Análisis de Proteínas

Transcripción

Electroforesis, Transferencia e Inmunodetección
advansta
Análisis de Proteínas:
Electroforesis, Transferencia e Inmunoprecipitación.
Un manual de laboratorio de la empresa Advansta
Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas.
Este método, descrito por primera vez por Towbin, et. al1, permite la detección de una sola
proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la proteína de interés.
Con la técnica de Western Blot se puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la
presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación,
y ser utilizado para comparar cuantitativamente los niveles
de proteína entre muestras.
Esta guía de laboratorio describe los pasos
involucrados en la realización de un Western
blot, incluyendo la preparación de muestras,
la separación de proteínas, la transferencia y
la detección.
Índice de Contenidos
Página
1. Western Blot: Visión General
2
2. Preparación de las muestras
4
3. Electroforesis en gel de Poliacrilamida
5
4. Transferencia Electroforética
11
5. Hibridación Anticuerpos
13
6. Detección
15
7. Solución de Problemas
17
8. Herramientas y Referencias Técnicas
21
1. Towbin, H. et. al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76(9):4350-4.
Página 1
Western Blot:
Visión General
1. Western Blot: Visión General
Consulte los capítulos siguientes para obtener más detalles acerca de cada paso.
a. Preparación de la muestra
Extracción de las proteínas de
las muestras biológicas mediante disrupción mecánica o
química.
Los materiales de partida incluyen
planta, tejidos animales, células
cultivadas, levadura, o bacterias.
La disrupción mecánica
con un homogenizador
disgrega los tejidos.
Procesos adicionales
logran el fraccionamiento subcelular
Se usan tampones conteniendo detergentes
para la lisis celular
Figura 1. Preparación de muestras
b. Electroforesis en gel de
Acrilamida
Las proteínas en el extracto se
separan de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis.
Se prepara un gel de acrilamida, bisacrilamida.
El dodecilsulfato de sodio
(SDS) añadido al gel se une a
las proteínas y confiere, de
forma proporcional a la masa
de cada proteína, una carga
negativa a cada una de ellas.
Se añade un colorante de carga. Así, la
migración de la muestra se puede monitorizar.
Se utiliza una pipeta para
cargar las muestras en los
pocillos del gel
Una fuente de alimentación proporciona el voltaje
El gel se coloca dentro de un tanque
de electroforesis lleno de tampón,
que conducirá la corriente. La proteínas con carga negativa migran desde el ánodo.
Figura 2. Electroforesis en Acrilamida
c. Transferencia electroforética a una membrana
Las proteínas son transferidas
electroforéticamente a un
soporte rígido o membrana,
dónde quedan inmovilizadas.
El gel y la membrana se coloca
entre papel de filtro y almohadillas
de esponja..
Se aplica voltaje en el
tanque de transferencia y
las proteínas migran desde
el gel a la membrana.
Un cartucho aplica presión y
mantiene un estrecho contacto
entre el gel y la membrana.
Figura 3. Transferencia de Proteínas a la Membrana
Página 2
a. Hibridación del Anticuerpo
La membrana con las proteínas inmovilizadas debe tratarse para bloquear las zonas
con ausencia de proteínas y
así evitar la unión no específica de los anticuerpos.
A continuación se incuba con
un anticuerpo primario dirigido contra el epítopo específico de la proteína diana.
Tras varios lavados de la membrana, se adiciona un anticuerpo secundario marcado
que se unirá de forma específica al anticuerpo primario,
proporcionando una forma
de detección.
Los materiales de partida incluyen
tejidos vegetales, tejidos animales,
células en cultivo, levadura, o bacterias.
Figura 4. Hibridación de Anticuerpo
e. Detección de las Bandas
Después de un lavado de la
membrana para eliminar el
anticuerpo no unido, se procede a detectar la localización de la banda en la membrana. Para la detección de
quimioluminiscencia, se utiliza
un anticuerpo secundario
conjugado con el enzima peroxidasa (HRP); la adición de
un sustrato de HRP provoca
una reacción enzimática que
da como resultado final la
emisión de luz. Dicha luz puede ser detectada en una película de rayos X, o de forma
digital, mediante un sistema
de captación de imágenes.
La detección de fluorescencia se basa en la captación
de luz emitid por sustancias
fluoróforas conjugadas con el
anticuerpo secundario.
Página 3
Figura 5. Detección quimioluminiscente de las bandas de proteínas
Preparación
de la muestra
2. Preparación de la muestra
Una adecuada preparación de la muestra es
esencial para tener éxito en un ensayo de Western Blot. En la mayoría de ensayos, las proteínas
se extraen mediante procesos químicos y/o
mecánicos. El método elegido dependerá del
tipo de muestra de partida, de la localización
subcelular de la proteína y de las condiciones
óptimas que requiera el anticuerpo para reconocer el epítopo proteico. En la tabla 1 se resumen
los métodos mecánicos que habitualmente se
utilizan en la extracción de proteínas para inmunotransferencia.
A menudo, en muestras tisulares de plantas y animales, se requiere el uso de un proceso mecánico para la disrupción de la compleja matriz celular. Disrupción mecánica que suele preceder a un
proceso químico de lisis celular, mediante el uso
de solución tampón que contiene detergentes,
que va dirigida a enriquecer la proteína de interés
dentro del extracto final. Las células en cultivo,
frecuentemente, se suelen lisar utilizando una solución tampón con detergente y sin la aplicación
de métodos mecánicos.
La estructura química de los detergentes permite
romper las membranas celulares y solubilizar las
proteínas. Estas substancias tienen una parte polar y otra no polar y se pueden clasificar según las
características del grupo polar: iónicos si el grupo
polar tiene carga positiva o negativa, no iónicos si
no poseen carga o zwiteriónicos si poseen carga
negativa y positiva y la carga neta es 0.
La elección de la substancia detergente, depende en parte de la localización, dentro de la célula, de la proteína de interés, citoplasmática, unida a la membrana, dentro de orgánulos celulares
como el núcleo y las mitocondrias, etc...Las proteínas citoplasmáticas se pueden unir a las proteínas del citoesqueleto, afectando así a los procesos de fraccionamiento subcelular.
En la tabla 2 se clasifican las soluciones tampón y
detergentes, más utilizados habitualmente, según
el tipo de proteína y localización subcelular.
Tabla 1. Métodos físicos para la dirupción de muestras
Método
Descripción
Tipo de muestra
Licuadora
La muestra se tritura
mediante cuchillas
rotatorias
Gran cantidad de
tejido
Homogenizador
Dounce
Tubo de vidrio con
pistón ajustado maja
las células por acción de corte.
Células tisulares; útil
para protocolos de
enriquecimiento de
proteínas mitocondriales o nucleares
Homogenizador de
ultrasonidos
Ondas de sonido
Células, tejidos, bacemitidas por una
terias.
sonda para romper
las membranas celulares
Pulverización en
Nitrógeno líquido
La muestra se pulve- Tejido animal o o
riza utilizando un
vegetal
mortero y una almirez refrigerados
Perlas de vidrio
La ruptura celular se Levaduras
produce por agitación de las perlas de
vidrio
Tabla 2. Soluciones Tampón y detergentes, según el tipo de proteína de interés y la localización subcelular
Tipo/Localización
Proteína de interés
Detergente o Solución Tampón
TComentarios
Nativa (no desnaturalizada)
Detergente suave
no iónico
Evitar detergentes
desnaturalizantes
(SDS, Deoxicolatos)
Citoplasmáticos
(soluble)
Tris-HCl
Puede combinarse
con métodos mecánicos, tales como el
homogenizador
Dounce
Citoplasmático
(unida a citoesqueleto)
Tris-Triton
Los detergentes
Triton son suaves y
no iónicos
Membrana mitocon- NP-40, RIPA
drial o nuclear
(multiples detergentes), Triton X-100
Lisado total de células
Para antígenos con
niveles bajos de
expresión pueden
ser necesarios procesos de enriquecimiento
NP-40, RIPA,
Triton X-100
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Con la rotura celular, se liberan enzimas proteasas
que pueden degradar la proteína de interés. Por
tanto, es importante evitar, durate la preparación
de la muestra, cualquier actividad proteásica.
Tabla 3. Inhibidores de fosfatasas y proteasas utilizans en la extracción de proteínas.
Inhibidores Proteasas
Concentración en Enzimas diana
el Tampón de lisis
La siguiente estrategia ayuda a evitar la degradación de proteínas:
Aprotinina
1-2 µg/ml
Proteasas de Serina
EDTA
1-10 mM
Mg++/Mn++ Metaloproteasas
EGTA
1-10 mM
Ca++ Metaloproteasas
Leupeptin
1-2 µg/ml
Proteasas de Serinas,
Cisteinas
Pepstatina A
1µg/ml
Proteasas de Aspartico
PMSF
(17-170 µg/ml)
O,1—1 mM
Proteasas de Serina
Inhibidores
Fosfatasas
Concentración en
el Tampón de lisis
Enzimas diana
 - Glicerofosfato
1 mM
Fosfatasas Serina/
Treonina
EDTA
1-10 mM
Mg++/Mn++ Metaloproteasas
EGTA
1-10 mM
Ca++ Metaloproteasas
Leupeptin
1-2 µg/ml
Proteasas de Serinas,
Cisteinas
Pepstatina A
1µg/ml
Proteasas de Aspartico
PMSF
(17-170 µg/ml)
O,1—1 mM
Proteasas de Serina
 Evitar excesivos ciclos de congelación/
descongelación.
 Trabajar rápido y mantener las muestras en
frío durante todo el proceso.
 Añadir inhibidores de la proteasa en el
tampón de lisis.
Además de inhibir la actividad de la proteasa,
puede ser interesante reducir la actividad de la
fosfatasa alcalina, en particular en estudios de
fosforilación.
En la tabla 3 se muestran los inhibidores deproteasa y fosfatasa de uso más habitual.
3. Electroforesis en Acrilamida
Las proteínas del extracto se separan mediante
electroforesis en gel de poliacrilmaida (PAGE). En
primer lugar, las proteínas, se revisten con carga
negativa, mediante la acción del detergente Dodecilsulfato Sódico (SDS), así Las proteínas, se
pueden separar en el gel según su tamaño (SDSPAGE).
Medición de proteína total
Previamente a la electroforesis, es importante determinar la concentración de proteínas por las
siguientes razones:
1. Asegurar la carga de la cantidad correcta de
proteínas en el gel.
La cantidad de proteína óptima a cargar dependerá de la prevalencia de la proteína de
interés y de la sensibilidad del anticuerpo primario.
Cargar mucha cantidad puede dar lugar a un
mayor ruido de fondo y unión no específica de
los anticuerpos. A menudo, para determinar la
carga de proteína apropiada, se requiere
hacer experimentos preliminares con cantidades seriadas de proteínas.
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Nota: con el kit Afyon ™ SDS-PAGE de preparación de
muestra, se puede controlar la cantidad de carga de la proteína mediante la cantidad de resina utilizada, evitando la
necesidad de determinar la concentración de proteína. Por
ejemplo, para 5 µg de proteína se utilizan 20 µl de resina Afyon.
Información para pedidos
K-02101-025
Afyon ™ SDS-PAGE ssmple preparation kit
Electroforesis
en Acrilamida
2. Realización de Western Blots cuantitativos o
semi-cuantitativos.
Si la cantidad de proteína cargada por carril
es la misma, se pueden comparar los niveles
relativos de la proteína de interés. Un experimento de Western Blot cuantitativo es útil para
estudio de cambios de expresión de proteínas
o de modificaciones proteicas como la fosforilación.
Descripción del método
Tabla 4. Métodos físicos para la dirupción de muestras
Ensayo
Descripción
Ventajas
Inconvenientes
Bradford
El colorante
azul de Coomasie se une a
las proteínas y
sufre un cambio de absorvancia
La realización
de los ensayos
son generalmente rápidos
y sencillos
 Interferencia
de SDS o de
otros detergentes a
altas concentraciones
.
 Rango lineal
pequeño.
BCA
Reducción de  Compatible
iones de Cu2+
con la mayo
mediante interación con las
ría de deterproteínas, el
gentes
 ComercialBCA se une a
los iones de
mente dispoCu1+ y forman
nible en forun producto
mato comcoloreado que
patible con
se puede meagentes
dir espectroforeductores.
metricamente  Menos varia(reacción de
ción proteíBiuret)
na-proteína
que en el
método
Bradford.
Lowry
Similar al BCA
(reacción de
Biuret)
Existen diversos métodos para medir la proteína
total de una muestra. Los más habituales son los
métodos Lowry, Bradford y Ácido Bincocinico
(BCA) (Tabla 4). Estos ensayos colorimétricos se
basan en las reacciones que se producen entre
las proteínas de la muestra y los reactivos de detección.
Con el fin de determinar la concentración de proteínas totales en una muestra, se debe realizar
una curva estándar en cada ensayo. Esto se logra
con la realización de un ensayo de concentración crecientes, de proteína pura. El estándar utilizado con mayor frecuencia es la albúmina de
suero bovino (BSA), aunque se puede utilizar cualquier proteína producida en el laboratorio o disponible comercialmente.
En la figura 6 se muestra un ejemplo de una curva
estándar. Los valores de absorvancia se trazan en
función del contenido conocido de la proteína
estándar utilizada. El contenido de la proteína de
interés en la muestra (línea verde) se puede determinar mediante la extrapolación de la absorvancia obtenida a la cantidad o concentración
de proteína correspondiente.
Interferencia
con agentes
quelantes o
reductores del
Cobre
Muy bien cita-  El tiempo de
da en literatura
ensayo puede ser mayor
que en otros
métodos
 No es práctico para
grupos grandes de
muestras
 Se pueden
formar precipitados
Hay muchos kits de determinación de proteínas
disponibles comercialmente. La elección depende de muchos factores:
 El equipo de lectura disponible en el laboratorio (espectrofotómetro, lector de placas,
etc…).
 Los reactivos del tampón de lisis - revisar el
protocolo del fabricante para identificar
sustancias interferentes.
 La cantidad de muestra disponible.
 La facilidad/rapidez del ensayo.
Absorvancia
Elección de un ensayo de proteínas
Proteína (mg)
Figura 6. Ejemplo de la curva estándar de un ensayo de proteínas. Se representa la absorvancia de las soluciones estándar
que contienen la proteína conocida (línea roja). La concentración de la proteína de interés se puede determinar extrapolando la absorvancia obtenida en la curva patrón o estándar
(línea verde de puntos).
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Tampón de carga de muestras
Una vez se tienen las muestras de proteína, se
pueden conservar congeladas, teniendo cuidado en evitar ciclos repetitivos de congelación/
descongelación. Alternativamente, se pueden
utilizar inmediatamente, combinándolas con un
tampón de carga y cargar la muestra en un gel
de electroforesis. Los componentes del tampón
de carga varían, dependiendo de las condiciones deseadas. Los ingredientes típicos de un
tampón de carga para detectar proteínas bajo
condiciones desnaturalizantes/reductoras se describen en la Tabla 5. No se utilizarán ni SDS, beta
mercaptoetanol o ditiotreitol, si se necesitan condiciones no desnaturalizantes /no reductoras.
Previamente a la carga del gel, las muestras se
someten a una incubación a 95ºC durante 5-10
minutos, para asegurar que la desnaturalización/
reducción es total. En condiciones no desnaturalizantes/no reductoras, esta incubación no es necesaria. En la Figura 7 se ilustra cual es el mecanismo de desnaturalización del SDS.
La proteína se encuentra en su
estado conformacional, manteniendo su carga intrínseca
SDS
El SDS se une a la proteína y da
lugar a una linearización y a una
uniformidad de la carga negativa
de ésta.
Figura 7. Mecanismo de desnaturalización por SDS de las proteínas.
Tabla 5. Componentes del tampón de carga.
Reactivo
Propósito
Glicero.
Aportan Viscosidad/densidad para arrastrar
la muestra la fondo del pocillo y evitar que se
extienda a los pocillos adyacentes.
Azul de Bromofenol
Molécula colorante pequeña:
 Da color a la muestra para ayudar a
la carga.
 Migra por delante de las proteínas, de
modo que se puede hacer el seguimiento del movimiento de las muestras
en el gel.
SDS
Detergente desnaturalizante
 Cola hidrofóbica que rodea la esqueleto peptídico.
 Unión a la proteína de forma regular,
aportando carga negativa de forma
proporcional al tamaño de la proteína.
 Evita las interacciones hidrofóbicas y
rompe los enlaces de hidrógeno.
 Destruye la estructura secundaria/
terciaria y lineariza la proteína.
Beta Mercaptoetanol o DTT
Agentes reductores
 Evita la oxidación de cisteínas.
 Completan la linearización de la proteína al romper los puentes disulfuro.
Tampón Tris Pepstatina A
Mantiene el pH adecuado
Nota: Los tampones de carga permiten ahorrar tiempo y
garantizan que las muestras se separan de forma reproducible, carril a carril y gel a gel. Advansta dispone de tampones
de carga reductores y no reductores.
R– 03018-B10 Non-reducing protein sample loading buffer (2x)
R-03019-B10
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Reducing protein sample loading buffer (2x)
Electroforesis
en Acrilamida
Gel de Electroforesis
Si se requieren condiciones naturales para que el
anticuerpo pueda detectar el epítopo, en la
electroforesis no se añadirá SDS ni en el gel ni en
el tampón de electroforesis. En esta situación,
también conocida como PAGE nativo, las proteínas mantienen su estructura tridimensional y la
migración en el gel depende de su masa: relación de carga de la proteína por encima de su
tamaño. Sin embargo, la mayoría de ensayos
Western Blot, se realizan en geles de poliacrilamida conteniendo SDS (SDS-PAGE) en condiciones
desnaturalizantes. Bajo estas condiciones desnaturalizantes y de reducción, las proteínas cargadas negativamente, cuando se someten a un
campo eléctrico, migran al electrodo positivo.
Debido a que el SDS iguala la carga en todas las
proteínas, la tasa de migración viene determinada por su peso molecular. Las moléculas más pequeñas migran más rápidamente que aquellas
con pesos moleculares mayores.
Tabla 6. Componentes del gel de acrilamida en las electroforesis
de proteínas
Reactivos
Propósito
Acrilamida
Moléculas que polimerizan para formar
cadenas.
Bisacrilamida
Forman uniones con las cadenas de acrilamida para formar un entramado.
SDS
Mantiene la linearidad y la uniformidad
de carga de las proteínas según la electroforesis.
Tampón Tris
Mantiene el pH adecuado.
Persulfato de Amonio
Generación de radicales libres que catalizan la reacción de polimerización.
TEMED
Aumenta la generación de radicales
libres por el persulfato de amonio.
Los geles de SDS-PAGE están disponibles comercialmente o se pueden elaborar en el propio laboratorio. Los geles pre-fabricados son muy
prácticos pero debido al coste, no son tan rentables como los elaborados por el usuario. En la tabla 6, se describen los componentes químicos de
un gel de SDS-PAGE.
Elección del grosor del gel y del tamaño de poro
El tipo de muestra y el peso molecular de la proteína de interés dictan el espesor y tamaño de
poro del gel.




Los espaciadores de gel (ver Figura 8) controlan el espesor del gel. Están disponibles en
diversos tamaños.
Los geles con mayor espesor, pueden aceptar mayor volumen de carga. También se
procesarán más lentamente y requieren
tiempos de transferencia mas largos que los
geles más delgados
El porcentaje del gel, según la cantidad de
acrilamida y bisacrilamida, determina el tamaño del poro. A más porcentaje menos
tamaño de poro.
Tabla 7. Rango de separación de proteínas según el porcentaje
de acrilamida.
Porcentaje
Rango Peso Molecular (kDa)
7,5
25-500
10
15-300
12
10-200
15
10-45
20
5-40
El tamaño de poro determina la ratio de separación de las proteínas. (tabla 7).
Página 8
Elaboración del gel
Si el gel de acrilamida esta elaborado en el laboratorio, los distintos reactivos se mezclan y se vierte en el molde, formado por el conjunto de dos
cristales, espaciadores lateral, espaciador inferior,
peines y un sistema de sujeción (Figura 8), dónde
la acrilamida se polimeriza en aproximadamente
30 minutos. Para mejorar la nitidez de la banda el
gel resolutivo se corona con una acrilamida de
menor porcentaje (stacking gel).
1. Colocar los espaciadores de la parte inferior y laterales entre
los cristales.
2. Tras fijación de los lados, verter el gel resolutivo y esperar que
el gel se polimerice.
3. Colocar el peine en la parte superior del gel.
Diseño Experimental; Controles y Estándares
Antes de la carga del gel, es importante diseñar
el experimento incorporando los controles y
estándares necesarios para la validación de los
resultados. Los tipos de estándares y controles utilizados incluyen:
4. Verter el ―stacking gel‖ y quitar el peine una vez el gel haya
polimerizado. Lavar los pocillos con ddH20. El gel está listo
para cargar las muestras y la electroforesis.
Figura 8. Preparación del gel de electroforesis para la separación de proteínas.
1. Marcadores de Peso Molecular.

Son una mezcla de proteínas purificadas de
peso molecular conocido.

Se utilizan para verificar si la proteína de interés está dentro del rango de tamaño apropiado.

Disponible en diversos intervalos de pesos
moleculares, así como teñidos o incoloros.
Las versiones preteñidas se utilizan para
controlar el progreso de la electroforesis y
comprobar la eficacia de la posterior transferencia.

Pueden estar marcadas por la detección
por fluorescencia o quimioluminiscencia.
Controles de carga

Como norma general se utilizan proteínas con
niveles de expresión constante para todas las
muestras. Similar a los ―housekeeping genes‖
en Biología Molecular.

Algunos tratamientos pueden alterar la expresión de estas proteínas ―housekeeping‖.

Se utiliza para verificar que la carga de proteína por carril es más o menos igual, así los niveles de proteínas se pueden comparar de forma
cuantitativa.

La expresión cuantitativa de la proteína de interés puede normalizarse con la del control de
carga para cada muestra.
2. Controles Positivos.

Para verificar si el anticuerpo primario se une
a la proteína correcta.

Generalmente, si está disponible, son una
muestra de la proteína de interés purificada.

Puede ser una línea celular que sobreexprese la proteína de interés.

Puede ser una muestra de tejido del que se
conozca que expresa altos niveles de la proteína de interés. Se pueden utilizar otras especies como tejido de control si el anticuerpo tiene reactividad cruzada apropiada.
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Péptidos de bloqueo

Algunos proveedores ofrecen péptidos de bloqueo para sus anticuerpos.

El péptido de bloqueo se mezcla con el anticuerpo primario antes de la incubación con la
membrana y evita la uníón del anticuerpo a la
proteína diana. Por tanto no se detectará ninguna banda.

Estos estudios demuestran que el anticuerpo
utilizado se une de forma específica a la proteína de interés.
Electroforesis
en Acrilamida
Inicio de Electroforesis
Muestra (pH 6,8)
Las muestras se cargan en los pocillos del gel mediante una pipeta. Normalmente se cargan de 20
a 40 µg de proteína total por carril. Es importante
conocer de antemano, el volumen que se puede
cargar por pocillo, para así evitar sobrecargas
que pueden dar lugar a la pérdida de muestra o
derrames en pocillos adyacentes. Una vez finalizada la carga, el gel se somete a un campo eléctrico generado por una fuente de alimentación. El
tampón utilizado durante la electroforesis, contiene Tris (mantiene el pH), Glicina (conductor electricidad) y SDS (mantiene las proteínas cargadas
negativamente). El progreso en el gel se monitoriza observando el frente coloreado por el colorante presente en el tampón de carga y la posición
de los marcadores de tamaño siempre que estos
estén teñidos.
La técnica de electroforesis más habitualmente
utilizada es la de Laemmli. En este método, los
valores de pH de la capa de gel de apilamiento
o concentración (Stacking Gel) y el gel de resolución (Resolving Gel) son diferentes. La figura 9 ilustra el flujo de iones durante la electroforesis.
Gly
Proteinas
CL-
Stacking Gel
pH 6,8
Gly
Proteinas
Resolving Gel
pH 8,8
Tampón de Electroforesis (pH 8,3)

La glicina tiene carga negativa en el tampón de electroforesis a pH 8,3.

Con la aplicación de un campo eléctrico, la glicina, en el
Stacking Gel, se aleja del electrodo negativo.

La glicina empieza a perder su carga a pH 6,8 y ralentiza
su movimiento. Los iones de cloruro avanzan por delante
de la Gly. El aumento de la resistencia, obliga a las proteínas a alejarse, de forma apilada, del electrodo negativo.

La glicina, debido a un mayor pH del ―Resolving Gel‖, aumenta su carga negativa y se mueve por delante de las
proteínas.

Las proteínas se separan según su peso molecular por el
Figura 9. Concentración de bandas de proteínas por el flujo
iónico en el sistema discontinuo de Laemmli.
Página 10
4. Transferencia a una Membrana
Una vez la electroforesis del gel ha terminado, las
proteínas se transfieren a una membrana. La
membrana es un soporte sólido que une e inmoviliza las proteínas, permitiendo así que la hibridación de un anticuerpo las pueda detectar. La
mayoría de los sistemas de transferencia utilizan la
generación de un campo eléctrico para conducir a las proteínas desde el electrodo negativo al
positivo. Los sistemas de transferencia están disponibles en formato semiseco o húmedo. Los sistemas semisecos son más rápidos y requeiren menor
cantidad de volumen de Tampón que los sistemas húmedos, sin embargo no son apropiados
para transferencia de proteínas de gran tamaño
(>70 kDa) y pueden causar, según el sistema de
detección, un mayor ruido de fondo. Ambos
métodos requieren, para una transferencia efectiva de las proteínas, un estrecho contacto entre el
gel y la membrana.
Aunque ambas funcionan bien en experimentos
de inmunotransferencia, las diferencias en sus características puden influir a la hora de la elección.
La membrana de PVDF, ofrece una mayor resistencai mecánica, resistencia la SDS y una mayor
unión que la nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa tiene la ventajas de proporcionar un menor ruido de fondo y que no requieren un pretratamiento con metanol. Recientemente se han
desarrollado, con el objetivo de reducir el ruido
de fondo al utilizar métodos de detección de fluorescencia, membranas PVDF de baja autofluorescencia.
Previamente a la transferencia, tanto el gel como
la membrana se equilibran en una solución
tampón pre-enfriada. Típicamente, el tampón de
transferencia contiene Tris, Glicina, SDS (opcional)
y metanos (para membranas de nitrocelulosa). La
figura 10 ilustra como se ensamblan el gel y la
membrana en un transferencia semiseca o húmeda.
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Figura 8. Transferencia de proteínas a una membrana.
Nota: Advansta suministra membranas de transferencia pre
-cortadas de nitrocelulosa o PVDF aptas de tamaño de minigel. El uso de membranas pre-cortadas permite ahorrar tiempo y elimina la contaminación accidental de las membranas
con guantes o tijeras contamindas.
L-08001-010
Membrana PVDF baja fluorescencia 7x9 cm
L-08002-010
Membrana Nitrocelulosa 0,45 µm 8x10 cm
L-08003-010
Membrana Nitrocelulosa 0,22 µm 8x10 cm
Electroforesis
en Acrilamida
A continuación se describen algunas sugerencias
para la consecución exitosa de una transferencia:

Evitar la manipulación de las membranas con
las manos desnudas. Las proteínas y aceites de
la piel pueden adherirse a la membrana y pueden dar lugar a manchas no deseadas en la
membrana.

Las burbujas de aire entre el gel y la membrana pueden causar transferencia defectuosa y
desigual. Se pueden eliminar haciendo rodar
suavemente una pipeta Pasteur por encima
del ―sándwich‖ formado por el gel/
membrana/papel de filtro.

No permitir un sobrecalentamiento durante la
transferencia. Es aconsejable utilizar tampón
frio, un sistema de refrigeración o hacer la
transferencia en una cámara fría. Disminuir el
voltaje o el tiempo si fuera necesario.

Ajustar las condiciones de transferencia al tamaño de la proteína. Las proteínas más pequeñas se transferirán más rápidamente y pueden
atravesar la membrana. Reducir o eliminar el
SDS o utilizar una membrana con un tamaño
de poro menor puede ayudar a una mayor
retención de la proteína. Incrementar la cantidad de SDS y disminuir la concentración de
Metanol pueden facilitar la transferencia de
proteínas de gran tamaño.

La aparición de marcadores de tamaño preteñidos en la membrana es indicación que se ha
completado la transferencia.

El colorante Ponceau S puede utilizarse para
teñir la membrana y asegurarse de la eficacia
de la transferencia. La membrana debe ser
desteñida antes del proceso de transferencia.
La tinción con Coomassie puede usarse para
la tinción del gel una vez realziada la transferencia y comprobar los residuos de proteína en
el gel.
Bloqueo
El bloqueo de la membrana se lleva a cabo incubando con una solución diseñada para reducir los
lugares de unión no específicos al anticuerpo. A menudo, son soluciones a base de proteínas, como la
leche descremada en polvo o la albúmina de suero
bovino (BSA). La primera elección, cuando se inicia
un nuevo protocolo, es la utilización de la leche descremada en polvo, ya que es más rentable que el
BSA, sin embargo y debido a la presencia de biotina
en las fosfoproteínas, puede que no sea la mejor
elección cuando se van a utilizar anticuerpos fosfoespecíficos o en métodos de detección de biotina.
Es preferible, para estas y otras situaciones, el uso
de agentes bloqueantes no proteicos.

El agente bloqueante se diluye en TBS (Tampón
Tris salino) o en PBS (Tampón Fosfato salino); se
puede añadir también detergente Tween 20.
Una
incubación
durante
una
hora
(temperatura ambiente o a 4ºC) suele ser suficiente para un bloqueo de los lugares de unión
no específicos del anticuerpo. Si los niveles del
ruido de fondo son demasiados altos, se pueden seleccionar otras soluciones de bloqueo
alternativas.
Nota: Advansta ofrece soluciones optimizadas de bloqueo
y de lavado para su línea de reactivos de detección, WesternBright, así como soluciones tampón en polvo de PCS, TBS,
...que facilitan una rápida y fácil preparación
R-03024-D50
AdvanWashTM, 500 ml
R-03023-D20
AdvanBlockTM-PF, 200 ml
R-01038-020
AvantTM Buffer Pouches - PBS
R-01039-020
AvantTM Buffer Pouches - TBS
Página 12
5. Hibridación del Anticuerpo.
Después del proceso de bloqueo, la membrana
se incuba con el anticuerpo primario. En general,
los anticuerpos reconocen una secuencia de
aminoácidos pequeña (epítopo) que queda expuesta al eliminar la estructura tridimensional de
la proteína en condiciones desnaturalizantes y
reductoras. Los geles nativos se pueden utilizar
cuando los anticuerpos requieren de la proteína
plegada para el reconocimiento del antígeno.
Tabla 8. Anticuerpos Policlonales vs Monoclonales.
Anticuerpos Primarios:
Monoclonal vs Policlonal.
En la transferencia Western se pueden utilizar, tanto anticuerpos primarios monoclonales como policlonales. Los dos tipos tienen distintas ventajas y
desventajas y se diferencian según la forma en la
que se sintetizan. El primer paso en la producción
de ambos anticuerpos, es la inyección de un antígeno en un animal, para provocar una respuesta
inmune. Los anticuerpos policlonales se obtienen
directamente a partir del suero del animal,
comúnmente conejo, cabra, burro u oveja y son
finalmente purificados y probados. Los anticuerpos policlonales reconocen múltiples epítopos del
antígeno y en cambio los monoclonales reconocen un único epítopo de la proteína. Para la síntesis de un anticuerpo monoclonal, las células que
sintetizan anticuerpos se aíslan del bazo del animal y se fusionan con células del mieloma. Lo
hibridomas resultantes secretan anticuerpos al
medio de cultivo, el cual se analiza y determina
la afinidad al antígeno. Los hibridomas con secreción más estable se seleccionan y pueden ser cultivados indefinidamente. Algunas características
de los anticuerpos monoclonales y policlonales se
describen en la Tabla 8.
Página 13
Anticuerpos
Monoclonales
Anticuerpos
Policlonales
Reconocimiento
epitopo y
sensibilidad
 Reconocimiento
de un único epítopo
 Menos sensibilidad debido a
que sólo un anticuerpo se une a
cada proteína
 Reconocimiento
múltiples epítopos
en una proteína
 Más sensible debido a los multiples
lugares de unión
de anticuerpo en
cada proteína.
 Bueno para proteínas poco abundantes.
Reactividad cruzada potencial
 Reactividad cruzada menos
probable.
 Potencial para
reconocer otras
proteínas que
contengan el
epítopo.
 Reactividad cruzada más probable.
 Mayor ruido de
fondo potencial
debido al reconocimiento de multiples epítopos.
 Reactividad cruzada con otras especies más probable.
Tiempo requerido
para su producción
Largo
Más corto
Coste de Preparación
Mayor coste - reMenor coste
quiere personal
capacitado y equipamiento especializado.
Variabilidad
Los lotes de un mismo hibridoma son
muy estables.
Tolerancia a condiciones variables
Poca tolerancia Más tolerante a conpuede dejar de
diciones variables.
reconocer al antígeno en condiciones de desnaturalización/reducción
de la proteína, o
por modificaciones
químicas
(glicosilación fosforilación) o por diferencias en la secuencia peptídica
debido a la presencia de polimorfismos.
Propenso a cierta
variabilidad entre
lotes.
Hibridación
Anticuerpos
Incubación de los anticuerpos
El anticuerpo primario se diluye en tampón de
bloqueo, TBST o en un tampón de disolución de
anticuerpo comercial. El fabricante puede recomendar una cantidad inicial, pero a menudo la
concentración óptima de anticuerpo debe determinarse empíricamente. La afinidad del anticuerpo, la abundancia de la proteína en la muestra y
la sensibilidad del sistema de detección afectarán a la cantidad de anticuerpo a utilizar.

Generalmente, un periodo de incubación
de 1 hora a temperatura ambiente suele ser
suficiente. También es posible una incubación a 4ºC durante toda la noche.

Durante la incubación, la membrana debe
someterse a agitación suave y sumergida en
la disolución, e incubar en un agitador de
vaivén. Un menor volumen puede utilizarse si
la membrana se sella dentro de una bolsa e
incuba en un agitador orbital.

En algunos casos, la disolución con el anticuerpo, puede reutilizarse. Si se utiliza acida
sódica como conservante, debe ser totalmente lavada de la membrana, ya que
puede eliminar la actividad de la peroxidasa
e interferir en los métodos de detección.
Después de la incubación con el anticuerpo primario, se procede a la eliminación del excedente
mediante tampones de lavado (TBS, PBS, TBST o
PBST). En métodos de detección indirectos
(sección 6), es necesario un anticuerpo secundario apropiado. A continuación se describen las
consideraciones a tener en cuenta a la hora de la
elección de un anticuerpo secundario:

Las especie del primer Ac dicta la elección
del Ac secundario. Si el primer Ac es de conejo, el segundo Ac debe ser anti-conejo, o
sea, deber ser producido en otra especie
distinta a conejo.

Para anticuerpos monoclonales se debe
considerar la clase de Inmunoglobulina (IgG,
IgM, IgA, IgD, IgE) y posiblemente la subclase
(IgG1, IgG2a,…). Un anticuerpo con amplia
especificidad inmunoglobulínica debería ser
suficiente, ya que los anticuerpos específicos
para sub-clases se utilian mayoritariamente,
en experimentos de doble etiquetado u
otras aplicaciones.
Nota: Advansta ofrece una línea completa de anticuerpos
secundarios marcados para detección mediante quimioluminscencia o fluorecencia.
R-05051-050
IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo, 50 µl
R-05051-250
IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo, 250 µl
R-05052-050
IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón, 50 µl
R-05051-250
IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón, 250 µl
R-05071-500
Anticuerpo Secundario conjugado HRP
cabra-anti-ratón, 500 µl
R-05072-500
Anticuerpo Secundario conjugado APC
cabra-anti-conejo, 500 µl
Página 14
6. Detección.
La detección de la proteína se puede hacer mediante métodos directos o indirectos, cada uno
con sus ventajas e inconvenientes. Los métodos
directos utilizan un anticuerpo primario conjugado con un marcaje detectable, como un enzima,
biotina o molécula fluorescente. Los anticuerpos
se pueden marcar mediante kits disponibles en le
mercado u obtenerlos ya marcados. Lo métodos
indirectos utilizan dos anticuerpos; un anticuerpo
primario y un anticuerpo secundario contra la especie del primer anticuerpo. En la detección indirecta, es el anticuerpo secundario el que está
conjugado con un marcaje detectable. La figura
11,ilustra los métodos de detección directos e indirectos y en la Tabla 9 se resumen las ventajas e
inconvenientes de los dos métodos.
Métodos de detección.
Los métodos más comúnmente utilizados para
detectar proteínas son: 1. Quimioluminiscencia, 2.
Fluorescencia y 3. Colorimetría.
Figura 11 . Detección directa e indirecta de proteínas
Tabla 9. Ventajas e Inconvenientes de los métodos de detección
Indirecto
Ventajas
 Amplificación de  Menos pasos.
señal debido a la  Menos posibilidaunión de múltides de unión no
ples Ac secundaespecífica.
rios a cada Ac
primario.
 Versátil - el mismo Ac secundario puede utilizarse para diversos
anticuerpos de
la misma especie.
Inconvenientes
 Mayor posibilidad de unión no
inespecífica.
 Más pasos.
1. Quimioluminiscencia.
Los métodos de detección de quimioluminiscencia utilizan comúnmente anticuerpos secundarios
conjugados con peroxidasa (HRP). La reacción
entre el encima y el substrato produce luz, que
puede ser detectada mediante la exposición de
la membrana a una película de rayos X o captada de forma digital utilizando una cámara CCD.
Directo
Ventajas: muy sensible, la membrana puede tratarse para re-utilizarse, se pueden hacer multiples
exposiciones en películas de rayos X, fácil de documentar.
 Puede ser más
costoso.
 La inmunorreactividad del Anticuerpo puede estar
afectada por el
marcaje.
Inconvenientes: requiere una habitación oscura
(película rayos X) o sistemas de imagen caros, semicuantitativa - porque se basa en una reacción
enzimática, la película tiene un rango dinámico
limitado, la intensidad de la señal puede variar
con la incubación o el tiempo de exposición, no
son posibles detecciones multiplex (detección de
mas de una proteína, sólo un color de reacción)
Nota:
LucentBlueTM es una película que ha sido optimizada para
la detección de señales de quimioluminiscencia en experimentos
realizados con los substratos WesternBright HRP, incluyedo WesternBrightTM ECL, Westernbright Quantum y WesternBright Sirius.
Página 15
L07014-100
Película Rayos X LucentBlueTM , 20x25 cm, 100 uds
L07013-100
Película Rayos X LucentBlueTM , 13x18 cm, 100 uds
Detección
2. Fluorescencia.
Re-utilización de la membrana
El anticuerpo secundario se une a un fluoróforo,
que cuando es ―excitado‖ emite luz. La luz emitida, se detecta mediante un dispositivo capaz de
medir la fluorescencia o mediante una cámara
CCD provista con los filtros de longitud de onda
apropiada. La imagen se digitaliza para su análisis.
Después de captar la imagen, la membrana puede ser tratada para volver a ser utilizada para la
detección de otra proteína. Este procedimiento
puede conservar las muestras, pero consume mucho tiempo. Con la detección multiplex de fluorescencia, se pueden detectar múltiples proteínas
de forma simultanea, es ideal para comparar la
proteína de interés con un control de carga, o
diferentes isoformas de la proteína. Las membranas PVDF son preferibles a la de nitrocelulosa en
protocolos de lavados para reutilización.
Ventajas: sensibilidad (la sensibilidad puede incrementarse utilizando el sistema streptavidina/
biotina), apto para ensayos multiplex con múltiples colorantes, amplio rango dinámico, no se
requiere el uso de una cámara oscura, aporta
datas cuantificables, fácil documentación de resultados, pueden usarse Ac primarios marcados
(para proteínas abundantes) y eliminar pasos.
Inconvenientes: los reactivos y el equipamiento
pueden ser costosos, no es tan sensible como la
quimioluminiscencia (puede no ser apropiado
para proteínas poco abundantes).
3. Colorimetría.
Los métodos colorimétricos utilizan un Ac secundario que ha sido conjugado previamente a un
enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina). El enzima convierte el colorante en un producto insoluble que es visible en la membrana. La cantidad
de colorante convertido es proporcional al cantidad en la muestra. La intensidad de la tinción
puede ser medida por espectrofotometría o por
un densitómetro.
Ventajas: sencilla de realizar, no requiere cámara
oscura, las membranas se pueden documentar
fácilmente mediante fotografía.
Inconvenientes: no es tan sensible como los otros
dos métodos, el color se desvanece con el tiempo.
Nota: WesternBright
TM
MCF permite la detección, mediante la
detección fluorescente multicolor, de dos proteínas en una
sola membrana. Perfecto para aquellos experimentos en los
que se necesite comparar la proteína de interés con un control
de carga.
K-12021-010 WesternBrightTM fluorescent Western blotting kit
Nota: Advansta suministra una línea completa de reactivos
de detección de quimioluminiscencia optimizados para los
diferenentes métodos, concentración de muestra y tipos experimentales.
K-12042-D10
WesternBrightTM Quantum Western Blotting HRP
Substrate (para 1000 cm2 de membrana)
K-12042-D10
WesternBrightTM Sirius Western Blotting HRP Substrate (para 1000 cm2 de membrana)
K-12045-D20
WesternBrightTM ECL Western Blotting HRP Substrate (para 2000 cm2 de membrana)
K-12042-D10
WesternBrightTM ECL Spray
Página 16
7. Solución de Problemas
Solución de problemas con Western Blot
A. No se puede
ver la proteína
de interés
B. Tamaño incorrecto de la
banda
Preparación
Muestra
(ver 1)
La proteína es
menor de lo
esperado
(ver 7)
Transferencia
Inadecuada
(ver 2)
Unión ineficiente del Anticuerpo (ver 3, 4)
Problemas con
los reactivos
(ver 5, 6)
La proteína es
mayor a lo esperado
(ver 8, 9)
C. Bandas artefactuales
D. Problemas en
la electroforesis
E. Ruido de fondo excesivo
Bandas
Incompletas
(ver 12)
El gel polimeriza
demasiado
rápido o demasiado lento
(ver 17,18,19)
Bloqueo
Insuficiente
(ver 24)
Bandas Difusas
(ver 13)
Rayas
Verticales
(ver 14)
Bandas Múltiples (ver 10)
Las bandas
aparecen muy
altas o muy
bajas en el gel
(ver 11)
El gel corre demasiado rápido
o demasiado
lento
(ver 20,21)
Distorsión
Lateral
(ver 15)
Frente corre
curvado
―smiling‖
(ver 22)
Bandas distorsionadas
(ver 16)
Frente corre
inclinado
(ver 23)
Lavado
inapropiado
(ver 25)
Contaminación
Reactivos
(ver 26)
Elección de
Membrana
(ver 27)
Unión no específica del
Anticuerpo
(ver 28)
Revelado de la
película
(ver 29)
Página 17
Solución de
Problemas
A. Problema
Causa(s)
Solución
1. Preparación Muestra
Extracción ineficiente
Intentar métodos alternativos; incluir control positivo en el gel
Baja expresión de la proteína en el tejido
o las células
Cargar más cantidad de proteína total en
el gel; concentrar utilizando Afyon, juntar
múltiples muestras
La proteína se ha degradado durante la
extracción
Usar inhibidores de proteasa en le tampón
de lisis
2. Transferencia indadecuada
3. Unión ineficiente del Anticuerpo primario
Tampón de transferencia preparado inco- Revisar el protocolo/disminuir metanol
rrectamente/demasiado metanol en el
tampón
Proteínas de mayor tamaño necesitan
mas tiempo/voltaje
Repetir con un tiempo mayor/mayor voltaje
Contacto insuficiente entre el gel y la
membrana
Revisar la almohadilla de fibra; sustituir si es
muy delgada
Baja afinidad del anticuerpo por la proteí- Incrementar la concentración del Antina o el anticuerpo es antiguo/débil
cuerpo; comprar un anticuerpo nuevo y
almacenarlo de forma apropiada
El Anticuerpo tiene reactividad cruzada
débil con las especies de interés
Probar con un Anticuerpo primario de diferente origen
El Anrticuerpo se ha eliminado con el lava- Usar menor numero de lavados; disminuir
do
la concentración de sales el tampón de
lavado
4. Unión ineficiente del Anticuerpo secundario
Antígeno enmascarado por el agente
bloqueante (ej.: Leche,…)
Utilizar un agente de bloqueo alternativo
(ej.: BSA,…)
Elección de especies errónea
Usar Anticuerpos dirigidos contra la especie del Anticuerpo primario
Concentración insuficiente del Anticuerpo Aumentar concentración o comprar uno
o Anticuerpo antiguo
Anticuerpo nuevo
5. Conjugado/Substrato Inac- Reactivos viejos o inestables
tivo
Peroxidasa (HRP) inactiva por azida sódica
Mezclar conjugado + substrato en un tubo; o luminiscencia en oscuridad - conseguir un nuevo reactivo si no hay señal
Evitar utilizar disoluciones conteniendo
este agente conservante
6. Reactivo de detección
(ECL)
La disolución es antigua o está almacena- Comprar reactivo nuevo
da de forma inapropiada
B. Problema
Causa (s)
Solución
7. Proteína más pequeña de
lo esperado
Proteólisis; Congelación/descongelación
de la muestra
Uso de inhibidores de proteasa/muestras
frescas
Proteína variante (Splicing)
Consultar literatura/utilizar controles apropiados
Proteínas modificadas de forma natural
(glicosilación, fosforilación, acetilación,
etc…)
Consultar literatura para encontrar aditivos que puedan eliminar grupos químicos
Cambio de la expresión de la proteína en
la línea celular
Utilizar cultivos anteriores; incluir un control
positivo
8. Proteína más larga de lo
esperado y/o bandas múltiples
9. Proteína más larga de lo
esperado
Agregado de proteínas - puentes disulfuro Uso de DTT en tampón de muestra; pulso
intactos
de centrífuga previo a la carga de la
muestra
Página 18
B. Problema
(continuación)
Causa(s)
Solución
10. Bandas Extras
Unión no específica del Anticuerpo prima- Disminuir concentraciones; intentar un
rio o secundario
experimento de bloqueo de péptido
(eliminará la proteína de interés)
11. La proteína aparece muy Porcentaje erróneo/no óptimo del gel
alta o muy baja en la membrana
Incrementar el porcentaje para proteínas
de pequeño tamaño; disminuir para proteínas de gran tamaño
C. Problema
Causa(s)
Solución
12. Bandas Incompletas
Burbujas entre el gel y la membrana
Usando una pipeta, hacer rodar por encima del paquete gel/membrana para forzar la salida de las burbujas
13. Bandas difusas
Migración lenta
Incrementar voltaje; asegurarse de la correcta preparación del tampón
Las muestras no se han calentado correctamente
Asegurarse que las muestras se han incubado durante 2 min a 90ºC antes de cargarlas en el gel
El SDS del tampón es antiguo
Preparar SDS nuevo para le tampón de
muestra
14. Rayas en los carriles
Alta concentración de sales en la muestra Disminuir la concentración de sal en el
tampón de muestra
Muestra muy concentrada o insuficiente
SDS
Incrementar concentración/usar más SDS
15. Distorsión lateral de las
bandas
Difusión de la muestra en los pocillos durante la carga
Minimizar el tiempo de carga
16. Distorsión de las bandas
Fallo en la completa polimerización de los Incrementar TEMED/AP
pocillos
Presión aplicada excesiva a la hora de
montar el gel
No apretar en exceso los tornillos del sistema, apretar hasta encontrar primera resistencia
Burbujas en el gel debido al uso de cristales sucios
Usar guantes en la preparación de los geles
Uso de Etanol y H2O desionizada en la limpieza de los cristales
Burbujas introducidas en el gel por el dispositivo de llenado (jeringa o pipeta)
No expulsar totalmente el volumen de la
mezcla del gel
Burbujas de aire atrapadas por el peine
Insertar el peine en ángulo y antes que se
polimerice el gel
D. Problema
Causa (s)
Solución
17. El gel no polimeriza
Fallo al añadir el TEMED y AP
Repetir con TEMED y AP
La disolución AP es estable durante dos o
tres días a 4ºC
Preparar AP fresco
El oxígeno inhibe la polimerización
Aplicar isopropanol antes de verter el gel
de apilamiento (stacking gel)
TEMED/AP Insuficiente
Incrementar la cantidad de TEMED/AP
La disolución de AP ha perdido su actividad
Preparar disolución fresca de AP
18. El gel polimeriza muy lento
Página 19
Solución de
Problemas
D. Problema
(continuación)
Causa(s)
Solución
19. El polimeriza demasiado
rápido
Cantidad excesiva de TEMED/AP
Reducir la cantidad de TEMED/AP, manteniendo la relación entre ambos
20. Tiempo de carrera inusualmente largo
Buffer de electroforesis demasiado concentrado
Revisar protocolo; diluir el tampón en caso
necesario
Voltaje insuficiente
Incrementar voltaje
21. Tiempo de carrera inusualmente corto
Tampón demasiado diluido
Revisar el protocolo; reemplazar tampón
en caso necesario
22. Frente curvado (smiling)
Migración demasiado rápida
Disminuir voltaje
Generación de calor
Disminuir voltaje; refrigerar
23. Frente inclinado
Burbuja atrapada entre los cristales en la
parte inferior del gel
Aguantar el gel en ángulo; colocar una
esquina en el tanque inferior del sistema
de electroforesis; lentamente volver a posición vertical
E. Problema
Causa(s)
Solución
24. Bloqueo insuficiente
La presencia de Biotina en la leche es incompatible con el uso de Estreptavidina,
o la leche contiene el antígeno de interés
Usar BSA
Si utiliza AdvanBlock-PF con WesternBright
MCF, algún Anticuerpo primario puede
requerir un bloqueante proteico
Incluir BSA o leche en la disolución AdvanBlock-PF utilizada en la dilución del Anticuerpo primario
La disolución está demasiado diluida
Incrementar con un 5% la disolución
Tiempo de bloqueo muy corto
Incrementar el tiempo de incubación
Algunos detergentes no son efectivos a
bajas temperaturas
Incubar a temperatura ambiente en vez
de toda la noche a 4ºC
Número insuficiente de lavados
Incrementar el número de lavados o la
duración de cada uno de ellos
25. Condiciones de lavado
inapropiadas
Concentración insuficiente de detergente Incrementar la concentración de detergente o usar detergentes más fuertes
(SDS, NP-40)
26. Contaminación de los
reactivos
Crecimiento bacteriano o fúngico en los
tampones
27. Elección de tipo de mem- Las membranas PVDF pueden tener más
brana
ruido de fondo que las de Nitrocelulosa
28. Unión no específica del
Anticuerpo primario o secundario
29. Sobreexposición de la
imagen
Revisar la turbidez de los tampones; preparar nuevos
Elegir membranas de Nitrocelulosa
Algunas membranas tienen alta autofluorescencia
Utilizar únicamente membranas PVDF con
baja autofluorescencia con Western Blots
fluorescentes
Membrana seca
Estar seguro que la membrana esta húmeda durante todo el proceso
Concentración muy alta del Anticuerpo o
no purificado por afinidad
Disminuir la concentración de Anticuerpo;
intentar con Anticuerpo monoclonal o
purificado por afinidad
Mucha cantidad de proteína en el gel
Disminuir la cantidad de proteína
El tiempo excesivo de exposición a la pelí- Reducir los tiempos de exposición; si no es
cula o al CCD
posible incrementar la dilución de los Anticuerpos o cargar menor cantidad de
muestra
Página 20
8. Herramientas y Referencias Técnicas
g de Soluto
Molaridad de una disolución =
[Masa molecular de Soluto (g/mol) x (L de disolución)
Tabla 10. Código genético y abreviaciones de los aminoácidos
Segunda Posición
U
Primera posición
U
C
A
G
C
UUU
UUC
Fenilalanina
(Phe, F)
UUA
UUG
Leucina
(Leu, L)
CUU
CUC
CUA
CUG
Leucina
(Leu, L)
AUU
AUC
AUA
Isoleucina
(Ile, I)
AUG
Metionina
(Met, M)
GUU
GUC
GUA
GUG
Valina
(Val, V)
UCU
UCC
UCA
UCG
A
Serina
(Ser, S)
CCU
CCC
CCA
CCG
Prolina
(Pro, P)
ACU
ACC
ACA
ACG
Treonina
(Thr, T)
GCU
GCC
GCA
GCG
Alanina
(Ala, A)
G
UAU
UAC
Tirosina
(Tyr, T)
UGU
UGC
Cisteina
(Cys, C)
UAA
UAG
STOP
UGA
STOP
UGG
Triptófano
(Trp, W)
CAU
CAC
Histidina
(His, H)
CGU
CGC
CGA
CGG
Arginina
(Arg, R)
CAA
CAG
Glutamina
(Gln, Q)
AAU
AAC
Asparagina
(Asn, N)
AGU
AGC
Serina
(Ser, S)
AAA
AAG
Lisina
(Lys, K)
AGA
AGG
Arginina
(Arg, R)
GAU
GAC
A. Aspártico
(Asp, D)
Glicina
(Gly, G)
GAA
GAG
A. Glutámico
(Glu, E)
GGU
GGC
GGA
GGG
Tabla 11. Conversión entre masa y moles de proteína
Tabla 12. Absorvancia a 280 nm de Proteinas habituale
Peso molecular
(Da)
1 µg
1 nmol
Proteina
10.000
100 pmol o 6x1013 moléculas
10 µg
IgG
1,35
20.000
20 pmol o
1,2x1013
50 µg
IgM
1,2
100.000
10 pmol o 6x1012 moléculas
100 µg
IgA
1,3
150.000
6,7 pmol o 4x1012 moléculas
150 µg
Proteina A
0,17
Avidina
1,5
Estreptavidina
3.4
Albumina suero bovino
0,7
Página 21
moléculas
A280 Uds por 1 mg&ml
Herramientas y
Referencias
Tabla 13. Prefijos métricos
mega
106
M
Kilo
103
m
mili
10-3
µ
micro
10-6
Tabla 16. Masa molecular media de los aminoácidos
nano
10-9
Códigos Aminoácidos
pico
10-12
A
Ala
71,08
femto
10-15
C
Cys
103,1
atto
10-18
D
Asp
115,1
E
Glu
129,1
Tabla 14. Abreviaciones
F
Phe
147,2
ds
doble cadena ( como en dsDNA)
G
Gly
57,05
ss
cadena sencilla (como en ssDNA)
H
His
137,1
bp
pares de base
I
Ile
113,2
kb
kilobase; 1.000 bases o pares de base
K
Lys
128,2
Da
Dalton, unidad de masa molecular
L
Leu
113,2
mol
mol
M
Met
131,2
M
molaridad, moles de soluto por litro de disolución
N
Asn
114,1
P
Peo
91,12
K
n
K
f
a
Masa molecular media
Q
Gln
128,1
Tabla 15.. Vida media de los Radioisótopos más habituales
R
Arg
156,2
Radioisótopo
Vida media
S
Ser
87,08
Carbono-14 (14C)
5.730 años
T
Thr
101,1
Iodo-125 (125I)
60 días
V
Val
99,07
Fósforo-32 (32P)
14,3 días
W
Trp
186,2
Azufre-35 (35S)
87,4 días
Y
Tyr
163,2
Tritio (3H)
12,4 años
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Página 22
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