guía para el análisis bromatológico de muestras de forrajes

Transcripción

GUÍA PARA EL
ANÁLISIS
BROMATOLÓGICO
DE MUESTRAS DE
FORRAJES
Facultad de Ciencias
Agropecuarias
Universidad de
Panamá
Autor:
Manuel De Gracia, Ph.D.
Apoyo en Revisión:
Alvis Gallardo
Guía para el Análisis Bromatológico de Muestras de
Forrajes
Laboratorio de Nutrición Animal
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Universidad de Panamá
Autor:
Manuel S. De Gracia, Ph.D.
Apoyo en revisión:
Alvis Gallardo
2011
2
TABLA DE CONTENIDO
Página No.
I. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................................... 1
II. TOMA DE MUESTRAS ............................................................................................................................... 2
A. PASTURAS ..................................................................................................................................... 3
B. HENOS ............................................................................................................................................ 3
C. ENSILAJE Y SUBPRODUCTOS DE FERMENTACIÓN ................................................................ 3
D. GRANOS O MEZCLAS DE CONCENTRADOS ............................................................................. 4
III. MEZCLA DE LAS MUESTRAS E IDENTIFICACIÓN ............................................................................... 4
IV. PRESECADO Y MOLIENDA..................................................................................................................... 6
V. PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS ............................................................................................................ 7
VI. DETERMINACIÓN DE LA MATERIA SECA .......................................................................................... 11
A. MATERIA SECA PARCIAL O A 60 °C ......................................................................................... 11
B. MATERIA SECA TOTAL O A 105 °C ........................................................................................... 12
C. MATERIA SECA TOTAL A 135 °C ............................................................................................... 13
D. DETERMINACIÓN DE HUMEDAD POR DESTILACIÓN CON TOLUENO ................................. 14
E. MÉTODOS ADICIONALES PARA DETERMINAR HUMEDAD ................................................... 15
F. DETERMINACIÓN DE HUMEDAD EN DOS PASOS ................................................................... 16
VII. DETERMINACIÓN DE CENIZAS ........................................................................................................... 17
VIII. DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO .................................................................................................... 18
IX. DETERMINACIÓN DEL EXTRACTO ETÉREO ...................................................................................... 24
X. DETERMINACIÓN DE FIBRA.................................................................................................................. 26
A. DETERMINACIÓN DE LA FIBRA CRUDA ................................................................................... 26
B. DETERMINACIÓN DE LA FIBRA DETERGENTE NEUTRO (FDN) O CONSTITUYENTES
DE LA PARED CELULAR. ........................................................................................................... 29
C. DETERMINACIÓN DE LA FIBRA DETERGENTE ÁCIDO (FDA). .............................................. 32
D. DETERMINACIÓN DE FIBRA POR ANÁLISIS ENZIMÁTICO .................................................... 35
XI. DETERMINACIÓN DE LIGNINA ............................................................................................................. 40
XII. DETERMINACIÓN DE MINERALES ..................................................................................................... 43
A. DETERMINACIÓN DE CALCIO .................................................................................................... 44
B. DETERMINACIÓN DE FÓSFORO ................................................................................................ 48
C. DETERMINACIÓN DE POTASIO ................................................................................................. 50
XIII. LITERATURA CONSULTADA .............................................................................................................. 54
Guía para el Análisis Bromatológico de Muestras de Forrajes
I. INTRODUCCIÓN
La nutrición como ciencia basa su aplicación en el conocimiento de las demandas nutricionales de los
animales en cada uno de sus estados fisiológicos y en la oferta de los nutrimentos para satisfacer estas
necesidades en las cantidades y calidad adecuadas. Resulta imposible poder formular una ración para el
consumo animal que maximice la respuesta de un grupo diverso de animales. De acuerdo con la
distribución normal de una determinada población, habrán animales con mayores o menores demandas
nutricionales en comparación con el promedio general del grupo, por lo que la ración que se formule
deberá cubrir los requerimientos nutricionales de un alto porcentaje de los animales, y solo en el caso de
aquellos animales más exigentes, se formularán raciones especiales si el valor económico de los animales
lo amerita. El formular raciones con un exceso de nutrimentos para cubrir las necesidades de todos los
animales puede acarrear una sobrealimentación de algunos o de muchos según sea el caso, y por
consiguiente disminuir los beneficios económicos, así como la competitividad de la actividad.
Para lograr formular una ración que se adecue a satisfacer los requerimientos nutricionales de la mayoría
de los animales en un lote tenemos que utilizar como punto de partida la composición química de los
diferentes alimentos o ingredientes que serán utilizados en la formulación de la ración. Debe quedar claro
que el solo conocimiento de la composición química de los ingredientes no puede predecir la respuesta
animal, pues se dan otros factores como lo son la genética de los animales, condiciones ambientales,
estado de salud de los animales, nivel de consumo de la ración, digestibilidad de la ración o de los
diversos ingredientes de la misma, entre otros. No obstante, se han desarrollado diversas ecuaciones
matemáticas que pretenden predecir el valor nutritivo de los alimentos en función de su composición y de
esta manera, indirectamente, predecir parcialmente la respuesta animal.
Con la composición química de los alimentos se puede establecer una clasificación relativa del valor de
cada uno de ellos, ya sea como fuente de nitrógeno o de energía, dos de los principales componentes en
cualquier ración que se desee formular. El aporte de minerales, vitaminas, así como el de fibra cruda,
Fibra Detergente Neutro, Fibra Ácido Detergente y de ácidos grasos esenciales, entre otros, también
resulta importante, pero dependen de la especie animal y del estado fisiológico. Igual resulta importante en
especies como porcinas y aves el aporte de amino ácidos esenciales en la ración. Adicionalmente,
dependiendo del lugar, la forma de producción y el procesamiento, entre otros, de los ingredientes
podemos obtener variaciones en la composición química, lo que implicaría realizar periódicamente análisis
de los alimentos cada vez que tengamos sospecha de que se puedan dar variaciones significativas que
pudieran alterar la composición final de la ración, y por consiguiente obtener resultados diversos en la
respuesta animal.
Con lo anterior podemos indicar que un análisis exhaustivo de la composición química de un alimento
sería lo mejor y tendría muchas ventajas al momento de formular una ración, sin embargo, esto sería muy
costoso, por lo que en forma práctica, resulta más económico realizar ciertos análisis específicos y utilizar
valores de referencia de la literatura para ciertos componentes, cuyo análisis demanda cierto tipo de
equipo y son mas costosos y difíciles de realizar. En el caso que se detecten variaciones significativas con
los valores de referencia, pudiera procederse a verificar la composición de forma periódica.
Finalmente, a lo largo de los años, se han desarrollado diversas técnicas de análisis, así como equipo más
sensible, que han permitido determinar con mayor exactitud la composición química de los alimentos. Se
han estandarizado procedimientos, entre los cuales se pueden indicar los de la AOAC International,
National Forage Testing Association, Japan Livestock Technology Association, o los de la USDA.
Igualmente, se proceden a certificar laboratorios donde se comprueba la veracidad de los resultados de
los análisis contra patrones establecidos y se comparan y validan total o parcialmente la composición de
ciertos alimentos.
En el curso de Nutrición Animal I el estudiante podrá conocer y realizar algunos de los procedimientos
analíticos más comunes que se aplican a los alimentos o forrajes utilizados en la nutrición animal de las
especies domésticas de interés económico en el país. Esperamos que este documento sirva de apoyo
para la realización de estas actividades y sirva de material de referencia al estudiante durante sus
prácticas de laboratorio. En el documento se ha respetado el derecho de autor de la información
1
presentada, y este documento no pretende sustituir la fuente original utilizada para la elaboración del
mismo.
II. TOMA DE MUESTRAS
La toma de muestra tiene como objetivo principal proveer de material para determinar algún aspecto de
interés de una población o universo. Para la realización de la mayoría de los análisis de laboratorio se
utilizan entre uno a dos gramos de muestra. Si comparamos esta cantidad de material con el total del
material de donde proviene, en muchos casos parece insignificante, por lo que se deduce la importancia
de poder contar para los análisis de laboratorio con una muestra que sea representativa del material que
queremos analizar.
Por lo anterior podemos indicar que la toma de muestra es un paso importante, pues del mismo dependerá
nuestra inferencia sobre el resto de material que será utilizado para la formulación de raciones para los
animales. Se considera que la toma de muestra es una de las mayores fuentes de variación durante los
procesos de análisis, por lo que se debe tener un gran cuidado en esta etapa. Si la muestra no representa
fielmente el material a utilizar podemos sub o sobreestimar la oferta de nutrimentos a los animales en la
ración, y por consiguiente pudiéramos no encontrar las respuestas deseadas en términos de producción y
productividad biológica, así como en términos económicos. Por lo tanto, es importante conocer que las
mediciones que se van a obtener en la muestra son correspondientes a una distribución que posee una
media o promedio determinado, y que el valor estimado desde la muestra no posee ningún sesgo y sea
preciso. No obstante, toda medición posee un grado de error, conocido como error estándar, y entre
menor es este error mayor es la precisión. Esta última puede aumentarse o disminuirse en función del
número de muestras que se tomen, o cambiando el tamaño de la muestra, lo que está limitado por los
recursos que se poseen.
La forma como obtengamos la muestra del campo va a depender del tipo de material que queremos
analizar. Así podemos tener materiales desde gramíneas de piso, decumbentes, erectas, de corte, como
también leguminosas de tipo arbustivo, rastreras, trepadoras, entre otras. Adicionalmente, en muchas
oportunidades nos encontramos con cultivos donde se desea utilizar parte del mismo o en su totalidad
como el caso del maíz y el sorgo para ensilaje, o en su defecto los rastrojos y subproductos de la cosecha
del grano. Para el caso de alimentos semi o totalmente procesados nos encontramos con diversidades de
formas de almacenamiento, ya sea a granel, en sacos, tanques u otro tipo de envase, así como en forma
líquida o semilíquida, o con altos niveles de humedad, como el caso de la melaza, subproductos de
destilería, pulpas, entre otros.
En muchos casos, existe la posibilidad que el material provenga de un solo lote o fecha de siembra, sin
embargo, se dan casos donde el material a utilizar es elaborado en diferentes fechas, por lo que se deben
tomar muestras de cada lote de elaboración si se desea mantener un control sobre los alimentos utilizados
en la formulación de las raciones. Finalmente, la cantidad preliminar de muestra que debe enviarse al
laboratorio deberá tomar en consideración la cantidad original de material. Así tenemos que para el caso
de pasturas, la cantidad y puntos donde se tome la muestra estará influenciada por la cantidad de
hectáreas que comprende el área a utilizar por los animales, que a su vez estará influenciada por la
uniformidad de las características del suelo, tanto en composición físico-química como de topografía. Para
muestras envasadas, tal como se mencionara anteriormente, no solo influirá el lote de fabricación o
procesamiento, sino también la cantidad de material producido, y la forma del envase.
Algo muy importante en lo que se refiere al tratamiento de las muestras para análisis, es que se debe
minimizar el tiempo entre la toma de la muestra y su acondicionamiento para análisis en el laboratorio. No
se deben guardar las muestras bajo condiciones que pueden alterar su composición, tales como alta
humedad, elevadas temperaturas, luz solar, entre otras. Si la muestra no va a ser acondicionada dentro de
las siguientes 24 horas de su recolección, es aconsejable colocarla en refrigeración hasta que llegue al
laboratorio. A continuación, algunas sugerencias sobre la toma de muestras de algunos alimentos
utilizados en la nutrición animal.
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A. PASTURAS
La obtención de muestra de pasturas debe realizarse con mucho cuidado y hay que tomar en
consideración varios factores, por lo que se podrán encontrar en la literatura diversas metodologías y
métodos para la recolección de muestras de acuerdo a cada situación. Lo importante es asegurarse que
se está tomando una muestra representativa del área utilizada. Por lo general la muestra debe ser cortada
a la altura con que frecuentemente los animales la consumen, en caso de que sean utilizadas en pastoreo
directo, que por lo general esta entre los 10 a 15 cm de altura. Uno de los métodos más comunes es el
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uso de cuadrantes o marcos de metal o madera que cubren 0.5 m de área. Los cuadrantes se arrojan
dentro del área al azar y se corta todo el material que se encuentra dentro del cuadrante. En caso de
parcelas experimentales pequeñas se deben evitar los bordes y tomar la muestra en el centro de la misma.
Cuando estamos frente a mayores extensiones se puede aplicar una sectorización del área de acuerdo a
las características de la parcela, y dentro de cada sector determinar visualmente cuadrantes y de los
cuales, de forma aleatoria, se tomaran muestras de algunos para obtener una muestra representativa de la
pastura. Por hectárea el rango de muestras varía desde 10 hasta 25 muestras.
Cuando son pasturas de crecimiento erecto, por lo general la altura de corte se puede incrementar hasta
unos 25 cm, ya que este tipo de pasturas por lo general es más susceptible a la defoliación severa,
además de que por lo general los animales no las consumen extensamente. En el caso de especies para
corte se seleccionan plantas consecutivas dentro de varias hileras del material sembrado, que muestren
un crecimiento promedio del campo, y se cortan a alturas inferiores a los 10 cm o a ras del suelo, para
permitir el crecimiento de nuevo material. Para especies arbustivas la selección de la muestra dependerá
de lo que se ofertará a los animales, ya sea hojas u hojas mas tallos jóvenes entre diversas plantas de la
parcela.
En todos los casos anteriores, todo el material cortado es pesado individualmente, de forma que pueda
estimarse posteriormente la cantidad de material producido por hectárea. Dependiendo del número de
muestras tomadas en campo, se pueden tomar submuestras del material cortado en cada localidad para
conformar una, dos o tres muestras finales del campo, o bien tomar todo el material cortado para preparar
la muestra que será enviada al laboratorio.
B. HENOS
Existen diversos dispositivos para tomar muestras de heno, el mas común consiste en una especie de
tubo de acero inoxidable de aproximadamente 45 cm de largo y 3 cm de diámetro con un extremo con
bordes cortantes. La toma de muestra dependerá de la forma de henificación y de la cantidad de material
henificado. Si es un heno de montón se deberán tomar muestras tanto de la parte externa como de la
parte interna. De la parte externa se deben tomar a una profundidad de aproximadamente 10 cm. Para el
caso de pacas se toman también muestras del interior, o en algunos casos se abren las pacas y se toman
sectores o franjas interiores en su totalidad.
Se puede asumir que cada muestra representará el total de la paca y tomando un número suficiente de
muestras de diversas pacas se obtiene una representatividad del heno. No se debe tratar de separar las
hojas de los tallos cuando se toma este tipo de muestra. El número de pacas utilizadas para obtener la
muestra dependerá del volumen de pacas obtenidas en campo y en algunos casos de la uniformidad del
material recolectado. De cada paca seleccionada se podrán tomar hasta cinco submuestras, que luego se
mezclan para seleccionar la muestra a enviar al laboratorio para análisis. Se dan procesos donde el heno
se oferta en forma de pequeños cubos. En estos casos su comercialización se hace en bolsas o sacos y
hasta en tanques, por lo que la toma de muestra de este tipo de material debe hacerse de forma muy
similar a la que se aplica para granos y otros productos que se envasan en el mismo sistema.
C. ENSILAJE Y SUBPRODUCTOS DE FERMENTACIÓN
Una vez se procede a abrir el silo, se deben tomar muestras de las áreas expuestas, que estén libres de
daños visibles (color oscuro, hongos o mohos). Se pueden tomar muestras del material cuando este es
transportado hacia los comederos, y se debe evitar tomar muestras muy cerca de los bordes superior,
inferior o los lados de la estructura. Para silos en bolsa, se pueden tomar muestras de cada bolsa según
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se estén utilizando, y en el caso de “silopress” tomar muestras a medida que se avance en su abertura. En
el caso de ensilaje se recomienda tomar muestras del silo por varios días consecutivos, las cuales se
congelan hasta que se mezclen todas y se vayan a enviar al laboratorio las submuestras. Si las
submuestras no serán procesadas inmediatamente, las mismas deberán ser envasadas en recipientes que
permiten excluir la mayor cantidad de aire posible y congelarlas. Al igual que con los otros materiales
utilizados en la alimentación animal se deberán tomar tantas muestras como se considere necesario de
acuerdo con el tamaño del silo y las características del material ensilado, tales como estado de madurez,
diferencias de crecimiento en campo, entre otros.
Para el caso de otros materiales con alto contenido de humedad y subproductos de procesos
fermentativos, como los residuos de cervecería, se deben tomar muestras de acuerdo a como se van
utilizando, de igual manera que con los ensilajes. Para la conservación de las submuestras, aunque no se
requiere la exclusión de aire, se debe proceder a su congelamiento si no van a ser procesadas de
inmediato. En estos materiales no se debe tratar de extraer los líquidos por presión, puesto que muchas
veces estos son consumidos por el animal cuando se ofrecen frescos, y solo se pierde líquido por
almacenamiento o transporte de forma normal, pero no por presión externa.
D. GRANOS O MEZCLAS DE CONCENTRADOS
Las muestras de granos o mezclas de alimentos que están envasados en bolsas se pueden tomar con un
dispositivo o probador adecuado para tal propósito. Se deben tomar de cada saco un par de muestras del
centro del saco, o hay quienes prefieren tomar muestras de la parte superior, inferior y del medio del saco,
pues se da la tendencia que material mas fino, así como el mas denso, si los sacos han sido manipulados,
se segreguen hacia el fondo o costados, si están estibados. No obstante, en el mejor de los casos es
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mejor tomar la muestra en el momento en que el material se esta vaciando. La AOAC indica que para
lotes de una a diez bolsas deberán tomarse muestras de todas las bolsas, para lotes mayores a 11 bolsas
tomar muestras de al menos diez bolsas al azar. Las bolsas se colocan horizontalmente y se toman
muestras diagonalmente, una de cada bolsa, y para menos de 4 bolsas tomar de cinco a mas muestras
diagonalmente.
En caso de que el material este a granel, se pueden tomar muestras de diferentes lugares, incluyendo el
centro del mismo, lo que puede resultar en la toma de mas de 10 muestras, o en su defecto tomar
muestras a medida que el material esta siendo utilizado. De igual forma, estas muestras deben ser
mezcladas totalmente y luego tomar las submuestras para el laboratorio.
III. MEZCLA DE LAS MUESTRAS E IDENTIFICACIÓN
En todos los casos anteriores si la muestra será utilizada para análisis de minerales se recomienda el uso
de tijeras u otro material de acero inoxidable, tanto para su recolección como para su conservación. Para
facilitar la mezcla del material cortado, este se corta a 3 cm de longitud aproximadamente y se mezcla
completamente. Posteriormente se puede utilizar el método del fraccionamiento en cuartos. Esto consiste
en distribuir la muestra total sobre una superficie limpia y dividirla en cuartos, los cuartos opuestos
diagonalmente se desechan y los restantes se mezclan, y se vuelven a dividir. Se repite la operación hasta
que se obtiene una muestra de aproximadamente 1.5 kg para material fresco y ensilajes, y de 300 g para
henos, concentrados, y otros. Otro método utilizado, recomendado por la AOAC consiste en colocar todo
el material en un solo montón y con una pala u otro instrumento ir tomando alternadamente muestras, es
decir, tomar una muestra y rechazar la siguiente. El nuevo montón que queda se somete al mismo
procedimiento, y así sucesivamente, hasta llegar a la cantidad que será enviada al laboratorio.
Durante el proceso de mezclado y selección de la submuestra se debe tener especial cuidado que el
material no se contamine o sufra algún tipo de degradación que altere los resultados De cada muestra de
campo se pueden enviar dos o tres submuestras para análisis al laboratorio. Esto no invalida el uso de
repeticiones en el laboratorio, pues a cada una de las submuestras en cada corrida o análisis se deberán
incluir repeticiones. Cada muestra deberá ser identificada adecuadamente, de manera que se puedan
conocer las condiciones bajo las cuales se obtuvo el material y asociar su composición con estas. Para
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AOAC International. Official Methods of Analysis. 17th Ed. W. Horwitz, Editor. 2000.
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identificar las muestras se puede incluir en el detalle parte de lo que se conoce como el “Nombre
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Internacional” utilizado por el National Research Council y basado en la propuesta de Harris y col. , que
permite estandarizar la identificación de los distintos alimentos utilizados en la alimentación animal.
Igualmente deberá indicarse la fecha de recolección, la localidad y si se desea el nombre de la persona
que recolectó el material.
El nombre internacional de la NRC de los alimentos se compone de los siguientes componentes:
 Nombre científico: esto incluye el género y especie del alimento (Zea mays, Digitaria
decumbens, Gossypium spp., como ejemplo)
 Variedad o clase: esto incluye las diversas líneas o variedades que se obtienen por lo general
con la manipulación genética (var identata, var Marandú, var Libertad, como ejemplo)
 Nombre común del alimento: esto corresponde al nombre vulgar conocido ampliamente en la
región o a nivel internacional (maíz, pasto pangola, algodón, como ejemplo)
 Parte de la planta, animal o subproducto: En este caso se identifica la porción de la planta o el
animal, y en todo caso el subproducto que es utilizado en la formulación de la ración (parte área,
tallos, semilla con cáscara, como ejemplo)
 Proceso(s) y tratamiento(s) que sufrió antes de consumirlo el animal: aquí se señala si el
alimento ha sido previamente procesado para ser incluido en la ración o consumido por el animal
(ensilado, fresco, fertilizado, extraído por prensa solvente, horneado a 110 °C, como ejemplo)
 Estado de madurez: Es importante señalar que muchas veces utilizamos edad de corte por edad
fisiológica de la planta, aunque son dos fenómenos diferentes. En este componente se debe
identificar el estado de madurez fisiológico de la planta (floración, antes de la floración, recién
germinado, como ejemplo)
 Corte o cosecha: Bajo este componente es que se indica la edad al momento del corte o cosecha.
En muchos cultivos, para los cuales se dan los rebrotes se puede indicar si es primero, segundo u
otro corte. Igualmente en otras latitudes se indica si el corte pertenece a determinada estación del
año.
 Grado o designación de calidad: Para ciertos granos o materiales se pueden dar indicaciones
más exactas sobre el grado o contenido de ciertos nutrientes importantes, para los cuales el
alimento es utilizado. Así tenemos que se puede indicar el nivel de proteína, fibra ácido detergente,
entre otros.
 Clasificación: Para la clasificación se utiliza un agrupamiento de los alimentos en función de
ciertas características muy particulares, las cuales no son rígidas en extremo. Hay circunstancias
donde un alimento bien pudiera ser clasificado o excluido de cierto grupo dada ciertas condiciones
al momento de su uso. Las clasificaciones utilizadas son:
► Forrajes secos y alimentos toscos (1): Esta clasificación incluye los henos, tanto de
gramíneas como leguminosas, algunos henos de cultivos de cereales, las pajas y residuos de
cosecha, rastrojos, y otros productos que tienen como característica principal poseer un
contenido de fibra cruda mayor al 18%. Este nivel de fibra es el que se utiliza para clasificar en
esta categoría todos los productos cuyo contenido en base seca exceda dicho nivel. También
forman parte de este grupo las cáscaras y vainas, el bagazo de la caña, las cascarillas y la
tuza del maíz
► Forrajes de fibra utilizados verdes (2): Se incluye en esta categoría todos los forrajes que
son utilizados frescos, aún cuando hayan sido cortados, ya que algunos autores incluyen en la
misma los pastos de corte. También se incluyen algunos residuos de cultivos alimenticios. Sin
embargo, se mantiene como parámetro para clasificarlos como forrajes el hecho de que en
base seca poseen más de 18% de fibra cruda. Tal como se mencionara anteriormente, hay
productos que son difíciles de clasificar, tal es el caso del ensilaje de maíz, el cual con un
contenido de fibra mayor al 18% posee un contenido de Nutrientes Digeribles Totales (NDT)
cerca de 70% lo que lo hace bastante digerible, a diferencia de los alimentos incluidos en esta
categoría. En el caso de las leguminosas, estas poseen un contenido de proteína cruda
superior en muchos casos al 20% y se clasifican en esta categoría.
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Harris, L., J. Malcon A. y E.W. Crampton. An International Feed nomenclature and methods for summarizing and using feed
data to calculate diets. Utah. Agr. Expt. Sta. Bul. 479. 1968
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
► Ensilajes (3): Como su nombre lo indica, aquí se incluyen todos los materiales que han sido
preservados mediante la técnica del ensilaje o fermentación anaeróbica. Existen ensilajes de
gramíneas, cereales como el maíz, sorgo y otros alimentos.
► Concentrados energéticos (4): a esta clasificación pertenecen todos los alimentos que
contienen menos de 20% de proteína cruda y menos de 18% de fibra cruda. Aquí se incluyen
los granos de cereales, subproductos de la molienda de los cereales, melazas, pulpas y
subproductos de cítricos, lípidos de origen animal y vegetal, suero, subproductos de
cervecería, desechos de algunas plantas de alimentos, frutas, vegetales, nueces, raíces y
tallos reservantes, desechos de panadería, banano de desecho, entre otros.
► Concentrados proteicos (5): Aquí pertenecen todos los alimentos con más de 20% de
proteína cruda. Existen dentro de esta categoría productos de origen animal como los son las
harinas de carne, de sangre y de carne y hueso, harinas de pescado, así como los
subproductos de animales como la gallinaza y la cerdaza. Entre los de origen vegetal tenemos
las harinas de las oleaginosas como la semilla de algodón, de soya, maní, entre otros. Se
incluyen las harinas de algas, algunos subproductos de la molienda de cereales, granos
desecados de la destilería y cervecerías, leguminosas deshidratadas, fuentes unicelulares por
bacterias, levaduras, así como los nitrogenados no proteicos como la urea.
► Suplementos minerales (6): Como su nombre lo indica a este grupo pertenecen todos los
productos que contienen los minerales necesarios en la alimentación animal, en sus diferentes
formas. Aquí se incluye la harina de hueso, de concha, entre otros.
► Suplementos vitamínicos (7): Al igual que en la clasificación anterior se incluyen todas las
formulaciones o productos que poseen un alto contenido, casi puro, de las diversas vitaminas
que se utilizan en la alimentación animal.
► Aditivos (8): Aquí corresponden la diversidad de productos, que aún cuando no aportan
ningún nutrimento a la alimentación animal, ayudan a ser más eficientes algunos aspectos del
metabolismo animal, aumentar el nivel de ingesta o prevenir ciertas enfermedades.
Número Internacional: Este se compone de 6 dígitos, X-XX-XXX, donde el primero corresponde
a su clasificación, y los demás son asignados de acuerdo a su inclusión dentro de la tabla de
composición de alimentos que norma la NRC, también se le conoce como el “Nombre Numérico”.
Este número es utilizado cuando se trabaja con sistemas de cómputo.
IV. PRESECADO Y MOLIENDA
Dependiendo del nivel de humedad del material colectado para muestra se deberá tener el cuidado de
poder disminuir el contenido de agua hasta niveles donde se pueda conservar en el laboratorio sin que el
material se deteriore hasta el momento de su análisis o para conservarlo para determinaciones futuras
adicionales. En el caso de materiales como heno, rastrojos, concentrados, granos cosechados y secados
previo almacenamiento, entre otros, que en su mayoría llegan al laboratorio con un 90 a 95% de materia
seca, pueden ser molidos directamente y el material puede ser conservado en frascos con tapa o en
bolsas plásticas con cierre hermético bajo condiciones normales de laboratorio o bodegas refrigeradas.
Estos recipientes deberán contar con una adecuada identificación y llevar un registro de las mismas en un
banco de datos. En la figura 1 se muestra un esquema del tratamiento de las muestras de acuerdo a su
nivel inicial de humedad.
Para los forrajes verdes, cosechados frescos, no se acostumbra guardarlos en su forma natural, por lo que
se someten a un presecado a temperaturas de 60 °C por aproximadamente 18 a 24 horas en hornos de
aire forzado caliente. Para el caso de muestras con altos niveles de humedad, tales como ensilajes,
subproductos de fermentación, pulpas, alimentos líquidos, inclusive aceites y grasas, entre otros, si no se
desea disminuir el nivel original de humedad deberán conservarse a temperaturas de congelamiento,
donde se eviten fermentaciones u oxidaciones adicionales por la presencia de bacterias, hongos, mohos y
oxígeno. Estos materiales por lo general poseen menos de 85% de materia seca. La reducción del
contenido de humedad de las muestras permite que se elimine el medio más general de reacción, el agua.
Una vez se disminuye la cantidad de agua libre es muy difícil que las reacciones ocurran, y si
adicionalmente se le reduce la temperatura ambiental, se reducen mucho más las posibilidades de que el
material sufra cambios mientras permanezca almacenado. Durante el presecado, se debe tener en cuenta
que no se ha eliminado totalmente el contenido de agua del material, lo que se elimina en gran parte es lo
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Figura 1. Esquema para la preparación de la muestra para
análisis.
que se conoce como agua libre. Esta pérdida de agua en el presecado deberá tomarse en cuenta cuando
se determine la humedad total, que se realiza a temperaturas cercanas a los 100 °C.
De manera general, todas las muestras que serán sometidas a análisis deben ser molidas. Los materiales
colectados en campo, en especial los forrajes, poseen partículas de gran tamaño, por lo que se debe
reducir su tamaño para realizar los análisis correspondientes. La reducción en el tamaño de las partículas
permite que la submuestra utilizada para el análisis sea representativa de todo el material colectado. En
muchos casos, existe la posibilidad de que el material pueda sufrir un calentamiento adicional en el molino,
por lo que se debe ser muy cuidadoso en el tamaño de partícula que se desea obtener y el tiempo que
tome la muestra en el molino. En este procedimiento se puede perder una cantidad adicional de humedad.
Para proceder a moler la muestra esta debe tener no más de un 12% de humedad, aproximadamente.
Las partículas grandes se reducen para que puedan colocarse en el molino, esto se puede realizar con
algún instrumento de acero inoxidable para no contaminar las muestras. Cuando las partículas de la
muestra son muy grandes, se aconseja molerlas inicialmente utilizando mallas que permitan obtener un
tamaño de partícula entre 4 a 6 mm. Por lo general, para la molienda final, se utilizan mallas en el molino
que permitan reducir el tamaño de las partículas entre 0.75 hasta 1 mm. En muestras que tengan
tendencia a perder humedad, la AOAC recomienda que se utilicen mallas de 2 mm, para minimizar el
tiempo en el proceso. El tipo de molino a utilizar dependerá del tipo de muestra y su nivel de humedad. El
molino de cuchillas o martillo trabaja bien para muestras con 80 a 85% de materia seca, sin embargo el de
bolas o tipo ciclón requiere que las muestras tengan entre 90 a 95% de materia seca para poder ser
molidas sin problemas. Una vez molida las muestras se procede a guardarlas en envase de vidrios o
bolsas plásticas a temperatura de laboratorio, donde se minimice su exposición al aire, calor y luz, y se
evite su deterioro. Finalmente se procede a la identificación apropiada de la muestra.
V. PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS
La determinación de la composición química de los alimentos utilizados en la alimentación animal se basa
en diversos procesos químicos que tienen como finalidad determinar cuantitativamente la presencia de
determinado elemento, compuesto o fracción de la estructura del material. En base a la composición, es
decir la presencia cuantitativa de un elemento, compuesto o fracción determinada, se realizan inferencias
sobre los beneficios que tiene determinado alimento sobre la nutrición animal. Hay otros tipos de análisis
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que permiten estimar la calidad del alimento, pero esto se considera como una evaluación un tanto
subjetiva y en muchos casos sus valores son relativos y no absolutos, pues solo permiten comparar el
valor de un alimento con respecto a otro o un grupo de alimentos. Adicionalmente, la composición
cuantitativa no refleja la eficiencia o el nivel de aprovechamiento con la cual el alimento es utilizado por
determinada especie. Factores como la digestibilidad, absorción y el uso a nivel tisular de cada nutrimento
de determinado alimento, consumido solo o combinado, varían entre las especies, y aún dentro de ellas,
para los diferentes estados fisiológicos de los animales. Por tal motivo, se han diseñado ensayos
biológicos que permiten medir la biodisponibilidad, o sea la cantidad de un nutrimento que el animal
realmente aprovecha. Estos métodos son generalmente más complicados y costosos.
A pesar de todo lo anterior, el análisis del alimento nos sirve de guía para determinar el nivel de
incorporación de un alimento en la formulación de raciones para cada especie, y conocer cuales son los
aportes en términos de nutrimentos y como poder complementarlos con otra fuente, ya sea natural o
artificial. La disponibilidad de nutrimentos en un alimento es esencialmente determinada por la
composición química del alimento: primero con respecto a la concentración de los componentes
disponibles y no disponibles y segundo a través de las estructuras orgánicas e inhibidores que pueden
limitar la disponibilidad de sus componentes con los cuales están asociados. Los análisis de laboratorio
son requeridos como un medio rápido y económico para el control de calidad de alimentos y predecir la
respuesta animal en diferentes situaciones de alimentación. Existen los análisis químicos y los de la
digestión in vivo e in vitro utilizando bacterias ruminales o enzimas. Esta última provee de estimaciones
más directas de digestibilidad pero es mas larga, cara y se indica que es menos reproducible.
El análisis proximal de la materia seca en uso por más de 100 años, se atribuye su desarrollo en
3
Alemania a Henneberg y Stohmann , y es conocido como el método Weende. El mismo consiste de los
siguientes pasos:
• Materia seca a los 100° C: Calentamiento de la muestra hasta un peso constante a temperaturas
por encima del punto de ebullición del agua (100 °C). Esto remueve el agua, por consiguiente la
pérdida de peso equivale al contenido de agua. Fuentes de error son el hecho de que cualquier
material que se volatiliza a esta temperatura se pierde (ensilajes u otros productos fermentados).
Algunos líquidos se oxidan cuando se calientan y por consiguiente aumentan de peso. Se utiliza la
determinación con tolueno, secado al vacío y secado en congelamiento, como métodos alternos.
• Lípidos: Extracción con éter del residuo para estimación de lípidos por 4 h. La pérdida de peso
luego del secado corresponde a los lípidos.
• Fibra Cruda: Reflujo del residuo del extracto etéreo por 30 m con ácido sulfúrico al 1.25% seguido
por 30 m con hidróxido de sodio al 1.25%. El residuo insoluble se seca, pesa e incinera, y la
materia orgánica insoluble se denomina fibra cruda, que está constituida por hemicelulosa,
celulosa y lignina insoluble.
• Determinación de nitrógeno: método del Kjeldhal. Pequeñas muestras son digeridas en ácido
sulfúrico concentrado y toda la materia orgánica es destruida. El nitrógeno en forma de sulfato de
amonio, luego es neutralizado con hidróxido de sodio, destilado y el amonio es llevado a una
solución ácida estándar y titulado.
• Cenizas: incineración por dos horas a 600° C. Las altas temperaturas pueden alterar la forma de
algunos minerales y pueden volatilizar algunos como el cloro, zinc, selenio y yodo.
• Extracto Libre de Nitrógeno: El cálculo de esta fracción se considera como la materia seca no
determinada por la suma del extracto etéreo, fibra cruda, cenizas y proteína (N x 6.25). compuesto
principalmente de carbohidratos altamente disponibles, tales como azúcares y almidón, pero
también puede contener hemicelulosa y lignina, especialmente en forrajes.
Este sistema es la base para los cálculos del NDT (Nutrientes Digeribles Totales) asumiendo lo siguiente:
• El extracto etéreo recolecta los lípidos y grasas que contienen 2.25 veces el contenido energético
de los carbohidratos
• Todo el nitrógeno está en forma de proteína que contiene 16% de nitrógeno
• La fibra cruda recolecta la porción fibrosa y material estructural menos digerible del alimento
• El extracto libre de nitrógeno representa carbohidratos altamente digeribles.
3
Maynard, L. A. y J. K. Loosli. Animal Nutrition. 6ta. Edición. McGraw Hill, 1973, McDonald, P., R. A. Edwards y J. F. Greenhalg.
Animal Nutrition. 2da. Edición. Longman, 1977 y Van Soest, P. J. Nutritional Ecology of the Ruminant. O & B Books, 1982.
8
Ninguna de las anteriores asunciones es cierta y el grado de error varía considerablemente, sin embargo
es uno de los métodos mas utilizados. El extracto etéreo incluye ceras, aceites volátiles, clorofila y
pigmentos con poco valor y no recupera los jabones en las heces que son la forma en la cual ácidos
grasos indigeribles son excretados. Los forrajes no poseen triglicéridos y los galactolípidos de las hojas
contienen menos energía que lo que implica el factor 2.25. Puede ser ignorado en el análisis de muchos
forrajes y alimentos para rumiantes. Los constituyentes nitrogenados incluyen: proteínas, ácidos nucleicos,
nitrógeno no proteico soluble en agua y fracciones muy insolubles asociadas con la lignina. El contenido
de nitrógeno de las plantas varía de 15 a 16%. La proteína verdadera solo representa el 70% del nitrógeno
del forraje y poco o nada del nitrógeno fecal. El nitrato no es convertido a sales de amonio por este
procedimiento. Muchos análisis de heces indican cantidades considerables de extracto libre de nitrógeno
pero ordinariamente no contienen carbohidratos hidrosolubles. Almidón insoluble es el único carbohidrato
no estructural que aparece en las heces y solo en grandes ingestas aparece con cantidades sustanciales.
El extracto libre de nitrógeno contienen los errores acumulados de todas las otras determinaciones.
Mayormente debido a la solubilidad y pérdida de lignina y hemicelulosa en la preparación de la fibra cruda.
Aún la celulosa no es totalmente recobrada y el comportamiento de diferentes materiales es variable.
Posteriormente, durante 1930 surge nuevamente el interés por el análisis de la fibra. Bajo el auspicio de
L.A. Moore se desarrolla el método de Van Soest que corrige un tanto las deficiencias en las
determinaciones de fibra cruda y el extracto libre de nitrógeno. Predecir el valor nutritivo a partir del
proximal es un problema, en especial con aquellos alimentos fibrosos. En este análisis se dividen los
nutrimentos que se encuentran en los tejidos vegetales en dos grandes compartimentos basado en su
disponibilidad nutricional, el contenido celular que es fácilmente disponible para todos los animales, y un
segundo compartimiento constituido por las paredes celulares las cuales son menos disponibles y cuya
digestibilidad es controlada por la concentración de lignina y celulosa. Este método puede repetirse con
mayor facilidad que el método de la fibra cruda, además aísla una fracción del alimento que generalmente
los animales utilizan en forma muy ineficiente. Existen otros métodos específicos y sofisticados para
determinar cada uno de los componentes químicos pero obviamente requieren de equipo sofisticado y son
más tediosos. Estos análisis sirven para complementar los análisis obtenidos por el método de Weende o
de Van Soest. El mismo autor indica “el carácter dual nutritivo de la materia seca de la planta (contenido
celular y constituyentes de la pared celular) contraindican el uso de un único factor para predecir la
totalidad de la digestibilidad de la materia seca”. Estos componentes son denominados “entidades
4
nutritivas” por Lucas (1961) debido a que estos dos componentes físicos tienen su propia disponibilidad
nutritiva característica.
En la figura 2 se muestra una comparación de cómo se distribuyen los constituyentes del tejido vegetal en
las diferentes fracciones según el análisis utilizado. Se debe indicar, que de acuerdo con el método de Van
Soest, es posible determinar el contenido de nitrógeno en cada una de las fracciones, y en cierta forma
determinar su biodisponibilidad. Métodos enzimáticos también han sido evaluados para analizar la
composición de los forrajes, en especial su componente fibroso. Uno de los métodos que está siendo
5
ampliamente aceptado es el desarrollado por el Dr. Abe , en el cual se utiliza -amilasa y una proteasa
para separa la fracción soluble o contenido celular (CC) de la fracción insoluble o pared celular (PC).
Posteriormente, se trata la fracción insoluble con una celulasa lo que separa una fracción de fibra
altamente digerible de una fibra de baja digestibilidad. En ambas fracciones se puede determinar la
fracción orgánica si ambas son incineradas y la diferencia de las cenizas se considera materia orgánica de
la fibra altamente digerible (Oa) y materia orgánica de fibra de baja digestibilidad (Ob), cuyas fracciones
6
sumadas nos proveen del contenido orgánico de la pared celular .
4
Mott, G.O. y J.E. Moore. Forage Evaluation Techniques in Perspective. Proceedings of the National Conference on forage
Quality Evaluation and Utilization, September 3-4, 1969, L-1-l-10.
Abe, T. The studying data of the Livestock Experiment Station. Vol. 2. 1988
6
Japan Livestock Technology Association. Technical Manual for Feed analysis. S. Tanabe, Ed., March, 2000.
5
9
Guía para Análisis de Muestras de Forrajes
Figura 2. Comparación entre Dos sistemas de Análisis de los Componentes de la Materia Orgánica del Forraje 7
Componentes del Forraje
Van Soest
Nitrogenado
Weende
No nitrogenado
Lípidos
8
Contenido Celular
(Solubles en Detergente
Neutro)
Extracto Etéreo
Nitrógeno No Proteico
Solubles en Agua
Proteína soluble
Pectina, Almidón
Extracto Libre
de Nitrógeno
Soluble en Ácido
Detergente
Constituyentes de la
9
Pared Celular (Fibra
Detergente Neutro)
Lignocelulosa
(Fibra Detergente Ácido)
Proteína Insoluble
Hemicelulosa
Nitrógeno Lignificado
Lignina Soluble en Álcali
Lignina insoluble
10
Fibra Cruda
Celulosa
11
7
Adaptado de Maynard, L. A. y J. K. Loosli. Animal Nutrition. 6ta. Edición. McGraw Hill, 1973 y Jurgens, M. H. Animal Feeding and Nutrition. Kendall/Hunt Publishing Company, 4ta. Ed.,
1978.
Incluyen azúcares, almidón, carbohidratos solubles, pectina, proteína, nitrógeno no proteico, lípidos, vitaminas y otros.
9
Incluye celulosa, hemicelulosa, lignina, sílice, proteína dañada por el calor
10
Determinada por incineración a 500° C
11
Soluble en H2SO4 al 72%
8
10
VI. DETERMINACIÓN DE LA MATERIA SECA
Es muy común que la gran mayoría de los alimentos utilizados en la alimentación animal cuando son
utilizados para la formulación de raciones posean cierto nivel de humedad. Este nivel de humedad varía
aún dentro de un mismo tipo de material debido a las condiciones donde se obtuvo. Así tenemos que en
los forrajes, de acuerdo a su madurez fisiológica van perdiendo humedad y se encuentra pastos con
contenidos elevados de humedad cuando jóvenes y con muy poca humedad cuando viejos. En los
subproductos agroindustriales, de acuerdo al procesamiento al cual son sometidos los materiales, la
pérdida de agua varía de acuerdo al método de extracción o secado. Igual sucede con el almacenamiento
de granos, que aunque se estandarizan, no todo el tiempo poseen el mismo grado de humedad.
Al tomar una muestra para analizar su composición es importante que la muestra no sufra deterioro o
alteraciones durante el tiempo que permanece en laboratorio para su análisis o mientras se guarde para
futuros análisis. Tal como se mencionara con anterioridad, la remoción de la humedad libre en el material
recién recolectado restringe la actividad enzimática y previene la actividad biológica de cualquier bacteria,
hongo u otro microorganismo presente en el material. Esto es quizás uno de los puntos mas importantes al
momento de acondicionar la muestra para su análisis. Por otra parte, la variabilidad en el contenido de
humedad dificulta un tanto la comparación que se pueda realizar entre los distintos materiales que se
utilizan en la alimentación animal. Por lo que resulta muy conveniente, expresar el contenido de
nutrimentos como porcentaje de la materia seca, o lo que se conoce como “Composición en Base Seca”.
Cuando se conoce el contenido original de humedad del material la composición se expresa como
“Composición Tal como Ofrecido” o “Composición en Base Fresca”.
A. MATERIA SECA PARCIAL O A 60 – 65 °C
Para la molienda de ciertos materiales y obtener el tamaño de partícula ideal para los análisis de
laboratorio, algunas muestras deben ser presecadas, así como también reducir su humedad para su
conservación. Para estos efectos se acostumbra secar la muestra en un horno de convección de aire
caliente a una temperatura de 60 -65 °C por 18 a 24 horas. Todas las muestras deberán ser procesadas
por duplicado. A continuación los pasos a seguir:
PROCEDIMIENTO




Todo el proceso debe realizarse en duplicado.
Use una bandeja de aluminio limpia.
Pese la bandeja de aluminio vacía con exactitud. P1
Agregue el material de muestra hasta que llene la bandeja y registre el peso de la bandeja mas la
muestra húmeda. P2
 Coloque la bandeja con la muestra húmeda en el horno de convección de aire forzado con
temperatura de 60 - 65 °C por un periodo no menor a las 18 horas.
 Luego del periodo indicado con anterioridad, retire la bandeja con la muestra parcialmente seca del
horno y colóquela sobre la mesa dejando que se equilibre con la humedad del aire del laboratorio por
lo menos durante 30 minutos.
 Pese la bandeja con la muestra parcialmente seca y registre este valor. P3
Peso (gramos)
Duplicado 1
Duplicado 2
P1. Peso de la bandeja vacía
P2. Peso de la bandeja mas la muestra fresca
P3. Peso de la bandeja mas la muestra parcialmente seca
P4. Peso de la muestra fresca (P2 – P1)
El contenido de humedad del material se determina por la diferencia de peso entre el material fresco y el
material parcialmente seco. Para obtener el contenido parcial de materia seca a 60 – 65 °C, utilice la
siguiente ecuación:
11
P -P
0
% DE MATERIA SECA A 60 C o PARCIALMENTE SECA 3 1 x100
P
4
El contenido parcial de humedad se obtiene por diferencia:
% DE HUMEDAD PARCIAL A 60O C  100 - % DE MATERIA SECA A 60O C
Con los pesos de los duplicados se obtiene un promedio, y ambos no deben variar mas de 1.5% de la
diferencia de ambos valores. Esta muestra parcialmente seca es molida y se conserva, debidamente
identificada, en envases de vidrio con tapa o en bolsas de plástico con cierres herméticos, para los futuros
análisis.
Las muestras no son secadas a 105 °C para extraer totalmente la humedad desde su inicio debido a que a
dicha temperatura se pueden provocar reacciones indeseables, tales como la Reacción de Maillard o de
12
empardecimiento , donde los grupos aminos de los aminoácidos, proteínas y aminas, tal como el -amino
de la lisina pueden llegar a reaccionar con carbohidratos, aldehídos y cetonas ligándose, y alterando los
resultados posteriores. Las reacciones subsecuentes como los rearreglos de Amadori y la formación de los
pigmentos de melanoidinas dan como producto final el empardecimiento de los alimentos.
B. MATERIA SECA TOTAL O A 105 °C
La remoción parcial de la humedad libre del material permite la conservación del mismo disminuyendo su
deterioro o alteraciones químicas. No obstante el material aún conserva cierto nivel de humedad que esta
ligada a ciertas estructuras y compuestos, la cual debe ser removida para determinar con exactitud el
contenido total de agua del material. En el caso de materiales que no han sido presecados a 60 – 65 °C y
que han sido molidos, se puede realizar la determinación de la humedad total directamente. Para
determinar el contenido total de humedad proceda con los siguientes pasos:
PROCEDIMIENTO
 Todo el proceso debe realizarse en duplicado.
 Coloque un crisol de porcelana con tapa con capacidad de 50 ml en un horno de convección de aire
forzado a 105 °C por 16 horas por lo menos. Si las muestras no serán utilizadas para la
determinación de cenizas, se pueden utilizar pequeños envases de aluminio no muy profundos con
tapa, de aproximadamente 50 mm de diámetro y 40 mm de profundidad.
 Remueva el crisol de porcelana del horno, utilizando pinzas de metal, y lo coloca en un desecador, el
cual debe poseer un agente secante en el fondo. Coloque la tapa del desecador sin cerrarlo
completamente. Si lo cierra completamente provocara un vacío dificultando la remoción posterior de
la tapa. Espere por lo menos dos minutos y proceda a colocar la tapa de manera que cierre
herméticamente el desecador. Espere cinco minutos para que se enfríe el crisol.
 Remueva el crisol y su tapa del desecador con unas pinzas de metal y proceda a registrar su peso.
El peso debe registrarse en una balanza analítica hasta cerca del 0.0001 g. P1
 Sin remover el crisol de la balanza, agregue con cuidado 2 g de muestra y registre el peso con la
mayor exactitud hasta 0.0001 g. P2
 Retire el crisol de la balanza y lo coloca en un horno de convección de aire forzado a 105 °C durante
13
24 horas. Algunos procedimientos indican un término de 3 horas solamente.
 Al final del periodo de secado, remueva el crisol del horno y lo coloca cerrado con su tapa en un
desecador, con las mismas precauciones indicadas con anterioridad. Déjelo enfriar.
 Registre el peso del crisol mas la muestra seca con exactitud hasta 0.0001 g. P3
12
13
Eskin, N.A.M., H.M. Henderson y R.J. Townsend. Biochemistry of Foods. Academic Press, New York. 1971
Undersander, D., D.R. Mertens and N. Thiex. Forage Analyses Procedures. National Forage Testing Association, 2001.
www.foragetesting.org
12
El contenido de humedad del material se determina por la diferencia de peso entre el material fresco y el
material seco. Para obtener el contenido de materia seca a 105 °C, utilice la siguiente ecuación:
PORCENTAJE DE MATERIA SECA A 1050 C
P3 - P1
x100
P4
Peso (gramos)
Duplicado 1
Duplicado 2
P1. Peso del crisol vacío
P2. Peso del crisol mas la muestra fresca
P3. Peso del crisol mas la muestra seca
El contenido de humedad se obtiene por diferencia:
% DE HUMEDAD A 105O C  100 - % DE MATERIA SECA A 105O C
Tal como en el caso anterior, la diferencia de los valores de los pesos de los duplicados no deben superar
mas del 1.5% de las diferencias de ambos con el promedio. Estas muestras secas se conservan en los
crisoles para la determinación del contenido de cenizas. No obstante, estas muestras no deben utilizarse
para la determinación de la fibra, lignina o nitrógeno insoluble en la fibra ácido detergente. Igualmente, en
este procedimiento se pierden compuestos volátiles, en especial de los ensilajes.
C. MATERIA SECA TOTAL A 135 °C
En algunos casos un procedimiento más rápido para la determinación de la materia seca total es aceptado
14
por la AOAC . En este caso las muestras son colocadas en hornos de convección de aire caliente a
temperatura de 135 °C. Este procedimiento no se recomienda para muestras donde se desea realizar
análisis de lípidos, o en materiales con urea, alto contenido de azúcares, materiales ensilados, productos
lácteos con contenido de azúcar mayor al 4% o productos que contengan algunos de estos compuestos,
debido a que pueden ocurrir reacciones que alteren la muestra y además puedan provocar la pérdida de
material dada la elevada temperatura utilizada durante el análisis. Para determinar la humedad por este
procedimiento siga los siguientes pasos:
PROCEDIMIENTO
 Coloque un pequeño envase de aluminio no muy profundo con su respectiva tapa en un horno de
convección de aire forzado a 135 ° C por 2 horas por lo menos.
 Remueva el envase de aluminio y su tapa, utilizando pinzas de metal, y lo coloca en un desecador, el
cual debe poseer un agente secante en el fondo. Coloque la tapa del desecador sin cerrarlo
completamente. Si lo cierra completamente provocara un vacío dificultando la remoción posterior de
la tapa. Espere por lo menos dos minutos y proceda a colocar la tapa de manera que cierre
herméticamente el desecador. Espere cinco minutos para que se enfríe el envase de aluminio.
 Remueva el envase de aluminio y su tapa del desecador con unas pinzas de metal y proceda a
registrar su peso. El peso debe registrarse en una balanza analítica hasta cerca del 0.0001 g. P1
 Sin remover el envase de aluminio de la balanza, agregue con cuidado 2 g de muestra y registre el
peso con la mayor exactitud hasta 0.0001 g. Remueva la muestra hasta que se distribuya
uniformemente en el fondo del envase. P2
 Retire el envase de aluminio de la balanza y lo coloca en un horno de convección de aire forzado a
135 °C durante 2 horas, sin colocarle la tapa.
14
13
 Al final del periodo de secado, remueva el envase de aluminio del horno, le coloca la tapa y lo coloca
en un desecador, con las mismas precauciones indicadas con anterioridad. Déjelo enfriar.
 Registre el peso del envase de aluminio con tapa mas la muestra seca con exactitud hasta 0.0001 g.
P3
El contenido de humedad del material se determina por la diferencia de peso que se da entre el material
fresco y el material seco luego del secado en el horno. Para obtener el contenido de materia seca a 135 °C,
utilice la siguiente ecuación:
P -P
PORCENTAJE DE MATERIA SECA A 1350 C 3 1 x100
P4
Peso (gramos)
Duplicado 1
Duplicado 2
P1. Peso del envase de aluminio vacío
P2. Peso del envase de aluminio mas la muestra fresca
P3. Peso del envase de aluminio mas la muestra seca
Al igual que en casos anteriores el contenido de humedad se obtiene por diferencia:
% DE HUMEDAD A 135O C  100 - % DE MATERIA SECA A 135O C
D. DETERMINACIÓN DE HUMEDAD POR DESTILACIÓN CON TOLUENO
Algunas muestras poseen una cantidad variable de compuestos volátiles, los cuales pueden eliminarse si
la muestra se calienta a las temperaturas utilizadas para determinar materia seca en hornos de convección
de aire forzado. En muchos casos estas pérdidas pueden ser insignificantes, mientras que para otras
puede resultar elevada, y se puede sobreestimar el contenido de humedad. Este es el caso de los
ensilajes, donde si se coloca el material en un horno convencional se pueden peder los ácidos acético,
propiónico y butírico, así como el amonia. Igualmente, algunos carbohidratos se pueden descomponer y
las proteínas pueden ligarse y formar compuestos insolubles en otros materiales.
Para evitar este tipo de errores en la determinación de humedad se utiliza el método de destilación por
tolueno o método de Dean y Stark. En este caso, se toma en consideración que el solvente y el agua son
inmiscibles, que el solvente posea un punto de ebullición mayor que el agua, sea menos denso que el
agua y seguro de utilizar. Durante la destilación, el tolueno y el agua del material se evaporan y condensan
en conjunto, y los ácidos grasos volátiles u otro material volátil permanece en la muestra, disueltos en el
solvente orgánico, lo que permite que no se sobreestime el contenido de humedad del material. Algunos
autores indican que la humedad remanente, cerca de 3 a 5%, son el equivalente de la pérdida de ácidos
15
grasos volátiles durante el secado convencional . Para el procedimiento se indica lo siguiente:
PROCEDIMIENTO
 Conecte un balón de fondo redondo con capacidad de 250 ml y un destilador Leibig de 500 mm de
altura a un recibidor de humedad tipo Bidwell-Sterling con un recibidor de 5 ml de capacidad. Ver
figura 3.
15
Undersander, D., D.R. Mertens and N. Thiex. Forage Analyses Procedures. National Forage Testing Association, 2001.
www.foragetesting.org
14
 Destile una cantidad conocida de agua para determinar la exactitud de la
columna hasta 0.01 ml.
 Se limpia el tubo receptor y el condensador con una mezcla de ácido
crómico, luego con suficiente agua, luego alcohol y finalmente lo seca al
horno para eliminar todo vestigio de agua.
 Pese suficiente cantidad de muestra que le permita extraer por lo menos
de dos a cinco mililitros de agua de la muestra. El peso debe ser exacto
con una exactitud de 0.0001 g.
 Introduzca la muestra en el balón y agregue suficiente tolueno grado
analítico hasta cubrir completamente la muestra.
 Llene el tubo recibidor con tolueno, agregándolo por la parte superior del
condensador.
 Caliente hasta el punto de ebullición y destile lentamente,
aproximadamente dos gotas por segundo, hasta que toda el agua haya
sido extraída, y luego eleve la tasa de destilación hasta cuatro gotas por
segundo.
 Cuando toda el agua haya sido aparentemente extraída, lo que puede
tomar cerca de una hora, lave el condensador adicionando tolueno desde
la parte superior y continúe la destilación para ver si se destila alguna
cantidad adicional de agua. Si ocurre, repite la operación.
 Si permanecen algunas gotas de agua en el condensador, remuévalas
cepillando el interior del condensador con un cepillo saturado con tolueno,
lavando igualmente con tolueno.
 Deje que el contenido se enfríe a temperatura ambiente. Fuerce cualquier
gota de agua hacia el recibidor utilizando un alambre de cobre cubierto con
una banda de hule al final
 Mide el volumen de agua con exactitud de 0.1 ml, y realice los cálculos
para obtener el porcentaje de humedad.
PORCENTAJE DE MATERIA SECA  (1 
Figura 3 Esquema del
sistema para
determinación de
humedad por
destilación con
tolueno.
Volumen de agua (ml)
)x100
Peso de la Muestra (g)
El porcentaje de humedad se obtiene por diferencia.
% DE HUMEDAD  100 - % DE MATERIA SECA
E. MÉTODOS ADICIONALES PARA DETERMINAR HUMEDAD
A lo largo de los años se han desarrollado nuevos métodos para determinar el contenido de humedad de
los alimentos. El uso de cada uno de los métodos dependerá del tipo de material y de las facilidades con
que se cuente en el laboratorio. Lo importante es mantener un procedimiento confiable y que sea
reproducible para poder obtener resultados exactos y precisos. Entre los métodos aprobados por la AOAC
16
esta el Espectroscopia utilizando la reflexión de ondas del Infrarrojo cercano (NIRS) . Otro método
es el de Karl Fischer, en el cual el agua se extrae de la muestra con metanol y se titula con el reactivo de
Karl Fischer. El método se basa en la siguiente reacción:
2H2O + SO2 + I2  H2SO4 + 2HI
Debido a que el HI es incoloro y el I2 es de color rojizo, este cambio en coloración permite determinar la
reacción del agua con los reactivos. Para evitar la pérdida de SO 2 y I2 de la solución, se le agrega piridina.
16
15
Se han propuesto métodos donde se utilizan microondas. Este método igualmente no es adecuado para
muestras que se desean analizar para fibra, lignina y análisis insoluble de nitrógeno en fibra o para NIRS.
Para este caso se requiere que el microondas posea un mínimo de 600 watts, con bandeja giratoria
preferiblemente. Las muestras son colocadas una y otra vez por espacio de tres minutos,
aproximadamente, hasta que no se registre cambio de peso. Existen algunos microondas que tienen
integrado una balanza de manera que se pueda monitorear el cambio de peso de las muestras.
Existe el método donde se coloca la muestra debajo de una lámpara infrarroja. En este caso, como la luz
puede penetrar el material, el agua al absorber la energía se evapora y el cambio de peso se registra
como pérdida de humedad. No obstante, en este procedimiento se debe estandarizar hasta la distancia de
la lámpara a la muestra así como el tamaño de la muestra para obtener resultados reproducibles. Es un
método relativamente rápido, donde se puede tardar entre 10 a 25 minutos para determinar el contenido
de humedad.
Para el caso de muestras con alto contenido de humedad se utilizan hornos de convección de aire forzado
caliente pero con reducción en la presión interna, por lo general debajo de 50 mm de Hg. Esto tiene la
ventaja de poder reducir la temperatura del aire hasta 70 °C, minimizando reacciones indeseables entre
los componentes de los alimentos. Igualmente existe el procedimiento de “Secado en congelamiento” o
liofilización. En este procedimiento el agua se sublima en cámaras donde se controla la temperatura, un
condensador donde se atrapa el agua que se remueve del producto, un sistema de refrigeración y un
sistema de vacío para reducir la presión dentro de la cámara. En el procedimiento es importante
inicialmente congelar el agua libre del producto, la manera lenta o rápida de congelamiento afecta el
tiempo inicial de secado. Luego al material se le reduce la presión en la cámara y se calienta para que el
agua se sublime. Esto se debe realizar lentamente para que no se pierda material por el movimiento del
vapor de agua, y si se calienta muy rápido el material puede fundirse o colapsar. Luego que el agua libre
se ha evaporado se eleva la temperatura para evaporar el agua ligada y se realiza a la máxima capacidad
de vacío del equipo.
También hay sondas térmicas, hay sondas que utilizan la conductancia eléctrica, y otras, de las cuales
algunas están aún en prueba y no han sido aprobadas oficialmente. No obstante, en algunas industrias las
utilizan por su versatilidad y rapidez.
F. DETERMINACIÓN DE HUMEDAD EN DOS PASOS
Este procedimiento es cuando se utiliza el presecado de la muestra, a temperaturas  60 °C, que se
denomina materia seca parcial, y luego se somete la muestra u otra porción de la muestra a la extracción
total de agua por otro método, en particular los de horno de convección forzada con aire caliente a
temperaturas  105 °C durante periodos de mas de 16 horas o a 135 °C por menos tiempo, por lo general
no mas de dos horas. En este caso, la cantidad total de humedad de la muestra bajo análisis se obtiene
multiplicando el porcentaje de humedad obtenido durante el presecado por el contenido de humedad
obtenido en el segundo paso o secado total. Como ejemplo, utilizamos la materia seca parcial a 60 °C y la
obtenida a 105 °C.
% TOTAL DE MATERIA SECA % DE MATERIA SECA A 60O C x % DE MATERIA SECA A 105O C
El contenido de humedad se obtiene por diferencia:
PORCENTAJE DE HUMEDAD 100 - PORCENTAJE TOTAL DE MATERIA SECA
16
VII. DETERMINACIÓN DE CENIZAS
Los minerales que están presentes en los alimentos, de muy diversas formas, constituyen la materia
denominada inorgánica, la cual se obtiene como residuo de la incineración del material o cenizas. El
residuo de la incineración puede variar de acuerdo con el grado de contaminación de la muestra, una
muestra altamente contaminada con suelo u otro material mineral nos da como resultado un alto contenido
de cenizas. Dado que la cantidad de cenizas formará parte del total de la materia seca, una alteración en
su porcentaje afectará la composición estimada de los demás nutrimentos que conforman el alimento.
El procedimiento para determinar las cenizas requiere que el material se incinere a temperaturas entre los
500 y 600 °C, temperatura a la cual algunos minerales se volatilizan, tales como el yodo y el selenio.
Igualmente se recomienda que no se utilice este procedimiento para materiales con alto contenido de
azúcares o líquidos. Siga el siguiente procedimiento para la determinación de cenizas:
PROCEDIMIENTO
 El crisol y la muestra seca utilizada para la determinación de humedad a 105 o 135 °C se coloca en
un incinerador frío, donde se ha preestablecido como temperatura máxima los 600 °C.
 Si no se ha realizado la determinación de humedad de la muestra y se hará directamente la
determinación de cenizas, realice lo siguiente:
 Coloque un crisol de porcelana en un incinerador a 600 °C por espacio de dos horas.
 Retire el crisol del incinerador y déjelo enfriar por aproximadamente 60 m en un desecador y
determine con exactitud su peso hasta 0.0001 g. P1
 Coloque el crisol en una balanza analítica y agregue aproximadamente 2 g de muestra con
exactitud de 0.0001 g. P2
17
 Coloque el crisol con la muestra en el incinerador , cierre la puerta y encienda el incinerador.
 Cuando la temperatura alcance los 600 °C deje las muestras por espacio de dos horas.
 Apague el incinerador y deje que la temperatura descienda por debajo de los 200 °C.
 Con mucho cuidado abra la puerta del incinerador para no crear corrientes de aire y remueva los
crisoles hacia un desecador, utilizando pinzas y guantes de asbesto, para que se enfríen. Esto puede
durar cerca de una hora.
 Pese los crisoles mas las cenizas con exactitud hasta 0.0001 g y realice los cálculos para obtener el
porcentaje de cenizas. P3
Peso (gramos)
Duplicado 1
Duplicado 2
P1. Peso del crisol vacío
P2. Peso del crisol mas la muestra fresca o parcialmente seca
P3. Peso del crisol mas la cenizas
P4. Peso de la muestra fresca o parcialmente seca (P2 – P1)
PORCENTAJE DE CENIZAS
P3 - P1
x100
P4
Si la muestra no ha sido presecada, el cálculo anterior nos brinda el Porcentaje de Cenizas Tal como
Ofrecido o en Base Fresca, para obtener el Porcentaje de cenizas en base seca cuando utilizamos una
muestra que ha sido presecada o parcialmente seca a 60 °C, se deberán realizar los correctivos para
ajustar el contenido y se debe realizar la siguiente operación:
% DE CENIZAS EN BASE SECA
17
% DE CENIZAS PARCIALMENTE SECA
x 100
% DE MATERIA SECA A 105o C
En algunos casos se recomienda precalentar e incinerar la muestra en una campana sobre una plancha caliente hasta que deje de
emanar humo y luego se transfiere al incinerador. Esto aumenta la manipulación de la muestra y puede aumentar
el grado de error.
17
VIII. DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO
En muchas partes este análisis es conocido como el de determinación de proteína cruda, debido a que
por convención, el porcentaje de nitrógeno determinado en el análisis se multiplica por el factor 6.25 para
obtener el porcentaje de proteína cruda. Este factor esta relacionado con el hecho de que la proteína, en
términos generales, contiene un 16% de nitrógeno, por lo que el factor se obtiene de la relación 100/16.Sin
embargo, es conocido que esto no es tan cierto, puesto que se conoce que el porcentaje de nitrógeno en
las proteínas varía desde un 15.5 hasta un 18%, por lo que habría que aplicar un factor diferente para
cada tipo de proteína. Como ejemplo tenemos que el complejo de proteínas de la leche da 15.7% en
promedio, por lo que el factor debe ser 6.38, en cambio en la harina de trigo es de 17.5% por lo que el
18
19
factor debe ser 5.71 , para otros granos es 6.25, para arroz es 5.95, y un valor de 3.44 para la cafeína.
20
Adicionalmente, en el procedimiento conocido como Método Kjeldhal , todo el nitrógeno presente en la
muestra, exceptuando los nitratos y nitritos, se convierten en amonio que a su vez es liberado del medio
de reacción en forma gaseosa y atrapado con un ácido débil para su titulación. Esto implica que el
nitrógeno determinado de esta manera, y expresado como proteína cruda, estaría disponible para los
animales, sin embargo, los animales de estómago simple o monogástricos no pueden hacer un uso
eficiente de todas las formas de nitrógeno, y requieren específicamente de ciertos aminoácidos presentes
en la proteína verdadera, estos son los denominados aminoácidos esenciales. Para el caso de los
animales de estómagos compuestos o rumiantes, esta determinación se relaciona mucho mejor con la
capacidad que tienen estos animales de utilizar la gran diversidad de fuentes de nitrógeno gracias al
fenómeno de fermentación ruminal que realizan las bacterias y otros organismos que habitan el retículorumen. Entre los compuestos nitrogenados de tipo no proteico que se incluyen en esta determinación
están las amidas, sales de amonio y la urea, entre otros.
El método de análisis para la determinación del nitrógeno involucra básicamente tres pasos. El primero
implica la digestión de la muestra donde el nitrógeno de la materia orgánica se descompone por la acción
de una solución concentrada de ácido. Esto se logra por el calentamiento de la muestra en ácido sulfúrico,
obteniéndose una solución de sulfato de amonio. En el segundo paso ocurre la destilación donde al
agregar un exceso de una base, el amonia iónico se convierte en amonia gaseoso el cual se libera del
medio por ebullición y el gas se condensa y atrapa en una solución con un ácido débil. Finalmente, el
tercer paso implica la titulación donde se cuantifica la cantidad de amonio presente en la solución
resultante. En el caso de la titulación esta la determinación directa y la indirecta, en esta última se utiliza,
por lo general, ácido bórico. La serie de reacciones que toman lugar durante la determinación de nitrógeno
en los alimentos son:
MATERIA ORGÁNICA CON N  H2SO4  (NH4 )2 SO4  H2O  CO2  OTROS SUBPRODUCT OS
(NH4 )2 SO4  2NaOH  2NH4OH  Na 2SO4
Calor
NH4OH  
 NH3   2H2O
NH3  H3BO3  (NH4 )H2BO3  H3BO3 (exceso)
(NH4 )H2BO3  HCl  H3BO3  NH4Cl
El equipo diseñado para este análisis ha variado en los últimos años, no obstante el método convencional
utiliza los balones tipo Kjeldhal, hornillas para calentar durante la digestión y destilación, el sistema de
condensación y recolección de amonia y los erlenmeyer, llevándose a cabo el proceso de digestión y
destilación bajo una cámara de gases.
18
Maynard, L.A., J.K. Loosli, H.F. Hintz y R.G. Warner. Nutrición Animal. 7ª. Ed. 4ta. En Español. McGraw-Hill.1998.
Labconco Corporation. Guide to Kjeldahl Nitrogen Determination Methods and Apparatus. 2-41-9/98-JCON-5M-R3. Kansas
City, Missouri. 1998
20
El científico danés Johan Kjeldahl introdujo este análisis en 1883.
19
18
1
2
8
6
3
4
7
5
6
Figura 4. Esquema de sistema integrado para análisis de nitrógeno por el
método de Kjeldhal.
1. Termostato o controlador de temperatura
2. Sistema de condensación
3. Abanico del sistema de extracción de gases
4. Plataforma para sostener erlenmeyer receptores de destilado
5. Sistema de extracción de gases
6. Calentadores eléctricos
7. Cámara externa del sistema
8. Bulbo conector separador de gases y líquidos
En la Figura 4 se muestra un
sistema integrado para análisis
de nitrógeno utilizando el método
21
de Kjeldhal . Como se observa
en la figura 4, en la parte inferior
están los calentadores eléctricos
(6) sobre los cuales se colocan
los balones con la muestra, el
H2SO4,
la
mezcla
de
catalizadores y las perlas de
ebullición u otra material utilizado
para evitar el sobrecalentamiento
y saltos durante la ebullición de la
mezcla. Los balones se apoyan
inclinados sobre un sistema de
extracción de gases (3, 5). Esta
parte constituye el complejo de
digestión de la muestra.
En la parte superior del sistema
se encuentra otra serie de
calentadores eléctricos (6) sobre
los cuales se colocan los balones
con la muestra digerida. Estos
balones se unen al sistema de
condensación (2), en cuyo
extremo posterior e inferior, tal
como se muestra en el esquema
sobre una plataforma (4) reposan
los erlenmeyer que contienen el ácido bórico con los indicadores que
recibirán el destilado con el amonia. En la parte superior de los balones
Kjeldhal se encuentran unos bulbos conectores (8) que permiten la
separación de los gases que se condensaran y el líquido que se pueda
formar antes de la condensación. En este esquema integrado se indica la
cabina o cámara (7) donde se encuentra el sistema, así como parte del
sistema de ventilación y extracción de gases (3, 4).
También existe un procedimiento similar pero denominado MicroKjeldhal,
donde se utilizan menores cantidades de muestra, pero el procedimiento
implica los mismos pasos que cuando se utilizan mayores cantidades de
muestra. El uso de menores cantidades de muestra en el análisis implica
que esta debe representar con bastante exactitud toda la cantidad de
alimento que se va a utilizar. Se indica que para este tipo de análisis es
crítico el tamaño y la uniformidad de la muestra que se va a analizar,
puesto que se puede alterar los resultados significativamente. En la
figura 5 se muestra el aparato utilizado para la destilación con este
método. Igualmente, para este proceso los balones de digestión son de
21
Figura 5. Sistema para
destilación por método
MicroKjeldhal.
Adaptado de: Labconco Corporation. Guide to Kjeldahl Nitrogen Determination Methods and Apparatus. 2-41-9/98-JCON-5MR3. Kansas City, Missouri. 1998
19
menor capacidad, de aproximadamente 30 a
100 ml, capacidad menor a la de los utilizados
en el sistema macro.
Igualmente, se han diseñado nuevos sistemas
para la digestión de la muestra. En estos
sistemas, en lugar de utilizar los balones
Kjeldhal se utilizan tubos que son colocados en
bloques que alcanzan altas temperaturas
permitiendo la descomposición de la muestra
Figura 6. Bloques para calentamiento de tubos utilizado para
la digestión de muestras para análisis por el
método Kjeldhal.
en el medio ácido. Estos son denominados digestores
rápidos debido a que el tiempo de digestión varía entre
25 a 45 minutos dependiendo del tipo de muestra y el
tipo de catalizador. En la figura 6 se muestra uno de
estos sistemas. En la figura se aprecian los tubos
utilizados y algunos elementos adicionales del sistema
de control de calor.
Con este sistema se ha automatizado igualmente el
sistema de destilación. En este sistema en un circuito
cerrado, donde se mantienen reservorios con las
soluciones, se agrega el agua, el NaOH, y se genera el
vapor para la destilación, y se recoge el destilado en un
erlenmeyer, donde por ajuste gravimétrico, se suspende
la destilación cuando se alcanza determinado volumen.
En la figura 7 se muestra uno de estos sistemas
automatizados donde la destilación puede tomar de
cinco a diez minutos por muestra, solamente.
Figura 7. Destilador automatizado para el análisis
Kjeldhal.
A continuación se indican los reactivos que se utilizan
en el análisis de nitrógeno por el método Kjeldhal,
donde se utiliza el CuSO4 como catalizador y el ácido bórico al 4% como solución para “atrapar” el amonia
producto del proceso de digestión y destilación.
REACTIVOS:
 Ácido Sulfúrico: Se utiliza ácido sulfúrico concentrado con pureza de 96 a 98%, grado analítico, d =
1.84.
 Hidróxido de sodio al 40%: Disuelva lentamente cerca de 400 g de NaOH bajo en N en agua, deje
enfriar y diluya hasta completar un litro de solución. También puede utilizar una solución de NaOH
con d  1.36
 Ácido Bórico al 4%: Disuelva cerca de 400 g de ácido bórico en agua destilada y adicionar 170 ml
de la mezcla de solución indicadora y lleve todo hasta diez litros de solución.
 Solución indicadora: Disuelva 0.1 g de verde de bromocresol en 100 ml de etanol y 0.1 g de rojo de
metilo en 100 ml de etanol. Mezcle 70 ml de la solución de rojo de metilo con 100 ml de la solución
de verde de bromocresol. Esta mezcla final se agrega y a diez litros de ácido bórico.
20
 Ácido Clorhídrico 0.1 N: Disuelva lentamente cerca de 86.0 ml de ácido clorhídrico 36.5 a 38.0% en
un litro de agua, luego diluya todo hasta 10 litros de solución. Estandarice esta solución de la
siguiente manera:
 Tome 40 ml de la solución ácida a estandarizar con una pipeta volumétrica de 40 ml y descártela.
Esto es para lavar la pipeta.
 Tome una alícuota de 40 ml de la solución ácida a estandarizar y transfiérala a un erlenmeyer de
250 a 300 ml que ha sido lavado con agua libre de CO2. Haga esto en triplicado.
 Lave una bureta con NaOH estandarizado con aproximadamente la misma concentración del
ácido que se va a estandarizar. Llene la bureta con la solución de NaOH y espere, por lo menos
un minuto, hasta que repose el líquido de las paredes y tome la lectura inicial. Recuerde siempre
leer la bureta al nivel del ojo y en el borde inferior del menisco.
 Utilice el indicador que se utilizara en el método de Kjeldhal para titular en la solución ácida.
Agregue gota a gota la solución de NaOH, siempre con agitación.
 Titule hasta el cambio de coloración de rojo a naranja a amarillo.
 Cuando ha logrado el punto final, remueva cualquier gota de la punta de la bureta y lave los lados
del erlenmeyer con agua libre de CO2 y observe si la coloración persiste. Si no persiste agregue
otra gota de NaOH y verifique el color.
 Calcule la normalidad y ajuste con HCl o agua si fuese necesario. Mezcle y verifique la
estandarización según lo indicado con anterioridad.
 Solución de NaOH 0.1 N: Diluya cerca de 54 ml de una solución 1:1 p/p de NaOH en agua destilada
libre de CO2 para obtener 10 litros de solución. Estandarice esta solución de la siguiente manera:
 Pese con la mayor exactitud cerca de 0.4 g de Ftalato ácido de potasio seco y transfiéralo a un
erlenmeyer de 300 ml.
 Añada 50 ml de agua destilada libre de CO2 y disuelva completamente.
 Titule hasta pH 8.6 con la solución a ser estandarizada utilizando ya sea electrodos de vidrio o
fenolftaleína. Para el caso de utilizar fenolftaleína, añada tres gotas a un recipiente que contenga
50 ml de solución amortiguadora con pH 8.6 y tápela. Este recipiente se utilizara como referencia
del punto final para un pH de 8.6 en la titulación.
 Determine el volumen requerido para lograr el punto final en una solución blanco que contenga 50
ml de agua libre de CO2 y tres gotas de fenolftaleína.
 Reste el volumen necesario para titular el blanco del volumen utilizado para titular el Ftalato ácido
de potasio y calcule la normalidad. Esta normalidad debe estar un poquito elevada.
 Ajuste a la concentración deseada, mezcle adecuadamente y verifique la estandarización de la
forma mencionada anteriormente.
 Catalizador: Se mezcla sulfato de potasio (K2SO4) y sulfato de cobre (CuSO45H2O) en una relación
de 9:1. También se puede mezclar 15 g de K2SO4 con 0.04 g de CuSO4 anhidro. En el caso de que
se utilice TiO2 como parte del catalizador, se mezclan 0.01 g de este reactivo con 16.7 g de K 2SO4 y
2223
0.01 g de CuSO4 anhidro.
Esta mezcla permite elevar la temperatura de ebullición del H 2SO4, de
330 a 390 °C aproximadamente, y acelerar la reacción de descomposición.
 Perlas de ebullición
 Piedra pómez
Para verificar la normalidad de las soluciones de NaOH y del HCl se deben realizar las siguientes
operaciones:
Normalidad de NaOH 
Normalidad de HCl 
22
23
g de KHC 8H 4 O 4 x 1000
ml de NaOH x 204.229
ml de NaOH estandarizada x Normalidad de NaOH estandarizada
ml de HCl en erlenmeyer
En el mercado se pueden obtener mezclas de catalizadores en tabletas. Dependiendo de las indicaciones del vendedor se pueden
utilizar de una hasta tres tabletas por muestra.
21
A continuación el procedimiento que se debe seguir para la determinación de nitrógeno utilizando ácido
bórico al 4% en la captura del amonia.
PROCEDIMIENTO
 En un papel filtro o encerado libre de Nitrógeno pese aproximadamente de 0.25 a 1.0 g de muestra
24
con exactitud de 0.0001 g.
 Coloque la muestra con el papel dentro del balón tipo Kjeldhal, evitando que se pierda algo de
muestra.
 Añada los catalizadores o la mezcla de ambos al balón. Se añade el equivalente de
aproximadamente 15.0 g de K2SO4 con 0.04 g de CuSO4 anhidro, u otra proporción seleccionada.
 Añada con mucho cuidado 20 ml de H2SO4 concentrado al balón y rote levemente el mismo para que
25
humedezca completamente el papel con la muestra. .
 Coloque las perlas de ebullición y piedra pómez. Esto es para evitar saltos bruscos del balón y
recalentamiento del mismo.
 Encienda el calentador de manera que la solución entre en ebullición en cinco minutos. Esta
temperatura es aquella que puede llevar 250 ml de H2O de 25 °C a ebullición en cinco minutos.
 Durante este periodo se observara un humo blanco dentro del balón, se pierde CO2, y la mezcla del
balón pasa de un color oscuro hasta quedar completamente clara o ligeramente verdosa, y se dejan
de emitir vapores.
 Continúe calentando por espacio de 90 minutos, dándole giros ocasionales al balón. Se podrá
observar la condensación de H2SO4 en el cuello del balón.
 Terminado el periodo, apague el calentador y deje enfriar los balones. Coloque los balones sobre
soportes adecuados y déjelos enfriar un poco mas.
 Aún tibios, agregue lentamente al balón aproximadamente 250 ml de H2O tratando de lavar las
paredes, y deje enfriar a temperatura ambiente. Asegúrese de que no se le han formado cristales en
el balón. Esto puede reducir la recuperación de nitrógeno, así como provocar bolsones de ácido que
reaccionan violentamente al agregarse el NaOH.
 Añada al balón lentamente, sin agitar, aproximadamente 20 ml de NaOH al 40%. No permita que se
caliente bruscamente la solución.
 Coloque el balón sobre el calentador del sistema de destilación y en el extremo opuesto del sistema
de condensación coloque un erlenmeyer con aproximadamente 25 ml de la solución de ácido bórico
e indicadores correspondientes, de manera que el extremo del tubo recolector quede inmerso en la
solución.
 Gire el balón de manera que la solución de NaOH se mezcle completamente con el contenido del
balón.
 Encienda el calentador y destile a una temperatura donde se logre el punto de ebullición en
aproximadamente 7.5 minutos.
 Destile hasta haber recolectado cerca de 150 ml de destilado. Retire el erlenmeyer de manera que la
punta del tubo recolector quede fuera de la solución pero no fuera del erlenmeyer. La solución debe
haber cambiado de un color rojo a verde.
 Apague el calentador, y siga recogiendo destilado por cerca de un minuto adicional hasta que cese
completamente. Si no retira el tubo recolector de la solución en el erlenmeyer, al enfriarse el
balón se dará un reflujo de solución del erlenmeyer hacia el balón y se perderá la muestra.
 Retire el erlenmeyer y titule el destilado con la solución estandarizada de HCl y calcule el porcentaje
de Nitrógeno en la muestra. Durante la titulación el color cambiara de color verde a un gris casi
transparente. Registre el volumen utilizado de ácido.
 Se debe correr blancos en duplicado donde se coloca igual cantidad de reactivos, inclusive hasta un
trozo del papel utilizado para pesar las muestras. En algunos casos se recomienda utilizar como
muestra lisina hidroclórica como patrón para realizar ajustes en los cálculos y verificar la confiabilidad
del proceso.
24
25
En algunos caso se recomienda utilizar de 0.3 a 0.7 g para alimentos, 0.2 a 0.5 para suplementos y 10 ml para orina.
Se recomienda añadir 1.0 ml adicional de H2SO4 por cada 0.1 g de grasa o cada 0.2 g de material si la muestra es mayor a 1.0 g.
22
 Al volumen utilizado para titular la muestra se resta el volumen utilizado en el blanco y calcule el
contenido porcentual de nitrógeno en la muestra.
% DE NITRÓGENO 
0.014 x [(ml de HCl de muestra - ml de HCl de blanco) x N de HCl]
Peso de la muestra (g)
Para el cálculo de proteína cruda se multiplica el contenido de nitrógeno por el factor 6.25 o en su defecto
el factor que mas se adecua al tipo de material analizado, según se indicó con anterioridad.
% DE PROTEÍNA CRUDA  % DE NITRÓGENO x 6.25
Para el cálculo del contenido de nitrógeno o proteína cruda en base seca se debe realizar el siguiente
ajuste:
% DE PROTEÍNA EN BASE SECA
% DE PROTEÍNA PARCIALMENTE SECA
x 100
En el caso de utilizar muestras que no han sido secadas parcialmente, solo se debe utilizar en lugar de %
de proteína parcialmente seca el valor obtenido directamente en el análisis y corregirlo por el contenido
de materia seca a 105 °C.
23
IX. DETERMINACIÓN DEL EXTRACTO ETÉREO
Al utilizar algún tipo de solvente orgánico se espera que los compuestos grasos o lípidos se disuelvan y
puedan ser removidos del material. No obstante, se conoce que otros compuestos, tales como ceras,
aceites volátiles, clorofila y pigmentos, que no aportan mucha energía a la nutrición de los animales,
también pueden ser extraídos con este procedimiento, por lo que de acuerdo a la cantidad presente de
estos compuestos se puede sobreestimar el aporte energético de la fracción de lípidos del alimento
evaluado.
El método para la determinación de la fracción de lípidos se basa en la evaporación continua de un
solvente orgánico, en muchos casos éter etílico, que luego de condensarse pasa por la muestra
extrayendo los materiales solubles. El extracto se recoge en un recipiente y el éter se destila y recoge,
dejando como residuo el extracto etéreo al cual se seca y se le determina el peso. Para el caso de algunas
muestras que poseen grandes cantidades de compuestos solubles en agua, tales como carbohidratos,
urea, ácido láctico, glicerol entre otros, se recomienda extraer cinco veces 2 g de la muestra con 20 ml de
26
agua en un pequeño papel filtro y secarla, antes de la extracción. El método anterior es conocido como
método directo, mientras que en el método indirecto el residuo se seca y se pesa, determinando el
porcentaje de extracto etéreo como el peso perdido en la muestra.
El análisis de extracto etéreo, dado el tipo de solvente que se utiliza, debe ser realizado en cámara
extractora de gases y tener mucho cuidado con el uso de cualquier material o equipo que pueda provocar
una combustión de manera accidental. A continuación se indican los pasos que se deben seguir para la
determinación del extracto etéreo por el método directo en la muestra:
PROCEDIMIENTO
 Un vaso químico, de aproximadamente 100 ml, diseñado para el aparato Goldfisch que se muestra
en la figura 8, se coloca en un horno a 105°C por espacio de dos horas como mínimo. Se deja enfriar
en un desecador y se obtiene su peso con exactitud de 0.0001 g. P1
 En el vaso químico se coloca de 30 a 40 ml del solvente orgánico que se va a utilizar. Se recomienda
no utilizar solventes cuyo punto de ebullición exceda los 85 °C.
27
28
 Para el caso del éter etílico este debe ser anhidro y libre de peróxidos o éter de petróleo.
 Se pesan cerca de 2.0 g de muestra con exactitud de 0.0001 g y se colocan en los dedales de
extracción a base de celulosa. P3
 Se puede colocar el dedal con la muestra en el horno a 105 °C por dos horas o secar una porción de
la muestra a esta temperatura previa al análisis.
 Coloque el dedal con la muestra dentro del extractor del sistema Goldfisch.
 Conecte el vaso al sistema, y active el sistema de enfriamiento para la condensación del éter, eleve y
encienda las hornillas. Las hornillas no necesariamente tienen que hacer contacto con el vaso
químico.
 Si se establece una tasa de condensación de cinco a seis gotas por segundo, el proceso puede
tomar cerca de cuatro horas. Durante este periodo verifique constantemente el volumen de éter y si
observa alguna disminución significativa por escape puede añadir, con mucho cuidado, una porción
adicional de éter al vaso químico.
 Luego de las cuatro horas, retire el calentador y permita que se seque el dedal. Deje que se enfríe.
26
Si no se posee éter anhidro, proceda de la siguiente manera:
 Lave el éter con dos o tres porciones de agua, y añada NaOH o KOH sólido.
 Deje reposar hasta que la mayor cantidad de agua sea removida del éter.
 Decante el éter a un envase totalmente seco y añada pequeñas piezas de Na metálico y deje en reposo hasta que cese la
liberación de hidrógeno. CUIDADO CON LA MANIPULACIÓN DEL SODIO METÁLICO.
 Guarde el éter de esta forma en botellas con las tapas ligeramente cerradas.
28
Se recomienda éter de petróleo con punto inicial de ebullición de 35 a 38 °C, gravedad específica a 15.5 °C de 0.630 – 0.660,
residuo luego de evaporación  0.002% y  95% destila a 54 °C.
27
24
 Remueva la muestra con el dedal de celulosa y coloque el tubo de recolección de éter bajo el
condensador. Coloque nuevamente el vaso químico y caliente nuevamente hasta que casi todo el
éter se haya evaporado del vaso y recogido en el tubo colector.
 Justo cuando todo el éter se ha casi evaporado, retire los calentadores y permita que se enfríen los
vasos. Recoja el éter para un uso futuro.
 Complete la evaporación del éter en la cámara extractora de gases a temperatura ambiente hasta
que no se sientan los vapores de éter.
 Una vez no se tengan residuos de éter en los vasos, coloque los vasos químicos con los residuos del
extracto etéreo en el horno de aire caliente de convección forzada a 105 °C por 30 minutos, retírelos
y colóquelos en un desecador. Déjelos enfriar y obtenga el peso del vaso más el residuo con una
 Estime el contenido de extracto etéreo.
 Para el método indirecto, coloque el dedal con la muestra a secar y determine la pérdida de peso.
Peso (gramos)
Duplicado 1
Duplicado 2
P1. Peso del vaso químico vacío
P2. Peso del vaso químico mas el extracto etéreo
P3. Peso de la muestra fresca o parcialmente seca
PORCENTAJE DE EXTRACTO ETÉREO
P2 - P1
x100
P3
Para el cálculo del contenido de extracto etéreo en base seca se debe ajustar el valor obtenido con la
muestra parcialmente seca con el siguiente ajuste:
% DE EXTRACTO ETÉREO EN BASE SECA
% DE EXTRACTO ETÉREO PARCIALMENTE SECO
x 100
En la figura 8 se muestra un esquema del instrumento
utilizado para el análisis de extracto etéreo del tipo
Goldfisch. En la parte inferior se observan las hornillas o
calentadores que poseen los controles de temperatura,
así como un sistema que permite ajustarlos verticalmente
para ajustar el vaso que contiene el solvente utilizado
para la extracción. En la parte superior se encuentra el
sistema de enfriamiento de agua, que luego del ajuste
del vaso permite la condensación continua del solvente
que pasa a través de la muestra para el proceso de
extracción de los lípidos u otro compuesto soluble en el
solvente utilizado.
Sistema de condensación
Calentadores
Vaso químico
Figura 8. Instrumento para determinación de
extracto etéreo tipo Goldfisch.
25
X. DETERMINACIÓN DE FIBRA
Tal como se mencionara al inicio, la fibra ha sido uno de los componentes del tejido vegetal, en especial
de los forrajes, que ha causado gran controversia tanto en su definición como en su determinación. Para la
clasificación de los forrajes se utiliza un nivel de 18% de fibra para separar los forrajes de los concentrados
o suplementos proteicos y los energéticos. No obstante, se conoce que alimentos con valores superiores
de fibra, como el caso del ensilaje, son alimentos de alto valor energético, donde la fibra no es una
limitante para su consumo y digestibilidad. Si se utiliza el método de análisis proximal o de Weende la
fracción resultante identificada como fibra cruda no esta constituida de manera uniforme por compuestos
específicos, y se dan casos donde pueden retenerse o perderse compuestos que no son propiamente
parte de la fibra del alimento.
En términos generales se consideraba que la fibra formaba la mayor parte del material indigerible de los
alimentos. Gran parte de esta fracción pasaba a través del tracto digestivo con muy pocas alteraciones
químicas y su aporte a la nutrición del animal era mínimo o casi nulo. En muchos casos esto resultaba
cierto para animales de estómago simple. No obstante, para animales de estómago compuesto o
rumiantes, este principio no es valedero, puesto que las bacterias y otros organismos que están presentes
en el retículo rumen de estos animales poseen enzimas capaces de degradar parte de los compuestos
que conforman la fibra, tales como la celulosa y la hemicelulosa. En algunos casos, de animales
herbívoros no rumiantes parte de la fibra puede ser digerida a nivel del ciego y colon, obteniéndose alguna
utilidad de la misma.
Dada esta discrepancia se desarrolló el método de análisis de fibra o de las paredes celulares de Van
Soest. En este método, con el uso de soluciones detergentes, el forraje se divide en dos fracciones
principales, el contenido celular (CC) y la pared celular (PC). De acuerdo con los científicos estas son
unidades uniformes, donde el contenido celular, indistintamente del tipo de animal, es totalmente digerible
y disponible para su digestión y absorción. En cambio, la pared celular se puede dividir en fracciones
donde se pueden aislar e identificar de manera uniforme las fracciones digeribles y las indigeribles, tal
como la lignocelulosa. El Dr. Abe ha diseñado un sistema de análisis donde por métodos enzimáticos, se
separa la fracción digerible (Oa) y la no digerible (Ob).
Para el caso de los humanos, la fracción fibrosa de los alimentos, determinada por el método de análisis
proximal, conlleva otra serie de implicaciones, puesto que como tal, la fibra ayuda a la eliminación de
ciertos compuestos y elementos nocivos para la salud humana, y a la vez estimula los movimientos
peristálticos facilitando el avance del material indigerible en la porción inferior del sistema digestivo. De
esta manera, aunque no aporta beneficios nutritivos al organismo ayuda en la nutrición al eliminar
sustancias no deseables.
Un método que ha sido aprobado por la AOAC y que ha tenido aceptación en el análisis de la fibra, una
vez se cuente con el equipo adecuado, es la determinación utilizando la Espectroscopia utilizando la
29
reflexión de ondas del Infrarrojo cercano (NIRS) . Con este método, además de poder determinar el
contenido de humedad de la muestra, se pueden determinar una serie de componentes de los alimentos.
Se ha considerado que para el caso de la fibra se obtienen valores con alta precisión y alta correlación con
30
los métodos de análisis químicos . A continuación se indicarán tres de los procedimientos que se utilizan
para la determinación de la fibra y parte de sus componentes en los forrajes.
A. DETERMINACIÓN DE LA FIBRA CRUDA
Este análisis corresponde al método proximal o de Weende. Se basa en la digestión de la muestra en
soluciones ácidas y básicas, donde el peso perdido de la muestra luego de la incineración del residuo se
considera la fibra cruda. Este método también ha sufrido una serie de modificaciones con el tiempo, en
especial lo que respecta al instrumental utilizado. Muchos lo consideran muy inexacto por la manipulación
de la muestra y además su poca uniformidad en los resultados. La muestra ha utilizar debe ser una
muestra libre o con muy poco contenido de lípidos. Tal como se indicó con anterioridad, el proceso trata de
29
30
Japan Livestock Technology Association. Technical Manual for Feed analysis. S. Tanabe, Ed., March, 2000.
26
simular el proceso digestivo de los forrajes en el tracto de los animales. En este procedimiento no deben
utilizarse muestras que han sido secadas en horno a temperatura  60 °C.
REACTIVOS:
 Ácido Sulfúrico al 1.25%: Se utiliza una solución de ácido sulfúrico 0.128 ± 0.003 M. Esto se logra
disolviendo 1.25 g de H2SO4 concentrado en 100 ml de agua. La concentración debe verificarse por
titulación.
 Hidróxido de sodio al 1.25%: Se utiliza una solución de hidróxido de sodio 0.313 ± 0.005 M. Esto se
logra disolviendo 1.25 g de NaOH en 100 ml de agua. Se debe verificar la concentración por
titulación.
 Alcohol: Se utiliza alcohol etílico al 95% grado reactivo, así como metanol o propanol.
31
 Solución limpiadora : Cuando se utilizan crisoles porosos para la filtración es conveniente que
periódicamente sean sometidos a una limpieza, dado que partículas de la muestra pueden obstruir
parcialmente los poros. La solución se prepara mezclando:
 Solución ácida: Disolver volúmenes iguales de ácido clorhídrico concentrado y agua.
 Solución alcalina: Disolver 5 g de Na2H2EDTA, 50 g de Na2HPO4 y 200 g de KOH en agua hasta
completar un litro.
 Mantenga las soluciones en recipientes de boca ancha con capacidad para dos a tres litros donde
puedan sumergirse y mantener los crisoles.
 Agente antiespumante: Se puede utilizar alcohol amílico u otra solución comercial con esta
propiedad.
PROCEDIMIENTO
 Se puede utilizar para este procedimiento la muestra proveniente de la determinación del extracto
etéreo, según procedimiento detallado con anterioridad, o la muestra parcialmente seca.
 Coloque en el horno de convección forzada de aire caliente a 105 °C por espacio de cuatro horas un
32
crisol de porcelana tipo Gooch con fondo poroso de 40 a 50 ml de capacidad . Retire del horno y
deje enfriar en un desecador.
33
 En un sistema de filtración por succión coloque un embudo tipo Büchner con una malla de 200
34
mesh que selle completamente el área de filtración.
 Coloque en el vaso químico tipo Berzelius con capacidad de 600 ml aproximadamente 2.0 g de
muestra pesada con exactitud de 0.0001 g. P3
 Caliente la solución de H2SO4 al 1.25% hasta punto de ebullición y transfiera, con la ayuda de
guantes de asbesto y mucho cuidado, 200 ml al vaso químico Berzelius que contiene la muestra,
asegurándose que toda la muestra quede humedecido y no se adhiera a las paredes.
 Mantenga en punto de ebullición aproximadamente un litro de agua destilada.
 Se puede añadir al vaso químico una solución antiespumante, como ejemplo una a dos gotas de
alcohol amílico o cualquier otro producto comercial con propiedades antiespumantes.
 Proceda a colocar el vaso sobre las hornillas, encienda el sistema de condensación y enfriamiento
de agua, y encienda las hornillas. La temperatura debe ser ajustada de manera que se pueda llevar
desde 25 °C hasta punto de ebullición 200 ml de agua en 15 ± 2 minutos. Luego mantenga la
temperatura de manera que se logre una ebullición estable, pero leve sin formación de mucha
espuma
Para el lavado de los crisoles, se sumergen inicialmente por espacio de  5 minutos en la solución alcalina, lavar con agua caliente,
a continuación sumerja los crisoles en la solución ácida por espacio de  5 minutos, lave con agua caliente y finalmente con
agua destilada caliente. Luego de haber utilizado los crisoles en tres a cuatro determinaciones, lávelos invertidos con agua
cerca del punto de ebullición.
32
Una de las alternativas utilizadas para filtrar es utilizar paños de tela, tipo manta sucia. En este caso, luego de la filtración con
ayuda de una espátula se “raspa” el material y se transfiere nuevamente al vaso químico Berzelius para la segunda digestión
con la solución de NaOH.
33
La AOAC ha propuesto el uso de un embudo tipo Büchner tipo California de plástico de dos piezas, al cual se le coloca una malla
de 200 mesh que selle totalmente el área de filtración.
34
Para el caso de materiales extremadamente finos se sugiere que se selle la malla utilizando una mezcla de 60 a 75 ml de H sSO4 al
1.25% con 1.5 g de fibra de cerámica, la cual ha sido previamente mezclada con agua (mezcla de 60 g de fibra con 800 ml de
agua licuada por un minuto a baja revolución)
31
27
 Para el caso de varias muestras, se recomienda colocar los vasos a intervalos de cinco minutos.
Permita que la solución se mantenga en ebullición durante 30 minutos. Periódicamente rote los
vasos de manera que la muestra no se adhiera a las paredes, y se mantenga en solución. En caso
de que parte de la muestra se adhiera a las paredes, con una botella lavadora que contiene solución
de H2SO4 al 1.25 % caliente, lave con cuidado las paredes hasta que toda la muestra permanezca en
solución.
 Cuando se esta terminando el periodo de reflujo, pase agua caliente por el embudo Büchner,
encienda el sistema de succión de manera que se alcance una presión de succión de 25 mm
aproximadamente.
 Retire el vaso de la hornilla, con cuidado utilizando guantes de asbesto, decante el líquido
sobrenadante sobre el embudo y lave el residuo del vaso utilizando el mínimo de agua caliente, con
ayuda de una botella lavadora. Filtre hasta que este seco, y luego proceda a lavar el residuo de
cuatro a cinco veces con aproximadamente 40 a 50 ml de agua caliente, cercana al punto de
ebullición. Al adicionar el agua de lavado no aplique succión. Este proceso deberá eliminar la
mayor cantidad de residuo ácido de la muestra.
 Trasvase el residuo del filtro hacia el vaso químico Berzelius utilizando solución a punto de ebullición
de NaOH al 1.25%. Luego de lavar el filtro, añada suficiente solución de NaOH al 1.25% para
completar aproximadamente 200 ml. Coloque los vasos a intervalos de cinco minutos y proceda a
mantener la solución en ebullición por espacio de 30 minutos.
alcohol amílico o cualquier otro producto comercial con propiedades antiespumantes. También se
pueden utilizar las denominadas perlas de ebullición para evitar el sobrecalentamiento y ebullición
brusca de la solución.
 Periódicamente rote los vasos de manera que la muestra no se adhiera a las paredes, y se
mantenga en solución. En caso de que parte de la muestra se adhiera a las paredes, con una botella
lavadora que contiene solución de NaOH al 1.25 % caliente, lave con cuidado las paredes hasta que
toda la muestra permanezca en solución.
 Cuando se esta terminando el periodo de reflujo, pase agua caliente por el crisol tipo Gooch,
encienda el sistema de succión de manera que se alcance una presión de succión de 25 mm
aproximadamente.
 Retire el vaso de la hornilla, con cuidado utilizando guantes de asbesto, decante el líquido
sobrenadante sobre el crisol tipo Gooch y lave el residuo del vaso utilizando el mínimo de agua
caliente, con ayuda de una botella lavadora.
 Eleve el nivel de vacío y proceda a lavar el residuo una sola vez con aproximadamente 25 a 30 ml de
la solución de H2SO4 al 1.25% cercana al punto de ebullición, y posteriormente dos veces con
aproximadamente 25 a 30 ml de agua caliente, cercana al punto de ebullición. Al adicionar el agua
de lavado no aplique succión. Filtre hasta sequedad. En algunos casos se recomienda lavar una
vez con alcohol y luego proceder a secar la muestra.
 Coloque el crisol con el residuo en un horno de convección forzada de aire caliente a una
temperatura de 110° C durante la noche. Luego de este periodo colóquelos en un desecador para
enfriarlos y pese con exactitud de 0.0001 g. P2
 Posteriormente coloque el crisol en un incinerador, cuya temperatura máxima sea de 550 °C ± 10 °C,
por espacio de dos horas. Al término de este periodo, deje enfriar el incinerador por debajo de los
250 °C, coloque el crisol en un desecador para enfriarlo y posteriormente registre su peso con
 Se recomienda procesar al menos dos blancos por cada 24 muestras analizadas.
 Determine el contenido de fibra cruda.
Peso (gramos)
Duplicado 1
Duplicado 2
P1. Peso del crisol tipo Gooch mas cenizas
P2. Peso del crisol tipo Gooch mas residuo
28
Para el caso de ajuste por los análisis de los blancos, reste la pérdida promedio de peso (B) obtenida
luego del secado e incinerado de los crisoles con los blancos a la pérdida de peso de la muestra analizada.
PORCENTAJE DE FIBRA CRUDA
(P2 - P1 )  B
x100
P3
Para el cálculo del contenido de fibra cruda en base seca se debe realizar el siguiente ajuste:
% DE FIBRA CRUDA EN BASE SECA
% DE FIBRA CRUDA PARCIALMENTE SECA
x 100
En la figura 9 se muestra el diagrama del instrumento utilizado, de manera general, para la determinación
de fibra cruda. Se basa en el mismo
Sistema de enfriamiento de agua
principio del instrumento utilizado para
el análisis de extracto etéreo, con la
diferencia que la muestra se
encuentra en constante contacto con
la solución del detergente que se
encuentra en ebullición. Este equipo
se utiliza igualmente para la
determinación de la fibra neutro (FDN)
y detergente ácido (FDA) del método
de análisis de fibra según Van Soest,
así como para cualquier otro tipo de
determinación en la que se requiera
mantener una solución en ebullición y
reflujo, minimizando la pérdida de la
Hornillas eléctricas
Vaso químico tipo Berzelius
solución. En la actualidad se han
ideado otros sistemas para la
Figura 9. Instrumento para determinación de fibra cruda.
digestión donde se minimiza la
manipulación de la muestra. En un
esquema cerrado, luego de colocar la muestra, la adición sucesiva de la solución ácida y la alcalina, así
como los lavados intermedios y finales con agua ocurren de manera automatizada.
B. DETERMINACIÓN DE LA FIBRA DETERGENTE NEUTRO (FDN) O CONSTITUYENTES DE LA
PARED CELULAR.
Según el método de análisis de la fibra propuesto por Van Soest, el tratamiento del forraje o material
vegetal con una solución neutro detergente, permite que todo el contenido celular del material se extraiga
y el residuo de la digestión lo constituya la pared celular. En este contexto, el residuo lo componen la
celulosa, la hemicelulosa, la lignina, así como otros compuestos que se encuentran ligados a la pared
celular, entre los que se incluye parte de los compuestos nitrogenados, que en algunos casos son
proteínas y algunos minerales. La fracción orgánica es conocida como fibra detergente neutro.
El procedimiento se puede utilizar en la mayoría de los forrajes, no obstante, cuando la muestra tiene alto
contenido de almidón, tales como concentrados, ensilaje de maíz y heces, se recomienda modificar el
proceso utilizando una amilasa para facilitar la filtración durante el análisis. El almidón puede quedarse
como parte del residuo por lo que se puede sobreestimar el contenido de fibra. A continuación se indicarán
los reactivos y procedimientos para el método simple y en el que utiliza amilasa. En este procedimiento
no deben utilizarse muestras que han sido secadas en horno a temperatura  60 °C.
29
REACTIVOS:
35
 Solución Detergente Neutro: Mezcle 540 g de sulfato sódico de lauril , 335 g de EDTA disódico,
123 g de borato sódico (Na2B4O710H2O) hasta un volumen de 10 litros de agua destilada.
Asegúrese que todo se ha disuelto. En un litro de agua destilada disuelva 82 g de fosfato sódico
dibásico (Na2HPO4) y mezcle las soluciones. Luego añada a esta solución 180 ml de éter monoetil
etilen glicol y lleve hasta un volumen final de 18 litros con agua destilada. El sulfato sódico de lauril
se precipita a bajas temperaturas por lo que la solución debe calentarse con agitación hasta que este
todo disuelto y totalmente transparente.
 Solución de amilasa:
 (a) Disuelva 2 g de la enzima en 90 ml de agua y filtre la solución resultante a través de un filtro
#541 y añada a la solución 10 ml de éter monoetil etilen glicol. Guarde la solución en refrigeración
a 5 °C. La enzima es obtenida del Bacillus subtilis, es de tipo III y con actividad óptima a pH 6.9
y 80 °C.
 (b) Prepare una solución amortiguadora de ácido fosfórico disolviendo 60.4 g de KH2PO4 y 19.9 g
de Na2HPO412H2O en agua destilada hasta cinco litros de solución. Ajuste el pH a 5.8. Disuelva
1 mg de -amilasa en 20 ml de solución amortiguadora de ácido fosfórico inmediatamente antes
de ser utilizada.
propiedad. Un agente conocido es Decalin o decahidronaftaleno.
36
 Solución limpiadora : Cuando se utilizan crisoles porososos para la filtración es conveniente que
completar un litro.
 Acetona: Utilice acetona grado reactivo.
 Papel filtro #410
PROCEDIMIENTO
 Coloque en el horno de convección forzada de aire caliente a 105 °C por espacio mayor de cuatro
horas un crisol de porcelana tipo Gooch con fondo poroso de 40 a 50 ml de capacidad. Retire del
horno, deje enfriar en un desecador y pese con exactitud de 0.0001 g. Esto es necesario si el residuo
será utilizado para la determinación de fibra ácido detergente. Si solo es para fibra detergente neutro
se puede utilizar papel filtro #410 y un sistema de filtración con embudos unidos a un sistema de
succión El papel filtro debe ser colocado igualmente en un horno a 105 °C por espacio de cuatro
horas. Terminado el periodo de secado colóquelo en un desecador para enfriarlo y péselo con
exactitud de 0.0001 g. Para este procedimiento se deberá igualmente secar un crisol y pesarlo con
 Transfiera 100 ml de la solución detergente neutro al vaso químico Berzelius que contiene la
muestra, asegurándose que toda la muestra quede humedecida y no se adhiera a las paredes.
35
Se puede reemplazar por detergente Orvus. Utilice 100 ml de la solución de Orvus por cada litro de solución detergente neutro.
Para los 18 litros se deben utilizar 1800 ml de Orvus. Esta solución debe calentarse hasta que este clara y luego la añade al
resto de la solución. Al momento de utilizar la solución detergente neutro se hace necesario mantenerla tibia para que todos los
ingredientes se mantengan en solución. No utilice la solución neutro detergente si esta turbia.
36
30
alcohol amílico o cualquier otro producto comercial con propiedades antiespumantes como el
Decalin.
de agua, y encienda las hornillas. La temperatura debe ser ajustada de manera que se pueda llegar
al punto de ebullición rápidamente, esto es elevar de 25 °C a ebullición 100 ml de agua en 4 a 5
minutos. Luego mantenga la temperatura de manera que se logre una ebullición estable, pero leve.
Esto debe permitir el movimiento significativo de las partículas en el vaso sin formación de mucha
espuma.
Permita que la solución se mantenga en ebullición durante una hora. Periódicamente rote los vasos
de manera que la muestra no se adhiera a las paredes, y se mantenga en solución. En caso de que
parte de la muestra se adhiera a las paredes o al bulbo de condensación, con una botella lavadora
que contiene solución neutro detergente, lave con cuidado hasta que toda la muestra permanezca en
solución.
 Con muestras con alto contenido de almidón, agregue inicialmente 50 ml de la solución detergente
neutro al vaso con la muestra y lleve a ebullición. Luego de 30 minutos, desde el comienzo de la
ebullición, agregue otros 50 ml de la solución detergente neutro y 2 ml de la solución enzimática
(a). Coloque nuevamente el vaso sobre la hornilla y lleve a ebullición por espacio de 30 minutos
adicionales. No puede utilizar el sistema de papel de filtro en este procedimiento.
 Una modificación a este procedimiento implica lo siguiente: en un erlenmeyer con capacidad para
100 ml agregue 20 ml de agua junto con un gramo de muestra pesada con exactitud de 0.0001 g.
Caliente la mezcla de manera que el almidón se gelatinice, la cual debe completarse una vez la
solución alcanza el punto de ebullición. Luego de enfriar, añada los 20 ml de la solución de amilasa (b) y mantenga en agitación por 16 horas a temperatura de 40 °C. Finalizada la hidrólisis
filtre en papel N°5 y lave completamente con agua destilada de tres a cuatro veces. Transfiera el
residuo al vaso químico Berzelius utilizando el mínimo de solución detergente neutro.
 Cuando se esta terminando el periodo de reflujo, pase agua caliente por el crisol o embudo con el
papel filtro, encienda el sistema de succión con una presión leve.
 Al término del tiempo de reflujo, lave toda la muestra que pueda estar adherida al bulbo de reflujo y
toda aquella que se encuentra en las paredes del vaso. Retire el vaso de la hornilla, con cuidado
utilizando guantes de asbesto, decante el líquido sobrenadante sobre el embudo y lave el residuo del
vaso utilizando el mínimo de agua caliente, con ayuda de una botella lavadora. Maximice la presión
de succión, y luego proceda a lavar el residuo de cuatro a cinco veces con aproximadamente 40 a 50
ml de agua caliente, cercana al punto de ebullición, esto debe remover los residuos de la solución
37
detergente neutro.
 Si se dan problemas en la filtración con las muestras de alto contenido de almidón, añada de uno
a dos mililitros adicionales de solución enzimática al residuo, así como 30 ml de agua caliente,
con temperatura aproximada de 80 °C. Deje reposar por 10 a 15 minutos. Encienda la succión
nuevamente. Proceda a lavar con agua caliente dos a tres veces.
 Proceda a lavar tres o cuatro veces con acetona y filtre hasta a secar la muestra. Asegúrese que en
la muestra no se sientan vapores de acetona.
 Coloque el crisol o el papel filtro con el residuo en un horno de convección forzada de aire caliente a
una temperatura de 105° C durante la noche. Luego de este periodo colóquelos en un desecador
para enfriarlos y pese con exactitud de 0.0001 g. P1
 Posteriormente coloque el crisol o el papel de filtro en un crisol de porcelana, en un incinerador cuya
38
temperatura máxima sea de 550 °C ± 10 °C, por espacio de dos horas. Al término de este periodo,
deje enfriar el incinerador por debajo de los 250 °C, coloque el crisol en un desecador para enfriarlo y
posteriormente registre su peso con exactitud de 0.0001 g. P2
 Determine el contenido de fibra detergente neutro por la pérdida de peso.
37
En algunos casos es recomendable cerrar el vacío y permitir que repose por tres a cinco minutos el agua caliente en el crisol, y con
ayuda de una varilla de vidrio agite y rompa la capa de material del fondo del crisol, y vuelva a aplicar succión.
38
Para el caso de utilizar papel de filtro se recomienda precalentar e incinerar la muestra en una campana sobre una plancha caliente
hasta que deje de emanar humo y luego se transfiere al incinerador. Esto aumenta la manipulación de la muestra y puede
aumentar el grado de error.
31
 Se recomienda procesar al menos dos blancos por cada 24 muestras analizadas, en especial
cuando se utiliza el método con la solución enzimática y con papel filtro.
Peso (gramos)
Duplicado 1
Duplicado 2
P1. Peso del crisol o papel filtro mas residuo
P2. Peso del crisol mas cenizas
P3 Peso del crisol o papel solo.
P4 Peso del residuo (P1 – P3)
P5 Peso de las cenizas (P2 – P3)*
* Para el caso del procedimiento donde se utilizo papel filtro, el peso del crisol corresponde al peso del crisol utilizado para la
incineración.
Para el caso de ajuste por los análisis de los blancos, reste el promedio de peso (B) obtenido luego del
secado e incineración de los crisoles con los blancos a los pesos de los residuos y cenizas de la muestra
analizada.
PORCENTAJE DE FIBRA DETERGENTE NEUTRO 
(P4 - Bresiduo ) - (P5 - B cenizas )
x100
P6
Para el cálculo del contenido de fibra detergente neutro en base seca se debe realizar el siguiente ajuste:
% DE FDN EN BASE SECA
% DE FDN PARCIALMENTE SECA
x 100
de la fibra detergente neutro (FDN), como se observa es similar o es el mismo utilizado para la
determinación de fibra cruda y fibra detergente ácido (FDA) del método de análisis de fibra según Van
Soest, así como para cualquier otro tipo de determinación en la que se requiera mantener una solución en
ebullición y reflujo, minimizando la pérdida de la solución.
C. DETERMINACIÓN DE LA FIBRA DETERGENTE ÁCIDO (FDA).
Por este procedimiento, la fracción menos digerible de la pared celular, la cual esta compuesta
principalmente de celulosa, hemicelulosa, lignina, parte de las proteínas ligadas a la pared celular y el
sílice, se separa del contenido celular, que se estima es alta y completamente disponible a los animales.
Este procedimiento utiliza un detergente catiónico en una solución de H 2SO4 que disuelve o remueve los
carbohidratos lábiles, proteína que no esta ligada por la reacción de Maillard y lípidos. Se da una limitación
en la acción de la solución detergente ácido cuando la muestra posee un contenido de lípidos superior al
5%, por lo que se recomienda la extracción de l muestra cuando se excede este porcentaje. Este
procedimiento puede repetirse con mayor facilidad que el método de fibra cruda, además que aísla una
fracción que básicamente es utilizada con poca eficiencia por los animales.
Con este procedimiento, casi toda la hemicelulosa es hidrolizada, aunque la fracción cristalina de la
celulosa no lo es. Adicionalmente, la lignina, presente en esta fracción, no es digerida, por lo que la
fracción la constituye lo que se conoce como lignocelulosa. En esta fracción queda retenida igualmente
proteína ligada y sílice. La proteína ligada es aquella que en el caso de productos vegetales y de origen
animal se ha dañado por efecto del calor al cual fue sometido el producto durante su procesamiento. De
esta manera la fracción orgánica es identificada como la fibra detergente ácido. Esta fracción puede
posteriormente ser digerida para identificar el contenido de cada uno de sus componentes, a saber
celulosa, lignina y sílice. En este procedimiento no deben utilizarse muestras que han sido secadas
en horno a temperatura  60 °C.
32
REACTIVOS:
39
 Solución Detergente Ácido: Mezcle 504 ml de H2SO4 en 10 litros de agua destilada y añada
posteriormente 360 g de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB). Finalmente lleve la solución hasta
18 litros.
propiedad. Un agente conocido es Decalin o decahidronaftaleno.
40
completar un litro.
41
 Papel filtro #410 o #541
PROCEDIMIENTO
 Coloque en el horno de convección forzada de aire caliente a 105 °C por espacio mayor de cuatro
42
horas un crisol de porcelana tipo Gooch con fondo poroso de 40 a 50 ml de capacidad. Retire del
horno, deje enfriar en un desecador y registre su peso con exactitud de 0.0001 g. Se puede utilizar
papel filtro #410 o #541 y un sistema de filtración con embudos unidos a un sistema de succión. El
papel filtro debe ser colocado igualmente en un horno a 105 °C por espacio de cuatro horas.
Terminado el periodo de secado colóquelo en un desecador para enfriarlo y péselo con exactitud de
0.0001 g. Para este procedimiento se deberá igualmente secar un crisol y pesarlo con exactitud de
0.0001 g. P3
43
 Transfiera 100 ml de la solución detergente ácido al vaso químico Berzelius que contiene la muestra,
asegurándose que toda la muestra quede humedecida y no se adhiera a las paredes.
alcohol amílico o cualquier otro producto comercial con propiedades antiespumantes como el
Decalin.
de agua, y encienda las hornillas. La temperatura debe ser ajustada de manera que se pueda llegar
al punto de ebullición rápidamente, esto es elevar de 25 °C a ebullición 100 ml de agua en 4 a 5
minutos. Luego mantenga la temperatura de manera que se logre una ebullición estable, pero leve.
Esto debe permitir el movimiento significativo de las partículas en el vaso sin formación de mucha
espuma.
Permita que la solución se mantenga en ebullición durante una hora. Periódicamente rote los vasos
de manera que la muestra no se adhiera a las paredes, y se mantenga en solución. En caso de que
39
H2SO4 con gravedad específica 1.634 a 20 °C o 12.0 M.
41
Papel filtro #541 debe ser utilizado si se desea determinar contenido de nitrógeno en la fibra detergente ácido.
42
El crisol con filtro poroso se utiliza si se desea determinar el contenido de lignina en la fibra detergente ácido.
43
Muestras con un contenido de lípidos > 5% deben ser procesadas con acetona, éter etílico o éter de petróleo. En este
procedimiento puede colocarse la muestra pesada con exactitud de 0.0001 g en el crisol de fondo poroso que será utilizado
para la determinación de fibra detergente ácido. Agregue cuatro veces cerca de 30 a 40 ml de acetona, dejando reposar por
cerca de tres a cinco minutos cada vez y filtrando por succión. Seque al aire por 10 a 15 minutos y transfiera el residuo al vaso
químico Berzelius para proceder al análisis.
40
33








parte de la muestra se adhiera a las paredes o al bulbo de condensación, con una botella lavadora
que contiene solución ácido detergente, lave con cuidado hasta que toda la muestra permanezca en
solución.
Cuando se esta terminando el periodo de reflujo, pase agua caliente por el embudo, encienda el
sistema de succión con una presión leve.
Al término del tiempo de reflujo, lave toda la muestra que pueda estar adherida al bulbo de reflujo y
toda aquella que se encuentra en las paredes del vaso. Retire el vaso de la hornilla, con cuidado
utilizando guantes de asbesto, decante el líquido sobrenadante sobre el embudo y lave el residuo del
vaso utilizando agua caliente, con ayuda de una botella lavadora. Maximice la presión de succión, y
luego proceda a lavar el residuo de cuatro a cinco veces con aproximadamente 40 a 50 ml de agua
caliente, cercana al punto de ebullición, esto debe remover los residuos de la solución detergente
ácido.
Proceda a lavar tres o cuatro veces con 30 a 40 ml de acetona y filtre hasta a secar la muestra.
Durante los lavados con acetona deje reposar de tres a cinco minutos antes de aplicar la succión, en
los últimos lavados el filtrado debe ser incoloro. Asegúrese que en la muestra no se sientan vapores
de acetona luego del último filtrado.
Coloque el crisol o el papel filtro con el residuo en un horno de convección forzada de aire caliente a
una temperatura de 105° C durante la noche. Luego de este periodo colóquelos en un desecador
para enfriarlos y pese con exactitud de 0.0001 g. P1
Determine el contenido de fibra detergente ácido. Como alternativa se puede llevar el residuo a
incineración y se estima el contenido de fibra detergente neutro por la pérdida de peso como se
detalla a continuación.
Coloque el crisol o el papel de filtro en un crisol de porcelana, en un incinerador cuya temperatura
44
máxima sea de 550 °C ± 10 °C, por espacio de dos horas. Al término de este periodo, deje enfriar
el incinerador por debajo de los 250 °C, coloque el crisol en un desecador para enfriarlo y
Determine el contenido de fibra detergente ácido por la pérdida de peso.
Se recomienda procesar al menos dos blancos por cada 24 muestras analizadas, en especial
cuando se utiliza el método con papel filtro.
Peso (gramos)
Duplicado 1
Duplicado 2
P1. Peso del crisol o papel filtro mas residuo
P3 Peso del crisol o papel solo.
P4 Peso del residuo (P1 – P3)
incineración.
secado e incineración de los crisoles con los blancos a los pesos de los residuos y cenizas de la muestra
analizada.
PORCENTAJE DE FIBRA DETERGENTE ÁCIDO
(P4 - Bresiduo ) - (P5 - B cenizas )
x100
P6
Para el cálculo del contenido de fibra detergente ácido en base seca se debe realizar el siguiente ajuste:
44
34
% DE FDA EN BASE SECA
% DE FDA PARCIALMENTE SECA
x 100
de la fibra detergente ácido (FDA), como se observa es similar o es el mismo utilizado para la
determinación de fibra cruda y fibra detergente neutro (FDN) del método de análisis de fibra según Van
Soest, así como para cualquier otro tipo de determinación en la que se requiera mantener una solución en
ebullición y reflujo, minimizando la pérdida de la solución.
En este procedimiento se asume que, luego de la incineración del residuo, las cenizas corresponden al
contenido de sílice, por lo que se puede aplicar el siguiente procedimiento y ecuaciones para determinar el
contenido de sílice de la muestra. Esta determinación no se puede realizar si se desea obtener el
contenido de lignina de la muestra, puesto que, para este caso, el residuo del análisis de la Fibra
Detergente Ácido se tratará posteriormente, con una solución de H 2SO4 o KMnO4 para eliminar la lignina,
quedando como residuo la celulosa.
Peso (gramos)
Duplicado 1
Duplicado 2
P3. Peso del crisol solo.
P6 Peso de la muestra fresca o parcialmente seca
incineración.
secado e incineración de los crisoles con los blancos a los pesos de las cenizas de la muestra analizada.
PORCENTAJE DE SÍLICE
(P4 - Bcenizas)
x100
P6
Para el cálculo del contenido de sílice en base seca se debe realizar el siguiente ajuste:
% DE SÍLICE EN BASE SECA
% DE SÍLICE PARCIALMENTE SECA
x 100
o
% DE MATERIA SECA A 105 C
D. DETERMINACIÓN DE FIBRA POR ANÁLISIS ENZIMÁTICO
45
La utilización de enzimas ha sido propuesto como método analítico para tratar de simular el tipo de
reacción que ocurre en el tracto digestivo de los animales. Existen una diversidad de métodos y enzimas
que han sido utilizadas para este propósito, no obstante, son muy pocos los análisis que han logrado una
estandarización, no solo dentro de un laboratorio, sino entre distintos laboratorios. Es un método complejo
que requiere de mucho cuidado en la manipulación de las enzimas y la determinación del grado de
actividad de la misma, si se desea lograr una buena exactitud y repetibilidad en el análisis.
Como se mencionara anteriormente, recientemente se ha propuesto un método enzimático, que esta
siendo aceptado por diversos laboratorios y presenta cierto grado de facilidad y repetibilidad entre
muestras. En este procedimiento la muestra es sometida a una digestión enzimática donde se separa el
contenido celular (CC) de la pared celular (PC). Adicionalmente, la fracción determinada como pared
45
Adaptado de Japan Livestock Technology Association, Technical Manual for Feed Analysis. S. Tanabe, Ed., March, 2000.
35
celular se somete a una segunda digestión enzimática donde se obtienen dos fracciones: fibra altamente
digerible (Oa) y la fibra de baja digestibilidad (Ob).
REACTIVOS:
 Solución de -amilasa en amortiguador de ácido fosfórico: Prepare una solución amortiguadora
de ácido fosfórico disolviendo 60.4 g de KH2PO4 y 19.9 g de Na2HPO412H2O en agua destilada
hasta cinco litros de solución. Ajuste el pH a 5.8. Disuelva 1 mg de -amilasa en 20 ml de solución
amortiguadora de ácido fosfórico y finalmente añada 5 ml de la solución de acetato de calcio por
cada litro de solución inmediatamente antes de ser utilizada.
 Solución de acetato de calcio: Disuelva 7.0 g de Ca(CH3COO)23H2O en agua destilada hasta un
litro de solución.
 Solución de proteasa: Prepare una solución amortiguadora de fosfato mezclando 9.0 g de KH2PO4
y 95.4 g de Na2HPO412H2O en agua destilada hasta cinco litros de solución. Ajuste el pH a 7.4.
46
Añada posteriormente proteasa en una relación de 0.02% (peso/peso) a la solución amortiguadora
que se le ha agregado solución de acetato de calcio en una relación de 5 ml por litro de solución.
 Solución de celulasa: Prepare una solución amortiguadora de acetato disolviendo 12.9 g de
Ca(CH3COO)23H2O en agua destilada a la cual se ha añadido con anterioridad 24.3 g de ácido
47
acético (CH3COOH) y se lleva la solución hasta cinco litros. Ajuste el pH a 4.0. Disuelva celulasa a
razón de 1% peso por peso.
 Solución de -amilasa en amortiguador de acetato: Prepare una solución amortiguadora de
acetato disolviendo 63.2 g de Ca(CH3COO)23H2O en agua destilada a la cual se ha añadido con
anterioridad 2.1 g de ácido acético (CH3COOH) y se lleva la solución hasta cinco litros. Ajuste el pH a
5.8.
 Solución de -amilasa/celulasa: Disuelva 1 mg de -amilasa y 8 mg de celulasa en 20 ml de la
solución amortiguadora de acetato, añadiendo solución de acetato de calcio a razón de 5 ml por litro
de solución.
48
completar un litro.
 Papel filtro N°5A
PROCEDIMIENTO
1. Determinación del contenido orgánico de la pared celular (OCW)
 Coloque 0.5 g de muestra con exactitud de 0.0001 g en un vial con capacidad de 50 ml con tapa
de rosca junto con 20 ml de agua destilada. P7
 Caliente el vial junto con la mezcla en una hornilla de manera que se gelatinice el almidón
presente en la muestra. Esto se completa cuando la solución llega al punto de ebullición.
 Deje reposar y enfriar. Añada 20 ml de la solución de -amilasa en solución amortiguadora de
fosfato. Cierre el vial y verifique que no se pueda derramar la solución.
 Coloque el vial en agitación a 40 °C por espacio de 16 horas para que ocurra la hidrólisis del
almidón.
46
Proteasa conocida comercialmente como Actinasa E.
Celulasa conocida comercialmente como Celulasa P1500 para análisis de alimentos.
48
47
36
 Luego de terminado el periodo, lave el contenido del vial con agua destilada en un vaso químico
con capacidad para 300 ml y lleve el volumen hasta los 300 ml con agua destilada y deje reposar
por un periodo de  tres horas.
 Decante el filtrado sobre un embudo con papel filtro N°5 y proceda a filtrar la solución bajo
succión. Lave de tres a cuatro veces el residuo con agua destilada.
 Pase el residuo del papel filtro hacia el vial utilizado con anterioridad, lavando el papel filtro con el
mínimo de la solución de proteasa, para lo que puede utilizar una botella lavadora. Llene el vial
con la solución de proteasa. Cierre el vial y verifique que no se pueda derramar la solución.
 Coloque el vial en agitación a 40 °C por espacio de 16 horas para que ocurra la digestión de la
proteína.
 Decante el filtrado sobre un embudo con papel filtro N°5, que ha sido previamente secado y
pesado con exactitud de 0.0001 g (P4), y proceda a filtrar la solución bajo succión. Lave de tres a
cuatro veces el residuo con agua destilada. Finalmente lave con porciones de acetona por lo
menos tres veces y deje secar el residuo a temperatura ambiente.
 Cuando no se sientan vapores de acetona en la muestra, lleve el papel filtro a un horno de
convección de aire forzado a temperatura de 135 °C por espacio de dos horas. Retire y deje
enfriar en un desecador por espacio de 30 minutos y pese con exactitud de 0.0001 g. P3
 Coloque el papel de filtro en un crisol de porcelana, que ha sido previamente secado y pesado con
exactitud de 0.0001 g, (P2) en un incinerador cuya temperatura máxima sea de 600 °C ± 10 °C,
49
por espacio de dos horas. Al término de este periodo, deje enfriar el incinerador por debajo de
los 250 °C, coloque el crisol en un desecador para enfriarlo, por espacio de 60 minutos, y
posteriormente registre su peso con exactitud de 0.0001 g. Determine el contenido orgánico de la
pared celular (OCW) por la pérdida de peso.
Peso (gramos)
Duplicado 1
Duplicado 2
P3. Peso del papel filtro más residuo.
P4. Peso del papel filtro solo.
P5. Peso del residuo (P3 – P4).
PORCENTAJE DE PARED CELULAR ORGÁNICA (OCW) 
(P5 - P6 )
x100
P7
Para el cálculo del contenido del contenido de pared celular orgánica en base seca se debe realizar el
siguiente ajuste:
% DE PARED CELULAR ORGÁNICA (OCW) EN BASE SECA
% DE OCW PARCIALMENTE SECA
x 100
Para la determinación de la fracción orgánica de baja digestibilidad identificada como Ob, se procede a
utilizar el residuo proveniente de la determinación de la fracción orgánica de la pared celular u OCW. Este
procedimiento se aplica a aquellas muestras donde el residuo de contenido de pared celular es de
aproximadamente 0.3 g. De esta manera, antes de que se proceda a lavar con acetona el residuo luego de
la digestión con la solución de proteasa se procesa el residuo con la solución de celulasa.
49
37
PROCEDIMIENTO
2. Determinación de la fracción orgánica de baja digestibilidad de la pared celular (Ob).
 Si requiere determinar la fracción Ob con una nueva muestra, calcule la cantidad de muestra a
utilizar mediante la siguiente relación [0.3/(Peso del residuo/Peso de la muestra)]. Pese la
cantidad a utilizar con exactitud de 0.0001 g (P7). Si va a utilizar el residuo de la determinación de
OCW, utilizando una botella lavadora que contenga la solución de celulasa en amortiguador de
acetato, transfiera el residuo luego de la digestión con proteasa a un vial con capacidad de 50 ml
50
y con tapa de rosca.
 Llene el vial con la solución de celulasa, cierre el vial y verifique que no se pueda derramar la
solución.
 Coloque el vial en agitación a 40 °C por espacio de 16 horas para que ocurra la digestión de la
celulosa y hemicelulosa.
 Luego que terminado el periodo de digestión, coloque los viales sobre una hornilla y caliente la
solución hasta una temperatura  80° C, temperatura a la cual se inactiva la celulasa. No deje
que la solución en el vial entre en ebullición.
 Decante el filtrado sobre un embudo con papel filtro N°5, que ha sido previamente secado y
pesado con exactitud de 0.0001 g (P4), y proceda a filtrar la solución bajo succión. Lave de tres a
cuatro veces el residuo con agua destilada. Finalmente lave con porciones de acetona por lo
menos tres veces y deje secar el residuo a temperatura ambiente.
 Cuando no se sientan vapores de acetona en la muestra, lleve el papel filtro a un horno de
convección de aire forzado a temperatura de 135 °C por espacio de dos horas. Retire y deje
enfriar en un desecador por espacio de 30 minutos y pese con exactitud de 0.0001 g. P3
 Coloque el papel de filtro en un crisol de porcelana, que ha sido previamente secado y pesado con
exactitud de 0.0001 g (P2), en un incinerador cuya temperatura máxima sea de 600 °C ± 10 °C,
51
por espacio de dos horas. Al término de este periodo, deje enfriar el incinerador por debajo de
los 250 °C, coloque el crisol en un desecador para enfriarlo, por espacio de 60 minutos, y
 Determine el contenido orgánico de baja digestibilidad de la pared celular (Ob) por la pérdida de
peso.
 Si se resta el valor de Ob del valor de OCW se obtiene el valor de la fracción orgánica de la pared
celular de lata digestibilidad.
Peso (gramos)
Duplicado 1
Duplicado 2
P3. Peso del papel filtro más residuo.
P4. Peso del papel filtro solo.
P5. Peso del residuo (P3 – P4).
P6 Peso de las cenizas (P1 – P2)
PORCENTAJE DE PARED CELULAR ORGÁNICA DE BAJA DIGESTIBILIDAD(Ob) 
(P5 - P6 )
x100
P7
Para el cálculo del contenido de pared celular orgánica de baja digestibilidad en base seca se debe
realizar el siguiente ajuste:
50
Si requiere determinar la fracción Ob con una nueva muestra, calcule la cantidad de muestra a utilizar mediante la siguiente
relación 0.3/(Peso del residuo/Peso de la muestra). Pese la cantidad a utilizar con
51
38
% DE PARED CELULARORGÁNICADEBAJA DIGESTIBIL
IDAD (Ob)EN BASE SECA
% DE Ob PARCIALMENTE SECA
x 100
o
% DE MATERIA SECA A105 C
Finalmente el contenido de pared celular orgánica de alta digestibilidad se obtiene de la siguiente manera:
PORCENTAJE DE PARED CELULAR ORGÁNICA DE ALTA DIGESTIBILIDAD(Oa)  OCW  Ob
39
XI. DETERMINACIÓN DE LIGNINA
Luego de la determinación de la fibra detergente ácido, uno de los componentes de esta fracción lo
constituye la lignina. La lignina se determina al disolver u oxidar el componente orgánico de la fracción
detergente ácido con una solución de H2SO4 al 72% por peso o una solución de KMnO4. La acción del
ácido o el permanganato es la disolución de la lignina dejando como residuo lo que sería la celulosa. Se
calcula el contenido de lignina por la pérdida de peso del material luego del tratamiento con cualquiera de
las soluciones antes mencionadas. Para el caso del permanganato de potasio, se utiliza adicionalmente
una solución decolorante, que remueve los residuos de permanganato, también conocida como solución
demineralizadora.
REACTIVOS:
1. Determinación del contenido de lignina con H2SO4
 Ácido sulfúrico al 72%: Utilice H2SO4 grado reactivo de gravedad específica 1.634 a 20 ºC o 12.0
M. Disuelva 1200 g de H2SO4 en 440 ml de agua destilada en un balón volumétrico tratando de
mantener fría la solución. Estandarice la solución a 1634 g/l a 20 ºC removiendo la solución y
adicionando o quitando agua o ácido sulfúrico según se requiera.
2. Determinación del contenido de lignina con KMnO4
 Solución saturada de Permanganato de potasio: Disuelva 50 g de KMnO4 grado reactivo en un
litro de agua destilada. Mantenga esta solución alejada de la luz solar. Es preferible almacenarla en
botella de color ámbar o en una botella clara envuelta en papel de aluminio. Preferiblemente dentro
de un anaquel.
 Solución amortiguadora para lignina: En 100 ml de agua destilada disuelva 6.0 g de
Fe(NO3)3·9H2O y 0.15 g de AgNO3. Prepare 500 ml de ácido acético glacial que contengan 5.0 g de
acetato de potasio. Finalmente, mezcla las dos soluciones anteriores y añada 400 ml de alcohol terbutílico. Mezcle completamente toda la solución.
 Solución demineralizadora: En 700 ml de alcohol etílico al 95% disuelva 50 g de ácido oxálico.
Añada 50 ml de HCl 12 N y 250 ml de agua destilada. Mezcle completamente.
 Etanol al 80%: Utilice etanol grado reactivo y disuelva 80 ml de alcohol etílico al 95% con 200 ml de
agua destilada.
 Acetona
PROCEDIMIENTO
1. Determinación del contenido de lignina con H2SO4
 El residuo del crisol donde se determino la Fibra Detergente Ácido se utiliza para la determinación
de lignina.
 Coloque el crisol dentro de una bandeja de vidrio o vaso químico.
 Agregue suficiente solución de H2SO4 al 72% para cubrir el contenido del crisol. La solución de
ácido sulfúrico debe estar a temperatura del laboratorio, cerca de 15 ºC.
 Agite con una varilla de vidrio el contenido y la solución de manera que todo el material reaccione
con el ácido y se rompan los grumos.
 Continúe agregando la solución de ácido sulfúrico hasta llenar la mitad del crisol y continúe
revolviendo.
 Verifique constantemente el volumen de ácido del crisol y agregue según disminuya el volumen.
Realice esta operación durante tres horas, agitando siempre con la misma varilla de vidrio.
Mantenga la reacción entre los 20 a 23 ºC, puede enfriar si fuese necesario.
 Al finalizar las tres horas, filtre al vacío y lave el crisol con agua destilada caliente hasta que la
solución filtrante no contenga residuos de ácido. Pruebe con papel para prueba de pH.
 Lave las partes laterales del crisol y la varilla de vidrio.
 Coloque el crisol en un horno de aire caliente de convección forzada a 100 ºC por un tiempo
mínimo de 16 horas. Luego de este periodo coloque en un desecador para enfriar y registre el
peso con exactitud de 0.0001 g. P3
40
 Coloque el crisol con el residuo en un incinerador cuya temperatura máxima sea de 500 ºC e
incinere el residuo por espacio de dos horas. Al término de este periodo, deje enfriar el incinerador
por debajo de los 250 °C, coloque el crisol, aún caliente, en un horno de aire caliente de
convección forzada a 100 ºC por una hora. Transfiera el crisol a un desecador para enfriarlo y
Peso (gramos)
Duplicado 1
Duplicado 2
52
P2. Peso del crisol solo .
53
P3. Peso del residuo .
54
secado e incineración de los crisoles con los blancos a los pesos de las cenizas de la muestra analizada.
PORCENTAJE DE LIGNINA
P3 - (P4 - B cenizas)
x100
P5
Para el cálculo del contenido de lignina en base seca se debe realizar el siguiente ajuste:
% DE LIGNINA EN BASE SECA
% DE LIGNINA PARCIALMENTE SECA
x 100
o
PROCEDIMIENTO
2. Determinación del contenido de lignina con KMnO4
 Todo lo anterior debe realizarse en duplicado.
 El residuo del crisol donde se determino la Fibra Detergente Ácido se utiliza para la determinación
de lignina.
 Coloque el crisol dentro de una bandeja de vidrio o vaso químico que contenga en el fondo una
pequeña lámina de agua destilada.
 Mezcle la solución saturada de KMnO4 y la solución amortiguadora para lignina en una relación de
volúmenes de 2:1.
 Agregue 25 ml de la mezcla de KMnO4 para cubrir el contenido del crisol.
 Agite con una varilla de vidrio el contenido y la solución de manera que todo el material reaccione
y se rompan los grumos.
 Adicione agua a la bandeja o vaso de manera que se restrinja el flujo de solución de KMnO4 fuera
del crisol. Continúe revolviendo.
 Verifique constantemente el volumen de solución en el crisol y agregue según disminuya el
volumen. La solución debe permanecer de color púrpura durante todo el periodo. Realice esta
operación durante aproximadamente 90 minutos, agitando siempre con la misma varilla de vidrio.
 Al finalizar los 90 minutos, filtre al vacío. No lave el crisol.
 Coloque nuevamente el crisol en la bandeja o vaso limpio y agregue la solución demineralizadora
hasta la mitad de la capacidad del crisol. Deje reposar por 15 minutos. Filtre al vacío.
 Añada nuevamente suficiente solución demineralizadora para llenar la mitad del crisol, lave las
paredes del crisol con solución demineralizadora con ayuda de una botella lavadora si fuera
52
Es el mismo peso del crisol utilizado para la determinación de Fibra Detergente Ácido
Es el mismo peso del residuo resultante en la determinación de Fibra Detergente Ácido
54
Es el mismo peso de la muestra utilizada para la determinación de Fibra Detergente Ácido
53
41
necesario. Deje reposar por espacio de 20 a 30 minutos durante los cuales el residuo dentro del
55
crisol debe estar de color blanco.
 Filtre al vacío y lave tres veces el contenido con alcohol etílico al 80%. Lave las partes laterales del
crisol y la varilla de vidrio, y finalmente lave dos veces con acetona.
 Cuando no se sientan vapores de acetona en la muestra, lleve el crisol a un horno de convección
de aire forzado a temperatura de 100 °C por espacio de 16 horas. Retire y deje enfriar en un
desecador por espacio de 30 minutos y pese con exactitud de 0.0001 g. P1
Peso (gramos)
Duplicado 1
Duplicado 2
P1. Peso del crisol mas residuo de celulosa
56
P2 Peso del crisol vacío
P3 Peso del residuo o celulosa (P1 – P2)
57
P4. Peso del residuo de Fibra Detergente Ácido .
58
P -P
PORCENTAJE DE LIGNINA 4 3 x100
P5
Para el cálculo del contenido de lignina en base seca se debe realizar el siguiente ajuste:
% DE LIGNINA EN BASE SECA
% DE LIGNINA PARCIALMENTE SECA
x 100
o
55
Para el caso de que el residuo este un tanto amarillo repita la operación de decoloración. Esto es común con muestras que poseen
más de 35% de lignina en la Fibra Detergente Ácido.
56
Es el mismo peso del crisol utilizado en la determinación de Fibra Detergente Ácido
57
Es el mismo peso del residuo resultante en la determinación de Fibra Detergente Ácido
58
Es el mismo peso de la muestra utilizada para la determinación de Fibra Detergente Ácido
42
XII. DETERMINACIÓN DE MINERALES
Los animales requieren consumir una serie de elementos minerales para el adecuado funcionamiento
metabólico. Los componentes minerales que se encuentran en los alimentos están distribuidos en el tejido
en diferentes formas, ya sea en forma iónica, formando sales y otros compuestos, así como formando
parte estructural de compuestos orgánicos. De acuerdo a la cantidad relativa de las necesidades de los
minerales, estos se dividen en macro y microminerales. Entre estos últimos, gracias a los avances
tecnológicos, principalmente su sensibilidad, se ha encontrado la presencia de ellos en los tejidos
animales, pero de algunos no se conoce aún su rol en el metabolismo.
En un principio, los métodos para la determinación cuantitativa de minerales específicos, se basaba en la
digestión y/o incineración de la muestra, para luego aplicar alguna técnica analítica entre las cuales
tenemos las gravimétricas y por titulación. Posteriormente, con el avance del uso de los
espectrofotómetros se desarrollaron técnicas colorimétricas, donde se conoce la longitud de onda donde el
mineral puro o un compuesto determinado que contiene el mineral en estudio presentan su mayor
absorción. El nivel o grado de absorción se compara con una serie de patrones o estándares y se
determina la cantidad de mineral presente en la muestra. Estos métodos son todavía aceptables para la
determinación de elementos que se encuentran presentes en grandes cantidades en la muestra.
La fotometría de llama, mas propiamente denominada espectrometría de emisión atómica de llama, es un
método analítico rápido, simple y sensitivo para la determinación de iones de elementos trazas en solución.
Debido a sus muy angostas y características líneas de emisión de la fase gaseosa atómica en la llama de
plasma, el método está relativamente libre de interferencias de otros elementos. La precisión y exactitud
típica del análisis de soluciones acuosas diluidas están cerca de ± 1-5% relativamente.
El método es adecuado para muchos elementos metálicos, especialmente para aquellos metales que son
fácilmente excitados a mayores niveles de energía a temperaturas de la llama: Na, K, Ca, Rb, Cs, Cu, Ba.
Los no-metales, generalmente no producen átomos neutrales aislados en una llama, por lo que para ellos
no es adecuada la determinación por espectroscopia de emisión de llama.
La fotometría de llama es un método empírico de análisis, esto es que se debe calibrar el método
cuidadosamente. Muchas diferentes variables experimentales afectan la intensidad de la luz emitida por la
llama. Por consiguiente, calibraciones frecuentes y cuidadosas son necesarias para buenos resultados.
Uno de los instrumentos utilizados para estos análisis es Coleman Flame Photometer, Model 21, con un
quemador de consumo total que utiliza gas natural y oxígeno. El aislamiento de la longitud de onda se
realiza por el uso de un simple filtro de interferencia. La luz de la llama se concentra hacia el final del cable
de fibra óptica (“tubo de luz”) el cual transmite la luz hacia un fotodiodo en una pequeña caja electrónica
en el fotómetro de llama. La electrónica allí convierte la salida del diodo en una emisión digital.
CUIDADO. Aunque la llama es bastante pequeña, tiene tan elevada temperatura que el contacto de la piel
con aún el borde externo de la llama produciría instantáneamente una quemadura de tercer grado.
Exceptuando por el encendido de la llama, las manos deben mantenerse completamente fuera de la
cámara durante el tiempo que la llama está ardiendo, aún si se ha disminuido su intensidad bastante entre
los análisis.
El principio se basa en que cualquier substancia cuando se expone a una suficiente alta temperatura será
forzada a un estado excitado por colisión térmica. Debido a que estos estados son inestables, los átomos
excitados o moléculas regresaran a su estado basal, disipando la energía absorbida de varias formas, una
de ellas es la emisión de luz. Cada átomo o molécula tiene asociada a sí mismo una seria de niveles
discretos de energía. En el estado separado atomizado, por consiguiente, los átomos excitados emitirán
un característico juego de longitudes de onda denominados “espectros”. La intensidad de la luz así emitida
es directamente proporcional al número de átomos que han sufrido dicha transición. De esta manera,
monitoreando selectivamente una longitud de onda característica de un elemento volatilizado y excitado en
una llama, se puede medir la concentración de dicho elemento directamente.
43
Los metales alcalinos del Grupo 1 de la Tabla Periódica tienen niveles bajos de energía de excitación y por
tal motivo son bien adecuados para análisis por emisión de llama. Sodio y Potasio ambos pueden ser
analizados por fotometría de llama en menor tiempo, a bajas concentraciones y con gran precisión y
exactitud que por cualquier otra técnica. Cambios al azar en la temperatura de la llama o tasas de
aspiración y varias interferencias químicas pueden causar fluctuaciones en la señal de emisión, dando una
respuesta bastante inestable. Para compensar por esta inherente inestabilidad en la salida, el Litium se
añade en una cantidad constante tanto en muestras como estándares como un “estándar interno” La
electrónica compara la señal de las concentraciones variables de Sodio y Potasio en la muestra contra la
señal de la concentración constante y muestra la razón de estas dos cantidades directamente en unidades
de concentración del elemento analizado. Fluctuaciones al azar en la llama pueden pues afectar tanto los
estándares internos y al Sodio y Potasio igualmente, la razón permanece sin afectación, y se puede
obtener una lectura exacta y estable.
Posteriormente el desarrollo de nuevos equipos como el espectrofotómetro de absorción atómica se
pueden medir pequeñas diferencias en concentraciones, así como determinar concentraciones de
elementos trazas. Este equipo permite analizar el contenido de determinado elemento en una sustancia
midiendo el nivel de absorción de longitudes de onda específicas al analizar la llama que se produce al
quemar la sustancia a altas temperaturas donde alcanza su disociación atómica. El nivel de energía
absorbida se relaciona con la cantidad del elemento presente. Otro método utiliza el horno de grafito para
muestras en estado sólido.
CaC2 O 4  H2 SO 4  CaSO4  H2 C 2 O 4
3H2 SO 4  5H2 C 2 O 4  2KMnO4  2MnSO4  K 2 SO 4  10CO2  8H2 O
Dado que algunos de estos equipos son costosos, muchos de los métodos gravimétricos, por titulación y
colorimétricos son utilizados en algunos laboratorios en forma rutinaria. La precisión y exactitud de estos
métodos depende del cuidado que se tenga en el procedimiento, en especial la contaminación durante el
mismo. En muchos casos, el contenido de minerales de una muestra obtenida en campo, tales como heno,
pastos de corte, entre otros, contienen minerales provenientes de la contaminación por el contacto con el
suelo, por lo que el contenido de minerales se eleva. Otra fuente de contaminación puede ser el
instrumento con el cual se obtuvo la muestra, por lo que se recomienda el uso de instrumentos de acero
inoxidable.
A. DETERMINACIÓN DE CALCIO
Entre los elementos que revisten cierta importancia en la nutrición animal se encuentra el calcio, que gran
parte del mismo se encuentra como constituyente de los huesos y dientes. No obstante, el calcio posee
otras funciones en el metabolismo y fisiología animal Los métodos pueden ajustarse si la medición se
desea realizar en una mezcla mineral o en un alimento. En este procedimiento el calcio presente en la
muestra es forzado a formar un precipitado de oxalato de calcio por la adición de una solución saturada de
oxalato de amonio a la solución de las cenizas del material evaluado. Este precipitado se lava
completamente con hidróxido de amonio para eliminar el exceso de oxalato de amonio. Por la acción del
ácido sulfúrico, el oxalato de calcio forma ácido oxálico y sulfato de calcio. El ácido oxálico es determinado
utilizando una solución estandarizada de KMnO4.
Las reacciones involucradas en el proceso para la determinación del contenido de calcio de la muestra son
las siguientes:
REACTIVOS:
1. Determinación de calcio en mezcla mineral
 Ácido Clorhídrico 3 N: Diluya ácido clorhídrico concentrado 12 N en una relación 1:3 en agua
destilada. Esto es 250 ml de HCl concentrado y llevar hasta un litro de solución. Concentración
aproximada 3 N.
 Ácido nítrico concentrado: Utilice ácido nítrico concentrado 15.9 N grado reactivo.
 Ácido sulfúrico concentrado: Utilice ácido sulfúrico concentrado 36.0 N grado reactivo.
 Solución de rojo de metilo (indicador)
44
 Hidróxido de amonio:
 Solución de hidróxido de amonio 7.25 N: Diluya hidróxido de amonio concentrado (14.5 N) en
una relación 1:1 en agua destilada.
 Solución de hidróxido de amonio 0.3 N: Diluya hidróxido de amonio concentrado (14.5 N) en
una relación 1:50 en agua destilada.
 Solución saturada de oxalato de amonio: Prepare una solución al 4.2% de oxalato de amonio
utilizando agua destilada.
 Permanganato de potasio 0.1 N: Diluya 3.16 g de KMnO4, grado reactivo, en un litro de agua
destilada. Mantenga esta solución alejada de la luz solar. Es preferible almacenarla en botella de
color ámbar o en una botella clara envuelta en papel de aluminio. Preferiblemente dentro de un
anaquel.
2. Determinación de calcio en forrajes
 Permanganato de potasio 0.05 N: Diluya 1.58 g de KMnO4, grado reactivo, en un litro de agua
destilada. Mantenga esta solución alejada de la luz solar. Es preferible almacenarla en botella de
color ámbar o en una botella clara envuelta en papel de aluminio. Preferiblemente dentro de un
anaquel.
PROCEDIMIENTO
1. Determinación de calcio en mezcla mineral
 Coloque un crisol de porcelana en un incinerador a 600 °C por espacio de dos horas.
 Retire el crisol del incinerador y déjelo enfriar por aproximadamente 60 m en un desecador.
 Coloque el crisol en una balanza analítica y agregue aproximadamente 2 g de muestra, finamente
molida, con exactitud de 0.0001 g (P1) o puede utilizar el residuo de la determinación de cenizas
 Coloque el crisol con la muestra en el incinerador, cierre la puerta y encienda el incinerador.
crisoles hacia un desecador, utilizando pinzas y guantes de asbesto, para que se enfríen. Esto
puede durar cerca de una hora.
 Añada al crisol 40 ml de HCl (1:3) y unas gotas de HNO 3 concentrado.
 Coloque el crisol en una plancha caliente y lleve hasta punto de ebullición debajo de una campana
extractora de gases.
 Transfiera la solución a un frasco volumétrico de 250 ml, deje enfriar y lleve hasta la marca de 250
ml con agua destilada. Tape el volumétrico y mezcle completamente.
 Deje reposar y transfiera una alícuota de 25 ml de la solución a un vaso químico y agregue 75 ml
de agua destilada. Añada dos gotas de rojo de metilo.
 Añada, gota a gota, solución de NH4OH 7.5 N hasta lograr un pH de 5.6 o hasta que la coloración
de la solución sea chocolate-anaranjada. Si se pasa del color, agregue unas gotas de HCl 7.5 N
para corregir y volver al color naranja. Finalmente, al llegar al color deseado, añada dos gotas
adicionales de HCl 7.5 N. La coloración debe cambiar a rosado, no naranja, y el pH debe estar
entre 2.5 a 3.0.
 Diluya hasta 150 ml con agua destilada.
 Lleve la solución a punto de ebullición sobre una hornilla y añada lentamente 10 ml de solución
saturada caliente de oxalato de amonio. El color puede cambiar a anaranjado o amarillo, si este
fuera el caso, añada unas gotas de la solución de HCl 3 N hasta que la solución vuelva a tomar el
color rosado.
 Deje reposar toda la noche para que se asiente el precipitado.
 Filtre el sobrenadante en papel filtro o en un crisol tipo Gooch, y lave varias veces el precipitado
con la solución de NH4OH 0.3 N.
 Coloque el papel filtro o crisol en el mismo vaso químico donde se obtuvo el precipitado y añada
125 ml de agua destilada y 5 ml de ácido sulfúrico. Asegurarse de haber disuelto todo el
precipitado.
45
 Caliente la solución hasta los 70 ºC y titule con la solución de KMnO4 0.1 N hasta que el color de la
59
solución cambie levemente a rosado. La temperatura de la solución no debe bajar de 60 ºC.
 Corrija el volumen utilizado con lo consumido por los blancos.
 Calcule el porcentaje de calcio.
2. Determinación de calcio en forrajes
 Coloque el crisol en una balanza analítica y agregue aproximadamente 2.5 g de muestra,
finamente molida, con exactitud de 0.0001 g (P1) o puede utilizar el residuo de la determinación de
cenizas
60
crisoles hacia un desecador, utilizando pinzas y guantes de asbesto, para que se enfríen. Esto
puede durar cerca de una hora.
 Añada al crisol 40 ml de HCl (1:3) y unas gotas de HNO 3 concentrado.
 Transfiera la solución a un frasco volumétrico de 250 ml, deje enfriar y lleve hasta la marca de 250
ml con agua destilada. Tape el volumétrico y mezcle completamente.
 Deje reposar y transfiera una alícuota de 25 ml de la solución a un vaso químico y agregue 75 ml
61
de agua destilada. Añada dos gotas de rojo de metilo.
 Añada, gota a gota, solución de NH4OH 7.5 N hasta lograr un pH de 5.6 o hasta que la coloración
de la solución sea chocolate-anaranjada. Si se pasa del color, agregue unas gotas de HCl 7.5 N
para corregir y volver al color naranja. Finalmente, al llegar al color deseado, añada dos gotas
adicionales de HCl 7.5 N. La coloración debe cambiar a rosado, no naranja, y el pH debe estar
entre 2.5 a 3.0.
 Diluya hasta 150 ml con agua destilada.
 Lleve la solución a punto de ebullición sobre una hornilla y añada lentamente 10 ml de solución
saturada caliente de oxalato de amonio. El color puede cambiar a anaranjado o amarillo, si este
fuera el caso, añada unas gotas de la solución de HCl 3 N hasta que la solución vuelva a tomar el
color rosado.
 Deje reposar toda la noche para que se asiente el precipitado.
 Filtre el sobrenadante en papel filtro o en un crisol tipo Gooch, y lave varias veces el precipitado
con la solución de NH4OH 0.3 N.
 Coloque el papel filtro o crisol en el mismo vaso químico donde se obtuvo el precipitado y añada
125 ml de agua destilada y 5 ml de ácido sulfúrico. Asegurarse de haber disuelto todo el
precipitado.
 Caliente la solución hasta los 70 ºC y titule con la solución de KMnO4 0.05 N hasta que el color de
6263
la solución cambie levemente a rosado. La temperatura de la solución no debe bajar de 60 ºC.
 Corrija el volumen utilizado con lo consumido por los blancos.
 Calcule el porcentaje de calcio.
59
Cuando utiliza papel filtro, este puede causar la pérdida de color en pocos segundos.
En algunos casos se recomienda precalentar e incinerar la muestra en una campana sobre una plancha caliente hasta que deje de
emanar humo y luego se transfiere al incinerador. Esto aumenta la manipulación de la muestra y puede aumentar el grado de
error.
61
Se recomienda utilizar una alícuota de 100 ml para granos.
62
Cuando utiliza papel filtro, este puede causar la pérdida de color en pocos segundos.
63
Para precisión en el método se debe ajustar el peso de la muestra, el tamaño de la alícuota y la concentración de KMnO4 de
manera que se consuman cerca de 20 ml de KMnO4.
60
46
PORCENTAJE DE CALCIO 
ml de KMnO4 x NKMnO 4 x 0.020 x 250
P1 x Volumen de alicuota
x100
Para el cálculo del contenido de calcio en base seca se debe realizar el siguiente ajuste:
% DE CALCIO EN BASE SECA
% DE CALCIO PARCIALMENTE SECO
x 100
47
B. DETERMINACIÓN DE FÓSFORO
Otro de los minerales que tiene gran importancia en la nutrición animal lo constituye el fósforo. Este es otro
elemento que se encuentra formando parte estructural en tejidos, como huesos y dientes, así como de
otros compuestos que tienen que ver con el metabolismo y fisiología, tales como el ADP, proteínas, lípidos,
entre otros. Uno de los métodos mas utilizados para la determinación del fósforo es el colorimétrico,
aunque también pueden utilizar otras técnicas como la espectrofotometría atómica. En este procedimiento,
el fósforo, como ácido fosfórico, reacciona con el molibdato de amonio y vanadato de amonio dando como
resultado la formación, en un medio ácido, del complejo de amoniofosfomolibdato y vanadio de color
amarillo. Este complejo se reduce dando paso a lo que se conoce como azul de molibdeno, encontrándose
una alta correlación entre la intensidad del color azul con la concentración de fósforo.
REACTIVOS:
 Reactivo de molibdenovanadato: Disuelva 27 g de molibdato de amonio en 400 ml de agua
destilada caliente y deje reposar para enfriar. Prepare una solución de 1.12 g de metavanadato de
amonio (NH4VO3) en 300 ml de agua caliente y deje reposar para enfriar. Añada posteriormente a la
solución de molibdato 250 ml de ácido nítrico. Finalmente, añada lentamente la solución de
molibdato a la solución de vanadato y lleve el volumen final a un litro. Guarde la solución resultante
en una botella ámbar.
 Solución estándar de fósforo: Disuelva 4.394 g de KH2PO4 en agua y lleve a un litro de solución.
Esta solución contiene 1000 ppm o 1 mg/ml de fósforo. Se preparan distintas soluciones tomando
alícuotas de 0, 5, 10. 15, 20, 25, 30, 35 y 40 ml que contienen 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 y 40 ppm
de fósforo, las que se transfieren a volumétricos de 50 ml y agregue los reactivos en la secuencia
que se aplicaran a la alícuota de la muestra.
PROCEDIMIENTO
 Añada al crisol 40 ml de HCl (1:3) y unas gotas de HNO3 concentrado.
 Con ayuda de un papel filtro, transfiera la solución a un frasco volumétrico de 250 ml, deje enfriar y
lleve hasta la marca de 250 ml con agua destilada. Tape el volumétrico y mezcle completamente.
 Tome una alícuota de 10 ml y transfiérala a un volumétrico de 50 ml, añádale 5 ml de la solución de
molibdenovanadato. Tape el volumétrico y mezcle completamente. Lleve hasta el aforo de 50 ml con
64
agua destilada, tape el volumétrico y mezcle completamente.
 Deje reposar por 10 minutos y lea la absorbancia a los 400 nm, tanto de la muestra en duplicado
como de las soluciones patrones.
 Determine la ecuación de regresión con las lecturas de las soluciones estándares y determine la
concentración de fósforo en la muestra.
Existen diferentes programas para computadoras o ciertas calculadoras que pueden realizar algunas
operaciones de tipo científico o estadísticas que permiten estimar directamente la ecuación de regresión
64
En este momento proceda a realizar la adición de la solución de molibdatovanadato a las alícuotas de las soluciones estándares de
fósforo.
48
que se adecue a los datos obtenidos en la determinación de fósforo en la muestra. Un método más simple,
consiste en utilizar una hoja milimetrada o cuadriculada donde se colocan las lecturas de absorción
obtenidas para cada concentración de las soluciones estándares, se traza la línea recta que contenga el
mayor número de puntos, luego se proceda a “interpolar” la lectura obtenida para la muestra y determinar
su concentración. Esto implica que existe la posibilidad de que cada persona pueda trazar una línea
diferente, y por consiguiente obtener diferentes valores para la muestra.
Al no contar con una calculadora o computadora es posible determinar el valor de la ecuación de regresión
realizando las operaciones que se describen en la siguiente tabla. Esto permitiría estimar la concentración
de fósforo en la muestra, con la sustitución de la lectura en la ecuación obtenida. En esta tabla r
corresponde al coeficiente de correlación, b al coeficiente de regresión o pendiente de la curva, a al
intercepto o valor de y para x = 0, y Ŷ = a + bX corresponde a la ecuación de regresión, donde X es la
concentración a determinar para cada muestra. Por consiguiente, una vez obtenida la lectura para la
muestra, su concentración corresponderá a: X = ( Ŷ - a)/b, donde Ŷ es reemplazado por la lectura de
absorbancia obtenida de la muestra.
Concentración
ppm (X)
Absorbancia
% (Y)
∑X =
∑Y=
∑XY =
X=
(∑X)2/n =
Y=
(∑Y)2/n =
(∑X∑Y)/n =
r2 = (∑xy)2/(∑x2 ∑y2)
X2
XY
r=
∑X2=
r2
Y2
x
X-
y
X
Y-Y
∑Y2=
b = ∑xy/∑x2
Xy
∑xy =
a=
Y -b X
x2
y2
∑x2 =
∑y2 =
Ŷ = a + bX
Una vez determinada la concentración de fósforo en la alícuota, se calcula la concentración de fósforo en
la muestra de acuerdo a la siguiente ecuación:
PORCENTAJE DE FÓSFORO 
ppm de Fósforo x 250 ml
P1 x 106 x 1 ml
x100
Para el cálculo del contenido de fósforo en base seca se debe realizar el siguiente ajuste:
% DE FÓSFORO EN BASE SECA
% DE FÓSFORO PARCIALMENTE SECO
x 100
49
C. DETERMINACIÓN DE POTASIO
Un método por el cual se puede analizar el contenido de potasio en una muestra es utilizando el Fotómetro
de Llama. A continuación un procedimiento común empleado para el análisis con este método.
De forma general el Uso del Fotómetro de llama es como se detalla a continuación.
 Lea inicialmente las instrucciones para el uso y protección adecuadas del equipo.
 Cuando esté listo con las muestras y patrones, llame al Técnico de Laboratorio para que encienda la
llama.
 Se estabiliza el fotómetro de llama.
 Aspire agua deionizada por lo menos dos minutos para limpiar y estabilizar el equipo.
 Mientras se aspira el agua deionizada coloque el control en CERO en la unidad de lectura a 0.0
unidades.
 Podrá darse algunas variaciones de lectura en el lector.
 Aspire primeramente la solución estándar más concentrada, y use el botón de GANANCIA (GAIN)
para establecer la lectura en 100.0 unidades.
 Verifique nuevamente el CERO con agua deionizada y la lectura de 100 con la concentración
estándar mas concentrada.
 Ahora proceda a aspirar todas las concentraciones estándar y los desconocidos uno a uno,
aspirando agua deionizada entre cada lectura para limpiar la unidad.
 El quemador mostrara un “efecto de memoria”.
 Repita todos los pasos de lectura nuevamente por una segunda vez para obtener una buen juego de
lecturas duplicadas.
 Repita todo por una tercera vez si fuera necesario para un tercer juego de lecturas.
 Cuando termine, aspire agua deionizada por lo menos dos minutos.
 Llame al Técnico de Laboratorio para que apague la unidad.
 Limpie el área de trabajo
Entre los mecanismos principales para el uso de este método están el principio de que las soluciones de
las muestras son atomizadas o aspirados como fina neblina hacia la llamas. El principio es la conversión
de las soluciones de muestra en aerosoles por un atomizador. Esto no implica un cambio químico en la
muestra en este estado. El atomizador no convierte nada en átomos. Seguidamente, el calor de la llama
vaporiza los constituyentes de la muestra, pero aún no ocurre ningún cambio químico. Por el calor de la
llama mas la acción del gas reductor (combustible) las moléculas e iones de las muestras son
+
0
descompuestas y reducidas para dar átomos. Ejemplo: Na + e →Na . El calor de la llama causa
excitación de algunos átomos hacia altos niveles electrónicos. Los átomos excitados se revierten hacia su
estado basal por la emisión de energía lumínica o fotones, һ, de una característica longitud de onda
medida por un detector. En la figura 10 se presenta un esquema de un Fotómetro de llama.
Fotodetector
Espejo
Lente
Rendija
Filtro
Aerosol entra en la llama
Combustible
Aire del
compresor
Muestra
Los átomos en el estado de vapor presentan una
línea espectral, no una banda, debido a que no hay
enlaces covalentes por lo que no hay subniveles
vibracionales para causar una amplitud en la línea.
Un filtro de vidrio coloreado es usualmente capaz de
aislar la línea de un elemento analítico si este ha
sido bien separado de otras líneas de emisión. Por
ejemplo para medir Na y K en una muestra que
contenga ambos esta es la separación de las líneas.
Emisión de
Sumidero
Figura 10. Esquema general de un fotómetro de llama.
Na
K
||
||
___________________________________
400
500
600
700
800
 (nm)
50
La fotometría de llama cuantitativa se obtiene analizando la relación de la intensidad de la emisión en
función de la concentración de iones de la muestra en solución que se está midiendo. Está relación es
lineal sobre un amplio rango pero se da una desviación a bajas y altas concentraciones tal como se
muestra en la figura 11.
Intensidad de
emisión
Concentración
A muy bajas concentraciones la emisión cae por debajo de lo
esperado. Debido a la ionización (algunos átomos vuelven a iones,
+
ejemplo: K → K + e .Y además hay una insignificante ionización a
altas temperaturas. No obstante hay una región lineal.Se da una
desviación negativa a altas concentraciones debido a una
autoabsorción. Los fotones emitidos por los átomos excitados son
parcialmente absorbidos por los átomos en su estado basal en la
llama.
Una mezcla de propano y aire o gas natural y aire dan una buena llama, un elevado nivel de calor, y una
mínima emisión de luz de fondo. Pero siempre se requiere correr un blanco con el solvente para
establecer la emisión a cero. Las soluciones diluidas, como se indicó con anterioridad, tienden a salirse de
la parte lineal de la curva de emisión. Se puede calibrar con estándares adecuadamente, por ejemplo de
+
+
+
0.05 hasta 0.25 mM de K . El uso de soluciones de muy bajas concentraciones de Na y K dan problemas
+
para evitar contaminación. Especialmente el Na que se libera lentamente de vidrio, contacto con la piel,
en algunos casos.
Los efectos de interferencia de aniones y cationes pueden causar errores, aumento o disminución. El
efecto de “amortiguamiento de la radiación” por la dilución de estándares y muestras promueven
inconsistencias. El uso de fotometría de llama como una herramienta cuantitativa puede remontarse hasta
los trabajos de Kirchhoff y Bunsen en los años de 1860. Pero su uso e historia moderna se inicia en los
años de 1940 cuando los instrumentos se hicieron mayormente disponibles para resolver
satisfactoriamente los problemas de introducción de muestras reproducibles y detección. La fotometría de
llama rápidamente se desarrollo en una herramienta analítica confiable para la determinación de diversos
cationes de interés farmacéutico, notablemente Sodio, Potasio y Litio. La técnica es útil en el análisis de
drogas voluminosas, formas de dosis y muestras clínicas tales como sangre y orina. Hay fotometría de
llama tradicional o de baja temperatura de la llama. La fotometría de alta temperatura ha evolucionado
hacia otras técnicas diversas típicamente identificadas por sus fuentes de temperatura. Por ejemplo
Espectrometría de emisión atómica acoplada a plasma inductiva (ICP-AES por sus siglas en inglés).
PROCEDIMIENTO
 Cuando la temperatura alcance los 600 °C deje las muestras por espacio de dos horas o una noche.
 Añada al crisol HCl (1:1).
 Con ayuda de un papel filtro, transfiera la solución a un frasco volumétrico de 50 ml, deje enfriar y
lleve hasta la marca de 50 ml con agua destilada. Tape el volumétrico y mezcle completamente.
 Tome una alícuota de 1 ml y transfiérala a un volumétrico de 10 ml, afore con 9 ml de agua destilada.
Tape el volumétrico y mezcle completamente. Dilución 1:10
51
 Tome una alícuota de 1 ml de la dilución anterior y transfiérala a un volumétrico de 10 ml, afore con 9
ml de agua destilada. Tape el volumétrico y mezcle completamente. Dilución 1:100
 Proceda a calibrar el fotómetro de llama con las soluciones patrones de Potasio. El ero se calibra con
agua destilada y el 100% de emisión con la solución patrón de 30 ppm de potasio.
 Determine el porcentaje de emisión de los patrones de Potasio para la construcción de la gráfica de
análisis. % de emisión vs ppm de Potasio en los patrones.
 Los patrones se preparan tomando alícuotas de 5, 10, 15, 20, 25 y 30 ml de una solución valorada
de 100 ppm de Potasio y transfiriendo cada alícuota a matraces volumétricos de 100 ml,
procediéndose a completar o aforar el volumen con agua destilada.
 Lea la emisión de la muestra primero en el extracto original y luego en las diucones se requiere.
 Determine la ecuación de regresión con las lecturas de las soluciones estándares y determine la
concentración de Potasio en la muestra.
Existen diferentes programas para computadoras o ciertas calculadoras que pueden realizar algunas
operaciones de tipo científico o estadísticas que permiten estimar directamente la ecuación de regresión
que se adecue a los datos obtenidos en la determinación de potasio en la muestra. Un método más simple,
consiste en utilizar una hoja milimetrada o cuadriculada donde se colocan las lecturas de absorción
obtenidas para cada concentración de las soluciones estándares, se traza la línea recta que contenga el
mayor número de puntos, luego se proceda a “interpolar” la lectura obtenida para la muestra y determinar
su concentración. Esto implica que existe la posibilidad de que cada persona pueda trazar una línea
diferente, y por consiguiente obtener diferentes valores para la muestra.
Al no contar con una calculadora o computadora es posible determinar el valor de la ecuación de regresión
realizando las operaciones que se describen en la siguiente tabla. Esto permitiría estimar la concentración
de potasio en la muestra, con la sustitución de la lectura en la ecuación obtenida. En esta tabla r
corresponde al coeficiente de correlación, b al coeficiente de regresión o pendiente de la curva, a al
intercepto o valor de y para x = 0, y Ŷ = a + bX corresponde a la ecuación de regresión, donde X es la
concentración a determinar para cada muestra. Por consiguiente, una vez obtenida la lectura para la
muestra, su concentración corresponderá a: X = ( Ŷ - a)/b, donde Ŷ es reemplazado por la lectura de
absorbancia obtenida de la muestra.
Concentración
ppm (X)
Absorbancia
% (Y)
XY
∑X2=
∑X =
∑Y=
∑XY =
X=
(∑X)2/n =
Y=
(∑Y)2/n =
(∑X∑Y)/n =
r2 = (∑xy)2/(∑x2 ∑y2)
r=
X2
r2
Y2
x
X-
y
X
Y-Y
∑Y2=
b = ∑xy/∑x2
Xy
∑xy =
a=
Y -b X
x2
y2
∑x2 =
∑y2 =
Ŷ = a + bX
Una vez determinada la concentración de fósforo en la alícuota, se calcula la concentración de potasio en
la muestra de acuerdo a la siguiente ecuación:
PORCENTAJE DE POTASIO 
ppm de Potasio x 0.25
P1 x Volumen de alicuota
52
Para el cálculo del contenido de potasio en base seca se debe realizar el siguiente ajuste:
% DE POTASIO EN BASE SECA
% DE POTASIO PARCIALMENTE SECO
x 100
Por interpolación se puede obtener el % de potasio de la muestra interpolando el porcentaje de emisión en
la gráfica construida y realizar las siguientes operaciones:
% de  
pp M de   25  F
1000
donde F es igual a 1, si la lectura es del extracto original, 10, si la lectura es de la primera dilución (1:10) y
100 si la lectura es de la segunda dilución (1:100)
53
XIII. LITERATURA CONSULTADA
Abe, T. The studying data of the Livestock Experiment Station. Vol. 2. 1988
th
AOAC International. Official Methods of Analysis. 17 Ed. W. Horwitz, Editor. 2000.
Chapman, H, y Prat, P. Métodos de Análisis para Suelos, Plantas y Aguas. Editorial Trillas, México, 195
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Edwards y J. F. Greenhalg. Animal Nutrition. 2da. Edición. Longman, 1977
Eskin, N.A.M., H.M. Henderson y R.J. Townsend. Biochemistry of Foods. Academic Press, New York.
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Harris, L., J. Malcon A. y E.W. Crampton. An International Feed nomenclature and methods for
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Jurgens, M. H. Animal Feeding and Nutrition. Kendall/Hunt Publishing Company, 4ta. Ed., 1978
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Undersander, D., D.R. Mertens and N. Thiex. Forage Analyses Procedures. National Forage Testing
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Woods, A.E. y L.W. Aurand. Laboratory Manual in Food Chemistry. The AVI Publishing Company, Inc.
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54

guía para el análisis bromatológico de muestras de forrajes

Transcripción

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