A).................................................................................................................. 1 x 3 ml
Acides nucléiques lyophilisés dans une solution tampon
Tris contenant 5 % d’agent liant ..............................................................................(après reconstitution)
Tampon d’amplification (AB) .............................................................................................................. 1 x 3 ml
Solution aqueuse contenant des conservateurs
39
Français
Les méthodes de culture conventionnelles permettent d’observer la croissance de M. tuberculosis dans un
délai de 1 à 8 semaines7,10. Le test MTD, quant à lui, permet la détection de l’ARNr des mycobactéries du
complexe M. tuberculosis en 2,5 à 3,5 heures. Bien qu’il ne permette pas de réaliser d’antibiogramme, le test
MTD détecte M. tuberculosis de manière fiable et rapide. Ceci permet d’utiliser au mieux les services d’isolement des hôpitaux, de débuter rapidement un traitement approprié et de prévenir la propagation de la maladie
grâce à l’identification précoce et l’isolement des individus contaminés3.
PRINCIPE
Le test MTD est un test en deux phases (l’amplification et la détection) qui sont réalisées dans un même tube.
Tout d’abord, la sonication provoque la libération des acides nucléiques des mycobactéries. La chaleur est
utilisée pour dénaturer ces acides nucléiques et rompre la structure secondaire de l’ARNr. La méthode d’amplification Gen-Probe TMA amplifie ensuite une cible spécifique d’ARNr mycobactérien via un intermédiaire
d’ADN, à une température constante de 42°C. De multiples copies de l’ARNr mycobactérien (amplicons) sont
ainsi produites.
5/23/2011
9:11 AM
Page 40
Réactif d’amplification huileux (huile pour réaction d’amplification) (O) .......................................... 1 x 10 ml
Huile silicone
Réactif Enzymatique (E) ................................................................................................................ 1 x 1,5 ml
Transcriptase inverse et ARN polymérase lyophilisées dans une solution
tampon HEPES contenant < 10 % d’agent liant et > 15 mM de N-Acétyl-L-Cystéine
(après reconstitution)
Tampon de Dilution Enzymatique (tampon de dilution des enzymes) (EDB) ..................................1 x 1,5 ml
Solution tampon Tris contenant un surfactant et du glycérol
PRESENTOIR DES REACTIFS POUR HYBRIDATION
Réactif d’Hybridation (H) ....................................................................................................................1 x 6 ml
< 100 ng/flacon de sonde ADN non infectieuse conjuguée à un marqueur
chimiluminescent, lyophilisée, dans une solution tampon succinate contenant
un agent liant et un détergent
(après reconstitution)
Tampon d’Hybridation (HB) ................................................................................................................1 x 6 ml
Solution tampon succinate contenant < 4 % de détergent
Réactif de Sélection (S) ....................................................................................................................1 x 15 ml
Solution tampon borate contenant un surfactant
Tubes de Lyse (LT) ......................................................................................................................2 x 25 tubes
Billes de verre, agent liant
CONSERVATION
Les solutions ou les composants non reconstitués suivants doivent être conservés à 2° - 8°C C et sont utilisables jusqu’à la date de péremption indiquée :
Tampon de Dilution des Echantillons (SDB)
Réactif d’Amplification (A)
Tampon d’Amplification (AB)
Réactif Enzymatique (E)
Tampon de Dilution Enzymatique (EDB)
Réactif d’Hybridation (H)
Le Réactif d’Amplification reconstitué (A) est utilisable pendant 2 mois s’il est conservé à 2° - 8°C. Le Réactif
d’Hybridation (H) et le Réactif Enzymatique (E) sont utilisables un mois à 2° - 8°C après reconstitution, ou
deux mois à une température égale ou inférieure à -20°C s’ils sont aliquotés et congelés le jour de leur reconstitution. Les fractions aliquotes congelées doivent être utilisées le jour où elles sont décongelées. Ne pas
utiliser de congélateur à dégivrage automatique.
Les composants suivants doivent être conservés entre 2° et 25°C et sont utilisables jusqu’à la date de
péremption indiquée :
Réactif d’amplification huileux (O)
Tampon d’Hybridation (HB)
Réactif de Sélection (S)
Tubes de Lyse (LT)
40
5/23/2011
9:11 AM
Page 41
PRELEVEMENT, CONSERVATION, TRANSPORT ET TRAITEMENT DES ECHANTILLONS
Prélèvement et conservation de l’échantillon:
Les échantillons doivent être placés dans des récipients en plastique stériles et conservés à 2° - 8°C avant
leur transport et leur traitement. Au cours des essais cliniques, les échantillons ont été stockés moins de 4
jours (généralement moins de 24 heures) avant leur traitement.
Transport :
Transporter les échantillons au laboratoire le plus rapidement possible conformément aux réglementations en
vigueur.
Traitement (décontamination et concentration) :
Les échantillons à forte concentration sanguine ne doivent pas être soumis au test MTD. Ce test est conçu
pour détecter l’ARNr des mycobactéries du complexe M. tuberculosis en utilisant des échantillons préparés
selon les méthodes de décontamination NALC-NaOH ou NaOH utilisant 1 % à 1,5 % de NaOH pendant 15 à
20 minutes et une centrifugation à une vitesse supérieure ou égale à 3 000 g 7.
Composition du coffret
(bioMérieux réf. 39006 / Gen-Probe Cat. No. 301001/1001F)
50 tests
PRESENTOIR DES REACTIFS POUR AMPLIFICATION
Tampon de Dilution des Echantillons (SDB)
1 x 2,5 ml
Réactif d’Amplification (A)
1 x 3 ml (après reconstitution)
Tampon de Reconstitution (AB)
1 x 3 ml
Réactif huileux (huile pour réaction d’amplification) (O)
1 x 10 ml
Réactif Enzymatique (E)
1 x 1,5 ml (après reconstitution)
Tampon de Dilution Enzymatique (EDB)
1 x 1,5 ml
PRESENTOIR DES REACTIFS POUR HYBRIDATION
Réactif d’Hybridation (H)
1 x 6 ml (après reconstitution)
Tampon d’Hybridation (HB)
1 x 6 ml
Réactif de Sélection (S)
1 x 15 ml
Tubes de Lyse (LT)
2 x 25 tubes
Cartes de protection (feuilles autocollantes)
1 paquet
B. Matériel nécessaire non fourni :
Micropipettes capables de distribuer 25 μl, 50μl, 100μl, 200μl, 300μl et 450μl
Vortex
Eau stérile (filtrée ou autoclavée)
Tubes de culture
Billes de verre stériles de 3 mm
Tubes pour microcentrifugeuse avec bouchons à vis
Portoir pour tubes réactionnels
41
Français
Stockage des échantillons traités :
Les échantillons peuvent être stockés au maximum 3 jours à 2° - 8°C avant le test. Ils peuvent également être
stockés entre -20° et -70° C pendant 6 mois au plus. Ne pas utiliser de congélateur à dégivrage automatique.
MATERIEL
A. Matériel fourni
5/23/2011
9:11 AM
Page 42
Pointes de pipette munies d’un filtre (1 000 μl)
Témoins Positifs d’Amplification (par ex. M. tuberculosis, ATCC 25177 ou ATCC 27294)
Témoins Négatifs d’Amplification (par ex. M. gordonae, ATCC 14470 ou M. terrae, ATCC 15755)
Eau de Javel (solution d’hypochlorite à 5,25 %)
Feuilles de protection de paillasse plastifiées
Pipettes répétitives
C. Matériel supplémentaire disponible chez votre distributeur Gen-Probe:
Sonicateur GEN-PROBE (bioMérieux réf. 39409 / Gen-Probe Cat. No. 901104/T460)
Blocs chauffants GEN-PROBE (42°C ± 1°C, 60°C ± 1°C, 95°C ± 5°C)A (bioMérieux réf. 39405, 39406,
39407 / Gen-Probe Cat. No. 3396, 3397, 3398)
Luminomètre GEN-PROBE LEADER 50i (bioMérieux réf. 39400 / Gen-Probe Cat. No. 103100i/3100i)
Contrôles d'Amplification GEN-PROBE MTD (bioMérieux réf.39223 / Gen-Probe Cat.No. 301043F/1043F)
Coffret de Réactifs de Détection GEN-PROBE (bioMérieux réf. 39300 / Gen-Probe Cat. No. 201791/1791)
Portoir de tubes pour le sonicateur GEN-PROBE (bioMérieux réf. 39313 / Gen-Probe Cat. No. 104027/
4027)
Portoir de tubes réactionnels (bioMérieux réf. 39311 / Gen-Probe Cat. No. 3994)
Pointes de pipette longues munies d’un filtre (1250 μl) (bioMérieux réf. 39315 / Gen-Probe Cat. No. 104316/
4316)
Tubes en polypropylène, 12 x 75 mm (bioMérieux réf. 39308 / Gen-Probe Cat. No. 102440/2440)
Bouchons en polypropylène pour tubes de 12 x 75 mm (bioMérieux réf. 39320 / Gen-Probe Cat. No. 400713)
MODE OPERATOIRE
Contrôles
Les souches utilisées comme Contrôle Positif d' Amplification doivent faire parties du complexe M. tuberculosis, par exemple comme souche non virulente H37Ra (ATCC 25177) ou comme souche virulente H37Rv
(ATCC 27294). Les souches utilisées comme Contrôle Négatif doivent être des souches de mycobactéries
non tuberculeuses (MOTT) par exemple M. gordonae (ATCC14470) ou M. terrae (ATCC 15755). Les témoins
doivent être préparés avant de tester les échantillons.
Les contrôles cellulaires doivent contenir de 25 à 150 CFU par 50 μl pour atteindre une concentration finale
de 1 à 10 CFU par test. Cette concentration peut être vérifiée par culture cellulaire. Ces contrôles cellulaires
seront utilisés dans la préparation des Contrôles d‘Amplification (voir Préparation des Echantillons).
1. Préparation recommandée des Contrôles Cellulaires :
a. Mettre 3 à 5 billes de verre stériles de 3 mm dans un tube de culture propre.
b. Ajouter 1-2 ml d’eau stérile. Ajouter le contenu de plusieurs öses de1 μl de la culture appropriée.
Fermer le tube et l’agiter au vortex plusieurs fois à grande vitesse.
c. Laisser reposer la suspension pendant 15 minutes.
d. Transférer le surnageant dans un tube de culture propre. Ajuster la turbidité à 1 McFarland à l’aide d’un
néphélémètre.
e. Faire une dilution au 1/100 en mettant 100 μl de la suspension à 1 McFarland dans 10 ml d’eau stérile.
Fermer et agiter à l’aide d’un Vortex. Ceci est la Dilution 1.
f. Faire une seconde dilution au 1/100 de la suspension en mettant 100 μl de la Dilution 1 dans 10 ml
d’eau stérile. Fermer et agiter à l’aide d’un Vortex. Ceci est la Dilution 2. Cette dilution doit contenir
42
5/23/2011
9:11 AM
Page 43
approximativement 25 à 150 CFU pour 50 μl.
Aliquotage et conservation des Contrôles Cellulaires :
a. Les dilutions doivent être reparties en fractions aliquotées (500 μl) à usage unique dans des tubes
microfuges propres de 1.5 ml avec bouchons à vis conservés à – 20°C pendant 6 mois ou à –70°C
pendant un an. Ne pas utiliser de congélateur à dégivrage automatique.
Le test avec le contrôle cellulaire positif recommandé de M. tuberculosis ne mettra en évidence seulement que les défaillances importantes des réactifs. Le contrôle positif est destiné à suivre les réactions
des réactifs durant la préparation pour des interférences provenant d’un excès de NaOH ou de tampon
phosphate. Le contrôle cellulaire recommandé ne détecte pas les variations de procédures concernant
les temps ou les températures qui pourraient affecter l’efficacité de l’amplification ou l’adéquation du
temps de la sélection. Des contrôles additionnels peuvent être testés conformément aux réglementations en vigueur ou guides de bonnes exécutions des analyses.
2. Contrôle d’inhibition des échantillons
Lorsque le test MTD est négatif mais que le diagnostic du médecin est en faveur d’une tuberculose, il est
possible de vérifier si l’échantillon contient un inhibiteur en utilisant la procédure suivante :
b. Introduire 50 μl de Témoin Positif d’Amplification et 450 μl d’échantillon dans un tube (surchargé).
Ajouter 450 μl d’échantillon dans le second tube (non surchargé). Réaliser le test selon le protocole
habituel.
Interprétation
Si le nombre de RLU (Relative Light Units) obtenu sur le luminomètre avec le tube surchargé est
> 30.000 RLU, l’échantillon ne contient pas d’inhibiteur de l’amplification et l’échantillon ne contient
apparemment pas de cible à amplifier. Si le nombre de RLU obtenu avec le tube surchargé est
< 30.000 RLU, l’échantillon contient un inhibiteur de l’amplification et un autre échantillon doit être testé.
Si le test répété du tube non surchargé est positif, le résultat du test MTD peut être rendu positif.
L’explication la plus plausible pour ce type de résultat est la variabilité liée à l’échantillonnage : la première
prise d’essai ne contenait pas de cible à amplifier, alors que la seconde en contenait. Le nombre de RLU
du tube non surchargé peut être positif ou négatif selon que la prise d’essai contient ou ne contient pas
d’ARNr de mycobactérie appartenant au complexe M. tuberculosis.
3. Contrôle de la contamination du laboratoire
Pour tester la contamination du laboratoire par les amplicons de M. tuberculosis, procéder comme suit :
a. Mettre 1 ml d’eau stérile dans un tube propre. Humidifier un écouvillon stérile en polyester ou en
dacron avec de l’eau stérile.
b. Frotter l’écouvillon sur la paillasse ou le matériel à tester.
c. Placer l’écouvillon dans le tube et mélanger doucement. Retirer l’écouvillon en l’essorant contre la paroi
du tube. Jeter l’écouvillon dans un récipient contenant une solution d’eau de Javel diluée au 1 / 2
(moitié eau de Javel, moitié eau).
d. Distribuer 25 μl de la solution ainsi obtenue dans un tube d’amplification contenant 50 μl de Réactif
d’Amplification et 200 μl d’huile pour réaction d’amplification.
e. Suivre les instructions du paragraphe « MODE OPERATOIRE » pour l’amplification et la détection.
Interprétation
Si les résultats sont > 30.000 RLU, la surface testée est contaminée et doit être décontaminée par un
traitement à l’eau de Javel suivant les instructions du paragraphe « MODE OPERATOIRE : Préparation
du matériel». Si l’on suspecte une contamination du bain-marie, procéder de la même façon que ci-dessus
43
Français
a. Placer 50 μl de Tampon de Dilution des échantillons dans 2 tubes de lyse (LT) des mycobactéries (surchargé et non surchargé).
5/23/2011
9:11 AM
Page 44
avec 25 μl de l’eau du bain-marie à condition que celle-ci ne contienne aucun produit antiseptique.
Préparation du matériel
1. a. Remplir le réservoir du sonicateur d’eau du robinet à température ambiante jusqu’à environ 1cm du
bord.
b. L’eau du bain à ultrasons doit être dégazée avant chaque essai, afin d’optimiser le transfert d’énergie
des ultrasons. Pour dégazer l’eau complètement, faire fonctionner le sonicateur pendant 15 minutes.
2. Régler un bloc chauffant à 95° ± 5°C, un bloc chauffant ou un bain-marie à 60° ± 1°C et un bloc chauffant
ou un bain-marie à 42° ± 1°C.
3. Nettoyer surfaces de travail, matériel et pipettes avec une dilution 1:2 d’eau de Javel avant de commencer
l’analyse. L’eau de Javel doit rester en contact pendant au moins 15 minutes. Rincer à l’eau la surface de
travail pour éliminer les traces d’eau de Javel. Couvrir la surface sur laquelle le test sera réalisé avec une
feuille de protection de paillasse plastifiée.
4. Préparer le luminomètre GEN-PROBE LEADER. S’assurer qu’il y ait une quantité suffisante de Réactifs de
Détection I et II pour réaliser les tests et s’assurer que les tubulures soient amorcées. Consulter le manuel
d’utilisation du luminomètre pour les instructions de chargement des Réactifs de Détection (ces réactifs
sont vendus séparément).
Préparation du réactif
Reconstituer le Réactif d’Amplification lyophilisé (A) dans son flacon (50 tests) avec 3 ml de Tampon
d’Amplification (AB). Homogénéiser à l’aide d’un Vortex. Laisser le réactif reconstitué reposer à température
ambiante jusqu’à ce qu’il devienne clair. Le Réactif d’Amplification reconstitué peut être conservé 2 mois à 2° 8°C. La solution doit être remise à température ambiante avant utilisation.
Préparation des échantillons
1. Identifier un nombre suffisant de Tubes de Lyse de Mycobactéries (LT) pour tester les échantillons et chacun des Contrôles Cellulaires d’Amplification positif et négatif ou des Témoins d’Amplification positifs et
négatifs. Retirer et conserver les bouchons.
2. Distribuer 50 μl du Tampon de Dilution des Echantillons (SDB) dans tous les tubes de lyse (LT). Suivre les
paragraphes ci-dessous A et B pour les contrôles et C pour les échantillons.
A. Témoins d’Amplification des Echantillons :
Pour chaque contrôle, ajouter 1 ml de solution CLNA/NaOH et 3 ml de tampon phosphate utilisé pour préparer les crachats avec 1 ml d’eau stérile dans le tube échantillon.
i. Agiter pour mélanger
ii. Transférer 450 μl de solution tampon phosphate CLNA/NaOH et 50 μl de la dilution du Contrôle
Cellulaire dans le Tube de Lyse identifié (LT).
B. Si on utilise les Contrôles Cellulaires d' Amplification, transférer 450 μl du flacon de Contrôle Cellulaire
d' Amplification au Tube de Lyse (LT) correspondant.
C. Echantillons : Transférer 450 μl d’échantillon, bien agité au vortex et décontaminé, de son flacon dans
le Tube de Lyse (LT) identifié correspondant.
3. Reboucher les Tubes de Lyse aprés addition de chaque échantillon.
4. Agiter sous Vortex pendant 3 secondes.
44
5/23/2011
9:11 AM
Page 45
Lyse des échantillons
1. Insérer les Tubes de Lyse dans le portoir du sonicateur de façon à ce que le mélange réactionnel au fond
des tubes soit immergé, tout en maintenant les bouchons hors de l’eau. Mettre le portoir en place. LES
TUBES NE DOIVENT EN AUCUN CAS ETRE EN CONTACT AVEC LE FOND OU LES PAROIS DU SONICATEUR.
2. Faire fonctionner le sonicateur pendant 15 minutes, mais pas plus de 20 minutes. Les échantillons et
témoins ainsi traités aux ultrasons sont des « lysats ». NE PAS UTILISER LE VORTEX POUR AGITER
LES LYSATS.
Amplification
1. En écrivant sur le haut des tubes, identifier les tubes polypropylène pour amplification (12 x 75 mm) avec
les numéros correspondant aux numéros d’identification des Tubes de Lyse (LT). Identifier également des
tubes d’amplification pour les témoins d’amplification positif et négatif. Si on utilise des contrôles ARN,
identifier des tubes d’amplification pour les contrôles Négatifs et Positifs.
3. NE PAS UTILISER LE VORTEX POUR LES LYSATS. Transférer 25 μl de chaque lysat dans le fond du
tube d’amplification correspondant en utilisant une nouvelle pointe munie d’un filtre pour chaque transfert .
Les lysats restants peuvent être conservés à 2° - 8°C pendant 7 jours, ou congelés à une température
égale ou inférieure à -20°C pendant 1 mois. Ne pas utiliser de congélateur à dégivrage automatique. Si
d’autres tests doivent être effectués sur les lysats, les laisser préalablement revenir à température
ambiante. NE PAS UTILISER LE VORTEX POUR LES LYSATS.
4. Incuber les tubes dans un bloc chauffant à 95°C pendant 15 minutes, mais pas plus de 20 minutes.
5. Préparer la Solution Enzymatique en ajoutant 1,5 ml de Tampon de Dilution Enzymatique (EDB) au Réactif
Enzymatique lyophilisé (E). Faire tournoyer pour mélanger. Ne pas agiter à l’aide d’un Vortex. Le Réactif
Enzymatique reconstitué est utilisable pendant un mois à 2° - 8°C ou pendant deux mois à une température égale ou inférieure à -20°C s’il est aliquoté et congeléB le jour de sa reconstitution. Si le test est effectué avec des fractions aliquotes d’enzymes congelées, les ramener préalablement à température
ambiante; ne pas décongeler les fractions aliquotes en les incubant à haute température. Pour
homogénéiser les fractions aliquotes décongelées, aspirer et rejeter doucement la solution en utilisant une
pipette répétitive avant de l’ajouter aux tubes d’amplification.
6. Transférer les tubes dans le bloc chauffant ou le bain-marie à 42° ± 1°C et les laisser refroidir pendant 5
minutes. NE PAS LAISSER LES TUBES ATTEINDRE LA TEMPERATURE AMBIANTE. NE PAS COUVRIR LE BAIN-MARIE.
7. Lorsque les tubes sont à 42°C, ajouter 25 μl de Réactif Enzymatique dans chaque tube en utilisant une
pipette répétitive. Secouer pour mélanger. Incuber à 42°C pendant 30 minutes, mais pas plus de 60 minutes. Il faut utiliser des feuilles autocollantes ou des bouchons pendant cette étape d’incubation. NE PAS
COUVRIR LE BAIN-MARIE.
8. Après la période d’incubation de 30 minutes, les tubes couverts peuvent être conservés à 2 - 8°C pendant
2 heures ou à -20°C jusqu’au lendemain. S’ils sont stockés à -20°C jusqu’au lendemain, les tubes doivent
être totalement décongelés à température ambiante ou au maximum à 60°C avant l’étape d’hybridation, et
doivent être fermés avec des bouchons plutôt qu’avec des feuilles autocollantes.
Hybridation
1. Reconstituer le Réactif d’Hybridation lyophilisé (H) avec 6 ml de Tampon d’Hybridation (HB). Le Réactif
d’Hybridation (H) et le Tampon d’Hybridation (HB) doivent être à température ambiante avant la reconstitution. Si le Tampon d’Hybridation (HB) a été réfrigéré, le réchauffer à 60°C en le faisant tournoyer doucement pour s’assurer que tous les composants sont solubilisés. Agiter à l’aide d’un Vortex jusqu’à ce que la
solution devienne claire (cela peut prendre jusqu’à une minute) pour s’assurer que tous les composants
45
Français
2. Introduire 50 μl de Réactif d’Amplification reconstitué au fond de chaque tube en utilisant une pipette
répétitive. Ajouter 200 μl d’huile pour réaction d’amplification (O) dans chaque tube en utilisant une pipette
répétitive.
5/23/2011
9:11 AM
Page 46
sont solubilisés. Le Réactif d’Hybridation reconstitué est utilisable pendant un mois à 2° - 8°C ou pendant
deux mois à une température égale ou inférieure à -20°C s’il est aliquoté et congeléC le jour de sa reconstitution. Si le Réactif d’Hybridation reconstitué a été réfrigéré ou congelé, le réchauffer à 60°C en le
faisant tournoyer doucement pour s’assurer que tous les composants sont solubilisés.
2. Ajouter 100 μl de Réactif d’Hybridation reconstitué dans chaque tube à l’aide d’une pipette répétitive.
Couvrir les tubes avec des feuilles autocollantes ou des bouchons. Agiter les tubes à l’aide d’un Vortex à
vitesse moyenne 3 fois pendant au moins 1 secondeD. Pour une bonne homogénéisation des tubes réactionnels, les maintenir en position verticale et laisser le mélange atteindre la moitié supérieure de la paroi
du tube pendant l’agitation (pour éviter toute contamination ne pas laisser le mélange réactionnel entrer en
contact avec les feuilles autocollantes ou les bouchons). Lorsque l’homogénéisation a été correctement
effectuée, le mélange doit alors avoir une couleur jaune uniforme.
3. Incuber à 60°C pendant 15 minutes, mais pas plus de 20 minutes, dans un bloc chauffant ou un bainmarie.
Sélection
1. Le Réactif de Sélection (S) doit être à température ambiante avant de commencer le test. Retirer les tubes
du bain-marie ou du bloc chauffant à 60°C et ajouter 300 μl de Réactif de Sélection (S) à l’aide d’une
pipette répétitive. Couvrir les tubes avec des feuilles autocollantes ou des bouchons. Agiter à l’aide d’un
Vortex, à vitesse moyenne, 3 fois pendant au moins 1 secondeD. Pour une bonne homogénéisation des
tubes réactionnels, les maintenir en position verticale et laisser le mélange atteindre la moitié supérieure
de la paroi du tube pendant l’agitation (pour éviter toute contamination ne pas laisser le mélange réactionnel entrer en contact avec les feuilles autocollantes ou les bouchons). Lorsque l’homogénéisation a été
correctement effectuée, le mélange doit alors avoir une couleur rose uniforme.
2. Incuber à 60°C pendant 15 minutes, mais pas plus de 16 minutes, dans un bloc chauffant ou un bainmarie.
3. Retirer les tubes du bain-marie ou du bloc chauffant. Laisser les tubes revenir à température ambiante
pendant au moins 5 minutes, mais pas plus d’une heure. Retirer les feuilles autocollantes ou les bouchons
juste avant la phase de détection.
Détection
1. Programmer le protocole approprié sur le luminomètre. Choisir une lecture à 2 secondes.
2. Pour éliminer tout résidu de la surface des tubes, les essuyer à l’aide de papier absorbant ne peluchant
pas humide, puis les introduire dans le luminomètre en suivant les instructions du manuel d’utilisation. Les
tubes doivent être lus moins d’une heure après l’étape de sélection.
3. Une fois l’analyse terminée, retirer les tubes du luminomètre.
4. Après la lecture des tubes, les remplir avec précaution d’une solution d’eau de Javel diluée au 1 / 10 (un
volume d’eau de Javel, 9 volumes d’eau), à l’aide d’une pissette. Laisser l’eau de Javel en contact pendant
au moins une heure avant de jeter les tubes pour éviter la contamination du laboratoire par les amplicons.
5. Les portoirs de tubes doivent être décontaminés par immersion complète dans une solution d’eau de Javel
diluée au 1 / 2 pendant au moins 15 minutes. Ils doivent ensuite être rincés à l’eau et essuyés, ou séchés
à l’air.
6. Décontaminer le laboratoire et le matériel à l’aide d’une solution d’eau de Javel diluée au 1 / 2.
Répétition du test
1. Si le test doit être répété, laisser revenir les lysats préparés à température ambiante. NE PAS UTILISER
LE VORTEX POUR LES LYSATS.
2. Suivre ensuite le mode opératoire, en commençant par l’étape d’amplification.
46
5/23/2011
9:11 AM
Page 47
REMARQUES
A. Réactifs
1. Le Réactif Enzymatique ne doit pas rester à température ambiante plus de 15 minutes après avoir été
reconstitué.
2. Le Tampon d’hybridation (HB) peut précipiter. Chauffer et agiter le Tampon d’Hybridation (HB) ou le
Réactif d’Hybridation reconstitué à 60°C pour dissoudre le précipité.
B. Température
1. L’amplification, l’hybridation et la sélection sont des réactions thermo-dépendantes ; par conséquent il
est impératif de maintenir le bain-marie ou le bloc chauffant aux températures préconisées.
2. Avant l’addition du Réactif Enzymatique, laisser refroidir les tubes pendant 5 minutes afin qu’ils
atteignent 42°C. Cette température permet d’obtenir des performances d’amplification optimales.
3. Le respect de la température est fondamental pour la phase d’amplification (42° ± 1°C).
C. Temps
1. Le niveau de l’eau dans le bain-marie doit être maintenu de manière à ce que le mélange réactionnel
au fond des tubes soit immergé, mais à ce que l’eau ne pénètre pas dans les tubes.
2. Durant la phase d’amplification, le bain-marie ne doit pas être couvert afin d’éviter que la condensation
ne tombe sur, ou dans les tubes.
E. Agitation à l’aide d’un Vortex
Il est important de disposer d’un mélange homogène lors des étapes d’hybridation et de sélection, particulièrement après l’addition du Réactif d’Hybridation (H) reconstitué (le mélange prend une couleur jaune
uniforme) et du Réactif de Sélection (S) (le mélange prend une couleur rose uniforme).
L’agitation à l’aide d’un Vortex permet d’obtenir une suspension uniforme. Quand les réactifs sont placés
dans un tube réactionnel et qu’ils sont exposés à une source d’énergie extérieure, il se produit une rotation
rapide de la solution autour de l’axe du tube. Il en résulte une suspension uniforme. Pour que l’homogénéisation soit correctement effectuée à l’aide d’un Vortex, les tubes doivent être tenus verticalement par le
haut du tube. Le liquide doit alors atteindre la moitié supérieure du tube au cours de l’agitation. Au cours
des étapes d’hybridation et de sélection, cette agitation est réalisée 3 fois de suite et doit durer au moins 1
seconde chaque fois.
INTERPRETATION DU TEST
Les résultats des échantillons testés par le coffret GEN-PROBE AMPLIFIED Mycobacterium Tuberculosis
Direct (MTD) sont interprétés sur la base d’un résultat initial négatif (< 30.000 RLU), d’un résultat initial positif
(> 500.000 RLU) ou d’un résultat initial équivoque (de 30.000 à 499.999 RLU). Le test MTD doit être répété à
partir du lysat conservé lorsque le résultat initial est équivoque. Un résultat répété du lysat > 30.000 est considéré comme positif.
A. Contrôle de qualité et acceptation des résultats
Les contrôles doivent satisfaire aux valeurs suivantes :
Contrôle Cellulaire Négatif d’Amplification : < 20.000 RLU
Contrôle Cellulaire Positif d’Amplification : > 500.000 RLU
Témoin Négatif d’Amplification : < 20.000 RLU
Témoin Positif d’Amplification : > 1.000.000 RLU
Les résultats des tests patient ne doivent pas être reportés si les contrôles ne répondent pas aux critères
47
Français
Il est impératif de respecter les temps indiqués dans le paragraphe « MODE OPERATOIRE ».
D. Bain-marie
5/23/2011
9:11 AM
Page 48
ci-dessus. Se reporter au chapitre « RESOLUTION D’INCIDENTS » pour plus d’informations.
Les valeurs cibles pour les contrôles doivent être déterminées pour chaque laboratoire en fonction des
résultats de chaque série de contrôles préparés.
B. Résultats des tests pour les échantillons cliniques :
Si les contrôles ne correspondent pas aux valeurs escomptées, les résultats des échantillons cliniques ne
sont pas valides et ne peuvent être rendus.
Résultats :
> 500.000 RLU : positif pour l’ARNr des mycobactéries du complexe M. tuberculosis
< 30.000 RLU : négatif pour l’ARNr des mycobactéries du complexe M. tuberculosis
de 30.000 à 499.999 RLU : positif probable pour l’ARNr des mycobactéries du complexe
M.tuberculosis ; test à répéter pour vérification :
test répété > 30.000 RLU : positif pour l’ARNr des mycobactérie du complexe M.tuberculosis.
test répété < 30.000 RLU : : négatif pour l’ARNr des mycobactérie du complexe M.tuberculosis.
PRESENTATION DES RESULTATS
Les résultats des tests MTD doivent être interprétés avec l’ensemble des données cliniques et autres tests du
laboratoire disponibles pour le clinicien .On peut considérer de tester d’autres échantillons en fonction du
degré d’appréciation de l’état clinique.
Si le résultat initial est positif avec une RLU > 500.000 ou que le test MTD répété est > 30.000 RLU, alors
présenter les résultats de la manière suivante :
Interprétation :
ARNr de mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis détecté. Résultat microscopique (positif ou négatif).
Informations complémentaires: Culture pour la recherche de BAAR en cours. L’échantillon
peut contenir à la fois des mycobactéries non tuberculeuses
et M. tuberculosis, ou M. tuberculosis seul. Ce test ne doit
pas être la seule base du diagnostic de tuberculose. La
valeur prédictive pour un patient avec un examen microscopique négatif est inférieure à celle d’un patient avec un
examen microscopique positif. Ceci est particulièrement
important dans les populations testés où la prévalence de la
tuberculose est faible et que les valeurs prédictives positives
des méthodes de diagnostic sont réduites de façon correspondante
Si le résultat initial ou le test répété MTD est négatif (< 30.000 RLU), alors présenter les résultats de la
manière suivante :
Interprétation :
ARNr de mycobactérie du complexe M.tuberculosis non
détecté
Résultat microscopique (positif ou négatif).
Information complémentaires : ARNr de mycobactérie du complexe M.tuberculosis non
détecté. Culture pour la recherche des BAAR en attente.
L’échantillon ne contient apparemment pas de mycobactéries
du complexe M.tuberculosis, mais le résultat peut être
faussement négatif du à la présence d’inhibiteurs dans
l’échantillon. La recherche sur un autre échantillon est
recommandée si une tuberculose active est cliniquement
suspectée ou si la présence d’inhibiteurs est envisagée.
48
5/23/2011
9:11 AM
Page 49
LIMITES
Ce test n’est destiné qu’à la détection des mycobactéries du complexe M. tuberculosis à partir d’échantillons
préparés selon les procédures NALC-NaOH ou NaOH recommandées par le CDC7. Ce test ne peut être utilisé qu’avec des échantillons préparés à partir de crachats (induits ou expectorés), de prélèvements
bronchiques (lavages broncho-alvéolaires ou aspirations bronchiques) ou d’aspirations trachéales.
Le test MTD est spécifique des mycobactéries du complexe M. tuberculosis, à savoir M. tuberculosis, M.
bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti et M. cannetti, mais ne différencie pas ces espèces entre elles.
M. celatum et M. terrae-like peuvent provoquer des réactions croisées s’ils sont présents à des concentrations
supérieures à 30 UFC par test. Toutefois, M. celatum et M. terrae-like sont rarement isolées en clinique.
La qualité des résultats du test est liée à la qualité du prélèvement et de son transport, à la variabilité de la
prise d’échantillons, aux erreurs techniques du laboratoire, aux erreurs d’identification des échantillons et aux
erreurs de transcription des résultats. Un test négatif n’exclut pas la présence d’une mycobactérie du complexe M. tuberculosis dans l’échantillon.
VALEURS ATTENDUES
A. Eventail des valeurs de contrôle relevées au cours des essais cliniques
B. Eventail des valeurs obtenues pour les échantillons cliniques
Pour les 127 échantillons MTD-positifs, les valeurs étaient comprises entre 35.777 et > 2.000.000 RLU.
Pour les 577 échantillons MTD-négatifs, les valeurs étaient comprises entre 573 et 19.176 RLU.
L’occurrence des résultats en RLU pour tous ces échantillons, après résolution des discordances, figure cidessous : la résolution des discordances est basée sur l’analyse d’autres échantillons, positifs en culture,
provenant d’un même patient et/ou sur le diagnostic final du médecin traitant.
49
Français
L’évantail des valeurs obtenues pour les contrôles (RLU) lors d’essais cliniques réalisés sur 7 sites a été :
5/23/2011
9:11 AM
Page 50
PERFORMANCES
A. Evaluation clinique
Les performances du test MTD dans sa forme originale ont été évaluées au cours d’essais cliniques réalisés dans six laboratoires en comparant les résultats obtenus par examen de frottis aux résultats de la culture, sur 6.079 échantillons provenant de 2.609 patients. Parmi ceux-ci, 4.000 échantillons provenaient de
1.898 patients ne recevant pas de traitement anti-tuberculeux. Les six sites représentaient des zones géographiques différentes : cinq centres hospitaliers de grandes villes américaines, possédant un service spécialisé pour la tuberculose, et un laboratoire public.
Les performances du test MTD dans sa forme actuelle ont été évaluées sur sept sites, en comparant les
résultats du test MTD aux résultats de la culture. Les sept centres participant au test représentaient des
zones géographiques différentes : six centres hospitaliers de grandes villes américaines, possédant un
service spécialisé pour la tuberculose, et un laboratoire public national de mycobactériologie. Les échantillons testés provenaient de patients ne recevant pas de traitement anti-tuberculeux. 132 ont donné des
résultats positifs en culture pour les mycobactéries du complexe M. tuberculosis. MTD a détecté 119 de
ces échantillons culture-positifs ; 7 échantillons contenaient des mycobactéries non tuberculeuses en plus
de M. tuberculosis.
50
5/23/2011
9:11 AM
Page 51
Sur les 564 échantillons négatifs en culture et MTD-négatifs pour les mycobactéries du complexe M. tuberculosis, 114 échantillons contenaient des mycobactéries atypiques, mises en évidence par culture, 64
provenaient de patients dont d’autres échantillons ont permis d’isoler des mycobactéries atypiques par culture et 169 provenaient de patients dont aucune mycobactérie n’a été isolée en culture.
B. Précision
Des panels d’échantillons, consistant en 2 échantillons négatifs, 2 échantillons faiblement positifs
(ª 100 UFC/ test) et 2 échantillons modérément positifs (ª 1000 UFC/ test) ont été testés sur trois sites. Les
échantillons positifs on été préparés en ajoutant des quantités connues de M. tuberculosis à un pool
d’échantillons modérément inhibiteurs. Les échantillons ainsi que des témoins d’amplification positif et
négatif ont été testés en triple deux fois par jour, pendant 3 jours sur les trois sites.
51
Français
Les patients suspectés d’être atteints d’une tuberculose pulmonaire active et n’étant pas sous traitement ont
été inclus dans cette étude. La prévalence totale des patients ayant eu une culture positive pour M. tuberculosis était de 20,5%.
Par patient, une sensibilité moyenne de 93,3 % et une spécificité moyenne de 99,1 % ont été déterminées,
par rapport à la culture. Par échantillon, une sensibilité moyenne de 90,6 % et une spécificité moyenne de
99,6 % ont été déterminées, par rapport à la culture. Le tableau ci-dessous donne la sensibilité, la spécificité,
la valeur prédictive positive (VPP) et la valeur prédictive négative (VPN), avec des intervalles de confiance de
95 %, pour les estimations de performances. Toutes les données affichées sont présentées après résolution
des discordances basée sur l’analyse d’autres échantillons, positifs en culture, provenant du même patient
et/ou sur le diagnostic final du médecin traitant.
5/23/2011
9:11 AM
Page 52
La variabilité des résultats n’étant pas significative d’un site à l’autre ou d’un jour à l’autre, les résultats des
trois sites ont pu être consolidés et sont présentés ci-dessous. Les valeurs de lecture mesurées en RLU
sont limitées par la résolution du tube photomultiplicateur du luminomètre. Pour cette raison, les valeurs
supérieures à 2.000.000 RLU sont ramenées à 2.000.000 RLU. Ni les écarts-types, ni les coefficients de
variation ne sont indiqués.
C. Reproductibilité
L’étude de reproductibilité a été effectuée en testant 25 échantillons, des témoins d’amplification négatifs
étant intercalés entre chaque échantillon, pour former un total de 50 échantillons. Le panel de reproductibilité a été testé sur quatre sites.
Au total, 100 % (120/120) des échantillons négatifs et 98,8 % (79/80) des échantillons positifs ont donné
les résultats attendus.
D. Spécificité analytique
La spécificité du test MTD a été évaluée à l’aide de bactéries, de champignons et de virus. Dans le cas
des bactéries et des champignons, les tests de spécificité ont porté sur 160 souches (151 espèces
provenant de 62 genres) de mycobactéries très proches de M. tuberculosis, d’autres microorganismes
responsables de maladies respiratoires, et d’un panel phylogénétique de microorganismes de la flore commensale de l’appareil respiratoire. Les souches types étaient des cultures ATCC (American Type Culture
Collection), et 5 souches avaient été fournies par des laboratoires d’analyses. Les lysats, préparés à partir
de cultures en phase active de croissance (ou d’ARNr, dans trois cas) ont été analysés selon le protocole
du test MTD, à environ 5 x 107 UFC par test. Seules les souches du complexe M. tuberculosis ont donné
des résultats positifs, à l’exception de souches de M. celatum et M. terrae-like.
A des concentrations supérieures à 30 UFC par test, les souches de M. celatum et certaines souches M.
terrae-like ont donné des résultats positifs (26.772 RLU pour M. celatum et de 19.470 à 49.976 RLU pour
M. terrae-like).
E. Limite de détection
Trente souches de M. tuberculosis provenant de régions géographiques très variées, y compris des
représentants de souches résistantes et de souches sensibles aux antibiotiques, ont été détectées par le
test MTD. Le test MTD a pu détecter jusqu’à 1 UFC par test de chacune des 30 souches.
F. Test de surcharge
De l’ARNr de Mycobacterium tuberculosis à une concentration de 25 fg (équivalant à 5 UFC par test) ont
été testés en présence d’environ 540.000 UFC par test (450 μl) des organismes non cibles suivants :
Corynebacterium pseudotuberculosis, C. diphtheriae, Gordona sputi et Rhodococcus bronchialis. Tous les
résultats ont été positifs pour l’ARNr de M. tuberculosis en présence de ces organismes non-cibles, qui
n’ont donc pas créé d’interférence.
52
5/23/2011
RESOLUTION D’INCIDENTS
OBSERVATION
Valeurs élevées pour les Contrôles
Cellulaires Négatifs d'
Amplification ou les Contrôles
Négatifs d’Amplification.
(> 20.000 RLU)
9:11 AM
Page 53
CAUSES POSSIBLES
z Homogénéisation insuffisante après ajout du Réactif de
Sélection (S) ou trop faible volume de Réactif de Sélection.
z Amplification de contaminants introduits par manque de
précaution au cours de la préparation des réactions.
z Omission de l’étape de
refroidissement de 5 minutes.
z Contamination du laboratoire
ou des réactifs.
Valeurs faibles pour les Contrôles
Cellulaires Positifs d' Amplification
ou les Contrôles Positifs
d’Amplification
(< 500.000 RLU)
z Non respect des températures préconisées lors de l’étape d’amplification.
z Ajout du Réactif
d’Amplification en versant le liquide sur les parois du tube et
non directement au fond du
tube.
z Homogénéisation insuffisante après ajout du Réactif
d’Hybridation reconstitué.
z Volume de Réactif de
Sélection trop important.
z Non respect du temps préconisé pour l’étape de sélection.
z La température des tubes
est descendue en dessous de
42°C après l’incubation à 95°C.
z Les tubulures amenant le
Réactif de Détection sont
bouchés.
53
Un grand soin doit être apporté à la
distribution des réactifs à l’aide des
pipettes. Les tubes usagés doivent
être décontaminés avec une solution
d’eau de Javel diluée au 1 / 10,
comme indiqué dans le paragraphe
« MODE OPERATOIRE ». Les paillasses, blocs chauffants, bains-marie
et pipettes doivent être décontaminés avec une solution d’eau de
Javel diluée au 1 / 2 comme indiqué
dans le paragraphe « MODE OPERATOIRE ».
Les tubes doivent être essuyés avec
du papier absorbant ne peluchant
pas humide avant lecture à l’aide du
luminomètre.
Vérifier la température du bain-marie
et/ou du bloc chauffant et l’ajuster si
nécessaire pour respecter les températures préconisées.
Agiter soigneusement à l’aide du
Vortex, comme spécifié (voir le paragraphe « Hybridation / 2 »). Vérifier
la formation d’une solution de
couleur jaune uniforme après agitation.
Vérifier le réglage de volume sur la
pipette.
Respecter les 15 minutes d’incubation à 60°C, au cours de l’étape de
Sélection.
Transférer directement les tubes du
bloc chauffant à 95°C au bain-marie
/ bloc chauffant à 42°C.
Rincer les tubulures à l’eau chaude
comme indiqué dans le manuel d’utilisation de l’instrument.
Français
z Omission de l’essuyage des
tubes avant lecture à l’aide du
luminomètre.
RECOMMANDATIONS
Ré-homogénéiser correctement.
Veiller à respecter les volumes
indiqués. Vérifier l’apparition d’une
solution de couleur rose uniforme
après l’agitation.
5/23/2011
9:11 AM
Page 54
NOTES
A Les blocs chauffants doivent avoir des puits prévus pour les tubes 12 x 75 mm. L’utilisation des blocs
chauffants GEN-PROBE est recommandée.
B Il est recommandé d’utiliser des tubes microfuges munis d’un bouchon à vis pour conserver les fractions
aliquotes congelées. Les fractions aliquotées ne peuvent être congelées et décongelées qu’une seule fois.
NE PAS utiliser de congélateurs à dégivrage automatique.
C Pour le stockage des fractions aliquotes congelées, il est recommandé d’utiliser des flacons pour réfrigération de 5 ml. Les fractions aliquotes congelées ne peuvent être décongelées qu’une seule fois. Ne pas
utiliser de congélateur à dégivrage automatique.
D Les performances des VORTEX pouvant différer selon le matériel utilisé , il peut être nécessaire d’adapter
le temps d’agitation. Régler la vitesse de l’appareil et suivre les instructions du « MODE OPÉRATOIRE,
paragraphe E », pour permettre au mélange réactionnel d’atteindre la moitié supérieure de la paroi du
tube. Une bonne homogénéisation est indispensable à l’obtention de résultats précis. Les temps d’agitation
peuvent être portés à 15 secondes sans affecter les résultats.
54
5/23/2011
9:11 AM
Page 55
TEST AMPLIFIED PARA LA DETECCION DIRECTA DEL COMPLEJO
Equipo de 50 tests
Las muestras que den resultados positivos deben ser cultivadas para determinar la eventual presencia de
otras micobacterias, además de las del complejo M. tuberculosis o de micobacterias atípicas. También deben
realizarse tests de sensibilidad frente a los agentes anti-micobacterianos. Deben realizarse cultivos para
detectar bacilos ácido-alcohol-resistentes (BAAR) con el fin de precisar qué subespecie del complejo M.
tuberculosis (M. bovis, por ejemplo) se encuentra presente.
Durante los ensayos clínicos, se han analizado muestras realizadas en niños, en pacientes HIV-positivos y en
pacientes contagiados con micobacterias atípicas. Sin embargo, el número de ensayos no ha permitido comparar estadísticamente los rendimientos del test en estos diferentes grupos.
No han sido evaluados los resultados del test en muestras procedentes de pacientes bajo tratamiento antituberculoso, con el fin de realizar un seguimiento terapéutico o de confirmar una mejoría.
Las muestras con elevada concentración sanguínea no deben ser analizadas con el equipo MTD.
PRECAUCIONES DE UTILIZACION
A. Utilización reservada para el diagnóstico in vitro.
B. El test MTD está destinado específicamente a las micobacterias del complejo M. tuberculosis, es decir, M.
tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, y M. canetti, pero no diferencia estas
especies entre sí. M. celatum y M. pseudo-terrae pueden provocar reacciones cruzadas si se encuentran
presentes en concentraciones superiores a 30 UFC (Unidades Formadoras de Colonias) por test. Sin
embargo, M. celatum y M. pseudo-terrae son rara vez aislados en clínica.
C. Un resultado negativo no excluye la presencia de una micobacteria del complejo M. tuberculosis en la
muestra. La calidad de los resultados depende de la calidad de la muestra y de su transporte, de la
variabilidad de la toma de muestras, de los errores técnicos del laboratorio, de los errores de identificación
de las muestras y de los errores en la transcripción de los resultados.
55
Español
UTILIZACION
El test AMPLIFIED PARA LA DETECCION DIRECTA DEL COMPLEJO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
(MTD) es un test que utiliza una sonda de ácido nucleico dirigida contra una diana amplificada, que permite la
detección in vitro de los ácidos nucleicos de las micobacterias del complejo Mycobacterium tuberculosis. Este
test es realizado a partir de muestras procedentes de esputos (inducidos o expectorados), de muestras bronquiales (lavados bronco-alveolares o aspirados bronquiales) o de aspiraciones traqueales.
ADVERTENCIAS
La eficacia de este test no ha sido aún demostrada para la detección directa del RNAr de M. tuberculosis a
partir de otras muestras clínicas (sanguíneas, urinarias o coprológicas, por ejemplo). Los rendimientos del test
MTD han sido estudiados exclusivamente en muestras tratadas según la técnica descrita, y conservadas
durante el tiempo y a las temperaturas especificadas en la presente ficha técnica.
5/23/2011
9:11 AM
Page 56
D. El test se encuentra destinado sólo a la detección de las micobacterias del complejo M. tuberculosis a partir de muestras preparadas según los métodos NALC-NaOH o NaOH, recomendados por los Centros para
el Control de Enfermedades (CDC)7. Este test debe ser utilizado sólo en muestras concentradas
preparadas a partir de esputos (inducidos o expectorados), de aspirados traqueales o de muestras bronquiales (lavados bronco-alveolares o aspiraciones bronquiales). Durante la puesta en suspensión de la
muestra en la solución de tampón fosfato, verificar que la concentración de fosfato sea de 67 mM7.
E. Evitar cualquier contacto de los Reactivos de Detección I y II (bioMérieux ref. 39300 / Gen-Probe Cat. No.
201791/1791) con la piel, los ojos y las mucosas. En caso de contacto, enjuagar con agua. Si estos reactivos se derraman, diluirlos con agua antes de secarlos.
F. Adoptar las precauciones habituales durante la realizatión de este test4. La preparación de las muestras
digeridas y descontaminadas, así como las etapas del test MTD, deben ser realizadas respetando las
reglas de seguridad microbiológica de nivel 2 5.
G. Utilizar sólo el material suministrado o material de laboratorio de un solo uso.
H. Las superficiies de trabajo, las pipetas y el material deben ser descontaminados con una solución de lejía
diluida al 1/2 (mitad de lejía, mitad de agua), como se describe en el párrafo
« TECNICA ». Dejar la lejía en contacto durante 15 minutos y después enjuagar con agua y secar para
eliminar los restos de lejía.
I. Para realizar este test deben utilizarse pipetas con desplazamiento positivo o pipetas con desplazamiento
de aire equipadas de puntas provistas de filtro. Durante la transferencia del lisado desde los tubos de lisis
a los tubos de amplificación, deben utilizarse puntas extra largas. Cambiar de punta entre una etapa y
otra. Evitar pasar por encima de otros tubos de la gradilla. Las puntas ya utilizadas deben ser desechadas
de inmediato en un recipiente destinado a los desechos biológicos.
J. Al utilizar una pipeta de repetición para la distribución de los reactivos, después de introducir el lisado en
los tubos, evitar tocar el tubo con la punta de la pipeta con el fin de reducir los riesgos de contaminación
entre los tubos. Los reactivos deben ser distribuidos contra la pared del tubo con el fin de evitar salpicaduras. Ser cuidadoso en la distribución de los reactivos reduce los riesgos de contaminación cruzada.
K. No volver a utilizar las mismas pipetas en las etapas anteriores a la amplificación y en las etapas que
siguen a la amplificación.
L. Después de la lectura de los resultados utilizando un luminómetro, descontaminar los tubos y desecharlos
como se ha descrito en los párrafos « TECNICA » y « OBSERVACIONES » con el fin de evitar la contaminación del laboratorio por los amplicones.
M. JAMAS volver a utilizar las hojas autoadhesivas y los tapones utilizados durante la etapa precedente. Los
tapones deben ser desechados en un recipiente apropiado, inmediatamente después de haberlos retirado,
para evitar cualquier contaminación cruzada. Las hojas autoadhesivas deben ser firmemente aplicadas en
la parte alta de los tubos de reactivos.
N. No cubrir el baño maría durante la incubación, en particular si se utilizan tapones (la condensación en la
tapa puede ser una fuente de contaminación).
O. Una buena homogeneización con un Vortex es necesaria después de añadir el Reactivo de Selección con
el fin de obtener resultados precisos.
P. Se recomienda elegir un lugar para la fase HPA (Hybridization Protection Assay ) con vistas a mini-mizar
la contaminación por amplicons. Este lugar debe ser diferente de aquél donde se realicen las preparaciones de las muestras, los reactivos y la etapa de amplificación.
Q. Para prevenir las contaminaciones por amplicons en el laboratorio, el proceso deberá organizarse mediante un flujo de trabajo unidireccional. Por ejemplo, proceder a la preparación de las muestras y los reactivos, después la fase de amplificación para, finalmente, realizar la etapa HPA. Las muestras, el equipo y
los reactivos nunca de-berían retornar al área donde se han llevado a cabo los procesos anteriores. El
personal no deberá volver a dichas áreas de trabajo sin haber tomado precauciones anticontaminación.
Se recomienda firmemente que la cabina de bioseguridad empleada para el procesamiento de muestras
no se reutilice para los ensayos MTD.
56
5/23/2011
9:11 AM
Page 57
INTRODUCCION
El test MTD utiliza los métodos TMA (Transcription-Mediated Amplification) y HPA (Hybridization Protection
Ensayo)2 para detectar cualitativamente el RNA ribosómico (RNAr) de las micobacterias del complejo M.
tuberculosis. El test MTD detecta el RNA de los organismos cultivables y no cultivables. El complejo M. tuberculosis incluye las subespecies M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, y M. canetti
(12, 13). El test MTD detecta todos los microorganismos del complejo M. tuberculosis. Sin embargo, M.
microti infecta solamente a los animales, M. bovis se transmite rara vez desde los animales infectados al
hombre, mientras que M. africanum, es responsable de la tuberculosis pulmonar en Africa Tropical12. M.
tuberculosis es con mucho el miembro más común, responsable de importante morbilidad en el mundo
entero. El CDC ha dado a conocer recientemente un aumento de los casos de tuberculosis en los pacientes
afectados de SIDA y en los inmigrantes, y un aumento de la transmisión de la enfermedad en la población de
alto riesgo6,9. Se observa además el aumento del número de cepas resistentes e incluso multirresistentes a
los agentes antituberculosos11. Las consecuencias son considerables en el ámbito de la salud pública.
Las secuencias del amplicon del RNAr, específicas a las micobacterias del complejo M. tuberculosis, son a
continuación detectadas gracias al método de hibridación de ácidos nucleicos Gen-Probe HPA2. El Reactivo
de Hibridación del test MTD contiene una sonda DNA monocatenaria conjugada con un marcador quimioluminiscente. Esta sonda es complementaria de las secuencias de RNA específicas de las micobacterias del
complejo M. tuberculosis. La sonda forma, con estas secuencias específicas, híbridos estables RNA-DNA.
Después de la etapa de selección, la señal luminosa emitida por las sondas hibridadas es medida con el
luminómetro de GEN-PROBE LEADER.
REACTIVOS
(Equipo de 50 tests)
Los reactivos para el test MTD son suministrados como sigue:
Volumen
Nombre del reactivo
BANDEJA DE REACTIVOS PARA LA AMPLIFICACION
Tampón de Dilución de las Muestras (SDB)....................................................................................1 x 2,5 ml
Solución tampón Tris que contiene < 3 % de detergente
Reactivo de Amplificación (A) ............................................................................................................1 x 3 ml
Acidos nucleicos liofilizados en una solución tampón Tris que
(después de la reconstitución)
contiene 5 % de agente ligante
Tampón de amplificación (AB) ............................................................................................................1 x 3 ml
Solución acuosa que contiene conservantes
Reactivo de amplificación oleoso (aceite para reacción de amplificación) (O) ................................1 x 10 ml
Aceite de silicona
Reactivo Enzimático (E) ..................................................................................................................1 x 1,5 ml
57
Español
Los métodos de cultivo convencionales permiten observar el crecimiento de M. tuberculosis en un plazo de 1
a 8 semanas7,10. El test MTD, por su parte, permite la detección del RNAr de las micobacterias del complejo M. tuberculosis en 2,5 a 3,5 horas. A pesar de que no permite realizar antibiogramas, el test MTD detecta
M. tuberculosis de manera fiable y rápida. Esto permite utilizar mejor los servicios de aislamiento en los hospitales, iniciar rápidamente un tratamiento apropiado y prevenir la propagación de la enfermedad gracias a la
identificación precoz y al aislamiento de los individuos contaminados3.
PRINCIPIO
El test MTD es un test en dos fases (amplificación y detección) , que son realizadas en un mismo tubo. En
primer lugar, la sonicación provoca la liberación de los ácidos nucleicos de las micobacterias. El calor es utilizado para desnaturalizar estos ácidos nucleicos y romper la estructura secundaria del RNAr. El método de
amplificación Gen-Probe TMA amplifica a continuación una diana específica del RNAr micobacteriano a
través de un intermediario del DNA a una temperatura constante de 42°C. Se producen así múltiples copias
del RNAr micobacteriano (amplicones).
5/23/2011
9:11 AM
Page 58
Transcriptasa inversa y RNA polimerasa liofilizadas en una solución
tampón HEPES que contiene < 10 % de agente ligante y > 15 mM
de N-Acetil-L-cisteína
Tampón de Dilución Enzimático (tampón de dilución de las enzimas) (EDB) ................................1 x 1,5 ml
Solución tampón Tris que contiene un sulfactante y glicerol
BANDEJA DE LOS REACTIVOS PARA HIBRIDACION
Reactivo de Hibridación (H)................................................................................................................1 x 6 ml
< 100 ng/frasco de sonda DNA no infecciosa conjugada con un
marcador quimioluminiscente, liofilizada, en una solución de tampón
succinato que contiene un agente ligante y un detergente
Tampón de Hibridación (HB) ..............................................................................................................1 x 6 ml
Solución de tampón succinato que contiene < 4 % de detergente
Reactivo de Selección (S) ................................................................................................................1 x 15 ml
Solución de tampón borato que contiene un sulfactante
Tubos de Lisis (LT) ......................................................................................................................2 x 25 tubos
Bolas de vidrio, agente ligante
CONSERVACION
Las soluciones o los componentes no reconstituidos siguientes deben ser conservados a 2° - 8°C y son utilizables hasta la fecha de caducidad indicada:
Tampón de Dilución de las Muestras (SDB)
Reactivo de Amplificación (A)
Tampón de Amplificación (AB)
Reactivo Enzimático (E)
Tampón de Dilución Enzimático (EDB)
Reactivo de Hibridación (H)
El Reactivo de Amplificación reconstituido (A) es utilizable durante 2 meses si se le conserva a 2° - 8°C. El
Reactivo de Hibridación (H) y el Reactivo Enzimático (E) son utilizables un mes a 2° - 8°C después de la
reconstitución, o dos meses a una temperatura igual o inferior a -20°C si son distribuidos en alícuotas y congelados el día de su reconstitución. Las fracciones alícuotas congeladas deben ser utilizadas el día en que
son descongeladas. No utilizar congeladores con descongelación automática.
Los siguientes componentes deben ser conservados entre 2° y 25°C y son utilizables hasta la fecha de
caducidad indicada:
Reactivo de Amplificación Oleosa (O)
Tampón de Hibridación (HB)
Reactivo de Selección (S)
Tubos de Lisis (LT)
TOMA DE MUESTRAS, CONSERVACION, TRANSPORTE Y TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS
Toma y conservación de las muestras:
Las muestras deben ser colocadas en recipientes estériles de plástico y conservadas a 2° - 8°C antes de su
transporte y tratamiento. Durante los ensayos clínicos, las muestras han estado almacenadas menos de 4
días (en general, menos de 24 horas) antes de su tratamiento.
58
5/23/2011
9:11 AM
Page 59
Transporte:
Transportar las muestras al laboratorio lo más rápidamente posible, conforme a la reglamentación vigente.
Tratamiento (descontaminación y concentración) :
Las muestras con una fuerte concentración sanguínea no deben ser sometidas al test MTD. Este test ha sido
diseñado para detectar el RNAr de las micobacterias del complejo M. tuberculosis utilizando muestras
preparadas según los métodos de descontaminación NALC-NaOH o NaOH, utilizando 1% a 1,5% de NaOH
durante 15 a 20 minutos y una centrifugación a una velocidad superior o igual a 3 000 g 7.
Conservación de las muestras tratadas:
Las muestras pueden ser conservadas como máximo durante 3 días a 2° - 8°C antes del test. Pueden también ser conservadas entre -20° y -70°C durante 6 meses como máximo. No utilizar congeladores con
descongelación automática.
MATERIAL
A. Material suministrado
Composición del equipo (bioMérieux ref. 39006 / Gen-Probe 50 tests
Cat. No. 1001F)
BANDEJA DE REACTIVOS PARA AMPLIFICACION
Tampón de Dilución de las Muestras (SDB)
1 x 2,5 ml
Reactivo de Amplificación (A)
1 x 3 ml (después de su reconstitución)
Tampón de Reconstitución (AB)
1 x 3 ml
Reactivo oleoso (aceite para reacción de amplificación) (O)
1 x 10 ml
Reactivo Enzimático (E)
1 x 1,5 ml (después de su reconstitución)
Tampón de Dilución Enzimática (EDB)
1 x 1,5 ml
Reactivo de Hibridación (H)
1 x 6 ml (después de su reconstitución)
Tampón de Hibridación (HB)
1 x 6 ml
Reactivo de Selección (S)
1 x 15 ml
Tubos de Lisis (LT)
2 x 25 tubos
Tarjetas de protección (hojas autoadhesivas)
1 paquete
B. Material necesario no suministrado:
Micropipetas capaces de distribuir 25 μl, 50μl, 100μl, 200μl, 300μl y 450μl
Vortex
Agua estéril (filtrada o sometida a autoclave)
Tubos de cultivo
Bolas de vidrio estériles de 3 mm
Tubos para microcentrifugadora con tapones de rosca
Portatubos para tubos de reactivos
Puntas de pipeta provistas de filtro (1 000 μl)
Controles Positivos de Amplificación (p. ej., M. tuberculosis, ATCC 25177 o ATCC 27294)
Controles Negativos de Amplificación (p. ej., M. gordonae, ATCC 14470 o M. terrae, ATCC 15755)
Lejía (solución de hipoclorito al 5,25%)
Hojas de protección de superficies de trabajo, plastificadas
59
Español
BANDEJA DE REACTIVOS PARA HIBRIDACION
5/23/2011
9:11 AM
Page 60
Pipetas repetitivas
C. Material suplementario disponible en su distribuidor Gen-Probe:
Sonicador GEN-PROBE (bioMérieux ref. 39409 / Gen-Probe Cat. No. 901104/T460)
Bloques calefactores GEN-PROBE (42°C ± 1°C, 60°C ± 1°C, 95°C ± 5°C)A (bioMérieux ref. 39405, 39406,
39407 / Gen-Probe Cat. No. 3396, 3397, 3398)
Luminómetro GEN-PROBE LEADER 50i (bioMérieux ref. 39400 / Gen-Probe Cat. No. 103100i/3100i)
Equipo de Reactivos de Detección GEN-PROBE (bioMérieux ref. 39300 / Gen-Probe Cat. No. 201791/
1791)
GEN-PROBE MTD Testigos de Amplificación (bioMérieux ref.39223/Gen-Probe Cat. No. 301043F/1043F)
Portatubos para el sonicador GEN-PROBE (bioMérieux ref. 39313 / Gen-Probe Cat. No. 104027/4027)
Portatubos para tubos de reactivos (bioMérieux ref. 39311 / Gen-Probe Cat. No. 3994)
Puntas de pipeta largas provistas de filtro (1250 μl) (bioMérieux ref. 39315 / Gen-Probe Cat. No. 104316/
4316)
Tubos de polipropileno, 12 x 75 mm (bioMérieux ref. 39308 / Gen-Probe Cat. No. 102440/2440)
Tapones de polipropileno para tubos de 12 x 75 mm (bioMérieux ref. 39320 / Gen-Probe Cat. No. 400713)
PROCEDIMIENTO DE ENSAYO
Controle
Las cepas usadas como Testigos Positivos de Amplificación deberían pertenecer al complejo M. tuberculosis
tales como el H37Ra (ATCC 25177)no virulento o el H37Rv (ATCC 27294) virulento Las cepas usadas como
Testigos Negativos deberían ser tipo MOTT,tales como M. gordona (ATCC 14470)o M. terra (ATCC 15755).
Los testigos deberían prepararse antes de analizar las muestras. Los testigos han de contener 25 -150 CFU
por 50 μl de forma que se consiga una concentración final de 1-10 CFU por ensayo Se verificará dicha concentración en cada cultivo Se utilizarán estos testigos en la preparación de los Testigos de Procesamiento de
Muestras (Ver Preparación de Muestras )
1. Recomendaciones para la Preparación de los Testigos.
a. Introducir de 3 a 5 bolas de vidrio estériles de 3 mm en un tubo de cultivo limpio
b. Añadir 1-2 ml de agua estéril A gregar el contenido de varias asas de 1 μl del cultivo apropiado. Cerrar
el tubo y homogeneizarlo repetida e intensamente mediante Vórtex
c. Dejar decantar la suspensión durante 15 minuto
d. Transferir la fase flotante a un tubo de cultivo limpio.Ajustar la turbidez al equivalente de 1 McFarland
mediante un nefelómetro estándard, utilizando una referencia McFarland .
e. Realizar una dilución al 1:100 de la suspensión, añadiendo 100 μl de la suspensión 1 McFarland en
10 ml de agua estéril. Tapar y agitar mediante Vórtex. Esta es la Dilución 1.
f. Realizar una 2ª dilución al 1:100 añadiendo 100 μl de Dilución 1 en 10 ml de agua estéril. Tapar y
agitar mediante Vórtex. Esta es la Dilución 2. Esta dilución debería contener 25-150 CFU por 50 μl
aprox Partes alícuotas y almacenamiento de los Testigos
a. Las diluciones deberán ser repartidas en fracciones alícuotas en microtubos limpios para
centrifugación, de 1,5 ml con tapón de rosca de un sólo uso, 500 μl y se conservarán congeladas a
-20°C durante 6 meses o a -70ºC durante un año. No usar congeladores con descongelación
automática.
Los ensayos de los testigos positivos recomendados para M. tuberculosis sólo controlarán fallos substanciales de los reactivos. El testigo positivo se ha diseñado para controlar el efecto de los reactivos durante el
procesamiento para la interferencia del exceso de los tampones de NaOH y fosfato Los cambios en tiempos o
60
5/23/2011
9:11 AM
Page 61
temperaturas de los procedimientos que pueden afectar la eficacia de la amplificación o la aceptabilidad del
tiempo de selección pueden no ser detectados usando los testigos recomendados Se ensayarán testigos
adicionales según normas o necesidades.
2. Control de inhibición de las muestras
Cuando el test MTD es negativo pero el diagnóstico del médico se inclina por una tuberculosis, es posible
verificar si la muestra contiene un inhibidor utilizando el procedimiento siguiente:
a. Poner 50 μl de Tampón de Dilución de las muestras en 2 tubos de lisis de las micobacterias (sobrecargada y no sobrecargada).
b. Introducir 50 μl de Control Positivo de Amplificación y 450 μl de muestra en un tubo (sobrecargado).
Añadir 450 μl de muestra en el segundo tubo (no sobrecargado). Realizar el test conforme al protocolo
habitual.
Interpretación
Si el número de RLU (Relative Light Units - Unidades Relativas de Luz) obtenido en el luminómetro con el
tubo sobrecargado es > 30.000 RLU, la muestra no contiene inhibidor de amplificación y la muestra
aparentemente no contiene diana por amplificar. Si el número de RLU obtenido con el tubo sobrecargado
es < 30.000 RLU, la muestra contiene un inhibidor de la amplificación y debe analizarse otra muestra. Si
el análisis repetido del tubo no sobrecargado es positivo, el resultado del test MTD puede ser considerado
positivo. La explicación más plausible para este tipo de resultado es la variabilidad ligada al muestreo: la
primera toma de prueba no contenía diana por amplificar, mientras que la segunda si contenía. El número
de RLU del tubo no sobrecargado puede ser positivo o negativo, según si la toma de muestra contiene o
no RNAr de micobacterias que pertenezcan al complejo M. tuberculosis.
3. Control de la contaminación del laboratorio
Para analizar la contaminación del laboratorio con amplicones de M. tuberculosis, proceder como sigue:
b. Frotar el escobillón en la cubierta de la mesa de trabajo o del material por analizar.
c. Colocar el escobillón en el tubo y mezclar suavemente. Retirar el escobillón estrujándolo contra la
pared del tubo. Desechar el escobillón en un recipiente que contenga una solución de lejía diluida al
1/2 (mitad de lejía, mitad de agua).
d. Distribuir 25 μl de la solución así obtenida en un tubo de amplificación que contenga 50μl de Reactivo
de Amplificación y 200μl de aceite para reacción de amplificación.
e. Seguir las instrucciones del párrafo « TECNICA » para la amplificación y la detección.
Interpretación
Si los resultados son > 30.000 RLU, la superficie estudiada está contaminada y debe ser descontaminada
mediante un tratamiento con lejía, siguiendo las instrucciones del párrafo
« TECNICA : Preparación del material ». Si se sospecha la presencia de contaminación del baño maría,
proceder en la misma forma ya indicada, con 25 μl de agua del baño maría, a condición que ésta no contenga productos antisépticos.
Preparación del material
1. a. Llenar el depósito del sonicador con agua de grifo a temperatura ambiente, hasta aproximadamente 1
cm del borde.
b. El agua del baño de ultrasonidos debe ser desgasificada antes de cada ensayo con el fin de optimizar
la transferencia de energía de los ultrasonidos. Para desgasificar el agua en forma completa, hacer
funcionar el sonicador durante 15 minutos.
2. Regular un bloque calefactor a 95° ± 5°C, un bloque calefactor o un baño maría a 60° ± 1°C y un bloque
61
Español
a. Introducir 1 ml de agua estéril en un tubo limpio. Humedecer un escobillón estéril de poliéster o
dacrón con agua estéril.
5/23/2011
9:11 AM
Page 62
calefactor o un baño maría a 42° ± 1°C.
3. Limpiar las superficies de trabajo, material y pipetas con una dilución 1/2 de lejía antes de comenzar el
análisis. La lejía debe permanecer en contacto con esos objetos durante al menos 15 minutos. Enjuagar
con agua la superficie de trabajo para eliminar los restos de lejía. Cubrir la superficie sobre la cual será
realizado el test con una hoja de protección plastificada.
4. Preparar el luminómetro GEN-PROBE LEADER. Verificar que se cuenta con una cantidad suficiente de
Reactivos de Detección I y II para realizar los tests y verificar que los tubos se encuentran cebados.
Consultar el manual de empleo del luminómetro para las instrucciones de carga de los Reactivos de
Detección (estos reactivos son vendidos por separado).
Preparación del reactivo
Reconstituir el Reactivo de Amplificación liofilizado (A) en su frasco (50 tests) con 3 ml de Tampón de
Amplificación (AB). Homogeneizar mediante un Vortex. Dejar reposar el reactivo reconstituido a temperatura
ambiente hasta que se vuelva transparente. El Reactivo de Amplificación reconstituido puede conservarse 2
meses a 2° - 8°C. La solución debe llevarse a la temperatura ambiente antes de su utilizatión.
Preparación de las muestras
1. Etiquetar e identificar un número suficiente de tubos de Lisis Mycobacterium (LT) para analizar tanto las
muestras, como un Testigo Positivo y otro Negativo bien sea de Amplificación o de Procesamiento de
Muestras. Retirar y conservar los tapones
2. Pipetear 50 μl del Tampón de Dilución de las Muestras (SDB) Mycobacterium en todos los tubos de Lisis
Mycobacterium (LT). Seguir las indicaciones facilitadas a continuación. Párrafos A o B para los testigos y
C para las muestras
A. Testigos de Procesamiento de Muestras:
Para cada testigo agregar 1 ml de la solución ClNa/NaOH y 3 ml del tampón fosfato utilizado para
analizar los esputos con 1 ml de agua estéril a un tubo de análisis de muestra.
i. Mezclar mediante Vórtex.
ii. Transferir 450 μl de la solución tampón fosfato/ClNa/NaOH y 50 μl de la dilución del Testigo al
tubo correspondientemente etiquetado de Lisis Mycobacterium (LT).
B. Caso de emplear los Testigos de Amplificación, transferir 450 μl de dichos Testigos desde su envase
al tubo de Lisis Mycobacterium (LT) correspondientemente etiquetado.
C. Muestra Transferir 450 μl de una muestra descontaminada bien mezclada en Vórtex, desde su envase
al tubo de Lisis Mycobacterium (LT) correspondientemente etiquetado.
3. Volver a tapar los tubos de Lisis Mycobacterium (LT) después de la adición de cada muestra.
4 Homogeneizar mediante Vórtex durante 3 segundos
Lisis de las muestras
1. Insertar los Tubos de Lisis (LT) en el portatubos del sonicador de manera que la mezcla de reactivos en el
fondo de los tubos se encuentre sumergida, manteniendo al mismo tiempo los tapones fuera del agua.
Poner el portatubos en su lugar. LOS TUBOS NO DEBEN EN NINGUN CASO ESTAR EN CONTACTO
CON EL FONDO NI CON LAS PAREDES DEL SONICADOR.
2. Hacer funcionar el sonicador durante 15 minutos, pero no más de 20 minutos. Las muestras y controles
así tratados con ultrasonidos son « lisados ». NO UTILIZAR EL VORTEX PARA AGITAR LOS LISADOS.
Amplificación
1. Escribiendo en la parte alta de los tubos, identificar los tubos de polipropileno para amplificación
(12 x 75 mm) con los números correspondientes a los números de identificación de los Tubos de Lisis (LT).
Identificar también los tubos de amplificación para los controles de amplificación positivo y negativo.
2. Introducir 50 μl de Reactivo de Amplificación reconstituido en el fondo de cada tubo utilizando una pipeta
62
5/23/2011
9:11 AM
Page 63
de repetición. Añadir 200 μl de aceite para reacción de amplificación (O) en cada tubo, utilizando una
pipeta de repetición.
3. NO UTILIZAR EL VORTEX PARA LOS LISADOS. Transferir 25 μl de cada lisado en el fondo del tubo de
amplificación correspondiente, utilizando una nueva punta provista de filtro para cada transferencia. Los
lisados restantes pueden ser conservados a 2° - 8°C durante 7 días, o congelados a una temperatura
igual o inferior a -20°C durante 1 mes. No utilizar congelador con descongelación automática. Si deben
efectuarse otros tests con los lisados, llevar antes a temperatura ambiente. NO UTILIZAR EL VORTEX
PARA LOS LISADOS.
4. Incubar los tubos en un bloque calefactor a 95° C durante 15 minutos, pero no más de 20 minutos.
5. Preparar la Solución Enzimática añadiendo 1,5 ml de Tampón de Dilución Enzimático (EDB) al Reactivo
Enzimático liofilizado (E). Hacer girar para mezclar. No utilizar el agitador Vortex. El Reactivo Enzimático
reconstituido es utilizable durante un mes a 2° - 8°C o durante dos meses a una temperatura igual o inferior
a -20°C si es dividido en alícuotas y congeladoB el día de su reconstitución. Si el test se realiza con fracciones alícuotas de enzimas congeladas, llevar a temperatura ambiente; no descongelar las fracciones
alícuotas incubándolas a alta temperatura. Para homogeneizar las fracciones alícuotas descongeladas, aspirar y expulsar suavemente la solución utilizando una pipeta de repetición antes de añadirla a los tubos de
amplificación.
6. Transferir los tubos al bloque calefactor o al baño maría a 42° ± 1°C y dejarlos enfriar durante 5 minutos.
NO DEJAR QUE LOS TUBOS ALCANCEN LA TEMPERATURA AMBIENTE. NO CUBRIR EL BAÑO
MARIA.
7. Cuando los tubos se encuentran a 42°C, añadir 25 μl de Reactivo Enzimático en cada tubo, utilizando
una pipeta de repetición. Agitar para mezclar. Incubar a 42°C durante 30 minutos, pero no más de 60
minutos. Hay que utilizar hojas autoadhesivas o tapones durante esta etapa de incubación. NO CUBRIR
EL BAÑO MARIA.
Hibridación
1. Reconstituir el Reactivo de Hibridación liofilizado (H) con 6 ml de Tampón de Hibridación (HB). El Reactivo
de Hibridación (H) y el Tampón de Hibridación (HB) deben estar a temperatura ambiente antes de la
reconstitución. Si el Tampón de Hibridación (HB) ha sido refrigerado, calentarlo hasta 60°C haciéndolo girar
suavemente para verificar que todos los componentes están disueltos. Agitar con ayuda de un Vortex hasta
que la solución se vuelva transparente (lo que puede demorar hasta un minuto) para verificar que todos los
componentes hayan quedado disueltos. El Reactivo de Hibridación reconstituido es utilizable durante un
mes a 2° - 8°C o durante dos meses a una temperatura igual o inferior a -20°C si es dividido en alícuotas y
congeladoC el día de su reconstitución. Si el Reactivo de Hibridación reconstituido ha sido refrigerado o
congelado, calentarlo hasta 60°C haciéndolo girar suavemente para que todos sus componentes queden
disueltos
2. Añadir 100 μl de Reactivo de Hibridación reconstituido a cada tubo utilizando una pipeta de repetición.
Cubrir los tubos con hojas autoadhesivas o con tapones. Agitar los tubos mediante un Vortex a velocidad
media 3 veces durante por lo menos 1 segundoD. Para alcanzar una correcta homogeneidad de los tubos
de reactivos, mantenerlos en posición vertical y dejar que la mezcla alcance la mitad superior de la pared
del tubo durante la agitación (para evitar cualquier contaminación, no dejar que la mezcla de reactivos
tome contacte con las hojas autoadhesivas o con los tapones). Cuando la homogeneización ha sido correctamente realizada, la mezcla debe presentar un color amarillo uniforme.
3. Incubar a 60°C durante 15 minutos, pero no más de 20 minutos, en un bloque calefactor o al
baño maría.
63
Español
8. Después del período de incubación de 30 minutos, los tubos cubiertos pueden ser conservados a
2° - 8° C durante 2 horas o a -20°C hasta el día siguiente. Si son conservadas a -20°C hasta el día
siguiente, los tubos deben ser totalmente descongelados a temperatura ambiente o, como máximo, a
60°C antes de cada etapa de hibridación, y deben ser cerrados con tapones mejor que con hojas
autoadhesivas.
5/23/2011
9:11 AM
Page 64
Selección
1. El Reactivo de Selección (S) debe estar a temperatura ambiente antes de comenzar el test. Retirar los
tubos del baño maría o del bloque calefactor a 60°C y añadir 300 μl de Reactivo de Selección (S) utilizando una pipeta de repetición. Cubrir los tubos con hojas autoadhesivas o tapones. Agitar mediante un
Vortex a velocidad media, 3 veces durante al menos 1 segundoD. Para alcanzar una buena homogeneización de los tubos de reactivos, mantenerlos en posición vertical y dejar que la mezcla alcance la
mitad superior de la pared del tubo durante la agitación (para evitar cualquier contaminación, no dejar que
la mezcla de reactivos entre en contacto con las hojas autoadhesivas o los tapones). Cuando se ha
realizado correctamente la homogeneización, la mezcla debe presentar en este momento un color rosa
uniforme.
2. Incubar a 60°C durante 15 minutos, pero no más de 16 minutos, en un bloque calefactor o al baño maría.
3. Retirar los tubos del baño maría o del bloque calefactor. Dejar los tubos a temperatura ambiente durante
al menos 5 minutos, pero no más de una hora. Retirar las hojas autoadhesivas o los tapones justo antes
de la fase de detección.
Detección
1. Programar el protocolo apropiado en el luminómetro. Elegir una lectura en 2 segundos.
2. Para eliminar cualquier residuo de la superficie de los tubos, secarlos con papel absorbente sin pelusas y
húmedo; introducir a continuación en el luminómetro siguiendo las instrucciones del manual de empleo.
Los tubos deben ser leídos dentro de la hora siguiente a la etapa de selección.
3. Una vez terminado el análisis, retirar los tubos del luminómetro.
4. Después de la lectura de los tubos, llenarlos con precauciones con una solución de lejía diluida a
1/10 (un volumen de lejía por 9 volúmenes de agua), utilizando un matraz. Dejar la lejía en contacto
durante por lo menos una hora antes de desechar los tubos, para evitar la contaminación del laboratorio
con amplicones.
5. Los portatubos deben ser descontaminados sumergiéndolos por completo en una solución de lejía diluida
al 1/2 durante al menos 15 minutos. Deben ser enjuagados a continuación con agua y secados, o dejados
secar al aire.
6. Descontaminar el laboratorio y el material utilizando una solución de lejía diluida a 1/2.
Repetición del test
1. Si se repite el test, llevar los lisados a temperatura ambiente. NO UTILIZAR VORTEX PARA LOS LISADOS.
2. Seguir a continuación la Técnica, comenzando por la etapa de amplificación.
OBSERVACIONES
A. Reactivos
1. El Reactivo Enzimático no debe quedar a temperatura ambiente más de 15 minutos después de haber
sido reconstituido.
2. El Tampón de Hibridación (HB) puede precipitar. Calentar y agitar el Tampón de Hibridación (HB) o el
Reactivo de Hibridación reconstituido a 60°C para disolver el precipitado.
B. Temperatura
1. La amplificación, la hibridación y la selección son reacciones termodependientes; en consecuencia, es
necesario mantener el baño maría o el bloque calefactor a las temperaturas recomendadas.
2. Antes de añadir el Reactivo Enzimático, dejar enfriar los tubos durante 5 minutos con el fin de que
alcancen 42°C. Esta temperatura permite alcanzar rendimientos de amplificación óptimos.
3. El respeto de la temperatura es fundamental para la fase de amplificación (42° ± 1°C).
64
5/23/2011
9:11 AM
Page 65
C. Tiempos
Es imperativo respetar los tiempos indicados en el párrafo « TECNICA ».
D. Baño maría
1. El nivel de agua en el baño maría debe mantenerse de manera que la mezcla de reactivos en el fondo
de los tubos se encuentre sumergido, pero que el agua no penetre en los tubos.
2. Durante la fase de amplificación, el baño maría no debe quedar cubierto con el fin de evitar que la condensación caiga sobre o dentro de los tubos.
E. Agitación utilizando ‘un Vortex
Es importante disponer de una mezcla homogénea durante las etapas de hibridación y de selección, particularmente después de añadir el Reactivo de Hibridación (H) reconstituido (la mezcla adopta un color
amarillo uniforme) y del Reactivo de Selección (S) (la mezcla adopta un color rosa uniforme).
B. Resultados de Ensayos en Pacientes
Caso de que los testigos no arrojen las cifras esperadas, los resultados de ensayo en muestras de
pacientes del mismo lote no deberán ser entregados
Result ado:
> 500.000 RLU positivo para ARNr del complejo M. tuberculosis
< 30.000 RLU negativo para ARNr del complejo M. tuberculosis
30.000 a 499.999 RLU probable positivo para ARNr del complejo M. tuberculos; repetir para verificación:
Repetir > 30.000 RLU positivo para ARNr del complejo M. tuberculosis
Repetir < 30.000 RLU negativo para ARNr del complejo M. tuberculosis
PRESENTACIÓN DE LOS RESULTADOS
65
Español
La agitación utilizando un Vortex permite obtener una suspensión uniforme. Cuando los reactivos son
colocados en un tubo de reactivos y son expuestos a una fuente de energía exterior, se produce una
rotación rápida de la solución en torno al eje del tubo. Esto se traduce en una suspensión uniforme. Para
que la homogeneización se realice correctamente, utilizando un Vortex, los tubos deben mantenerse verticalmente, sosteniéndolos por la parte superior. El líquido debe entonces alcanzar la mitad superior del
tubo durante la agitación. Durante etapas de hibridación y selección, esta agitación es realizada 3 veces
seguidas y debe durar por lo menos 1 segundo cada vez.
INTERPRETACION DEL ENSAYO
El resultado de la muestra analizada mediante el GEN-PROBE TEST AMPLIFI ED para la detección directa
del complejo Mycobacterium Tuberculosis (MTD) se interpreta basándose en un resultado negativo inicial (<
30.000 RLU),un resultado positivo inicial (> 500.000 RLU), o un resultado equívoco inicial (de 30.000 a
499.999 RLU). Debe repetirse el ensayo MTD del lisado reservado cuando el resultado del ensayo inicial
resulte equívoco. Un resultado repetido del lisado > 30.000 se considera positivo
A. Resultados de Control de Calidad y Aceptabilidad
Los testigos deberán producir los siguientes valores:
Testigo Negativo de Amplificación < 20.000 RLU
Testigo Positivo de Amplificación > 500.000 RLU
Testigo Negativo del Procesamiento de Muestra < 20.000 RLU
Testigo Positivo del Procesamiento de Muestra > 1.000.000 RLU
No deberán entregarse los resultados de ensayos MTD de pacientes que no cumplan los criterios arriba
reseñados.Consultar el párrafo "RESOLUCIÓN DE INCIDENTES" para información adicional.
Cada laboratorio debe determinar los valores objetivo para los testigos utilizando los resultados de ensayo
para cada lote de testigos preparados.
5/23/2011
9:11 AM
Page 66
Los resultados del ensayo MTD se interpretarán con juntamente con otros datos clínicos y de laboratorio
disponibles para el analista. Basándose en el grado de sospecha clínica, se debería considerar el ensayo de
una muestra adicional.
Si el ensayo inicial MTD fuese positivo a > 500.000 RLU, o el ensayo MTD repetido fuese positivo a > 30.000
RLU, se emitirá el siguiente informe:
Informe:
Se ha detectado ARNr del complejo Mycobacterium
tuberculosis. Frotis BAAR (positivo o negativo).
Información adicional:
Cultivo para detección BAAR en curso.La muestra puede
contener tanto MOTT como M. tuberculosis o sólo
M. tuberculosis Este ensayo no debes er la única base para
diagnosticar la tuberculosis. El valor positivo predictivo para
un frotis negativo del paciente es inferior a un frotis positivo
del paciente Resulta particularmente importante en ensayos
de poblaciones donde la prevalencia de tuberculosis resulte
baja y los valores positivos predictivos de los métodos de
diagnosis se reducen de forma correspondiente.
Caso de que el resultado del ensayo MTD inicial o repetido resultase negativo a < 30.000 RLU,se informaría
como sigue:
Informe:
No se ha detectado ARNr para el complejo Mycobacterium
tuberculos is Frotis BAAR (positivo o negativo).
Información Adicional:
N o hay detección de ARNr del complejo tuberculosis
Cultivo para detección BAAR en curso La muestra puede no
contener M. tuberculosis, el resultado puede ser falso negativo debido al bajo número de M. tuberculosis e presencia o
ausencia de MOTT, o el resultado puede ser falso debibo a
la interferencia en el ensayo de muestras inhibidoras. Se
recomienda analizar muestras de otro paciente si clínicamente se sospechase la presencia de tuberculosis activa o
de la inhibición de la muestra.
LIMITES
Este test está destinado exclusivamente a la detección de micobacterias del complejo M. tuberculosis a partir
de muestras preparadas según los procedimientos NALC-NaOH o NaOH recomendados por el CDC7. Esta
prueba sólo puede ser utilizada con muestras preparadas a partir de esputos (inducidos o expectorados), de
muestras bronquiales (lavados bronco-alveolares o aspirados bronquiales) o de aspirados traqueales.
El test MTD es específico para las micobacterias del complejo M. tuberculosis, a saber, M. tuberculosis, M.
bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, y M. canetti (12, 13), pero no diferencia estas especies entre
sí. M. celatum y M. pseudo-terrae pueden provocar reacciones cruzadas si se presentan en concentraciones
superiores a 30 UFC por test. En todo caso, M. celatum y M. pseudo-terrae son rara vez aisladas en clínica.
La calidad de los resultados del test se encuentra relacionada con la calidad de la toma de muestra y con su
transporte; con la variabilidad de la toma de muestras; con los errores técnicos del laboratorio; con los errores
de identificación de las muestras y con los errores de transcripción de los resultados. Un test negativo no
excluye la presencia de una micobacteria del complejo M. tuberculosis en la muestra.
66
5/23/2011
9:11 AM
Page 67
VALORES ESPERADOS
A. Gama de valores de control obtenidos durante los ensayos clínicos
La gama de valores obtenidos por los controles (RLU) durante los ensayos clínicos realizados en 7 sitios
ha sido la siguiente:
B. Gama de los valores obtenidos para las muestras clínicas
Para las 127 muestras MTD-positivas, los valores se encontraban entre 35.777 y > 2.000.000 RLU.
Para las 577 muestras MTD-negativas, los valores se encontraban entre 573 y 19.176 RLU.
La frecuencia de los resultados en RLU para todas estas muestras, después de resolver las discordan-
Español
67
5/23/2011
9:11 AM
Page 68
cias, figura a continuación. La resolución de las discordancias se basa en el análisis de otras muestras,
positivas en cultivo, procedentes de un mismo paciente y/o en el diagnóstico final del médico tratante.
RESULTADOS
A. Evaluación clínica
Los resultados del test MTD en su forma original han sido evaluados durante ensayos clínicos realizados
en seis laboratorios, comparando los resultados obtenidos por examen de frotis con resultados del cultivo,
en 6.079 muestras procedentes de 2.609 pacientes. Entre éstas, 4.000 muestras provenían de 1.898
pacientes que no habían recibido tratamiento antituberculoso. Los seis sitios representaban zonas geográficas diferentes: cinco centros hospitalarios de grandes ciudades de EE.UU. que poseen un servicio especializado para la tuberculosis, y un laboratorio público.
Los resultados del test MTD en su forma actual han sido evaluados en siete sitios, comparando los resultados del test MTD con los resultados del cultivo. Los siete centros que participaron en el test representaban zonas geográficas diferentes: seis centros hospitalarios de grandes ciudades de EE.UU. que poseían
un servicio especializado para la tuberculosis y un laboratorio nacional público de micobacteriología. Las
muestras analizadas provenían de pacientes que no habían recibido tratamiento antituberculoso. 132
dieron resultados positivos en cultivo con respecto a las micobacterias del complejo M. tuberculosis. MTD
detectó 119 de estas muestras como cultivos positivos; y 7 muestras contenían micobacterias no tuberculosas además de M. tuberculosis.
Pacientes sospechosos de estar afectados por una tuberculosis pulmonar activa que no se encontraban
bajo tratamiento han sido incluidos en este estudio. La prevalencia total de los pacientes que presentaron
un cultivo positivo de M. tuberculosis fue de 20,5%.
Por paciente, fueron determinadas una sensibilidad media de 93,3 % y una especificidad media de 99,1 %
en relación al cultivo. Por muestra, fueron determinadas una sensibilidad media de 90,6 % y una especificidad media de 99,6 % en relación al cultivo. En el cuadro que sigue se proporciona la sensibilidad, la
especificidad, el valor predictivo positivo (VPP) y el valor predictivo negativo (VPN), con intervalos de
confianza del 95%, para las estimaciones de resultados. Todos los datos visualizados son presentados
después de resolver las discordancias en base al análisis de otras muestras positivas en cultivo
procedentes del mismo paciente y/o en base al diagnóstico final del médico tratante.
68
5/23/2011
9:11 AM
Page 69
De las 564 muestras negativas en cultivo y MTD-negativas para las micobacterias del complejo M. tuberculosis, 114 muestras contenían micobacterias atípicas, puestas en evidencia por cultivo, 64 procedían de
pacientes cuyas otras muestras permitieron aislar micobacterias atípicas por cultivo y 169 provenían de
pacientes en los cuales no se aisló en cultivo ninguna micobacteria.
B. Precisión
Dada que la variabilidad de los resultados no era significativa entre un sitio y otro o entre un día y otro,
los resultados de los tres centros pudieron ser consolidados y son presentados a continuación. Los valores de lectura medidos en RLU son limitados por la resolución del tubo fotomultiplicador del luminómetro.
Por esta razón, los valores superiores a 2.000.000 RLU son llevados a 2.000.000 RLU. No se indican las
desviaciones tipo ni los coeficientes de variación.
69
Español
Paneles de muestras, consistentes en 2 muestras negativas, 2 muestras débilmente positivas
(= 100 UFC/ test) y 2 muestras moderadamente positivas (= 1000 UFC/ test) fueron analizadas en tres
centros. Las muestras positivas fueron preparadas agregando cantidades conocidas de M. tuberculosis a
una mezcla de muestras moderadamente inhibidoras.. Las muestras y los controles de amplificación positivo y negativo fueron analizados por triplicado dos veces al día, durante 3 días, en los tres centros
C.
D.
E.
F.
5/23/2011
9:11 AM
Page 70
Reproductibilidad
El estudio de reproductibilidad fue realizado analizando 25 muestras; se intercalaron controles de amplificación negativos entre cada muestra para formar un total de 50 muestras. El panel de reproductibilidad
fue analizado en cuatro centros
En total, 100 % (120/120) de las muestras negativas y 98,8 % (79/80) de las muestras positivas dieron
los resultados esperados.
Especificidad analítica
La especificidad del test MTD fue evaluada con la ayuda de bacterias, hongos y virus. En el caso de las
bacterias y de los hongos, los tests de especificidad incluyeron 160 cepas (151 especies procedentes de
62 géneros) de micobacterias muy cercanas a M. tuberculosis, otros microorganismos responsables de
enfermedades respiratorias y un panel filogenético de microorganismos de la flora comensal del aparato
respiratorio. Las cepas tipo fueron cultivos ATCC (American Type Culture Collection), y 5 cepas fueron
suministradas por laboratorios de análisis. Los lisados, preparados a partir de cultivos en fase activa de
crecimiento (o de RNAr, en tres casos) fueron analizados conforme al protocolo del test MTD a razón de
aproximadamente 5 x 107 UFC por test. Unicamente las cepas del complejo M. tuberculosis dieron resultados positivos, con excepción de cepas de M. celatum y M. pseudo-terrae.
Con concentraciones superiores a 30 UCF por test, las cepas de M. celatum y algunas cepas de M.
pseudo-terrae dieron resultados positivos (26.772 RLU para M. celatum y 19.470 a 49.976 RLU para M.
pseudo-terrae).
Límite de detección
Treinta cepas de M. tuberculosis provenientes de regiones geográficas muy variadas, incluidos representantes de cepas resistentes y de cepas sensibles a los antibióticos, fueron detectadas mediante el test
MTD. El test MTD pudo detectar hasta 1 UFC por test de cada una de las 30 cepas.
Test de sobrecarga
Fueron analizados RNAr de Mycobacterium tuberculosis con una concentración de 25 fg (equivalente a
5 UFC por test) en presencia de aproximadamente 540.000 UFC por test (450 μl) de los siguientes
organismos no dianas: Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila,
Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium gordonae, M. avium, M. kansasii, M. terrae, Nocardia asteroides, N. otitidis-caviarum, Corynebacterium pseudotuberculosis, C. diphtheriae, Gordona sputi y
Rhodococcus bronchialis. Todos los resultados fueron positivos para el RNAr de M. tuberculosis en presencia de estos organismos no dianas, que por lo tanto no crearon interferencia.
70
5/23/2011
RESOLUTION DE INCIDENTES
OBSERVACION
Valores Elevados de los Testigos
Negativos de Amplificación o de
Testigos Negativos de
Procesamiento de Muestras
(> 20.000 RLU)
9:11 AM
Page 71
CAUSAS POSIBLES
z Homogeneización insuficiente o adición de volumen
insuficiente tras añadir el
Mycobacterium Selection
z Amplificación de los contaminantes introducidos por falta de
precaución durante la
preparación de las reacciones.
z Omisión de la etapa de
enfriamiento de 5 minutos.
z Contaminación del laboratorio o de los reactivos.
RECOMENDACIONES
Conseguir una homogeneización
completa. Garantizar que el volumen
del reactivo añadido sea Correcto
Debe prestarse gran cuidado a la
distribución de los reactivos
mediante pipetas. Los tubos ya
utilizados deben ser
descontaminados con una solución
de lejía diluida al 1/10, tal como se
indica en el párrafo « TECNICA ».
Las superficies de trabajo, los
bloques calefactores, los baños
marías y las pipetas deben ser
descontaminadas con una solución
de lejía diluida al 1/2, como se indica en el párrafo « TECNICA ».
z Omisión del secado de los
tubos antes de la lectura con el
luminómetro.
z fase fuera del rango de
temperatura recomendado
z Adición del Reactivo de
Amplificación, vertiendo el
líquido en las paredes del tubo
y no directamente al fondo del
mismo.
z Homogeneización
insuficiente después de añadir
el Reactivo de Hibridación
reconstituido.
z Volumen de Reactivo de
Selección demasiado importante.
z No respeto del tiempo
recomendado para la etapa de
selección.
z La temperatura de los tubos
ha descendido por debajo de
42°C después de la incubación
a 95°C.
z Los conductos que llevan el
Reactivo de Detección se
encuentran obstruidos.
71
Ajustar según convenga para conseguir los rangos especificados de
temperatura
Verificar la temperatura del baño
maría y/o del bloque calefactor y
ajustarlo si fuera necesario para
respetar las temperaturas recomendadas.
Agitar cuidadosamente con el Vortex
como se ha especificado (ver el párrafo « Hibridación / 2 »). Verificar la
formación de una solución de color
amarillo uniforme después de la
agitación.
Respetar los 15 minutos de
incubación a 60°C, durante la etapa
de Selección.
Transferir directamente los tubos del
bloque calefactor a 95°C al baño
maría / bloque calefactor a 42°C.
Enjuagar los conductos con agua
caliente, como se indica en el
manual de empleo del instrumento.
Español
Valores Bajos de los Testigos
Positivos de Amplificación o de
Testigos Positivos de
Procesamiento de Muestras
(< 500.000 RLU)
5/23/2011
9:11 AM
Page 72
NOTAS
A
Los bloques calefactores deben tener pocillos previstos para los tubos 12 x 75 mm. Se recomienda utilizar bloques calefactores GEN-PROBE.
B
Se recomienda para el almacenamiento de la alícuotas congeladas tubos de microcentrífuga con tapa.
Las alícuotas individuales congeladas pueden congelarse y descongelarse solo de una vez. No deben
usarse congeladores con sistema “frost-free”.
C
Se recomienda para almacenar las alícuotas congeladas crioviales de 5 ml. Las alícuotas individuales
congeladas pueden congelarse y descongelarse solo de una vez. No deben usarse congeladores con
sistema “frost-free”.
D
Los rendimientos de los Vortex pueden diferir, según el material utilizado: puede ser necesario adaptar el
tiempo de agitación. Regular la velocidad del aparato y seguir las instrucciones descritas en « TECNICA,
párrafo E », con el fin de permitir que la mezcla de reactivos pueda alcanzar la mitad superior de la
pared del tubo. Una homogenización correcta es indispensable para obtener resultados precisos. El
tiempo de agitación puede ser llevado a 15 segundos sin afectar los resultados.
72
5/23/2011
9:11 AM
Page 73
TEST AMPLIFIED PER L’IDENTIFICAZIONE DIRETTA DEI MICOBATTERI DEL
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX
Kit da 50 test
(bioMérieux cod. 39006/Gen-Probe Cat. N. 301001/1001F)
MODALITÀ D’IMPIEGO
Il test AMPLIFIED PER L’IDENTIFICAZIONE DIRETTA DEI MICOBATTERI DEL MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX (MTD) è un test che impiega una sonda a DNA diretta contro un bersaglio amplificato.
Questa sonda permette di identificare in vitro gli acidi nucleici dei micobatteri del Mycobacterium tuberculosis
complex. Questo test viene effettuato su campioni provenienti da escreati (indotti o espettorati), prelievi
bronchiali (lavaggi bronco-alveolari o broncoaspirati) ed aspirati tracheali.
AVVERTENZA
Non è ancora stata dimostrata l’efficacia di questo test per l’identificazione diretta di rRNA di M. tuberculosis a
partire da altri campioni clinici (ad esempio ematici, urinari o coprologici). Le performance del test MTD sono
state unicamente stabilite per campioni trattati in base alla metodica descritta e conservati per i periodi e alle
temperature di cui al presente foglietto illustrativo.
I campioni che evidenziano risultati positivi devono essere messi in coltura allo scopo di determinare l’eventuale presenza di micobatteri diversi da quelli appartenenti al M. tuberculosis complex o micobatteri atipici.
Devono essere altresì effettuati sia test di sensibilità agli anti-tubercolari che, successivamente, colture per la
ricerca di bacilli alcol-acido resistenti (BAAR) al fine di precisare la sottospecie del TB complex presente (ad
esempio M. bovis).
Non sono state valutate le performance del test su prelievi da pazienti sotto trattamento anti-tubercolare al fine
di effettuare un monitoraggio terapeutico o confermare una guarigione.
Il kit MTD non deve essere impiegato per testare i campioni ad alta concentrazione ematica.
PRECAUZIONI D’USO
A. Il test è riservato esclusivamente all'uso diagnostico in vitro.
B. Il test MTD è specifico per i micobatteri del M. tuberculosis complex, vale a dire M. tuberculosis, M. bovis,
M. bovis BCG, M. africanum, M. microti e M. canetti (13), ma non consente di diversificare fra queste
specie. M. celatum e M. terrae-like possono indurre reazioni incrociate se presenti a concentrazioni superiori a 30 CFU (Unità Formanti Colonie) per test. Tuttavia, M. celatum e M. terrae-like vengono raramente
isolati in clinica.
C. Un risultato negativo non esclude la presenza nel campione di un micobatterio del M. tuberculosis complex. La qualità dei risultati dipende dal prelievo e dalla manipolazione, dalla variabilità del prelievo dei
campioni, dagli errori tecnici del laboratorio, dagli errori di identificazione dei campioni e dagli errori di
trascrizione dei risultati.
73
Italiano
Nel quadro delle prove cliniche, sono stati sottoposti al test anche prelievi eseguiti su bambini, su pazienti
HIV positivi e pazienti infettati da micobatteri atipici. In ogni caso il numero di questi test non ha consentito di
confrontare statisticamente le performance del test nei vari gruppi sopra citati.
5/23/2011
9:11 AM
Page 74
D. Il test è riservato all’identificazione dei micobatteri del M. tuberculosis complex a partire da campioni
preparati in base ai metodi NALC-NaOH o NaOH raccomandate dai Centers for Disease Control (CDC)7.
Questo test deve essere esclusivamente impiegato per campioni concentrati preparati a partire da escreati
(indotti o espettorati), aspirati tracheali o prelievi bronchiali (lavaggi bronco-alveolari o broncoaspirati).
Quando il campione viene rimesso in sospensione nella soluzione di tampone fosfato, assicurarsi che la
concentrazione di fosfato sia di 67 mM7.
E. Evitare qualsiasi contatto della cute, degli occhi e delle mucose con i Reagenti di Rivelazione I e II
(bioMérieux cod. 39300 / Gen-Probe Cat. N. 201791/1791). In caso di contatto, lavare abbondantemente
con acqua le parti interessate. Se si verificassero versamenti di reagenti, diluirli abbondantemente con
acqua prima di asciugare la superficie.
F. Adottare le normali precauzioni durante l’esecuzione di questo test4. La preparazione dei campioni digeriti
e decontaminati così come le fasi del test MTD devono essere effettuate osservando le norme di sicurezza
microbiologica di classe 25.
G. Usare esclusivamente il materiale compreso nel kit o materiale da laboratorio monouso.
H. Occorre decontaminare i banchi, le pipette e il materiale con una soluzione di candeggina diluita al 50%
(metà candeggina, metà acqua), seguendo le istruzioni fornite nel paragrafo “ PROCEDIMENTO ”. Lasciare
la candeggina in situ per 15 minuti, risciacquare con acqua e asciugare per eliminare i residui di candeggina.
I. Per condurre questo test è necessario impiegare pipette munite di puntali provvisti di filtro. Durante il
trasporto del lisato dalle provette di lisi alle provette di amplificazione, ricorrere a puntali extra-lunghi. Ad
ogni fase cambiare il puntale. Non passare sopra alle altre provette nel portaprovette. I puntali usati
devono essere immediatamente gettati in un apposito contenitore per rifiuti biologici.
J. Durante l’impiego di una micropipetta a volume fisso per l’erogazione dei reagenti, una volta introdotto il
lisato nelle provette non toccare la provetta con il puntale della pipetta al fine di minimizzare i rischi di contaminazione fra provette. I reagenti devono essere dispensati contro la parete della provetta per evitare
spruzzi. Un’erogazione estremamente accurata permetterà di ridurre i rischi di contaminazione crociata.
K. Non usare le stesse pipette per le tappe a monte e a valle dell’amplificazione.
L. Dopo la lettura dei risultati per mezzo del luminometro, decontaminare le provette e gettarle seguendo le
istruzioni fornite nei paragrafi “ PROCEDIMENTO ” e “ OSSERVAZIONI ” al fine di evitare la contaminazione del laboratorio attraverso gli amplicon.
M. Non riusare MAI i fogli autoadesivi e i tappi impiegati durante una fase precedente. I tappi devono essere
gettati in un apposito contenitore subito dopo la loro rimozione per evitare qualsiasi contaminazione
crociata. Le etichette devono essere perfettamente applicate sulla parte superiore delle provette di reazione.
N. Non coprire il bagno-maria durante le incubazioni, soprattutto nel caso in cui vengano impiegati tappi (la
condensa sul coperchio può costituire una fonte di contaminazione).
O. Per ottenere la massima precisione nei risultati, dopo aver aggiunto il Reagente di Selezione è necessario
operare una perfetta omogeneizzazione mediante Vortex.
P. Si raccomanda di utilizzare, per la fase HPA (Hybridization Protection Assay), un'area separata per ridurre
al minimo la contaminazione da amplicon del test. Questa area dedicata deve essere separata dall'area per
la preparazione dei campioni e dei reagenti e dall'area per l'amplificazione.
Q. Per aiutare a prevenire la contaminazione da amplicon delle aree di lavoro, il laboratorio deve disporre le
aree di lavoro secondo un flusso uni-direzionale. Per esempio, procedere dall'area di preparazione dei
campioni e dei reattivi all'area di amplificazione e quindi a quella dell'HPA. I campioni, i materiali ed i reattivi non possono essere riportati nell'area dove è stata eseguita la fase precedente. Inoltre il personale non
può tornare nelle precedenti aree di lavoro senza adeguate protezioni anti-contaminazioni. E' fortemente
raccomandato di non utilizzare, per l'esecuzione del test MTD, il locale di bio-sicurezza utilizzato per il trattamento dei campioni.
74
5/23/2011
9:11 AM
Page 75
INTRODUZIONE
Il test MTD impiega il metodo TMA (Transcription-Mediated Amplification) ed il metodo HPA (Hybridization
Protection Assay)2 al fine di identificare in maniera qualitativa l’RNA ribosomiale (rRNA) dei micobatteri del M.
tuberculosis complex. Il test MTD identifica l’RNA degli organismi coltivabili e non coltivabili. ll M. tuberculosis
complex comprende le sotto-specie M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti e M.
canetti (12, 13). Il test MTD identifica tutti i microrganismi del TB complex. Tuttavia, M. microti infetta unicamente gli animali; M. bovis viene trasmesso soltanto molto raramente dagli animali infetti all’essere umano; M.
africanum, dal canto suo, è responsabile della tubercolosi polmonare nell’Africa tropicale12; M. tuberculosis è
di gran lunga la sotto-specie più comune, responsabile di un tasso di morbilità significativamente alto in tutto il
mondo. Recentemente i CDC hanno diffuso dati relativi ad un aumento dei casi di tubercolosi nei soggetti colpiti da AIDS, fra gli immigrati e ad un incremento della trasmissione della patologia nelle popolazioni ad alto
rischio6,9. Si registra inoltre un aumento del numero di ceppi resistenti, ma anche multi-resistenti agli antitubercolari11. Nel campo della salute pubblica le conseguenze devono essere attentamente valutate.
I metodi di coltura tradizionali consentono l’osservazione della crescita di M. tuberculosis in un arco temporale variabile da 1 a 8 settimane7,10. Il test MTD, invece, permette di identificare l’rRNA dei micobatteri del M.
tuberculosis complex in 2,5 - 3,5 ore. Anche se non consente la realizzazione dell’antibiogramma, il test MTD
identifica il M. tuberculosis in modo rapido e affidabile. Ciò permette di gestire in modo ottimale i reparti di isolamento dei presidi ospedalieri al fine di iniziare immediatamente un trattamento adeguato e prevenire così la
propagazione della malattia grazie all’individuazione diretta e all’isolamento dei soggetti infetti3.
PRINCIPIO OPERATIVO
Il test MTD è un test suddiviso in due fasi (amplificazione e rivelazione) effettuate in una stessa provetta. In
primo luogo, mediante sonicazioneviene liberato l’RNA ribosomale dei micobatteri. Mediante il calore si
denatura e si rompe la struttura secondaria dell’rRNA. Il metodo di amplificazione Gen-Probe TMA amplifica
quindi un bersaglio specifico di rRNA micobatterico attraverso un intermedio di DNA ad una temperatura
costante di 42°C. In questo modo vengono prodotte molteplici copie di rRNA micobatterico (amplicon).
Le sequenze dell’amplicon di rRNA, specifiche dei micobatteri del M. tuberculosis complex, vengono poi identificate servendosi della metodica di ibridazione degli acidi nucleici Gen-Probe HPA2. Il Reagente di
Ibridazione del test MTD contiene una sonda a DNA a catena singola collegata ad un marker chemioluminescente. Questa sonda è complementare alle sequenze di RNA specifiche dei micobatteri del M. tuberculosis
complex. La sonda contenente queste sequenze specifiche forma degli ibridi stabili RNA-DNA. Dopo la fase di
selezione, il segnale luminoso emesso dagli ibridi viene misurato mediante un luminometro GEN-PROBE
LEADER.
REAGENTI
(Kit da 50 test)
I reagenti per il test MTD vengono forniti come di seguito indicato :
Volume
TRAY DEI REAGENTI PER AMPLIFICAZIONE
Tampone di Diluizione dei Campioni (SDB) ....................................................................................1 x 2,5 ml
Soluzione tampone Tris contenente < 3 % di detergente
Reagente di Amplificazione (A) ..........................................................................................................1 x 3 ml
Acidi nucleici liofilizzati in una soluzione tampone Tris contenente
il 5 % di agente legante
(dopo ricostituzione)
Tampone di amplificazione (AB) ........................................................................................................1 x 3 ml
Soluzione acquosa contenente conservanti
Reagente di amplificazione oleoso (olio per la reazione di amplificazione) (O) ..............................1 x 10 ml
Olio al silicone
Reagente Enzimatico (E) ................................................................................................................1 x 1,5 ml
Transcriptasi inversa e RNA polimerasi liofilizzate in una soluzione tampone
75
Italiano
Nome del reagente
5/23/2011
9:11 AM
Page 76
HEPES contenente < 10 % di agente legante e > 15 mM di N-Acetil-L-Cisteina
Tampone di Diluizione Enzimatica (tampone di diluizione degli enzimi) (EDB) ..............................1 x 1,5 ml
Soluzione tampone Tris contenente un surfactante e glicerolo
TRAY DEI REAGENTI PER IBRIDAZIONE
Reagente di Ibridazione (H)................................................................................................................1 x 6 ml
< 100 ng/flacone di sonda a DNA non infettiva associata ad un marker
chemioluminescente, liofilizzata, in una soluzione tampone succinato
contenente un agente legante e un detergente
Tampone di Ibridazione (HB) ..............................................................................................................1 x 6 ml
Soluzione tampone succinato contenente < 4 % di detergente
Reagente di Selezione (S)................................................................................................................1 x 15 ml
Soluzione tampone borato contenente un surfactante
Provette di Lisi (LT) ................................................................................................................2 x 25 provette
Sfere di vetro, agente legante
CONSERVAZIONE
A. Le soluzioni o i componenti non ricostituiti sottoindicati devono essere conservati ad una temperatura compresa tra 2° e 25°C e possono essere impiegati fino alla data di scadenza indicata:
Tampone di Diluizione dei Campioni (SDB)
Reagente di Amplificazione (A)
Tampone di Amplificazione (AB)
Reagente Enzimatico (E)
Tampone di Diluizione Enzimatico (EDB)
Reagente di Ibridazione (H)
Il Reagente di Amplificazione ricostituito (A) è stabile per 2 mesi se conservato a temperature comprese tra 2°
e 25°C. Il Reagente di Ibridazione (H) e il Reagente Enzimatico (E) sono stabili per un mese ad una temperatura compresa tra 2° e 25°C dopo ricostituzione o per due mesi a una temperatura uguale o inferiore a -20°C
nel caso in cui siano aliquotati e congelati il giorno della loro ricostituzione. Le aliquote congelate devono
essere impiegate il giorno in cui vengono scongelate. Non utilizzare congelatori a sbrinamento automatico.
B. I seguenti componenti devono essere conservati ad una temperatura compresa tra 2° e 25°C e possono
essere impiegati fino alla data di scadenza indicata :
Reagente di amplificazione oleoso (O)
Tampone di Ibridazione (HB)
Reagente di Selezione (S)
Provette di lisi (LT)
PRELIEVO, CONSERVAZIONE, TRASPORTO E TRATTAMENTO DEI CAMPIONI
Prelievo e conservazione del campione:
Prima del trasporto e del trattamento i campioni devono essere trasferiti in contenitori di plastica sterili e conservati ad una temperatura compresa tra 2° e 25°C. I campioni utilizzati nelle valutazioni cliniche erano staticonservati per meno di 4 giorni (in genere meno di 24 ore) prima del relativo trattamento.
76
5/23/2011
9:11 AM
Page 77
Trasporto :
Trasportare i campioni in laboratorio il più rapidamente possibile ottemperando alle normative in vigore.
Trattamento (decontaminazione e concentrazione) :
I campioni con elevata concentrazione ematica non devono essere sottoposti al test MTD. Questo test è stato
progettato e sviluppato per identificare l’RNA dei micobatteri del M. tuberculosis complex ricorrendo a campioni preparati in base ai metodi di decontaminazione NALC-NaOH o NaOH, impiegando dall’1% all’1,5% di
NaOH per un tempo variabile da 15 a 20 minuti e una centrifugazione ad una velocità superiore o uguale a
3000 g7.
Conservazione dei campioni trattati :
I campioni possono essere conservati, prima del test, per un massimo di 3 giorni a 2° - 8°C. Possono essere
anche conservati ad una temperatura compresa fra -20° e -70°C per un massimo di 6 mesi. Non utilizzare congelatori a sbrinamento automatico.
MATERIALE
A. Materiale fornito
Composizione del kit (bioMérieux cod. 39006 / Gen-Probe
Cat. N. 1001F)
50 test
TRAY DEI REAGENTI PER AMPLIFICAZIONE
Tampone di Diluizione del Campione (SDB)
1 x 2,5 ml
Reagente di Amplificazione (A)
1 x 3 ml (dopo ricostituzione)
Tampone di Ricostituzione (AB)
1 x 3 ml
Reagente oleoso (olio per reazione di amplificazione) (O)
1 x 10 ml
Reagente Enzimatico (E)
1 x 1,5 ml (dopo ricostituzione)
Tampone di Diluizione Enzimatico (EDB)
1 x 1,5 ml
TRAY DEI REAGENTI PER IBRIDAZIONE
Reagente di Ibridazione (H)
1 x 6 ml (dopo ricostituzione)
1 x 6 ml
Reagente di Selezione (S)
1 x 15 ml
Provette di lisi (LT)
2 x 25 provette
Fogli autoadesivi
1 pacchetto
B. Materiale necessario ma non fornito :
Micropipette con capacità di erogazione 25 μl, 50 μl, 100 μl, 200 μl, 300 μl e 450 μl
Vortex
Acqua sterile (filtrata o autoclavata)
Provette di coltura
Biglie di vetro sterili da 3 mm
Provette per microcentrifuga con tappi a vite
Porta-provette per provette di reazione
Puntali per pipetta provvisti di filtro (1000 μl)
Controlli Positivi di Amplificazione (ad es. M. tuberculosis, ATCC 25177 o ATCC 27294)
Controlli Negativi di Amplificazione (ad es. M. gordonae, ATCC 14470 o M. terrae, ATCC 15755)
Candeggina (soluzione di ipoclorito di sodio al 5,25 %)
77
Italiano
Tampone di Ibridazione (HB)
5/23/2011
9:11 AM
Page 78
Fogli plastificati per la protezione dei banconi
Micropipette a volume fisso Eppendorf
C. Materiale supplementare disponibile presso il vostro distributore Gen-Probe:
Sonicatore GEN-PROBE (bioMérieux cod. 39409 / Gen-Probe Cat. N. 901104/T460)
Incubatori GEN-PROBE (42°C ± 1°C, 60°C ± 1°C, 95°C ± 5°C)A (bioMérieux cod. 39405, 39406, 39407 /
Gen-Probe Cat. N. 3396, 3397, 3398)
Luminometro GEN-PROBE LEADER 50i (bioMérieux cod. 39400 / Gen-Probe Cat. N. 103100i/3100i)
Kit di Reagenti di Rivelazione GEN-PROBE (bioMérieux cod. 39300 / Gen-Probe Cat. N. 201791/1791)
Controlli dell'Amplificazione MTD GEN-PROBE (bioMérieux cod. 39223 / Gen-Probe Cat. N. 301043F/
1043F
Porta-provette per sonicatore GEN-PROBE (bioMérieux cod. 39313 / Gen-Probe Cat. N. 104027/4027)
Porta-provette per provette di reazione (bioMérieux cod. 39311 / Gen-Probe Cat. N. 3994)
Puntali lunghi provvisti di filtro per pipetta (1250 μl) (bioMérieux cod. 39315 / Gen-Probe Cat. N. 104316/
4316)
Provette in polipropilene da 12 x 75 mm (bioMérieux cod. 39308 / Gen-Probe Cat. N. 102440/2440)
Tappi in polipropilene per provette da 12 x 75 mm (bioMérieux cod. 39320 / Gen-Probe Cat. N. 400713)
PROCEDIMENTO
Controlli
I ceppi impiegati per il Controllo Positivo di Amplificazione devono appartenere al M. tuberculosis complex,
come il ceppo non virulento H37Ra (ATCC 25177) od il ceppo virulento H37Rv (ATCC 27294). I ceppi impiegati per il Controllo Negativo di Amplificazione devono appartenere ai MOTT, come il M. gordonae (ATCC
14470) od il M. terrae (ATCC 15755). I controlli devono essere preparati prima di iniziare l'analisi dei campioni.
I controlli devono contenere 25 - 150 CFU in 50 μl in modo da arrivare ad una concentrazione finale nel test di
1 - 10 CFU. Questa concentrazione può essere verificata tramite coltura. Questi controlli saranno utilizzati per
la preparazione dei Campioni di Controllo (Vedere Preparazione dei campioni).
1. Preparazione dei controlli consigliata
a. Inserire da 3 - 5 biglie di vetro da 3 mm all’interno di una provetta per coltura pulita.
b. Aggiungere 1 - 2 ml di acqua sterile. Prelevare diverse volte mediante un’ansa (1 μl) la coltura
appropriata. Richiudere la provetta e vortexarla più volte a velocità elevata.
c. Lasciare riposare la sospensione per 15 minuti.
d. Trasferire il supernatante in una provetta di coltura pulita. Regolare la torbidità ad 1 McFarland servendosi di un nefelometro.
e. Eseguire una diluizione 1:100 della sospensione mettendo 100 μl della sospensione 1 McFarland in 10
ml di acqua sterile. Chiudere e vortexare. Questa è la diluzione 1.
f. Eseguire una seconda diluizione 1 : mettendo 100 μl della diluizione 1 in 10 ml di acqua sterile.
Chiudere e vortexare.Questa è la diluizione 2; dovrebbe contenere approssimativamente 25 - 150 CFU
in 50 ml.
Suddivisione in aliquote e conservazione dei Controlli
a. Le diluizioni, suddivise in aliquote monouso (500 μl), vanno distribuite in provette da microcentrifuga con
tappo a vite e si conservano per 6 mesi se congelate a -20°C o per 1 anno se congelate a -70°C. Non utilizzare congelatori a sbrinamento automatico.
Testare il controllo positivo per il M. tuberculosis raccomandato consente di evidenziare unicamente gli errori
78
5/23/2011
9:11 AM
Page 79
grossolani dei reagenti. Il controllo positivo è concepito per monitorare l'effetto interferente dell'eccesso di
NaOH e di tampone fosfato sui reagenti utilizzati durante il procedimento. Variazioni del procedimento in termine di tempo o di temperatura che possono alterare l'efficienza dell'amplificazione non possono essere rilevate tramite il controllo raccomandato. Dei controlli addizionali possono essere testati in accordo con le lineeguida o con specifici requisiti.
2. Controllo di inibizione dei campioni
Quando il test MTD risulta negativo, ma il medico propende per una diagnosi di tubercolosi, è possibile verificare la presenza di eventuali inibitori agendo come segue:
a. Dispensare 50 μl di Tampone di Diluizione del Campione in 2 provette di lisi.
b. Dispensare 50 μl di Controllo Positivo di Amplificazione e 450 μl di campione nella I° provetta.
Dispensare 450 μl dello stesso campione nella II°provetta. Condurre il test seguendo il
solito protocollo.
Interpretazione
Se la quantità di RLU (Relative Light Units) misurata dal luminometro nella I° provetta è > 30.000 RLU, il
campione non contiene inibitori dell’amplificazione e non contiene apparentemente il bersaglio da amplificare. Se la quantità di RLU ottenuta nella I° provetta è < 30.000 RLU, il campione contiene un inibitore dell’amplificazione e deve essere testato un altro campione. Se il test ripetuto nella II° provetta è positivo, il
risultato del test MTD può essere dichiarato positivo. La spiegazione più plausibile per questo tipo di risultato è la variabilità legata al campione: il primo prelievo non conteneva alcun bersaglio da amplificare, contrariamente al secondo. La quantità di RLU nella II° provetta può essere positiva o negativa a seconda che
il prelievo contenga o meno rRNA di micobatteri appartenenti al M. tuberculosis complex.
3. Controllo della contaminazione del laboratorio
Per rivelare una eventuale contaminazione da amplicon di M. tuberculosis nel laboratorio, procedere nel
modo seguente:
a. Dispensare 1 ml di acqua sterile in una provetta pulita. Inumidire un tampone sterile in poliestere o in
dacron con acqua sterile.
b. Sfregare il tampone sul banco o sul materiale da testare.
c. Inserire il tampone nella provetta e mescolare lentamente. Estrarre il tampone premendolo contro la
parete della provetta per strizzarlo accuratamente. Gettare il tampone in un recipiente contenente una
soluzione di candeggina diluita al 50% (metà candeggina, metà acqua).
e. Per l’amplificazione e l’identificazione attenersi alle istruzioni del paragrafo “ PROCEDIMENTO ”.
Interpretazione
Se i risultati sono > 30.000 RLU, la superficie testata è contaminata e deve essere decontaminata mediante
trattamento con candeggina; a questo scopo seguire le istruzioni del paragrafo “ PROCEDIMENTO :
Preparazione del materiale ”. Nel caso in cui si sospetti una contaminazione del bagno-maria, procedere
come sopra indicato utilizzando 25 μl di acqua del bagno-maria che non contenga alcun prodotto
antisettico.
Preparazione del materiale
1. Per il trasferimento ottimale dell'energia sonica, prima di ogni sonicazione l'acqua contenuta nel sonicatore
deve essere accuratamente sgassata eseguendo il procedimento seguente:
a. Riempire il serbatoio del sonicatore con acqua corrente a temperatura ambiente fino ad 1 cm circa dal
bordo.
b. Per sgassare completamente l’acqua, far funzionare il sonicatore per 15 minuti.
79
Italiano
d. Dispensare 25 μl della soluzione così ottenuta in una provetta di amplificazione contenente 50 μl di
Reagente di Amplificazione e 200 μl di olio per la reazione di amplificazione.
5/23/2011
9:11 AM
Page 80
2. Impostare un incubatore ad una temperatura di 95° ± 5°C, un incubatore o un bagno-maria a
60° ± 1°C e un incubatore o un bagno-maria a 42° ± 1°C.
3. Prima di iniziare l’analisi pulire le superfici di lavoro, il materiale e le pipette con una diluizione 1/2 di candeggina. La candeggina deve agire almeno per 15 minuti. Risciacquare la superficie di lavoro con acqua
per eliminare le tracce di candeggina. Coprire la superficie su cui verrà realizzato il test servendosi di un
foglio protettivo plastificato per banconi.
4. Preparare il luminometro GEN-PROBE LEADER. Assicurarsi che vi sia una quantità sufficiente di Reagenti
di Rivelazione I e II per completare i test e che le provette siano correttamente inseriti. Consultare il manuale d’uso del luminometro per le istruzioni relative alla sostituzione dei Reagenti di Rivelazione (venduti a
parte).
Preparazione del reagente
Ricostituire il Reagente di Amplificazione liofilizzato (A) nel suo flacone (50 test) utilizzando 3 ml di Tampone
di Amplificazione (AB). Omogeneizzare servendosi di un Vortex. Far riposare il reagente ricostituito a temperatura ambiente fino a quando non assuma una colorazione chiara. Il Reagente di Amplificazione ricostituito
può essere conservato per 2 mesi ad una temperatura compresa tra 2° e 25°C. La soluzione deve essere
riportata a temperatura ambiente prima dell’uso.
Preparazione dei campioni
1. Contrassegnare un numero di provette di lisi (LT) sufficiente per testare i campioni ed 1 di ciascuno dei
Controlli Positivo e Negativo di Amplificazione o dei Controlli del Trattamento del Campione Positivo e
Negativo. Togliere e conservare i tappi.
2. Pipettare 50 μl del Tampone di Diluizione dei Campioni (SDB) in tutte le provette di lisi (LT).
Eseguire quanto indicato nei paragrafi A e B per i controlli e C per i campioni.
A. Controlli del Trattamento dei Campioni:
Per ogni controllo aggiungere, in una provetta per l'analisi dei campioni, 1 ml della soluzione
NALC/NaOH e 3 ml del tampone fosfato utilizzati per il trattamento degli espettorati ad 1 ml di acqua
sterile.
i. Mescolare con il vortex.
ii. Trasferire 450 μl della soluzione NALC/NaOH/tampone fosfato e 50 μl della diluizione dei ceppi di
Controllo nella corrispondente provetta di lisi (LT) contrassegnata.
B. Se vengono utilizzati i Controlli dell'Amplificazione, trasferire 450 μl del Controllo dell'Amplificazione dal
suo contenitore nella corrispondente provetta di lisi (LT) contrassegnata.
C. Campione: Trasferire 450 μl del campione decontaminato ed accuratamente vortexato dal suo contenitore alla corrispondente provetta di lisi (LT) contrassegnata.
3. Dopo aver aggiunto tutti i campiono, tappare nuovamente le provette di lisi (LT).
4. Vortexare per 3 secondi.
Lisi dei campioni
1. Inserire le provette di lisi nel porta-provette del sonicatore in modo che la miscela di reazione sul fondo
delle provette venga completamente sommersa, mantenendo i tappi fuori dall’acqua. Posizionare il portaprovette nel sonicatore. IN NESSUN CASO LE PROVETTE DEVONO TOCCARE IL FONDO O LE
PARETI DEL SONICATORE.
2. Fare funzionare il sonicatore per 15 minuti, avendo cura di non superare i 20 minuti. I campioni ed i controlli trattati con ultrasuoni sono ora indicati " lisati ”. NON USARE ILVORTEX PER AGITARE I LISATI.
Amplificazione
1. Contrassegnare le provette di polipropilene per l’amplificazione (12 x 75 mm) scrivendo sulla parte
80
5/23/2011
9:11 AM
Page 81
superiore delle stesse i numeri di identificazione (corrispondenti a quelli scritti sulle provette di lisi).
Analogamente, contrassegnare le provette di amplificazione per i Controlli di Amplificazione Positivo e
Negativo.
2. Erogare 50 μl di Reagente di Amplificazione ricostituito sul fondo di ogni provetta servendosi di una
micropipetta a volume fisso Eppendorf. Aggiungere 200 μl di olio per reazione di amplificazione (O) in ogni
provetta utilizzando una micropipetta ripetitiva.
3. NON USARE IL VORTEX PER I LISATI. Trasferire 25 μl di ogni lisato sul fondo della rispettiva provetta di
amplificazione servendosi, per ogni lisato, di un nuovo puntale dotato di filtro. I lisati rimanenti possono
essere conservati ad una temperatura compresa tra 2° e 25°C per 7 giorni o, congelati ad una temperatura
uguale o inferiore a -20°C, per 1 mese. Non utilizzare congelatori a sbrinamento automatico. Nel caso in
cui debbano essere effettuati altri test sui lisati, fare in modo che prima siano portati a temperatura
ambiente. NON USARE IL VORTEX PER I LISATI.
4. Incubare le provette in un incubatore a 95° C per 15 minuti, senza superare però i 20 minuti.
5. Preparare la Soluzione Enzimatica aggiungendo 1,5 ml di Tampone di Diluizione Enzimatica (EDB) al
Reagente Enzimatico liofilizzato (E). Non vortexare. Il Reagente Enzimatico ricostituito è stabile per un
mese ad una temperatura di 2° - 8°C o per due mesi ad una temperatura uguale od inferiore a -20°C nel
caso in cui sia stato aliquotato e congelatoB il giorno della sua ricostituzione. Se il test verrà effettuato con
aliquote di enzimi congelati, riportarle in primo luogo a temperatura ambiente; non scongelare le aliquote
incubandole a temperatura elevata. Per omogeneizzare le aliquote scongelate, aspirare e rilasciare lentamente la soluzione servendosi di una micropipetta a volume fisso prima di aggiungerla alle provette di
amplificazione.
6. Trasferire le provette nell’incubatore o nel bagno-maria a 42° ± 1°C e lasciare che si raffreddino per 5
minuti. EVITARE CHE LE PROVETTE RAGGIUNGANO LA TEMPERATURA AMBIENTE. NON COPRIRE
IL BAGNO-MARIA.
7. Quando le provette raggiungono i 42°C aggiungere in ognuna, con una micropipetta ripetitiva a siringa, 25
μl di Reagente Enzimatico. Mescolare delicatamente. Incubare a 42°C per 30 minuti, senza oltrepassare i
60 minuti. In questa fase di incubazione è necessario usare fogli autoadesivi o tappi. NON COPRIRE IL
BAGNO-MARIA.
Ibridazione
1. Ricostituire il Reagente di Ibridazione liofilizzato (H) con 6 ml di Tampone di Ibridazione (HB). Il Reagente
di Ibridazione (H) e il Tampone di Ibridazione (HB) devono essere portati a temperatura ambiente prima
della ricostituzione. Se il Tampone di Ibridazione (HB) è stato refrigerato, riscaldarlo a 60°C e mescolarlo
lentamente per assicurare una perfetta solubilizzazione di tutti i componenti. Vortexare fino a che la
soluzione non diventa chiara (questa operazione può richiedere sino ad un minuto) per ottenere la completa solubilizzazione di tutti gli elementi. Il Reagente di Ibridazione ricostituito può essere usato per un mese
ad una temperatura compresa tra 2° e 8°C o per due mesi ad una temperatura uguale od inferiore a -20°C
nel caso in cui sia stato aliquotato e congelatoC il giorno della sua ricostituzione. Se il Reagente di
Ibridazione ricostituito è stato refrigerato o congelato, riscaldarlo a 60°C e agitarlo lentamente al fine di
ottenere una perfetta solubilizzazione di tutti i componenti.
2. Dispensare 100 μl di Reagente di Ibridazione ricostituito in ogni provetta servendosi di una micropipetta
ripetitiva a siringa. Coprire le provette con fogli autoadesivi o con tappi. Vortexare 3 volte le provette a
velocità media per almeno 1 secondoD. Per ottenere una buona omogeneizzazione delle provette di
reazione, tenerle in posizione verticale e lasciare che durante l'agitazione la miscela raggiunga la metà
superiore della parete della provetta (evitare qualsiasi contatto della miscela di reazione con i fogli autoad81
Italiano
8. Dopo il periodo di incubazione della durata di 30 minuti, le provette possono essere conservate 2 ore ad
una temperatura compresa tra 2° e 8° C o, congelate a -20°C, fino al giorno seguente. Nel caso in cui
vengano conservate a -20°C fino all’indomani, le provette devono essere completamente scongelate a temperatura ambiente o al massimo a 60°C prima della fase di ibridazione e devono essere chiuse con i tappi
piuttosto che con i fogli autoadesivi.
5/23/2011
9:11 AM
Page 82
esivi o con i tappi per prevenire eventuali contaminazioni). Dopo la corretta esecuzione dell’omogeneizzazione, la miscela dovrà assumereuna colorazione gialla uniforme.
3. Incubare a 60°C per 15 minuti, senza superare però i 20 minuti, in un incubatore o in un bagno-maria.
Selezione
1. Prima di iniziare il test, il Reagente di Selezione (S) deve essere portato a temperatura ambiente. Estrarre
le provette dal bagno-maria o dall’incubatore a 60°C e aggiungere 300 μl di Reagente di Selezione (S) con
una micropipetta ripetitiva a siringa. Coprire le provette con fogli autoadesivi o con tappi. Vortexare 3 volte
a velocita media e per almeno 1 secondoD. Per ottenere una buona omogeneizzazione delle provette di
reazione, tenerle in posizione verticale e lasciare che durante l'agitazione la miscela raggiunga la metà
superiore della parete della provetta (evitare qualsiasi contatto della miscela di reazione con i fogli autoadesivi o con i tappi per prevenire un’eventuale contaminazione). Dopo la corretta esecuzione dell’omogeneizzazione, la miscela dovrà assumere una colorazione rosa uniforme.
2. Incubare a 60°C per 15 minuti, senza superare però i 16 minuti, in un incubatore o in un bagno-maria.
3. Estrarre le provette dal bagno-maria o dall’incubatore. Lasciare le provette a temperatura ambiente almeno
per 5 minuti, senza oltrepassare il limite di un’ora. Rimuovere i fogli autoadesivi od i tappi proprio prima
della lettura.
Lettura
1. Programmare il protocollo giusto sul luminometro. Impostare una lettura a 2 secondi.
2. Per eliminare tutti i residui dalla superficie delle provette, asciugarle con carta assorbente inumidita, priva
di lanugine, e inserirle successivamente nel luminometro, attenendosi alle istruzioni fornite nel manuale
d’uso. Le provette devono essere lette entro un’ora dalla fase di selezione.
3. Una volta conclusa l’analisi, estrarre le provette dal luminometro.
4. Dopo la lettura delle provette, riempirle accuratamente con una soluzione di candeggina diluita al 1:10 (un
volume di candeggina + 9 volumi di acqua ), servendosi di una spruzzetta. Il contatto con la candeggina
deve durare almeno un’ora; successivamente, eliminare le provette per prevenire ogni possibile contaminazione da amplicon del laboratorio.
5. I porta-provette devono essere decontaminati immergendoli completamente in una soluzione di candeggina diluita 1:2 per almeno 15 minuti. Successivamente dovranno essere risciacquati con acqua e asciugati
o esposti all’aria.
6. Decontaminare il laboratorio e il materiale con una soluzione di candeggina diluita al 1:2.
Ripetizione del test
1. Nel caso in cui occorra ripetere il test , riportare i lisati preparati a temperatura ambiente. NON USARE IL
VORTEX PER I LISATI.
2. ATTENERSI AL PROCEDIMENTO iniziando dalla fase di amplificazione.
OSSERVAZIONI
A. Reagenti
1. Il Reagente Enzimatico non deve rimanere a temperatura ambiente per più di 15 minuti dopo la
ricostituzione.
2. Il Tampone di Ibridazione (HB) può precipitare. Riscaldare e agitare il tampone di Ibridazione (HB) o il
Reagente di Ibridazione ricostituito a 60°C per sciogliere il precipitato.
B. Temperatura
1. L’amplificazione, l’ibridazione e la selezione sono reazioni temperatura-dipendenti, di conseguenza è
assolutamente necessario mantenere il bagno-maria o l’incubatore alle temperature prestabilite.
82
5/23/2011
9:11 AM
Page 83
2. Prima di aggiungere il Reagente Enzimatico, lasciare raffreddare le provette per 5 minuti affinché raggiungano i 42°C. Questa temperatura permette di ottenere performance ottimali di amplificazione.
3. Il rispetto della temperatura è fondamentale per la fase di amplificazione (42° ± 1°C).
C. Tempi
È assolutamente necessario rispettare i tempi indicati nel paragrafo “ PROCEDIMENTO ”.
D. Bagno-maria
1. Il livello dell’acqua nel bagno-maria deve essere tale da garantire che il fondo delle provette sia sempre
immerso, evitando comunque che l’acqua penetri nelle provette.
2. Durante la fase di amplificazione, il bagnomaria non deve essere coperto per evitare il rischio che la
condensa possa cadere sopra o all’interno delle provette.
E. Agitazione mediante Vortex
Durante le fasi di ibridazione e di selezione è assolutamente necessario avere a disposizione una miscela
omogenea, in particolare dopo l’aggiunta del Reagente di Ibridazione (H) ricostituito (la miscela si colora
uniformemente di giallo) e del Reagente di Selezione (S) (la miscela si colora uniformemente di rosa).
L’agitazione con il Vortex permette di ottenere una sospensione uniforme. Quando i reagenti vengono
introdotti in una provetta di reazione ed esposti ad una fonte di energia esterna, si crea una rapida
rotazione della soluzione attorno all’asse della provetta. Il risultato è una sospensione uniforme. Per realizzare una corretta omogeneizzazione con il Vortex, le provette devono essere impugnate nella parte superiore e tenute in posizione verticale Durante l'agitazione i liquido deve raggiungere la metà superiore della
provetta Durante le fasi di ibridazione e di selezione questa agitazione deve esser e ripetuta per 3 volte
vortexando per almeno 1 ogni volta.
INTERPRETAZIONE DEL TEST
I risultati del test AMPLIFIED PER LA RICERCA DIRETTA DEI MICOBATTERI DEL MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS COMPLEX vengono interpretati nel modo seguente: un risultato è negativo per un segnale
< 30.000 RLU, è positivo quando il segnale è > 500.000 RLU ed è dubbio per valori di RLUcompresi tra
30.000 e 499.999 RLU. Quando il risultato iniziale dell'esame èdubbio, il test MTD deve essere ripetuto partendo dal lisato conservato. Il campione va considerato positivo se il risultato della ripetizione partendo dal
lisato è > 30.000 RLU.
A. Controllo di Qualità e accettabilità dei risultati
Controllo Negativo di Amplificazione < 20.000 RLU
Controllo Positivo di Amplificazione > 500.000 RLU
Controllo Negativo del Trattamento del Campione < 20.000 RLU
Controllo Positivo del Trattamento del Campione > 500.000 RLU
Nel caso in cui i valori dei controlli non corrispondano ai valori sopra indicati,i risultati dei
campioni clinici non sono validi e non possono essere refertati Vedere il paragrafo
“ SOLUZIONE DI EVENTUALI PROBLEMI ” per maggiori informazioni.
Ogni laboratorio deve stabilire valori soglia per i controlli in base ai risultati ottenuti per ogni serie di controlli.
B. Risultati del test per i campioni clinici
Se i valori dei controlli non corrispondono ai valori previsti,i risultati dei campioni clinici non sono validi e
non possono essere refertati.
> 500.000 RLU positivo per l’rRNA dei micobatteri del M. tuberculosis complex
83
Italiano
I controlli devono dare i seguenti risultati :
5/23/2011
9:11 AM
Page 84
< 30.000 RLU negativo per l’rRNA dei micobatteri del M. tuberculosis complex
REFERTAZIONE DEI RISULTATI
Nel caso in cui il risultato del test MTD sia > 500.000 RLU,refertare i risultati nel modo seguente :
Refertazione :
Rilevato rRNA del Mycobacterium tuberculosis complex.
Esame microscopico (positivo o negativo).
Informazioni aggiuntive :
Coltura per la ricerca di BAAR in corso. Il campione può
contenere sia micobatteri non tubercolari (MOTT) che
il M. tuberculosis oppure soltanto il M. tuberculosis.
Questo test non può costituire l'unica base per
diagnosticare la tubercolosi.
Il valore predittivo positivo per un paziente, se l'esame
microscopico è negativo, è più basso rispetto a quello
di pazienti in cui sia risultato positivo. Questo è
particolarmente importante nei test sulla popolazione
quando la prevalenza della tubercolosi è bassa ed i
valori predittivi positivi dei metodi diagnostici è di
conseguenza ridotto.
Se il risultato del test MTD è < 30.000 RLU, refertare i risultati nel modo seguente:
Refertazione :
Non rilevato rRNAdel Mycobacterium tuberculosis complex.
Esame microscopico (positivo o negativo).
Informazioni aggiuntive :
Non è stato rilevato rRNA di micobatteri del Mycobacterium
tuberculosis complex.Coltura per la ricerca di BAAR in
corso. Il campione non contiene apparente mente micobatteri del M. tuberculosis complex, ma il risultato puo essere
un falso negativo se la quantità di M. tuberculosis è basa
che il campione contenga o meno micobatteri non tubercolari - o se il campione contiene inibitori che interferiscono
sull'esame. Se c'è il sospetto di una tubercolosi in fase attiva o si sospetta la presenza di inibitori, si raccomanda di
ripetere il test su un nuovo prelievo del
paziente.
LIMITI DEL TEST
Questo test è destinato esclusivamente la ricerca dei micobatteri del M. tuberculosis complex a partire da
campioni preparati secondo le procedure NALC-NaOH o NaOH raccomandate dal CDC7. Questo test può
essere impiegato soltanto con campioni preparati a partire da escreati (indotti od espettorati), prelievi
bronchiali (lavaggi bronco-alveolari o broncoaspirati) ovvero aspirati tracheali.
Il test MTD è specifico per i micobatteri del M. tuberculosis complex, vale a dire M. tuberculosis, M. bovis, M.
bovis BCG, M. africanum, M. microti e M. canetti ma non consente di differenziare queste specie fra loro.
M.celatum e M. terrae-like possono provocare reazioni crociate se presenti in concentrazioni superiori a 30
CFU per test. Tuttavia, M. celatum e M. terrae-like vengono raramente isolati a livello clinico.
La qualità dei risultati del test è correlata alla qualità del prelievo e del suo trasporto, alla variabilità del prelievo dei campioni, agli errori tecnici del laboratorio, agli errori di identificazione dei campioni e agli errori di
trascrizione dei risultati. Un test negativo non esclude la presenza nel campione di un micobatterio del M.
tuberculosis complex.
84
5/23/2011
9:11 AM
Page 85
VALORI ATTESI
A. Gamma dei valori di controllo rilevati durante le prove cliniche
La gamma dei valori ottenuti per i controlli (RLU) durante le prove cliniche effettuate su 7 siti è stata la
seguente:
B. Gamma dei valori ottenuti in campioni clinici
Per i 127 campioni MTD-positivi, i valori erano compresi fra 35.777 e > 2.000.000 RLU.
Per i 577 campioni MTD-negativi, i valori erano compresi fra 573 e 19.176 RLU.
La distribuzione frequenziale dei risultati in RLU per tutti questi campioni, dopo risoluzione delle discordanze, è di seguito indicata : la risoluzione delle discordanze si basa sull’analisi di altri campioni, positivi alla
coltura, provenienti da uno stesso paziente e/o sulla diagnosi finale del medico curante.
Italiano
85
5/23/2011
9:11 AM
Page 86
PERFORMANCE
A. Valutazione clinica
Le performance del test MTD nella sua forma originale sono state valutate durante delle prove cliniche
condotte in sei laboratori confrontando i risultati ottenuti mediante vetrino con i risultati della coltura su
6.079 campioni provenienti da 2.609 pazienti. Di questi campioni, 4.000 provenivano da 1.898 pazienti che
non erano sottoposti ad un trattamento anti-tubercolare. I sei laboratori rappresentavano zone geografiche
diverse: cinque nosocomi di grandi città statunitensi che disponevano di un reparto specializzato per la
tubercolosi e un laboratorio pubblico.
Le performance del test MTD nella sua forma attuale sono state valutate su sette laboratori, mettendo a
confronto i risultati del test MTD con i risultati della coltura. I sette laboratori che partecipavano al test rappresentavano zone geografiche diverse: sei presidi ospedalieri di grandi città statunitensi che disponevano
di un reparto specializzato per la tubercolosi e un laboratorio pubblico nazionale di micobatteriologia. I
campioni saggiati provenivano da pazienti che non erano sottoposti a trattamento anti-tubercolare. 132
hanno evidenziato risultati positivi in coltura per i micobatteri dell’M. tuberculosis complex. Il test MTD ha
identificato 119 di questi campioni di coltura positivi ; 7 campioni contenevano micobatteri non tubercolari
oltre a M. tuberculosis.
I pazienti con sospetta tubercolosi polmonare attiva e non sottoposti a trattamento sono stati inclusi in
questo studio. La prevalenza totale dei pazienti che hanno evidenziato una coltura positiva al M. tuberculosis era del 20,5%.
Sono state determinate, per ogni paziente, una sensibilità media del 93,3% e una specificità media del
99,1% rispetto alla coltura. Per ogni campione sono state rilevate una sensibilità media del 90,6% e una
specificità media del 99,6% rispetto alla coltura. La tabella sottoindicata mostra la sensibilità, la specificità,
il valore predittivo positivo (VPP) e il valore predittivo negativo (VPN) con intervalli di confidenza del 95%
per le stime di performance. Tutti i dati riportati sono quelli ottenuti dopo risoluzione delle discordanze
basata sull’analisi di altri campioni, positivi e negativi in coltura, provenienti dallo stesso paziente e/o sulla
diagnosi finale del medico curante.
86
5/23/2011
9:11 AM
Page 87
Sui 564 campioni negativi sia alla cultura che con l’MTD per i micobatteri del M. tuberculosis complex, 114
campioni erano risultati positivi per i MOTT alla coltura, 64 provenivano da pazienti per i quali in altri
campioni erano stati isolati con la coltura dei MOTT e 169 provenivano da pazienti in cui con l'esame
colturale non era stato isolato alcun micobatterio.
B. Precisione
Sono stati testati, in tre laboratori, pannelli di campioni composti da 2 campioni negativi, 2 campioni
scarsamente positivi (ª 100 CFU/ test) e 2 campioni moderatamente positivi (= 1000 CFU/ test). I campioni
positivi sono stati preparati aggiungendo quantità note di M. tuberculosis a un pool di campioni moderatamente inibitori. I campioni, così come i controlli di amplificazione positivo e negativo, sono stati testati sui
tre laboratori, in triplo cieco, due volte al giorno per 3 giorni.
La variabilità dei risultati non è risultata significativa tra un laboratorio e l’altro o da un giorno all’altro e
quindi i risultati dei tre laboratori hanno potuto essere consolidati e presentati come di seguito indicato. I
valori misurati in RLU sono limitati dalla risoluzione del fotomoltiplicatore del luminometro. Per questa
ragione i valori superiori a 2.000.000 RLU vengono riportati a 2.000.000 RLU. Non vengono indicati né le
deviazioni standard, né i coefficienti di variazione.
Italiano
C. Riproducibilità
Lo studio di riproducibilità è stato effettuato saggiando 25 campioni, con controlli di amplificazione negativi
intercalati fra ogni campione, per formare un totale di 50 campioni. Il panello di riproducibilità è stato testato in quattro laboratori.
In totale, il 100% (120/120) dei campioni negativi e il 98,8% (79/80) dei campioni positivi hanno dato i risultati attesi.
87
5/23/2011
9:11 AM
Page 88
D. Specificità analitica
La specificità del test MTD è stata valutata utilizzando batteri, funghi e virus. Nel caso dei batteri e dei
funghi, i test di specificità hanno riguardato 160 ceppi (151 specie provenienti da 62 generi) di micobatteri
molto vicini al M. tuberculosis, altri microrganismi responsabili di patologie respiratorie e un pannello filogenetico di microrganismi della flora commensale dell’apparato respiratorio. I ceppi tipo erano colture ATCC
(American Type Culture Collection) e 5 ceppi erano stati forniti da laboratori di analisi. I lisati, preparati a
partire da colture in fase attiva di crescita (o, in tre casi, da rRNA) sono stati analizzati seguendo il protocollo del test MTD, a circa 5 x 107 CFU per test. Soltanto i ceppi del M. tuberculosis complex hanno fornito
risultati positivi, con l'eccezione dei ceppi di M. celatum e M. terrae-like.
A concentrazioni superiori a 30 CFU per test, i ceppi di M. celatum e alcuni ceppi di M. terrae-like hanno
dato risultati positivi (26.772 RLU per M. celatum e tra 19.470 e 49.976 RLU per M. terrae-like).
E. Limite di identificazione
Trenta ceppi di M. tuberculosis provenienti da regioni geografiche molto diverse, compresi quelli rappresentanti di ceppi resistenti e di ceppi sensibili agli antibiotici, sono stati identificati dal test MTD. Il test MTD
ha potuto identificare fino a 1 CFU per test di ognuno dei 30 ceppi.
F. Test di sovraccarico
È stato testato l’rRNA di Mycobacterium tuberculosis ad una concentrazione di 25 fg (equivalente a 5 CFU
per test) in presenza di circa 540.000 CFU per test (450 μl) dei seguenti organismi non bersaglio:
Corynebacterium pseudotuberculosis, C. diphtheriae, Gordona sputi e Rhodococcus bronchialis. Tutti i
risultati sono stati positivi per l’rRNA del M. tuberculosis in presenza di questi organismi non bersaglio che
non hanno quindi originato alcun tipo di interferenza.
88
5/23/2011
9:11 AM
Page 89
RISOLUZIONE DI EVENTUALI PROBLEMI
OSSERVAZIONE
Valori elevati per il Controllo
Negativo di Amplificazione o per il
Controllo del Trattamento del
Campione Negativo
(> 20.000 RLU)
POSSIBILI CAUSE
z Omogeneizzazione insufficiente dopo aggiunta del
Reagente di Selezione (S) o
insufficiente volume del
Reagente di Selezione.
z Amplificazione di contaminanti introdotti per mancanza di
precauzioni durante la
preparazione delle reazioni.
Valori bassi per il Controllo
Negativo di Amplificazione o per il
Controllo del Trattamento del
Campione Negativo
(< 500.000 RLU)
z Volume eccessivo del
Reagente di Selezione.
z Inosservanza del tempo
prestabilito per la fase di
Selezione.
z La temperatura delle provette
è scesa sotto i 42°C dopo l’incubazione a 95°C.
z I tubi che portano il Reagente
di Rivelazione sono otturati.
89
La distribuzione dei reagenti con le
pipette deve essere eseguita con la
massima accuratezza. Le provette
devono essere decontaminate con
una soluzione di candeggina diluita
1:10, come indicato nel paragrafo «
PROCEDIMENTO ».
I banchi, gli incubatori, i bagno-maria
e le pipette devono essere decontaminati con una soluzione di candeggina diluita 1:2, come indicato nel
paragrafo « PROCEDIMENTO »..
Le provette devono essere asciugate con carta assorbente inumidita,
priva di lanugine, prima della lettura
con il luminometro.
Verificare la temperatura del bagnomaria e/o dell’incubatore e regolarla,
se necessario, per rispettare le
tempe-rature raccomandate.
Vortexare con cura, come specificato (vedere il punto 2 del paragrafo
Ibridazione). Verificare che dopo
aver agitato con il vortex la
soluzione assuma un colore giallo
uniforme.
Verificare la regolazione del volume
della pipetta.
Aver cura che, durante la fase di
Selezione, l’incubazione a 60°C duri
15 minuti.
Trasportare direttamente le provette
dall’incubatore a 95°C al bagnomaria / incubatore a 42°C.
Lavare i tubi con acqua calda come
indicato nel Manuale d’Uso dello
strumento.
Italiano
z Omissione della fase di raffredda-mento di 5 minuti.
z Contaminazione del laboratorio o dei reagenti.
z Omissione dell’asciugatura
delle provette prima della lettura con il luminometro.
z Mancato rispetto delle temperature raccomandate durante
la fase di amplificazione.
z Aggiunta del Reagente di
Amplifi-cazione dispensando il
reattivo sulle pareti della
provetta e non diretta-mente sul
fondo della stessa.
z Omogeneizzazione insufficiente dopo aggiunta del
Reagente di Ibridazione ricostituito.
AZIONI CONSIGLIATE
Ripetere l’omogeneizzazione in
maniera corretta. Rispettare scrupolo-samente i volumi indicati.
Verificare che dopo aver agitato con
il vortex la soluzione assuma un colore rosa uniforme.
5/23/2011
9:11 AM
Page 90
NOTE
A Gli incubatori devono avere alloggiamenti adeguati per le provette da 12 x 75 mm. Si raccomanda
l’impiego degli incubatori GEN-PROBE.
B Per la conservazione ed il congelamento in aliquote sono raccomandate le provette per microcentrifuga con
tappo a vite. Le aliquote congelate possono subire un unico ciclo di congelamento/scongelamento.
Non utilizzare congelatori con sbrinamento automatico.
c
Per lo stoccaggio delle aliquote congelate, si raccomanda di impiegare flaconi per la refrigerazione da 5 ml.
Le aliquote congelate possono essere scongelate soltanto una volta. Non utilizzare congelatori a sbrinamento automatico.
D Dato che vi sono differenze tra i diversi Vortex e che possono essere impostate velocità diverse, può essere
necessario allungare il tempo di agitazione. Impostare la velocità dell’apparecchio seguendo le istruzioni del
“ PROCEDIMENTO, paragrafo E ” per far sì che la miscela di reazione raggiunga la parte superiore della
parete della provetta. La precisione dei risultati dipende in gran parte da un’omogeneizzazione ottimale. I
tempi di agitazione possono arrivare a 15 secondi senza compromettere i risultati.
90
5/23/2011
9:12 AM
Page 91
TESTE AMPLIFIED PARA A DETECÇÃO DIRECTA DAS
MICOBACTÉRIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Embalagem de 50 testes
UTILIZAÇÃO
O teste AMPLIFIED PARA A DETECÇÃO DIRECTA DAS MICOBACTÉRIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS (MTD) é um teste que utiliza uma sonda de ácido nucleico dirigida contra um alvo
amplificado, permitindo a detecção in vitro dos ácidos nucleicos das micobactérias do complexo
Mycobacterium tuberculosis. Este teste efectua-se a partir de amostras provenientes de expectorações
(induzidas ou expectoradas), de colheitas/coletas brônquicas (lavagens bronco-alveolares ou aspirações
brônquicas) ou de aspirações traqueais.
ADVERTÊNCIA
A eficácia deste teste não foi demonstrada para a detecção directa de ARNr de M. tuberculosis a partir de
outras amostras clínicas (sangue, urina ou fezes, por exemplo). O comportamento funcional do teste MTD foi
estudada apenas para as amostras tratadas com a técnica descrita e conservadas respeitando o tempo e
temperaturas especificadas nesta ficha técnica.
As amostras que derem resultados positivos devem ser colocadas em cultura para determinar a presença
eventual de micobactérias atípicas juntamente com as do complexo M. tuberculosis permitindo efectuar testes
de sensibilidade aos agentes anti-micobacterianos. Devem ser efectuadas culturas para a detecção de bacilos ácido-álcool-resistentes (BAAR) para precisar que tipo de sub-espécie do complexo M. tuberculosis está
presente (M. bovis, por exemplo).
No decurso de ensaios clínicos, foram submetidas ao teste amostras provenientes de crianças, de pacientes
VIH-positivos e de pacientes infectados com micobactérias atípicas. No entanto, o número destes ensaios
não permitiu comparar estatisticamente o comportamento funcional do teste para estes diferentes grupos.
O comportamento funcional do teste em amostras provenientes de pacientes sob tratamento anti-tuberculose,
no intuito de efectuar um seguimento terapêutico ou de confirmar uma cura, não foi avaliada.
B. O teste MTD é específico para as micobactérias do complexo M. tuberculosis, ou seja, M. tuberculosis, M.
bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, e M.canetti (13), mas não as diferencia. M. celatum e M.
tipo-terrae podem provocar reacções cruzadas se estiverem presentes concentrações superiores a 30
UFC (Unidades Formadoras de Colónias) por teste. No entanto, M. celatum e M. tipo-terrae são raramente
isoladas em clínica.
C. Um resultado negativo não exclui a presença de uma micobactéria do complexo M. tuberculosis na
amostra. A qualidade dos resultados está ligada à qualidade da colheita e do seu transporte, à variabili91
Português
As amostras com muito sangue não devem ser analisadas com o dispositivo MTD.
PRECAUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
A. Somente para uso em diagnóstico in vitro.
5/23/2011
9:12 AM
Page 92
dade das colheitas/coleta , aos erros técnicos do laboratório, aos erros de identificação das amostras e
aos erros de transcrição dos resultados.
D. O teste destina-se apenas à detecção das micobactérias do complexo M. tuberculosis, a partir de
amostras preparadas segundo os métodos NALC-NaOH ou NaOH que são recomendados pelos Centers
for Disease Control (CDC)7. Este teste deve ser utilizado unicamente para amostras concentradas,
preparadas a partir de expectorações (induzidas ou expectoradas), de aspirações traqueais ou de colheitas/coleta brônquicas (lavagens bronco-alveolares ou aspirações brônquicas). Quando proceder à suspensão da amostra na solução de tampão fosfato, verificar se a concentração de fosfato é de 67 mM7.
E. Evitar qualquer contacto dos Reagentes de Detecção I e II (bioMérieux ref. 39300 / Gen-Probe Cat. No.
201791/1791) com a pele, olhos ou mucosas. Caso haja contacto, lavar com água. Se estes reagentes
forem entornados, diluí-los com água antes de limpar.
F. Ter as precauções habituais na realização deste teste4. A preparação das amostras fluidificadas e descontaminadas, bem como as etapas do teste MTD, devem ser efectuadas respeitando as regras de segurança microbiológica do nível 2 5.
G. Utilizar unicamente o material fornecido ou material de laboratório de utilização única.
H. As bancadas, pipetas e material devem ser descontaminados com uma solução de lixívia diluída a 1/2
(metade de lixívia, metade de água), como descrito no parágrafo « PROCEDIMENTO». Deixar a lixívia
actuar durante 15 minutos, depois lavar com água e enxugar para eliminar traços de lixívia.
I. Devem ser utilizadas “as pipetas da bancada de trabalho ou as pipetas da câmara de fluxo laminar”
equipadas de pontas com filtro para efectuar este teste. Devem utilizar-se pontas extra-longas para transferir o lisado dos tubos de lise para os tubos de amplificação. Mudar de ponta em cada etapa. Evitar passar por cima dos outros tubos do suporte. As pontas usadas devem ser imediatamente deitadas num
recipiente destinado aos detritos biológicos.
J. Quando utilizar uma pipeta de repetição para a distribuição dos reagentes, depois da introdução do lisado
nos tubos, evitar tocar no tubo com a ponta da pipeta para reduzir os riscos de contaminação entre tubos.
Os reagentes devem ser distribuídos contra a parede do tubo para evitar projecções. O cuidado na distribuição dos reagentes permitirá reduzir os riscos de contaminação cruzada.
K. Não utilizar as mesmas pipetas para as etapas anteriores e posteriores à amplificação.
L. Depois da leitura dos resultados no luminómetro, descontaminar os tubos e eliminá-los como descrito nos
parágrafos «PROCEDIMENTO» e «NOTAS» para evitar a contaminação do laboratório com amplicons.
M. NUNCA usar novamente as folhas autocolantes e as tampas utilizadas durante uma etapa anterior. As
tampas devem ser eliminadas num recipiente apropriado, imediatamente após tê-las retirado, para evitar
qualquer contaminação cruzada. As folhas autocolantes devem ser aplicadas firmemente no cimo dos
tubos reaccionais.
N. Não cobrir o banho-maria durante as incubações, especialmente se as tampas forem utilizadas (a condensação na tampa pode ser uma fonte de contaminação).
O. É necessário efectuar uma boa homogeneização em Vortex depois da adição do Reagentes de Selecção
para obter resultados precisos.
P. É recomendado utilizar uma área separada para a etapa de Ensaio de Protecção de Hibridização (HPA /
Hybridization Protection Assay) para minimizar a contaminação por amplicons no ensaio. Esta área deve
estar separada da área onde é efectuada a preparação da amostra, a preparação do reagente e a amplificação.
Q. Para evitar que as áreas do laboratório fiquem contaminadas por amplicons, o laboratório deve estar organizado de uma forma uni-direccional de trabalho. Por exemplo, efectuar em primeiro lugar a preparação da
amostra e do reagente numa área, em seguida a amplificação noutra, e por último o HPA noutra área. As
amostras, equipamento e reagentes não devem voltar para a área onde foi efectuada uma etapa anterior.
Além disso, o pessoal de laboratório não deve voltar para uma área de trabalho anterior sem ter as devi92
5/23/2011
9:12 AM
Page 93
das precauções de anti-contaminação. É vivamente recomendado que a área de segurança biológica
usada para o processamento da amostra não seja usada para efectuar o teste MTD.
INTRODUÇÃO
O teste MTD utiliza os métodos TMA (Transcription-Mediated Amplification) e HPA (Hybridization Protection
Assay)2 para detectar qualitativamente o ARN ribossómico (ARNr) das micobactérias do complexo M. tuberculosis. O teste MTD detecta o ARN dos organismos cultiváveis e não cultiváveis. O complexo M. tuberculosis
é constituído pelas sub-espécies M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti e M.
canetti12,13. O teste MTD detecta todos os microrganismos do complexo M. tuberculosis. No entanto, M.
microti infecta apenas os animais e M. bovis raramente se transmite dos animais para o homem. M.
africanum é responsável pela tuberculose pulmonar na África Tropical12. M. tuberculosis é ,de longe, o mais
comum, sendo responsável por uma morbidez significativa no mundo inteiro. O CDC relatou, recentemente,
um aumento dos casos de tuberculose nos pacientes atingidos com SIDA e nos imigrantes, e um aumento da
transmissão da doença nas populações de alto risco6,9. Observa-se igualmente o aumento de número de
estirpes/cepas resistentes, ou seja, multi-resistentes aos anti-tuberculostáticos11. As consequências são consideráveis no domínio da saúde pública.
Os métodos de cultura convencionais permitem observar o crescimento de M. tuberculosis num prazo de 1 a
8 semanas7,10. O teste MTD permite a detecção do ARNr das micobactérias do complexo M. tuberculosis
em 2,5 a 3,5 horas. Mesmo não permitindo efectuar o antibiograma, o teste MTD detecta o M. tuberculosis
fiável e rapidamente. Isto permite uma melhor utilização dos serviços de isolamento dos hospitais, começar
rapidamente um tratamento apropriado e prevenir a propagação da doença graças à identificação precoce e
ao isolamento das pessoas contaminadas3.
PRINCÍPIO
O teste MTD é um teste em duas fases (amplificação e detecção) que se efectuam no mesmo tubo. Primeiro,
a sonicação provoca a libertação dos ácidos nucleicos das micobactérias. O calor é utilizado para desnaturar
estes ácidos nucleicos e romper a estrutura secundária do ARNr. O método de amplificação Gen-Probe
Transcription-Mediated Amplification (TMA) amplifica em seguida um alvo específico do ARNr micobacteriano
através de um intermediário de ADN, a uma temperatura constante de 42°C. Produzem-se assim múltiplas
cópias de ARNr micobacteriano (amplicons).
As sequências de amplicons de ARNr, específicas das micobactérias do complexo M. tuberculosis, são detectadas em seguida pelo método de hibridização entre ácidos nucleicos Hibridization Protection Assay (HPA),
da Gen-Probe2. O Reagente de Hibridização do teste MTD contém uma sonda ADN monocatenária conjugada com um marcador quimioluminescente. Esta sonda é complementar das sequências de ARN específicas
das micobactérias do complexo M. tuberculosis. A sonda forma, com estas sequências específicas, híbridos
estáveis ARN:ADN. Após a etapa de selecção, o sinal luminoso emitido pelas sondas hibridizadas é medido
no luminómetro GEN-PROBE LEADER.
REAGENTES
(Embalagem de 50 testes)
Os reagentes para o teste MTD são fornecidos como segue:
Nome do reagente
Volume
EMBALAGEM DE REAGENTES PARA AMPLIFICAÇÃO
Solução Tampão Tris contendo < 3 % de detergente
Reagente de Amplificação (A) ............................................................................................................1 x 3 ml
Ácidos nucleicos liofilizados numa solução tampão Tris contendo 5 %
de agente espessante
(após reconstituição)
Tampão de amplificação (AB) ............................................................................................................1 x 3 ml
Solução aquosa contendo conservantes
Reagente óleo de amplificação (óleo para reacção de amplificação) (O)........................................1 x 10 ml
93
Português
Tampão de Diluição das Amostras (SDB)........................................................................................1 x 2,5 ml
5/23/2011
9:12 AM
Page 94
Óleo de silicone
Reagente Enzimático (E) ................................................................................................................ 1 x 1,5 ml
Transcriptase inversa e ARN polimerase liofilizadas numa solução
tampão HEPES
contendo < 10 % de agente espessante e > 15 mM de N-Acetil-L-Cisteína
Tampão de Diluição Enzimática (tampão de diluição das enzimas) (EDB) ....................................1 x 1,5 ml
Solução tampão Tris contendo um surfactante e glicerol
EMBALAGEM DE REAGENTES PARA A HIBRIDIZAÇÃO
Reagente de Hibridização (H) ............................................................................................................1 x 6 ml
< 100 ng/frasco de sonda ADN não infecciosa conjugada com um
marcador quimioluminescente, liofilizado numa solução tampão succinato
contendo um agente espessante e um detergente
Tampão de Hibridização (HB) ............................................................................................................1 x 6 ml
Solução tampão succinato contendo < 4 % de detergente
Reagente de Selecção (S)................................................................................................................1 x 15 ml
Solução tampão borato contendo um surfactante
Tubos de Lise (LT) ......................................................................................................................2 x 25 tubos
Esferas de vidro, agente espessante
CONSERVAÇÃO
A. As soluções ou os componentes não reconstituídos seguintes devem ser conservados a 2º - 8°C e são utilizáveis até à data de validade indicada:
Tampão de Diluição das Amostras (SDB)
Reagente de Amplificação (A)
Tampão de Amplificação (AB)
Reagente Enzimático (E)
Tampão de Diluição Enzimática (EDB)
Reagente de Hibridização (H)
B. O Reagente de Amplificação reconstituído (A) é utilizável durante 2 meses e conserva-se a 2º - 8°C. O
Reagente de Hibridização (H) e o Reagente Enzimático (E) são utilizáveis um mês a 2º - 8°C após reconstituição, ou dois meses a uma temperatura igual ou inferior a -20°C, se forem distribuídos em alíquotas e
congelados no dia da reconstituição. As alíquotas congeladas devem ser utilizadas no próprio dia da
descongelação. Não utilizar congelador com descongelação automática.
C. Os componentes que se seguem devem ser conservados entre 2° e 25°C e são utilizáveis até à data de
validade indicada:
Reagente óleo de amplificação (O)
Tampão de Hibridização (HB)
Reagente de Selecção (S)
Tubos de Lise (LT)
COLHEITA/COLETA, CONSERVAÇÃO, TRANSPORTE E TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
Colheita/coleta e conservação da amostra:
94
5/23/2011
9:12 AM
Page 95
As amostras devem ser colocadas em recipientes de plástico estéreis e conservadas a 2º - 8°C antes do seu
transporte e tratamento. No decurso dos ensaios clínicos, as amostras foram conservadas menos de 4 dias
(geralmente, menos de 24 horas) antes do seu tratamento.
Transporte:
Transportar as amostras para o laboratório o mais rapidamente possível, em conformidade com as regulamentações em vigor.
Tratamento (descontaminação e concentração):
As amostras com muito sangue não devem ser testadas com MTD. Este teste foi concebido para detectar o
ARNr das micobactérias do complexo M. tuberculosis utilizando amostras preparadas segundo os métodos
de descontaminação NALC-NaOH ou NaOH utilizando 1% a 1,5% de NaOH durante 15 a 20 minutos e uma
centrifugação com uma velocidade superior ou igual a 3 000 g 7.
Conservação das amostras tratadas:
As amostras podem ser conservadas, no máximo, durante 3 dias a 2º - 8°C antes do teste. Podem também
conservar-se entre -20° e -70°C durante 6 meses ou mais. Não utilizar congeladores com descongelação
automática.
MATERIAL
A. Material fornecido
Composição da embalagem (bioMérieux ref. 39006 / Gen-Probe Cat. No. 301001/1001F) 50 testes
EMBALAGEM DE REAGENTES PARA AMPLIFICAÇÃO
Tampão de Diluição das Amostras (SDB)
1 x 2,5 ml
Reagente de Amplificação (A)
1 x 3 ml (após reconstituição)
Tampão de Reconstituição (AB)
1 x 3 ml
Reagente de óleo (óleo para reacção de amplificação) (O)
1 x 10 ml
Reagente Enzimático (E)
1 x 1,5 ml (após reconstituição)
Tampão de Diluição Enzimática (EDB)
1 x 1,5 ml
EMBALAGEM DE REAGENTES PARA HIBRIDIZAÇÃO
Reagente de Hibridização (H)
1 x 6 ml (após reconstituição)
Tampão de Hibridização (HB)
1 x 6 ml
Reagente de Selecção (S)
1 x 15 ml
Tubos de Lise (LT)
2 x 25 tubos
Cartas de protecção (folhas autocolantes)
1 pacote
B. Material necessário não fornecido:
Micropipetas capazes de distribuir 25 μl, 50μl, 100μl, 200μl, 300μl e 450μl
Água estéril (filtrada ou autoclavada)
Tubos de cultura
Esferas de vidro estéreis de 3 mm
Tubos para microcentrífuga com tampas de enroscar
Suporte para tubos reaccionais
Pontas de pipeta com filtro (1 000 μl)
95
Português
Vortex
5/23/2011
9:12 AM
Page 96
Testemunhos Positivos de Amplificação (por ex. M. tuberculosis, ATCC 25177 ou ATCC 27294)
Testemunhos Negativos de Amplificação (por ex. M. gordonae, ATCC 14470 ou M. terrae, ATCC 15755)
Lixívia (solução de hipoclorito a 5,25%)
Folhas de protecção plastificadas para bancada
Pipetas de repetição
C. Material suplementar disponível no distribuidor Gen-Probe:
Sonicador GEN-PROBE (bioMérieux ref. 39409 / Gen-Probe Cat. No. 901104/T460)
Blocos de aquecimento GEN-PROBE (42°C ± 1°C, 60°C ± 1°C, 95°C ± 5°C)A (bioMérieux ref. 39405,
39406, 39407 / Gen-Probe Cat. No. 3396, 3397, 3398)
Luminómetro GEN-PROBE LEADER 50i (bioMérieux ref. 39400 / Gen-Probe Cat. No. 103100i/3100i)
Embalagem de Reagente de Detecção GEN-PROBE (bioMérieux ref. 39300 / Gen-Probe Cat. No. 201791/
1791)
Controlos de Amplificação MTD GEN-PROBE (bioMérieux ref. 39223/Gen-Probe Cat. No. 301043F/1043F)
Suporte de tubos para o sonicador GEN-PROBE (bioMérieux ref. 39313 / Gen-Probe Cat. No. 104027/
4027)
Suporte de tubos reaccionais (bioMérieux ref. 39311 / Gen-Probe Cat. No. 3994)
Pontas de pipeta longas com filtro (1250 μl) (bioMérieux ref. 39315 / Gen-Probe Cat. No. 104316/4316)
Tubos em polipropileno, 12 x 75 mm (bioMérieux ref. 39308 / Gen-Probe Cat. No. 102440/2440)
Tampas em polipropileno para tubos de 12 x 75 mm (bioMérieux ref. 39320 / Gen-Probe Cat. No. 400713)
PROCEDIMENTO
Controlos
As células usadas para o Controlo de Amplificação Positivo devem fazer parte do complexo M. tuberculosis,
tal como a H37Ra não-virulenta (ATCC 25177) ou a H37Rv virulenta (ATCC 27294). As células usadas para o
Controlo Negativo devem ser MOTT, tal como M. gordonae (ATCC 14470) ou M. terrae (ATCC 15755). Os
controlos devem ser preparados antes de efectuar o teste da amostra.
Os controlos devem conter 25 – 150 CFU por 50 μl para obter uma concentração final de 1 – 10 CFU por
amostra. Esta concentração deve ser verificada em cultura. Estes controlos devem ser utilizados na
preparação dos Controlos de Processamento da Amostra (consultar a Preparação da Amostra).
1. Preparação recomendada para os Controlos
a. Colocar 3 a 5 esferas de vidro de 3 mm num tubo de cultura limpo.
b. Adicionar 1 a 2 ml de água estéril. Adicionar o conteúdo de várias ansas (1 μl) de cultura apropriada.
Fechar o tubo e agitar várias vezes a uma grande velocidade, utilizando um Vortex.
c. Deixar repousar durante 15 minutos.
d. Transferir o sobrenadante para um tubo de cultura limpo. Ajustar a turbidez a 1 McFarland utilizando
um nefelómetro.
e. Diluir a 1/100 a suspensão, colocando 100 μl da suspensão a 1 McFarland em 10 ml de água estéril.
Fechar e agitar em vortex. Esta é a primeira diluição.
f. Diluir uma segunda vez a 1/100, colocando 100 μl da diluição 1 em 10 ml de água estéril. Fechar e
agitar em vortex. Esta é a segunda diluição. Esta diluição deve conter aproximadamente 25 – 150 CFU
por 50 μl.
Aliquotar e Conservar os Controlos
96
5/23/2011
9:12 AM
Page 97
a. As diluições devem ser distribuídas em alíquotas (500 μl), em micro-tubos de centrífuga de 1,5 ml
limpos, com tampas de rosca. As alíquotas destinam-se a uma única utilização e podem ser conservadas a –20 º C durante 6 meses ou a – 70º C durante 1 ano. Não utilizar congelador com descongelação automática.
A utilização do controlo positivo para M. tuberculosis servirá para monitorizar apenas a falha substancial do
reagente. O controlo positivo foi concebido para verificar se houve excesso de NaOH e de tampão fosfato nos
reagentes utilizados durante o procedimento. As variações dos procedimentos no tempo ou nas temperaturas
que podem afectar a eficiência da amplificação ou a exactidão do tempo seleccionado podem não ser detectadas utilizando os controlos recomendados. Os controlos adicionais podem ser testados em conformidade
com as directivas ou recomendações especiais.
2. Controlo de inibição das amostras
Quando o teste MTD for negativo mas o diagnóstico do médico for favorável a uma tuberculose, é possível verificar se a amostra contém um inibidor, procedendo da forma seguinte:
a. Colocar 50 μl de Tampão de Diluição das amostras em 2 tubos de lise das micobactérias (identificado
com testemunho e sem testemunho).
b. Introduzir 50 μl de Testemunho Positivo de Amplificação e 450 μl de amostra num tubo (com testemunho). Adicionar 450 μl de amostra num segundo tubo (sem testemunho). Efectuar o teste seguindo
o protocolo habitual.
Interpretação
Se o número RLU (Relative Light Units) obtido no luminómetro com o tubo com testemunho for
> 30.000 RLU, a amostra não contém inibidor de amplificação e, aparentemente, não contém alvo a amplificar. Se o número de RLU obtido com o tubo com testemunho for < 30.000 RLU, a amostra contém um
inibidor de amplificação e uma outra amostra deve ser analisada. Se o teste repetido do tubo sem testemunho for positivo, o resultado do teste MTD pode considerar-se positivo. A explicação mais plausível
para este tipo de resultado, é a variabilidade ligada à amostragem: a primeira amostra não continha alvo a
amplificar, enquanto a segunda o continha. O número de RLU do tubo em testemunho pode ser positivo
ou negativo dependendo da amostra conter ou não ARNr de micobactéria pertencente ao complexo M.
tuberculosis.
2. Controlo da contaminação do laboratório
Para controlar se o laboratório foi contaminado pelos amplicons de M. tuberculosis, proceder como segue:
a. Colocar 1 ml de água estéril num tubo limpo. Humidificar uma zaragatoa/swab estéril de poliester ou
dacron com água estéril.
b. Esfregar a zaragatoa/swab na bancada ou no material a controlar.
c. Colocar a zaragatoa/swab no tubo e misturar suavemente. Retirar a zaragatoa/swab , espremendo-a
na parede do tubo. Eliminar a zaragatoa/swab num recipiente contendo uma solução de lixívia diluída
a 1/2 (metade de lixívia, metade de água).
e. Seguir as instruções do parágrafo «PROCEDIMENTO» para a amplificação e a detecção.
Interpretação
Se os resultados forem > 30.000 RLU, a superfície analisada está contaminada e deve ser descontaminada com lixívia seguindo as instruções do parágrafo «PROCEDIMENTO: Preparação do material». Se se
suspeitar de uma contaminação do banho-maria, proceder do mesmo modo que o acima descrito com
25 μl de água do banho-maria, na condição de esta não conter nenhum produto anti-séptico.
97
Português
d. Distribuir 25 μl da solução obtida num tubo de amplificação contendo 50 μl de Reagente de
Amplificação e 200 μl de óleo para reacção de amplificação.
5/23/2011
9:12 AM
Page 98
Preparação do material
1. a. Encher o reservatório do sonicador com água da torneira à temperatura ambiente até cerca de
1 cm do bordo.
b. A água deverá ser desgaseificada para optimizar a transferência de energia dos ultra-sons. Para desgaseificar inteiramente a água, colocar o sonicador em funcionamento durante 15 minutos antes do início
dos testes.
2. Regular um bloco de aquecimento a 95° ± 5°C, um outro bloco de aquecimento ou um banho-maria a 60°
± 1°C e ainda outro bloco de aquecimento ou um banho-maria a 42° ± 1°C.
3. Limpar as superfícies de trabalho, material e pipetas com uma diluição 1:2 de lixívia antes de começar a
análise. Deixar a lixívia actuar durante, pelo menos, 15 minutos. Lavar com água a superfície de trabalho
para eliminar os traços de lixívia. Cobrir a superfície na qual o teste será efectuado com uma folha de protecção plastificada para bancada.
4. Preparar o luminómetro GEN-PROBE LEADER. Certificar-se de que há uma quantidade suficiente de
Reagentes de Detecção I e II para efectuar os testes e que os tubos são correctamente injectados com os
reagentes de detecção. Consultar o Manual de Utilização do luminómetro para as instruções de introdução dos Reagentes de Detecção (estes reagentes são vendidos separadamente).
Preparação do reagente
Reconstituir o Reagente de Amplificação liofilizado (A) no seu frasco (50 testes) com 3 ml de Tampão de
Amplificação (AB). Homogeneizar num Vortex. Deixar o reagente reconstituído repousar à temperatura ambiente até ficar claro. O Reagente de Amplificação reconstituído pode conservar-se durante 2 meses a 2º - 8°C.
A solução deve ser colocada à temperatura ambiente antes da utilização.
Preparação das amostras
1. Identificar um número suficiente de Tubos de Lise de Micobactérias (LT) para analisar as amostras, os
controlos de amplificação positiva e negativa e os testemunhos de amplificação positivo e negativo.
Retirar e conservar as tampas.
2. Distribuir 50 μl do Tampão de Diluição das Amostras de Micobactérias (SDB) em todos os tubos de lise de
Micobactérias (LT):
Proceder como infra descrito em A e B para os controlos e em C para as amostras.
A. Procedimento para Testemunhos de amplificação
Para cada controlo, adicionar 1 ml de solução de NALC/NaOH e 3 ml do tampão fosfato utilizado para
efectuar o processamento da expectoração com 1 ml de água estéril no tubo de processamento da
amostra.
i. Homogeneizar em vortex.
ii. Transferir 450 μl de solução de tampão fosfato/NALC/NaOH e 50 μl de diluição de Controlo de
Amplificação para o tubo correspondente de lise de micobactérias (LT) identificado.
B. Se estiverem a ser usados Controlos de Amplificação, transferir 450 μl do recipiente do Controlo de
Amplificação para o correspondente tubo de lise de micobactérias (LT) identificado.
C. Amostras: Transferir 450 μl de cada amostra descontaminada e homogeneizada do recipiente para o
correspondente tubo de lise de micobactérias identificado (LT).
2. Fechar os tubos de lise de Micobactérias (LT) após a adição de cada amostra.
3. Agitar durante 3 segundos em vortex.
Lise das amostras
1. Inserir os Tubos de Lise no suporte do sonicador de forma a que a mistura de reacção no fundo dos tubos
98
5/23/2011
9:12 AM
Page 99
fique imersa, mantendo as tampas fora de água. Colocar o suporte no local. OS TUBOS NÃO DEVEM,
EM CASO ALGUM, TOCAR NO FUNDO OU NAS PAREDES DO SONICADOR.
2. Colocar o sonicador em funcionamento durante 15 minutos, mas nunca mais de 20 minutos. As amostras
e testemunhos assim tratados com ultra-sons designam-se por «lisados». NÃO UTILIZAR O Vortex PARA
AGITAR OS LISADOS.
Amplificação
1. Identificar os tubos de polipropileno para amplificação (12 x 75 mm) escrevendo no topo os números correspondentes aos números de identificação dos Tubos de Lise. Identificar igualmente os tubos de amplificação para os testemunhos de amplificação positivo e negativo.
2. Introduzir 50 μl de Reagente de Amplificação reconstituído no fundo de cada tubo utilizando uma pipeta
repetitiva. Adicionar 200 μl de óleo para reacção de amplificação (O) em cada tubo utilizando uma pipeta
de repetição.
3. NÃO UTILIZAR O VORTEX PARA OS LISADOS. Transferir 25 μl de cada lisado para o fundo do tubo de
amplificação correspondente, utilizando uma nova ponta com filtro para cada transferência. Os lisados que
sobrarem podem ser conservados a 2º - 8°C durante 7 dias, ou congelados a uma temperatura igual ou
inferior a -20°C durante 1 mês. Não utilizar congelador com descongelação automática. Se for necessário
efectuar outros testes com os lisados, deixá-los atingir previamente a temperatura ambiente. NÃO UTILIZAR O VORTEX PARA OS LISADOS.
4. Incubar os tubos num bloco de aquecimento a 95°C durante 15 minutos, mas não mais de 20 minutos.
5. Preparar a Solução Enzimática adicionando 1,5 ml de Tampão de Diluição Enzimática (EDB) ao Reagente
Enzimático liofilizado (E). Rodar para misturar. Não agitar num Vortex. O Reagente Enzimático reconstituído é utilizável durante um mês a 2º - 8°C ou durante dois meses a uma temperatura igual ou inferior a 20°C, se for distribuído em alíquotas e congeladoB no dia da reconstituição. Se o teste for efectuado com
alíquotas de enzimas congeladas, colocá-las previamente à temperatura ambiente; não descongelar as
alíquotas colocando-as a uma alta temperatura. Para homogeneizar as alíquotas descongeladas, aspirar e
rejeitar a solução utilizando uma pipeta de repetição antes de adicioná-la aos tubos de amplificação.
6. Transferir os tubos para um bloco de aquecimento ou banho-maria a 42° ± 1°C e deixá-los arrefecer
durante 5 minutos. NÃO DEIXAR OS TUBOS ATINGIREM A TEMPERATURA AMBIENTE. NÃO COBRIR
O BANHO-MARIA.
7. Quando os tubos estiverem a 42°C, adicionar 25 μl de Reagente Enzimático em cada tubo utilizando uma
pipeta de repetição. Sacudir para misturar. Incubar a 42°C durante 30 minutos, mas não mais de 60 minutos. É necessário utilizar folhas autocolantes ou tampas durante esta etapa de incubação. NÃO COBRIR
O BANHO-MARIA.
8. Após o período de incubação de 30 minutos, os tubos cobertos podem ser conservados a 2° - 8°C
durante 2 horas ou a -20°C até ao dia seguinte. Se forem conservados a -20°C até ao dia seguinte, os
tubos devem ser totalmente descongelados à temperatura ambiente ou, no máximo, a 60°C antes da
etapa de hibridização, e devem ser, de preferência, fechados com tampas e não com folhas autocolantes.
Hibridização
99
Português
1. Reconstituir o Reagente de Hibridização liofilizado (H) com 6 ml de Tampão de Hibridização (HB). O
Reagente de Hibridização (H) e o Tampão de Hibridização (HB) devem estar à temperatura ambiente
antes da reconstituição. Se o Tampão de Hibridização (HB) foi guardado no frigorífico, aquecê-lo a 60°C,
rodando-o lentamente para assegurar que todos os componentes se dissolvem. Agitar num Vortex até
que a solução fique clara (o que pode demorar cerca de um minuto) para assegurar que todos os componentes estão dissolvidos. O Reagente de Hibridização reconstituído é utilizável durante um mês a 2° - 8°C
ou durante dois meses a uma temperatura igual ou inferior a -20°C, se tiver sido distribuído em alíquotas
e congeladoC no dia da reconstituição. Se o Reagente de Hibridização reconstituído foi guardado no frigorífico ou congelado, aquecê-lo a 60°C, rodando-o ligeiramente para assegurar que todos os componentes se dissolvem.
5/23/2011
9:12 AM
Page 100
2. Adicionar 100 μl de Reagente de Hibridização reconstituído em cada tubo com uma pipeta de repetição.
Cobrir os tubos com folhas autocolantes ou com tampas. Agitar os tubos com um Vortex, a uma velocidade média, 3 vezes durante, pelos menos, 1 segundoD. Para uma boa homogeneização dos tubos de
reacção, mantê-los na posição vertical e deixar a mistura atingir a metade superior da parede do tubo
durante a agitação (para evitar qualquer contaminação não deixar a mistura entrar em contacto com as
folhas autocolantes ou com as tampas). Quando a homogeneização estiver correctamente efectuada, a
mistura deve ter uma cor amarela uniforme.
3. Incubar a 60°C durante 15 minutos, mas não mais de 20 minutos, num bloco de aquecimento ou em
banho-maria.
Selecção
1. O Reagente de Selecção (S) deve estar à temperatura ambiente antes de começar o teste. Retirar os
tubos do banho-maria ou do bloco de aquecimento a 60°C e adicionar 300 μl de Reagente de Selecção
(S) com uma pipeta de repetição. Cobrir os tubos com folhas autocolantes ou com tampas. Agitar num
Vortex, a uma velocidade média, 3 vezes durante, pelo menos, 1 segundoD. Para uma boa homogeneização dos tubos de reacção, mantê-los na posição vertical e deixar a mistura atingir a metade superior da parede do tubo durante a agitação (para evitar qualquer contaminação não deixar a mistura entrar
em contacto com as folhas autocolantes ou com as tampas). Quando a homogeneização estiver correctamente efectuada, a mistura deve ter uma cor rosa uniforme.
2. Incubar a 60°C durante 15 minutos, mas não mais de 16 minutos, num bloco de aquecimento ou num
banho-maria.
3. Retirar os tubos do banho-maria ou do bloco de aquecimento. Deixar os tubos atingirem a temperatura
ambiente durante, pelo menos, 5 minutos, mas não mais de uma hora. Retirar as folhas autocolantes ou
as tampas imediatamente antes da fase de detecção.
Detecção
1. Programar o procedimento apropriado no luminómetro. Escolher uma leitura de 2 segundos.
2. Para eliminar qualquer resíduo da superfície dos tubos, limpá-los com um papel absorvente húmido que
não se desfaça com a humidade, e depois introduzi-los no luminómetro seguindo as instruções do manual
de utilização. Os tubos devem ser lidos na hora a seguir à etapa de selecção.
3. Quando a análise tiver terminado, retirar os tubos do luminómetro.
4. Após a leitura dos tubos, enchê-los cuidadosamente com uma solução de lixívia diluída a 1/10 (um volume de
lixívia, 9 volumes de água, utilizando um esguicho. Deixar a lixívia actuar durante, pelo menos, uma hora
antes de eliminar os tubos, para evitar a contaminação do laboratório com amplicons.
5. Os suportes de tubos devem ser descontaminados por imersão completa numa solução de lixívia diluída a
1/2 durante, pelo menos, 15 minutos. Em seguida, devem-se lavar com água e enxugar, ou secar ao ar.
6. Descontaminar o laboratório e o material utilizando uma solução de lixívia diluída a 1/2.
Repetição do teste
1. Se tiver de repetir o teste, deixar os lisados atingir a temperatura ambiente. NÃO UTILIZAR O VORTEX
PARA OS LISADOS.
2. Seguir o protocolo de «PROCEDIMENTO» começando pela etapa de amplificação.
NOTAS
A. Reagentes
1. O Reagente Enzimático não deve permanecer à temperatura ambiente mais de 15 minutos após a
reconstituição.
2. O Tampão de Hibridização (HB) pode precipitar. Aquecer e agitar o Tampão de Hibridização (HB) ou o
Reagente de Hibridização reconstituído a 60°C para dissolver o precipitado.
100
5/23/2011
9:12 AM
Page 101
B. Temperatura
1. A amplificação, a hibridização e a selecção são reacções termo-dependentes; consequentemente, é
imperativo manter o banho-maria ou o bloco de aquecimento às temperaturas preconizadas.
2. Antes de adicionar o Reagente Enzimático, deixar arrefecer os tubos a 42°C durante 5 minutos. Esta
temperatura permite obter um comportamento funcional óptimo de amplificação.
3. É fundamental respeitar a temperatura para a fase de amplificação (42° ± 1°C).
C. Tempo
É imperativo respeitar os tempos indicados no parágrafo «PROCEDIMENTO».
D. Banho-maria
1. O nível de água no banho-maria deve manter-se de forma a que a mistura de reagentes no fundo dos
tubos esteja imersa, mas que a água não penetre nos tubos.
2. Durante a fase de amplificação, o banho-maria não deve ser coberto para evitar que haja condensação sobre ou dentro dos tubos.
E. Agitação utilizando um Vortex
É importante dispor de uma mistura homogénea durante as etapas de hibridização e de selecção, especialmente após a adição do Reagente de Hibridização (H) reconstituído (a mistura fica com uma cor
amarela uniforme) e do Reagente de Selecção (S) (a mistura fica com uma cor rosa uniforme).
A agitação com Vortex permite obter uma suspensão uniforme. Quando os reagentes são colocados no
tubo de reacção e expostos a uma fonte de energia exterior, produz-se uma rotação rápida da solução à
volta do eixo do tubo. Daí resulta uma suspensão uniforme. Para que a homogeneização seja correctamente efectuada num Vortex, os tubos devem segurar-se na parte superior e manter-se na vertical. O
líquido deve então atingir a metade superior do tubo durante a agitação. Durante as etapas de hibridização e de selecção, esta agitação deve efectuar-se 3 vezes seguidas e durar, pelo menos, 1 segundo de
cada vez.
INTERPRETAÇÃO DO TESTE
Os resultados do teste GEN-PROBE AMPLIFIED PARA A DETECÇÃO DIRECTA DAS MICOBACTÉRIAS DO
COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS (MTD) são interpretados considerando que um resultado
negativo inicial (< 30.000 RLU), um resultado positivo inicial (> 500.000 RLU), ou um resultado equívoco inicial (30,000 a 499,999 RLU). O teste MTD deve ser repetido a partir do lisado reservado quando um teste inicial é equívoco. Um resultado repetido do lisado > 30.000 é considerado positivo.
A. Controlo de qualidade e validação de resultados
Os controlos devem dar os seguintes valores:
Controlo negativo de amplificação < 20.000 RLU
Controlo positivo de amplificação > 500.000 RLU
Testemunho negativo < 20.000 RLU
Os resultados dos testes dos pacientes não devem ser fornecidos se os valores do controlo de teste MTD
não estiverem dentro destes critérios. Consultar a tabela de RESOLUÇÃO DE INCIDENTES para informações complementares.
Cada laboratório deve determinar os valores alvo para cada controlo em função dos resultados obtidos
para cada série de controlos.
B. Resultados de Testes de Pacientes
101
Português
Testemunho positivo > 1.000.000 RLU
5/23/2011
9:12 AM
Page 102
Se os valores dos controlos não estiverem dentro dos valores esperados, os resultados das amostras de
testes de pacientes não devem ser validados.
Resultados:
> 500.000 RLU
positivo para o ARNr do complexo M. tuberculosis
< 30.000 RLU
negativo para o ARNr do complexo M. tuberculosis
30.000 a 499.999 RLU
provável rRNA positivo do complexo de M. tuberculosis; repetir para
verificar os resultados:
Repetir > 30.000 RLU positivo para o complexo rRNA para
M. tuberculosis
Repetir < 30.000 RLU negativo para o complexo rRNA para
M. tuberculosis
APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS
Os resultados do teste MTD devem ser interpretados em conjunto com outros dados clínicos e laboratoriais.
Deve ser considerada a possibilidade de ser testada uma outra amostra consoante a suspeita clínica existente.
Se o resultado de teste MTD inicial for positivo > 500.000 RLU, ou se o resultado do teste MTD repetido for
positivo > 30.000 RLU, apresentar os resultados da forma seguinte:
Apresentar:
Informação adicional:
Foi detectado o rRNA do complexo Mycobacterium tuberculosis. Coloração AFB (positiva ou negativa)
Cultura de AFB em crescimento. As amostras podem conter MOTT e M. tuberculosis ou apenas M. tuberculosis.
Este teste não deve ser efectuado isoladamente para o
diagnóstico M. tuberculosis. O valor positivo preditivo para
uma amostra com coloração AFB negativa é mais baixo
que para uma amostra com coloração AFB positiva. Tal é
particularmente importante ao testar amostras de populações em que a prevalência de M. tuberculosis é baixa e
os valores esperados com métodos de diagnóstico correspondentes são reduzidos.
Se o resultado de teste MTD ou a repetição deste for negativa < 30.000 RLU, apresentar os resultados da
forma seguinte:
Apresentar:
Informação adicional:
Não foi detectado o rRNA do complexo de Mycobacterium
tuberculosis. Coloração AFB (positiva ou negativa)
Não foi detectado o rRNA do complexo de Mycobacterium
tuberculosis Cultura de AFB em crescimento. As amostras
podem não conter M. tuberculosis, o resultado pode ser
falso negativo devido a baixos números de M. tuberculosis
na presença ou ausência de MOTT, ou o resultado pode
ser falso negativo devido a interferência de inibidores da
amostra. É recomendado testar uma nova amostra do
paciente se, clinicamente, houver forte suspeita de tuberculose ou se houver suspeita de inibição.es.
102
5/23/2011
9:12 AM
Page 103
LIMITES
Este teste destina-se apenas à detecção das micobactérias do complexo M. tuberculosis a partir de amostras
preparadas segundo os procedimentos NALC-NaOH ou NaOH recomendados pelo CDC7. Este teste só pode
ser efectuado com amostras preparadas a partir de expectorações (induzidas ou expectoradas), de colheitas/coletas brônquicas (lavagens bronco-alveolares ou aspirações brônquicas) ou de aspirações traqueais.
O teste MTD é específico das micobactérias do complexo M. tuberculosis, ou seja, M. tuberculosis, M. bovis,
M. bovis BCG, M. africanum, M. microti e M. canetti, mas não as diferencia entre si. M. celatum e M. tipoterrae podem provocar reacções cruzadas se estiverem presentes em concentrações superiores a 30 UFC
por teste. No entanto, M. celatum e M. tipo-terrae são raramente isoladas em clínica.
A qualidade dos resultados do teste está ligada à qualidade da colheita/coleta e ao seu transporte, à variabilidade das colheitas/coletas, aos erros técnicos do laboratório, aos erros de identificação das amostras e aos
erros de transcrição dos resultados. Um teste negativo não exclui a presença de uma micobactéria do complexo M. tuberculosis na amostra.
VALORES ESPERADOS
A. Intervalo dos valores de controlo obtidos no decurso de ensaios clínicos
O intervalo dos valores obtidos para os controlos (RLU) no decurso dos ensaios clínicos efectuados em 7
locais, foi:
B. Intervalo dos valores obtidos para amostras clínicas
Para 127 amostras MTD-positivas, os valores estavam compreendidos entre 35.777 e > 2.000.000 RLU.
Para 577 amostras MTD-negativas, os valores estavam compreendidos entre 573 e 19.176 RLU.
A distribuição dos resultados em RLU para todas estas amostras, após resolução das discordâncias,
encontra-se aqui abaixo: a resolução das discordâncias baseia-se na análise de outras amostras, positivas em cultura, provenientes do mesmo paciente e/ou com diagnóstico final do médico.
Português
103
5/23/2011
9:12 AM
Page 104
COMPORTAMENTO FUNCIONAL
A. Avaliação clínica
O comportamento funcional do teste MTD na sua forma original foram avaliadas no decurso de ensaios
clínicos efectuados em seis laboratórios, comparando os resultados obtidos por exame de esfregaços com
os resultados da cultura, em 6.079 amostras provenientes de 2.609 pacientes. Entre estas, 4.000
amostras provinham de 1.898 pacientes que não receberam tratamento anti-tuberculose. Os seis locais
representavam zonas geográficas diferentes: cinco hospitais de grandes cidades americanas, com um
serviço especializado para a tuberculose, e um laboratório público.
O comportamento funcional do teste MTD na sua forma actual foram avaliadas em sete locais, comparando os resultados do teste MTD com os resultados da cultura. Os sete hospitais que participaram no teste
representavam zonas geográficas diferentes: seis hospitais de grandes cidades americanas, com um
serviço especializado para a tuberculose, e um laboratório público nacional de micobacteriologia. As
amostras analisadas eram provenientes de pacientes que não receberam tratamento anti-tuberculose. 132
deram resultados positivos na cultura para as micobactérias do complexo M. tuberculosis. MTD detectou
119 destas amostras cultura-positivas; 7 amostras continham micobactérias não tuberculosas para além
das M. tuberculosis.
104
5/23/2011
9:12 AM
Page 105
Foram incluídos neste estudo pacientes suspeitos de terem uma tuberculose pulmonar activa, e não
estando sob tratamento. A prevalência total dos pacientes que tiveram uma cultura positiva para M. tuberculosis foi de 20,5%.
Foram determinadas, por paciente, uma sensibilidade média de 93,3% e uma especificidade média de
99,1% em relação à cultura. Foram determinadas, por amostra, uma sensibilidade média de 90,6% e uma
especificidade média de 99,6% em relação à cultura. O quadro abaixo dá a sensibilidade, especificidade,
valor predictivo positivo (VPP) e o valor predictivo negativo (VPN), com intervalos de confiança de 95%,
para as estimativas do comportamento funcional. Todos os dados são apresentados após resolução das
discordâncias, baseada na existência de outras amostras, com cultura positiva, provenientes do mesmo
paciente e/ou com diagnóstico final do médico.
B. Precisão
Foram analisados, em três locais, dois painéis de amostras, consistindo em 2 amostras negativas, 2
amostras fracamente positivas (ª 100 UFC/ teste) e 2 amostras moderadamente positivas
(ª 1000 UFC/ teste). As amostras positivas foram preparadas adicionando quantidades conhecidas de M.
tuberculosis a um pool de amostras moderadamente inibidor. Tanto as amostras como os testemunhos de
amplificação positivo e negativo foram testados em triplicado, duas vezes por dia, durante 3 dias em três
locais.
105
Português
Das 564 amostras com cultura e MTD negativas para o complexo M. tuberculosis, 114 amostras continham micobactérias atípicas, detectadas em cultura, 64 provinham de pacientes em que outras amostras
permitiram isolar micobactérias atípicas em cultura e 169 provinham de pacientes em que não foi isolada
nenhuma micobactéria em cultura.
5/23/2011
9:12 AM
Page 106
Não houve variabilidade significativa de resultados de um local para outro ou de um dia para outro e
assim, os resultados dos três locais puderam ser consolidados e apresentam-se aqui abaixo. Os valores
de leitura medidos em RLU estão limitados pela resolução do tubo fotomultiplicador do luminómetro. Por
esta razão, os valores superiores a 2.000.000 RLU foram truncados. Nem os desvios-padrão, nem os coeficientes de variação são indicados.
C. Reprodutibilidade
O estudo da reprodutibilidade foi efectuado com 25 amostras, intercaladas com testemunhos de amplificação negativos para um total de 50 amostras. O painel de reprodutibilidade foi testado em quatro locais.
No total, 100% (120/120) das amostras negativas e 98,8 % (79/80) das amostras positivas deram os
resultados esperados.
D. Especificidade analítica
A especificidade do teste MTD foi avaliada com bactérias, fungos e vírus. No caso das bactérias e dos
fungos, os testes de especificidade incluírem 160 estirpes/cepas (151 espécies provenientes de 62
géneros) de micobactérias muito próximas de M. tuberculosis, outros microrganismos responsáveis por
doenças respiratórias, e um painel filogenético de microrganismos da flora comensal do aparelho respiratório. As estirpes/cepas-tipo eram culturas ATCC (American Type Culture Collection), e 5 estirpes/cepas
foram fornecidas por laboratórios de análises. Os lisados, preparados a partir de culturas em crescimento
activo (ou de ARNr, em três casos) foram analisados seguindo o procedimento do teste MTD com cerca
de 5 x 107 UFC por teste. Só as estirpes/cepas do complexo M. tuberculosis deram resultados positivos,
exceptuando as estirpes/cepas M. celatum e M. tipo-terrae.
Com concentrações superiores a 30 UFC por teste, as estirpes/cepas de M. celatum e algumas
estirpes/cepas de M. tipo-terrae deram resultados positivos (26.772 RLU para M. celatum e de 19.470 a
49.976 RLU para M. tipo-terrae).
E. Limite de detecção
Foram detectadas, com o teste MTD, trinta estirpes/cepas de M. tuberculosis provenientes de regiões
geográficas muito variadas, incluindo representantes de estirpes/cepas resistentes e de estirpes/cepas
sensíveis aos antibióticos. O teste MTD detectou até 1 UFC por teste, de cada uma destas
estirpes/cepas.
F. Teste de sobrecarga
Foram analisados os ARNr de Mycobacterium tuberculosis , com uma concentração de 25 fg (equivalente
a 5 UFC por teste), na presença de cerca de 540.000 UFC por teste (450 μl) dos organismos não alvo
seguintes: Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas
aeruginosa, Mycobacterium gordonae, M. avium, M. kansasii, M. terrae, Nocardia asteroides, N. otitidis106
5/23/2011
9:12 AM
Page 107
caviarum, Corynebacterium pseudotuberculosis, C. diphtheriae, Gordona sputi e Rhodococcus bronchialis.
Todos os resultados foram positivos para o ARNr de M. tuberculosis na presença destes organismos nãoalvo, os quais, portanto, não criaram interferência.
RESOLUÇÃO DE INCIDENTES
OBSERVAÇÃO
Controlo negativo de
amplificação elevado ou
Controlo negativo de
Processamento da amostra
(> 20.000 RLU)
Controlo Positivo de
Amplificação Baixo ou Controlo
Positivo de Processamento da
Amostra
(< 500.000 RLU)
CAUSAS POSSÍVEIS
Homogeneização insuficiente
após adição do Reagente de
Selecção (S) ou volume insuficiente de Reagente de Selecção.
107
Português
RECOMENDAÇÕES
Voltar a homogeneizar correctamente.
Respeitar os volumes indicados.
Verificar o aparecimento de uma
solução de cor rosa uniforme após a
agitação.
Amplificação de contaminantes
Deve ter-se muito cuidado com a utiintroduzidos por falta de prelização das pipetas na distribuição dos
caução no decurso da preparação reagentes. Os tubos usados devem
das reacções.
ser descontaminados com uma
solução de lixívia a 1/10, como indicado no parágrafo «PROCEDIMENTO».
As bancadas, blocos de aquecimento,
banhos-maria e pipetas devem ser
Omissão da etapa de arrefecidescontaminados com uma solução de
mento de 5 minutos.
lixívia diluída a 1/2 como indicado no
Contaminação do laboratório ou
parágrafo «PROCEDIMENTO».
dos reagentes.
Omissão da limpeza dos tubos
Os tubos devem limpar-se com papel
antes da leitura no luminómetro.
absorvente húmido que não se desfaça, antes da leitura no luminómetro.
Desrespeito das temperaturas
Verificar a temperatura do banho-maria
preconizadas na etapa de amplifi- e/ou do bloco de aquecimento e
cação.
ajustá-la, se necessário, para respeitar
as temperaturas preconizadas.
Adição do Reagente de
Amplificação deitando o líquido
Agitar cuidadosamente num Vortex,
sobre as paredes do tubo e não
como especificado (consultar o parádirectamente no fundo.
grafo «Hibridização/ 2»). Verificar a forHomogeneização insuficiente
mação de uma solução de cor amarela
após adição do Reagente de
uniforme após a agitação.
Hibridização reconstituído.
Verificar a regulação do volume na
pipeta.
Volume excessivo de Reagente
Respeitar os 15 minutos de incubação
de Selecção.
a 60° C, no decurso da etapa de
Desrespeito do tempo preconiza- Selecção.
do para a etapa de selecção.
A temperatura dos tubos desceu
Transferir directamente os tubos do
a menos de 42°C após a
bloco de aquecimento a 95° C para
incubação a 95° C.
banho-maria / bloco de aquecimento a
Os tubos de passagem do
42° C.
Reagente de Detecção estão
Lavar os tubos com água quente como
entupidos.
indicado no manual de utilização do
aparelho.
5/23/2011
9:12 AM
Page 108
NOTAS
A Os blocos de aquecimento devem conter poços previstos para tubos de 12 x 75 mm. Aconselha-se a utilização dos blocos de aquecimento GEN-PROBE.
B Para a conservação das alíquotas congeladas recomenda-se a utilização de tubos de microcentrífuga com
tampa. As alíquotas congeladas individualmente podem ser descongeladas apenas uma vez. Não devem
ser usados congeladores com descongelação automática.
C Recomenda-se a utilização de frascos de congelação de 5 ml para a conservação das alíquotas congeladas.
As alíquotas congeladas individualmente podem ser descongeladas apenas uma vez. Não devem ser usados congeladores com descongelação automática.
D As performances dos Vortex podem variar consoante o material utilizado podendo, por isso, ser
necessário adaptar o tempo de agitação. Regular a velocidade do aparelho e seguir as instruções do
«PROCEDIMENTO, parágrafo E», para deixar a mistura de reacção atingir a metade superior da parede
do tubo. É indispensável uma boa homogeneização para obter resultados precisos. O tempo de agitação
pode ir até 15 segundos, sem afectar os resultados.
108
5/23/2011
9:12 AM
Page 109
BIBLIOGRAPHY/BIBLIOGRAPHIE/LITERATUR/BIBLIOGRAFIA
1. Thoracic Society, Medical Section of the American Lung Association, 1983. Levels of laboratory services
for mycobacterial diseases. Am. Rev. Respir. Dis. 128:213.
2. Arnold, L.J., P.W. Hammond, W.A. Wiese, and N.C. Nelson, 1989. Assay formats involving acridinuimester-labeled DNA probes. Clin. Chem. 35:1588-1594.
3. Bradley, S.T., S.L. Reed and A. Catanzaro, 1996. Clinical Efficacy of the Amplified Mycobacterium
Tuberculosis Direct Test for the Diagnosis of Pulmonary Tuberculosis. Am. J. Respir. Crit. Care Med.
153:1606-1610.
4. Centers for Disease Control, 1988. United States Morbid. and Mortal. Weekly Rep. 37:377-382, 387-388.
5. Centers for Disease Control and Prevention, and National Institute of Health. May, 1993. 3rd Edition.
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. pp. 93-96.
6. Collins, F. M., 1989. Mycobacterial disease, immunosuppression, and acquired immunodeficiency syndrome. Clin. Microbiol. Rev. 2: 360-377.
7. Kent, P.T. and G.P. Kubica, 1985. Public Health Mycobacteriology: A Guide for the Level III Laboratory.
U.S. Department of Public Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease
Control, Atlanta, GA.
8. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control: Principles and definitions;
Approved Guideline. NCCLS document C24-A. Villanova, PA: NCCLS; 1991.
9. Pitchenik, A.E., D. Fertel, and A.B. Block, 1988. Mycobacterial Disease: Epidemiology, Diagnosis,
Treatment, and Prevention. Clin. Chest Med. 9:425-441.
10. Roberts, G.D., E.W. Koneman, and Y.K. Kim, 1991. Mycobacterium, pp. 304-339. In A. Balows, et al.
(eds.), Manual of Clinical Microbiology, American Society for Microbiology, Washington, D.C.
11. Simone, P.M. and Iseman, M.D., 1992. Drug-resistant Tuberculosis: A Deadly and Growing Danger. J.
Resp. Dis. 13:960-971.
12. Wayne, L.G., 1982. Microbiology of the tubercle bacilli. Am. Rev. Respir. Dis. 125 (3 pt 2):31-41.
13. Van Soolingen, D., et al. 1997. A novel pathogenic taxon of the Mycobacterium tuberculosis complex,
canetti: characterization of an exceptional isolate from Africa. Intl. J. Syst. Bacteriol. 47:1236-1245.
14. Kerleguer A., Koeck J. L., Fabre M.,Gérôme P., Teyssou R., Hervé V., 2002. Application of a GreyZone for the Interpretation of The “Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test ”for the Rapid
Diagnosis of Respiratory Tuberculosis.Esm May 2002.
15. Coll P.,Garrigó M., Moreno C., Marti N., 2002. "Routine Use of E-Mtd (Gen-Probe) For Direct Detection
of Mycobacterium Tuberculosis in Clinical Samples."Esm 2002.
109
5/23/2011
9:12 AM
Page 110
110
5/23/2011
9:12 AM
Page 111
111
5/23/2011
9:12 AM
Page 112
112
5/23/2011
9:12 AM
Page 113
113
5/23/2011
9:51 AM
Page 114
Gen-Probe Incorporated
San Diego, CA 92121 (USA)
Authorized Representative
EMERGO EUROPE
Molenstraat 15
2513 BH, The Hague
The Netherlands
IN0013F-01 Rev. F 2011-05
©1995 - 2011 Gen-Probe Incorporated

IN0013F-01 Rev. F.qxd

Transcripción

Documentos relacionados

mtd amplification controls mtd amplifizierungskontrollen contrôles d

JUNKERS Ju87B-2/R

Lowienie rybek

instruction manual electric basses

libretto 14026