D-DI TEST - Annar Diagnóstica Import

D-DI TEST®
Prueba de aglutinación de látex en portaobjeto para la
determinación cualitativa y semicuantitativa de dímero D
•
Contenido del kit para aprox. 60 determinaciones:
– 1 vial de Reactivo 1 (Latex)
– 1 vial de Reactivo 2 (Buffer)
– 1 vial de Reactivo 3 (Control
)
– 1 vial de Reactivo 4 (Control
)
– 10 placas
– Agitadores
(REF 00454)
Español 6
1/ UTILIZACIÓN DEL KIT
El kit D-Di Test® suministra reactivos para la detección y
semicuantificación de productos del dímero D en el plasma mediante la
utilización de partículas de látex revestidas con anticuerpos monoclonales.
2/ SUMARIO
Revisión de la fibrinólisis
La degradación específica de la fibrina (es decir, la fibrinólisis) es el
mecanismo reactivo que responde a la formación de fibrina (4).
La plasmina es la enzima fibrinolítica derivada del plasminógeno
inactivo. El plasminógeno es convertido en plasmina por los activadores
plasminogénicos. Los principales activadores plasminogénicos son el
activador del plasminógeno de tipo tisular (TPA) y la prouroquinasa,
activada para convertirse en uroquinasa (UK) por, entre otros, el sistema
de contacto de la coagulación (5).
En el torrente sanguíneo, la plasmina es rápida y específicamente
neutralizada por la α2-antiplasmina (5), restringiendo así su actividad
fibrinogenolítica, y traduciéndose en consecuencia en la localización de
esta acción fibrinolítica en el coágulo de fibrina. En el coágulo de fibrina
la plasmina degrada la fibrina en varios productos, para los cuales se
han desarrollado anticuerpos muy específicos, que no reconocen el
fibrinógeno (2, 3). El dímero D es el último producto de degradación de
la fibrina (1, 6). Su presencia en el compartimiento plasmático es por lo
tanto la prueba de que el sistema fibrinolítico se encuentra en acción, en
respuesta a la activación coagulatoria.
Coagulación
activo
Plasminógeno
tPA
Fibrinógeno
Fibrina
Fibrina
UK
Plasmina
dímero D
La Degradación de la Fibrina dentro de dímero D
•
9/ TEST DE DETECCION
Las partículas de látex aportadas en el D-Di Test® se encuentran
revestidas con anticuerpos monoclonales dímeros D antihumanos en
espuma. Las muestras de prueba que contienen dímeros D, al mezclarse
con la suspensión de partículas de látex, hacen que las partículas se
aglutinen. Cuando se alcanza la concentración predeterminada de
dímeros D para la cual ha sido diseñado el D-Di Test®, la aglutinación de
las partículas de látex produce aglomeraciones macroscópicas que
pueden ser observadas a simple vista.
9.1. Procedimiento
Los plasmas a ensayar han de estar sin diluir.Todos los reactivos
deben estar a temperatura ambiente.
En cada círculo adecuadamente identificado de la tarjeta del test,
colocar 20 µl de la muestra de prueba (la del paciente sin diluir, el
Reactivo 3 y el Reactivo 4).
Agitar varias veces el frasco del Reactivo 1. Colocar en cada círculo
20 µl de Reactivo 1 cerca de la muestra de prueba. Utilizar varillas
de agitación separadas, combinar y mezclar las dos gotas en cada
círculo.
Meza lentamente la tarjeta de prueba de tal manera que el líquido
remolinee alrededor en cada círculo durante 2 minutos.
Compare el patrón de aglutinación de cada dilución de círculo con
los de los controles positivos y negativos (Reactivos 3 y 4).
9.2. Resultados
El D-Di Test® está diseñado para tener un cut-off positivo a
0,5 µg/ml, expresado en unidades equivalentes de fibrinógeno
(FEU). Las configuraciones de aglutinación positiva y negativa
pueden ser interpretadas como sigue:
4/ COMPOSICIÓN DEL KIT
Abril 2011
•
3/ PRINCIPIO DEL TEST
Aplicaciones clínicas
– Coagulación Intravascular Diseminada (CID)
En la CID, el sistema fibrinolítico es activado y, consecuentemente,
aumenta el nivel de dímero D. La dosificación del dímero D puede
ayudar al diagnóstico de la CID (9).
– Estados de activación de la coagulación
El nivel de dímero D aumenta durante los estados de activación de la
coagulación, dado que dichos estados generan la producción de
trombina, seguida por la formación de fibrina, y llevan a la fibrinólisis,
siendo esta última con mayor frecuencia reactiva.
Así, el incremento de los niveles del dímero D se observa en las
siguientes situaciones (9):
– trombosis venosas profundas, embolias,
– CID,
– hemorragias,
– períodos postoperatorios,
– cáncer,
– patologías infecciosas graves.
Es importante destacar que, si bien un D-Di Test® negativo no
descarta por completo la trombosis, puede ser útil como
suplemento en la elaboración del diagnóstico.
•
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•
•
Reactivo 1: frasco con 1,3 ml de suspensión de micropartículas de látex
recubiertas con anticuerpos monoclonales de ratón anti-dímero
D humana (2F7).
Reactivo 2: frasco con 20 ml de tampón de glicina, listo para usar.
Reactivos 3 y 4: Plasmas liofilizados humanos negativos y positivos,
utilizados como controles.
Placas: de un solo uso.
Agitadores: de un solo uso.
•
Los Reactivos 1 y 2 contienen azida sódica (< 1 g/l) como conservante.
Es preciso eliminar con precaución los reactivos que contienen azida sódica. Si estas
soluciones se vierten en el desagüe del lavabo, enjuagar con abundante agua para evitar la
formación de azidas metálicas que, si están concentradas, pueden provocar explosiones.
Plasma no diluido
Presencia de
aglutinación
dímero D nivel
(µg/ml - FEU)
Caso 1
no
< 0,5
Algunos reactivos de este kit contienen productos de origen humano y/o animal. Cuando se
ha utilizado plasma humano en la preparación de estos reactivos, se excluye previamente la
presencia del antígeno HBs, de los anticuerpos anti-HCV, anti-HIV 1 y anti-HIV 2 con los
correspondientes análisis. Sin embargo, ningún test puede garantizar de manera absoluta la
ausencia de agentes infecciosos. Por eso, estos reactivos de origen biológico han de ser
manipulados con las precauciones habituales, ya que se trata de productos potencialmente
infecciosos.
Caso 2
si
≥ 0,5
6/ OBTENCIÓN Y TRATAMIENTO DE LA MUESTRA
La obtención de la muestra debe ajustarse a las recomendaciones para las
pruebas de hemostasia.
• Obtención de sangre en solución de citrato trisódico 0,109 M: 1 vol. de
citrato por 9 vol. de sangre.
• Centrifugación : 15 minutos a 2000-2500 g.
• Conservación del plasma: 8 horas a 20 ± 5 °C
1 mes a –20 °C. Atemperar la muestra a
37 °C el tiempo necesario y suficiente para
que la descongelación sea completa.
7/ CONSERVACIÓN Y PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
Conservados a 2-8 °C en su embalaje original, los reactivos son estables
hasta la fecha de caducidad indicada en el estuche
• Reactivo 1
Mantener el Reactivo 1 a temperatura ambiente (18-25 °C) durante
30 minutos. Volver a suspender el Reactivo 1 invirtiendo varias veces el
frasco antes de usarlo.
• Reactivo 2
Mantener el Reactivo 2 a temperatura ambiente (18-25 °C) durante
30 minutos antes de su uso.
• Reactivos 3 y 4
Reconstituir cada vial con 1 ml de agua destilada. Dejar que la solución
se estabilice durante 30 minutos a temperatura ambiente (18-25 °C).
Luego, agitar suavemente antes de su uso.
Estabilidad tras la reconstitución: 2 mes a 2-8 °C
6 mes a –20 °C. Atemperar los
reactivos a 37 °C el tiempo necesario y
suficiente para que la descongelación
sea completa.
No volver a congelar.
Comprobar que los resultados obtenidos para los reactivos 3 y 4 son
respectivamente negativo y positivo. Si estos resultados no son
obtenidos, asegurarse del buen funcionamiento de todo el sistema:
condiciones operativas, reactivos, plasmas a analizar, etc. Si es
necesario, repetir las muestras.
10/ DETERMINACIÓN SEMICUANTITATIVA
10.1. Procedimiento
Un plasma no diluido que da resultados positivos con el D-Di Test®
debe contener por lo menos 0,5 µg/ml de dímero D. Para
semicuantificar el nivel de dímero D de una muestra, utilizar el
Reactivo 2 para diluirla serialmente. Diluidos en tubos de plástico.
Seguir el mismo procedimiento de dosificación descrito antes para el
test de detección.
10.2. Resultados
Los niveles de dímero D se obtienen multiplicando el límite de
detección del D-Di Test® por el número de dilución. Por ejemplo, si la
dilución 1/8 es la más alta que produce aglutinación, entonces el
nivel de D-dímero en plasma es igual o superior a 4 µg/ml (FEU)
(0,5 µg/ml x 8).
En el siguiente cuadro se encuentran concentraciones aproximativas
para las muestras de prueba dosificadas sin diluir y con diluciones de
1/2 a 1/16.
Aproximadas
Muestra
D-dímero nivel
No diluido
1/2
1/4
1/8
1/16
(µg/ml - FEU)
(–)
< 0,5
(+)
(–)
< 1,0
≥ 0,5
(+)
(+)
(–)
(+)
(+)
(+)
(–)
(+)
(+)
(+)
(+)
(–)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+): Presencia de aglutinación
≥ 1,0
< 2,0
≥ 2,0
< 4,0
≥ 4,0
•
< 8,0
La presencia del fibrinógeno a concentraciones superiores a 9 g/l
(900 mg/dl) puede hacer que se sobrestime el nivel de dímero D.
El método propuesto es insensible a las heparinas (HNF y HBPM) hasta
ensayar un nivel de 2 UI/ml.
La presencia de anticuerpos anti-ratón en ciertos sujetos puede producir
resultados erróneos.
13/ VALORES NORMALES
Generalmente, el valor plasmático del dímero D en el adulto es inferior a
0,5 µg/ml (FEU) (7). El resultado debe interpretarse en función del estado
clínico y biológico del paciente. Con la edad y durante el embarazo se
observa un aumento del valor de dímero D (7, 8, 9).
14/ CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO
•
•
•
5/ PRECAUCIONES
El estuche intacto se debe conservar a 2-8 °C. Estos reactivos se destinan
exclusivamente a un uso in vitro y deben ser manipulados por personal
autorizado del laboratorio. Utilizar únicamente reactivos de un mismo kit o
de un mismo lote. Los residuos se eliminarán con arreglo a la
reglamentación local vigente. Tener cuidado en el manejo de estos
reactivos y las muestras.
•
Especificidad
El sistema D-Di Test® es insensible al fragmento E. El fragmento D
induce una baja reactividad en el ensayo. Sin embargo, ésta no tiene
efecto porque la presencia in vivo de α2-antiplasmina impide la
producción del fragmento D a partir del fibrinógeno.
Efecto Hook
No se ha observado efecto Hook hasta niveles de dímero D del
500 µg/ml (FEU).
Reprodutibilidade
Se han realizado estudios de reproducibilidad, intra (n = 21) e inter-series
(n = 10) a partir de muestras normales y positivas. En todos los casos, la
muestra normal no dio ninguna aglutinación, mientras que se observó
una aglutinación con la muestra positiva.
BIBLIOGRAFIA
1. GAFFNEY P.J.: “Distinction between fibrinogen and fibrin degradation products in
plasma”. Clin. Chim. Acta, 65, 109-115, 1975.
2. SORIA J., SORIA C., BOUCHEIX C., MIRSHAHI M., PERROT J.-Y.,
BERNARDOU A., SAMAMA M.: “Immuno chemical differentiation of fibrinogen,
fragment D or E and cross-linked fibrin degradation products using monoclonal
antibodies” in “Fibrinogen - Structure, functional aspects, metabolism”. Haverrate
P., Henschen A., Nieuwenhuizen W., Straub P.W., Berlin, New-York: Walter de
Gruyter & Co., 2, 227-233, 1983.
3. SORIA J., SORIA C., BOUCHEIX C., MIRSHAHI M., PERROT J.-Y.,
BERNARDOU A., SAMAMA M., ROSENFELD C.: “Monoclonal antibodies that
react preferentially with fibrinogen degradation products or with cross-linked fibrin
split products”. Ann. NY. Acad. Sci., 408, 665-666, 1983.
4. FRANCIS C.W., MARKHAM R.E., Jr, MARDER V.J.: “Demonstration of in situ
fibrin degradation in pathologic thrombi”. Blood, 63, 1216-1224, 1984.
5. BACHMANN F.: “Fibrinolysis” in “Thrombosis and Haemostasis”, Verstraete M.,
Vermylen J., Lijnen H.R., Arnout J., (eds.). International Society on Thrombosis
and Haemostasis and Leuven University Press, Leuven, 227-265, 1987.
6. FRANCIS C.W., ALKJAERSIG N., GALANAKIS D.K., GRAEFF H., OWEN J.,
GAFFNEY P., MARDER V.J.: “Terminology for macromolecular plasmic
derivatives of crosslinked fibrin”. Thromb. Haemostasis, 57, 110-111, 1987.
7. GIANSANTE C., FIOTTI N., CATTIN L., DA COL P.G. : “Fibrinogen, D-dimer and
thrombin-antithrombin complexes in a random population sample: relationships
with other cardiovascular risk factors”. Thromb. Haemostasis, 71, 5, 581-586,
1994.
8. FRANCALANCI I., COMEGLIO P., ALESSANDRELLO LIOTTA A., CELLAI A.P.,
FEDI S., PARRETTI E., MELLO G., PRISCO D., ABBATE R.: “D-dimer
concentrations during normal pregnancy, as measured by ELISA”. Thromb. Res.,
78, 5, 399-405, 1995.
9. LECOURVOISIER C., TOULON P.: “Intérêt du dosage des D-dimères dans le
diagnostic d’exclusion de l’embolie pulmonaire”. Ann. Biol. Clin., 59, 6, 693-700,
2001.
≥ 8,0
(–): No aglutinación
11/ COMENTARIOS
Los resultados del D-Di Test® se expresan en unidades equivalentes de
fibrinógeno (FEU) iniciales, que son exactamente las mismas unidades
utilizadas para la dosificación FDP. Por definición, una FEU es la cantidad
de fibrinógeno inicialmente presente que lleva al nivel observado de
dímero D. En general, la cantidad real de dímero D es aproximadamente
la mitad de una FEU. Para fines prácticos, el valor de cut-off positivo de
0,5 µg/ml (FEU) es de aproximadamente 0,25 µg/ml (dímero D real). Para
mayor consistencia, todos los resultados analizados en este prospecto se
encuentran en FEU.
8/ REACTIVOS Y MATERIALES AUXILIARES
Equipamiento habitual en los laboratorios de análisis clínicos.
12/ LIMITACIONES
•
•
Niveles altos del factor reumatoide (FR) pueden resultar en falsas
aglutinaciones. Cualquier sospecha de presencia de dímero D debe ser
confirmada mediante una prueba distinta para FR.
Cualquier inicio del proceso de coagulación, incluso mínimo, desde la
extracción puede provocar una falsa aglutinación.
Los cambios significativos son indicados por las líneas punteadas en el margen.
DIAGNOSTICA STAGO S.A.S.
9 rue des Frères Chausson
92600 Asnières sur Seine (France)
+33 (0)1 46 88 20 20
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