Caracterización de microorganismos cromatografía de

Caracterización de microorganismos cromatografía de

CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYTSECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYTFONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYTFACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA
UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA -USAC-
INFORME FINAL
“Caracterización de microorganismos cromatografía de gases
acoplada a masas”
Proyecto FODECYT No. 19-2007
EDUARDO ROBLES AGUIRRE
Investigador Principal
GUATEMALA, JUNIO DE 2010
AGRADECIMIENTOS
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de
Ciencia y Tecnología, -FONACYT- otorgado por la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología –SENACYTy al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -CONCYT-.
Índice
RESUMEN ...................................................................................................................................................... 1
SUMMARY .................................................................................................................................................... 2
PARTE I .......................................................................................................................................................... 3
I.1
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................ 3
I.2
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................................................... 5
1.2.1. ANTECEDENTES EN GUATEMALA ..................................................................................................... 5
1.2.1.1.
Métodos actuales para la identificación de microorganismos ............................................... 5
1.2.1.2.
La identificación de microorganismos por técnicas cromatográficas..................................... 5
1.2.2. JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN .......................................................................... 7
I.3
OBJETIVOS E HIPÓTESIS ................................................................................................................... 8
1.3.1. OBJETIVOS ........................................................................................................................................ 8
1.3.1.1.
Objetivo General ...................................................................................................................... 8
1.3.1.2.
Objetivos Específicos ................................................................................................................ 8
I.4
METODOLOGÍA ................................................................................................................................. 9
1.4.1. LOCALIZACIÓN .................................................................................................................................. 9
1.4.2. LAS VARIABLES ................................................................................................................................. 9
1.4.2.1.
Variables dependientes............................................................................................................ 9
1.4.2.2.
Variables independientes ........................................................................................................ 9
1.4.3. INDICADORES ................................................................................................................................. 10
1.4.4. ESTRATEGIA METODOLÓGICA ....................................................................................................... 10
1.4.4.1.
Población y muestra ............................................................................................................... 10
1.4.5. EL MÉTODO..................................................................................................................................... 10
1.4.6. LA TÉCNICA ESTADÍSTICA ............................................................................................................... 11
1.4.7. LOS INSTRUMENTOS A UTILIZAR ................................................................................................... 12
PARTE II ....................................................................................................................................................... 14
II.
MARCO TEÓRICO ............................................................................................................................ 14
II.1
Descripción de microorganismos seleccionados ........................................................................... 14
II.2
Métodos actuales para la identificación de microorganismos ..................................................... 17
II.3
La cromatografía como técnica analítica ....................................................................................... 19
II.4
La cromatografía de gases ............................................................................................................. 20
II.5
La espectrometría de masas como método de detección en cromatografía ............................... 26
II.6
La identificación de microorganismos por técnicas cromatográficas .......................................... 27
PARTE III...................................................................................................................................................... 30
III.
RESULTADOS................................................................................................................................... 30
III.1
DISCUSIÓN DE RESULTADOS .......................................................................................................... 33
PARTE IV ..................................................................................................................................................... 35
IV.1
CONCLUSIONES............................................................................................................................... 35
IV.2
RECOMENDACIONES ...................................................................................................................... 37
IV.3
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................................... 38
IV.4
ANEXOS ........................................................................................................................................... 41
IV.4. 1 Cromatogramas y espectros de masas seleccionados .................................................................. 41
IV.4.2 Fotografías del proyecto ................................................................................................................ 78
PARTE V ...................................................................................................................................................... 81
V.1
INFORME FINANCIERO ................................................................................................................... 81
RESUMEN
Con el fin de identificar marcadores químicos para caracterizar y diferenciar a los
microorganismos Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Mycobacterium smegmatis, Pseudomonas
aeruginosa, Escherichia coli y Cryptococcus neoformas se desarrolló una metodología para el
análisis de lípidos de dichas bacterias usando cromatografía de gases acoplada a espectrometría de
masas. Para ello se preparó y analizó un extracto hexánico tras la lisis celular y derivatización de la
masa bacteriana fresca con metóxido de sodio 8% en metanol. El extracto hexánico de esta preparación
se analizó siguiendo la metodología desarrollada utilizando cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas.
De esta manera, se encontró tres marcadores biológicos (bioquímicos) característicos de la bacteria
Bacillus subtilis; así como uno característico de la bacteria Salmonella typhi y otros dos marcadores que
ocasionalmente se observan para esta bacteria, pero no para los demás microorganismos estudiados.
No se encontró marcadores biológicos (bioquímicos) constantes para la bacteria Staphylococcus aureus;
sin embargo se observó tres marcadores que ocasionalmente aparecen exclusivamente en esta bacteria,
pero no en los demás microorganismos estudiados. El mismo caso sucedió con Mycobacterium
smegmatis, para la cual se observó cinco marcadores ocasionales que aparecen únicamente para esta
bacteria y no para los demás microorganismos estudiados.
No se encontró marcadores biológicos (bioquímicos) que puedan tomarse como constantes para el
microorganismo Cryptococcus neoformans, aunque se observó dos marcadores característicos de este
microorganismo al compararlo con los demás bajo estudio; sin embargo los mismos no pueden
considerarse definitivos, debido a la debilidad de la señal producida por esta especie.
Tampoco se encontró marcadores biológicos (bioquímicos) constantes ni ocasionales exclusivos para la
bacteria Escherichia coli, pero esta especie aún puede diferenciarse de los demás microorganismos bajo
estudio por la presencia de un marcador poco común y la ausencia de los picos característicos de
Salmonella typhi, que también lo contiene.
No se encontró marcadores biológicos (bioquímicos) constantes ni ocasionales exclusivos para la
bacteria Pseudomonas aeruginosa, ni se pudo observar otros marcadores que permitieran su
diferenciación indirecta de los demás microorganismos bajo estudio, por lo que no se le puede aplicar
una estrategia inequívoca de identificación.
Al comparar los recursos consumidos por la metodología de caracterización de microorganismos por
cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas desarrollada contra la metodología de
caracterización convencional, se obtiene una reducción del tiempo de análisis del 94 % y una reducción
de costos directos del 2.5 %.
1
SUMMARY
In order to identify chemical biomarkers to characterize and differentiate the microorganisms
Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Mycobacterium smegmatis, Pseudomonas aeruginosa,
Escherichia coli and Cryptococcus neoformans it was developed a methodology for the lipids analysis
of these bacteria by gas chromatography coupled to mass spectrometry. A hexanic extract was prepared
and analyzed after cellular lysis and derivatization of fresh bacterial mass with 8% sodium metoxide in
methanol. This hexanic extract was analyzed following the developed methodology using gas
chromatography coupled to mass spectrometry.
There were found three chemical biomarkers characteristic of Bacillus subtillis, one characteristic of
Salmonella typhi as well as other tow biomarkers occasionally observed in this last bacterium, but not in
the other studied microorganisms.
There were not found constant biomarkers for Staphylococcus aureus, but three biomarkers that
occasionally showed exclusively for this bacterium were observed. It was the same for Mycobacterium
smegmatis, that it showed five occasional biomarkers that appeared only for this specie.
There were not found biomarkers that can be considered constant for Cryptococcus neoformans, even
though it was observed two characteristic biomarkers of this specie compared to the other ones under
study. However, these could not be considered definitive because of the weakness of the signal
produced.
It could not be found constant or occasional biomarkers for Escherichia coli either. But this specie can
still be differentiated of the other microorganisms studied by the presence of an uncommon biomarker
and the absence of the characteristic peaks of Salmonella typhi, that is the only other bacterium
showing that biomarker.
There were not found any constant or occasional biomarkers for Pseudomonas aeuruginosa and there
were not observed other biomarkers that could be used to indirectly identify it from the other
microorganisms under study, so a definitive identification strategy could not be applied.
Comparing consumed resources by the developed microorganisms characterization methodology by gas
chromatography coupled to mass spectrometry to de conventional characterization method, it was
obtained an analysis time reduction of about 94 % and a direct cost decrease of about 2.5 %.
2
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN
En la actualidad el diagnóstico de microorganismos y hongos patógenos se realiza a través de cultivos
que pueden llegar a tardar entre tres días a varias semanas dependiendo de cada organismo y en
especial para aquellos de crecimiento lento. En ese transcurso el médico tratante deberá utilizar su
intuición para adelantarse a darle un posible tratamiento a su paciente; ya que si espera demasiado
tiempo, para cuando se haya identificado el organismo causante de la afección del paciente, esté se
encontrara en una situación empeorada.
El presente proyecto buscaba como objetivo desarrollar una metodología que permita caracterizar
microorganismos, por medio del análisis de marcadores químicos, especialmente lípidos que forman
parte de las paredes bacterianas por medio de cromatografía de gases acoplada a masas, disminuyendo
así los tiempos de diagnóstico. Consecuentemente, al contar con un diagnóstico más rápido y objetivo,
el médico podrá tomar decisiones más oportunas y apropiadas a fin de salvar más vidas. Si bien la
inversión en equipo es considerable, rápidamente se recupera al ahorrar reactivos, medios de cultivo
incubadoras y tiempo.
En adición se obtuvo valiosa información con aplicación en bacteriología clínica e industrial ya que se
identificaron marcadores químicos que permiten determinar la presencia de las especies de
microorganismos estudiadas. Debe hacerse énfasis en que la información obtenida en el proyecto no
queda restringida al diagnóstico clínico, sino a la bacteriología industrial, el control de calidad
microbiológico en alimentos, cosméticos, agua y fármacos.
Los microorganismos seleccionados para el presente proyecto son Staphylococcus aureus, Salmonella
typhi, Mycobacterium smegmatis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Cryptococcus
neoformans, debido a que estas son las bacterias de referencia con las que cuenta la facultad de ciencias
químicas y farmacia y nuestros colaboradores en este momento.
El método a seguir para identificar los marcadores químicos a utilizar para la caracterización y posterior
identificación de las bacterias mencionadas consistió en el cultivo de dichas bacterias en agar MüllerHilton, tras lo cual se recolectó la masa bacteriana y se realizó en un solo paso la lisis celular y
derivatización de los lípidos, utilizando metóxido de sodio en metanol para el efecto.
Los extractos hexánicos obtenidos a partir de la anterior mezcla de reacción fueron analizados por
cromatografía de gases acoplada a masas, con un método analítico optimizado a partir de pruebas
preliminares con algunas de las bacterias a utilizar en la investigación.
3
Los resultados presentados a continuación se enfocan en la diferenciación de las especies de
microorganismos basándose en la presencia y/o ausencia de picos característicos en sus
cromatogramas, especialmente de picos exclusivos para cada especie.
De esta manera, la investigación aporta en el campo de la caracterización de microorganismos,
principalmente bacterias y agentes patógenos más comunes, haciendo uso de técnicas analíticas, cuya
aplicación en este campo es novedosa, lo es la cromatografía de gases acoplada a masas (GC-MS), a
través de la identificación de metabolitos propios de las especies en cuestión, principalmente los lípidos
de la pared celular, que se utilizaron como marcadores químicos.
Así se contribuye al proceso de desarrollo de nuevas formas de diagnóstico más rápidas y baratas que
las técnicas convencionales, que a largo plazo mejorarán la capacidad de respuesta en microbiología
clínica. Además se contribuye al conocimiento general de os microorganismo en cuestión, con
información que puede ser aplicada a otros campos.
4
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
1.2.1. ANTECEDENTES EN GUATEMALA
1.2.1.1. Métodos actuales para la identificación de microorganismos
Las últimas décadas han producido una explosión de nuevos métodos en el laboratorio
microbiológico. Aún en la década de los 70 los diagnósticos de laboratorio definitivos para
enfermedades infecciosas eran mayoritariamente alcanzados únicamente por medio del uso de
técnicas engorrosas, costosas, lentas y usualmente subjetivas, que requerían personal altamente
capacitado y experimentado. (Murray, 1995)
Los microorganismos se visualizaban directamente por microscopía de material clínico teñido.
Alternativamente o en adición, se realizaban cultivos usando métodos de un siglo de antigüedad
en medios sólidos o líquidos. Los organismos recuperados en el cultivo eran identificados por
métodos convencionales laboriosos basados en el crecimiento y, cuando era necesario, se realizaban
pruebas de susceptibilidad antimicrobiana por el procedimiento manual de difusión de discos. (Murray,
1995)
Este tipo de pruebas se continúan realizando en el país, aunque por lo general, no son las técnicas
rutinarias de diagnóstico. Varias áreas específicas han tenido un gran cambio en el laboratorio clínico
microbiológico actual. En el campo de la identificación de bacterias, ésta se logra ahora en gran
parte a través de sistemas de utilización de sustrato miniaturizados, muchos de los cuales so n
automatizados. (Murray, 1995)
Por otro lado, las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana son comúnmente realizadas con
procedimientos de microdilución de caldos de cultivo comerciales o por alguna forma instrumental.
La bacteremia y fungemia son usualmente detectadas por sistemas comerciales instrumentales de
cultivo en sangre. Existen nuevos métodos de inmunodiagnóstico para detección de antígenos y
anticuerpos, que son ampliamente utilizados. (Murray, 1995)
La identificación de bacterias y levaduras por medio de sistemas de utilización de sustratos se basa en
las siguientes características: reacciones que producen cambios de pH; perfiles enzimáticos, detectados
visual o automáticamente por liberación de cromógenos o fluorógenos; utilización de fuentes de
carbono, midiendo actividad metabólica visual o automáticamente con cambios de color; detección de
productos metabólicos, por cromatografía; y, detección visual de crecimiento, variando el sustrato. Solo
algunos de estos métodos son actualmente aplicados en Guatemala (Murray, 1995)
1.2.1.2.
La identificación de microorganismos por técnicas cromatográficas
El uso de métodos cromatográficos con fines de identificación y como herramienta de
caracterización fenotípica ha cobrado importancia en la microbiología recientemente. Cuando se
utilizan apropiadamente estas técnicas son extremadamente útiles para identificar microorganismos
de interés clínico, permitiendo la automatización y rapidez en la identificación de los mismos. (David et
al, 2008; Murray, 1995; Piñeiro-Vidal et al, 2008; Stenerson, 2004; Termonia et al, 1989)
5
El uso de la cromatografía de gases para la identificación de microorganismos a través del análisis de los
ésteres metílicos de ácidos grasos celulares comienza a generalizarse en otras partes del mundo,
existiendo métodos comerciales y diversidad de técnicas de preparación de muestra y de análisis
cromatográficos reportados. (Analysis, 2008; Bryan and Gardner, 1967; David et al, 2008; Kunitsky et al
2006; Wayne et al, 1974; Vannieuwenhuyze, 1987)
Sin embargo, en Guatemala, no se ha encontrado reportes del uso de técnicas cromatográficas, para la
identificación de microorganismos. Este campo aún no ha sido apropiadamente investigado en el país, a
pesar de que existen múltiples reportes de su uso en investigación científica, como por ejemplo los
anteriormente mencionados.
6
1.2.2. JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
En Guatemala actualmente la identificación de microorganismos para el diagnóstico de
enfermedades se realiza a través de métodos convencionales. Estos generalmente incluyen cultivos, que
pueden tardar de días a semanas, con lo cual el tiempo necesario para el diagnóstico adecuado se
extiende mientras empeora la salud de los pacientes. Esta situación se agrava al considerar la
elevada capacidad de mutación de los patógenos, su rápida difusión a través de los medios de
transporte modernos y el contacto humano con nuevos vectores al ampliar su hábitat. Es
necesario, por lo tanto, implementar nuevos métodos para la identificación de microorganismos
que permitan resultados más rápidos, conservando la exactitud en el diagnóstico.
En este trabajo de investigación se desarrolló metodología que permite caracterizar
microorganismos, por medio de la identificación de marcadores químicos, utilizando técnicas
cromatográficas. Esta metodología mejorará el diagnóstico clínico al reducir el tiempo de análisis de
muestras a pocas horas. Además, a largo plazo disminuye los costos de análisis, ya que ahorra el
gasto en enzimas, medios de cultivo, incubadoras, y tiempo de trabajo.
La metodología desarrollada servirá además de base para futuras investigación es en este campo, ya que
puede ampliarse para otros microorganismos no incluidos en esta investigación, e incluso servir
de referencia para el desarrollo de métodos de diferenciación celular en otros campos. Adicionalmente,
se obtuvo información bacteriológica acerca de marcadores químicos para cada una de las
especies incluidas, que puede aplicarse a otras ramas además de la microbiología clínica, como la
bacteriología industrial, el control de calidad microbiológico en alimentos, agua, fármacos, entre otras.
7
I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS
1.3.1. OBJETIVOS
1.3.1.1. Objetivo General
•
Contribuir a la investigación química de microorganismos.
1.3.1.2.
Objetivos Específicos
•
Encontrar marcadores biológicos que permitan diagnosticar la presencia de microorganismos
por medio de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas.
•
Desarrollar una metodología analítica que permita caracterizar los lípidos presentes en las
paredes de Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Mycobacterium smegmatis, Bacillus
subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Cryptococcus neoformans.
•
Reducir los costos de las metodologías de caracterización de microorganismos por cromatogafía
de gases acoplada a espectrometría de masas.
•
Desarrollar una metodología que permita extraer de manera reproducible los lípidos de las
paredes de bacterias.
8
I.4 METODOLOGÍA
1.4.1. LOCALIZACIÓN
La investigación se llevó a cabo en las instalaciones del Departamento de Fisicoquímica, de la
Escuela de Química de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San
Carlos de Guatemala, con el apoyo del Departamento de Citohistología de la Escuela de
Química Biológica de la misma facultad.
Ambos sitios de desarrollo de la investigación se encuentran dentro de la Ciudad Universitaria,
zona 12, para la cual se tienen los siguientes datos:
Coordenadas
Latitud:
N 14° 35.101’
Longitud:
W 90° 33.284’
Altitud:
1522 msnm
Precipitación pluvial (promedio anual):
1100 - 1200 mm
Temperatura máxima:
24.5 °C
Temperatura mínima:
14.0 °C
Humedad relativa (promedio):
78 %
(INSIVUMEH, 2010 y OLIVA, 2009)
1.4.2. LAS VARIABLES
1.4.2.1. Variables dependientes
Para el trabajo de investigación se consideró como variable dependiente la composición del
extracto hexánico, de la mezcla de lisis celular/derivatización de lípidos, determinada por medio
de cromatografía de gases acoplada a masas.
1.4.2.2. Variables independientes
Entre las variables independientes se tomó como variable de prueba la especie de
microorganismo, manteniendo constantes las demás variables independientes como medio de
9
cultivo, madurez de los cultivos, procedimientos de derivatización y extracción de analitos y
metodología analítica.
1.4.3. INDICADORES
Se tomó como indicadores, para la evaluación de la correlación entre la variable dependiente y
la variable independiente de trabajo, la presencia/ausencia de picos en los cromatogramas
obtenidos para los microorganismos bajo estudio.
1.4.4. ESTRATEGIA METODOLÓGICA
1.4.4.1. Población y muestra
El universo de trabajo lo constituyen las bacterias Staphylococcus aureus, Salmonella typhi,
Mycobacterium smegmatis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Cryptococcus
neoformans. La muestra consiste en porciones de masa bacteriana proveniente de cultivos
sobre agar Mûller-Hilton de cepas de estas bacterias.
1.4.5. EL MÉTODO
Preparación de muestras:
1. Se lavó cuantitativamente toda la cristalería a utilizar, esterilizando con etanol al final.
2. Se identificó una serie de frascos de 4 y 10 ml para cada microorganismo y solución a contener.
3. Se realizaron pruebas preliminares con dos de las bacterias utilizando diferentes
concentraciones de metóxido en metanol, solventes para extracción y técnicas de tratamiento
de las muestras, hasta encontrar una metodología apropiada.
4. Se preparó 50 ml de solución de metóxido de sodio en metanol 8 % (p/v).
5. Se agregó a cada tubo rotulado 1.500 ml de solución de metóxido.
6. Se agregó una asada llena de masa bacteriana a cada tubo correspondiente, recolectándola con
un asa de nicromo y agitándola para liberarla en el vial.
7. Se agitó y dejó reaccionar por 1 minuto.
8. Se agregó 0.900 ml de hexano.
10
9. Se agitó por 1 minuto y se centrifugó por 3 minutos para separar las fases.
10. Se recolectó la fase orgánica y se trasvasó a un vial de 4 ml identificado.
Análisis por Cromatografía de Gases Acoplada a Espectrometría de Masas:
1. Se realizaron pruebas preliminares con dos de los extractos utilizando diferentes condiciones de
análisis en una columna DB-5, variando la temperatura del inyector, temperatura inicial
del horno, temperatura final, rampa de temperatura, modo de inyección y volumen de inyección
2. Se grabó en el equipo de CG/EM un método para los extractos, tomando en cuenta las pruebas
preliminares, con la siguiente descripción: Inyección: 1 µL splitless por 30 segundos;
temperatura de inyección 280 ºC; temperatura inicial del horno 150 ºC por 5 minutos, gradiente
de 3 ºC/min hasta 180 ºC, gradiente de 2 ºC/min hasta 220 ºC y temperatura final de 220 ºC por
70 minutos; temperatura de interface 280 ºC; detector de espectrometría de masas en modo de
barrido desde m/z 40 hasta m/z 550, con 15 minutos de tiempo muerto.
3. Se inyectaron las muestras y se recolectó los espectros y cromatogramas correspondientes.
Análisis de cromatogramas:
1. Se identificaron picos persistentes en los diferentes cromatogramas de las mismas
bacterias analizadas.
2. Se identificaron picos iguales y diferentes en los cromatogramas de las distintas bacterias
analizadas obtenidos en las mismas condiciones.
3. Se numeró los picos de todos los cromatogramas para su fácil identificación.
4. Se buscó la diferenciación de las especies de estudio basándose en la presencia y/o ausencia de
picos característicos en sus cromatogramas, especialmente de picos exclusivos de cada
especie.
5. Se realizó la elucidación estructural de los compuestos correspondientes a los picos
exclusivos y principales de cada especie, para su asignación como marcadores químicos.
1.4.6. LA TÉCNICA ESTADÍSTICA
Para el análisis de la composición del extracto hexánico de los microorganismos bajo estudio se
repitió el procedimiento completo desde el cultivo de la cepa hasta el análisis cromatográfico,
buscando obtener tres cromatogramas para cada especie, a manera de obtener un resultado
11
más representativo en términos estadísticos. Sin embargo, la elección del número de replicados
estuvo limitada por la disposición de recursos, siendo éste el número máximo posible de
muestras a trabajar, independientemente de los criterios estadísticos aplicables.
Debido a que se utilizó indicadores cualitativos, no se aplicó un análisis estadístico a los
resultados.
1.4.7. LOS INSTRUMENTOS A UTILIZAR
Cromatógrafo de gases Hewlett-Packard 5890 II plus con detector de espectrometría de masas
HP 5970, equipado con columna Restek Rtx-5 de 30m, 0.25 mm DI y recubrimiento 0.50 µm.
Refrigerador
Microcentrífuga
Agitador vórtex
Probetas de 25 y 100 ml
Pipetas volumétricas de 5, 10 y 25 ml
Pipetas Pasteur
Micropipetas automáticas de 1000 y 200 µl
Bureta de 50 ml con llave de teflón
Beakers de 25, 50, 250 y 500 ml
Tubos de ensayo de 10 ml
Tubos de cultivo de 10 ml
Frascos ámbar de 4 ml
Frascos ámbar de 10 ml
Varilla de agitación
Asas de nicromo
Pipeteadores
Bulbos para pipetas Pasteur
12
Puntas para micropipetas automáticas
Jeringas para inyección en CG
Gradilla para tubos de ensayo
Espátulas metálicas
Metanol grado CLAR
Hexano grado CLAR
Etanol
Sodio metálico
Helio 99.999 %
13
PARTE II
II.
MARCO TEÓRICO
II.1
Descripción de microorganismos seleccionados
Para la investigación se usaron los siguientes microorganismos: Staphylococcus aureus, Salmonella typhi,
Mycobacterium smegmatis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Cryptococcus neoformas.
Staphylococcus aureus es una bacteria de forma esférica de 0.8 a 1.0 micrones. Ocurre aislada,
en parejas, en cadenas cortas y en agregados irregulares. No tiene motilidad. Es un coco gram
positivo, aeróbico facultativo. (Breed, 1948)
Da negativa la prueba del indol. Reduce los nitratos a nitritos. Forma ácido a partir de glucosa, lactosa,
sacarosa, manitol y glicerol, pero no de rafinosa, salicina o inulina. Fermenta el manitol. Forma
ácido láctico inactivo o levorrotatorio. Produce ligera formación de HS. No hidroliza el almidón.
No utiliza NH4H2PO4 como fuente de nitrógeno. Produce amoniaco de peptonas. (Breed, 1948)
Su temperatura óptima de incubación es de 37 º C. Licúa la gelatina, con una película amarillenta y un
sedimento amarillo a naranja.
Las colonias en agar son circulares, suaves, amarillentas a
anaranjadas, brillantes, intactas. En agar inclinado las colonias son abundantes, opacas, suaves, planas,
amarillentas a anaranjadas. En caldo el medio es turbio con un anillo amarillento y sedimento,
volviéndose transparente. (Breed, 1948)
Es patogénico. Las cepas varían en su habilidad para producir hemolisina, coagulasa y otros productos
metabólicos. Algunas cepas, bajo las condiciones adecuadas no sólo producen exotoxinas
(hematoxina, dermatoxina, toxina letal, etc.) sino también una potente enterotoxina que es una causa
significante de intoxicación alimentaria. (Breed, 1948)
Se recomienda examinar su presencia en comidas con ingredientes altos en proteínas, como
queso,carne, panadería rellena de crema, embutidos, ensaladas, etc. (Murray, 1995)
Se puede aislar del pus de las heridas. Su hábitat natural son la piel y las membranas mucosas.
Es causante de furúnculos, abscesos, supuración en las heridas, etc. (Breed, 1948)
Salmonella typhi es un bacilo de 0.6 a 0.7 por 2.0 a 3.0 micrones, ocurre aislado, en parejas y
ocasionalmente en cadenas cortas. Es móvil con flagelos peritricos. Es una bacteria gram negativa.
Es aeróbico facultativo. (Breed, 1948)
Produce ácido pero no gas de la glucosa, fructosa, galactosa, xilosa, maltosa, rafinosa, dextrina, glicerol,
manitol y sorbitol. No actúa en la lactosa, sacarosa, inulina, ramnosa, inositol, salicina y
usualmente arabinosa y dulcitol. Reduce el óxido de trimetilamina. No forma indol. Produce
nitritos a partir de nitratos. Produce sulfuro de hidrógeno. (Breed, 1948)
14
Su temperatura óptima de incubación es de 37º C . Las colonias en gelatina son grisáceas, de
transparentes a opacas, con superficie de hojuela. No licúa la gelatina. Las colonias en agar son
grisáceas, de transparentes a opacas. En agar inclinado el crecimiento es blanquecino a gris,
brillante, completo u ondulado. En caldo el medio se vuelve turbio con sedimento moderado y
una película delicada en cultivos viejos. No tiene un olor característico. (Breed, 1948)
Se encuentra en el intestino humano. Es causante de la fiebre tifoidea. Es patogénico para animales
de laboratorio. (Breed, 1948)
Mycobacterium smegmatis forma células elongadas que tienen una tendencia definida a ramificarse. Es
un bacilo gram positivo; no excede los 1.5 micrones y tiene mayoritariamente alrededor de 1 micrón de
diámetro. En ocasiones forma estructuras ramificadas que se asemejan al micelio de los hongos;
no forma esporas. (Azna, 2008)
Es una micobacteria de crecimiento rápido. Da positiva la prueba de alcohol ácido resistente para
el ácido pero no para el alcohol. Da negativa la prueba de la arilsulfatasa y la de catalasa. Crece en
agar MacC onckey sin cristal violeta. Reduce los nitratos. (Azna, 2008)
Su temperatura óptima de crecimiento es de 28º C. La mitad de las cepas clínicas producen una
pigmentación amarillo anaranjada en cultivos viejos. Las colonias en agar son habitualmente elevadas,
rugosas y de bordes festoneados, aunque algunas cepas forman colonias lisas. (Azna, 2008)
Se encuentra naturalmente en suelo y agua. Su potencial patógeno es escaso ya que es poco frecuente
en la patología humana. En esos casos, se ha asociado a infecciones en pacientes con
enfermedad pulmonar obstructiva, infecciones de la piel y partes blandas tras traumatismos y
cirugía, infecciones articulares, bacteriemia relacionada con catéteres, endocardiatitis, linfadenitis e
infección diseminada en pacientes inmunodeprimidos. (Azna, 2008)
Pseudomonas aeruginosa es un bacillo recto de 0.5 a 0.6 por 1.5 micrones, ocurre aislado, en parejas o
en cadenas cortas. Presenta motilidad ya que posee de uno a tres flagelos polares monotricos. Es
una bacteria gram negativa, aeróbica facultativa. (Breed, 1948)
Usualmente da negativa la prueba de formación del indol. Reduce los nitratos a nitritos y nitrógeno. No
ataca la glucosa, fructosa, galactosa, arabinosa, maltosa, lactosa, sacarosa, dextrina, inulina,
glicerol, manitol y dulcitol. Forma ácido de la glucosa. Provoca hemólisis. (Breed, 1948)
Su temperatura óptima de incubación es de 37 º C. Las colonias en gelatina son amarillentas o verdosas,
corrugadas, irregulares, similares a madejas de hilo. Licúa rápidamente la gelatina. Las colonias en agar
son grandes, esparcidas, grisáceas con centro oscuro y orilla translúcida, irregulares. El medio se torna
verdoso. En agar inclinado las colonias son abundantes, delgadas, blancas, brillantes. El medio se
torna verde a café oscuro o incluso negro, fluorescente. (Breed, 1948)
15
En caldo hay una marcada turbidez con una película gruesa y sedimento pesado . El medio se torna de
amarillo verdoso a azul, con fluorescencia, posteriormente café. Produce pyocianina, fluoresceína
y pyrorubrina. Los cultivos tienen un marcado olor de trimetilamina. (Breed, 1948)
Es patógena para conejos, conejillos de Indias, ratas y ratones. Se encuentra en el pus de las heridas. Es
causante de lesiones en humanos y animales. Se encuentra en agua contaminada y desagües. (Breed,
1948)
Escherichia coli es un bacilo usualmente de 0.5 por 1.0 a 3.0 micrones, variando de casi cocoide a largos
bacilos, ocurre aislado, en parejas y en cadenas cortas. Hay variedades móviles y no móviles. Las cepas
móviles tienen flagelos peritricos. No usualmente encapsulada. No forma esporas. Es gram
negativa, aeróbica facultativa. (Breed, 1948)
No utiliza ácido cítrico y sales de ácido cítrico como única fuente de carbono. No produce
acetilmetilcarbinol. Da positiva la prueba del rojo de metilo. Produce dióxido de carbono e hidrógeno en
volúmenes aproximadamente iguales a partir de glucosa. No utiliza ácido úrico como única fuente
de nitrógeno. Puede utilizar uracilo como única fuente de nitrógeno. (Breed, 1948)
No produce sulfuro de hidrógeno en agar peptona hierro. Usualmente da positiva la prueba del indol.
Produce nitritos a partir de nitratos. Algunas cepas son hemolíticas. Da negativo el test de
Voges- Proskauer. Produce catalasa. Forma ácido y gas a partir de glucosa, fructosa, galactosa, lactosa,
maltosa, arabinosa, xilosa, ramnosa y manitol. La sacarosa, rafinosa, salicina, esculina, dulcitol y glicerol
pueden o no ser fermentados. (Breed, 1948)
Crece en condiciones normales de laboratorio con crecimiento óptimo de 30 a 37 º C. Las colonias
en gelatina son opacas, húmedas, grisáceas a blancas, completas. No licúa la gelatina. Las colonias en
agar son usualmente blancas, a veces amarillentas y raramente amarillas, amarillo -café, doradocafé, rojizo naranja o rojas, completas u onduladas, húmedas, homogéneas. En agar inclinado el
crecimiento es usualmente blanco, a veces amarillento, rara vez amarillo, amarillo-café, dorado-café,
rojizo anaranjado o rojo, húmedo, brillante. En caldo el medio se vuelve turbio con sedimento pesado
grisáceo. No forma película; produce olor fecal. (Breed, 1948)
Normalmente habita el intestino del hombre y todos los vertebrados. Ampliamente distribuida en
la naturaleza. Frecuentemente causa infecciones del tracto genito -urinario. Invade el sistema
circulatorio en fases avanzadas de infección. Se utiliza como indicador de contaminación fecal en agua y
variedad de alimentos proteínicos y vegetales. (Breed, 1948).
Cryptococcus neoformans es una levadura encapsulada, de forma redonda a ovalada. Es un
basidiomiceto, que puede reproducirse de forma sexual o asexual. La reproducción asexual se da por
gemación, dejando una cicatriz en las células. La reproducción sexual se caracteriza por la formación de
esporas en forma de trébol. (Simmer y Seccko, 2009).
16
El género Cryptococcus contiene aproximadamente 37 especies, de las cuales únicamente Cryptococcus
neoformans es patógena. La inhalación ocasional de las basidioesporas causa la exposición al patógeno.
Aunque el sistema inmune normalmente lidia con dichas esporas, cuando el sistema inmune no est{a
funcionando apropiadamente, las células inhaladas pueden reproducirse y dispersarse a través del
cuerpo, resultando en cryptocococis. (Simmer y Secko, 2009).
La cryptocococis comúnmente causa meningitis, pero también se ha encontrado que causa neumonía y
lesiones de la piel. El aumento en las infecciones por C.neoformans está asociada al incremento global
de individuos inmunodeprimidos, principalmente relacionados con la epidema de SIDA. La incidencia de
pacientes VIH positivos que desarrollan cryptocococis es de alrededor de 10- 15 % en los países
occidentales y mucho mayor en otros lugares, como Zimbawe, donde la incidencia es de 88 %. (Simmer
y Sucko, 2009).
Se ha trabajado en investigar cómo C. neoformans causa enfermedad en humanos, y el grueso del
esfuerzo se ha dirigido a entender los factores de virulencia, siendo los principales la secreción de una
cápsula de polisacáridos y la síntesis de melanina. (Simmer y Sucko, 2009).
En respuesta a bajos niveles de hierro en el ambiente y niveles fisiológicis de CO2, C. neoformans puede
sintetizar una cápsula gruesa de polisacáridos, la cual interfiere con la acción de los macrófagos que
devoran las células invasoras, protegiendo a la levadura del sistema inmune. Adicionalmente, si los
macrófagos logran engullir el cryptococo, la cápsula le permite sobrevivir y reproducirse dentro del
mismo. (Simmer y Sucko, 2009).
El oscuro pigmento, melanina, es producido por la polimerización de polifenoles. La melanina ofrece al
criptococo protección contra los procesos oxidativos del sistema inmune. En las células como los
macrófagos las células invasoras son destruidas por medio de la exposición a radicales libres, que
desnaturalizan ADN y proteínas. La melanina neutraliza los radicales, protegiendo a la célula de la
reacción con los mismos. (Simmer y Sucko, 2009).
II.2
Métodos actuales para la identificación de microorganismos
Las últimas décadas han producido una explosión de nuevos métodos en el laboratorio
microbiológico. Aún en la década de los 70 los diagnósticos de laboratorio definitivos para
enfermedades infecciosas eran mayoritariamente alcanzados únicamente por medio del uso de
técnicas engorrosas, costosas, lentas y usualmente subjetivas, que requerían personal altamente
capacitado y experimentado. (Murray, 1995)
Los microorganismos se visualizaban directamente por microscopía de material clínico teñido.
Alternativamente o en adición, se realizaban cultivos usando métodos de un siglo de antigüedad
en medios sólidos o líquidos. Los organismos recuperados en el cultivo eran identificados por
17
métodos convencionales laboriosos basados en el crecimiento y, cuando era necesario, se realizaban
pruebas de susceptibilidad antimicrobiana por el procedimiento manual de difusión de discos. (Murray,
1995)
Varias áreas específicas han tenido un gran cambio en el laboratorio clínico microbiológico actual. En el
campo de la identificación de bacterias, ésta se logra ahora en gran parte a través de sistemas
de utilización de sustrato miniaturizados, muchos de los cuales son automatizados. Además el
uso de pruebas basadas en el examen de ácidos nucleicos ha jugado un papel cada vez más
importante en la detección y caracterización de microorganismos. Finalmente la caracterización por
métodos cromatográficos comienza a utilizarse para la identificación de cultivos y detección en
muestras clínicas. (Murray, 1995)
Por otro lado, las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana son comúnmente realizadas con
procedimientos de microdilución de caldos de cultivo comerciales o por alguna forma instrumental.
La bacteremia y fungemia son usualmente detectadas por sistemas comerciales instrumentales de
cultivo en sangre. Existen nuevos métodos de inmunodiagnóstico para detección de antígenos y
anticuerpos. (Murray, 1995)
La identificación de bacterias y levaduras por medio de sistemas de utilización de sustratos se basa en
las siguientes características: reacciones que producen cambios de pH; perfiles enzimáticos, detectados
visual o automáticamente por liberación de cromógenos o fluorógenos; utilización de fuentes de
carbono, midiendo actividad metabólica visual o automáticamente con cambios de color; detección de
productos metabólicos, por cromatografía; y, detección visual de crecimiento, variando el sustrato.
(Murray, 1995)
Los análisis de ADN se dividen en convencionales y amplificados. Ambos han demostrado ser útiles para
la caracterización de microorganismos para los cuales los métodos de cultivo y serológicos son difíciles,
demasiado caros o inaccesibles. Los ensayos convencionales son particularmente adecuados para
la hibridación in situ en tejido en que la localización y distribución de los organismos debe cerciorarse,
o para confirmación de cultivos de microorganismos de crecimiento lento. (Murray, 1995)
El alto nivel de sensibilidad alcanzado con las técnicas de amplificación hace de éstas el método
escoger para la detección directa de ADN microbiano en muestras clínicas. Aunque es importante
recordar que estos procedimientos no reemplazan el cultivo convencional y los procedimientos
serológicos en todas las situaciones, por varias razones. (Murray, 1995)
En primer lugar, las pruebas de ácidos nucléicos determinan si el ADN o ARN de un organismo
en particular está presente en la muestra pero no revelan nada acerca de la viabilidad del organismo o
si está implicado en un proceso infeccioso. Por otro lado para garantizar que el material genético
identificado pertenece únicamente a la muestra, es necesario trabajar en un ambiente completamente
18
limpio, libre de cualquier residuo genético contaminante y con protocolos de trabajo que eviten
la contaminación de la muestra en todas las etapas de preparación y análisis. (Murray, 1995)
Otra parte significativa de la microbiología clínica es la caracterización fenotípica de microorganismos. El
uso de métodos como la cromatografía para propósitos de identificación se ha vuelto, por lo tanto, cada
vez más importante. Dependiendo del tipo de compuesto a ser detectado se utilizan diferentes métodos
cromatográficos. Por ejemplo la separación de proteínas implica algún tipo de cromatografía
líquida- sólida al igual que carbohidratos y polisacáridos complejos. Los ácidos grasos de cadena
larga suelen separarse e identificarse por cromatografía gaseosa. Componentes separados como
proteínas, ADN, ARN y carbohidratos usualmente se detectan visualmente separándolos por
cromatografía de capa fina. (Butler, 1987; Floyd, 1992; Fox, 1993; Kunitsky et al., 2006; Lévy-Frébault,
1986; Maliwan, 1988; Pritchard, 1981; Sasser, 1990)
II.3
La cromatografía como técnica analítica
La cromatografía es un método de separación basado en las diferencias de afinidad de los
diferentes compuestos (analitos) entre una fase móvil y una fase estacionaria. Dado que cada
analito tiene una afinidad específica en relación a estas fases, la migración entre las fases es
diferente para cada uno dando origen a la separación a lo largo del desarrollo de la cromatografía.
(Skoog, 1992)
Los componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionara se mueven lentamente con el
flujo de la fase móvil. Por el contrario los componentes que se unen débilmente a la fase
estacionara se mueven con rapidez. La distinta movilidad permite la separación de los componentes
en bandas o zonas discretas. (Skoog, 1992)
La cromatografía en columna fue inventada y denominada así, a principios del siglo XX, por el botánico
ruso Mikhail Tswett, al aplicar la técnica para separar pigmentos vegetales. Desde entonces las
aplicaciones, cualitativas y cuantitativas, de la cromatografía se han extendido a todas las ramas de la
ciencia. (Cazes, 2004; Skoog, 1992)
La cromatografía opera con el mismo principio que la extracción líquido-líquido donde un soluto se
transfiere de una fase a otra; la razón de hacerlo es concentrar o aislar el analito deseado o separarlo de
especies que podrían interferir en el análisis. La cromatografía opera bajo el mismo principio de la
extracción pero una fase se encuentra inmóvil mientras que la otra se mueve estando en contacto con
ésta última. (Gallegos, 1999)
Para que la muestra se separe en sus componentes por cromatografía, debe existir entonces, una fase
movil, la cual puede ser un líquido o un gas, y una fase estacionaria, que también puede ser un líquido o
19
un sólido. El fluido que entra a la columna se le llama eluyente y el que emerge eluato. El proceso
descrito se conoce como elución. (Skoog, 1992)
Los métodos cromatográficos se pueden clasificar de dos modos distintos. El primero se basa en
la forma en que las fases estacionaria y móvil se ponen en contacto. En la cromatografía en
columna un tubo estrecho contiene la fase estacionara a través de la cual se hace pasar la fase móvil
por gravedad o presión. En la cromatografía en plano la fase estacionaria se fija sobre una placa o a los
intersticios de un papel y la fase móvil se desplaza a través de ella por capilaridad. (Skoog, 1992)
Una clasificación más fundamental de los métodos se basa en el tipo de fase móvil y estacionaria y en la
clase de equilibrios implicados en la transferencia de analitos entre las fases. Un resumen de
esta clasificación se presenta en la tabla 1.
II.4
La cromatografía de gases
A mediados de siglo Martin y Synge pensaron que empleando una fase móvil no líquida, sino gaseosa se
acortaría el tiempo de análisis, pues se facilitaba la propagación de la muestra, ahora gaseosa, a través
de la columna, en este momento había nacido la cromatografia de gases, lo que le valió a Martin y Synge
el premio Nobel. Pronto comenzaron a describirse teorías que describían el proceso y se tuvo una
20
cromatografía simple, rápida y aplicable a la separación de muchos materiales volátiles especialmente
en la petroquímica donde en ese momento se preferían los métodos de destilación. (Gallegos, 1999)
La cromatografía de gases más utilizada se basa en la distribución de un analito entre una fase
móvil gaseosa inerte, comúnmente argón o helio, y una líquida inmovilizada sobre una superficie sólida
inerte. La muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se
produce por el flujo de la fase móvil, que no interacciona con las moléculas de analito. Las sustancias se
separan, en función de su punto de ebullición, por lo que el control de la temperatura de la
columna es determinante. (Jennings et al, 1996; Skoog, 1992)
La elección del gas portador a utilizar se hace principalmente en función del tipo de detector a utilizar,
ya que su única función es de transporte, mientras que la elección de la columna es esencial para la
separación. Existen dos tipos fundamentales de columnas para CG, las cuales son: empaquetadas
o de relleno y las tubulares abiertas o capilares. Las columnas tubulares abiertas de sílice fundida
están construidas de sílice purificada de óxidos metálicos. Los capilares así obtenidos tienen
paredes mucho más delgados que sus equivalentes de vidrio y luego se recubren con una capa
de poliimida para reforzarlas. Las columnas obtenidas mediante está técnica son flexibles y pueden
enrollarse longitudes considerables en cilindros de unos cuantos centímetros de diámetro. Al
aumentar el largo de la columna se mejora la separación. (Jennings et al, 1996; Skoog, 1992)
Los recubrimientos de las columnas para gas-líquido suelen ser: polidimetilsiloxano, el cual alcanza una
temperatura máxima de 350°C y su aplicación es de uso general, hidrocarburos, compuestos aromáticos,
drogas, esteroides y PCBs; poli(fenilmetildifenil)siloxano 10%, para ácidos grasos, alcaloides,
drogas, compuestos halogenados; polifenilmetilsiloxano 50%, para drogas, esteroides, pesticidas y
glicoles; y, polietilenglicoles, para ácidos libres, alcoholes, éteres, aceites esenciales y glicoles. (Skoog,
1992)
En general, como se ve posteriormente del diagrama, el sistema de un cromatógrafo de gases consiste
en:
a) Sistema del Gas acarreador
b) Inyector
c) Columna
d) Horno
e) Detector
f) Sistema de registro de resultados
21
Un esquema simplificado del sistema cromatográfico de un cromatógrafo de gases se puede apreciar en
la siguiente figura:
Figura 1. Diagrama esquemático de un cromatógrafo de gases
Fuente: Gallegos, J. Curso Básico. Cromatografía de gases.
Para el sistema del gas acarreador, en general se recomienda no utilizar cilindros que estén por debajo
de 100 – 200 psi (700 – 1400 KPa) de presión, ya que los contaminantes en el cilindro comienzan a
vaporizarse a contaminar el gas. Se recomienda el uso de gases denominados de ultra alta pureza (UHP)
y libres de oxígeno. Estos gases contienen menos de 1 ppm de oxígeno y 1 ppm de hidrocarburos, el
criterio de selección más importante es la baja concentración de oxígeno. En columnas capilares en
particular con películas de poco espesor el hidrógeno es el mejor gas acarreador dado que se tiene un
buen rango donde se logran análisis rápido con una pérdida mínima en eficiencia. (Gallegos, 1999)
La meta principal de la inyección de muestra es introducir la muestra en la columna. Para ello se debe
cumplir dos requisitos: El perfil de la muestra inyectada debe ser tan pequeño como sea posible y la
cantidad de muestra debe ser muy pequeña. Generalmente de 1μg a fin de no sobrecargar la columna.
(Gallegos, 1999)
Existen dos tipos básicos de inyectores: inyectores por vaporización e inyectores “on column”. Un
inyector por vaporización consiste básicamente en un cuerpo de metal que se calienta y donde se coloca
por dentro una tubería corta de vidrio llamado “liner” o “inserto“. Generalmente el gas acarreador entra
por la parte superior del inyector. Una jeringa se utiliza para perforar la septa (o septum) e introducir la
muestra en el inyector. La elevada temperatura del inyector causa que los componentes volátiles de la
muestra rápidamente se vaporicen, y sea arrastrada por el gas acarreador hacia la columna, donde el
proceso de separación comienza. (Gallegos, 1999)
La mayoría de los inyectores tienen una purga la cual está localizada en la parte superior del inyector
inmediatamente por debajo de la septa, por donde sale el gas con un flujo entre 0.5 – 5 mL/min.
22
(generalmente 1–3 mL/min.). Esta purga ayuda a minimizar la condensación de no volátiles o materiales
de elevado punto de ebullición provenientes de la parte expuesta de la septa. La temperatura del
inyector debe ser lo suficientemente elevada a fin de asegurar la vaporización instantánea de la
muestra, siempre que no se degrade la muestra. (Gallegos, 1999)
Los inyectores de vaporización permiten hacer dos tipos de inyección. La primera es con el Inyector en
Split. Es la más antigua, simple y fácil inyección. El proceso involucra inyectar 1 μL de la muestra la cual
es evaporada rápidamente pero sólo una fracción de ella (1 – 2%) en fase de vapor entra a la columna
(figura XXX). El resto de la columna vaporizada junto con gran cantidad de gas acarreador deja el
inyector a través de una salida del split. La cantidad de la división del flujo es medida por la proporción
del split. (split ratio) el cual es el volumen de gas acarreado que entra en la columna contra el volumen
que abandona el sistema vía la salida del split (split vent). Se determina midiendo o calculando los flujos
del gas que salen por la salida del split (split vent) y la columna. Los splits son reportados como el flujo
normalizado a la unidad. (Gallegos, 1999)
Para la inyección Splitess, se utiliza el mismo inyector, pero la válvula de split se cierra de inicio. La
muestra se diluye en un disolvente volátil (como hexano o metano) y se inyectan de 1 a 5 μL (de hecho
se recomienda inyectar lentamente). La muestra se mezcla con el gas acarreador y se transporta a la
columna con un flujo de aproximadamente 1mL/min. La columna debe estar unos 40°C (al menos 10°C)
abajo del punto de ebullición del disolvente, el cual se condensa al comienzo de la columna. Los analitos
son atrapados en el solvente en una banda estrecha lo que evita el problema de una pobre inyección,
este proceso se conoce como efecto del disolvente o atrapado del solvente. (Gallegos, 1999)
El otro tipo de inyector es el inyector en columna. En este método la aguja de la jeringa se inserta de
forma perfectamente alineada con la columna (usualmente megaboro de 0.53 mm de diámetro)
realizando la inyección dentro de la columna. Este inyector elimina problemas de backflash y
discriminación. La ventaja estriba en que es mejor para análisis de trazas y para buenas cuantificaciones.
(Gallegos, 1999)
Existen dos decisiones importantes al llevar a cabo un análisis en cromatografía de gases: la selección de
la mejor columna (la mejor fase estacionaria) y la selección de la temperatura de la columna, siendo la
más importante la primera de ellas. En el mercado se disponen de varias fases estacionarias. Para
escoger una fase líquida para un problema determinado se debe de tomar en cuenta la regla de que lo
“semejante disuelve a lo semejante”. Así, columnas no polares son mejores para solutos no polares,
columnas de polaridad intermedia son mejores para solutos con polaridad intermedia, y finalmente,
columnas con fases fuertemente polares son mejores para solutos fuertemente polares. (Gallegos,
1999)
Entre las fases estacionarias liquidas se encuentran: (Gallegos, 1999)
23
A) Escualeno.- Se considera la fase con menor polaridad, es un hidrocarburo saturado de fórmula, C30H62
si bien su temperatura límite superior es solo de 125°C.
B) Apolano 87.- Con la fórmula C87H176 ha sido sustituto del escualeno, si bien es ligeramente más polar.
C) Polisiloxanos o silicones.- Los polisiloxanos sustituidos tienen buena estabilidad térmica. Se considera
que tienen la mayor resistencia al abuso, y por lo tanto, un mayor tiempo de vida.
Este tipo de fases estacionarias se distinguen por tener un esqueleto lineal que alterna silicio y oxígeno
con dos grupos funcionales enlazados a cada silicio. Los grupos funcionales que generalmente se utilizan
son: metil (CH3-), fenil (C6H5-), cianopropil (-CH2CH2CH2CN) y trifluoropropil (-CH2CH2CF3). Estos grupos
se utilizan en varias cantidades y combinaciones a fin de impartir una separación específica
característica a cada fase estacionaria. Los grupos funcionales se adicionan al esqueleto en forma
semiordenada. La mayoría de las sustituciones están hechas por bloques que se van repitiendo con
cierta frecuencia. El número total de cada bloque está regulado precisamente a fin de mantener las
propiedades del polímero.
La fase con metil substituido al 100% es la más elemental sustitución del polisiloxano. Las demás fases
son mezclas que contienen una parte sustancial sustituida con metilos. Las mezclas comunes son:
a) fenil-metil
b) Cianopropil-fenil-metil
c) Cianopropil-metil
d) Trifluoropropil-metil
Las descripciones de la fase estacionaria proveen información acerca del tipo y cantidad de sustitución
del esqueleto de polisiloxano. Los nombres para los fabricantes con frecuencia no tienen un significado
real. Las fases de polisiloxanos usan el porcentaje de substitución para designar la estructura de la fase
- 5% fenil-metil-polisiloxano.- Un 5% de los grupos substituidos son fenilos, el 95% restante son
metilos. Una forma abreviada de nombrarla sería una fase de fenil al 5% (5% fenilos). Si no se
dan otras indicaciones se supone que los otros grupos son metilos con el porcentaje que
complete el 100%.
- Polisiloxano-cianopropil-fenil.- Cianopropilos y fenilos van separados, pero enlazados al mismo
átomo de silicio; el cianopropil NO va enlazado al fenilo. Por una fase 6% cianopropil-fenilmetil
polisiloxano, tiene un cianopropil enlazado al 3% de los sitios de silicio y 3% de fenilo, con un
94% con metilos.
24
- Fases estacionarias de bajo sangrado son típicamente polisiloxanos modificados adicionando
un fenilo en el esqueleto del polisiloxano estándar. Estas columnas se diseñan a fin de que sean
equivalentes a las comúnmente utilizadas por ejemplo DB-5 a DB-5MS; ambas con separaciones
muy similares, pero no exactamente iguales, si bien generalmente las diferencias en separación
son insignificantes.
D) Polietilenglicoles. Las fases PEG tienen características únicas no mostradas por los polisiloxanos, la
mayor desventaja de las fases estacionarias PEG es su extremada sensibilidad hacia el oxígeno,
especialmente a elevadas temperaturas, la presencia de oxígeno en el gas acarreador causa rápida
destrucción de la mayoría de las fases estacionarias de columnas capilares, siendo más susceptibles con
las fases de PEG.
E) PLOT. Son polímeros porosos que generalmente son sostenidos por algún tipo de enlace con la
tubería de sílice. Fases como óxido de aluminio (alúmina), mallas moleculares y una serie de polímeros
porosos (poraplot, por ejemplo) están disponibles. Para este tipo de columnas el mecanismo de
separación involucrados es el mecanismo primario de separación, ( en PEG y polisiloxanos el mecanismo
principal es la partición). Trabajan bien para hidrocarburos ligeros, gases sulfurados, compuestos
volátiles, dado que son muy retentivas.
Con pocas excepciones, la mayoría de los detectores utilizados en cromatografía de gases se inventan
específicamente para esta técnica. Las mayores excepciones son el detector de conductividad térmica y
el espectrómetro de masas. Existen alrededor de 60 detectores que se han utilizado en cromatografía de
gases. (Gallegos, 1999) Los más comunes son:
•
Detector de ionización de flama (FID)
•
Detector de conductividad térmica (TCD)
•
Detector de captura de electrones (ECD)
•
Detector de Fósforo/nitrógeno (NPD)
•
Detector de ionización de flama alcalina(AFID)
•
Detector de ionización termoiónica (TID)
•
Detector de fotoionización (PID);
•
Detector de ionización de Descarga (DID)
•
Detector de ionización de helio (HID)
•
Detector fotométrico de flama (FPD)
25
II.5
•
Emisión atómica de plasma (AED)
•
Detectores electroquímicos
•
Conductividad electrolítica Hall (HECD)
•
Quimiolumiscencia
•
Detector de densidad de gases (GADE)
•
Detector de radioactividad
•
Espectrómetro de masas (MS o MSD)
•
Infrarrojo de transformada de Fourier (FTIR)
La espectrometría de masas como método de detección en cromatografía
La primera aplicación general de la espectrometría de masas en análisis químico se produjo a principio
de los años cuarenta, en la industria del petróleo, para el análisis cuantitativo en mezclas de
hidrocarburos. A comienzos de los años cincuenta se empezó a utilizar para la identificación y
elucidación estructural de una amplia variedad de compuestos orgánicos. Esta capacidad se aplicó
posteriormente a la cromatografía como un método de detección muy valioso. (Skoog, 1992)
Para obtener un espectro de masas se bombardea el vapor del analito con un haz de electrones que da
lugar a la pérdida de un electrón del analito y la formación de un ion molecular que es una
especie cargada radicalar. La colisión entre los electrones energéticos y las moléculas de analito
proporcionan suficiente energía para dejarlas en estado excitado. La relajación se produce
posteriormente con frecuencia mediante fragmentación de parte de los iones moleculares, que dan
lugar a iones de masas más bajas. Los iones positivos producidos por impacto de electrones pasan
a través de la rendija del espectrómetro de masas, de donde salen de acuerdo con su relación
masa/carga originándose el espectro de masas. Al pico más alto, denominado pico base, se le asigna
el valor arbitrario de 100 y se considera la altura del resto de picos como un porcentaje de la altura del
pico base. (Kitson et al, 1996; Skoog, 1992)
Es rutinario acoplar un espectrómetro de masas a algún instrumento cromatográfico, como un
cromatógrafo de gases o un cromatógrafo líquido. El espectrómetro de masas encuentra amplio uso en
el análisis de compuestos cuyo espectro de masas es conocido y también en el análisis de compuestos
completamente desconocidos. En el caso de los primeros, la identificación se realiza comparando el
espectro de masas obtenido contra una base de datos o biblioteca de espectros. En el caso de un
compuesto desconocido, el ion molecular, el patrón de fragmentación y la evidencia obtenida de otras
26
formas de espectrometría conducen a la elucidación estructural y posterior identificación del nuevo
compuesto (Silverstein et al, 2005)
Como detector en cromatografía el espectrómetro de masas brinda amplia información acerca de
los analitos. En primer lugar permite determinar el peso molecular. Un análisis más detallado
permite la elucidación estructural del compuesto. La identificación de sustancias conocidas puede
hacerse de manera más rápida al comparar el espectro de masa obtenido con una librería de espectros.
En el caso de sustancias desconocidas la comparación de los espectros de masas de los analitos permite
decir con certeza si un pico de un cromatograma corresponde a la misma sustancia de un pico
en otro cromatograma. (Kitson et al, 1996; Skoog, 1992; Silverstein et al, 2005)
II.6
La identificación de microorganismos por técnicas cromatográficas
El uso de métodos cromatográficos con fines de identificación y como herramienta de
caracterización fenotípica ha cobrado importancia en la microbiología recientemente. Cuando se
utilizan apropiadamente estas técnicas son extremadamente útiles para identificar microorganismos
de interés clínico, permitiendo la automatización y rapidez en la identificación de los mismos. (David et
al, 2008; Murray, 1995; Piñeiro-Vidal et al, 2008; Stenerson, 2004; Termonia et al, 1989)
Naturalmente, dependiendo del tipo de compuestos a ser separados e identificados se han
aplicado diferentes métodos. Por ejemplo, la separación de proteínas de manera que no dañe las
moléculas separadas, generalmente implica el uso de cromatografía líquido -líquido. Los carbohidratos
complejos y polisacáridos son separados normalmente usando cromatografía líquido-sólido, al igual que
fragmentos de ADN y ARN, aunque los mono y disacáridos también pueden ser separados por
cromatografía gas-líquido. (Fox, 1993; Murray, 1995)
Los ácidos grasos de cadena larga que componen las paredes celulares son identificados usualmente por
cromatografía gaseosa, aunque los ácidos micólicos también han sido separados utilizando
cromatografía líquida de alta resolución. (Butler, 1987; Huys et al, 2008; Thompson, 1993)
El uso de la cromatografía de gases para la identificación de microorganismos a través del análisis de los
ésteres metílicos de ácidos grasos celulares comienza a generalizarse, existiendo métodos comerciales y
diversidad de técnicas de preparación de muestra y de análisis cromatográficos reportados. (Analysis,
2008; Bryan and Gardner, 1967; David et al, 2008; Kunitsky et al 2006; Wayne et al, 1974;
Vannieuwenhuyze, 1987)
Los detectores utilizados también varían dependiendo de la señal biológica y varían desde
detectores espectrofotométricos, usados principalmente para proteínas y polisacáridos, hasta
detectores de pH para ácidos y bases. Las tinciones de componentes separados, como proteínas,
27
ADN, ARN y carbohidratos son usualmente detectados visualmente en cromatografía de capa fina.
(Murray, 1995)
El método de análisis también toma en cuenta factores como la sensibilidad y especificidad de
los detectores, las ventajas de los métodos no destructivos, la necesidad de derivatización, etc. (Skoog,
1992) Los
métodos cromatográficos usados para la caracterización e identificación de
microorganismos además pueden enfocarse de distintos modos para alcanzar dicho objetivo. Así
se ha trabajado el análisis de productos metabólicos y el análisis de componentes estructurales de
los microorganismos. (Murray, 1995)
La cromatografía se ha utilizado por casi 40 años como método para la detección de ácidos orgánicos de
cadena corta (ácidos grasos volátiles) y alcoholes producidos por anaerobios obligados. Dado que por su
incapacidad de utilizar el oxígeno como aceptor final de la cadena de electrones los anaerobios
obligados han desarrollado rutas metabólicas alternativas únicas para cada género e incluso especie. La
aplicación de la cromatografía para el análisis de los componentes de estas rutas ha demostrado ser una
útil herramienta complementaria para la identificación de estas especies. (Murray, 1995)
Por otra parte las bacterias y levaduras, como organismos vivos están compuestos de los cuatro tipos
principales de biomoléculas: lípidos, proteínas, carbohidratos y ácidos nucléicos. Los monómeros
de estos componentes mayoritarios son 20 aminoácidos, cinco bases nitrogenadas,
aproximadamente 10 azúcares y más de 300 ácidos grasos.
De allí que para el análisis
monomérico, los ácidos grasos presentan una gran diversidad en los microorganismos, y por
tanto proveen de un amplio rango de características fenotípicas para la identificación de bacterias
y levaduras. Además los ácidos grasos generalmente son parte estable de las estructuras de
cualquier microorganismo y por lo tanto están siempre presentes en una forma predecible. (Murray,
1995)
Mientras que el análisis de ácidos grasos volátiles es complementario a la identificación bioquímica, los
ácidos grasos de cadena larga pueden ser utilizados por sí solos o combinados con información
bioquímica para la identificación de microorganismos. (Murray, 1995)
Aunque el análisis de ácidos grasos se realiza usualmente por medio de cromatografía gaseosa a través
del análisis de los ésteres metílicos de los ácidos grasos de la célula completa, algunos ácidos
muy grandes, como los ácidos micólicos (presentes en mycobacteriaS, Nocardia spp. Y Rhodococcus
spp. Por ejemplo) se analizan más efectivamente con CLAR. (Butler, 1987; Floyd, 1992; Lévy-Frébault,
1986; Maliwan, 1988; Murray, 1995)
La aplicación de técnicas cromatográficas a la identificación microbiana implica varias
consideraciones importantes. Temas como la estandarización en los métodos de crecimiento, extracción
y derivatización, los compuestos a ser analizados, etc. son factores significativos para el éxito. El
análisis de datos y el diseño de algoritmos de identificación quedan a criterio del analista. El análisis
28
de datos puede ser tan simple como la identificación de picos o más sofisticado como reconocimiento
de perfiles o análisis de cluster. (Eeerola y Lehtonen, 1988; Maliwan, 1988; Murray, 1995)
El análisis de perfiles de carbohidratos también se ha utilizado para la identificación de
microorganismos, aunque en mucho menor medida que el de ácidos grasos. Resulta útil para
algunos géneros como Cryptococcus y Bacillus. (Fox, 1993; Pritchard, 1981)
29
PARTE III
III. RESULTADOS
Después de probar con varias técnicas para la extracción y derivatización de los compuestos a analizar,
provenientes de los diferentes microorganismos bajo estudio, se encontraron como adecuados los
parámetros de tratamiento de la tabla número 2, para la extracción reproducible de los lípidos de las
paredes celulares bacterianas:
Tabla 2. Condiciones para extracción de lípidos de paredes celulares bacterianas
Parámetro
Condición
Medio de cultivo
Agar Muller-Hilton
Masa bacteriana
Fresca
Agente para derivatización
Solución de metóxido de sodio al 8% en metanol
Solvente para extracción
Hexano
Tiempos de reacción
1 minuto para agitación y 3 minutos para centrifugación
Volúmenes de reactivos
1 asada de masa bacteriana, 1.500 ml de solución de
metóxido y 0.900 ml de hexano
Tipo de material de contención
Únicamente vidrio
Procedimientos adicionales
Ninguno
Fuente: FODECYT 19-2007
Así mismo, tras la realización de varias pruebas preliminares con algunas de las bacterias a analizar, se
encontraron las condiciones analíticas que permitieron caracterizar los lípidos de las paredes celulares
de los microorganismos analizados, las cuales se muestran en la tabla número 3.
Tabla 3. Condiciones para análisis cromatográfico de lípidos de paredes celulares bacterianas
Parámetro
Condición
Tipo de inyección
Splitless
Volumen de inyección
1 µl (30 s)
Temperatura del inyector
280 ºC
Temperatura inicial del horno
150 ºC (5 min)
Rampas de temperatura del horno
3 ºC/min (180 ºC) ; 2 ºC/min (220º C)
Temperatura final del horno
220 ºC (70 min)
Temperatura de interfase
280 ºC
Modo de adquisición de datos
Scan
Rango de barrido
40 -550 m/z
Tiempo de retraso por solvente
15 min
Fuente: FODECYT 19-2007
30
Con las condiciones anteriores se obtuvo una serie de cromatogramas para cada uno de los
microorganismos bajo estudio. Los marcadores biológicos (compuestos bioquímicos), identificados en
los cromatogramas a partir de sus espectros de masas, que se utilizaron para determinar la presencia
de cada uno de los microorganismos, se resumen a manera de matriz en la tabla número 4.
Tabla 4. Marcadores principales encontrados en diferentes microorganismos
No./
morg.
P. aeur B subt
S. aur
1
E. coli
S.
typhi
M.
smeg
O
X
O
2
X
3
X
X
4
X
O
5
O
6
O
7
X
8
X
9
X
10
X
O
X
X
X
O
X
X
O
11
X
13
X
14
X
O
X
O
X
15
X
X
16
O
17
O
18
X
X
O
20
O
O
O
O
X
X
O
O
21
O
22
O
23
O
24
O
25
X
O
12
19
C. neof
O
31
No./
morg.
P. aeur B subt
S. aur
E. coli
S.
typhi
26
M.
smeg
O
27
O
28
X
X
X
O
29
X
X
X
X
O
O
30
X
X
X
X
O
O
X
31
X
32
X
33
X
X
X
X
O
34
X
X
X
O
O
35
X
O
O
O
O
Clave
X
O
C. neof
Picos exclusivos constantes
Picos exclusivos ocasionales
Picos confirmatorios
Siempre
A veces
Fuente: FODECYT 19-2007
Trabajando con esta metodología de caracterización de microorganismos por medio de cromatografía
de gases acoplada a espectrometría de masas se obtuvo una reducción de costos y recursos con
respecto al diagnóstico convencional, que se resume en la tabla número 5.
Tabla 5. Reducciones de costos para caracterización de microorganismos
Metodo tradicional
Tiempo de resultado
Metodo de cromatografia de gas acoplado a masas
48 Hrs.
Tiempo de resultado
3 Hrs.
Costo en
Insumos y equipo
Quetzales
70,000.00 Cromatografo de gas acoplado a masas
costo en
Quetzales
248,000.00
Incinerador electrico de asas
Asas en argolla
Autoclave
Incubadora con regulador de temperatura
Estufa electrica
Balanza semianalitica
5,000.00 Reactivos, disolventes, cristaleria y gas
15 Medios de transporte
65,000.00
67,000.00
5,000.00
8,000.00
20,000.00
1,200.00
Medios de cultivo: MK, SS, XLD,AS,AC,MH,TS
Medios de cultivo e identificacion:
TSI,LIA,MIO,CITRATO, UREA, LISINA, OMITINA Y
ARGENINA,DULCITOL, TARTATO
Cristaleria e insumos
TOTAL
Fuente: FODECYT 19-2007
18,000.00
Insumos y equipo
Campana de flujo laminar tipo II
18,000.00
20,000.00
276,015.00 TOTAL
269,200.00
32
III.1
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Con el fin de desarrollar una metodología adecuada para el análisis de ácidos grasos celulares de los
microorganismos bajo estudio, se realizaron diversas pruebas para optimizar diferentes parámetros en
la preparación de muestras y análisis por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
de
los microorganismos Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Mycobacterium smegmatis,
Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Cryptococcus neoformans.
Para la derivatización de las muestras, con el fin de obtener como analitos ésteres metílicos de los
ácidos grasos celulares, se probaron diferentes concentraciones de metóxido de sodio en metanol,
tiempos y modos de agitación para la transesterificación y la extracción con hexano. Después de
varias pruebas se determinó que para la preparación de muestras era adecuada una concentración del
8 % de metóxido de sodio en metanol, ya que concentraciones mayores no incrementaban la
respuesta.
También se encontró que es suficiente un minuto de agitación al utilizar un agitador vórtex, tanto
para la transesterificación como para la extracción. En el caso de la transesterificación, en menos de un
minuto se puede obtener una suspensión homogénea de una asada llena de masa bacteriana en 1500
µL de metóxido 8 % en metanol. También se encontró que aplicar ultrasonido en esta fase del
procedimiento, como se había planteado originalmente, resulta contraproducente ya que aumenta la
cantidad de subproductos de bajo peso molecular en los cromatogramas.
Para la extracción con hexano, puede utilizarse un tiempo de agitación menor a un minuto con
buenos resultados. Sin embargo se tomó este valor por comodidad, al ser fácilmente reproducible.
Luego de la extracción, las fases se separan por gravedad, pero se optó por la centrifugación para
hacer más rápido y reproducible el procedimiento. El extracto obtenido es directamente inyectable al
cromatógrafo, bajo las condiciones establecidas para los análisis.
Para la determinación de las condiciones de operación del cromatógrafo se realizaron varias corridas
con los extractos de las bacterias E. coli y S. aureus tras lo cual se fijaron los parámetros descritos en el
procedimiento. Se eligió estas bacterias como representativas de los bacilos gram negativos y los cocos
gram positivos, respectivamente. El tiempo de retraso para el encendido del detector se fijó en 15
minutos para evitar la serie de picos correspondientes a compuestos de bajo peso molecular que no
tienen utilidad analítica, ya que son comunes a todas las bacterias del estudio. La programación
de temperatura utilizada permite la resolución adecuada de picos manteniendo bajo el ruido de fondo.
Una vez obtenidos al menos dos cromatogramas para cada uno de los microorganismos bajo estudio se
procedió a numerar los picos principales identificados por sus espectros de masas, para facilitar su
manejo, y se elaboró la matriz de presencia de marcadores para los diferentes microorganismos, que se
presenta en la Tabla 4 en la sección de Resultados. A partir de la misma se determinó cuáles son los
picos exclusivos para cada bacteria, y los picos comunes a dos o más de los microorganismos.
33
Los picos exclusivos de cada microorganismo permiten su rápida identificación ya que al ser propios de
cada bacteria, el encontrarlos en un cromatograma permite deducir inmediatamente de qué
microorganismo se trata, bajo las condiciones analíticas especificadas. En este caso se encontró algunos
picos exclusivos en todos los cromatogramas del mismo microorganismo para las especies Bacillus
subtilis y Salmonella typhi. Otras especies como Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatis y
Cryptococcus neoformans presentan picos exclusivos en algunos de sus cromatogramas. Finalmente,
para las especies Pseudomonas aeuruginosa y Escherichia coli no se encontró picos exclusivos
apreciables en los experimentos realizados.
Para Bacillus subtilis se encontró tres picos exclusivos constantes en los cromatogramas analizados,
identificados con los números 8, 31 y 32.
En el caso de Salmonella typhi se encontró sólo un pico exclusivo constante, denominado 2. Además en
uno de sus cromatogramas se identificó como pico exclusivo el identificado con el número 5 y en el otro
cromatograma, al pico denominado 6.
Staphylococcus aureus no presentó picos exclusivos constantes, pero los picos 23, 24 y 27 aparecen
ocasionalmente en sus cromatogramas y no se observan en los de otras especies.
Los resultados de Mycobacterium smegmatis muestran cinco picos exclusivos pero que no aparecen
siempre en todos los cromatogramas analizados de este microorganismo. Dichos picos fueron
identificados con los números 11, 20, 22, 25 y 26.
Para Cryptococcus neoformans sólo se encontraron tres picos principales, dos de los cuales parecen ser
exclusivos de este microorganismo al compararlo con los demás bajo estudio. Sin embargo debido a la
débil intensidad de los picos obtenidos en el único cromatograma legible logrado, estas conclusiones no
deben tomarse como definitivas. Estos picos están identificados como 16 y 21.
Al analizar los cromatogramas de Pseudomonas aeuruginosa y de Escherichia coli no se encontró picos
exclusivos de ningún tipo entre sus picos principales. Por esta razón en la matriz de resultados se
resaltaron también aquellos picos principales poco comunes. En el caso de Escherichia coli, la ausencia
de picos característicos y la presencia del pico denominado 15 permite distinguirla de Salmonella typhi y
por lo tanto identificarla. Desafortunadamente para Pseudomonas aeuruginosa no se encontró una
forma inequívoca de identificación.
Finalmente, en cuanto al análisis de costos realizado se observó que con la metodología propuesta se
obtiene una reducción del tiempo de análisis del 94 % y una reducción de costos del 2.5 %. Es necesario
considerar además que la reducción de tiempo de análisis implica una reducción indirecta de costos, que
varía en función del personal utilizado (horas hombre), equipo e instalaciones (horas máquina), y la
correspondiente carga a los servicios de soporte.
34
PARTE IV
IV.1 CONCLUSIONES
1. Se encontró marcadores biológicos para diagnosticar la presencia de microorganismos por
medio de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, de la siguiente manera:
a. Se encontró tres marcadores biológicos (bioquímicos) característicos de la bacteria
Bacillus subtilis.
b. Se encontró un marcador biológico (bioquímico) característico de la bacteria Salmonella
typhi así como otros dos marcadores que ocasionalmente se observan para esta
bacteria, pero no para los demás microorganismos estudiados.
c. No se encontró marcadores biológicos (bioquímicos) constantes para la bacteria
Staphylococcus aureus; sin embargo se observó tres marcadores que ocasionalmente
aparecen exclusivamente en esta bacteria, pero no en los demás microorganismos
estudiados.
d. No se encontró marcadores biológicos (bioquímicos) constantes para la bacteria
Mycobacterium smegmatis, pero se observó cinco marcadores que ocasionalmente
aparecen exclusivamente para esta bacteria y no para los demás microorganismos
estudiados.
e. No se encontró marcadores biológicos (bioquímicos) que puedan tomarse como
constantes para el microorganismo Cryptococcus neoformans, aunque se observó dos
marcadores característicos de este microorganismo al compararlo con los demás bajo
estudio; sin embargo los mismos no pueden considerarse definitivos, debido a la
debilidad de la señal producida por esta especie.
f.
No se encontró marcadores biológicos (bioquímicos) constantes ni ocasionales
exclusivos para la bacteria Escherichia coli, pero esta especie aún puede diferenciarse de
los demás microorganismos bajo estudio por la presencia de un marcador poco común y
la ausencia de los picos característicos de Salmonella typhi, que también lo contiene.
g. No se encontró marcadores biológicos (bioquímicos) constantes ni ocasionales
exclusivos para la bacteria Pseudomonas aeruginosa, ni se pudo observar otros
marcadores que permitieran su diferenciación indirecta de los demás microorganismos
bajo estudio, por lo que no se le puede aplicar una estrategia inequívoca de
identificación.
2. Se consiguió desarrollar una metodología analítica adecuada para caracterizar los lípidos
presentes en las paredes de los microorganismos investigados, utilizando cromatografía de
gases acoplada a espectrometría de masas.
35
3. Al comparar los recursos consumidos por la metodología de caracterización de microorganismos
por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas desarrollada contra la
metodología de caracterización convencional, se obtiene una reducción del tiempo de análisis
del 94 % y una reducción de costos directos del 2.5 %.
4. Se pudo desarrollar una metodología adecuada que permitió extraer de manera reproducible los
lípidos de las paredes celulares de los microorganismos investigados, utilizando metóxido de
sodio al 8% en metanol como derivatizante sobre la masa bacteriana fresca y hexano como
solvente para la extracción.
36
IV.2
RECOMENDACIONES
1. Aplicar la metodología utilizada a otros microorganismos para evaluar su capacidad como
método de caracterización e identificación en un rango más amplio o para iniciar el desarrollo
de nuevas metodologías para diferentes grupos de microorganismos, esencialmente con las
mismas técnicas analíticas.
2. Aplicar la metodología analítica desarrollada a varias cepas de los microorganismos bajo estudio
para evaluar y validar las variaciones en los resultados obtenidos en esta investigación.
3. Actualizar los cálculos de reducción de costos de metodologías de caracterización de
microorganismos conforme se aplique la metodología a otros microorganismos o se optimizen
detalles de la misma.
4. Investigar la posibilidad de optimización de condiciones para la metodología de extracción
desarrollada, para obtener resultados reproducibles de manera más eficiente.
37
IV.3
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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actualización: No disponible. Fecha de consulta: 12/12/2008.
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Analysis of Bacterial Cellular Fatty Acids. Chromatographia 23(11).
31. Wayne, C., Lambert, M. y Merwin, W. (1974) Comparison of rapid methods for analysis of
bacterial fatty acids. Applied Microbiology 28(1): 80-85.
40
IV.4
ANEXOS
IV.4. 1 Cromatogramas y espectros de masas seleccionados
Gráfica 1. Cromatograma 1 de la bacteria Pseudomonas aeuruginosa
Fuente: FODECYT 19-2007
41
Gráfica 2. Cromatograma 2 de la bacteria Pseudomonas aeuruginosa
Fuente: FODECYT 19-2007
42
Gráfica 3. Cromatograma 1 de la bacteria Bacillus subtilis
Fuente: FODECYT 19-2007
43
Gráfica 4. Cromatograma 2 de la bacteria Bacillus subtilis
Fuente: FODECYT 19-2007
44
Gráfica 5. Cromatograma 1 de la bacteria Staphylococcus aureus
Fuente: FODECYT 19-2007
45
Gráfica 6. Cromatograma 2 de la bacteria Staphylococcus aureus
Fuente: FODECYT 19-2007
46
Gráfica 7. Cromatograma 1 de la bacteria Escherichia coli
Fuente: FODECYT 19-2007
47
Gráfica 8. Cromatograma 2 de la bacteria Escherichia coli
Fuente: FODECYT 19-2007
48
Gráfica 9. Cromatograma 1 de la bacteria Salmonella typhi
Fuente: FODECYT 19-2007
49
Gráfica 10. Cromatograma 2 de la bacteria Salmonella typhi
Fuente: FODECYT 19-2007
50
Gráfica 11. Cromatograma 3 de la bacteria Salmonella typhi
Fuente: FODECYT 19-2007
51
Gráfica 12. Cromatograma 1 de la bacteria Mycobacterium smegmatis
Fuente: FODECYT 19-2007
52
Gráfica 13. Cromatograma 2 de la bacteria Mycobacterium smegmatis
Fuente: FODECYT 19-2007
53
Gráfica 14. Cromatograma 3 de la bacteria Mycobacterium smegmatis
Fuente: FODECYT 19-2007
54
Gráfica 15. Cromatograma 1 del microorganismo Cryptococcus neoformans
Fuente: FODECYT 19-2007
55
Gráfica 16. Espectro de masas del marcador 2, exclusivo de Salmonella typhi
Fuente: FODECYT 19-2007
56
Gráfica 17. Espectro de masas del marcador 3, confirmativo de Bacillus subtilis y Mycobacterium
smegmatis
Fuente: FODECYT 19-2007
57
Gráfica 18. Espectro de masas del marcador 4, confirmativo de Bacillus subtilis y Mycobacterium
smegmatis
Fuente: FODECYT 19-2007
58
Gráfica 19. Espectro de masas del marcador 5, exclusivo ocasional de Salmonella typhi
Fuente: FODECYT 19-2007
59
Gráfica 20. Espectro de masas del marcador 6, exclusivo ocasional de Salmonella typhi
Fuente: FODECYT 19-2007
60
Gráfica 21. Espectro de masas del marcador 7 confirmativo de Bacillus subtilis y confirmativo
ocasional de Mycobacterium smegmatis
Fuente: FODECYT 19-2007
61
Gráfica 22. Espectro de masas del marcador 8, exclusivo de Bacillus subtilis
Fuente: FODECYT 19-2007
62
Gráfica 23. Espectro de masas del marcador 11, exclusivo de Mycobacterium smegmatis
Fuente: FODECYT 19-2007
63
Gráfica 24. Espectro de masas del marcador 12, confirmativo de Bacillus subtilis y confirmativo
ocasional de Mycobacterium smegmatis
Fuente: FODECYT 19-2007
64
Gráfica 25. Espectro de masas del marcador 14, confirmativo de Bacillus subtilis y Mycobacterium
smegmatis
Fuente: FODECYT 19-2007
65
Gráfica 26. Espectro de masas del marcador 15, confirmativo de Escherichia coli y Salmonella typhi
Fuente: FODECYT 19-2007
66
Gráfica 27. Espectro de masas del marcador 16, exclusivo ocasional de Cryptococcus neoformans
Fuente: FODECYT 19-2007
67
Gráfica 28. Espectro de masas del marcador 20, exclusivo ocasional de Mycobacterium smegmatis
Fuente: FODECYT 19-2007
68
Gráfica 29. Espectro de masas del marcador 21, exclusivo de Cryptococcus neoformans
Fuente: FODECYT 19-2007
69
Gráfica 30. Espectro de masas del marcador 22, exclusivo ocasional de Mycobacterium smegmatis
Fuente: FODECYT 19-2007
70
Gráfica 31. Espectro de masas del marcador 23, exclusivo ocasional de Staphylcococcus aureus
Fuente: FODECYT 19-2007
71
Gráfica 32. Espectro de masas del marcador 24, exclusivo ocasional de Staphylcococcus aureus
Fuente: FODECYT 19-2007
72
Gráfica 33. Espectro de masas del marcador 25, exclusivo exclusivo ocasional de Mycobacterium
smegmatis
Fuente: FODECYT 19-2007
73
Gráfica 34. Espectro de masas del marcador 26, exclusivo exclusivo ocasional de Mycobacterium
smegmatis
Fuente: FODECYT 19-2007
74
Gráfica 35. Espectro de masas del marcador 27, exclusivo exclusivo ocasional de Staphylcococcus
aureus
Fuente: FODECYT 19-2007
75
Gráfica 36. Espectro de masas del marcador 31, exclusivo de Bacillus subtilis
Fuente: FODECYT 19-2007
76
Gráfica 37. Espectro de masas del marcador 32, exclusivo de Bacillus subtilis
Fuente: FODECYT 19-2007
77
IV.4.2 Fotografías del proyecto
Fuente: FODECYT 19-2007
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Fuente: FODECYT 19-2007
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PARTE V
V.1
INFORME FINANCIERO
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