Roche Diagnostics Informa Octubre 2010

Transcripción

Roche
Diagnostics
informa
Octubre 2010
LA MEDICINA
PERSONALIZADA
Una nueva era para
el laboratorio clínico
Utilidad clínica de
los marcadores
angiogénicos en la
preeclampsia
4
Troponina T cardíaca
ultrasensible.
Un paso adelante
en el diagnóstico
45
cardiológico.
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Roche Diagnostics informa | Octubre 2010
Utilidad clínica de los marcadores
angiogénicos en la preeclampsia.
4
Nuevas perspectivas en el cribado del cáncer
de cuello de útero. Importancia de la prueba de
detección del virus del papiloma humano.
9
Microparticulas circulantes
17
Diseño e implantación del programa de cribado
del Síndrome de Down y otras
cromosomopatías en la Comunidad
Autónoma Vasca
23
Incorporación del equipo Sysmex XT 4000i
en la automatización de líquidos biológicos en
el laboratorio y modificación del protocolo
de trabajo.
32
Importancia de la carga viral plasmática de
bajo nivel en la infección por virus de la
inmunodeficiencia humana tipo-1 (VIh-1).
39
Troponina T cardíaca ultrasensible. Un paso
adelante en el diagnóstico cardiológico.
45
E d i t a : Roche Diagnostics S.L. Av. Generalitat 171-173 08174 Sant Cugat del Vallès Tel. 935834000 Fax 935834340
D i r e c t o r a : Maite Panadero C o m i t e d e r e d ac c i ó n : Luis de Cabo, Maribel Villarino, José Luis Salvador y José Mari Sanz
R e a l iz ac i ó n : Miguel Luis Maier e - m a i l : [email protected] D e p ó s i t o l e g a l : B-4684 1980
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LA MEDICINA PERSONALIZADA
Una nueva era para el laboratorio clínico
La medicina personalizada es un nuevo concepto en la práctica médica que ha llegado para quedarse. Si bien no
es una forma desconocida de hacer medicina – por ejemplo, la medición de la glucosa en sangre o del tiempo de
coagulación para adaptar las dosis terapéuticas a los pacientes en función de los datos aportados por el diagnóstico
in vitro realizado supone una cierta individualización del tratamiento – el actual uso de este término, su desarrollo
conceptual y su aplicación práctica supone un significativo avance en la forma de diagnosticar y definir la medidas
terapéuticas para ciertas patologías.
Existen claras evidencias desde hace tiempo que demuestran que la eficacia de las terapias es muy irregular y que
sus efectos no deseados son, a veces, dramáticos. Por ejemplo, en EE.UU. se producen anualmente más de 100.000
muertes asociadas a efectos secundarios indeseables de medicamentos convencionales. En otros estudios se ha
comprobado que solamente entre un 25% y un 75% de los pacientes obtienen una eficacia terapéutica adecuada
cuando son tratados con fármacos de uso común, según el tipo de enfermedad. Este hecho es especialmente relevante
en oncología, donde la tasa de fracaso llega hasta el 80%, lo que hace necesario un largo y arriesgado proceso de
prueba y error por parte del clínico tratante hasta encontrar una respuesta terapéutica positiva. Los profesionales de
la medicina, por tanto, están ansiosos por disponer de herramientas que les permitan preveer de antemano el efecto
que una cierta terapia pueda tener en un paciente para así poder buscar la más efectiva y minimizar adicionalmente los
riesgos asociados al uso de medicamentos.
El desarrollo de nuevas tecnologías para el diagnóstico, establecidas sobre el conocimiento de las bases moleculares
y genéticas de las enfermedades, tienen el potencial de convertirse en esa deseada herramienta. La abundante
investigación biomédica que se está desarrollando alrededor de estos tópicos está aportando incontestable evidencia
molecular y clínica sobre la bondad de estos conceptos y hace posible por primera vez el diagnóstico, la elección
terapéutica adecuada y la evaluación del pronóstico médico de varias patologías, especialmente cáncer, que poco
tiempo atrás presentaban formidables desafíos a los clínicos. La medicina personalizada se puede definir en este
contexto como la capacidad de ajustar el tratamiento a subgrupos específicos de pacientes que comparten similitudes,
ya sea a nivel genético o en la naturaleza molecular de la enfermedad.
El papel del laboratorio es crucial para poder desarrollar las potencialidades medicas y asistenciales de este nuevo
enfoque. El laboratorio debe dar un salto cualitativo y pasar a ser un elemento imprescindible en la medicina,
proveyendo al clínico no sólo de datos valiosos sino, sobre todo, de información fundamental para poder diseñar juntos
el mejor tratamiento posible para los pacientes y convertirse así en actor destacado en la práctica médica moderna.
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Roche Diagnostics informa | Junio 2008
UTILIDAD CLíNICA DE LoS MARCADoRES
ANGIoGéNICoS EN LA PREECLAMPSIA
Ignacio Herraiz García1, Ana Elena López Jiménez2 , Paula Isabel Gómez Arriaga1, Alberto Galindo Izquierdo1
1 Servicio de Obstetricia y Ginecología. Hospital Universitario “12 de Octubre”. Madrid.
2 Servicio de Bioquímica Clínica. Hospital Universitario “12 de Octubre”. Madrid
Introducción
La preeclampsia (PE) forma parte de la triada de
complicaciones más temibles del embarazo, conjuntamente
con la hemorragia puerperal y las infecciones. La PE está
involucrada en el 15% de las muertes maternas relacionadas
con el embarazo. Estas cifras no se han visto reducidas a
pesar de los importantes avances acontecidos en la última
década en la medicina perinatal, e incluso aumentan en
países como el nuestro a consecuencia del incremento en la
edad media materna, la inmigración, la obesidad y los
embarazos múltiples derivados de las técnicas de
reproducción asistida (1).
La PE es un trastorno hipertensivo del embarazo que se
asocia a un daño vascular sistémico materno con particular
afectación de los endotelios fenestrados presentes en el riñón,
el hígado y el cerebro. Puesto que la PE produce una
afectación generalizada del sistema circulatorio, la
hipertensión es una de sus manifestaciones más frecuentes,
pero no es la única. Actualmente la PE se define por consenso
como la nueva aparición de hipertensión y proteinuria
significativa a partir de la semana 20 de gestación, aunque se
debe sospechar ante la presencia de hipertensión asociada a la
alteración de cualquiera de sus órganos diana durante la
segunda mitad del embarazo (2).
La PE afecta a aproximadamente el 3% de las gestaciones,
elevándose este porcentaje hasta el 5-10% en presencia de
factores de riesgo como la nuliparidad, edad materna
superior a 40 años, raza negra, embarazo múltiple,
fecundación in vitro o enfermedad trombofílica. En mujeres
con factores de muy alto riesgo como la hipertensión crónica,
diabetes mellitus, obesidad, nefropatía o antecedente de PE
en un embarazo previo, la probabilidad de padecer una PE se
eleva al 10-30% (3).
El espectro clínico de la PE es muy amplio. El 80-90% de los
casos son de presentación tardía (más allá de la semana 34 de
gestación) y cursan habitualmente como formas leves sin
repercusión en el pronóstico materno y/o fetal. El 10-20%
restante aparecen de forma precoz (antes de la semana 34) y
se asocian con más frecuencia a complicaciones maternas (4)
como la insuficiencia renal, fallo hepático, trastornos de la
coagulación, hemorragia hepática, edema de pulmón,
convulsiones (eclampsia) e ictus, así como con
complicaciones fetales: retraso del crecimiento intrauterino y
abruptio placentae. A pesar de la evidente asociación entre la
precocidad en la aparición de la PE y su severidad, el curso de
este síndrome resulta difícilmente predecible de forma
individual (5).
Aún no se dispone en la práctica clínica habitual de métodos
suficientemente efectivos para su predicción, prevención ni
diagnóstico precoz. Tampoco existe un tratamiento curativo,
exceptuando la finalización de la gestación. Los principales
dilemas en cuanto al manejo clínico se plantean en los casos
precoces, cuando la terminación del embarazo actúa en
detrimento del pronóstico fetal y su continuación puede
poner en riesgo la salud materna. A pesar de estas
limitaciones, se ha demostrado que la optimización del
manejo clínico de la PE disminuye sustancialmente sus
complicaciones, siendo éste su único factor pronóstico
modificable (6) (tabla I).
Tabla I. Principales determinantes del pronóstico materno y fetal en la
preeclampsia
Factores que condicionan el pronóstico
Edad gestacional en el momento del diagnóstico
Presencia o ausencia de criterios de severidad
Presencia o ausencia de enfermedades predisponentes
Calidad de la atención médica
La principal dificultad que hasta el momento se ha
interpuesto en la mejora del manejo clínico de la PE es el
desconocimiento acerca de aspectos fundamentales
relacionados con su fisiopatología. Se cree que si bien la PE se
manifiesta clínicamente a partir de la segunda mitad del
embarazo, su sustrato patogénico se establece durante la
primera mitad y se debe a una placentación anómala. Desde
hace tiempo se acepta que la presencia de la placenta es un
requisito indispensable para la aparición de la PE. No así el
feto, ya que la PE puede aparecer en gestaciones molares.
Tampoco el útero, ya que se ha descrito la existencia de PE en
gestaciones abdominales. Además, tras la expulsión de la
placenta, los signos y síntomas de la PE remiten rápidamente
por lo general. Los primeros cambios fisiopatológicos
conocidos que conducen a la PE acontecen en la circulación
úteroplacentaria y dan lugar a una insuficiencia e isquemia
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placentaria. Sin embargo, el fallo en la placentación no es
suficiente para explicar el daño endotelial que origina el
síndrome materno, ya que alteraciones placentarias similares
se han encontrado también en casos de crecimiento
intrauterino fetal restringido e incluso en embarazos de curso
normal. Debe existir, por tanto, una relación entre una
placentación insuficiente y la inducción de una lesión
vascular materna, que podría estar mediada por factores
liberados a la circulación general desde una placenta
hipóxica. En resumen, la PE se concibe como un trastorno
que se establece en dos fases: la primera consiste en el
establecimiento de una deficiente circulación placentaria
durante la mitad inicial del embarazo que condiciona un
estado de hipoxia placentaria, y la segunda en la aparición de
una respuesta sistémica materna durante la mitad final de la
gestación (7) (figura 1).
Genética
Ambiente
Factores inmunológicos
ALTERACIÓN
PLACENTARIA
PREDISPOSICIÓN
PLACENTA
MADRE
FETO
Implantación superficial
CIR
Hipoxia placentartia
ALTERACIÓN
SISTÉMICA
sFlt1 / PIGF
OBESIDAD
DM
DISLIPEMIA
TROMBOFILIA
¿INFECCIÓN?
PESO
Estrés oxidativo
LÍPIDOS
Disfunción
endotelial
PE
NO DM
NO PE
materno (8). El propósito fundamental de esta revisión es
plantear cuáles pueden ser las futuras aplicaciones clínicas
derivadas del estudio de los marcadores angiogénicos
involucrados en la patogenia de la PE.
Papel de los marcadores angiogénicos en la fisiopatología
de la preeclampsia
Los estudios sobre perfiles de expresión génica, iniciados hace
ya más de diez años, permitieron diferenciar algunas
sustancias cuya formación se encontraba regulada al alza en
tejidos placentarios de embarazos complicados con PE. De
este modo, algunos grupos de investigación familiarizados
con el estudio de la angiogénesis comenzaron a interrogarse
acerca del aumento de la expresión en estos tejidos de la
forma soluble de la proteína fms-like tyrosine kinase 1 (sFlt1), que reconocieron como un importante factor implicado
en la angiogénesis y la vasculogénesis en enfermedades
oncológicas y nefrológicas. Esto dio lugar a la realización de
estudios sobre sueros de gestantes que padecieron PE. En ellos
se encontraron también concentraciones elevadas de sFlt-1.
Esta proteína actúa como un potente factor antiangiogénico
endógeno antagonista de dos factores proangiogénicos
conocidos como vascular endotelial growth factor (VEGF) y
placental growth factor (PlGF). La sFlt-1 se adhiere a los
dominios de unión de PlGF y VEGF, variando la
configuración de estas proteínas. Esto impide su interacción
con los receptores endoteliales de superficie y por tanto
induce la disfunción endotelial (9) (Figura 2).
Figura 1. Teoría actualmente aceptada en relación a la patogenia
de la preeclampsia. En las gestantes predispuestas se produce una
implantación placentaria anómala durante la primera mitad de la
gestación que impide el normal intercambio de flujo sanguíneo entre la
madre y la placenta, comprometiendo el crecimiento fetal. La placenta
en situación de hipoxia libera a la circulación general un exceso
de factores antiangiogénicos (sFlt1) y menor cantidad de factores
angiogénicos (PlGF). El sistema circulatorio materno se altera de forma
directamente proporcional al insulto antiangiogénico e inversamente
proporcional a la capacidad de defensa de sus endotelios. Dicha
capacidad defensiva se encuentra disminuida en aquellas mujeres
con factores condicionantes de daño endotelial. La preeclampsia
aparece en el momento en que el desequilibrio angiogénico supera las
capacidades compensatorias del endotelio materno.
CIR, crecimiento intrauterino restringido; sFlt1, soluble fms-like tyroxin
kinase 1; PlGF, placental growth factor; DM, diabetes mellitus; PE,
preeclampsia.
El principal avance reciente en la investigación sobre la PE
consiste en el descubrimiento de la existencia de un
desequilibrio en la producción y liberación a la circulación
materna de factores reguladores de la angiogénesis desde las
placentas en situación de isquemia. Se postula que éste es el
insulto de origen placentario que ocasiona el daño vascular
Figura 2. Esquema representativo del equilibrio normal entre factores
angiogénicos circulantes, comparado con la disfunción endotelial
inducida en la preeclampsia.
Flt1, fms-like tyrosine kinase 1; PlGF, placental growth factor; VEGF,
vascular endothelial growth factor; sFlt1, soluble fms-like tyrosine
kinase.
[5]
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Actualmente se cree que la sFlt-1 es un péptido involucrado
de forma clave en el desarrollo de la PE. Se ha demostrado in
vitro que las placentas hipóxicas expresan en mucha mayor
cantidad la sFlt-1. De forma interesante, se han encontrado
valores aumentados de la ratio sFlt-1/PlGF en sueros de
madres que desarrollan PE hasta cinco semanas antes de su
establecimiento clínico. Dicha ratio también se encuentra
aumentada en la PE injertada sobre enfermedades como la
hipertensión crónica, el lupus eritematoso sistémico y la
glomérulonefritis. Además, la severidad de la PE se ha
correlacionado positivamente con los valores de la ratio sFlt1/PlGF circulantes. Por último, también se ha observado que
los valores de sFlt-1/PlGF de las mujeres que han padecido
una PE se normalizan tras el parto. En modelos animales, la
administración exógena de sFlt-1 en ratas gestantes induce
hipertensión, proteinuria y endoteliosis glomerular, que son
hallazgos similares a los encontrados en la PE humana (10).
Determinación analítica de los marcadores angiogénicos
sFlt-1 y PlGF
La técnica de enzimoinmunoensayo (ELISA) manual ha sido
hasta este momento el único método disponible para la
cuantificación de ambos marcadores. En la actualidad, Roche
ha desarrollado el primer método automatizado para ser
utilizado en las plataformas Elecsys y Cobas y para el análisis
de PlGF y sFlt-1. Para ambos marcadores se trata de un
inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) de 18
minutos que utiliza dos anticuerpos monoclonales: uno
biotinilado específico anti-PlGF o anti-sFlt-1 (anticuerpo de
captura) y otro marcado con un complejo de rutenio
(anticuerpo de detección).
Las principales características analíticas de los métodos:
linealidad, precisión total y límite de detección, resultan
convenientes para los propósitos clínicos. No se ven afectados
por biomoléculas clásicas como la hemólisis hasta una
concentración de hemoglobina libre de 5 g/L, ictericia hasta
una concentración de bilirrubina de 427,5 µmol/L (25 mg/dL)
ni lipemia hasta 15,81 mmol/L (1400 mg/dL) de
concentración de triglicéridos. Tampoco se han encontrado
interferencias con fármacos de uso común.
El suero es la muestra recomendada, recogida en tubo seco o
con gel separador. Sin embargo, en nuestro laboratorio hemos
obtenido valores intercambiables en tubo con presencia de
anticoagulante heparina de litio.
Aún no hay datos de variabilidad intraindividual que
permitan conocer la variación biológica total de ambos
marcadores
Los valores de referencia han sido obtenidos a partir de un
estudio multicéntrico europeo en el que ha participado un
hospital español (Hospital Universitario “12 de octubre” de
Madrid) y han sido recientemente publicados (tabla II) (20).
Tabla II. Valores de referencia de los factores angiogénicos Placental
Growth Factor (PlGF) y soluble fms-like tyrosine kinase 1 (sFlt1)
obtenidos con la plataforma automatizada Elecsys system (Elecsys PIGF,
human PIGF y Elecsys sFlt-1, sFlt-1).
Percentiles del test Elecsys sFIt-1 (pg/mL)
Semanas de gestación
10-14
15-19
20-23
24-28
29-33
34-36 37-parto
Perc. 5
555
470
649
630
707
978
1671
Perc. 50
1445
1459
1576
1449
1934
2972
4400
Perc. 95
2361
2785
2944
3890
6688
9921
11324
N (visitas)
40
44
82
98
105
78
77
Percentiles del test Elecsys PIGF (pg/mL)
10-14
15-19
20-23
24-28
29-33
34-36 37-parto
Perc. 5
29,4
65,7
125
130
73,3
62,7
52,3
Perc. 50
62,8
135
265
412
439
232
161
Perc. 95
183
203
541
1108
1108
972
659
N (visitas)
40
44
82
98
105
78
77
Cociente entre los percentiles de los tests Elecsys sFIt-1/Elecsys PIGF
10-14
15-19
20-23
24-28
29-33
34-36 37-parto
Perc. 5
5,21
4,32
2,19
1,01
0,945
1,38
3,65
Perc. 50
22,7
12,6
6,09
3,80
4,03
13,3
26,2
Perc. 95
57,3
26,9
14,8
16,9
86,4
92,0
138
N (visitas)
40
44
82
98
105
78
77
Marcadores angiogénicos en la predicción de la
preeclampsia
En la práctica clínica actual, no existe un método óptimo
para seleccionar a aquellas gestantes con un mayor riesgo de
desarrollar una PE. Las gestantes con factores conocidos de
muy alto riesgo de PE son seguidas de forma más intensiva en
consultas especializadas en embarazos de alto riesgo, según
se recomienda en los protocolos de la Sociedad Española de
Ginecología y obstetricia (11). Sin embargo, la mayoría de los
casos de PE suceden en gestantes clasificadas a priori como de
bajo riesgo, mientras que entre las seleccionadas como de alto
riesgo, más de tres cuartas partes no llegan a padecer nunca
una PE. Si se pretende mejorar la sensibilidad del cribado
incluyendo a embarazadas con criterios de selección más
laxos tales como la nuliparidad, la edad avanzada o la raza
negra, el cribado pierde todo su sentido práctico, ya que
incluiría a más de la mitad de la población de gestantes para
su seguimiento intensivo, lo cual resulta inasumible para
cualquier sistema de salud (12). El estudio Doppler ecográfico
de las arterias uterinas maternas con el fin de valorar de
forma indirecta las resistencias al flujo úteroplacentario se ha
propuesto como un método para mejorar la detección de las
gestantes con mayor riesgo de desarrollar una PE. Aunque es
un método que alcanza una sensibilidad del 60-70% para
detectar los casos de PE precoz, su empleo rutinario no se ha
extendido ya que presenta un bajo valor predictivo positivo
-situado alrededor del 20%- y hacen falta ecografistas
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experimentados para su medición (13).
La consecución de un método de cribado para la PE más
eficiente podría servir para mejorar nuestra capacidad de
discriminación, de manera que se pudiesen concentrar los
esfuerzos en aquellas gestantes en las que el cribado resultara
positivo y disminuir la ansiedad en el grupo de embarazadas
con factores de riesgo en el que resultara negativo. La
inexistencia de un tratamiento efectivo disponible es la
principal limitación para considerar necesario el cribado de
la PE en la actualidad. Sin embargo, la correcta selección
puede ser la clave para identificar a aquellas mujeres que más
se puedan beneficiar de medidas profilácticas (14). Un
reciente metanálisis demuestra que la administración de
ácido acetilsalicílico en baja dosis (75-150 mg/día) puede
evitar aproximadamente un 10% de los casos de PE siempre
que se comience a administrar durante la primera mitad del
embarazo y en gestantes de alto riesgo (15). Por tanto, se cree
que esta modesta acción preventiva de la aspirina podría
potenciarse con la implantación de un cribado de la PE al
final del primer trimestre. Aunque en esta etapa no se ha
completado aún la implantación placentaria, algunos
marcadores de PE ya se encuentran alterados. Uno de los
marcadores que mejores resultados predictivos ha
demostrado en esta edad gestacional es la PlGF. En
combinación con otros marcadores bioquímicos como la
proteína placentaria A asociada al embarazo (PAPP-A) y
ecográficos como el estudio Doppler de las arterias uterinas
ha demostrado alcanzar una sensibilidad y especificidad
cercanas al 90% para la detección de la PE precoz (16). Esta
estrategia de cribado resulta fácilmente implementable al
cribado combinado de cromosomopatías que ya se realiza de
forma rutinaria en la mayoría de centros entre las semanas
11-14, sin la necesidad de añadir nuevas pruebas.
El sFlt-1 no ha demostrado su eficacia en el primer trimestre,
pero sí en la segunda mitad del embarazo. Entre las 20-24
semanas de gestación alcanza una sensibilidad del 37-67%
con una especificidad del 89-95% para la predicción de la PE
precoz. Para una especificidad del 95%, la sensibilidad se
eleva al 83% y 89% con el uso combinado de sFlt-1+PlGF y
sFlt-1+PlGF+Doppler de las arterias uterinas,
respectivamente (17, 18).
Por tanto, la aplicación de los nuevos marcadores
angiogénicos en combinación con otros marcadores de PE ya
conocidos como el estudio Doppler de las arterias uterinas ha
puesto a nuestro alcance la posibilidad inimaginable hace tan
solo pocos años de realizar un cribado eficiente de la PE antes
de la segunda mitad del embarazo.
Marcadores angiogénicos como ayuda al diagnóstico
La utilidad de los marcadores angiogénicos, y en concreto de
la ratio sFlt-1/PlGF, para el diagnóstico de la PE se muestra
incluso superior a la de la predicción. Dos estudios
publicados a comienzos de este año han demostrado que la
ratio sFlt-1/PlGF tiene una sensibilidad y especificidad
superior al 95% para el diagnóstico de la PE precoz una vez
que ésta ya está establecida mediante criterios clínicos (19,
20).
La certeza diagnóstica que aporta la elevación de la ratio sFlt1/PlGF puede resultar de gran utilidad para el manejo de
algunas situaciones clínicas. Por ejemplo, el 15-20% de los
casos de síndrome de HELLP (hemólisis, elevación de
transaminasas y disminución de plaquetas) y el 40% de los
casos de eclampsia, cursan sin la presencia inicial de
hipertensión y/o proteinuria, mientras que la ratio sFlt-1/
PlGF se muestra muy elevada de forma constante en estas
complicaciones graves de la PE. También ayuda a confirmar
el difícil diagnóstico de PE injertada en gestantes con
hipertensión y/o proteinuria previa, ya que la ratio sFlt-1/
PlGF obtiene una concordancia casi perfecta con el
diagnóstico clínico final (19). Por último, la ratio sFlt-1/PlGF
también se ha mostrado de gran utilidad para realizar el
diagnóstico diferencial entre la PE y la agudización de otras
enfermedades que pueden simular el mismo cuadro clínico,
tales como el síndrome nefrótico, la crisis lúpica, el síndrome
hemolítico urémico o la púrpura trombótica
trombocitopénica (21). Realizar el diagnóstico diferencial en
estos casos es de vital importancia a la hora de decidir si se
continúa o no con la gestación, ya que si se trata de alguno de
estos diagnósticos diferenciales se puede intentar un
tratamiento curativo que permita prolongar el embarazo. Por
el contrario, si se trata de una complicación de la PE obliga a
finalizar la gestación independientemente de la edad
gestacional, ya que no existen tratamientos curativos y la
situación solamente es susceptible de empeorar. Por tanto, la
normalidad de la ratio sFlt-1/PlGF en cuadros susceptibles de
ser confundidos con una PE nos puede ayudar a evitar
prematuridades yatrogénicas innecesarias de los recién
nacidos. La reciente automatización de los métodos para
determinar la sFlt-1 y la PlGF permite su rápida obtención, lo
cual puede resultar de gran interés en situaciones de urgencia
que requieran confirmar el diagnóstico de PE.
otra posible utilidad de la ratio sFlt-1/PlGF es la predicción
de complicaciones. En la actualidad se recomienda el manejo
expectante de la PE precoz siempre que no exista una
complicación que suponga un riesgo inminente para la salud
de la madre y/o el feto (22). Esta actitud permite la
prolongación del embarazo y la consiguiente mejora del
pronóstico del recién nacido, pero siempre se ve amenazada
por la posible instauración de una complicación grave de la
PE que en ocasiones se presenta de forma súbita e
impredecible. De hecho, en uno de cada tres casos de PE
precoz fracasa esta actitud expectante y es necesario finalizar
la gestación de forma inmediata. Se ha observado que la ratio
sFlt-1/PlGF se eleva especialmente antes de la aparición de las
complicaciones más graves de PE (23). Por tanto, la
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monitorización de los valores de sFlt-1/PlGF en las mujeres
que sufren casos de PE precoz podría ayudar a decidir cuánto
prolongar el manejo expectante en ellas sin someterlas al
riesgo de una complicación que pueda ponerlas en grave
riesgo.
Por último, el descubrimiento de la implicación de los
factores angiogénicos en el desencadenamiento de los
mecanismos patogénicos de la PE ha dado lugar a la búsqueda
de tratamientos dirigidos hacia estos factores. Por el
momento estos tratamientos se encuentran en fase
experimental con animales, habiéndose obtenido resultados
preliminares exitosos con el empleo de factores
proangiogénicos recombinantes (24). Si estos tratamientos se
aplican en humanos en el futuro, será imprescindible
determinar previamente los marcadores angiogénicos para
conocer qué gestantes son susceptibles de ser beneficiadas
con su empleo (tabla III).
Tabla III. Posible aplicaciones de los marcadores angiogénicos en la
práctica clínica.
1. Predicción de la PE en la primera mitad del embarazo:
• Primer trimestre (11-14 semanas): selección de gestantes que
se pueden beneficiar de medidas profilácticas como el AAS en
baja dosis.
• Segundo trimestre (20-24 semanas): selección de gestantes
que se pueden beneficiar de un seguimiento intensivo.
2. Diagnóstico precoz: el ratio sFlt-1/PlGF permite el
diagnóstico de la PE hasta 5 semanas antes de la aparición de
los signos y síntomas clínicos.
3. Diagnóstico diferencial:
• Casos dudosos.
• Casos atípicos.
4. Identificación de los casos favorables para el tratamiento
conservador.
5. Selección de candidatas para futuros tratamientos
preventivos y curativos.
PE, preeclampsia; AAS, ácido acetilsalicílico; sFlt-1, soluble
fms-like tyrosine kinase1; PlGF, placental growth factor.
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[8]
RDiOCT2010.indb 8
07/10/10 10:37
NUEVAS
PERSPECTIVAS
EN EL CRIBADo
DEL CÁNCER DE
CUELLo DE ÚTERo.
IMPoRTANCIA
DE LA PRUEBA DE
DETECCIÓN DEL
VIRUS DEL PAPILoMA HUMANo.
edad menos incidencia de infecciones VPH transitorias).
Existe una evidencia sólida para recomendar la utilización de
la detección del VPH, conjuntamente con la citología, en el
cribado del cáncer de cuello de útero por encima de los 30
años. Múltiples estudios exploran la eficacia y eficiencia de
aplicar la detección del VPH como prueba única en el cribado
primario del cáncer cervical. Existe un interés creciente en el
genotipado, especialmente para la toma de decisiones en
mujeres con VPH positivo y citología normal. La progresiva
implementación de la vacuna frente al VPH acelerará los
profundos cambios en los programas de cribado existentes. El
cribado basado en la citología repetida se abandonará por ser
poco eficiente. La detección del VPH en primera línea será de
elección pudiéndose iniciar el cribado más tarde y con
intervalos más prolongados.
Aureli Torné
Servicio de Ginecología Oncológica.
Hospital Clínic.
Institut d’Investigadions
Biomèdiques Agustí Pi i Sunyer IDIBAPS.
Departamento de Ginecología y
Obstetricia. Universidad de
Barcelona. Barcelona.
Resumen
El principal objetivo del cribado del cáncer de cuello de útero
es disminuir la incidencia y mortalidad por dicha neoplasia
mediante la identificación y tratamiento de sus lesiones
precursoras. El cribado rutinario mediante citología cervical,
introducido hace más de 50 años, ha permitido una notable
reducción de dicha enfermedad entre la población cribada.
Una de sus principales limitaciones es la baja sensibilidad,
que se suple, en parte, por la reiteración de la prueba. La
dificultad en organizar cribados centralizados aplicables a la
mayor parte de la población, se ha traducido en un gran
esfuerzo y costes para los países desarrollados, que con
frecuencia realizan cribados oportunistas, y en la práctica
ausencia de cribado en los países en desarrollo.
La implicación etiopatogénica del virus del papiloma humano
(VPH) en estas lesiones y la disponibilidad de técnicas para
su detección ha posibilitado su introducción en la practica
clínica. La prueba de detección del VPH, frente a la citología,
aporta una gran sensibilidad, reproducibilidad, fácil
monitorización y elevado valor predictivo negativo que
permiten aumentar el intervalo de cribado. La discreta
perdida de especificidad se ha minimizado indicando su
determinación sólo a mujeres mayores de 30 años (a mayor
1. Citología en el cribado del cáncer cervical: ventajas y
limitaciones.
El cáncer de cuello de útero, con unos 500.000 casos nuevos
anuales, constituye el segundo cáncer más frecuente entre las
mujeres en todo el mundo y el primero más frecuente en la
mayoría de países en desarrollo. En los países desarrollados,
en los que se realiza algún sistema de prevención secundaria,
esta neoplasia es la sexta o septima más frecuente pero es la
segunda o tercera en importancia entre las mujeres más
jóvenes (por debajo de los 45 años).
Desde que se estableció el concepto de lesión precursora del
cáncer de cuello de útero, la citología cervical (según técnica
de Papanicolaou), ha constituido el principal método de
cribado capaz de reducir significativamente tanto la
incidencia como la mortalidad por dicha neoplasia entre los
países en los que se ha aplicado de forma masiva y
continuada. Sin embargo, en los últimos años, además de sus
ventajas, también se han puesto de manifiesto sus
deficiencias, especialmente su falta de sensibilidad, que obliga
a reiterar la exploración para reducir el número de falsos
negativos. La principales limitaciones de la citología son:
1. Naturaleza subjetiva de la prueba, que comporta errores en
la interpretación.
2. Marcada variabilidad, dependiente en gran medida del
medio en el que se aplique y del control de calidad que se
lleve a cabo en todo el proceso (toma de muestra,
procesamiento y lectura).
3. Baja reproducibilidad, que explica el amplio intervalo de
sensibilidad y especificidad según el laboratorio en el que se
realice.
4. Necesidad de una compleja infraestructura sanitaria para
[9]
RDiOCT2010.indb 9
07/10/10 10:37
llevar a cabo todo el cribado. A pesar del esfuerzo en
introducir la prueba de forma generalizada, sólo algunos
países en todo el mundo han conseguido hacerlo
organizadamente y reducir drásticamente la incidencia y
mortalidad por dicha neoplasia
En esta misma línea, datos recientes procedentes de
diferentes estudios de revisión de la literatura muestran que
una citología única puede ser incapaz de detectar hasta el
40-50% de las lesiones de alto grado o invasivas
confirmadas histológicamente (1, 2). Un metaanálisis que
incluyó 59 series halló para la citología una elevada
especificidad (90-95%) a expensas de una muy baja
sensibilidad (20-35%). otro metaanálisis sobre 12 estudios
metodológicamente impecables, seleccionados de entre 94
publicaciones, halló que la citología convencional presenta
un intervalo de sensibilidad entre el 30% y el 87% y una
especificidad entre el 86% y el 100% (2). Por último, un
estudio aleatorizado ha confirmado que la sensibilidad de la
citología para la detección de lesiones de alto grado
(CIN 2+) es del 53% y la especificidad del 97% (3). Estas
limitaciones de la citología todavía son más notables en el
caso del adenocarcinoma de cuello de útero, donde el
cribado citológico se ha mostrado inefectivo para reducir las
tasas de incidencia y mortalidad por dicha neoplasia (4).
La reciente introducción de diversos métodos de lectura
automatizada de la citología persiguen un mayor
rendimiento y pueden ser una opción para mejorar la
eficiencia. Sin embargo, globalmente la lectura automática
parece ofrecer pequeñas ventajas comparada con la citología
convencional (5).
2. Detección del VPH en la prevención secundaria del
cáncer de cérvix
En las dos últimas décadas múltiples investigaciones
clínicas, epidemiológicas y virológicas, han demostrado que
todos los cánceres de cuello uterino, tanto los derivados del
epitelio escamoso como del epitelio glandular, están
relacionados causalmente con la infección cervical por tipos
oncogénicos de VPH (6). Más concretamente, se ha
demostrado que la progresión de las lesiones cervicales
siempre está asociada a la infección persistente por tipos de
VPH de alto riesgo oncogénico (VPH-AR).
El desarrollo experimental y clínico de sistemas de
detección del VPH capaces de identificar la presencia de
alguno de los tipos oncogénicos ha permitido plantear su
potencial beneficio en el diagnóstico de lesiones precursoras
del cáncer de cérvix, especialmente CIN-2 y CIN-3. Las
limitaciones de la citología como prueba de cribado junto
con la evidencia de que los métodos de detección del VPH
son fiables, exactos y reproducibles ha permitido evaluar su
utilidad en la prevención secundaria del cáncer de cérvix
(7).
En la práctica clínica, la prueba para la detección de
VPH-AR se ha considerado potencialmente útil en tres
situaciones:
1. Cribado en combinación con la citología o como prueba
única para la detección de lesiones precancerosas del cérvix.
2. Selección de mujeres con citologías que presentan
alteraciones menores (ASC-US) que requieren reevaluación
para diagnóstico y eventual tratamiento.
3. Seguimiento en mujeres tratadas por lesiones
intraepiteliales de alto grado para predecir curación o
posible recidiva.
3. Métodos de detección del VPH en la práctica clínica
En condiciones ideales, una prueba de detección de VPH
destinada al cribado del cáncer de cérvix debería tener una
elevada sensibilidad, que permita identificar el mayor
número de casos de CIN y evitar su progresión, y una
elevada especificidad, que permita disminuir el
sobretratamiento de lesiones de bajo grado que
probablemente regresen espontáneamente.
Para la validación clínica de una prueba de detección de
VPH es importante tener en cuenta el concepto de
sensibilidad analítica (detección de cualquier infección
VPH-AR, incluso las infecciones transitorias que son
clínicamente irrelevantes) y el concepto de sensibilidad
clínica (detección de infecciones VPH-AR asociadas a
CIN-2/3+ y por tanto clínicamente relevantes). La detección
de VPH-AR en el cribado cervical sólo es útil cuando ésta se
asocia a la presencia o desarrollo de CIN 2/3+ (8).
Los dos métodos de detección del VPH más utilizados en la
práctica clínica son la captura híbrida y la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR).
CAPTURA DE HíBRIDoS II (HC-II):
Método basado en la hibridación del ADN del VPH con
sondas de ARN marcadas. Los híbridos ADN-ARN se
detectan con un anticuerpo monoclonal específico y un
sustrato quimioluminiscente, (medición semicuantitativa
de la carga viral). Existen dos sondas, una para 5 tipos de
VPH de bajo riesgo (VPH-BR: 6,11,42,43 y 44) y otra para 13
tipos de VPH de alto riesgo (VPH-AR: 16,18,31,33,35,39,45,5
1,52,56,58,59 y 68) (Digene HC2 High-Risk HPV DNA Test
de Qiagen). El resultado se expresa en unidades relativas de
luz (URL) siendo positivo a partir de 1 URL. En la práctica
clínica sólo se utiliza la sonda para VPH-AR. La HC2 se ha
validado en numerosos estudios clínicos y se aprobó por la
FDA en el año 2000 como técnica de selección de mujeres
con citología anormal y posteriormente en el año 2003 para
su uso en el cribado conjuntamente con la citología (9).
PCR DE CoNSENSo:
Este método detecta varios genotipos de VPH en una sola
[10]
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sesión de amplificación. Los cebadores o “primers”
empleados van dirigidos al gen L1 (una región del genoma
altamente conservada) y varían en el tamaño. Los test de
PCR de consenso más frecuentemente utilizadas son
GP 5+/6+, PGMY09/11 y SPF10.
• Amplicor® (Roche Molecular Diagnostics, Basilea, Suiza)
es el primer Kit comercial de PCR disponible. Utiliza varios
cebadores que se dirigen a un pequeño fragmento de 170 pb
de los genes L1 de los 13 tipos de alto riesgo de VPH
incluidos en la HC2. El pequeño tamaño del fragmento
amplificado permite una buena sensibilidad analítica.
• cobas® 4800 (Roche Molecular Diagnostics, Basilea,
Suiza) es un sistema totalmente automatizado que detecta
por separado los genotipos de VPH de alto riesgo
(VPH –AR) 16 y 18 , además la detección de 12 genotipos de
alto riesgo (31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68)
• Cervista™ HPV-HR es una prueba de amplificación
isotérmica que utiliza la enzima cleavasa, endonucleasa que
reconoce y digiere el extremo 5’ de los anillamientos
producidos en el ADN.
GENoTIPADo:
La identificación selectiva de los tipos de VPH es útil ya
que la persitencia viral y el riesgo de progresión es variable
incluso entre los VPH-AR.
• Genotipado con PCR de consenso: se basa en el marcaje
de los productos de PCR con biotina durante el proceso de
amplificación y posterior hibridación con sondas
específicas.
• La última generación de Captura Híbrida permite el
genotipado, utilizando primers GP5+/6+ que identifican
los tipos 16, 18 y 45, con una técnica muy sensible y de fácil
uso e interpretación.
• Genotipado con microarrays: consiste en fijar secuencias
de oligonucleótidos de diferentes tipos específicos de VPH
sobre una membrana de celulosa, incrustada en un cristal.
Constituye un método sensible, rápido y sencillo.
- Clinical Arrays HPV ® (Genomica, Coslada-Madrid,
España), detecta los 35 tipos de VPH de alto y bajo riesgo
más relevantes.
- Linear Array HPV (Roche Diagnostics , Basilea, Suiza)
permite la identificación de 37 genotipos de VPH de alto y
bajo riesgo con control de b-globina
- Biomedlab (Seul, Corea del Sur) microarrays en el que se
fijan sondas de oligonucleótidos específicos y una sonda de
control de beta globina se fijan a una diapositiva.
- Luminex: el ADN del VPH se amplifica mediante una
PCR consenso, PGMY09/11 o GP5+/6+. El genotipado se
basa en la hibridación con sondas de oligonucleótidos tipo
específico con bolas de poliestireno en suspensión que se
tiñen con f luoróforos.
- PapilloCheck® (Greiner-Bio-one, Frickenhausen,
Alemania) amplifica un fragmento de E1. Los microarrays
genotipan simultáneamente 24 VPH-BR, AR y probable alto
riesgo.
4. Detección del VPH en el cribado del cáncer de cérvix:
características y aspectos diferenciales con la citología
Las ventajas de la detección del VPH en el cribado fueron
evidenciadas en 1995 por Cuzick et al. al observar que el
44% de los casos de CIN2+ no habían sido diagnosticados
por la citología pero sí por la prueba VPH (que incluía sólo
los tipos 16, 18, 31 y 33) en un estudio sobre 2009 mujeres
(10). El mismo grupo publicó en 1999 el valor del cribado
conjunto (citología y detección de VPH mediante HC2) en
3000 mujeres mayores de 34 años. La sensibilidad para
CIN2+ fue del 95% y el VPP del 27%, concluyendo que el
cribado conjunto podría suponer una mayor protección y
permitir un mayor intervalo de cribado (11).
Posteriormente se han publicado múltiples estudios
comparativos entre citología y detección de VPH
(frecuentemente realizados mediante captura híbrida). El
análisis de 15 series publicadas entre 2000 y 2006 halló una
sensibilidad para la detección de lesiones CIN2/3 y cáncer
claramente superior para las pruebas de detección de VPH
que para la citología (91,1% versus 61,3% respectivamente)
(12). También se confirmó la gran dispersión de los
resultados de la citología (intervalo de sensibilidad entre
18,6% y 94%) consecuencia de la gran variabilidad entre
laboratorios. Por contra, los resultados de los diferentes
estudios mostraron una dispersión mínima para la detección
de VPH (intervalo: 84,9% - 100%), lo que confirma la
elevada reproducibilidad de esta prueba. Respecto a la
especificidad, la citología aventajó ligeramente a las pruebas
de VPH con valores del 93,5% (intervalo: 77,8 - 99,5%)
frente a 89,3% (intervalo: 81,8 - 96,5%) respectivamente. En
esta misma línea, un reciente metaanálisis concluyó que, de
promedio, la detección de VPH tiene una sensibilidad un
27% mayor y una especificidad un 8,4% menor que la
citología (13).
otro aspecto deseable para una prueba de cribado es el
elevado valor predictivo negativo (VPN), o probabilidad de no
tener enfermedad cuando el resultado de la prueba es
negativo. Diversos estudios, en diferentes poblaciones y
grupos de edad, hallaron un VPN para la detección de VPH
por encima del 97% (incluso en muchos estudios el VPN fue
del 99%-100%) (11, 13, 14-19). El elevado VPN de la detección
de VPH tiene importantes implicaciones en el cribado ya que
un resultado negativo se traduce en un riesgo insignificante de
desarrollar cáncer de cérvix en los próximos 5-8 años (7). Las
mujeres con una citología y una prueba de VPH negativos
tienen un riesgo inferior a 1 entre 1000 de tener un CIN 2+ no
detectado (20).
En la tabla I se resumen los puntos clave sobre la utilidad de la
prueba de detección de VPH en el cribado del cáncer cervical.
[11]
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Tabla I. Prueba de detección de VPH en el cribado del cáncer cervical:
aspectos clave.
Existe una evidencia sólida para recomendar la utilización de
la prueba de detección de VPH en el cribado del cáncer de
cuello de útero en mujeres mayores de 30 años.
Edad e intervalo de cribado
La prueba de detección de VPH no es apropiada para el
cribado de mujeres de menos de 30 años.
La detección de VPH conjuntamente con la citología en
mujeres de más de 30 años, no debe realizarse antes de los 3
años (cuando ambas pruebas son negativas)
La detección de VPH no debe realizarse nunca en un
intervalo inferior a 12 meses.
El incremento del intervalo de cribado es una de las mayores
ventajas de la prueba de detección de VPH.
Sensibilidad – Especificidad
Prueba de VPH en la detección precoz de CIN 2/3. Un Test
positivo es más predictivo de CIN2 + en el seguimiento
posterior que una citología anormal.
Prueba de VPH negativa: riesgo extremadamente bajo de
tener o desarrollar CIN2+ (elevado VPN)
La mayor desventaja de la prueba de detección de VPH es la
falta de especificidad (más en mujeres < 30 años).
Implicaciones: sobreestudio de mujeres VPH positivas,
sobrediagnóstico y sobretratamiento.
Se necesitan nuevos protocolos para las mujeres VPH
positivas para evitar el exceso de colposcopias y el
sobretratamiento de lesiones regresivas
5. Cribado cervical mediante citología y detección de VPH
conjuntamente
La International Agency for Research on Cancer (IARC)
confirmó en 2005 que existía una evidencia suficiente sobre
la utilidad de la prueba de detección de VPH en la reducción
de la incidencia y mortalidad por cáncer de cérvix. Por tanto,
no existen dudas sobre si dicha prueba debe o no
incorporarse a los programas de cribado sino en como debe
incorporarse (21).
La elevada sensibilidad y VPN de la prueba de VPH en la
detección de lesiones precancersosas del cérvix, claramente
superior a la citología, junto con su facilidad, fiabilidad y
reproducibilidad han permitido, en los últimos años, su
progresiva introducción tanto en los programas de cribado
organizados (poblacionales) como en los oportunistas. Todos
los programas que combinan citología y detección de VPH
incluyen un corte de edad, mujeres mayores de 30-35 años, en
las que existe una menor prevalencia de VPH-AR y una
mayor incidencia de CIN3 y cáncer. Además, la combinación
de ambas pruebas ha demostrado ser mejor que la utilización
de cualquiera de ellas por separado.
Diferentes estudios confirman que la utilización conjunta de
citología y detección de VPH ofrece una sensibilidad óptima
(media: 95,7%, límites: 76,3-100,0%) con un VPN del 100%
sin apenas dispersión entre los estudios. Estos resultados
sustentan la posibilidad de que el intervalo entre cribados
pueda ser alargado con seguridad (12). Por ejemplo, un
estudio halló que la incidencia acumulada de CIN3 o cáncer,
cuando ambas pruebas fueron negativas, fue del 0,16% a los
Primera citología
3 años después del primer coito
o a los 25 años de edad
(con relaciones sexuales
Citología anual cada dos años de edad
Repetir cada 3 años
*
Ambos normales
> 35 años
Final del cribado
65 años
Citología y ADN-VPH
Ambos negativos
Citología (-)
VPH (+)
Citología (+)
Citología y VPH
cada 5 años
Citología y VPH
al año
Protocolo de
citología anormal
* Opción sujeta a disponibilidad del test de VPH.
Figura 1: Algoritmo para el cribado
primario del cáncer de cuello uterino.
Consenso de la Sociedad Española de
Ginecología y Obstetricia (SEGO), la
Sociedad Española de Citología (SEC),
la Asociación Española de Patología
Cervical y Colposcopia (AEPCC) y
la Sociedad Española de Anatomía
Patológica (SEAP). Adaptado de PuigTintoré et al. 2006
[12]
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45 meses y del 0,33% a los 10 años (22). Por tanto, si ambas
pruebas son negativas es posible alargar con confianza y
seguridad el intervalo de cribado hasta 5 o más años (23-26).
Por último, antes de aplicar la prueba de detección de VPH
en el cribado se deberían tener en cuenta consideraciones
económicas y estudios de coste-eficacia para cada medio
particular.
En noviembre de 2006 la Sociedad Española de Ginecología y
obstetricia (SEGo), la Sociedad Española de Citología (SEC),
la Asociación Española de Patología Cervical y Colposcopia
(AEPCC) y la Sociedad Española de Anatomía Patológica
(SEAP) publicaron un Documento de Consenso que establece
el cribado primario del cáncer de cérvix tal como se expone
en la figura 1 (27).
6. Cribado cervical mediante detección VPH (como prueba
única) y selección con citología. Genotipado viral.
En la mayoría de los países desarrollados la detección de
VPH-AR en mujeres mayores de 30 años es inferior a 10-15%.
En este contexto más del 80% de las mujeres cribadas
presentan citología y VPH negativos. Basándose en estos
datos se ha sugerido el uso, en mujeres mayores de 30 años,
de la detección de VPH como prueba única en cribado
primario (11). Una objeción teórica a esta pauta radica en la
baja especificidad de la prueba de VPH que puede representar
un incremento de mujeres referidas para un seguimiento
innecesario y potencial sobrediagnóstico y sobretratamiento
con los costes asociados. Para incrementar la especificidad sin
perder la sensibilidad de esta prueba se han propuesto dos
opciones: 1) utilizar la citología como prueba secundaria
reservándola únicamente para las mujeres VPH-positivas; 2)
realizar alguno de las pruebas de detección de VPH que
permita el genotipado viral.
Se sabe que los tipos de VPH 16 y 18 presentan un riesgo
significativamente mayor de desarrollar CIN-2+, o
adenocarcinoma que el resto de virus oncogénicos. Diferentes
estudios han demostrado que el VPH 16 y 18 son los dos tipos
más prevalentes en el cáncer escamoso y adenocarcinoma
(provocan el 70% y 80% de todos los casos, respectivamente).
Concretamente, la infección persistente por el VPH 16
representa un riesgo acumulado de CIN 2+ a los 10 años del
22% y la infección persistente por VPH 18 del 17%. Por el
contrario, el riesgo para el resto de tipos de VPH-AR es de
1-2% y para las mujeres VPH negativas tiende a ser de cero
(28).
Por todo ello, se ha propuesto que las mujeres con test VPH
positivo para los tipos 16 y 18 se realicen una colposcopia
inmediata o un seguimiento más intensivo (a los 6 y 12
meses) dado el elevado riesgo de CIN3. En contra, las mujeres
VPH-AR positivas pero negativas para los tipos 16 y 18
pueden seguirse de manera menos intensiva (a intervalos de 1
ó 2 años) con la consiguiente reducción del número de
colposcopias (29).
La American Society for Cervical Pathology and Colposcopy
(ASCPC) en 2009 ha publicado una modificación en sus guías
clínicas que contempla el genotipado en el algoritmo
diagnóstico de las mujeres con VPH positivo y citología
anormal. El objetivo es seleccionar a las mujeres con
infección por VPH 16 y 18 para realizar colposcopia
inmediata. Por el contrario, el resto de mujeres positivas para
otros VPH-AR deben realizarse un control anual con
citología y detección de VPH (figura 2) (30)
Recientemente se ha publicado unas recomendaciones para la
práctica clínica en la prevención primaria y secundaria de los
cánceres de cuello de útero y vulva, en las que también se
incluye el genotipado en el algoritmo diagnóstico de las mujeres
con resultado de VPH positivo y citología anormal (31).
Test VPH-AR (+) / citología (-)
VPH 16/18 (+)
VPH 16/18 (-)
Repetir test VPH-AR y citología
(al año)
Colposcopia
Ambos (-)
Citología (-)
VPH (+)
Citología (+)
VPH (+/-)
Cribado
rutinario
Colposcopia
Conducta
según guía
Figura 2: Algoritmo para el cribado del
cáncer de cuello uterino. Genotipado
en la selección de las mujeres con test
VPH-AR positivo. American Society for
Cervical Pathology and Colposcopy
(ASCPC, 2009).
[13]
RDiOCT2010.indb 13
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En la actualidad están en marcha 7 grandes ensayos clínicos
randomizados diseñados para demostrar, en los próximos
años, la eficacia de la detección det VPH en el cribado
primario: Suecia (Swedescreening con 12.500 mujeres),
Holanda (PoBASCAM con 44.000 mujeres), Reino Unido
(ARTISTIC con 25.000 mujeres), Italia (NTCC con 95.000
mujeres), Finlandia (Finnish RPHT con 200.000 mujeres),
Canada (12.000 mujeres) e India (140.000 mujeres).
VACUNACIÓN FRENTE AL VPH: IMPACTo EN LAS ESTRATEGIAS DE
CRIBADo
La vacunación frente a los VPH 16/18 reducirá –pero no
eliminará– el riesgo de cáncer de cuello uterino. Las mujeres
correctamente vacunadas tendrán, a corto plazo, una
importante reducción de las alteraciones citológicas menores
(ASC-US, L-SIL) y a largo plazo una reducción de la
prevalencia de H-SIL y de cáncer de cérvix.
Esta reducción de la prevalencia de anomalías cervicales
condicionará en la citología una pérdida del valor predictivo
positivo (VPP). Se estima que el actual VPP (en torno a 5070%) caerá al 10-20% en el caso de cribar mujeres vacunadas
(32). Esto significa que aumentará el porcentaje de mujeres
con falsos positivos. Por contra, la menor prevalencia de
alteraciones entre las vacunadas, puede suponer una
disminución del rigor y atención de lectura por parte de los
citotécnicos, con la consiguiente perdida de sensibilidad y
aumento de falsos negativos. En definitiva, la citología en el
contexto de mujeres vacunadas será una exploración todavía
mucho menos eficiente.
La detección de VPH es más sensible y discretamente menos
específica que la citología para la detección de lesiones de alto
grado o cáncer. Dado que la prueba de VPH no depende de
una interpretación subjetiva, mantendrá su rendimiento en
condiciones de baja prevalencia. Por tanto a medida que la
vacunación sea capaz de reducir las tasas de prevalencia de las
lesiones cervicales, la prueba de VPH será proporcionalmente
superior a la citología. Sin embargo, la elevada especificidad
de la citología la convierte en la prueba ideal para utilizar en
segunda línea y descartar lesiones de alto grado o cáncer
entre los casos VPH positivos.
En definitiva, la vacuna frente al VPH acelerará los profundos
cambios que deben realizarse en los programas de cribado
existentes. La modalidad de cribado basada en la citología
repetida deberá abandonarse por ser poco eficiente. La
detección de VPH, los test que permitan genotipar o los
nuevos marcadores moleculares, actualmente en estudio,
ofrecerán mejor capacidad para seguir a las mujeres
vacunadas. La citología quedará como prueba de selección
para los casos VPH positivos. La baja prevalencia de lesiones
precursoras del cáncer de cérvix entre las mujeres vacunadas
y la elevada sensibilidad y VPN de test VPH permitirá que el
cribado se inicie más tarde y con intervalos más prolongados.
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HST-N. Automatización Sysmex
Soluciones integradas para el laboratorio de hematimetría
• Organización del análisis celular en muestras de sangre total.
• Especializado en hematología.
• Gestión del tubo de EDTA Sysmex WOrkExPErTELInE.
[16]
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MICRoPARTICULAS
CIRCULANTES
Juan Carlos Reverter Calatayud, M. Dolores Tàssies Penella.
Servicio de Hemoterapia y Hemostasia. Hospital Clínic.
Institut d’Investigacions Biomèdiques Agustí Pi i Sunyer - IDIBAPS. Barcelona
Introducción
Desde la década de los sesenta se identifican en la circulación
fragmentos de plaquetas activadas, aunque el conocimiento
de la posible existencia de elementos subcelulares en la sangre
con actividad procoagulante venia ya de antes. Estos
fragmentos son vesículas celulares, que no solo son de origen
plaquetario, de pequeño tamaño liberadas a la circulación a
las que posteriormente se ha venido a denominar
micropartículas circulantes.
Aunque inicialmente estas micropartículas se consideraron
poco relevantes, estudios posteriores han demostrado que son
componentes de la sangre que poseen una gran actividad
biológica, tanto en situaciones fisiológicas como patológicas.
Actualmente las micropartículas circulantes constituyen un
campo de activa investigación tanto en el territorio de la
hemostasia, con un papel en apariencia prioritariamente
procoagulante, como en otros campos numerosos de la
biología, habiéndolas llegado a considerar, incluso, como
directores de orquesta en las interacciones celulares. En la
presente exposición revisaremos su origen, funciones (en
especial las referidas a la hemostasia), y modos de detección
actuales.
¿Qué son las micropartículas circulantes?
Las micropartículas circulantes son fragmentos celulares de
un tamaño de entre 0,1 y 1 µm de diámetro que se
encuentran en el plasma y proceden de las membranas
citoplasmáticas tras la activación o la apoptosis de las células
de origen. Las vesículas de menor tamaño, de unos 50 a 100
µm, se llaman exosomas y las partículas de mayor tamaño, de
más de 1,5 µm, se denominan cuerpos apoptóticos. La
definición de consenso de la Sociedad Internacional de
Trombosis y Hemostasia (ISTH) las define como vesículas de:
a) tamaño entre 0,1 a 1 µm de diámetro.
b) sin núcleo ni capacidad de síntesis.
c) con citoesqueleto.
d) pueden proceder de una amplia variedad de células y
contienen cantidades variables de fosfatidilserina y de
antígenos de superficie de las células de las que se originan.
Las micropartículas se producen por vesiculación de la
membrana citoplasmática debida a mecanismos que son aún
en buena parte desconocidos pero que parecen derivar de
cambios en el citoesqueleto y en la modificación de la
asimetría normal de los fosfolípidos de la misma ocasionados
por incremento del calcio intracelular. El aumento de calcio
intracelular produce la reorganización de las proteínas del
citoesqueleto y origina cambios en la asimetría de los lípidos
de membrana, debidos a la activación de la flopasa o la
escramblasa y a la inactivación de la flipasa, con exposición
en la cara externa de la membrana de fosfolípidos aniónicos,
fundamentalmente fosfatidilserina, que usualmente están en
la cara citoplasmática de la membrana celular.
Las micropartículas circulantes así formadas constituyen una
población muy heterogénea de fragmentos celulares de
diferentes orígenes que derivan de una amplia variedad de
células tanto normales (tales como plaquetas, leucocitos,
monocitos, linfocitos, eritrocitos, células endoteliales o
células musculares lisas) como patológicas (células
neoplásicas).
Las micropartículas pueden originarse como respuesta a
numerosas noxas como pueden ser los procesos infecciosos,
la inflamación aguda o crónica, las situaciones de
hipercoagulabilidad o las neoplasias, entre muchas otras.
Estas situaciones actúan sobre los elementos celulares y les llevan
a generar micropartículas, las cuales tendrán acciones biológicas
que pueden causar lesiones, sobretodo vasculares, pudiendo, a su
vez, realimentar el proceso (figura 1).
Las micropartículas circulantes transportan en sus
membranas y en el citoplasma restante numerosas proteínas y
elementos celulares que proceden de las células de las que
derivan. En las micropartículas circulantes se encuentran
tanto receptores funcionales de membrana, como el factor
tisular, así como proteínas intracelulares, segundos
mensajeros y material genético.
Además, las micropartículas circulantes pueden fusionarse
con otras micropartículas de distinto origen celular. Estas
fusiones de membranas entre micropartículas incrementan la
[17]
RDiOCT2010.indb 17
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LESIÓN
ACCIÓN:
procoagulante
proinflamatoria
protrombótica
Micropartículas
Endotelio
Plaquetas
Leucocitos
Figura 1. Mecanismo de la
acción patológica vascular de
las micropartículas. Diversas
situaciones como procesos
inflamatorios, infecciosos u
otros pueden actuar sobre
células normales del tipo del
endotelio, las plaquetas o los
leucocitos e inducir a éstas
a liberar micropartículas a
la circulación sanguínea.
Estas micropartículas
ejercerán en los vasos sus
acciones procoagulante,
proinflamatoria y
protrombótica causando
lesión vascular la cual puede,
a su vez, retroalimentar
la formación de más
Inflamación
Infección
Hipercoagulabilidad
Cáncer
complejidad aparente de la población de micropartículas y se
ve confirmada por el hallazgo de micropartículas circulantes
que expresan simultáneamente proteínas específicas de
distintas líneas celulares.
¿Qué funciones tienen las micropartículas circulantes?
Las micropartículas circulantes intervienen en muchos
procesos fisiológicos como la hemostasia, la inflamación, el
remodelado vascular y la angiogénesis. Se han descrito como
posibles mediadores en enfermedades inflamatorias,
cardiovasculares, diabetes mellitus y en la progresión
tumoral. Asimismo, las micropartículas circulantes que
expresan factor tisular y moléculas de adhesión, como la
P-selectina y su ligando la P-selectin glycoprotein ligand-1
(PSGL-1), pueden tener un importante papel en la formación
del trombo sea éste fisiológico o patológico.
En situación normal fisiológica el efecto biológico de las
micropartículas circulantes depende en buena medida de su
composición lipoproteica y de proteínas de membrana, que
varia dependiendo del tipo celular que las ha originado y del
estímulo que ha causado su formación. Las micropartículas
circulantes externalizan fosfolípidos aniónicos, en especial
fosfatidilserina, que están involucrados en la fase de inicio y
amplificación de la coagulación sanguínea y que también
pueden intervenir en otros procesos biológicos, como la
inflamación y la activación del complemento.
Las micropartículas circulantes se han descrito aumentadas
en numerosas entidades (tabla I). Así, en los pacientes con
cáncer se puede encontrar un número aumentado de
micropartículas circulantes que se producen por causas aún
no completamente aclaradas. En estos enfermos, el origen
celular de las micropartículas circulantes pueden ser a partir
de las células tumorales o de las células normales, como
células endoteliales, monocitos y plaquetas. Se ha podido
demostrar relación entre la generación de micropartículas
circulantes y la actividad procoagulante asociada al cáncer y
se han correlacionado con el riesgo de trombosis en estos
enfermos. La micropartículas circulantes también parecen
jugar un papel importante en la trombocitopenia inducida
por heparina y en los pacientes con infecciones. El aumento
de micropartículas circulantes en estos enfermos favorece
una generación de trombina aumentada y la formación
consecuente de trombos. Las micropartículas circulantes
además pueden contribuir a la patogenia del
tromboembolismo venoso ofreciendo localmente la superficie
fosfolipídica aniónica requerida para la formación del
complejo tenasa y del complejo protrombinasa de la
coagulación y se supone que también contribuyen la
reorganización del trombo tras una trombosis venosa.
Asimismo, las micropartículas circulantes pueden tener un
papel en la púrpura trombótica trombocitopénica
transportando factor von Willebrand capaz de inducir los
agregados plaquetarios, en las trombosis que se dan en la
hemoglobinuria paroxística nocturna o en las enfermedades
autoinmunes y en ciertas complicaciones de la gestación
como la pre-eclampsia o el retraso de crecimiento
intrauterino.
En su acción sobre la hemostasia, las micropartículas
circulantes proporcionan una superficie fosfolipídica
procoagulante cargada negativamente, preferentemente por
expresión de fosfatidilserina, que permite el ensamblaje de las
Tabla I. Enfermedades en las que se ha descrito un aumento de
• Cáncer
• Infecciones
• Enfermedades cardiovasculares
• Trombosis venosa profunda y embolismo pulmonar
• Anemia falciforme
• Trombocitopenia inducida por heparina
• Púrpura trombótica trombocitopénica
• Hemoglobinura paroxística nocturna
• Enfermedades autoinmunes
• Diabetes mellitus
• Hipertensión arterial grave
• Infección por virus de la inmmunodeficiencia humana
• Preeclampsia
• Esclerosis múltiple
• Insuficiencia renal
[18]
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enzimas de las vías de la coagulación, que es indispensable
para promover la generación de trombina e incrementa la
actividad procoagulante del factor tisular. Además de la
acción de sus fosfolípidos, las micropartículas circulantes
contribuyen a la activación de la coagulación por la expresión
de factor tisular transportado por las mismas. Las
micropartículas circulantes expresan diferentes efectores
específicos en función de su origen, aunque, como ya se ha
indicado, puede haber con cierta frecuencia micropartículas
circulantes híbridas fruto de fusiones de las mismas. Así, las
micropartículas circulantes de origen plaquetario expresan
P-selectina, glicoproteínas de membrana o tromboxano y su
interacción con monocitos o con micropartículas circulantes
monocitarias, promueve la expresión en su superficie de
factor tisular. Por su parte, las micropartículas de origen
monocitario pueden expresar, junto al factor tisular, PSGL-1
la cual puede unirse a la P-selectina de las plaquetas activadas
que están en la zona del trombo inicial, localizando así la
presencia de factor tisular y gran cantidad de fosfolípidos
aniónicos de membrana en ese punto. En el sentido contrario,
la presencia de trombomodulina y de proteína C en la
superficie de las micropartículas circulantes sugiere que éstas
también pueden actuar con un papel anticoagulante, por lo
que, dependiendo de los estímulos, las micropartículas
circulantes pueden ser preferentemente pro- o
anticoagulantes, contribuyendo de este modo a la regulación
de la coagulación.
Las micropartículas circulantes también participan en la
angiogénesis a través de su contenido en factores promotores
como el VEGF o por la expresión de moléculas de adhesión y
por el transporte de diversos factores de crecimiento y
metaloproteinasas. Asimismo, las micropartículas circulantes
contribuyen a los mecanismos de la inflamación aumentando
la expresión de citocinas en los monocitos y las células
endoteliales y favoreciendo la agregación de los leucocitos a
través de la P-selectina y de la PSGL-1. otra función que se ha
descrito de las micropartículas circulantes es la modulación
de la respuesta inmune mediante la exposición de FasL
(CD95L) en su superficie, lo que puede inducir la apoptosis
de los linfocitos T citotóxicos.
Adicionalmente a sus potenciales efectos debidos a su acción
biológica como micropartículas, las micropartículas, tras
unirse a receptores celulares específicos, puede fusionar su
membrana con la de la célula diana transfiriendo a estas
últimas su contenido citoplasmático de proteínas, de RNA, e
incluso de oncogenes causando modificaciones del fenotipo
en las células diana.
¿Cómo se cuantifican las micropartículas circulantes?
La determinación, cuantificación y caracterización, de las
micropartículas circulantes en el laboratorio es compleja.
Para intentar lograrlo se han desarrollado diferentes
metodologías que miran cada una de ellas distintos aspectos
de las micropartículas circulantes y de diferentes modos. En
esencia podemos clasificar los métodos de laboratorio
principales para el estudio de las micropartículas circulantes
en cuatro grupos:
a) Citometría de flujo.
b) Estudio de la capacidad procoagulante de las
micropartículas.
c) Métodos de ELISA de captura de las micropartículas.
d) Microscopía electrónica.
a) La citometría de flujo se ha empleado con frecuencia en la
evaluación de las micropartículas circulantes y es la
metodología más extendida para éste uso en los laboratorios.
Sin embargo, la citometría de flujo para la determinación de
las micropartículas circulantes tiene numerosos problemas y
limitaciones en cuanto a su estandarización. De todos modos,
resulta un método rápido y permite la detección simultánea
de múltiples marcadores antigénicos y del tamaño de las
micropartículas. De esta manera es posible por citometría de
flujo identificar distintas subpoblaciones de micropartículas.
Desafortunadamente, la citometría de flujo se ve claramente
limitada en la evaluación de las micropartículas menores a
0,5 µm, debido a que por su tamaño se aproximan a la
longitud de onda de la luz láser utilizada, aunque los
instrumentos más modernos digitales parece que pueden
llegar a determinar incluso micropartículas de hasta menos
de 0,3 µm y ciertamente los nuevos citómetros de impedancia
también pueden ser de mayor resolución. En cualquier caso,
el efecto del ruido de fondo es siempre problemático para el
estudio de las micropartículas circulantes por citometría y
depende mucho del instrumento, de su antigüedad y de su
mantenimiento. En numerosas ocasiones para medir las
micropartículas circulantes se requiere la adición a la muestra
de marcadores de tamaño calibrados. Visto de una manera
global los estudios de citometría de flujo para evaluar
micropartículas circulantes tienen la ventaja de requerir
volúmenes muy pequeños, pero como defectos son bastante
caros y algo lentos, precisan de operadores especializados y
son muy sensibles a la producción de artefactos durante el
procesamiento de los especímenes.
b) Los ensayos de actividad procoagulante se basan en medir
la expresión de fosfolípidos aniónicos en la superficie de las
micropartículas en cuanto a su capacidad de contribuir en la
generación de trombina. Esta acción sobre la hemostasia es
una de las funciones biológicas claves de las micropartículas
circulantes. Para este fin se ha empleado un test de cefalina
diluida o el tiempo de víbora de Russell bajo determinadas
condiciones. Sin embargo, estos aparentemente sencillos
métodos se han visto en muchas ocasiones limitados por la
dificultad de obtener un plasma realmente libre de
micropartículas y pueden verse afectados por la presencia de
anticoagulante lúpico o por disminución de los factores de la
coagulación. También se ha introducido un método
[19]
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Adición de plasma
libre de micropartículas
Aporta factores
de la coagulación
Adición de reactivos
de activación
2+
con factor Xa y Ca
Especimen
a estudiar
Incubación
automatizable basado en la adición de factor X activado y
calcio en un ensayo con empleo de plasma libre de
micropartículas obtenido por acción de un veneno de
serpiente (figura 2). Asimismo, en otros estudios se han
realizado modificaciones para estudiar las micropartículas en
ensayos de medición de potencial endógeno de trombina para
hacerlos sensibles y aproximadamente lineales a la
concentración de las mismas. De un modo general, los
ensayos de actividad procoagulante de las micropartículas
circulantes son baratos, pueden automatizarse en muchos
casos y realizan una evaluación global de una función
biológica esencial de las mismas. Por otra parte, pueden tener
como puntos débiles el no dar información del tamaño y
origen de las micropartículas circulantes y centrarse solo en
una función de las mismas.
c) Los métodos de ELISA de captura de las micropartículas se
basan en ensayos con la presencia de sustancias adheridas a la
superficie de los pocillos que inmovilizan a las
micropartículas en suspensión, las cuales luego pueden ser
detectadas y cuantificadas. El método más usual para realizar
esta inmovilización es la unión a los pocillos de anexina V
que, a su vez, es capaz de unirse a la fosfatidilserina expresada
por las micropartículas y de este modo capturarlas. También
se han desarrollado ensayos en los que esta fase de
inmovilización se realiza con el empleo de anticuerpos
capaces de detectar marcadores celulares específicos. Una vez
inmovilizadas las micropartículas, su detección puede
realizarse por diversos métodos. Las micropartículas pueden
revelarse empleando anticuerpos monoclonales marcados en
un ensayo tipo sandwich, pero los métodos más interesantes
son aquellos que las detectan en ensayos procoagulantes con
la adición de calcio, factor X activado y un sustrato
cromogénico sensible a la trombina. Estos ensayos de captura
de las micropartículas son relativamente baratos y muy
versátiles y pueden ser automatizados, al menos en parte.
Asimismo, realizan una medición global de las
micropartículas de cualquier tamaño y origen. Sin embargo,
Coagulación
Figura 2. Esquema de un
ensayo de medición de
actividad procoagulante
basado en la adición de
factor X activado y calcio y
el empleo de plasma libre
de micropartículas obtenido
por acción de un veneno
de serpiente. Un tempo
de coagulación más corto
indica un mayor contenido
de micropartículas en el
espécimen a estudiar.
hay que destacar el inconveniente de que son muy
dependientes de la especificidad del método de captura.
d) La microscopía electrónica es otra aproximación que se ha
desarrollado para el estudio de las micropartículas
circulantes. La microscopía óptica está limitada por sus
características para la observación y medición de las
micropartículas menores de 1 µm aunque el empleo de la
microscopía confocal puede contribuir a una mejor
aproximación. Sin embargo, la microscopía electrónica
resulta muy útil para evaluar las micropartículas en su
tamaño, forma y arquitectura interior. El empleo simultáneo
de microscopía electrónica con tinción inmunológica, como
puede ser con inmuno-oro, puede localizar de modo preciso
en las micropartículas distintas proteínas de interés funcional
o marcadores de su origen. Sin embargo, estas metodologías
de microscopía electrónica son caras y lentas, precisan de
operadores especializados y son muy sensibles a la aparición
de artefactos durante la fijación, procesamiento y tinción de
los especímenes.
A estos métodos principales se están incorporando
recientemente nuevas tecnologías capaces de medir las
micropartículas circulantes. Así, los estudios con la
tecnología de Dinamic Light Scattering (DLS) permiten
medir de forma muy ajustada partículas incluso de menor
tamaño que las micropartículas circulantes sanguíneas. Esta
tecnología permite la medición del tamaño de las
micropartículas y analizar los histogramas de distribución
del mismo, pero no permite analizar su función o
componentes. En este sentido, en la actualidad se está
empezando a introducir la medición de fluorescencia en estos
sistemas de DSL. También se han evaluado las
micropartículas circulantes empleando la microscopía de
fuerza atómica. En este método las micropartículas
circulantes se inmovilizan en una superficie mediante
anticuerpos específicos frente a componentes de su
membrana.
Estos dos últimos métodos, DLS y microscopía de fuerza
[20]
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atómica, capaces de medir micropartículas de muy pequeño
tamaño han permitido demostrar que las micropartículas
medidas por citometría de flujo solo son una fracción
mínima de las que realmente están presentes. Este dato
podría ayudar a explicar la mala correlación de las
micropartículas circulantes medidas por citometría en
numerosas entidades nosológicas y los resultados mucho más
ajustados de los métodos funcionales.
En cualquier caso, hay que destacar que, en cualquiera de los
métodos, la fase preanalítica es de crucial importancia para la
cuantificación de las micropartículas circulantes y así ha sido
destacado por la ISTH en su Subcomité de Biología Vascular.
Se precisa de una muy cuidadosa atención en la extracción de
la muestra en referencia al tamaño de la aguja, al uso de
torniquete y al tipo de anticoagulante empleado. También hay
que ser estricto en la preparación del plasma con vigilancia
del tiempo transcurrido desde la extracción, de la
centrifugación, y de la congelación y descongelación de los
especímenes.
Conclusiones
Las micropartículas circulantes son unos efectores vasculares
activos y por esa razón están involucradas en muchos
procesos biológicos tales como las trombosis, la inflamación
o el remodelado vascular. Actualmente todavía hay
limitaciones técnicas en la cuantificación y el estudio de la
función de las micropartículas circulantes por lo que se
precisa un esfuerzo para su mejor identificación,
caracterización y estandarización de las técnicas de
cuantificación. En una aproximación hipotética, el control
farmacológico de las micropartículas circulantes en su
número o función podría representar una atractiva vía
terapéutica para restaurar la biología vascular fisiológica. Por
tanto, el avance en el conocimiento de la biología y funciones
de las micropartículas circulantes puede ofrecer mejoras
importantes en el diagnóstico y pronóstico, así como ofrecer
nuevas dianas terapéuticas en un gran número de
enfermedades en las que la generación de micropartículas
puede tener un papel relevante.
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DISEño E IMPLANTACIÓN DEL
PRoGRAMA DE CRIBADo DEL SíNDRoME
DE DoWN Y oTRAS CRoMoSoMoPATíAS
EN LA CoMUNIDAD AUTÓNoMA VASCA.
Antonio López Urrutia1, Andoni Arcelay Salazar2 , Adolfo Uribarren Zaballa 3, Angeles Aniel Quiroga1, Ernesto Casis Saenz4,
Carmen Mar Medina 5, Carmen Duque de las Heras 6, Carmen Zugaza Salazar7, Josep Sabrià Rius8, Isabel Portillo Villares9.
1 Servicio de Bioquímica Clínica, Hospital de Cruces Vizcaya; 2 Subdirección de Atención Especializada, Organización Central de
Osakidetza; 3 . Servicio de Ginecología, Hospital de Cruces, Vizcaya; 4 Laboratorio Unificado, Hospital Donostia, Guipúzcoa; 5
Servicio de Análisis Clínicos, Hospital de Galdakao, Vizcaya; 6 Servicio de Bioquímica Clínica, Hospital de Basurto, Vizcaya; 7.
Servicio de Análisis, Hospital Txagorritxu, Alava; 8 SBP soft 2007; 9. Coordinación programa de Cribado, Organización Central
de Osakidetza.
Introducción
El Síndrome de Down (SD) es un problema de salud
importante ya que representa el trastorno cromosómico más
frecuente, el síndrome malformativo más común y la primera
causa de retraso mental. Por este motivo, desde hace muchos
años se han desarrollado técnicas para su diagnóstico
prenatal, principalmente las técnicas citogenéticas sobre
líquido amniótico o biopsia corial.
El carácter invasivo de estas técnicas, el riesgo de pérdida
fetal asociado a ellas así como su elevado coste han
propiciado el establecimiento de estrategias de cribado que
permitan seleccionar aquellas gestantes con mayor
probabilidad de tener un feto con una anomalía de este tipo y
solo a éstas realizarles la prueba invasiva.
Dado que el riesgo de SD se incrementa con la edad materna,
éste fue el primer criterio utilizado para seleccionar a la
población de riesgo tributaria de ser sometida a
amniocentesis (1). El «punto de corte» de edad materna se
consensuó en la década de los 70 en 35 años, teniendo en
cuenta la relación entre el riesgo de gestación afectada con SD
y el riesgo de pérdida fetal que se estima en un 0,9 -1%.
Sin embargo, esta aproximación deja sin diagnosticar un 60%
de embarazos con SD que se producen en mujeres de menos
de 35 años. Por ello, a partir de los años 90 se comenzaron a
desarrollar estrategias basadas en técnicas bioquímicas como
el triple test del segundo trimestre del embarazo, que
combinaba los valores de tres magnitudes bioquímicas séricas
(la alfafetoproteína, la fracción beta de la gonadotropina
coriónica humana y el estriol libre no conjugado) con la edad
materna, ofreciendo una tasa de detección del orden del 60%
en todos los intervalos de edad maternal con una tasa del 5%
de falsos positivos (2).
En los últimos años se han desarrollado programas de
cribado que utilizan marcadores bioquímicos y ecográficos,
permitiendo detecciones del 80 al 96% con una tasa de falsos
positivos de menos del 5%. El más extendido es el llamado
cribado combinado del primer trimestre que combina la
determinación en las semanas 9 – 13, de dos parámetros
bioquímicos, la proteína asociada al embarazo (PAPP-A) y la
fracción beta libre de la gonadotropina coriónica humana
(beta hCG libre) y la medida ecográfica de la translucencia
nucal (TN), con la edad de la gestante. La asociación de estos
parámetros con algunos modificadores del riesgo
proporciona una tasa de detección del 80 al 92% (3-8).
En la comunidad autónoma del País Vasco (CAPV) desde
1997, mediante una instrucción de la Dirección General de
Servicio Vasco de Salud osakidetza (SVS-osakidetza), se
ofrece a las gestantes con edad igual o mayor de 35 años la
amniocentesis para diagnóstico del síndrome de Down y
otras cromosomopatías, no permitiendo cribados
bioquímicos “hasta que se desarrollen tests con mayor
sensibilidad”, según se dice en la propia instrucción.
En diciembre de 2006, un informe sobre el cribado del SD de
la Agencia Vasca de Evaluación de Tecnologías Sanitarias
(osteba), recomendó la implantación de estrategias no
invasivas de cribado del primer trimestre a toda la población
por su eficacia, eficiencia y precocidad (9).
En base a dicho informe, en 2007 el SVS-osakidetza encargó
a un grupo de expertos, el diseño e implantación de un
programa de cribado del SD con cobertura a todas las
gestantes de la CAPV.
El diseño y pilotaje tuvo lugar entre 2008 y 2009 y el
despliegue en todos los centros de seguimiento de embarazos
de la CAPV, en febrero de 2010.
A pesar de que existen numerosas experiencias de
implantación de programas de cribado en diferentes centros a
nivel nacional e internacional, consideramos que nuestra
experiencia planteada desde una perspectiva integral y en
toda la comunidad autónoma vasca puede ser de utilidad.
[23]
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Objetivos y especificaciones
Los objetivos marcados por el SVS-osakidetza al grupo de
trabajo fueron:
• Establecer un Programa de cribado del síndrome de Down y
otras cromosomopatías a todas las mujeres embarazadas de la
CAPV, que fuera eficaz y seguro
• Evaluar, diagnosticar y asesorar, proponiendo alternativas
de forma individualizada en función del riesgo detectado y
respetando las preferencias y valores de las mujeres.
• Estandarizar el proceso de control ecográfico del embarazo
en la CAPV
A la vista de las diferentes opciones y en base a las
recomendaciones de la Sociedad Española de Ginecología y
obstetricia (SEGo) de la Sociedad Española de Biopatología
Médica (AEBM), de la recomendaciones de osteba y las
preferencias dentro del grupo de trabajo, se optó por diseñar
un programa basado en el cribado combinado del primer
trimestre ya que proporciona una buena tasa de detección
(80-92%), es de organización relativamente sencilla, no
implica visitas adicionales de la gestante, tiene un coste
razonable y permite una mayor precocidad en la toma de
decisiones.
El grupo de trabajo estableció las siguientes especificaciones:
• Los criterios, circuitos y procedimientos a utilizar deberían
ser únicos y consensuados para minimizar en lo posible la
variabilidad.
• El punto de corte para ofrecer prueba invasiva sería 1/270
• En caso de positividad se realizaría, además del cariotipo,
una prueba genética rápida con respuesta en menos de 72
horas.
• Se daría formación a todos los profesionales implicados.
• La aplicación informática de soporte del programa debería
ser única, multicéntrica y basada en un gestor de bases de
datos estándar, utilizable en entorno web que debería
garantizar el cumplimiento de la Ley orgánica de protección
de datos (LoPD). El motor de cálculo debería ser de
fiabilidad probada.
• Los reactivos, equipos y controles internos y externos
deberían ser unificados para los laboratorios participantes
con el fin de disminuir la variabilidad.
• Los circuitos e infraestructuras a utilizar deberían ser en su
mayoría los habituales del embarazo, evitando circuitos o
infraestructuras especiales para este programa.
• Todos los profesionales implicados en el programa tendrían
acceso a la información que necesitaran para su trabajo.
• Se debería minimizar la entrada manual de información y la
trascripción de datos, maximizando la comunicación entre
los diferentes sistemas de información corporativos.
• La estructura final debería permitir el seguimiento y
evaluación de los resultados del programa a fin de introducir
modificaciones que se traduzcan en una mejora continua de
la eficacia y eficiencia del programa.
• Se ofertaría el cribado del segundo trimestre en el caso que
la gestante contactara por primera vez mas tarde de la semana
13.
• Terminado el diseño se haría una prueba piloto que
permitiera probar todos los elementos del programa.
Circuito de cribado
A la vista de las infraestructuras existentes, y el número de
embarazos previstos, que era de aproximadamente 20.000 por
año, se propuso una incorporación del cribado al circuito
asistencial mejorando su gestión. El circuito asistencial
propuesto fue:
1. La gestante contacta en primer lugar con la matrona, ésta le
informa y le propone participar en el programa. Si acepta, le
cita en la semana 9-11 en su centro de extracción, para
realizar las determinaciones del cribado y las pruebas
analíticas habituales correspondientes al control del primer
trimestre de embarazo. También cita a la gestante al centro
ecográfico en la semana 11 – 13.
2. La gestante se realiza las pruebas de laboratorio en la
semana 9-11 y en la semana 11-13 acude al centro ecográfico
donde se le calcula la edad gestacional, se le mide la TN y se le
calcula el riesgo. Si el riesgo es positivo se le ofrece la técnica
invasiva.
3. Los laboratorios de genética realizan las pruebas rápidas de
diagnóstico y el cariotipo en líquido amniótico.
4. El resultado de la prueba invasiva se le informa a la
gestante y se le ofrecen las alternativas.
5. El resultado final del embarazo es registrado un mes
después de la fecha probable de parto y el cribado se cierra.
Estructura organizativa y profesionales implicados
El programa constituye un ejemplo de proceso de
colaboración multidisciplinar entre niveles asistenciales en el
que intervienen los siguientes profesionales y estructuras:
• 120 matronas de atención primaria: suponen el primer
contacto de la gestante con el sistema sanitario. Su
intervención en el proceso es fundamental, ya que es la
persona responsable de captar e informar a la gestante,
iniciando el Programa
• 6 laboratorios intermedios: reciben las muestras de sus
centros de salud, realizan las pruebas de control del embarazo
y envían las muestras a los laboratorios de cribado
• 5 laboratorios de referencia de cribado: reciben las muestras
de sus centros de salud, realizan las pruebas de control del
embarazo y las pruebas bioquímicas del cribado de toda su
área de influencia
• 10 centros ecográficos: Centralizan la medición ecográfica de
la TN, la datación ecográfica del embarazo e informan del
riesgo calculado a la embarazada.
• 10 centros de realización de pruebas invasivas, normalmente
[24]
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en los mismos Servicios que realizan las ecografías.
• 3 laboratorios de genética: realizan las pruebas genéticas en
líquido amniótico.
• 1 centro coordinador: responsable de completar y cerrar los
episodios así como de coordinar y centralizar la problemática
derivada del Programa.
• 1 coordinador clínico: ginecólogo ecografista encargado de
coordinar los centros ecográficos, obstetras y matronas.
• 1 comité de evaluación y seguimiento formado por
profesionales de las disciplinas implicadas.
Software y sistemas de información implicados.
La previsión del número anual de embarazos, la estructura
organizativa diseñada y las especificaciones que se definieron
hacían que el sistema de información que soportara este
programa fuera clave en el éxito del mismo.
Existen numerosos programas de cribado, en su mayoría
cedidos por el fabricante de reactivos, condicionado al
consumo de éstos. La mayoría de ellos están diseñados para
entornos de un solo centro y estructura monousuario o
pequeños entornos multiusuario. Sin embargo, la estructura
propuesta implica un sistema en el que coexisten múltiples
laboratorios y centros ecográficos de gestión descentralizada
pero cálculos y evaluación centralizada.
Se planteó, por tanto, la necesidad de desarrollar un sistema
que cumpliera con las especificaciones y requerimientos
definidos, independiente de los proveedores de reactivos.
Debido a que todos los laboratorios pertenecientes al SVSosakidetza tienen implantada como aplicación corporativa
de gestión de laboratorios el sistema omega2000 de Roche
Diagnóstics (RD), y a que RD tiene un acuerdo de
distribución del software de cribado SsdwLab5 de SBP Soft
2007 se valoró la posibilidad de utilizar dicho software.
Aunque dicho programa, inicialmente no cumplía con los
requerimientos planteados por el grupo de trabajo, se plantea
la posibilidad de desarrollar una versión que se ajustara a
nuestras necesidades.
Por tanto se acuerda con Roche Diagnóstics y SBP Soft 2007
el desarrollo e implantación de una versión del software
SsdwLab5 preexistente acorde con las especificaciones y
requerimientos planteados por el grupo de trabajo,
manteniendo el motor de cálculo de la aplicación inicial de
fiabilidad contrastada. El sistema desarrollado formará parte
los sistemas de información corporativos del SVSosakidetza.
Sistema de información de cribado. SsdwLab6 web:
La aplicación desarrollada por SBP Soft 2007 fue SsdwLab6
web sobre un gestor de base de datos SQL Server® (Microsoft)
y programada para un entorno web con Flash y Flex®
(Adobe).
Permite un número ilimitado de gestantes, usuarios, puestos,
centros, laboratorios, centros ecográficos, laboratorios de
genética y conexiones con otros sistemas o aplicaciones.
Dispone de un estricto control de la seguridad y acceso,
permitiendo la creación de perfiles de usuarios;
administradores, bioquímicos, ecografistas, genetistas,
coordinadores, etc., por cada centro o conjunto de centros,
que garantizan a cada profesional el acceso al área específica
necesaria para el desarrollo de su trabajo, pudiendo ver,
modificar y crear datos relacionados con su área.
El aplicativo permite una evaluación y control de calidad a
nivel global o a cualquier otro nivel de detalle así como la
exportación de datos a cualquier otro entorno.
Los administradores pueden llevar a cabo toda la gestión
relativa al motor de cálculo de riesgo; medianas, ecuaciones,
modificadores, etc.,a nivel, global, permitiendo en caso
necesario individualizarlas a nivel de centro o ecografista.
Existen pantallas específicas donde figuran los datos
relacionados con cada fase del proceso; embarazo, cribado,
analítica, ecografía, prueba invasiva, ecografía morfológica y
resultado final del embarazo lo cual facilita el trabajo de cada
profesional.
El acceso de los profesionales implicados al sistema
informático SsdwLab6 se lleva a cabo mediante un navegador
web a través de la intranet excepto las matronas que lo hacen
por medio del sistema de información asistenciales de SVS
– osakidetza (osabideAP y PCH).
Las relaciones entre los distintos profesionales y sistemas se
esquematizan en la figura 2.
Inicio del proceso.
Las gestantes acuden normalmente al médico de familia o
matrona antes de la semana 8 (calculada en función de la
fecha de la última regla, FUR). En el caso de acudir al médico
de familia, éste la deriva a la matrona.
La matrona del centro de salud informa a la embarazada del
programa y le entrega un tríptico diseñado al efecto.
En caso de que la gestante no acepte su inclusión, la matrona
lo hace constar en el sistema informático asistencial.
Introduce al sistema de información asistencial (osabideAP o
PCH) la solicitud de pruebas analíticas de control de
embarazo y el cribado de primer trimestre para la semana
9-11. El sistema le solicita la introducción de la fecha de la
última regla, el peso y los siguientes modificadores del riesgo:
Diabetes, tabaquismo, raza y antecedentes de trisomías (1014).
En el caso de que por la edad gestacional actual no sea posible
el cribado del primer trimestre, se solicita el cribado del
segundo trimestre.
La matrona solicita asimismo una cita para el centro
ecográfico para la semana 11-13.
[25]
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Evolución del numero mensual de cribados
2009 - 2010
1800
1600
1400
Extensión
Cribados
1200
1000
800
Piloto
600
400
Prepiloto
200
0
Ene
Febr
Mar
Abr
May
Jun
Jul
Ago
Set
Oct
1er trimestre
Nov
Dic
Ene
Total
Febr
Mar
Abr
2º trimestre
Figura 1: Evolución mensual
del número de cribados
desde enero de 2009 hasta
abril de 2010.
Centro coordinador
[web intranet]
10 centros ecográficos
[web intranet]
3 laboratorios de genética
[web intranet]
SsdwLab6
5 laboratorios
de cribado
[Omega 2000/ PSM]
6 laboratorios
intermedios
[Omega 2000/ PSM]
Puesto clínico
[PCH, Osabide]
Matronas
Figura 2: Representación esquemática de la relación entre los distintos profesionales y sistemas implicados
en el modelo de programa de cribado propuesto.
[26]
RDiOCT2010.indb 26
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Estudios bioquímicos
factores de corrección tanto propias como globales.
Las pruebas bioquímicas, proteína plasmática asociada al
embarazo (PAPP-A) y la fracción libre de la subunidad beta
de la gonadotropina coriónica (bHCG) se realizan en 5
laboratorios de referencia que utilizan los mismos equipos y
reactivos, actualmente Immulite 2000 (Siemens). Los
controles de calidad internos son suministrados por el
mismo fabricante, asegurando un único lote para los 5
laboratorios. Todos ellos están suscritos además al programa
de evaluación externa de la calidad UK-NEQAS
La gestante acude a su centro de extracción en la fecha en la
que ha sido citada, (semanas 9 – 11), para la obtención de
muestras.
Las muestras se envían al laboratorio de referencia de ese
centro de salud. Los datos informáticos se trasmiten desde los
sistemas de petición electrónica asistencial (osabideAP y
PCH) a los sistemas del laboratorio (omega2000) por la
intranet, incluyendo los datos demográficos, las pruebas, los
modificadores del riesgo y el Código de Identificación
Corporativo (CIC), número identificador único para cada
usuario de la CAPV.
Las pruebas que no son del cribado se procesan normalmente,
se validan y se envían de nuevo al sistema informático
asistencial.
En el caso de tratarse de un laboratorio intermedio, es decir,
que no realiza cribados, éste envía la muestra a su laboratorio
de referencia y trasmite informáticamente los datos y los
modificadores del riesgo.
En el caso de un laboratorio de cribado, al realizar la
validación clínica de las pruebas correspondientes al cribado,
los datos demográficos, las pruebas, los resultados y los
modificadores del riesgo se envían automáticamente por la
intranet al sistema SsdwLab6 donde se dará de alta la paciente
con sus datos y CIC, el embarazo, el cribado y las pruebas
analíticas con sus resultados. En el caso de que la gestante no
hubiera aceptado participar en el programa, el laboratorio
envía solo los datos de la gestante al programa SsdwLab6
marcando “no acepta el cribado” lo cual permite una mejor
evaluación del programa, permitiendo su utilización como
base de datos de todos los embarazos.
El resto de pruebas se informan normalmente y se envían a
los sistemas de información asistencial.
Una vez que se han volcado los datos a la base de datos, el
profesional del laboratorio accede al programa SsdwLab6 y
ejecuta un proceso de validación en el que da su conformidad
a los datos recibidos y a los resultados a la vista de los datos y
los riesgos provisionales calculados por el programa a partir
de la FUR. Este proceso es requerido para que posteriormente
el ecografista pueda introducir los datos ecográficos y
calcular el riesgo final.
El laboratorio puede además mediante SsdwLab6 llevar a
cabo una monitorización exhaustiva de las medianas y los
Estudios ecográficos e informe de riesgo
La gestante acude a uno de los 10 Centros ecográficos en la
semana 11-13 citada por la matrona.
En el centro ecográfico se localiza a la gestante en el
programa SsdwLab6, quien habrá sido dada de alta en la
aplicación por el laboratorio.
El ecografista mide la longitud cráneo caudal (CRL) y la TN,
introduce estos datos en el programa SsdwLab6 y completa
los datos sobre el tipo de embarazo, el número de fetos, y
cualquier modificador que no haya sido introducido
previamente por la matrona. Todos los campos son
obligatorios y el programa no calculará el riesgo si falta
alguno de ellos. Esto dota de una gran calidad a la base de
datos resultante.
El programa calcula la edad gestacional ecográfica y el riesgo
combinado tanto para trisomía 21 (SD) como para trisomía
18 (síndrome de Edwards) y 13 (Síndrome de Patau) (15,16).
El ecografista imprime entonces el informe para la gestante.
En el caso de que alguno de los riesgos sea superior a 1/270, se
le ofrece la prueba invasiva (amniocentesis o biopsia corial).
En el momento de imprimir el informe, el SsdwLab6 envía al
sistema del laboratorio de cribado los resultados de los riesgos
para trisomía 21 y 18-13. De forma automática, éste trasmite
al sistema informático asistencial los valores de riesgo para
que formen parte de la historia electrónica.
El programa también permite al ecografista introducir
opcionalmente otros parámetros ecográficos dicotómicos que
mejoran la detección. Estos parámetros son: la ausencia de
hueso nasal, fémur corto, ectasia piélica, foco ecogénico
cardíaco, intestino ecogénico, flujo del ductus anormal,
regurgitación tricuspídea o malformación mayor para
trísomía 21 y quiste único de los plexos coroideos, la arteria
umbilical única u otra malformación mayor para las
trisomías 18 y 13 (17-23).
En el caso de embarazos gemelares el sistema permite
duplicar, en las gestaciones bicoriales los datos ecográficos y
los correspondientes riesgos así como las pruebas invasivas y
el resultado perinatal para todo tipo de gemelares (24-31).
El programa SsdwLab6 dispone además de herramientas de
control de calidad que permiten monitorizar la calidad de las
medidas de la TN a nivel global, de centro o incluso por cada
ecografista (CUSUM) (32).
Técnicas invasivas y estudios genéticos
A las gestantes con riesgo mayor de 1/270 se les oferta la
realización de una técnica invasiva, normalmente biopsia
corial o amniocentesis.
Las muestras se envían a los laboratorios de genética donde se
realiza en primer lugar una técnica rápida, FISH o QFPCR,
[27]
RDiOCT2010.indb 27
07/10/10 10:37
cuyo resultado se entrega en menos de 72 horas. A todas las
muestras se les realiza cariotipo.
Los datos de la prueba invasiva, (tipo, lugar, fecha,
indicación, etc.) así como los resultados de los estudios
genéticos se introducen en el programa SsdwLab6 en los
laboratorios de genética de una forma estandarizada de forma
que sea posible su explotación
Ecografía morfológica
El programa está preparado para registrar los datos de la
ecografía morfológica de la semana 20 lo cual nos permite
integrar todos los datos del embarazo en la misma base de
datos.
Resultado perinatal
Gestantes
La recogida de los datos del resultado final del embarazo es
fundamental para la evaluación del programa en su conjunto.
Por este motivo, el grupo de trabajo recomendó disponer de
una infraestructura que permitiera llegar al resultado final de
cada uno de los casos. Además, se propuso la conexión
informática del programa de cribado con las bases de datos
de anomalías congénitas y con otras bases de datos de los
servicio obstétricos de cada Centro para facilitar esta labor.
El programa permite la introducción de información relativa
al final del embarazo (normal, aborto, anomalías y datos
complementarios. Esta información se introduce en los
propios centros en el caso de que se conozca el dato.
Transcurridos 30 días desde la fecha probable de parto, El
centro coordinador del Programa será la responsable de
cerrar el caso. Para ello, consultará las distintas bases de
datos o contactará con los centros con el fin de conocer e
introducir en el programa el resultado final del embarazo.
Evaluación y seguimiento
El programa implantado permite la obtención de todo tipo de
información sobre el programa de cribado tanto a nivel global
como a cualquier nivel de detalle.
Para llevar a cabo la evaluación y seguimiento del programa
se va a crear un comité de seguimiento con el fin de asesorar
la planificación, despliegue y evaluación del programa en la
CAPV. Mas específicamente:
• Proponer criterios generales para el desarrollo del
programa.
• Gestión de casos de riesgo, gestión de falsos negativos y
falsos positivos.
• Calidad del proceso, seguimiento de los casos.
• Asesorar los criterios del Sistema de Información
• Monitorizar el seguimiento y los indicadores de proceso y
resultados.
• Canalizar la revisión de casos complejos.
• Elaborar Informes para las autoridades sanitarias.
• Proponer investigaciones, publicaciones y difusión del
programa.
Resultados y discusión
La fase prepiloto comenzó en enero de 2009, durante 3 meses
se probaron los equipos, los reactivos, el programa
informático, las medianas, las conexiones y el circuito en el
Hospital de Cruces con un solo centro de salud (Leioa). Tras
realizar los pertinentes ajustes y modificaciones y se pasó a la
6000
Bioquímica
5000
Ecografía
4000
3000
2000
1000
0
8
9
10
11
12
Edad gestacional (semanas)
13
14
Figura 3: Distribución de gestantes
que acuden a las pruebas
bioquímicas y ecográficas por edad
gestacional a la que acuden.
[28]
RDiOCT2010.indb 28
07/10/10 10:37
siguiente fase.
La fase piloto consistió en ofrecer el programa de cribado a
embarazadas de un único centro de salud adscrito a cada uno
de los 10 centros ecográficos y de los 5 laboratorios. También
se probaron los circuitos en los que las muestras llegaban a
través de un laboratorio intermedio.
La fase de implantación o extensión tuvo lugar desde octubre
de 2009 hasta febrero de 2010. En esta fase se fueron
incorporando paulatinamente centros de la red del SVSosakidetza de manera que en mayo de 2010 el número total
de cribados iniciados era de más de 12.000 con un número
mensual superior a los 1500 de los cuales un 97,2 % son del
primer trimestre y un 2,8% del segundo trimestre.
En la figura 1 se observan la evolución mensual del número
de cribados desde enero de 2009 y se puede observar la
incorporación de los distintos centros hasta llegar a la
completa extensión.
La figura 4 muestra la distribución por edades de las
gestantes, la mediana es de 33 años y un 34,5 % de las
gestantes tiene 35 años o más lo cual nos indica que con el
anterior sistema basado en la edad se harían pruebas
invasivas a un 34,5 % de las gestantes.
La distribución del momento en que las gestantes acuden a la
prueba bioquímica y a la ecográfica se muestra en la figura 3.
Las semanas de mayor frecuencia son la 10 (44%) para las
pruebas bioquímicas y la 12 (60%) para la TN.
Hasta el mes de enero de 2010 se utilizaron unas medianas
procedentes de otras poblaciones. La tasa de positivos con
dichas medianas fue del 7%. En enero de 2010, una vez
obtenido un número suficiente de embarazos, se recalcularon
las medianas con datos propios. La tasa de positivos con las
actuales medianas es de 3,5 % para el primer trimestre y de
5,4 % para el segundo trimestre.
A la fecha de redactar este artículo los embarazos con el
procedimiento de cierre completo son 1.373 con una
sensibilidad del 100% para el Síndrome de Down y 87,5 %
para el conjunto de aneuploidías. Estos resultados deben
considerarse como preliminares ya que la evaluación de los
resultados finales se hará a partir de los 5.000 cribados, es
decir, dentro de tres meses.
Conclusiones
El modelo propuesto tanto a nivel estructural, como logístico,
informático y técnico ha permitido la implantación del
Programa en toda la CAPV en un tiempo razonable sin
recurrir a circuitos especiales.
A falta de una evaluación completa de los resultados con
suficiente número de casos cerrados, el modelo propuesto
ofrece las siguientes ventajas:
Disminución de la variabilidad por la utilización común de
reactivos, equipos, controles, modificadores, algoritmos,
medianas y criterios.
Las posibilidades de seguimiento, evaluación y mejora son
muy elevadas.
La infraestructura creada permite su utilización como base
de datos del embarazo con posibilidades de incorporar nueva
información de utilidad futura.
El modelo de colaboración multidisciplinar que ha contado
con una excelente implicación de los profesionales
involucrados en este programa, ha resultado positivo y
enriquecedor para todos.
1200
Número de altas de cribado
1000
800
600
400
200
0
14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49
Edad de la madre
Figura 4:
Distribución
por edades de
las gestantes.
[29]
RDiOCT2010.indb 29
07/10/10 10:37
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[30]
RDiOCT2010.indb 30
07/10/10 10:37
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TRABAJo
Amaia García de Vicuña, Arantza Arza Ruesga, Carmen
Martínez Campos, Cosme Gorostiza Guerricaecheverria,
Antonio López-Urrutia Fernández.
Servicio de Bioquímica Clínica, Hospital de Cruces, Barakaldo,
Vizcaya.
Introducción
El estudio bioquímico y microscópico de los líquidos
biológicos que se realiza en los laboratorios clínicos
representa un área de trabajo muy importante, sobre todo
desde un punto de vista cualitativo ya, que constituye muchas
veces una prueba vital para el diagnóstico de muchos
pacientes (1). Por lo tanto, el correcto procesamiento de
dichas muestras, así como la exactitud de los resultados son
esenciales para esta tarea. El informe del laboratorio
complementa al examen físico realizado por el médico al
paciente y a otras pruebas de diagnóstico como son las
imágenes radiológicas, pruebas de ultrasonidos o
ecocardiográficas.
En los laboratorios, la diversidad organizativa a la hora de
realizar esta prueba es enorme debido a que el grado de
implicación del profesional que lo realiza (facultativo, técnico
especialista en laboratorio; diplomado universitario en
enfermería); los criterios para realizar el recuento diferencial
y la metodología implicada son diferentes en cada centro.
Los líquidos biológicos que con más frecuencia se remiten al
laboratorio para su estudio se pueden dividir en tres grandes
grupos: el líquido cefalorraquídeo (LCR), el líquido sinovial
(LS) y los líquidos serosos: líquido pleural (LP), ascítico (LA)
o peritoneal (LPER), y pericárdico (LPERI).
El LCR es el líquido que con más frecuencia se remite a los
laboratorios clínicos y su análisis resulta clave para el
tratamiento inmediato del paciente.
Este líquido es una solución compleja formada por una
secreción activa de las células de los plexos coroideos y de las
células ependimales por difusión del plasma. Se diferencia de
los fluidos serosos y sinoviales, en la permeabilidad selectiva
de las membranas y tejidos adyacentes (barrera
hematoencefálica). El gradiente de presión hidrostática
dentro de los capilares coroideos produce la filtración de
fluido a través de la barrera de células del endotelio capilar en
el tejido conectivo a las células epiteliales delimitantes. El
LCR tiene múltiples funciones, protege al cerebro y médula
espinal de cambios súbitos de presión, mantiene un ambiente
químico estable y retira los productos de desecho del
metabolismo cerebral (2). La obtención del LCR es
habitualmente por punción lumbar, pero también puede
obtenerse a través de una punción cervical lateral o cisternal.
Las alteraciones en el sistema nervioso central que producen
cambios en la composición química, microscópica y
macroscópica del LCR son diversas, entre las que destacan
por su mayor relevancia las hemorragias, las infecciones, las
neoplasias y las enfermedades desmielinizantes.
Los líquidos biológicos serosos: ascítico (LA), pleural (LP),
peritoneal (LPER) y pericárdico (LPERI) son los líquidos
derivados del plasma y que están contenidos en varias
cavidades. Estas cavidades están delimitadas por una
membrana serosa visceral y por una parietal. Los líquidos
serosos son ultrafiltrados del plasma que derivan de la
abundante red capilar de la membrana serosa. El análisis de
laboratorio que se realiza en estos líquidos es muy importante
para diagnosticar la causa del derrame, clasificado, según su
contenido proteico, en trasudado o exudado. Los trasudados
son líquidos no inflamatorios que se originan por alteración
de factores sistémicos que afectan a la formación o
reabsorción del líquido (presión hidrostática o
coloidosmótica). Los exudados, por el contrario, son líquidos
inflamatorios que contienen gran cantidad de proteínas y se
deben a una afectación de la pared capilar producida por una
infección bacteriana, micótica o vírica, por una inflamación
aséptica o por un tumor maligno.
El estudio de los líquidos biológicos serosos proporciona
información importante sobre la fisiopatología de los órganos
y tejidos donde se generan y es función del laboratorio la
selección de magnitudes diagnósticas apropiadamente
validadas y con buena capacidad discriminatoria, para que
este estudio aporte información decisiva en la práctica clínica
(2).
El líquido sinovial (LS) es el líquido de las articulaciones
[32]
RDiOCT2010.indb 32
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diartrósicas que son las más móviles (rodilla, tobillo, cadera,
codo, muñeca y hombro). Es un ultrafiltrado del plasma al
que las células sinoviales le aportan el ácido hialurónico que
es el responsable de la viscosidad del fluido. La finalidad del
estudio del líquido sinovial, obtenido por artrocentesis o
punción articular, es ayudar a diagnosticar las enfermedades
reumatológicas e infecciosas que afectan a las articulaciones,
ya que su alteración refleja la patología de la membrana
sinovial y del cartílago articular subyacente. El examen del
laboratorio tanto bioquímico como microscópico nos da la
posibilidad de clasificar el LS en cuatro categorías: no
inflamatorio, inflamatorio, séptico y hemorrágico (2).
Hasta la fecha, el método de referencia para el contaje celular
en muchos laboratorios sigue siendo el recuento manual en
cámara; pero debido a la demora en el tiempo de respuesta, a
la manipulación de muestras potencialmente contagiosas, a la
necesidad de tener personal altamente cualificado, a la gran
variabilidad entre observadores, así como a problemas
inherentes al tipo de muestra como la escasa estabilidad de
algunos fluidos, el número reducido de células en muchos
casos y la dificultad de detectar células atípicas hace que sea
necesario la automatización y estandarización de los fluidos
biológicos.
El objetivo de este estudio es evaluar y comparar el
analizador hematológico XT-4000i (Sysmex Co, Kobe, Japan)
con el recuento y diferenciación manual, y a su vez, valorar su
eficacia, estudiando si su implantación supondrá una mejora.
Una vez estudiada su eficacia y su eficiencia nos proponemos
la elaboración de un protocolo de trabajo para los diferentes
líquidos biológicos basándonos en la estructura organizativa
de nuestro hospital y en su rendimiento clínico.
Material y métodos
Se han analizado un total de mil líquidos biológicos (n=1000)
recibidos durante 8 meses en el laboratorio de un hospital de
referencia de tercer nivel, con todas las especialidades. De
éstos, un 71% corresponden a LCR, 9% a LP, 10% a LA, 5% a
LPER y un 5% a LS. Se han incluido todas las muestras de las
que había volumen suficiente (volumen >500 µL). Los
líquidos cefalorraquídeos obtenidos tanto por punción
lumbar como por punción y derivación ventricular han sido
extraídos en tubo estéril sin gel y sin anticoagulante,
mientras que los líquidos serosos y el líquido sinovial lo han
sido en tubo estéril con EDTA. El transporte se ha llevado a
cabo a temperatura ambiente.
A todos los líquidos se les ha realizado de forma inmediata el
recuento celular al microscopio en cámara desechable Kova
Glasstic (el volumen retenido en cada retículo es de 1 µL.),
diluyendo previamente con cloruro sódico al 0,9% en caso
necesario. El recuento leucocitario diferencial se ha efectuado
en las extensiones del sedimento teñidas con una tinción
panóptica de Schiff, siguiendo los criterios habituales del
laboratorio: LCR con más de 5 células/µL o más de 10 en el
caso de tratarse de recién nacidos y más de 250 células/µL.
para el resto de líquidos biológicos.
Se han analizado 714 muestras de LCR enviadas a nuestro
laboratorio desde las diferentes unidades clínicas. Primero de
manera manual en cámara y a partir de 5 -10 células/µL, en
función de su procedencia, se prepara el botón celular
mediante centrifugación y tinción para su diferenciación al
microscopio. A continuación se han procesado con el
analizador Sysmex XT-4000i, seleccionando el modo para
fluidos biológicos (BF Mode), según instrucciones del
fabricante. El equipo ofrece de forma automatizada en su
modo para líquidos biológicos los recuentos de hematíes,
leucocitos y células de alta fluorescencia, así como la
diferenciación de los leucocitos en mononucleares (MN) y
polimorfonucleares (PMN), en porcentaje y en unidades
absolutas. Además de la medición por impedancia, la
tecnología aplicada se basa en la citometría de flujo y la
fluorescencia con colorantes fluorescentes que tiñen los
ácidos nucleicos y el material proteico, para la serie blanca y
células de alta fluorescencia.
Previamente al análisis se ha realizado un chequeo del
recuento de fondo (background). Las muestras se han
introducido directamente por aspiración manual con un
volumen de 85 µL. Los diagramas de dispersión se han
evaluado cuidadosamente y todos los datos se han impreso y
guardado para su análisis posterior.
En cuanto a los líquidos serosos, hemos analizado 232
muestras (85 LP, 101 LA, 44 LPER y 2 LPERI) y respecto a los
líquidos sinoviales 54 muestras. Todos estos líquidos han sido
procesados de igual manera pero con un punto de corte de
250 células/µL para su diferenciación celular.
El estudio estadístico se ha realizado mediante el programa
Medcalc de comparación de métodos, haciendo un análisis de
regresión con el método de Passisng- Bablok para los
recuentos leucocitarios, hemáticos, de PMN y MN de todos
los líquidos y usando la gráfica de Bland-Altman para las
diferencias entre dos mediciones frente a su media.
La concordancia clínica se ha analizado con el estadístico
kappa (índice de conformidad entre métodos u observadores)
y su correspondiente intervalo de confianza del 95% con el
programa estadístico SPSS v 18.0. Para ello las muestras han
sido categorizadas según el tipo de líquido en diferentes
puntos de corte de significado clínico atendiendo al recuento
celular. Los LCR se han dividido, en cinco categorías
diagnósticas (clases I-V) para el cálculo de los índices de
correlación: <10 (n=401), 10-30 (n=113), 31-100 (n= 94),
101-1000 (n=94) y >1000 (n=12) células/L. Los LS en cuatro
categorías (clases I-IV): <250 (n=4), 250 -1000 (n=7). 100110000 (n=15) y >10000 (n=28) células/L. Los líquidos
serosos se han dividido en las mismas cuatro categorías: <250
(n=96), 250 - 1000 (n=68). 1001-10000 (n=60) y >10000
(n=8) células/L.
[33]
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LEUCOCITOS LCR
16000
14000
La reproducibilidad ha sido evaluada mediante el estudio de
la precisión. Para la precisión intradiaria se ha analizado un
líquido con una celularidad alta 10 veces consecutivas y se ha
calculado la media y el coeficiente de variación. Para la
precisión interdiaria se ha analizado un control hematológico
(e-check XE Sysmex) valorado durante 20 días ya que no se
disponía de un control específico para líquidos biológicos
(3,4).
La linealidad del método se ha obtenido mediante diluciones
seriadas por duplicado de un líquido seroso con alta
concentración celular.
La sensibilidad funcional se calcula como la concentración de
leucocitos y hematíes en la que el coeficiente de variación es
menor del 20%.
Para descartar el ruido de fondo se ha analizado 20 veces de
forma consecutiva en dos días diferentes el diluyente
(Cellpack) del equipo.
10000
8000
6000
y =2,00+1,5x
r =0,97
4000
2000
0
0
5000
10000
15000
Microscopio
(XT4000i + 1 -microscopio + 1)/Promedio %
Rendimiento y evaluación
XT-4000i
12000
LEUCOCITOS LCR
200
+1,96 SD
179,5
150
100
Media
50
57,6
0
-1,96 SD
-64,3
-50
-100
-150
-200
0
5000
10000
15000
20000
Promedio de XT4000i + 1 y microscopio + 1
Resultados
En el estudio de correlación de los LCR se han obtenido los
siguientes valores en la comparación de métodos con la
regresión de Passing- Bablok:
Recuento de hematíes: r = 0,98, recta de regresión y = 155 +
0,99x, intervalos de confianza 0,98 – 1,00 para la pendiente y
0,00 – 205 para la ordenada en el origen, para todos aquellos
líquidos con más de 750 hematíes/L.
Recuento celular: r = 0,97, y = 2 + 1,5x, intervalos de
confianza 1.40 – 1.58 para la pendiente y 1,24 – 2.16 para la
ordenada en el origen (figura 1).
Diferenciación de las poblaciones leucocitarias:
Para PMN: r = 0,88, recta de regresión y = 6,18 + 0,93x,
intervalo de confianza 0,87 – 1,00 para la pendiente y 4.00 –
9,18 para la ordenada en el origen.
Para MN: r = 0,88, recta de regresión y = -0,07 + 0,94x,
intervalo de confianza 0,87 – 1,00 para la pendiente y -4,00
– 3,30 para la ordenada en el origen (figura 2).
Con los resultados obtenidos podemos concluir que, a pesar
de la buena correlación, los métodos no son intercambiables.
Ante este resultado decidimos estudiar la correlación de los
LCR por categorías y observamos que para las categorías IV y
V, que se corresponden con los líquidos que contienen mayor
LCR
100
80
PMN% XT-4000i
LíQUIDo CEFALoRRAQUíDEo
Figura 1. Recta de regresión de Passing-Bablok y
de Bland-Altman para leucocitos de LCR.
60
40
20
y = 6,18+0,93x
r = 0,88
0
0
20
40
60
80
100
PMN% Microscopio
LCR
100
80
MN% XT-4000i
Podemos señalar que los resultados obtenidos en cuanto a
reproducibilidad y sensibilidad del aparato XT-4000i en el
análisis de líquidos biológicos han sido: una precisión
intradiaria e interdiaria (coeficiente de variación, CV) para
hematíes de 1,7% y 0,3% y para células de 0,06% y 1,2%
respectivamente. La sensibilidad funcional obtenida ha sido
de 750 hematíes y 5 células (CV< 20%).
60
40
20
y = -0,07+0,94x
r = 0,88
0
0
20
40
60
80
100
MN% Microscopio
Figura 2. Recta de regresión de Passing-Bablok
para MN% y PMN% de LCR.
[34]
RDiOCT2010.indb 34
07/10/10 10:37
100000
80000
20000
0
y = 0,23 + 0,99 x
r = 0,94
0
20000
40000
60000
80000 100000 120000
Microscopio
5
62
27
5
83
6
>1000
100
LS
80
1
11
LíQUIDo SINoVIAL
En el estudio de correlación de los LS se han obtenido los
siguientes valores en la comparación de métodos con la
regresión de Passing- Bablok:
Recuento de hematíes: r = 0,99, recta de regresión y = 2217 +
1,07x, intervalo de confianza 0,94 –1,15 y 1410 – 3973 para la
ordenada en el origen.
Recuento celular: r = 0,94, recta de regresión y = 0,23 + 0,99x,
intervalo de confianza 0,96-1,06) y -319 – 238 para la
Diferenciación de las poblaciones leucocitarias (figura 3):
intervalo de confianza 0,78 – 1,00 para la pendiente y 1,00
– 19,21) para la ordenada en el origen.
Para MN: r = 0,94, recta de regresión y = 0,39 + 0,92x,
intervalo de confianza 0,81 – 1,00) para la pendiente y -1,002,18 para la ordenada en el origen.
En el estudio de concordancia clínica hemos obtenido un
valor de Kappa de 0,81 (Error t = 0,07) y un acuerdo entre
clases que osciló entre 75% para la clase I, 57% para la clase
II, 93% para la clase III y 96% para la clase IV.
LíQUIDoS SERoSoS
En el estudio de correlación de los líquidos serosos se han
obtenido los siguientes valores en la comparación de métodos
con la regresión de Passing- Bablok:
Recuento de hematíes: r = 0,92, recta de regresión y = 86.25 +
1.00x, intervalo de confianza 0,97 – 1,03 para la pendiente y
0,00 – 227 para la ordenada en el origen.
Recuento celular: r = 0,99, recta de regresión y = 3,00 + 1,00x,
PMN% XT-4000i
31-100 101-1000
60
40
20
0
y = 8,05 + 0,91 x
r = 0,94
0
20
40
60
80
100
PMN% Microscopio
LS
100
80
MN% XT-4000i
XT-4000i
60000
40000
Tabla I. Tabla de contingencia atendiendo al recuento de leucocitos
en LCR.
LEUCoCIToS/ µL
MICRoSCoPIo
<10 10-30
<10
249
5
10-30
119
50
31-100
31
50
101-1000
2
8
>1000
LEUCOCITOS LS
120000
XT-4000i
número de células, los métodos son intercambiables.
En el estudio del concordancia clínica hemos obtenido un
II, 65% para la clase III, 88% para la clase IV y 91% para la
clase V, como se puede apreciar en la tabla de contingencia
(tabla I). Al estudiar la concordancia separando los LCR en
función de su lugar de procedencia y su vía de obtención se
observa que la mayoría de los desacuerdos coinciden con los
líquidos obtenidos por derivación ventricular.
60
40
20
0
y = 0,39 + 0,92 x
r = 0,94
0
20
40
60
80
100
MN% Microscopio
para leucocitos MN% y PMN% de LS.
intervalo de confianza 0,97 – 1,03) y 0,07 – 8,29 para la
Diferenciación de las poblaciones leucocitarias:
[35]
RDiOCT2010.indb 35
07/10/10 10:37
LEUCOCITOS LÍQUIDOS SEROSOS
60000
50000
40000
XT-4000i
intervalo de confianza 0,95 – 1,03) para la pendiente y 1,91 –
5 para la ordenada en el origen.
Para MN: r = 0,91, recta de regresión y = -4,00 + 1,00x,
intervalo de confianza 0,95 – 1,03 para la pendiente y -5.48 –
0.24 para la ordenada en el origen (figura 4).
En el estudio de concordancia clínica hemos obtenido un
II, 93% para la clase III, 100% para la clase IV.
De acuerdo con estos resultados el método propuesto por
Sysmex es intercambiable con el microscópico tanto para los
líquidos serosos como sinoviales con una buena correlación y
concordancia.
30000
20000
10000
y = 3,00 + 1,00
r = 0,99
0
0
10000
Discusión
LíQUIDoS SERoSoS Y SINoVIALES
El analizador Sysmex XT-4000i es reproducible para el
recuento de hematíes, leucocitos y fórmula diferencial con
respecto al método de referencia para los líquidos serosos y
sinoviales, aportando las ventajas de automatización y
estandarización. Una aportación importante del análisis de
este tipo de líquidos en el XT-4000i es el recuento de células
de alta fluorescencia (AF), cuyo valor elevado (>5%) viene
ref lejado en el equipo con una alarma anorm esc WBC.
30000
40000
50000
60000
Microscopio
LÍQUIDOS SEROSOS
100
PMN% XT-4000i
80
60
40
20
0
y = 4,00 + 1,00 x
r = 0,92
0
20
40
60
80
100
PMN% Microscopio
LÍQUIDOS SEROSOS
100
80
MN% XT-4000i
En los laboratorios clínicos, uno de los procedimientos
menos automatizado es el estudio de los líquidos biológicos,
particularmente el estudio citológico. Esto provoca una
variabilidad tanto en el procedimiento de cada laboratorio
como en el personal que lo analiza, lo que se traduce en
imprecisión. La estandarización de los métodos en el
laboratorio pretende eliminar posibles causas de variación
como son el tiempo, el volumen de líquido, la superficie de
conteo y la interpretación del personal. Pudiendo
implementar también un sistema de control de calidad (5).
En nuestro hospital tenemos que analizar diariamente una
alta cantidad de líquidos biológicos procedentes de diversas
áreas clínicas. Durante 2009 se procesaron un total de 4679
líquidos. El procedimiento automatizado propuesto por
Sysmex es rápido y fácil de manejar, no necesita
pretratamiento de la muestra, el análisis es más preciso y no
requiere personal particularmente especializado.
Iniciamos el estudio y analizamos 1000 fluidos biológicos
(71% LCR, 9% LP, 10% LA, 5% LPER y un 5% LS).
observamos que en general el analizador tiende a realizar
recuentos superiores que el análisis microscópico. Hemos
visto que la cuantificación de hematíes sólo es útil por
encima de 750 células/µL. Este límite de cuantificación es
suficiente para estimar el grado de contaminación sanguínea
de la muestra. Sin embargo en los LCR con bajos recuentos en
los que se requiere además una morfología eritrocitaria no es
suficiente.
20000
60
40
y = -4,0 + 1,00 x
r = 0,91
20
0
0
20
40
60
80
100
MN% Microscopio
para leucocitos, MN% y PMN% de líquidos serosos.
[36]
RDiOCT2010.indb 36
07/10/10 10:37
Esta magnitud sugiere la presencia de otro tipo de células
como pueden ser las mesoteliales, macrófagos linfocitos B
activados o células tumorales que algunos casos pueden
sugerir un análisis al microscopio para descartar un proceso
inflamatorio o neoplásico. También nos proporciona el valor
absoluto y porcentaje de eosinófilos dentro del recuento
celular.
LíQUIDoS CEFALoRRAQUíDEoS
El punto clave para el uso de los contadores automatizados en
el análisis de líquidos biológicos es asegurar que el
instrumento realice recuentos fiables a partir del escaso
número de células que se encuentran en este tipo de líquido
en particular. Aproximadamente el 70% de los líquidos que
se reciben en nuestro laboratorio de urgencias son LCR.
Algunos de estos se extraen por punción lumbar pero gran
parte de ellos son obtenidos de los shunts ventriculares
sistémicos y reservorios. Debido a las discrepancias obtenidas
en los resultados decidimos estudiar con más detenimiento
este tipo de líquidos y los diferenciamos según el tipo de
extracción y el recuento celular. Así concluimos que el
contador en general tiende a sobreestimar la cantidad de
leucocitos en este tipo de muestras, de manera que en LCR
con un recuento 5 - 30 células/µL no nos permite
discriminar con la suficiente exactitud y precisión si un
líquido es normal o patológico. Por encima de este valor los
recuentos tanto para hematíes como para células son
reproducibles.
La correlación también es buena para la diferenciación de
células mononucleares y polimorfonucleares en pacientes con
recuentos de leucocitos superiores a 30 células/µL, ya que por
debajo de este punto de corte el analizador sobrestima la
cantidad de PMN en el recuento diferencial.
Para los LCR obtenidos de los shunts ventriculares sistémicos
y reservorios el analizador realiza un contaje de células muy
superior al obtenido al microscopio. Creemos que
posiblemente puede ser debido a la contaminación por restos
celulares u otras partículas de origen proteico en este tipo de
muestras, pero sería necesario realizar más estudios para
poder llegar a una conclusión definitiva. Por el contrario en
pacientes en tratamiento intratecal con liposomas de
citarabina, que pueden ser confundidos con leucocitos en el
momento de su inspección al microscopio, la citometría de
flujo/fluorescencia ofrece menor interferencia (10). También
para aquellos LCR que por diversos tratamientos contienen
alta cantidad de sales y su observación al microscopio es
difícil.
Protocolo
Cada laboratorio debe definir los límites inferiores para el
Sysmexde células nucleadas y eritrocitos, por debajo del
recuento
XT4000
cual
el uso de los contadores automáticos no es fiable (9). En
nuestro hospital después de varios meses de trabajo con el
equipo Sysmex y sobre la base de los resultados que hemos
obtenido hemos propuesto el protocolo de trabajo expuesto
en la figura 5.
Otros líquidos
LCR
¿Shunt o
derivación?
Si (71 %)
No
Sysmex XT4000
¿Poca muestra?
Vol < 300 µL
Si (3 %)
No (26 %)
Sysmex XT4000
Microscopio (75 %)
¿>5% AF?
Si
¿>5% AF?
Si
Microscopio (14,5 %)
No
No (85,5 %)
Si (7 %)
¿5-30 cel?
No (19 %)
Informe
Informe
Figura 5: Protocolo de trabajo tras la incorporación del equipo Sysmex XT-4000i.
[37]
RDiOCT2010.indb 37
07/10/10 10:37
Conclusión
La incorporación del analizador Sysmex XT-4000i en el
laboratorio supone una mejora en el rendimiento de trabajo.
El 85% de los líquidos serosos y sinoviales que se reciben en
nuestro área de trabajo pueden ser informados con mayor
rapidez y precisión mediante la implantación de este equipo,
reduciendo a un 15% aproximadamente, los líquidos a
evaluar manualmente para descartar un proceso oncológico o
cualquier otra alteración clínica, ya que el equipo nos
informa del porcentaje de células de alta fluorescencia. Esto
supone una ventaja ya que la revisión al microscopio de
algunos de estos líquidos es laboriosa, bien por la cantidad de
células que contienen, que obliga a realizar diluciones o
debido a la turbidez de la muestra.
Diferentes área clínicas de nuestro hospital, como pueden ser
los servicios de neurocirugía o reanimación, solicitan
controles periódicos de los pacientes mediante el estudio del
líquido cefalorraquídeo. Esto hace que en nuestro laboratorio
casi el 70% de los líquidos que se reciben anualmente se
correspondan con este tipo de muestras. Un alto porcentaje
de estos líquidos son extraídos mediante shunts ventriculares
o catéteres, aproximadamente un 71%. Para estos es necesaria
la observación al microscopio debido a posibles interferencias
que hemos encontrado. Un nuevo reto que nos proponemos
es ampliar el estudio de estos líquidos para poder llegar a una
conclusión definitiva. Aunque el rendimiento del analizador
que hemos obtenido es menor para el estudio de los LCR, el
equipo es capaz de procesar los líquidos patológicos con
buena precisión tanto para el recuento de leucocitos como el
de las poblaciones celulares, reservando la inspección manual
para los líquidos claros y con un recuento celular bajo (menor
de 30 células/µL) que es una operación sencilla.
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[38]
RDiOCT2010.indb 38
07/10/10 10:37
IMPoRTANCIA DE LA CARGA VIRAL
PLASMÁTICA DE BAJo NIVEL EN
LA INFECCIÓN PoR VIRUS DE LA
INMUNoDEFICIENCIA HUMANA TIPo-1
(VIH-1)
RAFAEL DELGADo
Servicio de Microbiología. Hospital Universitario 12 de Octubre. Madrid.
La medida de la Carga Viral Plasmática (CVP) de VIH-1 es
una herramienta fundamental en el manejo clínico de los
pacientes infectados por VIH-1. Su valor patogénico y
pronóstico la hacen imprescindible en todas las fases de la
infección pero especialmente en los pacientes en tratamiento
anti-retroviral (TAR), ya que es el indicador más importante
de respuesta terapéutica y es de gran ayuda para predecir la
evolución clínica (1).
La introducción de anti-retrovirales específicos y la
instauración del tratamiento de combinación a mediados de
los años 90, han supuesto un cambio espectacular en el
manejo de los pacientes infectados por VIH y se considera
uno de los logros terapeúticos más importantes de la
medicina moderna. Las combinaciones de anti-retrovirales
actuales permiten que en la mayor parte de los pacientes que
inician TAR se consiga rápidamente el control de la
replicación del VIH y la subsiguiente recuperación de los
linfocitos T CD4+. El TAR debe sin embargo mantenerse de
por vida ya que no es posible, por el momento, la erradicación
completa del virus debido fundamentalmente a la existencia
de un reservorio celular, en su mayoría linfocitos T CD4+
memoria en reposo o quiescentes, en el que el VIH se
encuentra integrado latentemente y con la capacidad de
iniciar de nuevo la replicación si se suspendiera el TAR. La
estabilidad de este reservorio celular es considerable, lo que
en la práctica significa la persistencia de células infectadas a
lo largo de toda la vida del paciente. Existe, así mismo, la
evidencia de que en la mayoría de los pacientes en
tratamiento, es posible detectar con técnicas ultrasensibles
cierta actividad replicativa que resulta en una carga viral por
debajo del umbral de detección de las técnicas
convencionales, habitualmente 50 copias de ARN de VIH/mL
de plasma, conocida como viremia residual. Determinar el
origen y la naturaleza de esta viremia residual está siendo
objeto de intensa investigación y debate. Las hipótesis que se
invocan para explicar esta dinámica de bajo nivel son dos
principalmente: la existencia de santuarios celulares donde la
concentración de anti-retrovirales es insuficiente para el
control completo de la replicación y, en segundo lugar, la
posibilidad de que se trate de una simple liberación de
partículas por células latentemente infectadas sin que den
lugar a posteriores ciclos de reinfección. Estas dos hipótesis,
no completamente excluyentes, condicionarían un diferente
pronóstico en la evolución a largo plazo de los pacientes en
tratamiento.
El reservorio celular de VIH:
La investigación sobre las circunstancias que explican que la
infección por VIH sea intrínsecamente incurable con antiretrovirales proviene fundamentalmente del trabajo del
laboratorio de Robert Siliciano en la Escuela de Medicina de
la Universidad Johns Hopkinks en Baltimore, EE.UU. Aunque
existían evidencias iniciales sobre células en las que, por
hibridación in situ, era posible detectar ADN de VIH sin
producción de ARN (2), no fue hasta 1995 que el grupo de
Siliciano demostró de manera incontrovertible la presencia
del VIH integrado en linfocitos T CD4+ quiescentes (3). La
estimación del número de células latentemente infectadas por
VIH no parece muy grande, 1/106 linfocitos T CD4+, unos
pocos miles en cualquier caso (4), sin embargo la aparente
estabilidad del reservorio compromete la posibilidad de
erradicación del virus con anti-retrovirales (5), ya que es
posible seguir detectando células infectadas a lo largo de todo
el tratamiento (6;7) y el VIH emerge sistemáticamente una
vez que la terapia se interrumpe (8). Tras un minucioso
trabajo en el que se fueron realizando mediciones seriadas del
tamaño del reservorio, y su estabilidad en diferentes
pacientes, fue también quedando claro que la vida media del
reservorio de células latentemente infectadas era más larga de
lo previsto, 44 meses, lo que hacía poco realista el objetivo de
erradicación al ser teóricamente necesarios 70 años para
eliminar completamente esta población con TAR (9;10).
Adicionalmente el reservorio no solo es muy estable, sino que
constituye un auténtico archivo de todas las variantes que
han estado circulando incluyendo las mutantes de resistentes
[39]
RDiOCT2010.indb 39
07/10/10 10:37
seleccionadas en el contexto del TAR (11), lo que implica que
las mutantes resistentes de VIH pueden dejar de circular
mayoritariamente si se reduce la presión farmacológica por
un cambio de medicación, pero no desaparecen ya que está
muy probablemente representada en el reservorio y pueden
emerger si se producen las circunstancias precisas.
residual aumentando la potencia del TAR (18), lo que
apoyaría la hipótesis de que la viremia residual no proviene
de ciclos de replicación sino, muy posiblemente, de la simple
liberación de partículas por las células del reservorio
latentemente infectado (figura 1).
El umbral de 50 copias/mL
Una vez iniciado el TAR, el objetivo actual de todas las
recomendaciones clínicas es lograr la supresión completa de
la replicación del virus lo que equivale a una carga viral
indetectable, menos de 50 copias de ARN de VIH por mL de
plasma según la mayoría de técnicas disponibles, (12;13), lo
que se consigue habitualmente en un plazo de 12-24 semanas.
Este umbral técnico de 50 copias/mL podría coincidir con un
umbral biológico por debajo del cual no se produce auténtica
replicación y evolución del virus. Ante la proporción cada
vez mayor de pacientes que se encuentra en esta situación
surge la pregunta de hasta cuánto tiempo va a ser posible
mantener el control virológico teniendo en cuenta la alta
capacidad de variabilidad del virus, en otras palabras ¿es
posible mantener a los pacientes con tratamiento antiretroviral indefinidamente? o, por el contrario, la generación
de mutaciones de resistencias es un fenómeno inexorable que
tarde o temprano resultará en fallo terapéutico y progresión
de la enfermedad.
La optimización de las técnicas de detección y cuantificación
de virus basadas en biología molecular ha supuesto un avance
muy valioso para el estudio de la infección por VIH y el
manejo de los pacientes (14). La sensibilidad de las técnicas
diagnósticas estandarizadas para la determinación de la CVP
ha sido hasta recientemente de 50 copias/mL de plasma. En el
laboratorio de investigación se han realizado modificaciones
de estas técnicas para aumentar la sensibilidad y llegar a
detectar una sola copia (Single Copy Assay, SCA)(15). El SCA
se basa fundamentalmente en utilizar un mayor volumen de
plasma seguido de concentración de partículas por
ultracentrifgación, extracción de ácidos nucléicos y RT-PCR
en tiempo real con sondas fluorecentes en una laboriosa
combinación (15). Cuando se han realizado estas técnicas
ultrasensibles en pacientes en TAR y con CVP estándar
indetectable, se ha podido documentar presencia de viremia
de bajo nivel en la mayoría de los casos (7). La hipótesis de
que esta viremia residual pudiera tratarse de auténtica
replicación viral de bajo nivel por actividad subóptima del
tratamiento de combinación ha sido investigada en diversos
estudios de intensificación en los que se administran antiretrovirales adicionales, pertenecientes a distintas familas, y
se mide mediante SCA el posible impacto de esta
intensificación en la reducción de la viremia residual (16-18).
Los resultados de estos estudios de intensificación confirman
en su mayor parte que no es posible disminuir la viremia
Replicación
Liberación
Figura 1: La interpretación más aceptada de la viremia residual
(<50 copias/mL) en los pacientes con infección por VIH que reciben
tratamiento es que se trata de liberación de partículas víricas a partir
del reservorio de células laténtemente infectadas (inferior), a diferencia
de la viremia de alto nivel (superior) que sería producto de ciclos
completos de replicación e infección de nuevas células.
El significado de la producción continua de bajo nivel de
VIH-1 no está suficientemente aclarado, en parte por la
dificultad de estudiar experimentalmente el problema de la
latencia-reactivación en una población reducida de células y
la producción detectable pero muy baja de partículas de VIH.
Sin embargo si parece posible realizar, en estudios
longitudinales, el seguimiento de la evolución de esta viremia
de bajo nivel utilizando una metodología que permite el
genotipado de secuencias individuales de VIH
circulante(11;19-22) . Las secuencias encontradas parecen
más bien ser reflejo de la activación limitada del reservorio
que puede liberar una pequeña cantidad de partículas de VIH
que no darían lugar a ciclos sucesivos de infección y por tanto
no estarían directamente influenciados por la presión
selectiva farmacológica. Por lo tanto es posible que la
inhibición de la evolución del virus, inducida por el
tratamiento de combinación, tenga un umbral biológico
importante que podría estar muy cercano al límite de
detección de las técnicas convencionales de cuantificación de
carga viral, esto es 50 copias/mL. Aunque sabemos que existe
producción de virus por debajo de 50 copias, este umbral
podría ser un indicador por debajo del cual el virus no
evoluciona y la generación de resistencias sería improbable.
Aunque lógicamente estos resultados necesitan ser
confirmados con un seguimiento más prolongados para
descartar que se produzca evolución a lo largo de periodos de
varios años, comienza a surgir la idea de que a pesar de la
[40]
RDiOCT2010.indb 40
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gran capacidad de variabilidad del VIH, podría ser posible
mantener el control farmacológico de la infección de manera
indefinida. La infección por VIH seguiría siendo incurable
con anti-retrovirales pero al menos la enfermedad y la posible
emergencia de variantes resistentes podrían ser controladas
eficaz y prolongadamente con medicación potente que
mantenga la mayor supresión posible sobre la replicación del
virus.
Aunque los resultados de la mayor parte de los trabajos
apoyan esta idea, recientemente los resultados de un
importante estudio de intensificación con un inhibidor
específico de la integrasa de VIH sugieren la existencia de
replicación de muy bajo nivel en un subgrupo de pacientes
con TAR supresor (23). Es posible por tanto que por debajo
de 50 copias no todos los pacientes se comporten igual y la
viremia residual pueda representar la expresión de diferentes
fenómenos.
La evolución de la CVP durante el TAR
El TAR produce una primera fase de rápida disminución
exponencial de la CVP con una vida media de alrededor de 1
día (figura 2). Esta importante reducción de la CVP
corresponde a la muerte de los linfocitos T CD4+ infectados y
activados. Una segunda fase de la caída de la replicación con
una vida media mayor de 2-4 semanas se ha atribuido a la
extinción de los macrófagos infectados, una población celular
CD4+
V1/2
24 hs
Macrófagos
V1/2
14 días
¿Células?
V1/2
9-15 meses
CD4+ quiescentes
V1/2
4 años
Figura 2: Evolución de la Carga Viral Plasmática durante el Tratamiento
Anti-Retroviral: La primera fase de rápida caída exponencial
corresponde al control de la infección de linfocitos CD4+ activados
(vida media 24 hs), seguida de una fase de caída más lenta atribuida
a la población de macrófagos infectados. Recientemente se ha
propuesto una fase ya por debajo del límite de detección de las técnicas
convencionales (50 copias/mL) que correspondería a un reservorio por
caracterizar y a continuación la viremia residual (3-20 copias/mL) que
se ha relacionado con liberación de partículas a partir del reservorio de
CD4+ quiescentes laténtemente infectado, esta población tiene una vida
media estimada de 44 meses.
más longeva. Recientemente se ha descrito, una tercera fase
de caída de la CVP más prolongada con una vida media de
9-15 meses relacionada con un posible reservorio aún por
determinar (24;25), por último, la cuarta fase mucho más
estable, asociada con la infección latente de las células T
CD4+ quiescentes y con una vida media estimada de casi 4
años.
¿Es útil medir CVP por debajo de 50 copias en el
laboratorio clínico?:
En la actualidad disponemos de técnicas comerciales capaces
de detectar CVP por debajo de 50 copias/mL, sin embargo la
importancia de la detección de CPV de VIH-1 por debajo de
50 cp/mL en el ámbito clínico está todavía por establecer
(26-28).
Los estudios sobre viremia residual y la evolución del
reservorio a lo largo del tiempo se han realizado, hasta el
momento, en el contexto de estudios de investigación que han
desarrollado localmente técnicas complejas y laboriosas de
SCA. La disponibilidad de técnicas comerciales
estandarizadas para la determinación del CVP con mayor
sensibilidad nos puede permitir un conocimiento más preciso
de estos fenómenos en una población amplia de pacientes en
el ámbito clínico.
En un estudio realizado en nuestro laboratorio hemos
empleado la nueva técnica de CoBAS ® TaqMan ® VIH-1 v2.0
que permite cuantificar CVP de VIH-1 con un límite de
sensibilidad de 20 copias/mL en un grupo de pacientes con
TAR supresor (< 50 copias de VIH-1/mL) (29). El objetivo de
nuestro estudio ha sido analizar los factores clínicos
relacionados con la viremia residual (20-49 copias/mL) en
pacientes con TAR supresor en seguimiento en nuestra clínica
de pacientes infectados por VIH.
En el 21% de estos pacientes se detectó viremia (20-49 copias
de VIH-1/mL) utilizando TaqMan ® VIH-1 v2.0. Este
resultado sería esperable teniendo en cuenta la información
disponible sobre viremia residual en la mayoría de los
pacientes que reciben TAR y suprimen la replicación por
técnicas convencionales (20;24;30).
En nuestro grupo de pacientes en tratamiento se encontró
que la presencia de CVP de VIH-1 entre 20 y 49 copias/mL se
asociaba significativamente con dos factores: una CVP más
alta previa al inicio del TAR y un menor tiempo recibiendo
TAR (tabla I). En trabajos previos en pacientes con TAR
supresor (24;30), ha quedado claramente demostrada una
correlación significativa entre la CVP pre-tratamiento y el
nivel de viremia residual determinado por SCA. Este hallazgo
sugiere que el tamaño de la población de células infectadas
antes de la iniciación del TAR está directamente relacionado
con el nivel de viremia residual y éste podría ser un buen
marcador del tamaño y de la evolución del reservorio.
La asociación de un mayor tiempo de tratamiento en los
[41]
RDiOCT2010.indb 41
07/10/10 10:37
Tabla I. Una mayor CVP pre-TAR y el menor tiempo trascurrido desde el inicio del TAR se asociaron significativamente con una carga viral entre
20-49 copias de VIH-1/mL en un grupo de 83 pacientes estudiados en nuestro laboratorio(29). CVP: Carga Viral Plasmática, TAR: Tratamiento AntiRetroviral, ITINAN: Inhibidores de la Transcriptasa Inversa No Analogos de Nucleósidos, IP: Inhibidores de Proteasa, OR: Odds Ratio.
CVP < 20cp/mL
n=62
CVP 20-49 cp/mL
n=21
39.3 (32.2-44.6)
41.5 (35.7-48.9)
0.2
33 (53.2)
12 (57.1)
0.756
257 (142-385)
207 (127-312)
0.351
TAR con ITINAN/IP
24(38.7)/38(61.3)
10(47.6)/11(52.4)
0.473
CVP pre-TAR (log10)
4.97 (4.65-5.29)
5.13 (4.87-5.70)
101 (60-146)
59 (48-112)
Edad (años)
Diagnóstico de SIDA
CD4/µL pre-TAR
Tiempo en TAR (semanas)
pacientes de nuestro estudio que tuvieron CVP menor, es
decir < 20 copias/mL, sugiere que por debajo del umbral de
50 copias existe un cierto nivel de replicación que puede ser
todavía controlado por el TAR. Con respecto a esta
posibilidad hay que señalar que el patrón de disminución de
la CVP durante el tratamiento no está del todo claro,
especialmente durante los primeros meses de terapia. En un
estudio de Maldarelly et al. se comprobó que no existía una
disminución significativa en el nivel de la viremia residual
después de 5 años recibiendo TAR con aparente supresión
virológica (24).Sin embargo, utilizando la misma tecnología
de SCA en muestras de pacientes que han recibido TAR
durante 5-7 años, Palmer et al. describen una probable
evolución bifásica de la viremia residual lo que, según los
autores, sugiere la existencia de dos depósitos celulares con
diferentes vidas medias (30).
En nuestro trabajo inicial no se ha podido realizar un estudio
longitudinal de la CVP por debajo de 50 copias/mL para
medir la evolución de esta viremia de bajo nivel y realizar así
una estimación de la tasa de caída. Este estudio necesita de
un seguimiento más prolongado que se está llevando a cabo
en la actualidad de forma prospectiva, no obstante, el patrón
temporal de la viremia de bajo nivel en el tratamiento
supresor podría seguir estando en relación con partículas
liberadas de este reservorio latente celular aún por definir.
Sin embargo, otra posibilidad derivada de nuestros resultados
es que pueda tratarse del control farmacológico de un
pequeño nivel de replicación viral por debajo de 50 copias/
mL, las consecuencias de este plus de sensibilidad y control
terapéutico podrían ser importantes. En este sentido se ha
informado recientemente un incremento de la viremia
residual por SCA en algunos pacientes en regímenes de
simplificación justo antes de experimentar fracaso virológico
(31). Lo que sugiere que la medida de la viremia residual
podría anticipar pérdida de control virológico o la potencial
aparición de resistencias. Ahora que es técnicamente posible,
Análisis Univariable Análisis Multivariable
p
OR (95%CI) p
0.019 4.24 (1.28-13.97) 0.018
0.031
0.987 (0.974-1) 0.044
será interesante investigar si la CPV entre 20 y 49 copias/mL
puede tener implicaciones biológicas similares en un contexto
clínico más amplio. En cualquier caso se puede predecir que
la disponibilidad de técnicas ultrasensibles estandarizadas
para la detección de viremia por VIH que puedan utilizarse
ampliamente en laboratorios de diagnóstico clínico será una
importante aportación en nuestro conocimento de la
biología, evolución y relevancia clínica de la viremia residual.
El objetivo último de la erradicación
Una vez conseguida el control virológico y la recuperación
inmunológica en la mayoría de los pacientes que tienen
acceso al tratamiento, se plantea de una forma más decidida
el abordaje del reto de la erradicación completa del virus del
organismo (32). Por una parte, la medicación anti-retroviral,
aun con la seguridad y eficacia conseguida actualmente, no
está exenta de efectos secundarios a largo plazo; por otra, la
pequeña pero persistente viremia residual ya comentada, bien
producto de liberación por el reservorio celular o procedente
de santuarios no accesibles al TAR (25), puede mantener la
estimulación de la activación inmunológica a través de
receptores específicos y contribuir a largo plazo al
agotamiento de la regeneración de linfocitos CD4+ (32). Si
bien la erradicación no parece un objetivo alcanzable a corto
plazo, cada vez conocemos mejor el mecanismo de latencia
del VIH (33) y se han comenzado interesantes ensayos con
compuestos que pueden estimular la reactivación del VIH
latente sin inducir activación inmunológica (34-36). En el
escenario futuro de la posible disponibilidad de tratamientos
con el objetivo de erradicar el VIH, necesitaremos nuevas
herramientas para monitorizar la evolución del reservorio
celular y controlar la extinción de la viremia residual más allá
de los límites actuales. Las nuevas técnicas ultrasensibles
deberán demostrar su utilidad para la consecución de este
por ahora elusivo objetivo.
[42]
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[43]
RDiOCT2010.indb 43
07/10/10 10:37
Marcadores de sepsis, Elecsys IL-6,
Elecsys BRAHMS PCT y CRP
[Los tres marcadores totalmente automatizados
en el área de urgencias: cobas ® 6000]
El tiempo importa
La IL-6 puede considerarse como una “alarma” sensible y precoz para
inflamación sistémica y sepsis. Es el primero que se eleva.
Paciente de 70 años con sepsis severa
1600
20
18
IL-6
1400
CRP
1000
12
10
800
8
600
CRP [mg/mL]
PCT [ng/mL]
CRP confirma también el incremento de IL-6, especialmente cuando la
PCT no se eleva. Cubre el periodo ventana durante el que la IL 6
disminuye regulado por los mediadores anti-inflamatorios.
16
14
IL-6 [pg/mL]
La PCT, debido a su incremento posterior, y a su vida media permite la
confirmación de la sepsis bacteriana. Es el más específico.
PCT
1200
6
400
4
200
0
2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Días
RDiOCT2010.indb 44
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TROPONINA T
CARDÍACA
ULTRASENSIBLE
UN PASO ADELANTE EN EL
DIA NóSTICO CARDIOLógICO
DIAg
JoRDI oRDÓñEZ LLANoS
Servicio de Bioquímica. Hospital de Sant Pau.
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad Autónoma. Barcelona.
Antecedentes
Desde el inicio de los años 90, diversos estudios habían
evidenciado la cardioespecificidad de la Troponina T
cardíaca (TnT); la cardioespecificidad confería al
biomarcador una inmejorable combinación de
especificidad, sensibilidad y precocidad diagnósticas para
detectar la necrosis miocárdica (1). Los primeros
inmunoensayos para medir las isoformas cardíacas de Tn T
(TnT) utilizaban reacciones con detección enzimática;
pero, incluso, existían tiras reactivas en las que se detectaba
cualitivamente TnT “positiva” o “negativa”. En
consecuencia, los límites de detección de las técnicas eran
elevados. Los métodos analíticos fueron mejorando y a
finales de los años 90, la medida de Troponina T podía
realizarse mediante inmunoensayos
electroquimiolumniscentes completamente automatizados,
con tiempos de respuesta analíticos muy convenientes para
la evaluación de los síndromes coronarios agudos (SCA) y
con límites de detección mejorados en relación a los
métodos iniciales.
La experiencia obtenida con los primeros métodos para
medir TnT permitió evidenciar que se podían detectar
concentraciones aumentadas en sujetos con SCA y sin
aumento de concentración o actividad de los
biomarcadores “clásicos” como la creatina cinasa MB (CK
MB) o la mioglobina. Según diferentes estudios, el
porcentaje de estos sujetos oscilaba entre el 16 y el 28% de
los pacientes con SCA. La evolución clínica de estos
pacientes indicaba que, a pesar de no presentar criterios
bioquímicos de infarto agudo de miocardio (IAM), tenían
una peor evolución clínica que los pacientes con TnT no
aumentada (2). Sin embargo, estas concentraciones
detectables de TnT se obtenían con imprecisión analítica
muy elevada (coeficiente de variación total >15-20%),
circunstancia que limitaba su significación clínica.
Las guías clínicas y bioquímicas
Año 1999
La National Academy of Clinical Biochemistry publicó en el
año 1999 una recomendación sobre el uso de los
biomarcadores de los SCA; esta fue la primera guía que
propuso el uso sistemático de las troponinas (Tn) cardíacas
en la práctica clínica y de laboratorio (3). La guía propuso el
uso de dos límites de decisión clínica para la concentración
de Tn en la evaluación de los SCA: un límite superior de
referencia que producía resultados diagnósticos equivalentes,
[45]
RDiOCT2010.indb 45
07/10/10 10:37
aproximadamente, a los que hubieran obtenido midiendo CK
MB y un límite inferior que permitía identificar a pacientes
con SCA, CK MB negativa y Tn por encima de este límite
inferior a los que se clasificó como SCA con “lesión
miocárdica mínima”.
Año 2000
En el año 2000, diferentes sociedades cardiológicas
recomendaron conjuntamente el uso de la medida de Tn
como el biomarcador de elección para la evaluación de los
SCA y el diagnóstico del IAM. La recomendación era que se
estableciera el diagnóstico de IAM cuando, en el contexto
clínico de sospecha de isquemia coronaria, un paciente
presentara un valor de Tn superior al del percentil 99 (p99)
de la población de referencia (4). La recomendación se recoge
en la tabla I.
La guía del año 2000 venía a reconocer la demostrada
cardioespecificidad de la medida de Tn, característica sobre la
Tabla I. Criterios bioquímicos para el diagnóstico del infarto de
miocardio*.
Un paciente presenta un infarto agudo de miocardio si
durante las primeras 24 horas de un episodio clínico de
isquemia presenta:
• Una concentración máxima de troponina T o troponina I
superior al límite de decisión clínica, o sea, al percentil 99 de
la población de referencia, en al menos en una ocasión
durante el episodio.
Se recomienda que el percentil 99 se obtenga con una
imprecisión total, medida como coeficiente de variación,
inferior al 10%.
• Una concentración máxima de creatina cinasa MB,
preferiblemente medida como concentración de masa,
superior a:
1. El percentil 99 de la población referencia, al menos en 2
ocasiones durante el episodio. Para que los valores de CKMB
puedan considerarse diagnósticos deben mostrar un perfil de
aumento o descenso.
2. El doble del valor de referencia poblacional (el percentil 99
u otro), al menos en 1 ocasión durante el episodio clínico.
Esta última definición se corresponde a la recomendada por
la organización Mundial de la Salud en sus guías de 1971 y
1979.
*Criterios publicados simultáneamente en J Am Coll Cardiol 2000; 36:959-69
(referencia 4 del trabajo) y Eur Heart J 2000; 18:1502-13.
que se basan la especificidad, sensibilidad y precocidad
diagnósticas actuales del IAM. Aunque los primeros métodos
para medir Tn se habían desarrollado a principio de los años
90, se tardó una década en asumir que cuando un paciente
con SCA presentaba un aumento de concentración de Tn,
aunque no existiera aumento de los marcadores “clásicos”
como CK MB o mioglobina, no se trataba de un “falso
positivo” para la Tn, sino de un “verdadero positivo” para el
diagnóstico de IAM y un “falso negativo” para CKMB o
mioglobina. La evolución clínica confirmaba que estos
pacientes presentaban mayor proporción de muerte
cardiovascular o por otras causas y de nuevos IAM y
requerían más revascularización. La consecuencia implícita
de estas observaciones era que la medida de CK MB o
mioglobina aportaba menos valor a la evaluación de los SCA
que la de Tn y que medir Tn simultáneamente con CK MB o
mioglobina no era útil. Basándose en estos datos, en la guía
del año 2000 no se recomendaba el uso de mioglobina como
biomarcador para evaluar los SCA y sólo se recomendaba la
medida de CK MB, preferentemente su concentración de
masa, si no era posible medir Tn.
Sin embargo, la recomendación del año 2000 establecía una
condición que los métodos para medir Tn no podían cumplir
con facilidad. Dada la naturaleza del diagnóstico diferencial a
establecer (IAM, otros tipos de SCA o no SCA) y las
consecuencias en el manejo clínico del paciente derivadas del
mismo, la calidad analítica de la medida de Tn debía ser
máxima. Esta máxima calidad analítica se concretaba en la
recomendación de que el valor diagnóstico, o sea el del p99 de
referencia, se obtuviera con una imprecisión total igual o
inferior al 10%. Tanto en el año 2001 como en la actualidad
pocos métodos para medir Tn satisfacen este requisito
analítico tal como se muestra en la tabla II que ha sido
producida por el Committee on Standardization of Cardiac
Markers Damage de la International Federation of Clinical
Chemistry (IFCC) y que puede consultarse en la dirección
que se cita. Los datos que figuran en la misma son los
proporcionados por las compañías que comercializan los
métodos y evaluaciones independientes han demostrado que
suelen representar un valor óptimo, ya que se han obtenido
en condiciones de evaluación muy controladas, no siempre
representativas de las que se dan en el día a día del
laboratorio asistencial. La consecuencia de que muchos
métodos no puedan medir el valor del p99 con una
imprecisión igual o inferior al 10%, es que en la práctica
clínica se utiliza como valor diagnóstico aquel que se mide
con el 10% de imprecisión; como este valor es superior al del
p99 existe un grupo de pacientes con valores de Tn entre el
p99 y el que se mide con el 10% de imprecisión que son
clasificados como no afectos de IAM. Aparte de ello, los
fabricantes han desarrollado diferentes generaciones de los
métodos para mejorar su límite de detección y, en
consecuencia, bajo una misma denominación pueden
[46]
RDiOCT2010.indb 46
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Tabla II. Características analíticas de los métodos actuales para medir troponinas (Tn) I y T cardíacas.
Fabricante, instrumento, método
(generación)
Límite de
detección
(µg/L)
Tn en el
percentil 99
(µg/L)
0,02
0,04
15
0,16
<0,01
0,028
15
0,032
Abbott i-STAT1
0,02
0,08
16,5
0,1
Beckman Coulter Access Accu (2ª)
0,01
0,04
14
0,06
BioMerieux Vidas Ultra (2ª)
0,01
0,01
27,7
0,11
0,015 14 (a 19 ng/L)
0,036
Abbott AxSYM ADV (2ª)
Abbott Architect
Innotrac Aio! (2ª)
0,006
CV en el Tn en el 10%
percentil 99
CV
(%)
(µg/L)
Inverness Biosite Triage1
0,05
<0,05
ND
ND
Inverness Biosite Triage1 (r)
0,01
0,056
17
ND
Mitsubishi Chemical PATHFAST
0,008
0,029
5
0,014
ortho Vitros ECi ES
0,012
0,034
10
0,034
Radiometer AQT90
0,0095
0,023
17,7
0,039
Response Biomedical RAMP
0,03
<0,1
18,5
0,21
Roche E170
0,01
<0,01
18
0,03
Roche Elecsys 2010
0,01
<0,01
18
0,03
Roche Cardiac Reader1
<0,05
<0,05
ND
ND
Siemens Centaur Ultra
0,006
0,04
10
0,03
0,04
0,07
20
0,14
Siemens Immulite 2500 STAT
0,1
0,2
ND
0,42
Siemens Immulite 1000 Turbo
0,15
ND
ND
0,64
Siemens Stratus CS
0,03
0,07
10
0,06
0,015
0,045
10
0,04
0,06
<0,06
8,5
0,09
Siemens Dimension RxL
Siemens VISTA
Tosoh AIA II
coexistir metodologías con diferente límite de detección. A
modo de ejemplo, un método con sensibilidad analítica
mejorada permite detectar valores anormales de Tn en un
50-75% de las muestras iniciales de pacientes con IAM,
cuando con una versión menos sensible del mismo método
sólo se detectan valores anormales en un 15-35% de los
pacientes (5).
Año 2007
Las recomendaciones del año 2000 favorecieron el uso
1 Métodos tipo Point-of-Care,
(r): Método revisado en
evaluación por la Food and Drug
Administration; nD: no
determinado; CV: coeficiente de
variación; 10% CV:
concentración medida con una
imprecisión total del 10%
medida como CV.
Puede consultarse la tabla
original en: http://www.ifcc.org/
PDF/ScientificActivities/
Committees/C-SMCD/cTn_
Assay_Table_v091209.pdf.
Versión actualizada el 12 de
septiembre de 2009, con
modificaciones del autor.
sistemático de la medida de Tn en la práctica clínica; ello
permitió obtener información relevante sobre el biomarcador
que se han recogido en la guía del año 2007; la conocida
como “Definición universal del infarto de miocardio” (6).
La definición universal del infarto de miocardio presentó dos
novedades respecto a la guía del año 2000. La primera es que
se abandonó la recomendación de que el valor del p99 se
midiera con el 10% de CV ya que diversos estudios
demostraron que un grado de imprecisión total
moderadamente elevado (de hasta un 20%) no aumentaba
[47]
RDiOCT2010.indb 47
07/10/10 10:37
significativamente el número de falsos positivos en el
diagnóstico del IAM (7); sin embargo, hay que tener en
cuenta que una imprecisión analítica elevada hace que sea
más fácil observar cambios en las concentraciones de Tn. La
segunda novedad radicó en recomendar que para
diagnosticar IAM, además de observar un valor elevado de
Tn, debía observarse un patrón dinámico de las
concentraciones de Tn (un aumento o un descenso). Esta
recomendación se fundamentaba en que en diferentes
patologías cardíacas y no cardíacas, la concentración de Tn
puede aumentar sin que ello se deba a una isquemia
coronaria; estas patologías se resumen en la tabla III.
Definir qué variación de Tn se puede considerar como
Tabla III. Causas de elevación de troponina cardíaca en ausencia de
isquemia coronaria.
CAUSAS CARDíACAS
CAUSAS No CARDIACAS
1. Causas que producen
lesión miocárdica
1. Alteraciones de órganos/
tejidos específicos
Ablación por radiofrecuencia
Edema pulmonar
Amiloidosis cardiaca
Embolia pulmonar
Cardioversión
Hemorragia subaracnoidea
Cierre de comunicación
interauricular
Hipertensión pulmonar
primaria
Cirugía cardiaca
Ictus cerebral
Contusión cardiaca
Insuficiencia renal crónica
Descargas de desfibrilador
implantable
2. Alteraciones generales
Intervención coronaria
percutánea
Pacientes en estado crítico
Miocarditis
Pericarditis
Ejercicio aeróbico intenso
Quimioterapia a altas dosis
Sepsis y shock séptico
Trasplante cardiaco
Tratamiento con
simpaticomiméticos
Taquicardia supraventricular
Causas metodológicas
Vasospasmo coronario
Interferencia por anticuerpos
heterófilos
2. Causas que producen
aumento del tamaño
cardíaco
Hipertrofia ventricular
izquierda
Interferencia por factor
reumatoide
Muestras coaguladas
Insuficiencia cardiaca
Miocardiopatía dilatada
Miocardiopatía hipertrófica
significativa en las determinaciones seriadas no es fácil y la
guía del año 2007 propuso como criterio un cambio igual o
mayor a 3 veces la desviación estándar del método analítico
en el valor de Tn medido. El empleo de este criterio exige que
el laboratorio informe del mismo, puesto que sus valores
variarán en función del perfil de precisión de cada método;
concretamente, a valores de Tn bajos, próximos al p99, la
imprecisión suele ser muy superior a la existente a valores
más elevados. Para algunos métodos con baja imprecisión se
puede fijar como significativo un cambio superior al 20-30%,
pero para métodos con mayor imprecisión este valor no será
recomendable. Algunos autores han propuesto emplear como
criterio un cambio superior a la variación biológica de Tn.
Como el estudio de la variabilidad biológica debe hacerse en
individuos de referencia y los métodos actuales no detectan
Tn en la mayoría de estos individuos, hasta muy
recientemente no se han podido realizar estos estudios y
conocer cuál es la variabilidad biológica de la Tn.
La necesidad de detectar cambios seriados de la Tn y de
calcular con mayor exactitud el percentil 99, así como el
conocimiento de que valores de Tn inferiores al percentil 99,
pero detectables con los actuales métodos identifican a
pacientes con riesgo cardiovascular aumentado (8,9), ha
estimulado el desarrollo de métodos más precisos y de mayor
sensibilidad analítica para medir Tn.
Métodos ultrasensibles para medir Tn
Se denominan métodos “de alta sensibilidad” aquellos
métodos con una mejora del límite de detección; esto es, la
concentración mínima que puede diferenciarse de cero. No
existen guías formales para designar a un método como de
alta sensibilidad (Tn-us), aunque se ha recomendado una
clasificación basada en la imprecisión analítica en el valor del
p99 y en el porcentaje de sujetos de referencia con valores de
Tn-us detectables (10). Un método se clasificaría como
recomendable para ser incluídos en las guías de uso clínico si
su imprecisión fuera <10%; de no ser así, se clasificaría como
clínicamente útil si la imprecisión estuviera entre el 10 y el
20% y como no aceptable si fuera >20%. En la tabla IV se
evidencia que sólo 6 de los métodos actuales detectan el p99
con una imprecisión <10% y serían clasificables como
“recomendables en las guías” y sólo uno es capaz de detectar
la Tn en más del 50% de los individuos de referencia. En
cambio, todos, menos uno, los métodos de alta sensibilidad
alcanzan las máximas categorías de imprecisión y % de
sujetos con Tn-us detectable.
A tenor de estas características recomendadas, ninguno de los
métodos actuales de Tn podría considerarse de alta
sensibilidad. ésta es una cuestión importante a tener en
cuenta al analizar los resultados de las publicaciones recientes
(11, 12) en que han utilizado métodos denominados
“sensibles” para medir Tn y que no lo son de acuerdo a los
datos de la tabla IV. Por el contrario, la capacidad de medir
concentraciones de Tn entre 2 y 5 veces menores que las
actualmente detectables tendrá consecuencias evidentes en la
[48]
RDiOCT2010.indb 48
07/10/10 10:37
Tabla IV. Clasificación de los métodos actuales y en investigación para la medida de troponina cardíaca. La
columna de la derecha muestra el porcentaje de individuos de referencia en los que se detecta la Tn.
Métodos actuales
Abbott AxSYM ADV (2ª generación)
Aceptable clínicamente
< 50 %
Abbott Architect
< 50 %
Abbott i-STAT1
< 50 %
Beckman Coulter Access Accu (2ª generación)
< 50 %
No aceptable
< 50 %
50-75 %
No determinado
< 50 %
Desconocido
Mitsubishi Chemical PATHFAST
Aceptable para guía
< 50 %
ortho Vitros ECi ES
< 50 %
Radiometer AQT90
< 50 %
Response Biomedical RAMP
< 50 %
Roche MODULAR <E 170>
< 50 %
Roche Elecsys 2010
< 50 %
Roche cobas h 2321
No determinado
< 50 %
< 50 %
< 50 %
Siemens Immulite 2500 STAT
No determinado
< 50 %
Siemens Immulite 1000 Turbo
No determinado
< 50 %
Siemens Stratus CS
< 50 %
Siemens VISTA
< 50 %
Tosoh AIA II
< 50 %
Beckman Coulter Access hs-cTnI
> 95 %
Roche Elecsys hs-cTnT
> 95 %
Nanosphere hs-cTnI
75-95 %
Singulex hs-cTnI
> 95 %
BioMerieux Vidas Ultra (2ª generación)
Innotrac Aio! (2ª generación)
Inverness Biosite Triage1
Inverness Biosite Triage1 (r)
Siemens Centaur Ultra
Siemens Dimension RxL
Métodos de alta sensibilidad en investigación
práctica diaria; los datos preliminares obtenidos en varios
ámbitos de actividad clínica se describen a continuación.
SUJEToS DE REFERENCIA
Los métodos ultrasensibles permiten detectar Troponina T en
más del 95% de la población de referencia; en consecuencia,
1 Métodos tipo Point-ofCare, (r): Método
revisado en evaluación
por la Food and Drug
Administration;
nD: no determinado
los datos que se obtengan en estas poblaciones serán
fundamentales para la evaluación de los sujetos con patología
cardíaca.
El p99 del método para medir de TnT-us está entre 13 y 16
ng/L (0,013-0,016 µg/L), en comparación con el valor
indetectable (<0,01 µg/L [<10 ng/L]) observado con el
[49]
RDiOCT2010.indb 49
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método actual de 4ª generación (13); se han observado
valores superiores en hombres que en mujeres. Aunque no se
ha descrito para el caso de la TnT-us, debe subrayarse que se
han descrito diferencias menores en los valores de TnI-us
según el tipo de muestra (14). Estas diferencias que no
resultaban críticas para los métodos anteriores,
probablemente pueden ser relevantes con los métodos
ultrasensibles.
ENFERMEDAD CoRoNARIA AGUDA
La medida de TnT-us modificará la evaluación de los SCA,
especialmente cuando se evalúen las muestras obtenidas en el
momento del ingreso de los pacientes. La TnT-us muestra una
sensibilidad diagnóstica para la detección del IAM superior a
la observada con los métodos actuales en las muestras
iniciales de los pacientes, incluso en aquellas obtenidas 3-4 h
después del inicio de los síntomas (15). Por consiguiente, el
tiempo transcurrido hasta el diagnóstico se reduce
drásticamente; en un estudio disminuyó de 247 a 71,5 min
(15). En pacientes con dolor torácico y con probabilidad baja
o intermedia de SCA, la determinación de la TnT-us al
ingreso presentó una sensibilidad y especificidad diagnóstica
del 62% y 89%, respectivamente, y un valor predictivo
negativo del 96% para el SCA, comparadas con la sensibilidad
del 35% y la especificidad del 99% del método actual de TnT.
En total, la TnT-us detectó un 27% más de casos de SCA que
el método actual (16).
Como se ha comentado, la guía del año 2007 recomienda que
se evalúe el patrón dinámico de las concentraciones de Tn
para evaluar los SCA. La mayor sensibilidad para detectar el
IAM en sujetos con SCA se ha observado cuando los valores
de TnT-us variaban un 177 y un 243%, respectivamente,
frente al valor basal en muestras extraídas con 3 y con 6 h de
separación (17). Recientemente, se ha evaluado la variabilidad
biológica de la TnT-us en sujetos de referencia y en muestras
obtenidas horariamente durante 4h; a partir de la
variabilidad obtenida se ha calculado que un cambio de TnThs será significativo cuando sobrepase el 85% del valor inicial
(18).
estratificación del riesgo en pacientes con EC estable (19).
oTRAS SITUACIoNES
El estudio de la TnT-us en situaciones distintas a la
enfermedad coronaria se encuentra aún en su primera fase.
Es muy probable que estos los métodos ultrasensibles
aumenten la frecuencia de las anormalidades observadas en
pacientes en estado crítico o con otras patologías y que
ayuden a definir nuevas situaciones en las que se producen
lesiones miocárdicas.
En este sentido, la especificidad de las elevaciones de TnT-us
para el diagnóstico del SCA disminuirá; por consiguiente,
aumentará la complejidad de la selección clínica de los
pacientes en presencia de elevaciones de TnT-us. Con toda
probabilidad definir un patrón del cambio evolutivo de TnTus será obligado y de gran utilidad para sustentar el uso
diagnóstico y pronóstico de la TnT-us.
ENFERMEDAD ARTERIAL CoRoNARIA ESTABLE
Al medir TnT-us se observan elevaciones en un mayor
número de pacientes con enfermedad coronaria
aparentemente estable que con la medida actual. La TnT-us
fue mayor al valor del p99 en el 11% y detectable en el 97% de
los pacientes con enfermedad arterial coronaria (EC) estable.
Es interesante que, al igual que se ha observado en población
de referencia, la TnT-us fué más elevada en los hombres que
en las mujeres con EC estable (19). En estos pacientes con EC
estable, la TnT-us se relacionó con el desarrollo de
insuficiencia cardiaca congestiva (ICC) mortal o no mortal y
la muerte por causas cardiovasculares, excepto por ICC. En
consecuencia, la TnT-us será de utilidad para la
[50]
RDiOCT2010.indb 50
07/10/10 10:37
REFERENCIAS
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[51]
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