estudio de proteinas de la membrana del globulo rojo en

ESTUDIO DE PROTEINAS DE LA MEMBRANA DEL GLOBULO ROJO EN
PACIENTES PEDIATRICOS CON ESFEROCITOSIS HEREDITARIA DE LA
FUNDACION HOSPITAL DE LA MISERICORDIA
Dr. EDGAR VLADIMIR CABRERA BERNAL
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE MEDICINA – DEPARTAMENTO DE PEDIATRIA
UNIDAD DE ONCOHEMATOLOGIA PEDIATRICA
BOGOTÁ
2008
ESTUDIO DE PROTEINAS DE LA MEMBRANA DEL GLOBULO ROJO EN
PACIENTES PEDIATRICOS CON ESFEROCITOSIS HEREDITARIA DE LA
FUNDACION HOSPITAL DE LA MISERICORDIA
Autor:
Dr. EDGAR VLADIMIR CABRERA BERNAL
Código 597928
Tesis de grado para optar por el titulo de:
ESPECIALISTA EN ONCOHEMATOLOGÍA PEDIÁTRICA
Director de Tesis:
Dr. EDUARDO BELTRÁN DUSSAN
Profesor Titular Departamento de Pediatría
Coordinador Académico División de Oncohematología Pediátrica
Coordinador de la Especialidad en Oncohematología Pediátrica
Codirector de Tesis:
Dr. JORGE EDUARDO CAMINOS PINZÓN
Profesor de la Facultad de Medicina
División de Bioquímica
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE MEDICINA – DEPARTAMENTO DE PEDIATRIA
UNIDAD DE ONCOHEMATOLOGIA PEDIATRICA
BOGOTÁ
2008
A mi compañera Adriana, impulsora incansable de todas mis
batallas y a quien pertenece también este triunfo
A mis hijas: Laura, Juliana y Camilita: a quienes debo el amor
a la vida
A mis padres Zoila y William, ejemplo de lucha, lealtad,
rectitud y bondad
A mis maestros
A mis pacientes
A todos mis colaboradores
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Susana Bravo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Santiago
de Compostela, España
Al Dr. Justo Castaño de la Universidad de Córdoba, España
A la Universidad Nacional de Colombia
A la Fundación Hospital de la Misericordia
Al Departamento de Pediatría de la Universidad Nacional de Colombia
Al Servicio de Oncohematología Pediátrica de la Fundación Hospital de la
Misericordia
CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCION
10
1. JUSTIFICACIÓN
13
2. OBJETIVOS
15
2.1 OBJETIVO GENERAL
15
2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
15
3. MARCO TEORICO
16
3.1 ESTRUCTURA DE LA MEMBRANA
16
3.2 ETIOLOGIA Y FISIOPATOLOGIA
23
3.3 MANIFESTACIONES CLINICAS Y PARACLINICAS
28
3.4 DIAGNOSTICO
30
3.5 TRATAMIENTO
37
4. METODOLOGIA
38
4.1 TIPO DE ESTUDIO
38
4.2 CRITERIOS DE INCLUSION Y EXCLUSION
38
4.3 RECURSOS INSTITUCIONALES
39
4.4 RECURSO HUMANO
39
4.5 CONSIDERACIONES ETICAS Y DISPOSICIONES VIGENTES
39
4.6 TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS
41
5. RESULTADOS
47
5.1 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS
47
5.2 HALLAZGOS DE LABORATORIO
49
5.3 CURVA DE FRAGILIDAD OSMÓTICA
50
5.4 RESULTADOS DE ELECTROFORESIS 1D
50
5.5 RESULTADOS DE 2D-PAGE Y ESPECTROMETRÍA DE MASAS MALDITOF
51
6. DISCUSION
53
7. CONCLUSIONES
56
BIBLIOGRAFIA
57
ANEXOS
60
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Principales proteínas de la membrana del eritrocito
24
Tabla 2. Clasificación de esferocitosis e indicación de esplenectomía
29
Tabla 3. Características epidemiológicas de los pacientes
47
Tabla 4. Antecedentes personales y familiares
49
Tabla 5. Características de laboratorios
50
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1.
edición.
Malla del citoesqueleto. Modificado de William’s Hematology 7ª
18
Figura 2. Organización de la membrana del eritrocito.
21
Figura 3. Principales métodos proteómicos.
35
Figura 4.
controles
52
Diferencia de expresión de los pacientes con EH versus los
LISTA DE ANEXOS
Pág.
Anexo A. Consentimiento informado
61
Anexo B. Curvas de fragilidad osmótica
62
Anexo C.
Gel de Coomasie donde se observan las proteínas
similares(cuadros verdes) y diferentes(cuadros rojos) de los pacientes versus
los controles
70
Anexo D. Electroforesis en 2D-PAGE, donde se observa las proteínas que se
expresan en los pacientes con respecto a los controles.
71
Anexo E. Geles en 2D-PAGE: se observan las diferencias entre los controles
y el paciente 3 (subrayado por un cuadro rojo)
72
Anexo F. Resultados de espectrometría de masas de algunas de las
proteínas identificadas en los geles de los paciente
73
INTRODUCCION
La esferocitosis hereditaria (EH) es la causa de anemia hemolítica más frecuente
en todo el mundo y es secundaria a alteraciones o deficiencias en las proteínas
del citoesqueleto del eritrocito principalmente la espectrina, la ankirina, banda 3 y
banda 4.2, entre otras. Esta patología ocurre en todos los grupos étnicos y
raciales, con mayor prevalencia en la raza blanca. Tiene una incidencia que varía
entre 1 por cada 2.000 a 5.000 nacidos vivos dependiendo del sitio geográfico;
lamentablemente no hay estudios en Colombia donde se establezcan la incidencia
y la prevalencia de esta enfermedad.
Las manifestaciones clínicas son muy variadas por su comportamiento genético
que es también heterogéneo. Es autosómica dominante aproximadamente en el
75% de los casos y en el restante es: autosómica recesiva, autosómica dominante
con penetrancia variable o por mutaciones de novo.
El estudio y diagnóstico de la EH en nuestro medio es relativamente sencillo en
aquellos pacientes con antecedentes familiares y con un cuadro clínico y examen
físico clásico, el cual se complementa con los estudios de laboratorio que de
manera indirecta nos ayudan al diagnóstico. Pero el problema son los pacientes
con enfermedades leves o portadores (con rasgo) porque pueden cursar con
síntomas mínimos o incluso asintomáticos y las pruebas diagnósticas de rutina
pueden no revelar el diagnóstico por su baja sensibilidad en estos casos. Los
estudios de laboratorio generales son: cuadro hemático con evaluación de la
hemoglobina, hematocrito, volumen corpuscular medio, hemoglobina corpuscular
media y concentración de hemoglobina corpuscular media, conteo de reticulocitos
corregido, frotis de sangre periférica, Coombs directo y fraccionado y curva de
fragilidad osmótica. Se complementa con: bilirrubina total y diferencial, ecografía
10
de abdomen superior para evaluar el tamaño del bazo y la presencia de cálculos
en la vesícula biliar.
Una de las pruebas confirmatorias es la electroforesis de proteínas de membrana
del glóbulo rojo en gel de poliacrilamida solubilizada en sodio dodecil sulfato (SDSPAGE, de sus siglas en ingles) con la cual se puede identificar la ausencia única o
combinada de las proteínas del citoesqueleto y del cual hay sólo un estudio en
Colombia realizado por Torres et al (1) quienes describieron las características
clínicas y de laboratorio de 29 pacientes adultos con EH y a quienes se les
practicó electroforesis de proteínas de membrana del eritrocito en SDS-PAGE,
encontrando mayor deficiencia de Banda 3 que de espectrina a diferencia de lo
descrito en la mayoría de estudios y finalmente plantean completar los datos con
estudios de biología molecular.
Actualmente los avances científicos y tecnológicos en Biología Molecular permiten
la evaluación simultánea de las características genéticas y proteicas de una
muestra y han sido ampliamente empleados en diferentes campos de la medicina
con un futuro prometedor. Dentro de estos avances están las llamadas técnicas
“omic”: Genómica, Transcriptómica y Proteómica. Los genes (analizados por la
genómica) se transcriben a ARN (estudiados por la transcriptómica). Hasta este
nivel hay cierto grado de variabilidad generado por inicios, transcripción y
procesamientos de intrones alternativos. La mayoría del ARN es traducido para
generar proteínas (evaluadas por la proteómica). En este último proceso existe un
alto nivel de heterogeneidad ya que la proteína recién sintetizada puede
experimentar multitud de modificaciones postraduccionales, muchas de ellas con
relevante significado funcional (2). Finalmente, el futuro en el diagnóstico,
pronóstico y establecimiento de factores de riesgo de las enfermedades en
general, se realizarán con técnicas moleculares como la proteómica que ayudará a
establecer el significado funcional de las diferentes proteínas en los tejidos. Para
el diagnostico de EH, no se realizan, hasta el momento, estudios electroforéticos
11
de rutina y menos estudios de proteómica pues por su complejidad y costo, sólo
se puede acceder a esta tecnología en muy pocos centros de investigación a nivel
mundial. Para los estudios de proteómica se emplea el sistema de electroforesis
en 2 dimensiones (2D) que separa las proteínas por cargas y peso molecular y
luego sobre el gel se hace la identificación y aislamiento de ”spots” diferentes,
luego se realiza la extracción de la proteína mediante digestión enzimática con
tripsina y se determina el patrón peptídico empleando espectrometría de masas.
Este patrón se compara con la masa esperada de las proteínas incluídas en
potentes bases de datos (como DMSR, SWISS-PROT y TrEMBL), generando un
listado de posibles candidatos (2).
Dentro del estudio de la EH es muy importante conocer la alteración de la proteína
de del citoesqueleto de la membrana del glóbulo rojo, primero para confirmar el
diagnóstico, establecer cuál es el déficit más frecuente, asociarlo con la severidad
de la enfermedad, las alteraciones genéticas y finalmente para el manejo y el
pronóstico. En nuestro medio no es posible realizar las pruebas de proteómica,
pero conociendo la importancia de desarrollar esta técnica en nuestro país y
especialmente en patologías hematológicas, este hecho nos llevó a plantear este
estudio en pacientes con esferocitosis hereditaria (EH) en quienes se propone
encontrar el déficit de proteínas de membrana pero además encontrar y describir
la expresión de nuevas proteínas o proteínas alteradas por medio del estudio de
masas. Es así como se realizó la toma de muestras de sangre de pacientes con
EH que asisten a control de Hematología Pediátrica en la Fundación Hospital de la
Misericordia, luego se llevó a cabo el aislamiento de las membranas del eritrocito
en el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la Universidad
Nacional de Colombia y posteriormente se realizó la electroforesis en 2D y la
identificación de la(s) proteína(s) deficitaria(s) o alterada(s) con respecto a los
controles, en el Departamento de Fisiología de la Facultad de Medicina de la
Universidad de Santiago de Compostela en España con colaboración del grupo
del Dr Justo Castaño en la Universidad de Córdoba.
12
1. JUSTIFICACIÓN
La EH es la anemia hemolítica más frecuente en el mundo, causada por alteración
en las proteínas de citoesqueleto del glóbulo rojo, de carácter hereditario
autosómica dominante en un poco más del 70% de los casos, con una gran
variabilidad en las manifestaciones clínicas desde asintomáticos en aquellos
pacientes portadores hasta anemias severas, ictericia, esplenomegalia y
requerimientos transfusionales. El diagnóstico es relativamente sencillo en los
casos severos y moderados, pero la dificultad es en aquellos portadores
asintomáticos o con mínimos síntomas, en los cuales las pruebas con las que
contamos en nuestro medio no pueden confirmarlo por su baja sensibilidad.
Los estudios básicos son: cuadro hemático completo para evaluar: hemoglobina,
hematocrito,
volumen
corpuscular
medio,
concentración
de
hemoglobina
corpuscular media, conteo de reticulocitos corregido, frotis de sangre periférica,
además de Coombs directo y fraccionado y curva de fragilidad osmótica. Con esta
última se confirma el diagnóstico, pero es una prueba con baja sensibilidad y
frecuentes falsos positivos.
Otro estudio de laboratorio de mayor complejidad y que no está estandarizado en
nuestro medio para su realización de rutina en el diagnóstico de EH, es la
electroforesis de proteínas del citoesqueleto del glóbulo rojo en SDS-PAGE. En
Colombia sólo hay publicado un estudio realizado entre 1995 y 1997 por Torres et
al, quienes hacen la descripción de las características clínicas de 29 pacientes
adultos con EH y realizan posteriormente electroforesis en SDS-PAGE
demostrando que la deficiencia más frecuente en este grupo es de Banda 3, a
diferencia de lo reportado a nivel mundial. Finalmente concluyen que este estudio
se debe confirmar con estudios de Biología Molecular (1), como serían los de
13
genómica (estudios de las alteraciones en los genes), transcriptómica (estudio de
la trascripción del ARN) y proteómica (estudio de la codificación de las proteínas),
técnicas de alta complejidad y con las cuales se cuentan en laboratorios de
investigación de alto nivel.
Con el advenimiento de nuevas técnicas de estudio en Biología Molecular en
Medicina, como es la genómica, transcriptómica y ahora la proteómica, se planteó
y realizó un estudio piloto de Proteómica en los pacientes con EH que asisten a la
consulta de Hematología Pediátrica en la Fundación Hospital de la Misericordia
para confirmar el diagnóstico, determinar la alteración más frecuente en las
proteínas del citoesqueleto y su relación con la severidad clínica, el tratamiento
quirúrgico y con la pruebas diagnósticas disponibles de rutina en el Hospital,
además se quiere encontrar y describir la expresión de nuevas proteínas o
proteínas alteradas en las membranas de eritrocitos de los pacientes con EH que
puedan ayudar a explicar la adaptación de los glóbulos rojos a la mutación de las
proteínas que generan la EH.
14
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GENERAL
Realizar
y
estandarizar
las
pruebas
de
electroforesis
en
2D-PAGE
y
espectrometría de masas MALDI-TOF de proteínas de membrana del eritrocito a
pacientes que consultan en la Fundación Hospital de la Misericordia con
diagnóstico de esferocitosis hereditaria (EH) y compararlas con las de individuos
sanos para detectar la deficiencia de proteínas de membrana e identificar la
modificación de otras.
2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
•
Identificar por estudios moleculares las alteraciones en las proteínas de la
membrana del eritrocito en pacientes con diagnóstico de EH.
•
Establecer la posible relación entre los estudios moleculares de las proteínas
de membrana del eritrocito con los resultados de laboratorio de los pacientes
con diagnóstico de EH.
•
Establecer la posible relación entre los estudios moleculares de las proteínas
de membrana con las características clínicas de los pacientes con diagnóstico
de EH.
•
Encontrar y describir la expresión de nuevas proteínas o proteínas modificadas
en la membrana de los eritrocitos de pacientes con EH.
15
3. MARCO TEORICO
La esferocitosis hereditaria (EH) es la causa más frecuente de anemia hemolítica y
es secundaria a deficiencias en las proteínas de la membrana y del citoesqueleto
del eritrocito como son principalmente la espectrina, ankirina, banda 3, banda 4.2,
entre otras. Esta patología ocurre en todos los grupos raciales, con mayor
prevalencia en la raza blanca provenientes del norte de Europa. Tiene una
incidencia que varía entre 1 por cada 2.000 a 5.000 nacidos vivos dependiendo del
sitio geográfico, como en Europa donde alcanza a 1 en 2000 nacidos vivos, como
se deduce de los estudios realizados en Alemania y Escandinavia, en donde a
donadores de sangre se les realizó la prueba de fragilidad osmótica,
encontrándose que el 1% estaban alteradas (3). Lamentablemente no hay
estudios en Colombia donde se establezcan la incidencia y la prevalencia de esta
enfermedad.
Las manifestaciones clínicas son muy variadas y dependen de las alteraciones
genéticas
que
también
son
heterogéneas.
Es
autosómica
dominante
aproximadamente en el 70% de los casos; no se ha detectado homocigotos
posiblemente porque es incompatible con la vida (4,5). En el restante es:
autosómica recesiva, autosómica dominante con penetrancia variable o son
mutaciones de novo.
3.1 ESTRUCTURA DE LA MEMBRANA
La membrana del glóbulo rojo es aproximadamente el 1% de su peso. Está
conformada por dos grandes estructuras: la primera, la bicapa lipídica que en un
80% son fosfolípidos y colesterol y el 20% restante son glicolípidos y
aminofosfolípidos; una característica de la bicapa es que los fosfolípidos son
distribuídos asimétricamente: fosfatidilcolina y esfingomielina se localizan en la
16
monocapa externa mientras que la fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina (PS) y
fosfoinosítidos en la monocapa interna. Las proteínas escramblasas y flipasas,
han sido implicadas en la función de mantener esta asimetría de la bicapa lipídica,
la cual tiene importancia fisiológica porque la PS y los fosfoinositidos interactúan
con las proteínas del citoesqueleto, espectrina y proteína 4.1R, para anclarlas a la
bicapa lipídica y darle estabilidad. Por otro lado, la pérdida de la asimetría de la
bicapa, resulta en traslocación de la PS a la monocapa externa, favoreciendo el
reconocimiento y la fagocitosis por el macrófago. Este tipo de reconocimiento
juega un papel importante en la destrucción prematura en el caso de células
falciformes y de talasemias (6,7). La segunda, por proteínas integrales y
periféricas. Las proteínas integrales se han descrito más de 50 y van de varios
cientos a más de un millón de copias por eritrocito; aproximadamente 25 de estas
proteínas son antígenos de subgrupos sanguíneos. Las proteínas periféricas
conforman el citoesqueleto en la cara citoplasmática de la membrana e interactúan
entre sí y con los filamentos y túbulos del citoesqueleto creando una malla que es
importante para la estructura y estabilidad y le confieren las propiedades
viscoelásticas al eritrocito. Entre estas proteínas periféricas se destacan: la
espectrina, ankirina (bandas 2.1, 2.2, 2.3, y 2.6), banda 4.1, banda 4.2, banda 4.9,
aducina, tropomiosina y banda 7 (8).
3.1.1 Proteínas del citoesqueleto.
El citoesqueleto del glóbulo rojo está
constituido primordialmente por: espectrina con sus cadenas α y β, proteínas 4.1R,
y actina. Están conectadas entre sí en dos sitios: primero, dos o más dímeros de α
y β espectrina se articulan cabeza con cabeza (como se explica más adelante) en
el sitio de unión (self association). Segundo, la parte final de los tetrámeros de
espectrina convergen formando un complejo de unión (caja C en la figura 2) donde
la proteína 4.1R interactúa con su dominio de 10 kD con la región N-terminal de la
cadena beta de espectrina, manteniendo los tetrámeros juntos. Participan también
en este complejo filamentos cortos de actina y una variedad de otras proteínas
(demantina (proteína 4.9), β–aducina, tropomiosina, tropomodulina).
17
De una manera simplificada la malla básica del citoesqueleto es un hexágono,
donde los lados y los radios están formados por los tetrámeros de espectrina y en
la mitad de estos están los puntos de unión de las cadenas de espectrina y los
puntos de convergencia son los complejos de unión (5). Figura 1.
La espectrina conforma una red localizada en el lado citoplasmático de la bicapa
lipídica de la membrana. Cada proteína de espectrina tiene una cadena α y otra β
constituídas por repeticiones de 106 aminoácidos que forman hélices y se enrollan
de forma antiparalela. Los heterodímeros α y β forman tetrámeros al unirse cabeza
con cabeza en el sitio conocido como el punto de unión donde la porción NH2terminal de α espectrina se une con la COOH-terminal de β espectrina. Otros
residuos terminales de los heterodímeros de espectrina se asocian con las
proteínas 4.1R y actina (Figura 2). La unión vertical de la espectrina a la bicapa
lipídica involucra dos proteínas transmembrana: la banda 3 y la glicoforina C las
cuales se encuentran unidas formando dímeros y oligómeros móviles que pueden
variar en su configuración dándole flexibilidad al glóbulo rojo. Las anormalidades
de la espectrina, llevan a una inestabilidad de la bicapa lipídica con pérdida
progresiva de ésta, alterando la relación volumen-superficie del eritrocito(3)
Figura 1. Malla del citoesqueleto. Modificado de William’s Hematology 7ª edición.
COMPLEJOS
DE
UNION
ESPECTRINA
Fuente: Autor
18
3.1.2 Proteínas transmembrana.
La Banda 3 (AE-1) es la principal proteína
integral siendo aproximadamente el 30% de las proteínas de la membrana. Hace
parte de la familia de proteínas de intercambio aniónico, AE 0-3 (de las siglas en
inglés de Anion Exchanger) y está involucrada en un gran número de actividades
fisiológicas que tiene que ver con el volumen y la osmolaridad celular, intercambio
de iones de cloro y bicarbonato, envejecimiento del eritrocito, unión con IgG y
remoción celular y finalmente con el mantenimiento de la integridad estructural de
las células. Se encuentra en todas las membranas celulares e incluso de
organelas como las mitocondrias, el aparato de Golgi y el núcleo. Se han descrito
más de 50 mutaciones del gen de Banda 3 algunas de las cuales generan
diferentes enfermedades como ovalocitosis (una deleción de 9 aminoácidos de los
residuos 400 al 408), acidosis tubular renal distal que puede estar asociado con
ovalocitosis. Alteraciones en Banda 3 también son asociadas a enfermedades
neurológicas tales como disquinesia paroxística familiar, epilepsia generalizada
idiopática y neuroacantosis. La mutación en el gen de Banda 3 también genera la
EH, que se comporta como deficiencia ya sea porque la proteína mutada no se
incorpora dentro de la membrana o por que no es funcional (9).
En la cara externa la Banda 3 porta glicanos N- y/o O- algunos de los cuales son
antígenos del grupo sanguíneo (sistema ABO)(6). Su dominio citoplasmático Nterminal media el anclaje del citoesqueleto através de la Ankirina-1 y se une a
varias enzimas importantes para el control de la glicolisis. El dominio
transmembrana C-terminal tiene 12 segmentos y contiene el canal de intercambio
aniónico para el bicarbonato y cloro, permitiendo el transporte de dióxido de
carbono de los tejidos a los pulmones. Existe como dímero y tetrámero que
interactúa con la Ankirina, la cual a su vez se une a la beta espectrina y a la
Proteína 4.1R (banda 4.1R) en su dominio N- terminal. La banda 3 se une también
a la Proteína 4.2 para dar más estabilidad al citoesqueleto (Ver grafica 2)(5).
La Banda 3 es el centro del “complejo Banda 3” (caja A en Figura 2) el cual está
compuesto por: ankirina-1; proteína 4.2 y Glicoforina A. Con este está asociado el
19
”complejo Rh” que incluye 5 proteínas: polipéptido Rh, glicoproteína asociada a
Rh, el CD 47, glicoforina B y glicoproteína Landsteiner-Wiener, una glicoproteína
integral de membrana de 241 residuos y miembro de la superfamilia de Ig (caja B
en figura 2)(5).
Las proteínas que unen glicosilfosfatidilinositol (GPI-proteins: glycosylphosphati
dylinosito l-linked proteins) están en la cara externa de la bicapa lipídica y unida a
su estructura por glicanos cortos y complejos y residuos de fosfatidilinositol. Están
involucradas en la hemoglobinuria paroxística nocturna (Figura 2).
Las glicoforinas son las glicoproteínas integrales más abundantes del eritrocito.
Están compuestas de un único dominio extracelular hidrofílico N-terminal, un
dominio transmembrana y una cola intracelular C-terminal. Estudios de genómica
han revelado que las glicoforinas se pueden dividir en dos diferentes grupos, el
primero, las glicoforinas A y B son homólogas entre sí y son codificadas por dos
genes que están estrechamente relacionados, el segundo, son las glicoforinas C y
D que derivan de un único locus, pero se diferencias por el uso de un inicio de
traslación creado por splicing alternativo (3). Las glicoforinas por tener ácido
siálico en la porción N terminal extracelular, son las responsables de más del 60%
de la carga negativa de la superficie del eritrocito, lo cual modula las interacciones
entre eritrocito y eritrocito y entre eritrocito-endotelio. La Glicoforina C interactúa
con la proteína p55 y con la proteína 4.1R, que a su vez se une a la cadena β de
la espectrina, desempeñando un papel fundamental en la estabilización del
citoesqueleto. Las glicoforinas sirven como receptores a algunos agentes
infecciosos como el Plasmodium falciparum, además son portadoras de algunos
antígenos del grupo sanguíneo como MN, Ss, Miltenberger V entre otros (3).
3.1.3 Proteínas de unión. Estas moléculas median la unión entre las proteínas
del citoesqueleto y las de transmembrana. Primero, la Ankirina-1 une la Espectrina
(en el dominio 15 de la cadena β porción C-terminal) a la Banda 3 en su dominio
citoplasmático. La Proteína 4.2 juega un papel aún no bien definido en esta
20
interacción. Segundo, la función principal de la proteína 4.1R es unir la red de
espectrina con las proteínas de transmembrana Glicoforina C/D (5).
Actina
Ankirina-1
β-Espectrina
α-Espectrina
Tropomiosina
a
Interacciones verticales
Figura 2. Organización de la membrana del eritrocito.
Interacciones horizontales
Caja A: Complejo Banda 3, Caja B: Complejo Rh, Caja C: Complejo de unión, Caja D: espectrina.
GPA: glicoforina A, GPC/D: glicoforina C/D, GPI: (glycosylphosphatidylinositol-linked protein)
proteína que une glicosilfosfatidilinositol, LW: glicoproteína Landsteiner-Wiener, RhAG: (Rhassociated glycoprotein) glicoproteína asociada a Rh, Rh: polipéptidos de Rh.
Fuente: Delaunay J. The molecular basis of hereditary red cell membrane disorders. Blood
Reviews 2007; 21: 1-20.
La proteína 4.1R interactúa con la espectrina mediante uno de sus dominios en el
complejo de unión y con otro dominio se une a la glicoforina C/D inmediatamente
al lado del complejo de unión (5).
21
La proteína p55 es un miembro de la familia MAG-UK (Homólogas de la guanilato
kinasa asociada a membrana, de las siglas en inglés de membrana-associated
guanylate kinase homologues) y contiene un dominio PDZ, que interactúa con
4.1R y Glicoforina C/D. Estos dominios PDZ, están en proteínas localizadas en
sitios submembranosos especializados y parecen tener una función de receptores,
canales iónicos y de señalización intracelular (5).
La ankirina es una proteína polar que se puede separar en tres dominios
funcionales: un dominio N-terminal unido a la membrana, que tiene sitios de unión
para banda 3, otro dominio intermedio que tiene sitios de unión para espectrina y
otro dominio C-terminal con funciones regulatorias de unión entre ankirina y las
otras proteínas. El dominio regulatorio C-terminal, tiene múltiples isoformas
generadas por splicing alternativo; una de estas isoformas (ankirina 2.2) tiene
mayor afinidad y se une más fuertemente a la espectrina y a Banda 3 (3). Las
anomalías de ankirina son las más frecuentes en la EH por su importancia en la
unión entre la bicapa lipídica por medio de la banda 3 y con el citoesqueleto
através de la espectrina.
Los estudios moleculares han permitido conocer la localización cromosómica de
estas proteínas así como la secuencia de cada uno de los genes (Tabla1).
Las
interacciones
de
las
proteínas
integrales
y
del
citoesqueleto
son
fundamentales para la estabilidad e integridad de la membrana y son de dos tipos:
•
Verticales: que fijan el citoesqueleto a la doble capa lipídica y están dadas por
la unión entre espectrina y banda 3 por medio de ankirina y regulada por
proteína 4.2 como también por la unión de proteína 4.1R y banda 3.
•
Horizontales: son responsables de la estabilidad global del citoesqueleto y se
establecen por la unión entre moléculas de espectrina para formar dímeros y
oligómeros de mayor peso molecular y por la unión entre espectrina, actina y
la proteína 4.1R, regulada por la proteína 4.9 (8). (ver figura 2).
22
Las proteínas de la membrana del glóbulo rojo tienen una gran variedad de
isoformas por cambios postraduccionales o postranslacionales generados por
mecanismos de splicing alternativo. Esto hace que a pesar de provenir de un
mismo gen y gracias al splicing alternativo, las isoformas puedan estar en
diferentes células o incluso en las mismas células en diferentes organelas o en el
mismo lugar subcelular con diferentes estados de diferenciación (3).
3.2 ETIOLOGIA Y FISIOPATOLOGIA
El defecto primario es en las proteínas de membrana y del citoesqueleto del
eritrocito incluyendo espectrina α y β, ankirina y proteína 4.2. Puede ser
cuantitativo o cualitativo, causando inestabilidad del citoesqueleto y fragilidad de la
membrana llevándola a formar microvesículas en los puntos en los cuales no hay
proteínas ancladas y pérdida de superficie con disminución en la relación entre
superficie y volumen del eritrocito tornándose esférico, más sensible a los cambios
de volumen y menos flexible, lo que hace que sea más fácilmente atrapado en los
sinusoides del bazo y destruído por el sistema retículo-endotelial (3,8,10). Esto
hace que el bazo sea un órgano importante en la fisiopatología de la hemólisis que
sufren los pacientes con EH, la cual como vemos es secundaria a los defectos de
membrana (5). También se ha descrito que los esferocitos son vulnerables a las
alteraciones metabólicas llevándolos más rápidamente a la autohemólisis cuando
se incuban en ausencia de glucosa. Esto se explica porque los esferocitos en
ausencia de glucosa se depletan más rápidamente de ATP, lo que causa una
falla
en
la
bomba
de
cationes,
penetrando agua y sodio intracelular. Si
continúan los niveles bajos de ATP, también falla la bomba de calcio causando
una salida de potasio, cambiando la osmolaridad intracelular y saliendo agua
deshidratándose el eritrocito. Los esferocitos son muy susceptibles a estos
cambios de osmolaridad lo que también causa vesiculación de la membrana
predominando sobre la disminución del volumen y se produce la auto hemólisis
(8).
23
Tabla 1. Principales proteínas de la membrana del eritrocito
Banda
el GEL
SDSPAGE
Proteína
Localización
Cromosómica
Símbolo
del gen
Tamaño
del gen
(Kb)
Número
de
exones
Número
de amino
ácidos
PM
(kD)
aprox /
deducido
PI
1
α-Espectrina
1q22-25
SPTA1
80
52
2 429
240/241
4,96
2
β-Espectrina
14q23-24.2
SPTB
> 100
32
2 137
220/246
4,96
2.1
Ankirina
8p11.2
ANK1
~160
42
1 880
210/206
5,65
2.9
α-Aducina
β-Aducina
4p16.3
2p13-14
ADDA
ADDB
85
~100
16
17
737
726
103/81
97/80
3
Banda 3
17q12-21
EPB3
17
20
911
90-/102
4.1
Proteína 4.1
1p33-34.2
EL1
> 250
23
588
88/66
4.2
Palidina
15q15-21
ELB42
20
13
691
72/27
4.9
Demantina
p55
8p21.1
Xq28
MPP1
-
-
466
48/43
55/53
5
β-Actina
tropomodulina
7pter-q22
9q22
ACTB
TMOD
>4
-
6
-
375
359
43/42
43/41
6
G3PD
12p13
G3PD
5
9
-
35/36
9q34.1
1q31
EPB72
TPM3
40
-
7
-
287
239
31/31
27/28
Estomatina
Tropomiosina
pI: punto isoeléctrico
7
Fuente: Autor
24
5,96
5,24
Por otro lado en la dinámica del atrapamiento esplénico, aún no está claro cuál es
el mecanismo de la hemólisis. Se sabe que los esferocitos son selectivamente
atrapados por el bazo, produciendo una pérdida de la membrana y la eventual
hemólisis. El tiempo de tránsito en el bazo se correlaciona inversamente con la
supervivencia del glóbulo rojo, pero también hay evidencia que el bazo genera
cambios metabólicos y de pH en el esferocito lo que acelera su autohemólisis
(8,11).
3.2.1 Defectos de las proteínas de membrana. El estudio de la membrana del
eritrocito ha revelado varios defectos cualitativos y cuantitativos en la EH. En
frecuencia, las alteraciones son:
•
Deficiencia de ankirina combinada con deficiencia de espectrina
•
Deficiencia de banda 3
•
Deficiencia aislada de espectrina
•
Deficiencia aislada de banda 4.2 (3,12)
•
Ankirina. La deficiencia de ankirina junto con espectrina es la más frecuente
en EH y se han incluído varios mecanismos desde disminución en la síntesis de
ankirina, disminución en el ensamble o un ensamble anormal lo cual lleva a que la
espectrina no se una a la membrana. Tiene un patrón hereditario autosómico
dominante (AD) pero no es infrecuente que también sean debidas a mutaciones
de novo dentro de una familia (5). La mayoría son mutaciones nonsense o de
cambio en el marco de lectura lo que genera una ankirina defectuosa y/o
deficiente (3). Con una excepción, todas las mutaciones descritas en el gen ANK-1
son individuales y no se repiten en otras familias. El cuadro clínico puede ser
moderado, pero generalmente no requieren de trasfusión al menos durante el
primer año de vida (8). En pacientes con herencia autosómica recesiva (AR) han
sido descritas variantes genéticas en el promotor del gen de ANK-1, pero no se ha
revelado la importancia funcional de esta mutación.
25
No se han reportado casos homocigotos en humanos, sin poder aclarar si esta
condición es incompatible con la vida (8). Se han descrito pacientes con EH por
deficiencia de ankirina, con dismorfismo, retardo psicomotor e hipogonadismo.
Estos pacientes sufren de un síndrome de “gen contiguo” que incluye el locus del
gen ANK-1, 8p11.2.
•
Banda 3. Las mutaciones en el gen de banda 3 (SLC4A1) tienen un patrón de
herencia AD. En los heterocigotos todas las mutaciones son en los dominios
transmembrana y citoplasmático con un cuadro clínico de hemólisis moderado (8).
Un subgrupo de pacientes tienen disminución del 20 al 30% de banda 3
concomitante con proteína 4.2, con un cuadro leve a moderado y esferocitos
“pincered” en el frotis de sangre periférica (3,13). Hay una gran variabilidad en la
expresión de la mutación lo cual hace que el cuadro clínico no sea siempre
severo.
Se han descrito 3 grupos de homocigotos para
mutaciones de banda 3 en
humanos dentro de familias consanguíneas: Banda 3 Coimbra, Neapolis y
Algerian. Excepto por un grupo, las demás tiene algunas proteínas banda 3 en las
membranas celulares. En su mayoría se asocian a acidosis tubular renal distal. Lo
que es importante resaltar es que a pesar de la ausencia de la proteína banda 3,
pueden ser compatibles con la vida con determinados tratamientos a diferencia de
la ausencia de ankirina o espectrina las cuales como se ha visto no son viables
(8,13).
•
Espectrina.
Los esferocitos de muchos pacientes son en su mayoría
deficientes de espectrina. El grado de deficiencia de espectrina se correlaciona
bien con la esferocidad del eritrocito, la habilidad para soportar las fuerzas de
cizallamiento, el grado de hemolisis y la respuesta a la esplenectomía (3,8,12,13)
26
Las mutaciones de α-espectrina son AR mientras que las de β-espectrina son AD,
esto es debido a que la cadena α de la espectrina se sintetiza en exceso
comparada con la de la β espectrina, haciendo que una reducción en la síntesis de
esta última tenga una mayor efecto en la configuración del citoesqueleto en los
pacientes heterocigotos (autosómica dominante), (12,14). Al final el grado de
deficiencia de espectrina y de la cadena α o β, se asocia con la severidad de la
hemólisis (13,14).
•
Proteína 4.2. La variedad de EH por mutación en el gen EPB42 es rara y
tiene una herencia AR. El cuadro clínico usualmente es de sintomatología
moderada (8). Se han descrito 9 mutaciones hasta ahora y la mayoría en el Japón.
La deficiencia de proteína 4.2 también se ha asociado a mutaciones en el dominio
citoplasmático de banda 3 por compromiso de los sitios de interacción entre estas
proteínas.
3.2.2 Herencia. Los genes implicados son los de α y β espectrina, banda 3,
ankirina y proteína 4.2. Entre el 50 y 75% de los casos, la EH es AD. En los
restantes pacientes puede ser AR o mutaciones de novo. Los casos de herencia
AR resultan en defectos de α-espectrina o proteína 4.2. Unos pocos casos de EH
resultado de mutaciones homocigotos o heterocigotos compuestos en banda 3 o
espectrina dan como resultado anemias hemolíticas severas en el periodo
neonatal o muertes fetales por hidrops (3). Un estudio realizado en Italia con 80
niños con diagnóstico de EH de diferente severidad pero con padres normales,
demostró que las mutaciones de novo dominante son 6 veces más frecuentes que
las mutaciones recesivas, lo cual debe ser tenido en cuenta para consejería
genética de una pareja normal con un hijo con EH (15).
27
3.3 MANIFESTACIONES CLINICAS Y PARACLINICAS
Las manifestaciones clínicas son muy heterogéneas. El cuadro clínico típico
combina manifestaciones de hemólisis (ictericia, esplenomegalia y anemia con
reticulocitos elevados) con extendido de sangre periférica con esferocitosis y
antecedentes familiares positivos (3). La severidad del cuadro es variable, desde
asintomático en los casos de portadores hasta severo con todo el cuadro clínico
evidente. Se puede clasificar como: portador (rasgo), leve, moderada (también
denominada típica) y severa, dependiendo del valor de Hb, bilirrubinas,
reticulocitos y de la concentración de espectrina en el glóbulo rojo (esta última se
correlaciona con la severidad de la hemolisis) (Tabla 2).
Portadores asintomáticos: corresponden a menos del 2% de los pacientes.
Presentan mínimos síntomas o generalmente asintomáticos. Pueden ser un
miembro de una familia con herencia AR con laboratorios ligeramente alterados,
elevación leve de reticulocitos, aproximadamente 2%, escasos esferocitos y
fragilidad osmótica incubada alterada. También pueden ser mutaciones nuevas
dentro de una familia, lo que aparentaría una herencia AR, por lo que siempre es
importante el estudio de la familia (3,8,16).
Los casos de esferocitosis leve son aproximadamente entre el 20 y 30%.
Presentan una hemólisis ligera compensada con valores de Hb normales. La
sintomatología es mínima, cursan con esplenomegalia e ictericia muy leves lo que
hace difícil el diagnóstico y generalmente se encuentran en estudios de rutina de
EH familiar. También se pueden manifestar durante una infección viral por ejemplo
Parvovirosis, con anemia, esplenomegalia e ictericia (3; 8).
La esferocitosis típica se presenta en la mayoría de los pacientes con EH AD y
pueden ser entre el 50 y el 60% de los casos. Se presenta con una hemólisis
descompensada y anemia moderada. Se puede manifestar con ictericia en niños,
pero también en adultos y asociado a esplenomegalia leve entre 2 a 6 cm de su
28
tamaño, generalmente después de una infección viral por la estimulación que
produce del sistema reticuloendotelial. Los requerimientos trasfusionales son
ocasionales y generalmente son después del primer año de vida (3,8).
Tabla 2. Clasificación de esferocitosis e indicación de esplenectomía
CLASIFICACIÓN
RASGO
LEVE
MODERADA
SEVERA
>15
11-15
8-12
6-8
Conteo de
reticulocitos
Normal
(<3%)
3-6%
>6%
> 10 %
Bilirrubina T.
(mg/dl)
<1
1-2
2-3
>3
Espectrina por
eritrocito (% del
normal)
100
80-100
50-80
40-60
Esplenectomía
No
requerida
Usualmente
no necesaria
Necesaria antes
de la pubertad
Necesaria, en
lo posible > 6
años
Hb (g/dl)
Modificado de: Bolton-Maggs PHB. The diagnosis and management of hereditary spherocytosis.
Baillère’s Clinical Haematology. 2000; 13: 327-42.
Fuente: Autor
La esferocitosis severa, se presenta en el 5 al 10% de los casos, con ictericia y
anemia severa que requiere múltiples trasfusiones. Se manifiesta generalmente
desde
recién
nacido
con
ictericia
intensa
que
requiere
incluso
exsanguinotransfusión. Se presenta en la EH tanto AD como AR, generalmente
por mutaciones en el gen de la α-espectrina.
Dentro de las complicaciones más frecuentes esta el retardo en el crecimiento,
retardo en la maduración sexual y anemias aplásicas transitorias. El tratamiento
de elección es la esplenectomía. (3,8):
29
3.4 DIAGNOSTICO
La esferocitosis hereditaria generalmente es fácilmente sospechada por el cuadro
clínico, los laboratorios de rutina y cuando existen antecedentes familiares, pero
hay varias situaciones que pueden hacer difícil el diagnóstico como la anemia
hemolítica neonatal o durante una crisis hemolítica aguda, o cuando no hay
antecedentes familiares y es una mutación de novo o cuando uno de los padres es
un portador asintomático o en otras patologías que también aumentan la relación
superficie-volumen de los glóbulos rojos como en la ictericia obstructiva, la
deficiencia de hierro, las talasemias, la deficiencia de vitamina B12 o folato y las
hemoglobinopatías SC que pueden mimetizar una EH.
El diagnóstico por laboratorios se basa fundamentalmente en el hemograma en
donde se puede encontrar la Hb baja, el volumen corpuscular medio (VCM) normal
o levemente disminuída, la concentración de hemoglobina corpuscular media
(CHCM) alta (entre 35 y 38%) y el aumento en el conteo de los reticulocitos.
En el extendido de sangre periférica típico se debe encontrar un número variable
de esferocitos (eritrocitos de menor tamaño y sin el halo claro central), estando
presentes en un 3 al 5% en las formas leves y en un 25 al 30% en las formas
moderadas. Con menor frecuencia se encuentran esferocitos pequeños y densos,
eritrocitos con formas bizarras y anisocitosis y poiquilocitosis. Se han descrito
características morfológicas específicas de ciertos déficits como los esferocitos
pincered (por déficit de banda 3) y esfero-acantocitos (por déficit de β-espectrina).
También se analizan los niveles de bilirrubinas total y diferencial y se realiza
ecografía de abdomen superior para evaluar tamaño del bazo y presencia de
colelitiasis.
Dentro de los estudios de laboratorio para completar el diagnóstico se encuentran:
30
•
Test de fragilidad osmótica: se basa en la fragilidad aumentada que
tienen los esferocitos a la solución salina hipotónica en comparación con las
células normales (22). Este test tiene como desventajas en primer lugar la baja
sensibilidad, en donde los casos leves hasta el 20% pueden ser omitidos después
de la prueba con incubación. No es fiable en pacientes con escaso número de
esferocitos incluyendo los transfundidos y finalmente no diferencia la esferocitosis
causada por trastornos inmunológicos, deficiencia de hierro o ictericia obstructiva.
La fragilidad osmótica se encuentra incrementada en el 66% de los pacientes con
EH no esplenectomizados.
Se considera que la prueba de resistencia osmótica está disminuída cuando existe
evidencia de hemólisis en concentraciones de solución salina ≥0,55g/dl. Según la
clasificación de Dacie, la curva de resistencia osmótica se divide en tipo I si había
desplazamiento de la curva hacia la derecha con hemólisis que inicia en
concentraciones de solución salina de 0,55g/dl. Curva de resistencia osmótica
disminuída tipo II cuando hay desplazamiento de la curva hacia la derecha con
inicio de hemólisis en concentraciones de solución salina de 0,6 g/dl y curva de
resistencia osmótica disminuída tipo III si hay desplazamiento de la curva hacia la
derecha con inicio de hemólisis en concentraciones de solución salina de 0,85 g/dl
(1,17)
•
Test de lisis con glicerol: útil en neonatos porque la cantidad de muestra
requerida es mínima. Se realiza colocando una mezcla de solución salina de
glicerol hipotónica a la muestra de sangre con anticoagulante y tomando el tiempo
en que la densidad óptica medida por espectrofotometría cae al 50% de la inicial
(50%de lisis); los eritrocitos normales toman más de 30 minutos y los esferocitos
tiene un rango de 25 a 150 segundos. Tiene igual sensibilidad que el test de
fragilidad osmótica (16,18). No disponible en Colombia como prueba de rutina.
31
•
Gradiente osmótico ektacitométrico: es un examen muy sensible, pero
de alto costo, que requiere de experiencia por parte del operador. Mide con un
láser los cambios de forma del glóbulo rojo al ser expuesto a fuerzas de
cizallamiento. Ventaja: distingue curvas entre EH, Eliptocitosis hereditaria y
drepanocitosis (16,18). No se dispone de esta prueba en Colombia.
•
Citometría de flujo: se emplea una sonda fluorescente que reacciona con
la banda 3. Pacientes con esferocitosis hereditaria que tengan defecto en la
espectrina, banda 3 o proteína 4.2 tienen disminución en la señal de fluorescencia,
comparado con los controles, con neonatos o con pacientes con otras anemias.
Tiene la ventaja de requerir un volumen muy pequeño de sangre y que los
resultados se obtienen en pocas horas. Sensibilidad de 92.7% y especificidad de
99.1% (16,18). No se dispone de esta prueba estandarizada en Colombia
(3,16,18).
•
Análisis bioquímico de las proteínas de membrana de los glóbulos
rojos: se realiza mediante separación por electroforesis en gel de poliacrilamida
(PAGE-SDS polyacrylamide gel electrophoresis in the presencia sodium
dodecylsulate).que detecta defectos en las proteínas de membrana. Es una
prueba especializada, tiene alto costo, es útil en los pacientes con diagnóstico
poco claro y es una prueba confirmatoria de EH. No se hace de rutina en
Colombia (3,16,18).
•
Análisis genético molecular: está disponible en unos pocos laboratorios
especializados. Busca identificar alteraciones en la expresión de las proteínas de
membrana por mutaciones en los genes que las codifican. Varias técnicas han
sido utilizadas como secuenciación de nucleótidos y amplificación del gen mutado
con reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (16,18).
•
Técnicas de mapeo en 2D y espectrometría de masas: es una
herramienta invaluable en la exploración de patologías relacionadas con defectos
genéticos y alteraciones en las proteínas (19). Se realiza mediante el análisis de
32
mezcla de proteínas y la posterior identificación por espectrometría de masas. Es
un método muy preciso, sensible y específico, con alta resolución y
automatización, la desventaja es su alto costo y que se realiza a nivel de
investigación en pocos centros especializados. No está disponible en Colombia y
no hay estudios de proteínas de membranas en EH.
3.4.1 Proteómica. Actualmente los avances científicos y tecnológicos en Biología
Molecular permiten la evaluación simultánea de las características genéticas y
proteicas de una muestra y han sido ampliamente empleados en diferentes
campos de la medicina con un futuro prometedor. Dentro de estos avances están
las llamadas técnicas “omic”: Genómica, Transcriptómica y Proteómica. Los genes
(analizados por la genómica) se transcriben a ARN (estudiados por la
transcriptómica). En este nivel existe cierto grado de variabilidad generado por
inicios,
transcripción
y
procesamientos
de
intrones
alternativos
(splicing
alternativo). La mayoría del ARN es traducido para generar proteínas (evaluadas
por la proteómica). En este último proceso existe un alto nivel de heterogeneidad
ya que la proteína recién sintetizada puede experimentar multitud de
modificaciones postraduccionales, muchas de ellas con relevante significado
funcional y patológico (2,20). Alteraciones cuantitativas o cualitativas (estructura,
localización y función) de una proteína, que son aspectos que son valorados
mediante técnicas de proteómica, pueden ser biomarcadores de anomalías
patológicas previas al desarrollo de manifestaciones clínicas, útiles marcadores
diagnósticos o pronósticos. Es por estas características de la proteómica que está
superando a la genómica como herramienta de análisis más amplio de los
elementos relacionados con procesos fisiopatológicos y en la búsqueda de nuevos
blancos terapéuticos. La proteómica que en un inicio tenía el objetivo de identificar
las proteínas que se modifican como causa de diferentes factores (genéticos o
no), ahora permite conocer aspectos más profundos de la estructura, función,
interacciones, las modificaciones postraduccionales e incluso la localización
celular de las proteínas identificadas (2,20).
33
La técnica que se ha desarrollado para analizar mezclas de proteínas y que ha
permitido que la proteómica evolucione se llama espectrometría de masas. Se
trata de un método muy avanzado con alta precisión, sensibilidad (a nivel de
fentomoles), especificidad, resolución y automatización.
Existen diferentes equipos para preparar y cargar las proteínas en estos sistemas
de espectrometría de masas, el más usado es el matrix assited laser
desorption/Ionization (MALDI). La muestra ionizada posteriormente se pasa a
analizadores de masas, el más empleado es el time of flight (TOF).
Primero se deben separar las proteínas de la muestra y hay dos aproximaciones:
• Empleando el sistema de electroforesis en 2 dimensiones (2D) que separa las
proteínas por cargas y peso molecular y luego, sobre el gel, se hace la
identificación y aislamiento de ”spots” diferentes, identificación de la proteína
mediante digestión enzimática con tripsina y determinación del patrón de masas
peptídico empleando espectrometría de masas. Este patrón se compara con la
masa esperada de las proteínas incluídas en potentes bases de datos (como
DMSR, SWISS-PROT y TrEMBL), generando un listado de posibles candidatos.
También
se
puede
separar
por
cromatografía
líquida,
un
sistema
multidimensional que separa proteínas usando cromatografía de intercambio
iónico y de fases reversas, acoplado directamente a sistemas de espectrometría
de masas o por trampa iónica, en este caso la ionización es distinta a la
empleada en la espectroscopia de masas por MALDI-TOF, puesto que aquí la
ionización es en fase líquida al aplicar un alto voltaje a la salida de la
cromatografía líquida. El tipo de ionización se conoce como ESI. El empleo de
uno u otro método depende de la proteína y de por cuál de los dos métodos se
obtenga una mejor ionización de sus péptidos. En general este método detecta
proteínas que no entran o no se separan fácilmente en geles 2-DE.
• Mediante el estudio sistemático y a gran escala de muestras sin separación
electroforética de las proteínas para la identificación de perfiles proteicos.
34
Emplea como sistema el SELDI-TOF (surface enhaced laser/desorption
ionization) de alta resolución tras capturar las proteínas de una muestra con
diferentes chips analíticos (diferentes tipos de matrices que unen las proteínas
de una muestra empleando distintas características físico químicas) Figura 3.
Figura 3. Principales métodos proteómicos.
a
Las proteínas de una muestra se pueden separar 1) en geles 2D, 2) en cromatografía líquida y 3)
por utilización de chips. LC: cromatografía líquida, MS: espectrometría de masas.
Fuente: Corral J, González-Conejero R, Hernández-Espinosa D, Martínez C, Vicente V.
Genómica y proteómica en hemostasia. Haematologica 2005;90: 65-70.
35
La principal limitación de las técnicas proteómicas es la incapacidad de amplificar
las proteínas, a diferencia de los ácidos nucleicos. También la gran
heterogeneidad proteica de un tejido o plasma puede hacer que dos muestras de
un mismo paciente sean ligeramente diferentes, lo que exige al menos repetir 3
veces la prueba para obtener resultados fiables (20).
También se ha avanzado significativamente en el proteoma de las células,
especialmente del eritrocito (21). Los trabajos realizados en estas células
muestran un proteoma complejo, mayor del que se podía esperar (teniendo en
cuenta que el 98% del citoplasma del eritrocito es Hb y que no tiene núcleo ni
organelas) mostrando nuevamente las diferencias entre genómica y proteómica.
Además de la Hb, el eritrocito tiene otras proteínas importantes para su
metabolismo y su conformación estructural, e incluso otras funciones como las
oxidativas e inflamatorias. Hasta el momento los estudios realizados en eritrocitos
han detectado más de 1500 proteínas (22,23) que abarcan múltiples funciones
(citoesqueleto,
señalización,
receptores
de
membrana,
metabolismo
intermediario), aunque el número real de proteínas es mucho mayor. En un
estudio de proteómica del eritrocito (21)
se identificaron 340 proteínas de
membrana discriminadas así: 105 proteínas integrales, 54 unidas a la membrana,
5 como GPI, 40 del citoesqueleto, 21 como organelos, 41 del citoplasma (8 de las
cuales tiene actividad en la glucolisis), 20 extracelulares y para 54 proteínas su
localización subcelular no fue posible. Estos estudios de proteómica además
permiten describir las proteínas y sus modificaciones implicadas en procesos
específicos de la función del eritrocito.
36
3.5 TRATAMIENTO
El tratamiento es médico en los casos de esferocitosis leve con aportes de ácido
fólico y seguimientos clínicos y de laboratorio cada año. Ecografías de abdomen
superior pueden realizar desde los 5 años y controles posteriores cada 3 a 5 años
en casos en que permanezcan estables y sin síntomas (16). Los controles se
hacen más frecuentes en las épocas del año en que se presentan más infecciones
virales.
La esplenectomía es el tratamiento de elección para los pacientes con EH severa
por ser más efectivo en el control de la anemia aunque la sobrevida de los
esferocitos permanece acortada. Está indicada en pacientes con anemia
hemolítica severa o en los casos de esferocitosis moderada con complicaciones
como cálculos en la vesícula biliar y esplenomegalia importante. En los casos
leves y moderados sin complicaciones, la decisión de esplenectomía está muy
discutida porque no tiene un claro beneficio y aumenta el riesgo de infecciones
graves. La decisión de esplenectomía en estos pacientes se debe evaluar
individualmente. La esplenectomía se intentar posponer hasta los 5 a 6 años para
reducir el riesgo de complicaciones como infecciones por gérmenes encapsulados
y por lo cual previo al procedimiento quirúrgico se indica la vacunación contra
neumococo con 23 serotipos y profilaxis antibiótica con fenoximetilpenicilina
durante 5 años después de la esplenectomía (8,16,18).
Diferentes estudios han demostrado que el grado de respuesta a la esplenectomía
está relacionado directamente con el grado de deficiencia de espectrina,
especialmente en la forma severa (la forma AR), por lo que los pacientes mejoran
adecuadamente posterior a la esplenectomía (8,16).
La complicación más grave es la sepsis que puede ocurrir en 3 al 5% de los
pacientes esplenectomizados de los cuales puede ser fatal hasta el 60%. Por esta
razón se han empleado métodos quirúrgicos más conservadores como la
esplenectomía parcial o embolización esplénica parcial con éxito aceptable (8).
37
4. METODOLOGIA
4.1 TIPO DE ESTUDIO
Es un estudio descriptivo de los resultados obtenidos de una prueba de
electroforesis en 2D-PAGE y espectrometría de masas MALDI-TOF realizada a
proteínas de membrana de eritrocitos y el análisis de características clínicas y de
laboratorios de una serie de pacientes con diagnóstico de EH que asisten a la
consulta de Hematología Pediátrica de la Fundación Hospital de la Misericordia.
4.2 CRITERIOS DE INCLUSION Y EXCLUSION
Se hizo una selección preliminar de los pacientes que asisten a la consulta de
Hematología Pediátrica de la Fundación Hospital de la Misericordia con
diagnóstico de esferocitosis hereditaria. Se revisaron las historias clínicas y los
laboratorios los cuales deben incluír: hemograma (de IV nivel con índices), conteo
de reticulocitos, extendido de sangre periférica, prueba de fragilidad osmótica,
bilirrubinas totales y diferenciales, prueba de Coombs directo y ecografía de
abdomen superior. Posteriormente, se realizó una base de datos.
Se tuvieron en cuenta los siguientes criterios de inclusión:
•
Pacientes con anemia hemolítica no inmunológica (con prueba de Coombs
directo negativo), con sospecha de esferocitosis hereditaria.
•
Pacientes con manifestaciones clínicas y criterios paraclínicos compatibles
con esferocitosis hereditaria como se menciona en el numeral 4.3 y 4.4 del
marco teórico.
•
Consentimiento informado firmado por los padres o representante legal
aceptando participar en el estudio. Ver anexo A.
38
Criterios de exclusión:
•
Haber sido trasfundido en los últimos 4 meses previos a la toma de la muestra
para estudio de proteínas de membrana.
•
La no aceptación a participar en el estudio.
4.3 RECURSOS INSTITUCIONALES
Se contó con la colaboración de la Fundación Hospital de la Misericordia, de
donde se obtuvieron los pacientes y sus registros clínicos; la Universidad Nacional
de Colombia, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica donde se
tomaron y procesaron las muestras para realizar la extracción de membranas; la
Universidad de Santiago de Compostela, Facultad de Medicina, Departamento de
Fisiología donde se realizó la electroforesis 2D-PAGE y análisis de los resultados
y la Universidad de Córdoba donde se realizó la espectrometría de masas.
4.4 RECURSO HUMANO
Se contó con la colaboración del personal docente y de laboratorio de la
Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Medicina, Departamentos de
Pediatría y Bioquímica y del personal de enfermería y administrativo de la
Fundación Hospital de la Misericordia en Colombia y con el personal del
laboratorio de Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Santiago
de Compostela y de la Universidad de Córdoba.
4.5 CONSIDERACIONES ETICAS Y DISPOSICIONES VIGENTES
El desarrollo de la presente propuesta se realizará de acuerdo a la legislación
vigente y otras normas reguladoras en materia de ética, experimentación humana,
animal o de bioseguridad. El proyecto de investigación será sometido a la
evaluación del Comité de Ética de la Fundación Hospital de la Misericordia, de
39
acuerdo a las disposiciones previstas en la Resolución No. 008430 de 1993 del
Ministerio de Salud y en la Ley 84 de 1989.
En cuanto a las implicaciones éticas o de bioseguridad del presente proyecto de
investigación, se puede afirmar que:
•
Este proyecto está clasificado como Investigación con riesgo mínimo, según
las características establecidas en el artículo 11 de la Resolución 008430 de
1993, del Ministerio de Salud.
•
El proyecto se desarrollará en los servicios de consulta externa del Hospital de
la Misericordia, en el Laboratorio de Bioquímica de la Facultad de Medicina de
la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá y el Departamento de
Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Santiago de
Compostela, en España, las cuales cuentan con comité de ética. En el
proyecto se detallan las muestras biológicas obtenidas de los diferentes
ensayos y el uso que éstas recibirán.
•
La Facultad de Medicina, así como el Hospital de la Misericordia, disponen de
instalaciones apropiadas y con personal idóneo en el procedimiento de toma
de muestras sanguíneas a pacientes pediátricos.
•
La Unidad de Recursos Físicos de la Universidad Nacional a través del
programa UN Ambiente se hará cargo de la disposición definitiva de los
desechos orgánicos y químicos producidos por el presente proyecto.
•
Para la participación en la investigación se solicitará el consentimiento
informado por escrito a los padres o acudientes del menor, explicándole los
objetivos de la investigación y los riesgos de la toma de muestra de sangre.
•
La historia clínica de los niños del grupo de estudio están custodiadas en el
archivo por el Hospital Universitario Fundación Hospital de La Misericordia,
garantizando la confidencialidad de la misma.
40
•
El presente estudio no ofrecerá dilemas éticos al grupo investigativo, ya que
los pacientes se encuentran bajo tratamiento en un hospital de cuarto nivel de
complejidad y el análisis de las muestras no ofrecen ningún riesgo para la
salud de los niños.
•
Se garantiza que será suspendido el estudio para las familias que así lo
manifiesten.
•
En cualquier momento previo a la toma de las muestras, se diligenciará el
consentimiento informado por escrito mediante el cual, a cualquiera de los
padres o al representante legal del menor se solicita la autorización para la
participación del menor en el estudio, en el que aceptará pleno conocimiento
del procedimiento y de los riesgos que éste conlleva así como la libre elección
de participar. Se adjunta el texto completo del consentimiento informado.
Anexo 1.
•
Las muestras no serán utilizadas para fines distintos del proyecto o que no
estén mencionados en el consentimiento informado.
4.6 TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS
Desde marzo a julio de 2008 se inició la revisión de historias clínicas de pacientes
con diagnóstico de EH que asisten a la consulta de Hematología Pediátrica de la
Fundación Hospital de la Misericordia; se obtuvo una base de datos de posibles
candidatos para el estudio teniendo en cuenta las características clínicas y de
laboratorio como hemograma completo, extendido de sangre periférica, prueba de
fragilidad osmótica, bilirrubinas totales y diferenciales y ecografía de abdomen
superior. Con la revisión de historia clínica se procedió a hablar con los padres o
representantes legales y después de cumplir los criterios de inclusión y exclusión,
se firmó el consentimiento informado.
41
Después de obtener firmado el consentimiento por parte de los padres y/o
acudientes, se tomó una muestra de sangre venosa entre 5 y 10 cc, en tubo con
anticoagulante (EDTA) a los pacientes seleccionados con diagnostico de
esferocitosis hereditaria y a los controles, en el Departamento de Bioquímica de la
Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia.
A continuación se explica la técnica en los siguientes pasos:
•
Separación de las membranas de los eritrocitos.
Una fracción de la
muestra de sangre se centrifuga a 1500g y se lava el pellet de glóbulos rojos en
buffer salino de fosfato (PBS-pH 7.4) tres veces. Aproximadamente cien millones
de hematíes se tratan con buffer de lisis (buffer, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2mM
dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mM EDTA, 0.25 M sucrose)
durante 10 minutos a 4ºC. Las membranas se centrifugan a 14.000 g durante 10
minutos a 4ºC y luego se lavan tres veces con tampón de lisis. Las muestras se
lisan por frío, se dejan 20 min a temperatura ambiente en buffer de lisis y se
centrifugan a 14.000 g durante 20 minutos. Posteriormente se resuspenden en un
buffer específico para 2D con elevado contenido de Urea (7M de Urea, 2M de
Tiourea, 5% de CHAPS y 2mM de TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine
hydrochloride)) y se almacena a -70ºC (24) hasta que se corra la electroforesis en
2D.
•
Electroforesis en 2D. La cuantificación de la concentración de proteína se
realizó utilizando kits comerciales en los que no influye la urea de la muestra, kit
RC DC protein Assay (BIO-RAD); además se confirmó el resultado corriendo un
gel 1D y realizando una tinción con Coomasie, con lo cual se consigue ver si las
proteínas se encuentran en buen estado (no degradadas). Es muy importante que
las muestras destinadas a un análisis por espectrometría de masas sean
preparadas en un ambiente lo más limpio posible, libre de queratinas y suciedad
(los cristales en los que se corran los geles, cualquier recipiente utilizado y el
material fungible) y que cualquiera de estas sean manipuladas con guantes libres
42
de talco y nunca con las manos desnudas. A continuación se procede a su
fraccionamiento mediante geles 2D-PAGE (SDS-PAGE) de diferentes rango de pH
permitiendonos separar las distintas proteínas presentes en las muestras con base
en la diferente masa y punto isoeléctrico. Estudios previos realizados en otros
tipos de tejidos muestran que el mayor número de proteínas se encuentra en el
rango de pH de 4 a 7. Las muestras se solubilizan, durante más de 4 horas en un
buffer de rehidratación (7M de Urea, 2M de Tiourea, 5% de CHAPS) usando como
reductor 50mM de DTT y 4% de anfolitos del mismo rango de pH en el que se
corren los geles para facilitar la migración de las proteínas. La primera dimensión,
en la que las proteínas se separan en función del pI (punto isoeléctrico), se lleva a
cabo en un equipo IPGphor III (Ge Healthcare); se corre en tiras de 11 cm y se
somete a un enfoque de 12000V totales siguiendo el protocolo:
-. 30V 5h
-. 60V 5h
-. 120V 1h
-. 250V 1h
-. 500V 1h
-. 1000V 30 min
-. gradiente 1000V a 8000V 30 min
-. enfoque a 12000
Antes de realizar la segunda dimensión, las tiras se equilibran en buffer de
equilibrado con 1% de DTT durante 30 minutos (para reducir las proteínas) y 30
minutos en buffer de equilibrado con 4% de iodoacetamida (para alquilar las
proteínas). A continuación se cargan las tiras en geles de acrilamida-bisacrilamida
al 12% (segunda dimensión) para separar las proteínas en función del peso
molecular mediante un sistema de electroforesis vertical Hoefer (Bio-Rad). El
patrón de expresión proteico se visualiza utilizando métodos de tinción con plata
43
mediante el uso del kit comercial PlusOne Silver Staining Kit, Protein (Ge
Healtcare).
Una vez obtenidos los geles de las distintas muestras controles vs pacientes y un
mínimo de triplicado por muestra se realiza un análisis exhaustivo de todas las
proteínas observadas en los geles. Para ello, los geles se escanean y se analizan
las imágenes del patrón de expresión de proteínas mediante el uso de programas
informáticos como, “PDQuest” disponibles en la unidad de Proteómica de la
Universidad de Córdoba, España (en colaboración permanente con el grupo del Dr
Justo Castaño) que facilita la comparación entre las proteínas observadas en los
distintos geles. Además estos geles pueden compararse con bases de datos de
geles de 2D existentes en el dominio público de la red de Internet lo que nos daría
una idea de la proteína que puede ser de interés. El análisis mediante los
programas informáticos nos da datos de interés como el porcentaje en el que las
proteínas están sobreexpresadas o disminuídas.
•
Identificación de la(s) proteína(s) expresada(s) de forma diferencial
mediante MALDI-TOF.
Una vez analizados los geles, en caso de encontrar
algunas proteínas diferenciales se cortan los “spots” y se procede a la digestión
tríptica “in-gel” de las proteínas de interés mediante la utilización del robot digestor
automático Proteineer DP (Bruker-Daltonics). Esta muestra se resuspende en 10
microlitros de 0.2% de TFA y se purifica mediante la utilización de puntas de
pipetas Zip-Tipc18 que disponen en su extremo de una pequeña columna
cromatográfica en fase reversa. A continuación se seca en un speed-back, se
mezcla con la matriz adecuada (ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico) y se procede a
plaquearla en un anchorChip para la obtención de la huella peptídica (fingerprint)
usando un espectrómetro de masas MALDI-TOF Bruker Reflex IV, dotado con un
software específico adecuado para el análisis exhaustivo de los datos recogidos.
El tratamiento y análisis realizados con distintos programas informáticos de los
picos observados nos permite enviar las masas de los péptidos trípticos medidos,
44
a una base de datos (NCBInr, MSDB, SwissProt, MASCOT) mediante un software
específico en que se concretan varios parámetros críticos a la hora de la
identificación de cada proteína.
4.6.1
Evaluación de las características clínicas y de laboratorio de los
pacientes. Para la clasificación de severidad de los pacientes con EH, se tuvo en
cuenta los exámenes paraclínicos disponibles en la historia clínica y los criterios
descritos en la tabla 2 del marco teórico.
Se consideró que la prueba de resistencia osmótica estaba disminuída cuando
existía evidencia de hemólisis en concentraciones de solución salina ≥0,55g/dl.
Según la clasificación de Dacie, la curva de resistencia osmótica se dividió en tipo
I: si había desplazamiento de la curva hacia la derecha, con hemólisis que inició
en concentraciones de solución salina de 0,55g/dl; curva de resistencia osmótica
disminuída tipo II, cuando hubo desplazamiento de la curva hacia la derecha con
inicio de hemólisis en concentraciones de solución salina de 0,6 g/dl, y curva de
resistencia osmótica disminuída tipo III si había desplazamiento de la curva hacia
la derecha con inicio de hemólisis en concentraciones de solución salina de 0,85
g/dl (1,17).
Con el fin de establecer los rangos normales de las proteínas de membrana de los
eritrocitos y de tener un grupo control, se estudiaron paralelamente un grupo de 8
individuos normales sanos a quienes se les realizó electroforesis de proteínas de
membrana en 1D y 2D. Este grupo tiene un hemograma normal, bilirrubinas
normales, prueba de Coombs negativa y fragilidad osmótica normal.
Para este estudio se estableció que la cantidad de espectrina más ankirina, banda
4.1 más banda 4.2, fueron expresadas en relación con la banda 3. Estas se
cuantificaron por densitometría de los geles teñidos en Coomasie a 540nM
45
(BioRAD) y el área bajo los picos se determinó por el programa de computadora
Molecular Analist (BioRAD). Los resultados fueron basados en 3 electroforesis del
mismo paciente.
Se catalogó como déficit de espectrina más ankirina cuando la relación entre la
banda electroforética correspondiente a espectrina más ankirina y la banda
electroforética correspondiente a banda 3 fue menor que la misma relación medida
en los individuos normales. El diagnóstico de déficit de proteína 4.1 mas proteína
4.2 fue hecho cuando la relación entre la banda electroforética correspondiente a
banda 4.1 mas banda 4.2 y la banda 3 fue menor que la misma relación medida en
el grupo de individuos normales. El diagnóstico de déficit de de banda 3 fue
realizado cuando la relación entre la banda electroforética correspondiente a
espectrina más ankirina y la banda 3 fue mayor que la misma relación en los
individuos normales.
46
5. RESULTADOS
Se realizó el estudio en 8 pacientes y 8 controles. Los pacientes son niños que
asisten a la consulta de Hematología Pediátrica de la Fundación Hospital de la
Misericordia con diagnóstico de esferocitosis hereditaria (EH) a quienes se les hizo
seguimiento desde marzo hasta agosto de 2008 y cumplieron los criterios de
inclusión.
El promedio de edad fue de 7,1 años, con rango de 1,8 a 13,75 años. El 62,5%
correspondió al sexo femenino y 37,5% al masculino.
Las características epidemiológicas de los 8 pacientes se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Características epidemiológicas de los pacientes
PACIENTE
SEXO
EDAD
(años)
PESO
(Kg)
TALLA
(cm)
1
F
1,81
10,3
77
2
M
13,75
48,5
159
3
F
8,51
28,7
128,5
4
M
5,52
22,3
113
5
F
13,1
57
161
6
F
2,66
11,7
84
7
F
5,41
18
106
8
M
6,25
28,7
123
Fuente: Autor
5.1 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS
Los antecedentes personales de los pacientes estudiados se muestran en la
Tabla 4.
47
Cinco
pacientes
tenían
antecedente
de
ictericia
neonatal
manejada
hospitalariamente con fototerapia, 3 de los cuales también requirieron trasfusión
de glóbulos rojos en la misma hospitalización por anemia pero no para
exsanguinotrasfusión indicando que la ictericia fue moderada con adecuada
respuesta a fototerapia. De estos 5 pacientes, 4 tenían antecedentes familiares de
EH: dos son hermanos y la madre tiene diagnóstico de EH y los otros dos tienen
antecedentes de padre con EH.
Hay cinco pacientes con antecedentes familiares de EH, cuatro descritos en el
párrafo anterior y el quinto con antecedente de padre con EH y esplenectomía.
En total 4 pacientes han requerido trasfusión de glóbulos rojos por anemias
consideradas como importantes; 3 en edad de recién nacido y uno, posterior a un
procedimiento quirúrgico osteoarticular programado. Ninguno ha sido trasfundido
en los últimos 6 meses.
Hay una paciente a quien durante el estudio y seguimiento de EH con ecografía
abdominal, se le encontró colelitiasis, la cual está en control clínico y radiológico
estrecho.
Al examen físico el paciente número 8 se encontraba ictérico y con
esplenomegalia de 4 cm por debajo del reborde costal derecho (PDRCD); el
paciente número 6 presentaba bazo palpable a 2 cm PDRCD, sin ictericia. La
paciente número 5 fue esplenectomizada en marzo de 2008 por la severidad del
cuadro clínico y los otros 5 pacientes se encontraron asintomáticos y sin ictericia ni
bazo palpable.
Según la gravedad del cuadro clínico, teniendo en cuenta los criterios descritos en
el marco teórico, los pacientes se pueden clasificar como: rasgo en un caso
(paciente Nº 2) (12,5%), leve en 4 casos (pacientes Nº1,3, 6 y 8)(50%), moderada
48
en 2 casos (pacientes Nº 4 y 11) (25%) y severa en un caso (paciente Nº
5)(12,5%), esta última es la paciente que se esplenectomizó en marzo de 2008.
Tabla 4. Antecedentes personales y familiares
ANTECEDENTES
PACIENTES(%)
Ictericia
7 (87,5%)
Ictericia Neonatal
5 (62,5%)
Familiares
5 (62,5%)
Anemia
4 (50,0%)
Trasfusiones
4 (50,0%)
Colelitiasis
1 (12,5%)
Esplenectomía
1 (12,5%)
n=8
Fuente: Autor
5.2 HALLAZGOS DE LABORATORIO
La tabla número 5 describe las características del hemograma y niveles de
bilirrubinas más significativos reportados en la historia clínica de los 8 pacientes
estudiados.
En el cuadro hemático, el promedio de la concentración de hemoglobina
corpuscular media estuvo en valores normales (33.7 g/dl), pero los pacientes 4, 6
y 8 tuvieron valores elevados ≥ de 35 g/dl.
El ancho de distribución está elevado en todos los pacientes por encima del rango
normal de 15%.
El valor promedio de bilirrubina total estuvo elevado, en 4.9 mg/dl (rangos de 0,9 a
14,7mg/dl). Sólo el paciente Nº1 tenía valores dentro de límites normales y está
clasificado como rasgo por los otros parámetros de laboratorio.
49
Tabla 5. Características de laboratorios
No.
Hb
(g/dl)
Hcto
(%)
VCM
(fL)
CHCM
(g/%)
HCM
AD
(%)
Retis
correg
FSP
BT
BI
1
12
35,4
80,9
34,9
28,3
16,0
5,74
+
4,49
4,07
2
15
44,4
88,1
34,3
30,2
15,3
2,0
NORMAL
0,9
0,6
3
12
37,6
87,4
32,7
28,6
17,0
16,0
++
5,49
4,46
4
10
27,0
78,7
37,4
29,4
19,4
7,0
+
14,7
13,83
5
5,6
16,0
75,4
30,8
23,1
21,4
11,6
+++
4,89
4,41
6
13
35,2
71,9
35,7
25,7
20,2
20,0
+
2,3
2,05
7
8,6
28,8
87,3
29,9
26,1
24,6
9,65
++
2,91
2,41
8
11
34,0
82,6
35
28,9
24,8
15,7
NORMAL
4,27
3,66
FSP=
+
++
+++
frotis de sangre periférica.
esferocitos escasos
esferocitos moderados
esferocitos abundantes
Fuente: Autor
5.3 CURVA DE FRAGILIDAD OSMÓTICA
Se realizó la prueba de fragilidad osmótica incubada, la cual se repitió mínimo en
dos oportunidades en laboratorios de referencia y se encontraron las siguientes
curvas que se pueden ver en el Anexo B: en los pacientes Nº 1, 3, 4, 6 y 7 el perfil
de hemólisis es tipo III. En dos pacientes (Nº 2 y 5) fueron normales y en uno (Nº
8), la curva es de patrón de resistencia globular osmótica. En la paciente 5 se
repitió la prueba de fragilidad osmótica y evidenció un patrón sugestivo de EH (no
mostrado en el Anexo B). En este caso primó el cuadro clínico y los antecedentes
familiares.
5.4 RESULTADOS DE ELECTROFORESIS 1D
Se realizó a los pacientes y a los controles electroforesis 1D que fueron teñidas
con Coomasie (ver ejemplo en anexo 3). A pesar de realizarse varios ensayos a
diferentes concentraciones de poliacrilamida, no se logró separar la banda de
50
ankirina de la de espectrina debido a que el peso molecular de estas dos proteínas
es muy similar entre sí y solamente se pueden diferenciar mediante
aproximaciones de inmunohistoquímica como Western Blot, por lo cual se decidió
tomar en conjunto el área de la espectrina y la ankirina. De igual manera no se
observa una alteración en el tamaño de estas dos proteínas lo cual podría estar
asociado a mutaciones puntuales y no a perdidas como deleciones.
Respecto a las proteínas de membrana alterada se encontró: 3 pacientes (Nº2, 3 y
4)(37,5%) con déficit combinado de ankirina y espectrina y en los 5 pacientes
restantes, déficit de banda 3 (Nº 1, 5, 6 , 7 y 8)(62,5%).
En todos los geles de electroforesis 1D de los pacientes, se encontró por
densitometría la presencia de una banda proteica a nivel del marcador de peso
molecular de 26 kD, la cual no se evidenció en los geles de los controles.
5.5 RESULTADOS DE 2D-PAGE Y ESPECTROMETRÍA DE MASAS MALDI-TOF
Posteriormente se realizaron electroforesis 2D-PAGE a los pacientes y controles,
en las cuales también se evidenció diferencias significativas en algunas proteínas
de membrana localizada en un peso molecular aproximado de 26 kD cuando se
analizan con densitometría y presentes únicamente en los pacientes y ausentes
en los controles (Ver anexo 3, 4 y 5 y gráfica 1).
Luego, las proteínas que se identificaron en estos geles, se aislaron sus “spots” y
se procedió a la digestión con
tripsina para su posterior análisis por
Espectrometría de Masas la cual se realizó en la Universidad de Córdoba en el
Servicio Central de Apoyo a la Investigación, con el objetivo de identificar algunas
proteínas que se manifestaron únicamente en los pacientes y poder explicar su
expresión este grupo de pacientes con EH.
51
Los resultados del estudio de masas de los “spots” permitieron identificar
diferentes proteínas, muestras S1, S2 y S3 que se consignan en el anexo 6, donde
se destaca principalmente la presencia de α-espectrina localizada en un peso
molecular diferente al calculado para su estructura y punto isoeléctrico.
Figura 4. Diferencia de expresión de los pacientes con EH versus los controles
Proteína de 26Kda que se ve tanto en los geles teñidos con coomasie como en los 2D
***
Niveles de proteína
3
2.5
2
1.5
paciente
1
0.5
0
control
Fuente: Autor
52
6. DISCUSION
Se evidenció que los 8 pacientes con EH incluídos en este estudio, presentan al
igual que se describe en la literatura, una variabilidad clínica y paraclínica de tal
forma que dos terceras partes de los pacientes presentaron ictericia neonatal pero
no de magnitud significativa como para exsanguinotrasfusión. Aproximadamente el
65% tienen, antecedentes familiares de EH lo cual coincide con los reportes
mundiales que están entre el 70 a 85%. La mitad de los pacientes consultaron por
anemia y un poco más del 85%, por ictericia. Sólo un paciente requirió
esplenectomía por la severidad de los síntomas y en otro se encontró colelitiasis
como hallazgo incidental dentro de los estudios de extensión.
En el hemograma los hallazgos más notorios fueron anemia, reticulocitosis y
elevación del ancho de distribución pero a diferencia de lo descrito en estudios
previos (1, 3, 4, 8, 10, 11, 13, 16, 18), no hay un aumento de la concentración de
hemoglobina corpuscular media en este grupo.
La curva de fragilidad osmótica más frecuente en los pacientes estudiados fue la
tipo III y no se correlaciona con la severidad de la enfermedad.
La prueba de fragilidad osmótica que en nuestro medio hace parte fundamental
del diagnóstico de EH, fue normal en 3 pacientes. En todos los pacientes, el
corrido electroforético en 1D detectó deficiencias en las proteínas de membrana, lo
cual indica que esta última es más sensible y específica para el diagnóstico.
Encontramos que todos los pacientes seleccionados tenían deficiencia de
proteínas de membrana y la más frecuente en esta serie es la de Banda 3,
seguida por la deficiencia combinada de espectrina y ankirina. No encontramos
deficiencias de proteínas 4.1 y 4.2. Llama la atención este hallazgo, pues la
53
literatura reporta como primera causa la deficiencia de ankirina o la combinada de
ankirina y espectrina. No se puede concluir que esta sea la deficiencia más
prevalente en nuestra población por el número de pacientes incluídos en la serie,
pero los resultados son similares a los encontrados en el estudio realizado en
1997 en el Hospital San Juan de Dios y el Hospital de la Misericordia de Bogotá
por Torres y colaboradores (1) a 29 pacientes con EH, entre 1 y 79 años de edad,
a quienes se les hizo electroforesis 1D y se encontró que la mayor deficiencia era
la de Banda 3 seguida por la combinada de espectrina/ankirina. Esto nos plantea
la necesidad de ampliar la muestra de pacientes para poder obtener resultados
epidemiológicos más precisos. Estos defectos de las proteínas de membrana
podrían ser confirmadas mediante técnicas de inmunohistoquímica como el
Western Blot, pero esta metodología aunque es sensible no se puede hacer para
analizar varias posibles proteínas involucradas en la patología, lo cual la hace
costosa y poco eficiente para el diagnóstico
La paciente Nº 5 requirió esplenectomía por la severidad de la enfermedad que se
correlaciona con los criterios de clasificación anotados en el marco teórico.
Presenta un antecedente de ictericia neonatal, trasfusiones y EH familiar. Es
importante anotar que la curva de fragilidad osmótica no fue útil en este caso para
apoyar el diagnóstico porque no fueron conclusivas. La electroforesis de proteínas
de membrana encontró en esta paciente una deficiencia de proteína banda 3: esta
deficiencia no se ha asociado a severidad. En este caso se demuestra que los
ensayos paraclínicos disponibles no son concluyentes para lo cual sería necesario
un
estudio
más
detallado
de
las
proteínas
de
membranas
mediante
aproximaciones moleculares.
El paciente Nº 8, clínicamente cumple los criterios de EH moderada, su
electroforesis reportó deficiencia de proteína banda 3 y la curva de fragilidad
osmótica muestra patrón de resistencia a la hemólisis. Una vez más se demuestra,
que aunque la prueba de fragilidad es una herramienta valiosa no siempre es útil
para el diagnóstico.
54
Los pacientes Nº 2 y 4 son hermanos, tienen deficiencia combinada de espectrina
con ankirina. Uno de ellos con curva de fragilidad normal y el otro de hemólisis tipo
III. Se puede concluir que al tener la misma deficiencia de proteínas, tiene una
mutación de patrón hereditario autosómico dominante, información útil para
consejería genética.
Teniendo en cuenta las dificultades para el diagnóstico y la variabilidad en las
curvas de fragilidad osmótica, se consideró de mucha utilidad realizar las pruebas
de electroforesis 1D y 2D así como la espectrometría de masas. Encontramos que
unas proteínas de 26 kD tienen una gran expresión en todos los pacientes del
estudio comparados contra controles sanos, tanto en la electroforesis 1D como
2D-PAGE. El análisis por MALDI-TOF permitió identificar algunas de estas
proteínas, donde el hallazgo más importante es la presencia de α-espectrina,
localizada en otro punto isoeléctrico y peso molecular al calculado. Su ubicación
en este lugar posiblemente sea explicada por las modificaciones que sufre
postraducionalmente al no poderse ensamblar adecuadamente en el citoesqueleto
de la membrana por la(s) deficiencia(s) encontrada(s) en proteínas fundamentales
de este, como Banda 3 y de espectrina/ankirina.
Esta investigación es la primera en estudiar por técnicas moleculares, como la
espectrometría de masas, las proteínas de membrana del eritrocito en casos de
esferocitosis hereditaria a nivel de Colombia y de Galicia-España, donde se
adelantaron los estudios de electroforesis y MALDI-TOF. Incluye inicialmente 8
pacientes y 8 controles ya que esto implicó un gran esfuerzo técnico, logístico y
económico, pero además se utilizó como una prueba piloto para estandarizar la
técnica y poder posteriormente ampliar la muestra de pacientes.
55
7. CONCLUSIONES
•
La deficiencia de proteína de membrana más frecuente en esta serie es de
Banda 3, seguida de la combinada ankirina/espectrina. No se encontró
deficiencia de proteínas 4.1 o 4.2.
•
No hay correlación entre la deficiencia de proteína de membrana y la
severidad de la esferocitosis hereditaria en este estudio.
•
La prueba de fragilidad osmótica tuvo baja sensibilidad para apoyar el
diagnóstico de esferocitosis hereditaria en esta serie.
•
La electroforesis 1D tiene alta sensibilidad y especificidad para el diagnóstico
de esferocitosis hereditaria, con algunas incertidumbres al no poder separar
con esta técnica, proteínas que tengan pesos moleculares cercanos.
•
La espectrometría de masas nos permitió identificar proteínas modificadas
como la α-espectrina, ubicada a nivel de 26 kD. Esta proteína podría tener
utilidad como biomarcador de esferocitosis hereditaria.
•
Se deben confirmar los resultados de los análisis de masas mediante técnicas
como Western Blot y genómica.
•
Se recomienda el estudio de espectrometría de masas de los defectos de las
proteínas de membrana del eritrocito ya que en nuestro medio no existen
estudios con técnicas moleculares de EH.
•
Aunque los costos actuales de estos procesos pueden considerarse elevados,
al estandarizarse y utilizarse rutinariamente disminuirán en forma significativa.
56
BIBLIOGRAFIA
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membrana de los eritrocitos en la esferocitosis hereditaria. Acta Médica
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59
ANEXOS
ANEXOS
60
Anexo A. Consentimiento informado
“ESTUDIO DE PROTEINAS DE MEMBRANA DEL GLOBULO ROJO EN
PACIENTES PEDIATRICOS CON ESFEROCITOSIS HEREDITARIA DE LA
FUNDACION HOSPITAL DE LA MISERICORDIA”
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE PEDIATRIA Y BIOQUIMICA
Bogotá,
Fecha: ________________
Yo,_____________________________, identificado con cédula de ciudadanía
Nº______________________,
padre
y/o
acudiente
de____________________________, con identificación No._______________,
con capacidad de libre elección y sin coacción alguna, autorizo que participe en el
“ESTUDIO DE PROTEINAS DE LA MEMBRANA DEL GLOBULO ROJO EN
PACIENTES PEDIATRICOS CON ESFEROCITOSIS HEREDITARIA DE LA
FUNDACION HOSPITAL DE LA MISERICORDIA”.
Declaro que se me ha informado sobre la metodología del estudio, las posibles
consecuencias derivadas de él y que se resolvieron de manera satisfactoria mis
dudas.
Además se me garantizó confidencialidad, libertad de retiro del estudio en
cualquier momento y que se me podrá dar información durante el desarrollo del
mismo.
______________________
CC
Teléfono
Acudiente
_________________________
CC
Teléfono
Médico Investigador
______________________
CC
Teléfono
Testigo
_________________________
CC
Teléfono
Testigo
61
Anexo B. Curvas de fragilidad osmótica
Paciente 1
120%
100%
80%
NORMAL 1
NORMAL 2
%HEMOLISIS
60%
40%
20%
0%
0,90%
0,80%
0,70%
0,60%
0,50%
[Na Cl]
0,90%
0,85%
0,80%
0,75%
0,70%
0,65%
0,60%
0,55%
0,50%
0,45%
0,40%
0,35%
0,30%
0,25%
0,20%
0,15%
0,10%
0,40%
% HEMOLISIS
7,0%
30,0%
70,0%
78,0%
87,0%
84,0%
90,0%
90,0%
90,0%
90,0%
90,0%
90,0%
90,0%
90,0%
100,0%
100,0%
100,0%
62
0,30%
0,20%
Paciente 2.
120%
100%
80%
NORMAL 1
NORMAL 2
% HEMOLISIS
60%
40%
20%
0%
0,90%
0,80%
0,70%
0,60%
0,50%
[Na Cl]
0,90%
0,85%
0,80%
0,75%
0,70%
0,65%
0,60%
0,55%
0,50%
0,45%
0,40%
0,35%
0,30%
0,25%
0,20%
0,15%
0,10%
0,40%
% HEMOLISIS
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
1,6%
58,8%
79,1%
81,2%
81,9%
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
63
0,30%
0,20%
Paciente 3.
120%
100%
80%
NORMAL 1
NORMAL 2
%HEMOLISIS
60%
40%
20%
0%
0,90%
0,80%
0,70%
0,60%
[Na Cl]
0,90%
0,85%
0,80%
0,75%
0,70%
0,65%
0,60%
0,55%
0,50%
0,45%
0,40%
0,35%
0,30%
0,25%
0,20%
0,15%
0,10%
0,50%
0,40%
% HEMOLISIS
0,0%
2,5%
8,3%
21,5%
34,3%
52,0%
53,4%
70,9%
79,8%
79,8%
81,5%
88,0%
94,8%
96,5%
100,0%
100,0%
100,0%
64
0,30%
0,20%
Paciente 4.
120%
100%
80%
NORMAL 1
NORMAL 2
% HEMOLISIS
60%
40%
20%
0%
0,90%
0,80%
0,70%
0,60%
[Na Cl]
0,90%
0,85%
0,80%
0,75%
0,70%
0,65%
0,60%
0,55%
0,50%
0,45%
0,40%
0,35%
0,30%
0,25%
0,20%
0,15%
0,10%
0,50%
0,40%
% HEMOLISIS
10,0%
10,0%
15,0%
22,0%
37,0%
62,0%
76,0%
82,0%
87,0%
90,0%
92,0%
94,0%
96,0%
98,0%
100,0%
100,0%
100,0%
65
0,30%
0,20%
Paciente 5.
120%
100%
80%
NORMAL 1
NORMAL 2
% HEMOLISIS
60%
40%
20%
0%
0,90%
0,80%
0,70%
0,60%
[Na Cl]
0,90%
0,85%
0,80%
0,75%
0,70%
0,65%
0,60%
0,55%
0,50%
0,45%
0,40%
0,35%
0,30%
0,25%
0,20%
0,15%
0,10%
0,50%
0,40%
% HEMOLISIS
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
2,8%
4,4%
12,2%
50,2%
91,6%
92,4%
98,4%
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
66
0,30%
0,20%
Paciente 6.
120%
100%
80%
NORMAL 1
NORMAL 2
% HEMOLISIS
60%
40%
20%
0%
0,90%
0,80%
0,70%
0,60%
[Na Cl]
0,90%
0,85%
0,80%
0,75%
0,70%
0,65%
0,60%
0,55%
0,50%
0,45%
0,40%
0,35%
0,30%
0,25%
0,20%
0,15%
0,10%
0,50%
0,40%
% HEMOLISIS
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
33,3%
51,2%
55,5%
69,7%
89,6%
86,4%
90,7%
95,6%
98,7%
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
67
0,30%
0,20%
Paciente 7.
120%
100%
80%
NORMAL 1
NORMAL 2
% HEMOLISIS
60%
40%
20%
0%
0,90%
0,80%
0,70%
0,60%
[Na Cl]
0,90%
0,85%
0,80%
0,75%
0,70%
0,65%
0,60%
0,55%
0,50%
0,45%
0,40%
0,35%
0,30%
0,25%
0,20%
0,15%
0,10%
0,50%
0,40%
% HEMOLISIS
0,0%
3,7%
27,8%
30,5%
33,4%
69,9%
72,8%
73,7%
93,1%
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
68
0,30%
0,20%
Paciente 8.
120%
100%
80%
NORMAL 1
NORMAL 2
% HEMOLISIS
60%
40%
20%
0%
0,90%
0,80%
0,70%
0,60%
[Na Cl]
0,90%
0,85%
0,80%
0,75%
0,70%
0,65%
0,60%
0,55%
0,50%
0,45%
0,40%
0,35%
0,30%
0,25%
0,20%
0,15%
0,10%
0,50%
0,40%
% HEMOLISIS
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
17,4%
3,8%
50,7%
61,1%
71,5%
80,2%
100,0%
100,0%
100,0%
69
0,30%
0,20%
Anexo C. Gel de Coomasie donde se observan las proteínas similares(cuadros
verdes) y diferentes(cuadros rojos) de los pacientes versus los controles
20μl de muestra
170
130
96
72
55
43
34
26
17
70
Anexo D. Electroforesis en 2D-PAGE, donde se observa las proteínas que se
expresan en los pacientes con respecto a los controles.
MWM
MWM
99KDa
99KDa
66KDa
66KDa
45KDa
45KDa
35KDa
35KDa
20KDa
20KDa
4
Control 2
7
Control 6
4
MWM
99KDa
66KDa
45KDa
29-10-08
35KDa
20KDa
4
paciente 3
71
7
7
Anexo E. Geles en 2D-PAGE: se observan las diferencias entre los controles y el
paciente 3 (subrayado por un cuadro rojo)
MWM
99KDa
66KDa
45KDa
35KDa
20KDa
4
Control 1
MWM
MWM
99KDa
99KDa
66KDa
66KDa
45KDa
45KDa
35KDa
35KDa
20KDa
20KDa
4
7
paciente 1
7
72
4
paciente 2
7
Anexo F. Resultados de espectrometría de masas de algunas de las proteínas
identificadas en los geles de los paciente
73
74
75