antigen retrieval solution

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Fremont, CA 94538
Tel : +1 (800) 421-4149,
Fax: +1 (510) 824-1490,
[email protected]
Emergo Europe,
Molenstraat 15
NL-2513 BH The Hague,
The Netherlands
Tel: (+31) 70-345-8570
Fax: (+31) 70-346-7299
ANTIGEN RETRIEVAL SOLUTION
Doc. No. 932-HK086E-4 Rev. No. H
Release Date: 07-Aug-2014
ENGLISH
Intended Use
Antigen retrieval solutions are intended for in vitro diagnostic use to recover antigenicity in formalinfixed, paraffin-embedded tissue.
Summary and Explanation
The Antigen Retrieval technique† is a novel method for the rescue of antigens from formalin-fixed,
paraffin-embedded tissue. It consists of heating sections in a microwave oven in the presence of an
antigen retrieval solution. The quality of the staining result is largely dependent on strict adherence to
the antigen retrieval protocol. If the antigens are incompletely retrieved, the staining is light and the
background may be high. A user following the standard protocol outlined on the reverse side will see
crisp, clear nuclear staining with little or no background.
Principles of the Procedure
Formalin fixation of the tissues induces protein cross links that helps in maintaining the cellular
morphology by inactivating the digestive enzymes and preserving the cytoskeleton. At the same time it
can cause conformational changes in the epitopes. This may cause a loss of reactivity of a specific
antibody to that antigen. High-energy treatment of such proteins in appropriate pH leads to restoration of
the epitope structure and hence retrieves the reactivity of antibody to the target antigen. This process is
defined as Antigen Retrieval. Shi et al 1991, have suggested that antigen retrieval loosens or breaks the
cross linkages induced by formalin. This allows for the enhanced penetration of antibodies and
accessibility of epitopes.
Reagents Provided
One of the following:
Cat. No.
Reagent Description
Format
Volume(ml)/Bottle
HK057-5KE
AR-10 Solution
10X Concentrate 100
HK081-5KE
Citra Plus Solution
Ready-to-use
250
HK081-20KE
Citra Plus Solution
Ready-to-use
1000
HK086-5K
Citra Solution
10X Concentrate 100
HK086-9K
Citra Solution
10X Concentrate 500
HK087-5KE
Citra Solution
Ready-to-use
250
HK087-20KE
Citra Solution
Ready-to-use
1000
HK584-5KE
EZ-DeWax™ Solution
Concentrate
500
Reagents Required but Not Supplied
Microwave oven, slide rack and containers.
Microwave Pressure Cooker ®, Cat. No. 62104, Nordic Ware®, Minneapolis,MN;
BioGenex Cat. No. NW001-PC(Optional).
• Add 4950 ml deionized water to the carboy. Cap the carboy tightly and shake the carboy for several
seconds to completely mix the solution.
• Store with cap tightly secured. The working solution may be stored and used at room temperature for up
to 1 month.
•
BioGenex Manual Protocol
Standard Protocol
1. Rinse slides in deionized water. Place slides in a plastic staining holder** with any empty slots filled
with blank slides. Place the holder in a slide bath containing sufficient volume of the antigen retrieval
solution to adequately cover the tissue on the slides.
2. Turn the oven on high power (500-1000 watts) and closely watch the solution until it comes to a rapid
boil, and then turn off the oven. (Note: It usually takes 2-4 minutes before a boil is reached. However,
the amount of time required may vary significantly depending on a number of factors, such as the
starting temperature of the retrieval solution, the wattage of the microwave oven, and the age of the oven
(It is very important that a rapid boil is reached for every run before proceeding to the next step.)
3. Set oven power to approximately 200W and simmer for 10 to 15 minutes. (This power setting should be
noted and used for this step in all subsequent runs for the same antibody. Each antibody should be tested
for the optimal time for this step.)
4. Remove the slide bath from the microwave oven. Allow slides to cool for 20-30 minutes at room
temperature. Rinse with several changes of deionized water. Place slides in 1X PBS and continue with
the immunostaining procedure.
Alternate Method: Microwave Pressure Cooker Protocol
The alternate method uses a pressure cooker inside of the microwave. The pressure cooker that we
recommend is available through Nordic Ware®, or you may purchase it through BioGenex for your
convenience.*
1. Place slides in a slide holder** filling empty slots with blank slides. Put the holder in the slide bath
containing 250 ml of working strength Antigen Retrieval Solution.
2. Fill a plastic pressure cooker with 600 ml of distilled water. Up to three baths may be placed side-byside in the pressure cooker. Cover the pressure cooker according to the manufacturer’s instructions.
3. Position the pressure cooker at the center inside the microwave oven, and turn the oven on high power
(500-1000 watts) for approximately 15 minutes, until the cooker is fully pressurized.
4. Reduce the microwave power level to 300-350 watts (40% power for 800watt ovens) and allow the
solution to simmer for 15 minutes. Then remove the pressure cooker from the microwave oven and
carefully open the cover according to the manufacturer’s instructions. Leaving the slides in the cooker,
allow the slides to cool for 20 minutes, then continue with the immunostaining procedure.
Quality Control
A positive control slide, which has been treated with the same antigen retrieval conditions as the tissues of
interest, should be included in every experiment.
This product has been validated through extensive testing on the following tissues: stomach, kidney, liver
and skin.
Run appropriate controls slides with and without antigen retrieval. The antigen retrieval should enhance the
signal with appropriate control antibody.
Trouble shooting
1. Avoid allowing the solution to boil over as this may cause the tissue to come off the slide or the tissue to
dry out.
2. Some tissues are more prone to coming off the slides during antigen retrieval (particularly fatty tissue).
Should this occur it might be necessary to bring the antigen retrieval solution to a boil prior to adding the
slides, followed by a gentle simmer for 3-5 minutes. Then cool to room temperature for 20-30 minutes
prior to continuing with immunohistochemistry.
3. Non-specific staining in the negative control can be due to the exposure of endogenous biotin. Over
retrieval can sometimes make the tissue act like frozen tissue. This will make the detection system too
strong or the antibody too concentrated. Further titration may be necessary. Including an additional
avidin-biotin block should prevent staining of the exposed biotin.
4. After antigen retrieval, the slides can be stored overnight in Phosphate Buffered Saline(PBS)at 4ºC if
required. This can, however, cause some tissues to fall off and care should be taken to avoid this.
5. If positive control gives optimum signal, negative control shows no background and test slide gives
negative or weak signal, a different fixative might have been used. In order to obtain the best signal in
tissue sections fixed with a different fixative, optimization of antigen retrieval conditions is
recommended.
6. Refer to appropriate antibody and detection system inserts for pattern and intensity of staining with
different antibodies.
Expected Results
Antigen retrieval can produce markedly improved staining of a wide variety of monoclonal and polyclonal
antibodies. This helps overcome false negative staining of over fixed tissue, expand the range of antibodies
that can be used and increase the usefulness of archival tissue.
Storage and Handling
Store all reagents at 2-8°C. Do not use after expiration dates as indicated on the reagent labels.
Optimized antigen retrieval should improve signal to noise in immunohistochemistry.
Specimen Preparation
Appropriate fixation plays an important role in preserving the tissue structure. The antigen retrieval
protocol is recommended for use in tissues that have been fixed in formalin only. Ensure that the fixed
sections are adequately embedded in paraffin. Cut tissue sections to 4-5 microns.
Limitations of the procedure
The antigen retrieval protocol is recommended for use with tissues fixed with formalin only. Other fixatives
or fixation procedures may not produce comparable results. Interpretation of the staining results is solely the
responsibility of the user.
Precautions
HK511-YOKE, HK512-YOKE, HK513-YOKE, HK584-5KE
Performance Characteristics
BioGenex has conducted studies to evaluate the performance of all its antigen retrieval agents using several
BioGenex antibodies and detection systems. BioGenex antigen retrieval reagents have shown reproducible
and consistent results when used within a single run, between runs, between lots and wherever applicable
between manual and automated runs. The products have been determined to be stable for the periods
specified on the labels either by standard real time or accelerated testing methods. BioGenex ensures
product quality through 100% quality control for all products released and through surveillance programs.
Carc 3;R40 = Limited evidence of a carcinogenic effect.
S36/37; S60 = Wear suitable protective clothing and gloves.This material and its container must
be disposed of as hazardous waste.
Preparation of Working Solutions
Antigen Retrieval Solution, are available in a ready to use (RTU) or a concentrated format. The 10X
concentrated format should be diluted tenfold with deionized water (mix one part of concentrated
Antigen Retrieval Solution with nine parts of deionized water). EZ-DeWax™ Solution is concentrated
and requires reconstitution in 500ml reagent alcohol.
• For AR1, AR2 and AR3, prepare as stated below:
• Shake the bottle vigorously to completely mix the components of the concentrate (the solution may
separate into phases over time).
• Pour the entire contents of the bottle into the corresponding AR carboy. Add 225 ml histologicalgrade alcohol to the carboy. (Note: AR solutions must be reconstituted with histological-grade
alcohol. For example, Fisher Reagent Grade Alcohol, Cat. No. A962, or Sigma Reagent Alcohol, Cat.
No. R8382, are specifically denatured for histological use and also specifically filtered for use in
tissue processors.)
ITALIANO, ITALIAN
Uso previsto
Le soluzioni per antigen retrieval sono destinate all'uso diagnostico in vitro per il recupero dell'antigenicità
in tessuto fissato in formalina, incluso in paraffina.
Riassunto e spiegazione
La tecnica di antigen retrieval è un metodo innovativo per il recupero di antigeni da sezioni di tessuto fissate
in formalina, incluse in paraffina. Essa consiste nel riscaldare le sezioni di tessuto in un forno a microonde,
in presenza di una soluzione per antigen retrieval. La qualità del risultato della colorazione dipende
ampiamente dal rigoroso rispetto del protocollo di antigen retrieval. Se gli antigeni vengono completamente
recuperati, la colorazione risulta leggera, mentre il fondo può avere un colore intenso. L'utente che rispetti il
protocollo standard, descritto sul retro di questa scheda, noterà una vivace colorazione chiara del nucleo,
con un fondo scarso o assente.
Principi della procedura
La fissazione dei tessuti in formalina induce legami crociati tra proteine e aiuta a mantenere la morfologia
cellulare, inattivando gli enzimi digestivi e preservando il citoscheletro. Al tempo stesso, essa determina
modificazioni conformazionali degli epitopi. Ciò può causare una perdita di reattività di un anticorpo
specifico per l'antigene in questione. Il trattamento ad alta energia di tali proteine ad un pH idoneo
favorisce il ripristino della struttura degli epitopi e quindi recupera la reattività dell'anticorpo nei confronti
dell'antigene bersaglio. Questo processo è definito "antigen retrieval". Shi et al 1991 hanno suggerito che
l'antigen retrieval allenta o spezza i legami crociati indotti dalla formalina. Ciò consente una maggiore
penetrazione degli anticorpi ed una maggiore accessibilità degli epitopi.
Reagenti forniti
Uno dei seguenti:
N. di catalogo
Descrizione reagente
Formato
HK057-5KE
Soluzione AR-10
Concentrata 10X 100
Volume (ml)/flacone
HK081-5KE
Citra Plus Solution
Pronta per l'uso
250
HK081-20KE
Citra Plus Solution
Pronta per l'uso
1000
HK086-5K
Citra Solution
Concentrata 10X 100
HK086-9K
Citra Solution
Concentrata 10X 500
HK087-5KE
Citra Solution
Pronta per l'uso
250
HK087-20KE
Citra Solution
Pronta per l'uso
1000
HK584-5KE
EZ-DeWax™ Solution*
Concentrata
500
Antigen Retrieval e' un prodotto con marchio depositato di proprieta' di BioGenex sotto i seguenti brevetti:
Brevetto Statunitense No. 5244787, No. 5578452 e No. 6451551;
Brevetto Europeo No. 0607422; e brevetto Giapponese No. 3108099.
*Brevetto Statunitense No. 6451551 e No. 6632598.
Reagenti necessari, ma non forniti
Forno a microonde, rack per vetrini e recipienti.
Microwave Pressure Cooker ®, N. di catalogo 62104, Nordic Ware®, Minneapolis,MN;
N. di catalogo NW001-PC BioGenex (opzionale).
Conservazione e manipolazione
Conservare tutti i reagenti a 2-8°C. Non utilizzare dopo la data di scadenza impressa sull'etichetta dei
diversi reagenti.
Allestimento dei campioni
La fissazione ha un ruolo importante nella conservazione della struttura del tessuto. Il protocollo di antigen
retrieval è raccomandato per l'uso su tessuti che sono stati fissati esclusivamente in formalina. Assicurarsi
che le sezioni fissate siano opportunamente incluse in paraffina. Tagliare sezioni di tessuto di 4-5 micron.
Precauzioni
HK511-YOKE, HK512-YOKE, HK513-YOKE, HK584-5KE
Carc 3;R40 = Possibilità di effetti cancerogeni - prove insufficienti.
S36/37; S60 = Usare indumenti protettivi e guanti adatti.Questo materiale e il suo contenitore
devono essere smaltiti come rifiuti pericolosi.
Preparazione delle soluzioni di lavoro
Le Soluzioni di Recupero Antigenico, sono disponibili in formato pronto uso (RTU) o concentrato. Il
formato concentrato 10x dovrebbe essere diluito 10 volte con acqua deionizzata (mescolare una parte di
Soluzione di Recupero Antigenico concentrata con nove parti di acqua deionizzata).
La Soluzione EZ-DeWax™ è concentrata e richiede la ricostituzione in 500 ml di reagente alcolico.
• Per le Soluzioni AR1, AR2 ed AR3, preparare come di seguito stabilito:
• Scuotere vigorosamente la bottiglia affinchè i componenti della soluzione concentrata si mescolino
completamente (la soluzione si può separare in due fasi nel tempo).
• Versare l’intero contenuto della bottiglia nella corrispondente tanica dell’AR.
• Aggiungere 225 ml di alcool per istologia nella tanica. (Nota: le Soluzioni AR devono essere ricostituite
con alcool istologico. Per esempio, l’alcool della Fisher, codice A962, o quello della Sigma, codice
R8382, sono specificamente denaturati per uso istologico ed anche specificamente filtrati per l’uso in
processatori di tessuto).
• Aggiungere 4.950 ml di acqua deionizzata alla tanica. Chiudere bene la tanica con il relativo tappo e
scuotere la tanica per alcuni secondi per completare il mescolamento della soluzione.
• Conservare con il tappo ben chiuso. La soluzione di lavoro può essere conservata ed usata a temperatura
ambiente fino ad 1 mese dalla sua ricostituzione.
Protocollo manuale BioGenex
Protocollo standard
1. Risciacquare i vetrini in acqua deionizzata. Collocare i vetrini in un supporto di plastica per
colorazione**, in cui gli eventuali slot vuoti siano riempiti con vetrini inutilizzati. Collocare il supporto
in una vaschetta per vetrini, contenente soluzione per antigen retrieval in quantità sufficiente da coprire
opportunamente il tessuto sui vetrini.
2. Portare il forno ad alta potenza (500-1000 watt) e osservare da vicino la soluzione finché non giunge a
rapida ebollizione, quindi spegnere il forno. (Nota: occorrono in genere 2-4 minuti prima che si
raggiunga l'ebollizione. Tuttavia, la quantità di tempo necessaria può variare sensibilmente in funzione
di numerosi fattori, come la temperatura iniziale della soluzione di recupero, il wattaggio del forno a
microonde e l'età del forno (è molto importante che si raggiunga un'ebollizione rapida per ogni ciclo,
prima di procedere alla fase successiva).
3. Regolare la potenza del forno su circa 200 watt e scaldare per 10-15 minuti. (È bene annotare questo
valore di potenza e utilizzarlo per questa fase, in tutti i cicli successivi per lo stesso anticorpo. Occorre
verificare per ogni anticorpo quale sia la quantità di tempo ottimale per questa fase).
4. Rimuovere la vaschetta con i vetrini dal forno a microonde. Lasciar raffreddare i vetrini per 20-30
minuti a temperatura ambiente. Risciacquare più volte i vetrini con acqua deionizzata. Collocare i
vetrini in soluzione tampone fosfato (PBS) 1X e continuare con la procedura di immunocolorazione.
Metodo alternativo: protocollo Microwave Pressure Cooker
Il metodo alternativo si avvale di una pentola a pressione invece del forno a microonde. La pentola a
pressione da noi consigliata è disponibile presso la Nordic Ware® o, eventualmente, può essere
acquistata tramite la BioGenex.
1. Collocare i vetrini in un supporto per colorazione**, riempiendo gli slot vuoti con vetrini
inutilizzati. Collocare il supporto in una vaschetta per vetrini, contenente 250 ml di soluzione di
lavoro per antigen retrieval.
2. Riempire una pentola a pressione di plastica con 600 ml di acqua distillata. È possibile inserire nella
pentola a pressione fino a tre vaschette, una di fianco all'altra. Chiudere la pentola a pressione
secondo le istruzioni fornite dal produttore.
3. Posizionare la pentola a pressione al centro del forno a microonde, portare il forno ad alta potenza
(500-1000 watt) per circa 15 minuti, finché la pentola non sia interamente sotto pressione.
4. Ridurre la potenza del forno a 300-350 watt (40% della potenza per i forni da 800 watt) e lasciar
bollire lentamente la soluzione per 15 minuti. Quindi togliere la pentola a pressione dal forno e
rimuovere con cautela il coperchio, secondo le istruzioni fornite dal produttore. Senza togliere i
vetrini dalla pentola, lasciarli raffreddare per 20 minuti, quindi continuare con la procedura di
immunocolorazione.
Controllo qualità
In ogni esperimento deve essere incluso un vetrino di controllo positivo, che sia stato trattato con le
stesse condizioni di recupero antigenicità dei tessuti d'interesse.
Questo prodotto è stato convalidato mediante test approfonditi, condotti sui seguenti tessuti: stomaco,
reni, fegato e cute.
Utilizzare opportuni vetrini di controllo con e senza antigen retrieval. L'antigen retrieval dovrebbe
amplificare il segnale con un idoneo anticorpo di controllo.
Risoluzione dei problemi
1. Non lasciar bollire la soluzione per un periodo eccessivo, poiché ciò potrebbe provocare il distacco
del tessuto dal vetrino o l'essiccazione del tessuto.
2. Alcuni tessuti sono soggetti a staccarsi dai vetrini durante l'antigen retrieval (soprattutto i tessuti
grassi). Qualora ciò accadesse, potrebbe essere necessario portare la soluzione per antigen retrieval
ad ebollizione prima di aggiungere i vetrini, lasciandola poi bollire lentamente per 3-5 minuti.
Quindi lasciar raffreddare per 20-30 minuti a temperatura ambiente, prima di continuare con
l'immunoistochimica.
3. Una colorazione aspecifica nel controllo negativo può essere dovuta all'esposizione della biotina
endogena. Talvolta, un recupero eccessivo dell'antigenicità può indurre il tessuto a comportarsi
come tessuto congelato. Ciò rende il sistema di rivelazione troppo potente o l'anticorpo troppo
concentrato. Potrebbe occorrere un'ulteriore titolazione. Aggiungendo un complesso avidina-biotina,
si dovrebbe impedire la colorazione della biotina esposta.
4. Dopo l'antigen retrieval, i vetrini possono essere conservati per la notte, se necessario, in PBS a 4°C.
Tuttavia, ciò può causare il distacco di taluni tessuti: adottare ogni precauzione per evitarlo.
5. Se il controllo positivo fornisce un segnale ottimo, il controllo negativo non mostra alcun fondo e il
vetrino di prova fornisce un segnale negativo o debole, significa che probabilmente è stato utilizzato
un fissativo diverso. Per ottenere il segnale migliore, in sezioni di tessuto fissate con un fissativo
diverso, si raccomanda di ottimizzare le condizioni dell'antigen retrieval.
6. Consultare gli appositi foglietti illustrativi degli anticorpi e dei sistemi di rivelazione per conoscere
il pattern e l'intensità della colorazione con anticorpi diversi.
Risultati attesi
L'antigen retrieval può fornire una colorazione notevolmente potenziata di un'ampia varietà di anticorpi
monoclonali e policlonali. Si può così ovviare agli inconvenienti della colorazione falsa negativa di un
tessuto sottoposto ad eccessiva fissazione, ampliare la gamma degli anticorpi utilizzabili ed accrescere
l'utilità del tessuto d'archiviazione.
Una tecnica ottimizzata di antigen retrieval dovrebbe migliorare il rapporto segnale/rumore in
immunoistochimica.
Limiti della procedura
Il protocollo di antigen retrieval è raccomandato per l'uso su tessuti che sono stati fissati esclusivamente
in formalina. Altri fissativi o altre procedure di fissazione potrebbero non fornire risultati altrettanto
validi. L'interpretazione dei risultati della colorazione è di esclusiva responsabilità dell'utilizzatore.
Caratteristiche funzionali
BioGenex ha condotto diversi studi per valutare l'efficacia di tutti i suoi agenti per antigen retrieval,
utilizzando diversi sistemi di rivelazione e anticorpi BioGenex. I reagenti per antigen retrieval Biogenex
hanno mostrato risultati riproducibili e coerenti, quando sono stati utilizzati nell'ambito di un singolo
ciclo, tra più cicli, tra più lotti, nonché quando sono risultati applicabili tra cicli automatici e cicli
manuali. Si è potuto determinare che tali prodotti rimangono stabili per i periodi indicati sulle relative
etichette, sia secondo il tempo reale standard sia in base a metodi di test accelerati. BioGenex assicura la
qualità del prodotto grazie ad un controllo qualità al 100% su tutti i prodotti forniti e grazie a programmi
di sorveglianza.
DEUTSCH, GERMAN
Verwendungszweck
Antigen Retrieval Lösungen dienen in der In-vitro-Diagnostik zur Wiederherstellung von Antigenität in
Formalin-fixiertem, Paraffin-eingebettetem Gewebe.
Zusammenfassung und Erklärung
Die Antigen-Wiederherstellungstechnik† ist ein neuartiges Verfahren zur Befreiung von Antigenen aus
Formalin-fixiertem, Paraffin-eingebettetem Gewebe. Dabei werden Schnitte in einem Mikrowellenherd
in Anwesenheit einer Antigen Retrieval Lösung erhitzt. Die Qualität des Färberesultats hängt zum
Großteil von der strikten Befolgung des Antigen-Wiederherstellungsprotokolls ab. Wenn die Antigene
unvollständig wiederhergestellt werden, ist die Anfärbung hell und der Hintergrund möglicherweise
hochrot. Ein Anwender, der das auf der Rückseite beschriebene Standardprotokoll befolgt, sieht eine
klare, deutliche Zellkernfärbung mit wenig oder keinem Hintergrund.
Prinzipien des Verfahrens
Die Formalinfixierung der Gewebe induziert Protein-Quervernetzungen, die helfen, die
Zellmorphologie durch Inaktivierung der Verdauungsenzyme und Erhalt des Zytoskeletts aufrecht zu
erhalten. Gleichzeitig kann sie Konformationsänderungen in den Epitopen verursachen. Das kann zu
einem Reaktivitätsverlust eines spezifischen Antikörpers gegen dieses Antigen führen. Eine
Hochenergiebehandlung solcher Proteine bei einem geeigneten pH-Wert führt zur Wiederherstellung
der Epitopstruktur und damit auch der Reaktivität des Antikörpers gegen das Zielantigen. Dieser
Vorgang ist als „Antigen Retrieval“ (Antigen-Wiederherstellung) definiert. Shi et al., 1991, haben
vorgeschlagen, dass die Antigen-Wiederherstellung die durch Formalin induzierten Quervernetzungen
lockert oder aufbricht. Das ermöglicht die verbesserte Penetration von Antikörpern und Zugänglichkeit
der Epitope.
1
Mitgelieferte Reagenzien
Eines der folgenden:
Kat. Nr.
Bezeichnung Reagenz
Format
Volumen (ml)/Flasche
HK057-5KE
AR-10 Solution
10X Konzentrat
HK081-5KE
Citra Plus Solution
Gebrauchsfertig 250
HK081-20KE
Citra Plus Solution
100
Gebrauchsfertig 1000
HK086-5K
Citra Solution
10X Konzentrat
100
HK086-9K
Citra Solution
10X Konzentrat
500
HK087-5KE
Citra Solution
Gebrauchsfertig 250
HK087-20KE
Citra Solution
Gebrauchsfertig 1000
HK584-5KE
EZ-DeWax™ Solution*
Konzentrat
500
Antigen Retrieval ist patentrechtlich geschützt durch folgende Patente der Firma BioGenex:
US-Patent Nr. 5,244,787, Nr. 5,578,452, Nr. 6,451,551; europäisches Patent Nr. 0607422 und
japanisches Patent Nr. 3108099.
*US-Patent Nr. 6,451,551 und Nr. 6,632,598.
Benötigte Materialien (nicht im Lieferumfang)
Mikrowellenherd, Objektträger-Gestell und Behälter.
Microwave Pressure Cooker ®, Kat. Nr. 62104, Nordic Ware®, Minneapolis,MN;
BioGenex Kat. Nr. NW001-PC (Optional).
Lagerung und Handhabung
Alle Reagenzien bei 2–8 °C lagern. Nicht nach dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum
verwenden.
Probenvorbereitung
Die geeignete Fixierung spielt eine wichtige Rolle bei der Konservierung der Gewebestruktur. Das
Antigen-Wiederherstellungsprotokoll wird zur Verwendung bei Geweben empfohlen, die nur in
Formalin fixiert wurden. Die fixierten Schnitte müssen korrekt in Paraffin eingebettet sein.
Gewebeschnitte mit einer Dicke von 4–5 Mikron durchführen.
Vorsichtsmaßnahmen
HK511-YOKE, HK512-YOKE, HK513-YOKE, HK584-5KE
Carc 3;R40 = Verdacht auf krebserzeugende Wirkung.
S36/37; S60 = Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzkleidung tragen.Dieses Produkt
und sein Behälter sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen.
Zubereitung von Arbeitslösungen
Die “Antigen Retrieval” Lösung ist in einem ready to use oder in einem konzentriertem Format
verfügbar. Das 10-fach konzentrierte Format muss mit de-ionisiertem Wasser (ein Teil der
konzentrierten Antigen Retrieval Lösung wird mit neun Teilen de-ionisiertem Wasser gemischt) 10-fach
verdünnt werden. Die EZ-DeWax™ Lösung ist konzentriert und benötigt eine Rekonstituierung in 500
ml Reagenzien-Alkohol.
2. Einen Kunststoff-Druckkochtopf mit 600 ml destilliertem Wasser füllen. Bis zu drei Bäder können Seite
an Seite in den Druckkochtopf gestellt werden. Den Druckkochtopf entsprechend den
Herstelleranweisungen abdecken.
3. Den Druckkochtopf in die Mitte des Mikrowellenherds stellen und diesen für etwa 15 Minuten auf hohe
Leistung (500–1000 Watt) einstellen, bis der Kochtopf vollständig unter Druck steht.
4. Die Mikrowellenleistung auf 300–350 Watt reduzieren (40 % Leistung für 800-Watt-Herde) und die
Lösung 15 Minuten köcheln lassen. Den Druckkochtopf dann aus dem Mikrowellenherd nehmen und die
Abdeckung vorsichtig entsprechend den Herstelleranweisungen öffnen. Die Objektträger im Kochtopf
20 Minuten abkühlen lassen und dann mit der Immunfärbung weitermachen.
Qualitätskontrolle
Ein positiver Kontroll-Objektträger, der mit den gleichen Antigen-Wiederherstellungsbedingungen wie die
Zielgewebe behandelt wurde, sollte bei jedem Experiment mitlaufen.
Dieses Produkt wurde durch ausgedehnte Tests an den folgenden Geweben überprüft: Magen, Niere, Leber
und Haut.
Geeignete Kontroll-Objektträger mit und ohne Antigen-Wiederherstellung mitlaufen lassen. Die AntigenWiederherstellung sollte das Signal mit geeignetem Kontroll-Antikörper verstärken.
Fehlerbehebung
1. Ein Überkochen der Lösung vermeiden, da dies dazu führen kann, dass sich das Gewebe vom
Objektträger ablöst oder austrocknet.
2. Einige Gewebe neigen eher dazu, sich während der Antigen-Wiederherstellung von den Objektträgern
abzulösen (insbesondere Fettgewebe). Falls dies auftritt, kann es erforderlich sein, die Antigen Retrieval
Lösung vor Zugabe der Objektträger zum Kochen zu bringen und dann 3–5 Minuten leicht köcheln zu
lasen. Dann 20–30 Minuten auf Zimmertemperatur abkühlen, bevor mit der Immunohistochemie
weitergemacht wird.
3. Eine unspezifische Färbung in der Negativkontrolle kann durch Exposition von endogenem Biotin
verursacht werden. Eine übermäßige Wiederherstellung kann gelegentlich dazu führen, dass das Gewebe
wie gefrorenes Gewebe reagiert. Das macht das Nachweissystem zu stark oder den Antikörper zu
konzentriert. Eine weitere Titration kann erforderlich sein. Das Einbeziehen eines zusätzlichen AvidinBiotin-Blocks sollte eine Anfärbung des exponierten Biotins verhindern.
4. Nach der Antigen-Wiederherstellung können die Objektträger falls erforderlich über Nacht in PBS bei 4
°C gelagert werden. Das kann jedoch bei einigen Geweben zur Ablösung führen und sollte möglichst
vermieden werden.
5. Wenn die positive Kontrolle ein optimales Signal gibt, die Negativkontrolle keinen Hintergrund zeigt
und der Test-Objektträger ein negatives oder schwaches Signal gibt, wurde möglicherweise ein anderes
Fixiermittel verwendet. Um bei Gewebeschnitten, die mit einem anderen Mittel fixiert wurden, das
bestmögliche Signal zu erhalten, wird eine Optimierung der Antigen-Wiederherstellungsbedingungen
empfohlen.
6. Die Informationen über Färbemuster und -intensität bei anderen Antikörpern sind den entsprechenden
Packungsbeilagen von Antikörpern und Nachweissystemen zu entnehmen.
Erwartete Ergebnisse
Die Antigen-Wiederherstellung kann eine deutlich verbesserte Anfärbung einer breiten Palette von
monoklonalen und polyklonalen Antikörpern bewirken. Dies hilft, eine falsch negative Anfärbung von
überfixiertem Gewebe auszugleichen, die Palette der verwendbaren Antikörper zu vergrößern und die
Brauchbarkeit archivierter Gewebe zu steigern.
Die optimierte Antigen-Wiederherstellung sollte das Signal/Rausch-Verhältnis in der Immunohistochemie
verbessern.
Einschränkungen des Verfahrens
Das Antigen-Wiederherstellungsprotokoll wird nur für Formalin-fixierte Gewebe empfohlen. Andere
Fixative oder Fixierverfahren können möglicherweise nicht vergleichbare Resultate ergeben. Die
Interpretation der Färbungsresultate obliegt der alleinigen Verantwortung des Anwenders.
• AR1, AR2 und AR3 werden wie folgt vorbereitet:
• Schütteln Sie die Flasche heftig um die Komponenten des Konzentrates vollständig durchzumischen
(die Lösung kann sich über die Zeit in die einzelnen Phasen separieren).
• Füllen Sie den gesamten Inhalt der Flasche in den entsprechende AR-Ballon.
• Fügen Sie 225 ml Alkohol histologischen Gütegrades in den Ballon bei (Anmerkung: AR Lösungen
müssen in Alkohol histologischen Gütegrades rekonstituiert werden. Zum Beispiel:
• Fisher Alkohol Reagenzien-Gütegrad, Cat. No. A962, oder Sigma Alkohol Reagenzien-Gütegrad sind
speziell denaturiert für den histologischen Gebrauch und ebenfalls spezifisch für den Einsatz in
Gewebe-Verarbeitungssystemen gefiltert).
• Fügen Sie 4950 ml de-ionisiertes Wasser in den Ballon bei.
• Schliessen Sie den Ballon fest zu und schütteln Sie ihn mehrerer Sekunden lang, um die Lösung
vollständig zu mischen.
• Lagern Sie die Lösung mit fest geschlossenem Deckel. Die Arbeitslösung kann bei Raumtemperatur
gelagert und bis zu einem Monat lang verwendet werden.
Leistungsmerkmale
BioGenex hat Untersuchungen zur Beurteilung der Leistungsfähigkeit all seiner AntigenWiederherstellungsreagenzien unter Verwendung verschiedener BioGenex Antikörper und
Nachweissysteme durchgeführt. BioGenex Antigen-Wiederherstellungsreagenzien haben reproduzierbare
und konsistente Ergebnisse gezeigt, bei Verwendung innerhalb eines einzigen Durchlaufs, bei verschiedenen
Durchläufen, mit verschiedenen Chargen und, falls zutreffend, auch beim Vergleich zwischen manuellen
und automatisierten Durchläufen. Die Produkte wurden für die auf den Etiketten angegebenen Zeiträume als
stabil bestimmt, entweder mit Standard-Echtzeit- oder beschleunigten Testmethoden. BioGenex sichert die
Produktqualität durch 100%ige Qualitätskontrolle für alle freigegebenen Produkte und durch
Überwachungsprogramme.
BioGenex Handbuch-Protokoll
Standardprotokoll
1. Objektträger in deionisiertem Wasser abspülen. Objektträger in einen Kunststoff-Färbehalter**
stellen, wobei alle leeren Einschübe mit blanken Objektträgern gefüllt werden. Den Halter in ein
Objektträgerbad mit einer ausreichenden Menge der Antigen Retrieval Lösung zur Bedeckung des
Gewebes auf den Objektträgern stellen.
2. Den Herd auf hohe Leistung (500–1000 Watt) einstellen und die Lösung beobachten, bis es zu einem
schnellen Aufkochen kommt, dann den Herd ausschalten. (Hinweis: Es dauert normalerweise 2–4
Minuten bis zum Aufkochen.) Die benötigte Zeit kann jedoch beträchtlich variieren, abhängig von
mehreren Faktoren wie beispielsweise der Anfangstemperatur der Wiederherstellungslösung, der
Wattzahl des Mikrowellenherds und dem Alter des Herds (es ist sehr wichtig, dass für jeden
Durchlauf ein schnelles Aufkochen erreicht wird, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird)
3. Die Herdleistung auf etwa 200 W einstellen und 10 bis 15 Minuten auf köcheln lassen. (Diese
Einstellung sollte notiert und für diesen Schritt bei allen nachfolgenden Durchläufen für den gleichen
Antikörper verwendet werden. Jeder Antikörper sollte auf die optimale Zeit für diesen Schritt
getestet werden.)
4. Das Objektträgerbad aus dem Mikrowellenherd nehmen. Die Objektträger 20–30 Minuten auf
Zimmertemperatur abkühlen lassen. Mit mehrfach gewechseltem deionisiertem Wasser abspülen.
Die Objektträger in 1X PBS geben und mit dem Immunfärbeverfahren weitermachen.
Uso previsto
Las soluciones de recuperación de antígenos son para uso diagnóstico in vitro, para recuperar la
antigenicidad del tejido fijado con formol y embebido en parafina.
Alternative Methode: Microwave Pressure Cooker Protokoll
Die alternative Methode verwendet einen Druckkochtopf im Inneren des Mikrowellenherds. Der von uns
empfohlene Druckkochtopf ist über Nordic Ware® erhältlich oder kann bequem über BioGenex bezogen
werden*
1. Objektträger in einen Objektträgerhalter** stellen und alle leeren Einschübe mit blanken
Objektträgern füllen. Den Halter in ein Objektträgerbad mit 250 ml Antigen Retrieval Lösung in
Arbeitsstärke geben.
ESPANOL, SPANISH
Resumen y explicación
La técnica de Recuperación del antígeno† es un nuevo método para el rescate de antígeno en un tejido fijado
con formol y embebido en parafina. Consiste en calentar los cortes en un horno microondas en presencia de
una solución de recuperación del antígeno. La calidad del resultado de la tinción depende en gran medida de
que se siga estrictamente el protocolo de recuperación del antígeno. Si la recuperación de los antígenos es
incompleta, la tinción es clara y puede ser alta en el fondo. El usuario que siga el protocolo estándar que se
expone en el reverso de esta hoja verá una tinción nítida y transparente del núcleo con un fondo escaso o
nulo.
Principios del procedimiento
La fijación de los tejidos con formol induce una reticulación proteica que ayuda a mantener la morfología
celular al inactivar las enzimas digestivas y conservar el citoesqueleto. Al mismo tiempo, puede provocar
cambios de conformación en los epitopos. Con ello, se puede perder la reactividad ante un anticuerpo
específico de ese antígeno. El tratamiento de alta energía de tales proteínas en un pH adecuado restaura la
estructura de los epitopos y, en consecuencia, se recupera la reactividad del anticuerpo hacia el antígeno
diana. Este proceso se define como “recuperación del antígeno”. Shi y cols. sugirieron en 1991 que la
recuperación del antígeno debilita o rompe la reticulación inducida por formol. Con ello se potencia la
penetración de los anticuerpos y la accesibilidad de los epitopos.
Reactivos suministrados
Uno de los siguientes:
Nº de ref.
Descripción del reactivo
Formato
Volumen (ml)/frasco
HK057-5KE
Solución AR-10
Concentrado 10X
100
HK081-5KE
Citra Plus Solution
Listo para usar
250
HK081-20KE
Citra Plus Solution
Listo para usar
1000
HK086-5K
Citra Solution
Concentrado 10X
100
HK086-9K
Citra Solution
Concentrado 10X
500
HK087-5KE
Citra Solution
Listo para usar
250
HK087-20KE
Citra Solution
Listo para usar
1000
HK584-5KE
EZ-DeWax™ Solution
Concentrado
500
Reactivos necesarios pero no suministrados
Horno microondas, gradilla y recipientes para portaobjetos.
Microwave Pressure Cooker ®, Nº de ref. 62104, Nordic Ware®, Minneapolis,MN;
BioGenex Nº de ref. NW001-PC (Opcional).
Almacenamiento y manipulación
Almacenar todos los reactivos a 2-8 ºC. No usar después de las fechas de caducidad que se indican en las
etiquetas de los reactivos.
Preparación de la muestra
La fijación apropiada es primordial en la conservación de la estructura del tejido. Se recomienda usar el
protocolo de recuperación en tejidos que se han fijado sólo con formol. Comprobar que los cortes estén
correctamente embebidos en parafina. Cortar secciones de tejido de 4-5 micras.
Precauciones
HK511-YOKE, HK512-YOKE, HK513-YOKE, HK584-5KE
Carc 3;R40 = Posibles efectos cancerígenos.
S36/37; S60 = Úsense indumentaria y guantes de protección adecuados.Elimínense el producto y
su recipiente como residuos peligrosos.
Preparación de las soluciones de trabajo
La Solución de Recuperación de Antígenos (Antigen Retrieval Solution) está disponible en dos formatos:
lista para usar o concentrada. El formato con una concentración de 10X tiene que diluirse diez veces con
agua desionizada (mezcle una parte de Solución concentrada de Recuperación de Antígenos con nueve
partes de agua desionizada).
La solución EZ-DeWax(tm) es concentrada y tiene que reconstituirse en 500ml de alcohol reactivo.
• Para AR1, AR2 y AR3, realice los siguientes pasos:
• Agite bien la botella para mezclar correctamente los componentes del concentrado (es posible que, con
el tiempo, la solución se haya separado en sus diferentes fases).
• Vierta todo el contenido de la botella en el correspondiente bidón de AR.
• Añada 225 ml de alcohol para uso histológico al bidón. (Nota: las soluciones AR deben reconstituirse
con alcohol para uso histológico. Por ejemplo, los productos Fisher Reagent Grade Alcohol, Nº Cat.
A962, y Sigma Reagent Alcohol, Nº Cat. R8382, están especialmente desnaturalizados para uso
histológico y, además, se han filtrado específicamente para su uso en procesadores de tejido).
• Añada 4950 ml de agua desionizada all bidón. Tape bien el bidón y agítelo durante algunos segundos,
hasta que la solución esté completamente mezclada.
• Antes de almacenar el bidón, asegúrese de que está bien tapado. La solución de trabajo puede
almacenarse y utilizarse a temperatura ambiente, y como máximo en el plazo de 1 mes.
Protocolo manual de BioGenex
Protocolo estándar
1. Aclare los portaobjetos con agua desionizada. Coloque los portaobjetos en un soporte de tinción de
plástico**, llenando las ranuras vacías con portaobjetos en blanco. Coloque el soporte en un baño de
portaobjetos que contenga el volumen suficiente de solución de recuperación del antígeno para cubrir
adecuadamente los tejidos en los portaobjetos.
2. Encienda el horno (500-1000 vatios) y vigile de cerca la solución hasta que comience un rápido hervor,
y después apague el horno. (Nota: Habitualmente se tarda 2-4 minutos para alcanzar el hervor. No
obstante, la cantidad de tiempo requerida puede variar significativamente dependiendo de varios
factores, como la temperatura inicial de la solución de recuperación, el voltaje del horno microondas y
la antigüedad del horno (es muy importante que se alcance el hervor rápido en cada serie antes de
continuar con el paso siguiente).
3. Fije la potencia del horno aproximadamente en 200 W y déjelo hervir durante 10-15 minutos a fuego
lento. (Esta configuración se anotará y se usará en este paso en todas las series sucesivas para el mismo
anticuerpo. En cada anticuerpo se deberá comprobar el tiempo óptimo de este paso).
4. Extraiga el baño de portaobjetos del horno microondas. Deje enfriar los portaobjetos durante 20-30
minutos a temperatura ambiente. Aclárelos con varios cambios de agua desionizada. Coloque los
portaobjetos en PBS 1X y continúe con el procedimiento de inmunotinción.
Resolución de problemas
1. No deje hervir la solución en exceso, ya que el tejido podría desprenderse del portaobjetos o secarse.
2. Algunos tejidos son más propensos a desprenderse del portaobjetos durante la recuperación del
antígeno (en particular, el tejido graso). Si esto ocurre, podría ser necesario llevar a ebullición la
solución de recuperación del antígeno antes de añadir los portaobjetos, dejándolos hervir después
suavemente durante 3-5 minutos. Seguidamente, enfríelos a temperatura ambiente durante 20-30
minutos antes de continuar con la inmunohistoquímica.
3. La tinción inespecífica del control negativo puede deberse a la exposición de la biotina endógena.
Un exceso de recuperación puede hacer que el tejido actúe como un tejido congelado. Con ello se
consigue que el sistema de detección sea demasiado fuerte o que el anticuerpo esté demasiado
concentrado. Puede ser necesaria una nueva valoración. La inclusión de un bloqueo adicional de
avidina-biotina evitará la tinción de la biotina expuesta.
4. Después de recuperar el antígeno, los portaobjetos se pueden almacenar toda la noche en PBS a 4
ºC, si es necesario. Sin embargo, con ello se puede conseguir que se desprendan algunos tejidos, por
lo que se evitará hacerlo.
5. Se deberá usar un fijador diferente si el control positivo da una señal óptima, el control negativo no
muestra tinción en el fondo, y el portaobjetos de prueba da una señal negativa o débil. Se
recomienda optimizar las condiciones de recuperación del antígeno para obtener la mejor señal en
los cortes de tejido fijados con un fijador diferente.
6. Consulte en los prospectos correspondientes del anticuerpo y del sistema de detección el patrón y la
intensidad con distintos anticuerpos.
Resultados esperados
La recuperación del antígeno puede producir una importante mejora de la tinción con varios anticuerpos
monoclonales y policlonales. Con ello se evita la tinción negativa falsa del tejido fijado en exceso, y
aumenta el número de anticuerpos que se pueden usar y la utilidad del tejido archivado.
La recuperación optimizada del antígeno debe mejorar la relación señal-ruido en inmunohistoquímica.
Limitaciones del procedimiento
Se recomienda usar el protocolo de recuperación del antígeno únicamente con tejidos fijados con
formol. Los resultados obtenidos con otros fijadores o procedimientos de fijación pueden no ser
comparables. La interpretación del resultado de la tinción es únicamente responsabilidad del usuario.
Características de funcionamiento
BioGenex ha realizado estudios para evaluar el funcionamiento de todos los agentes de recuperación del
antígeno usando varios anticuerpos y sistemas de detección de BioGenex. Los reactivos de recuperación
de antígenos BioGenex han mostrado resultados reproducibles y coherentes cuando se usan en un solo
procedimiento, entre procedimientos, entre lotes y, siempre que proceda, entre los procedimientos
manuales y automatizados. Se ha determinado que los productos son estables durante los períodos que
se especifican en las etiquetas, ya sea por métodos de tiempo real estándar o en condiciones aceleradas.
BioGenex garantiza la calidad del producto mediante un control de calidad al 100% de todos los
productos comercializados y mediante programas de seguimiento.
Bibliography
1.
Shi, S.R., et al. Antigen Retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement
method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. J
Histochem Cytochem 39:741, 1991.
2.
Gown, A.M., et al. Microwave-based antigenic unmasking: a revolutionary new technique for
routine immunohistochemistry. Appl. Immunohistochem 1:256-266, 1993.
3.
Shi, S.R., et al. Antigen Retrieval technique: a novel approach to immunohistochemistry on
routinely processed tissue sections. Cell Vision 2:6-22, 1995.
4.
Shi, S.R., et al. Antigen Retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using
monoclonal antibodies. J Histochem Cytochem 43:193-201, 1995.
Representative in the European Community
Mandatario nella Comunità Europea
Bevollmächtigter in der Europäischen Gemeinschaft
Representante autorizado en la Comunidad Europea
In Vitro Diagnostic Medical Device
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
In Vitro Diagnostikum
Producto sanitario para diagnóstico in vitro
Cons ult Instructions for use
Consultare le istruzioni per l'uso
Gebrauchsanweisung beachten
Consulte las instrucciones de uso
Temperature Limitation
Limiti di temperatura
Zulässiger Temperaturbereich
Limite de temperatura
Manufacturer
Fabbricante
Hersteller
Fabricante
Método alternativo: Protocolo de Microwave Pressure Cooker
El método alternativo usa una olla a presión dentro del horno microondas. La olla a presión recomendada
es la suministrada por Nordic Ware®, o bien la puede adquirir en BioGenex para su comodidad*.
1. Coloque los portaobjetos en un soporte**, llenando las ranuras vacías con portaobjetos en blanco.
Ponga el soporte en el baño de portaobjetos con 250 ml de Antigen Retrieval Solution a la
concentración de trabajo.
2. Llene la olla a presión de plástico con 600 ml de agua destilada. Se pueden colocar hasta tres baños
lado a lado en la olla a presión. Cubra la olla a presión siguiendo las instrucciones del fabricante.
3. Ponga la olla a presión en el centro del horno microondas y enciéndalo a una potencia alta (500-1000
vatios) durante aproximadamente 15 minutos, hasta que se alcance la máxima presión en la olla.
4. Reduzca la potencia del microondas a 300-350 vatios (40% de la potencia para los hornos de 800
vatios) y deje que la solución hierva a fuego lento durante 15 minutos. Extraiga a continuación la olla a
presión del microondas y abra la tapa despacio siguiendo las instrucciones del fabricante. Deje enfriar
los portaobjetos durante 20 minutos dentro de la olla y después continúe con el procedimiento de
inmunotinción.
Control de calidad
En cada experimento se debe incluir un portaobjetos de control positivo que se haya tratado con las
mismas condiciones de recuperación del antígeno que los tejidos de interés.
Este producto se ha validado mediante un estudio exhaustivo en los siguientes tejidos: estómago, riñón,
hígado y piel.
Procese los portaobjetos de control adecuados, con y sin la recuperación del antígeno. La recuperación del
antígeno debe mejorar la señal con un anticuerpo de control apropiado.
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