IDEIA Lyme Neuroborreliosis

IDEIA Lyme
Neuroborreliosis
K602811-2
96
ES
Un inmunoensayo enzimático para la determinación de los
anticuerpos IgG e IgM intratecales humanos frente a Borrelia
burgdorferi sensu lato.
1. INDICACIONES DE USO
El ensayo IDEIA™ Lyme Neuroborreliosis es un inmunoensayo
enzimático para la detección de anticuerpos IgG e IgM humanos
producidos intratecalmente contra Borrelia burgdorferi sensu
lato. El kit está indicado como herramienta de ayuda para el
diagnóstico de la neuroborreliosis de Lyme.
2. RESUMEN
La borreliosis de Lyme es una infección multisistémica causada
por la espiroqueta, transmitida por garrapatas, B. burgdorferi
sensu lato1,2. La borreliosis de Lyme es la enfermedad humana
transmitida por vectores más común en Europa y Norteamérica.
La enfermedad ha sido reconocida también en los países que
conformaron la antigua Unión Soviética, así como en China y
Japón.
La implicación del sistema nervioso, o neuroborreliosis, es una
manifestación común, grave, de la borreliosis de Lyme3. La
neuroborreliosis aparece en aproximadamente el 10% de los
pacientes que no han recibido tratamiento contra la lesión de la fase
primaria, el eritema migrans. B. burgdorferi provoca una variedad
de trastornos neurológicos tales como la meningorradiculitis
linfocítica dolorosa con o sin parálisis del nervio craneal y paresias
de las extremidades (síndrome de Bannwarth), meningitis
linfocítica crónica, mielitis y encefalomielitis progresiva crónica4,5.
Para la neuroborreliosis se precisa una prueba diagnóstica sensible
y fiable porque existe una serie de enfermedades con síntomas
similares y porque la neuroborreliosis, a diferencia de muchas de
estas enfermedades, responde al tratamiento con antibióticos.
Actualmente, el mejor indicador de neuroborreliosis activa
es un cambio inflamatorio en el líquido cefalorraquídeo
(LCR), especialmente un aumento en el número de células
mononucleares (pleocitosis mononuclear), combinado con la
aparición de anticuerpos específicos contra Borrelia, producidos
intratecalmente, en el LCR. La detección de una respuesta inmune
intratecal específica es más significativa en el plano diagnóstico
que la medición de anticuerpos específicos en suero. Además,
en la neuroborreliosis, la síntesis de anticuerpos específicos se
detecta, frecuentemente, antes en el LCR que en el suero6,7.
La síntesis intratecal de anticuerpos específicos es en muy pocas
ocasiones un hallazgo no significativo en los pacientes que
presentan síntomas neurológicos.
El ensayo IDEIA Lyme Neuroborreliosis está designado para la
detección directa, sensible, de anticuerpos IgG e IgM producidos
intratecalmente contra B. burgdorferi8. Con él, no se necesita la
medición de sustancias de referencia (como la albúmina, etc.)
y las complicadas correcciones a la trasudación de anticuerpos
séricos al LCR causada por daños en la barrera hematoencefálica.
Incluso la contaminación sanguínea del LCR durante una punción
lumbar no conduce a resultados falsos positivos.
En el ensayo se utiliza como antígeno el flagelo nativo purificado
de la cepa DK1 de B. afzelii. El flagelo es altamente inmunogénico,
genera una respuesta inmune temprana, intensa y persistente9,10,
y es el principal antígeno para la respuesta de producción
intratecal de anticuerpos11,12. Comparado con el antígeno del
ensayo convencional, que se basa en un extracto celular completo
de la espiroqueta, el antígeno flagelar nativo purificado mejora la
sensibilidad y especificidad diagnóstica de los ensayos serológicos
de la borreliosis de Lyme7,13. Además, el uso del flagelo como
antígeno de ensayo es apropiado en todas las áreas geográficas,
ya que el flagelo no varía significativamente en las diversas cepas
de B. burgdorferi.
3. PRINCIPIO DEL ENSAYO
El ensayo se basa en el principio del ELISA de captura y consta
de un ensayo de captura de IgG humana y un ensayo de
captura de IgM humana para la determinación de anticuerpos
IgG e IgM producidos intratecalmente contra B. burgdorferi,
respectivamente. A continuación, se describe detalladamente el
ensayo de captura de IgG humana:
La comparación de los valores DO de muestras emparejadas de
suero y LCR analizadas en paralelo hace posible determinar si se
han producido o no anticuerpos específicos contra B. burgdorferi
intratecalmente. La fórmula para el cálculo de los resultados del
ensayo se ha diseñado de tal forma que tiene en cuenta cualquier
variación intraensayo al comparar las diferencias en el valor de
DO de las muestras emparejadas de LCR y de suero.8
El exceso de conjugado de flagelo se elimina mediante lavado.
La cantidad de conjugado de flagelo unido por micropocillo se
visualiza mediante la adición de un sustrato cromogénico, que
desarrolla un color azul. Esta reacción se interrumpe mediante la
adición de ácido, que vira el color azul a amarillo. La intensidad
del color se corresponde con la concentración de IgG específica
contra B. burgdorferi capturadas en la fase sólida.
En consecuencia, en el caso de la neuroborreliosis, se obtiene un
valor de DO significativamente mayor en el LCR en comparación
con el valor de DO obtenido en la muestra de suero. En tales
casos, el valor de DO del LCR menos el valor de DO del suero es,
por tanto, >0.
Número de catálogo
Instrucciones de uso
Contenido suficiente para <N> ensayos
Fabricante
Producto sanitario para diagnóstico in vitro
1mL de complejo de peroxidasa: estreptavidina
conjugada con peroxidasa en tampón que
contiene proteínas de transporte y antibiótico.
12mL de sustrato: peróxido estabilizado y
3,3’-5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) en una
solución tampón diluida. Se ha informado de
que la TMB no es carcinogénica. No obstante,
se recomienda utilizar equipo protector
personal a fin de evitar la exposición directa
a esta sustancia.
Fecha de caducidad
Código de lote
25mL de solución de interrupción: ácido
sulfúrico 0,46mol/L.
Límite de temperatura
Añade agua
5. REACTIVOS SUMINISTRADOS
96 - Cada kit contiene materiales suficientes para 96
- La vida útil del kit es la indicada en la
determinaciones.
etiqueta exterior del envase.
5.1.
CONTENIDO DEL ENSAYO IDEIA LYME NEUROBORRELIOSIS
Un folleto con las instrucciones de uso.
48 micropocillos (6 tiras de 8 micropocillos)
recubiertos de anti-IgG humana (código
de color verde) y 48 micropocillos (6 tiras
de 8 micropocillos) recubiertos de antiIgM humana (código de color amarillo). Se
suministra también una bolsa de plástico
resellable para el almacenamiento de los
micropocillos no utilizados.
El ensayo de captura de IgM humana es similar al del ensayo
de captura de IgG humana, excepto que los micropocillos están
recubiertos con un anticuerpo de captura anti-IgM humana.
Normalmente, las concentraciones totales de IgG e IgM en el LCR
son muy bajas comparadas con los niveles presentes en suero. Por
ello, cuando la producción intratecal de anticuerpos específicos
contra B. burgdorferi tiene lugar, la cantidad de anticuerpos IgG
o IgM específicos en el LCR constituye una proporción mucho
mayor de la cantidad total de IgG e IgM, respectivamente, que las
proporciones presentes en suero. Si no hay producción intratecal
de anticuerpos específicos, o si los anticuerpos específicos
presentes en el LCR se deben a una contaminación sanguínea o
trasudación del suero, el valor de DO del LCR menos el valor de
DO del suero es ≤0.
Conjugado de flagelo liofilizado: flagelo
biotinado de B. afzelii que debe reconstituirse
con tampón de reconstitución, y formar
complejo con estreptavidina conjugada con
peroxidasa, antes de su uso.
12,5mL de tampón de reconstitución: solución
tamponada con antibiótico y de color azul.
4. DEFINICIONES
En la información del producto se han utilizado los siguientes
símbolos.
N
1,5mL de control positivo de IgM: suero
humano en tampón con antibiótico y de color
amarillo.
Gracias a la inmunocaptura selectiva de anticuerpos IgG e IgM,
no se produce interferencia competitiva por parte de otras clases
de inmunoglobulinas. Además, el uso del antígeno conjugado del
ensayo evita la interferencia del factor reumatoide (FR).
Se añaden muestras emparejadas de LCR y suero a micropocillos
recubiertos de anticuerpo específico contra IgG humana. La
dilución del LCR y el suero asegura que el anticuerpo de captura
anti-IgG humana se sature con IgG de LCR o sérica. Por ello, en
los micropocillos se captura la misma cantidad de IgG total de
LCR o de suero.
Tras el lavado de los micropocillos para eliminar el exceso de
proteína, se añade a los micropocillos flagelo nativo biotinado de
Borrelia en forma de complejo con estreptavidina conjugada con
peroxidasa (conjugado de flagelo). El conjugado de flagelo se une
exclusivamente a IgG específica contra B. burgdorferi, mientras
que la IgG no específica de B. burgdorferi no se une al conjugado
de flagelo.
Un frasco de cada uno de los siguientes reactivos:
100mL de diluyente de muestras: solución
tamponada con detergente, antibiótico y tinte
de color rojo.
50mL de tampón de lavado concentrado
25x: solución tamponada con detergente y
antibiótico.
1,5mL de control positivo de IgG: suero
humano en tampón con antibiótico y tinte de
color verde.
5.2.
PREPARACIÓN, ALMACENAMIENTO Y REUTILIZACIÓN DE
LOS COMPONENTES DEL KIT
El formato del kit IDEIA Lyme Neuroborreliosis permite realizar
hasta 6 ensayos individuales durante cualquier período de 3
meses dentro del plazo máximo establecido por la fecha de
caducidad indicada en la etiqueta del kit. A fin de asegurar la
eficacia óptima del kit, es importante que los componentes sin
usar del kit se preparen y almacenen con arreglo a las siguientes
instrucciones:
5.2.1
Micropocillos -
Abra la bolsa que contiene la placa cortando a lo largo del
cierre. Separe el número requerido de tiras de anti-IgG
humana (código de color verde) y de tiras de anti-IgM humana
(código de color amarillo) y reubíquelos en el armazón. Una
tira permite la determinación doble del LCR y del suero de un
paciente; los cuatro micropocillos restantes de la tira se utilizan
para los controles positivos y de tampón. Cada tira de IgG y de
IgM adicional permite analizar muestras emparejadas de dos
pacientes. Cuando se utiliza el armazón completo de 6 tiras de IgG
y 6 tiras de IgM simultáneamente, pueden analizarse las muestras
de LCR y de suero de 11 pacientes a fin de determinar la presencia
de anticuerpos IgG e IgM.
Coloque los micropocillos sin usar en la bolsa de plástico resellable
con el desecante, vuelva a sellar la bolsa cuidadosamente y
almacene a 2-8°C. Los micropocillos pueden utilizarse durante
un máximo de 12 semanas tras abrir la bolsa por primera vez,
siempre que se almacenen de esta manera.
5.2.2
Diluyente de muestras -
Listo para su uso. Almacene el diluyente de muestras sin usar a
una temperatura de 2 a 8°C.
5.2.3
Concentrado de tampón de lavado -
Se suministra en una concentración 25x. Prepare el tampón
de lavado a concentración de trabajo añadiendo 1 parte de
concentrado de tampón de lavado a 24 partes de agua desionizada
o destilada fresca (o añada el contenido del concentrado de
tampón de lavado a 1200mL de agua desionizada o destilada
fresca). Prepare el tampón de lavado a la concentración de
trabajo requerida en el día en que vaya a utilizarlo. Almacene el
concentrado sin usar a una temeratura de 2-8°C.
No almacene el tampón de lavado a la concentración de trabajo
requerida que no haya sido utilizado para usarlo posteriormente
(véase la Sección 8.2.11).
5.2.4
Control positivo de IgG -
Listo para su uso. Almacene el control positivo de IgG sin usar a
una temperatura de 2 a 8°C.
5.2.5
Control positivo de IgM -
Listo para su uso. Almacene el control positivo de IgM sin usar a
una temperatura de 2 a 8°C.
5.2.6
Conjugado de flagelo, peroxidasa y tampón de
/
/
reconstitución -
Reconstituya el conjugado de flagelo biotinado, liofilizado de
Borrelia con el contenido del tampón de reconstitución y añada
650µL de complejo de peroxidasa. Mezcle el contenido por
inversión. El conjugado de flagelo reconstituido debe prepararse
al menos 1 hora antes de su uso. El conjugado reconstituido de
flagelo debe almacenarse a 2-8°C y utilizarse dentro de un plazo
de 3 meses.
5.2.7
Sustrato -
Listo para su uso. Almacene el sustrato sin usar a una temperatura
de 2-8°C.
5.2.8
Solución de interrupción -
Lista para su uso. Almacene la solución de interrupción sin usar a
una temperatura de 2-8°C.
6. REACTIVOS ADICIONALES
6.1. REACTIVOS
Agua desionizada o destilada fresca.
7. EQUIPO
Necesitará el siguiente equipo:
Cilindro de medición (2L)
Tubos de ensayo con una capacidad aproximada de 5mL
Micropipetas de precisión y puntas desechables capaces de
administrar volúmenes de 10-1000µL
Pipeta de 8 canales capaz de administrar 100µL (opcional)
Depósitos de reactivo para la pipeta de 8 canales (opcional)
Papel absorbente limpio (sobre el que se pueda golpear
suavemente los micropocillos para secarlos)
Tapa de plástico para la placa de micropocillos
Agitador de placas de microtitulación capaz de alcanzar una
velocidad mínima de 500 rpm, con un diámetro orbital de 3-4
mm. Para información sobre agitadores de placas adecuados,
contacte con la distribuidor local.
Cronómetro
Lavador de placas automático (opcional) o equipo adecuado para
lavar tiras de 8 micropocillos (Sección 10.2.3).
Nota: si va a lavar menos de 8 micropocillos de ensayo de una
tira utilizando un lavador automático con un cabezal para 8
micropocillos, es importante que llene por completo la tira con
micropocillos vacíos.
Espectrofotómetro o lector de placas de inmunoensayo
enzimático (IEE) capaz de leer una placa de 96 micropocillos con
tiras de 8 micropocillos a una absorbancia de 450nm con una
referencia a 620-650nm. (Opcional, Sección 10.3, Lectura de los
resultados del ensayo).
Puede obtener notas de aplicación para el uso de este ensayo con
sistemas automáticos abiertos contactando con la distribuidor
local.
8. PRECAUCIONES
- Para uso diagnóstico in vitro. Cualquier persona que lleve
a cabo un ensayo con este producto debe recibir formación para
su uso y tener experiencia en los procedimientos de laboratorio.
8.1. PRECAUCIONES DE SEGURIDAD
8.1.1
Cada uno de los sueros de donantes utilizados para la
preparación de los controles positivos ha sido analizado
por separado, comprobándose que da negativo a la
presencia del an¬tígeno de superficie del virus de la
hepatitis B y a la presencia de anticuerpos contra el VIH
y el virus de la hepatitis C.
8.1.2
La solución de interrupción contiene ácido sulfúrico
(0,46mol/L). Evite el contacto con los ojos y con la piel
llevando puestas ropa protectora y protección ocular.
8.1.3
No se aplique cosméticos, no fume, no beba ni coma,
ni almacene o prepare alimentos dentro del área de
trabajo designada.
8.1.4
No pipetee los materiales con la boca.
8.1.5
Lleve puestos guantes desechables cuando manipule
muestras clínicas, y lávese siempre las manos después
de trabajar con materiales infecciosos.
8.1.6
Deseche todas las muestras clínicas con arreglo a la
legislación local.
8.1.7
Los usuarios profesionales pueden solicitar a Oxoid una
“hoja de datos sobre seguridad”.
8.1.8
Este producto contiene NMP, así que ha sido clasificado
como tóxico.
R61
Riesgo durante el embarazo de
efectos adversos para el feto.
8.2. 8.2 PRECAUCIONES TÉCNICAS
8.2.1
No utilice los componentes más allá de la fecha de
caducidad impresa en las etiquetas. No mezcle ni
intercambie lotes de reactivos diferentes, con la
excepción de los reactivos estándar (diluyente de
muestras, concentrado de tampón de lavado, sustrato
y solución de interrupción) que se utilizan también
en el ensayo IDEIA Borrelia burgdorferi, IgG (número
de catálogo K602911-2) y en el ensayo IDEIA Borrelia
burgdorferi, IgM (número de catálogo K603011-2).
8.2.2
Los reactivos se suministran en concentraciones
de trabajo fijas. Si se modifican los reactivos, o si
se almacenan bajo condiciones diferentes a las
especificadas en la Sección 5.2, la eficacia del ensayo se
verá afectada.
Evite la contaminación de los reactivos.
Utilice pipetas desechables o puntas de pipeta separadas
para cada muestra, control o reactivo a fin de evitar la
contaminación cruzada de las muestras o los controles,
que podría generar resultados erróneos.
8.2.5
Evite la contaminación con iones metálicos y agentes
oxidantes.
8.2.6
Almacene el agua desionizada o destilada para la
dilución de los reactivos concentrados en contenedores
limpios, a fin de evitar la contaminación microbiana.
8.2.7
No utilice sustrato que muestre un color azul antes de su
adición a los micropocillos.
8.2.8
Proteja el sustrato de la luz.
8.2.9
Los micropocillos no pueden reutilizarse.
8.2.10 El equipo de lavado manual o automático debe estar
libre de contaminación microbiana, estar calibrado
correctamente y mantenerse con arreglo a las
instrucciones del fabricante.
8.2.11 No almacene el tampón de lavado a la concentración
de trabajo requerida que no haya sido utilizado para
usarlo posteriormente. Cuando no se los utilice, los
reservorios de tampón de lavado deben lavarse con
agua desionizada o destilada y dejarse a secar.
9. RECOGIDA Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
9.1. RECOGIDA DE MUESTRAS
El kit IDEIA Lyme Neuroborreliosis está indicado para analizar
simultáneamente muestras emparejadas de LCR y de suero
humanas. Las muestras emparejadas de LCR y suero deben
obtenerse simultáneamente del paciente. Si bien se necesita un
mínimo de 0,5mL de LCR, es mejor obtener 1-2mL de LCR, puesto
que esto permite repetir el ensayo o la ejecución del ensayo con
una dilución menor de LCR. En cuanto al suero, basta con 0,5mL.
el análisis simultáneo por duplicado de todas las
muestras. Si las muestras del paciente o pacientes
deben analizarse una única vez, se recomienda que
los usuarios lleven a cabo tal ensayo o ensayos sólo
después de haberse familiarizado con las características
de ejecución del ensayo. La variación intraensayo (CV%)
es aproximadamente un 50% más alta cuando se basa
en una sola determinación.
10.1.3 Si no se dispone de un agitador capaz de alcanzar una
velocidad de 500rpm, la velocidad de agitación de las
tiras de micropocillos durante los 2 pasos de incubación
puede reducirse a 300rpm sin que esto afecte
negativamente a la ejecución del ensayo; también existe
un protocolo de incubación estática, que puede obtener
contactando con la distribuidor local, que le aconsejarán
sobre el protocolo más adecuado.
10.2. PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
NOTA: el procedimiento del ensayo requiere el uso de un agitador
de placas de microtitulación. Para información sobre agitadores
adecuados, contacte con la distribuidor local.
El análisis de muestras túrbidas y viscosas puede conducir a
resultados no fiables a causa de errores al pipetear.
10.2.2 Incubación de las muestras
8.2.3
8.2.4
Las muestras emparejadas de LCR y de suero pueden almacenarse
durante 14 días a 2-8°C antes de su ensayo, y durante al menos 6
meses a una temperatura de –20°C o menos.
9.2. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
Diluya las muestras de LCR al 1+4 añadiendo 100 µL de LCR a
400µL de diluyente de muestras.
Diluya las muestras de suero al 1+200 añadiendo 10µL de suero a
2mL de diluyente de muestras.
10. PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
Consulte la Sección 8.2, Precauciones técnicas, antes de llevar a
cabo el procedimiento del ensayo.
10.1. NOTAS SOBRE EL PROCEDIMIENTO
10.1.1 Los reactivos estándar (diluyente de muestras,
concentrado de tampón de lavado, sustrato y solución
de interrupción), y un procedimiento de ensayo
similar, se utilizan también en el ensayo IDEIA Borrelia
burgdorferi IgG (número de catálogo K602911-2) y en
el ensayo IDEIA Borrelia burgdorferi IgM (número de
catálogo K603011-2). Esto ofrece la posibilidad de llevar
a cabo cada uno de los ensayos en paralelo utilizando
una única dilución de suero del paciente.
10.1.2 La validación de la ejecución del ensayo se basa en
Si se utilizan varias tiras, se recomienda utilizar una pipeta de
8 canales para añadir el conjugado, el sustrato y la solución de
interrupción.
10.2.1 Adición de las muestras y de los controles
Coloque el número requerido de micropocillos en el soporte para
micropocillos. Añada 100µL de LCR y suero diluidos del paciente
a micropocillos duplicados de los micropocillos de la tira verde de
anti-IgG y de la tira amarilla de anti-IgM. Añada 100µL de control
positivo de IgG a dos micropocillos anti-IgG y 100µL del control
positivo de IgM a dos micropocillos anti-IgM. Añada diluyente de
muestras a los micropocillos de IgG y de IgM por separado. (Debe
incluirse al menos 1 micropocillo con diluyente de muestras, con
cada lote de muestras a analizar).
Cubra los micropocillos e incúbelos en un agitador a temperatura
ambiente (20-25°C) con agitación durante 60 minutos.
10.2.3 Lavado de los micropocillos
Los micropocillos deben lavarse utilizando tampón de lavado a
concentración de trabajo (consulte la Sección 5.2.3).
La técnica de lavado es crucial para la ejecución del ensayo
(consulte la Sección 8.2.10) y debe llevarse a cabo asegurando el
completo llenado (con un mínimo de 350µL de tampón de lavado
a concentración de trabajo) y vaciado de los micropocillos.
Es esencial realizar cuatro ciclos de lavado, mediante técnicas
automáticas o manuales, que deben incluir un período de
empapado de 2 minutos durante el segundo lavado o un período
total de empapado de 2 minutos durante el ciclo completo.
Lavado manual
Si lava los micropocillos manualmente, aspire o elimine por
agitación el contenido de los micropocillos y, usando tampón
de lavado fresco, asegure el completo llenado y vaciado de los
micropocillos. Entre cada paso de lavado, elimine todo el tampón
de lavado restante golpeando suavemente los micropocillos
colocados boca abajo sobre papel absorbente limpio. La eficiencia
del lavado manual se asegura aún más si el tampón de lavado
se administra con una inclinación que produzca un vórtice en los
micropocillos. Tras el lavado final, coloque la placa boca abajo y
golpéela suavemente sobre papel absorbente a fin de eliminar los
últimos restos de tampón de lavado.
DOLCR
Índice = x (DOLCR - DOsuero)
DOsuero
11.4. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
11.4.1 Interpretación cualitativa
Lavado automático
Los lavadores automáticos deben programarse para que realicen
4 ciclos de lavado e incorporen el equivalente a 2 minutos de
tiempo de empapado durante el ciclo completo de lavado. Los
lavadores deben calibrarse correctamente para asegurar un
completo llenado y vaciado de los micropocillos entre un lavado
y otro. Tras el lavado final, coloque la placa boca abajo y golpéela
suavemente sobre papel absorbente a fin de eliminar los últimos
restos de tampón de lavado.
Interprete de la siguiente manera:
Negativo para la producción intratecal de anticuerpos IgG contra
B. burgdorferi:
IIgG <0,3
o
DOLCR <0,150
Positivo para la producción intratecal de anticuerpos IgG contra
B. burgdorferi:
10.2.4 Adición del conjugado
Mezcle el conjugado de flagelo por inversión. Añada 100µL de
conjugado de flagelo a cada micropocillo.
10.2.5 Incubación del conjugado
Cubra los micropocillos e incúbelos en un agitador a temperatura
ambiente (20-25°C) con agitación durante 60 minutos.
10.2.6 Lavado de los micropocillos
Lave los micropocillos de la manera descrita en 10.2.3.
10.2.7 Adición e incubación del sustrato
Añada 100µL de sustrato a cada micropocillo.
Cubra los micropocillos e incúbelos a temperatura ambiente
(20-25°C) sin agitación durante 10 minutos.
10.2.8 Interrupción de la reacción
11. CONTROL DE CALIDAD E INTERPRETACIÓN DE LOS
RESULTADOS
11.1. CONTROL DE TAMPÓN
Calcule los valores de DO (densidad óptica) promedio de los dos
micropocillos de control de tampón.
El valor de DO promedio del control de tampón debe ser inferior
a 0,100, pero superior a 0,000 (lectura a doble longitud de onda).
Si el valor es superior a 0,100, la causa puede ser un lavado
inadecuado o una contaminación del sustrato. Si el valor es
inferior a 0,000, vuelva a calibrar a cero el lector de ELISA sobre
aire y luego vuelva a leer los micropocillos.
Si los requisitos de control de calidad no se cumplen, los
resultados del ensayo no son válidos y debe repetirse el ensayo.
Añada 100µL de solución de interrupción a cada micropocillo.
Asegure una mezcla homogénea en los micropocillos. El producto
coloreado es estable durante 30 minutos. No lo exponga a
la luz solar directa; de lo contrario, podría producirse una
fotodecoloración del producto coloreado.
11.2. CONTROL POSITIVO DE IgG Y CONTROL POSITIVO DE IgM
Calcule los valores de DO promedio del control positivo de IgG
y del control positivo de IgM. Los valores individuales de DO del
ensayo por duplicado no deben diferir en más de un 15% del valor
de DO promedio.
10.3. LECTURA DE LOS RESULTADOS DEL ENSAYO
10.3.1 Lectura fotométrica
El valor de DO promedio del control positivo de IgG y del control
positivo de IgM deben ser al menos de 0,500, respectivamente. Si
estos valores son inferiores a 0,500, la causa puede ser un lavado
inadecuado, una agitación inadecuada durante las incubaciones,
o una temperatura ambiente baja, especialmente durante la
incubación con la solución de sustrato.
Los micropocillos deben leerse fotométricamente dentro de un
plazo de 30 minutos tras la adición de la solución de interrupción.
Mezcle el contenido de los micropocillos y lea la absorbancia
de cada micropocillo usando un espectrofotómetro o lector de
placas de inmunoensayo enzimático (IEE) adecuado ajustado a
450nm. Asegúrese de que la parte inferior de los micropocillos
está limpia antes de leerlos y compruebe que no haya material
extraño presente en los micropocillos. El lector debe calibrarse a
cero sobre aire (es decir, sin placa en la platina) antes de escanear
la placa.
Como alternativa, si el espectrofotómetro o el lector de placas de
inmunoensayo enzimático (IEE) permite el uso de una longitud
de onda de referencia (620 a 650nm), debe realizarse una lectura
a doble longitud de onda, ya que elimina cualquier posible
interferencia causadas por aberraciones, tales como suciedad o
marcas, presentes en la superficie óptica de los micropocillos.
10.4. RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO IDEIA LYME
NEUROBORRELIOSIS
Si los requisitos de control de calidad no se cumplen, los
resultados del ensayo no son válidos y debe repetirse el ensayo.
11.3. MUESTRAS DE LOS PACIENTES
Calcule el valor de DO promedio de cada muestra de LCR (DOLCR)
y de suero (DOsuero) del paciente para la determinación de IgG y
de IgM. Los valores de DO no deben diferir en más de un 15%
del valor de DO promedio. Debe volver a ensayarse cualquier
muestra que no cumpla esta condición. No obstante, si ambos
micropocillos de ensayo muestran un resultado negativo, puede
aceptarse una diferencia de más de un 15% sin tener que repetir
el ensayo, ya que los valores de DO bajos se miden con menor
precisión.
A continuación, se muestra la fórmula del índice de anticuerpos
específicos. Calcule el índice de anticuerpos específicos IgG (IIgG) e
IgM (IIgM), respectivamente. El cálculo del índice no debe llevarse
a cabo si el valor de DO promedio de la determinación de LCR es
inferior a 0,150. Cualquier resultado de tales características debe
describirse como negativo.
IIgG ≥0,3
Negativo para la producción intratecal de anticuerpos IgM contra
B. burgdorferi:
IIgM <0,3
o
DOLCR <0,150
Positivo para la producción intratecal de anticuerpos IgM contra
B. burgdorferi:
IIgM ≥0,3
11.4.2 Interpretación semicuantitativa
Cuanto mayor es el índice obtenido, más pronunciada es la
producción intratecal de anticuerpos específicos. Los valores del
índice pueden ser de 100 o incluso superiores.
El índice de anticuerpos específicos es una medición
semicuantitativa altamente sensible de la producción intratecal
de anticuerpos porque depende de la tasa de producción
intratecal de anticuerpos, de la permeabilidad de la barrera
hematoencefálica y del nivel de anticuerpos específicos en suero.
Por lo tanto, en las muestras consiguientes obtenidas después del
tratamiento, un cambio sólo debe considerarse significativo si un
índice positivo es <0,3, o si se reduce o aumenta más de 5 veces.
Éstas son sólo pautas.
11.4.3 Comentarios acerca de la interpretación de los
resultados
Expresión de los resultados
Teóricamente, existe producción intratecal de anticuerpos si
DOLCR/DOSuero >1. No obstante, esta suposición no es segura,
debido a la variación intraensayo, especialmente en el intervalo
más bajo de DO. La diferencia neta de DO (DOLCR - DOSuero) ofrece
información más precisa, pero, debido a la variación intraensayo,
la diferencia mínima de DO indicativa de síntesis intratecal de
anticuerpos aumenta cuanto más aumentan los valores de DO.
Estas dificultades se eliminan multiplicando la proporción de DO
por la diferencia de DO, como expresa el índice de anticuerpos
específicos (I). El límite inferior del valor del índice, establecido
en 0,3 para un resultado positivo, asegura que la DOLCR es
significativamente mayor que la DOSuero 8.
Resultados positivos
Un índice de IgG y/o de IgM ≥0,3 con una pleocitosis mononuclear
concomitante en el LCR es altamente indicativa de una
neuroborreliosis de Lyme. (Un valor alto de DO del LCR no es
indicativo por sí mismo de producción intratecal de anticuerpos).
Un índice de IgM ≥0,3 es habitualmente compatible con una
duración de la enfermedad inferior a 6 meses. La síntesis intratecal
de IgM específica es una sólida indicación de neuroborreliosis,
pero la IgM no es un hallazgo obligatorio. Habitualmente, los
pacientes con neuroborreliosis activa de más de 6 meses de
duración presentan sólo síntesis intratecal de IgG específica, y se
detecta un índice de IgG ≥0,3.
Resultados negativos
Un resultado negativo, es decir, un índice de IgG y de IgM <0,3,
con pleocitosis mononuclear concomitante en el LCR, no excluye
el diagnóstico clínico de neuroborreliosis de Lyme. Esto es
especialmente aplicable cuando el tiempo transcurrido entre la
aparición de síntomas neurológicos y la recogida de muestras de
suero y de LCR es corto.
En la mayoría de los pacientes no tratados con signos clínicos
definidos de neuroborreliosis, los anticuerpos específicos en el
LCR se hacen detectables en la segunda semana tras la aparición
de los síntomas neurológicos8. En los pacientes que presentan
neuroborreliosis temprana y un resultado negativo en el ensayo,
a menudo una muestra recogida más tarde da resultado positivo,
incluso tras la instauración de tratamiento.
Un índice de IgM <0,3 no siempre excluye la síntesis intratecal
de IgM específica. El hallazgo de un valor de DO de IgM elevado
(≥1,0) en el LCR que sea igual o incluso inferior al valor de DO
de IgM correspondiente en suero puede ser todavía indicativo de
síntesis intratecal de anticuerpos si puede excluirse una alteración
importante de la barrera hematoencefálica8.
Muestras después del tratamiento
Evaluación de muestras de LCR/suero consecutivas después del
tratamiento: tras el tratamiento apropiado con antibióticos, el
índice de IgM específica disminuye, y transcurridos 6-9 meses, el
índice es habitualmente <0,3. A menudo, persiste durante años
un índice de IgG elevado pese a una recuperación completa.
Un índice de IgG ≥0,3 sin pleocitosis mononuclear concomitante
en el LCR es un hallazgo raro, excepto en las muestras después
del tratamiento. Por ello, este hallazgo puede indicar un episodio
previo de neuroborreliosis.
12. LIMITACIONES DE LA EFICACIA
12.1. Una excesiva contaminación con sangre en la muestra de
LCR puede conducir a índices de anticuerpos específicos
falsamente bajos.
12.2. Debido a la relación antigénica entre B. burgdorferi y
Treponema pallidum, pueden producirse reacciones
cruzadas serológicas, aunque escasas, en pacientes
con un historial reciente o pasado de neurosífilis. La
discriminación serológica es posible utilizando el ensayo
de hemaglutinación de T. pallidum (TPHA) o los ensayos de
cardiolipina no treponémicos: VDRL, prueba de la reagina
plasmática rápida (RPR), y reacción de Wassermann. Estas
pruebas dan negativo en pacientes infectados sólo por
B. burgdorferi.
12.3. Un tratamiento previo con antibióticos puede frenar la
respuesta con anticuerpos y, por ello, hacer los hallazgos
serológicos menos predecibles.
12.4. La recogida de muestras pronto durante el transcurso de
la enfermedad puede conducir a resultados negativos en
el ensayo (consulte la Sección 11).
12.5. Si se modifican los reactivos, o si se almacenan bajo
condiciones diferentes a las especificadas en la Sección
5.2, la eficacia del ensayo se verá afectada negativamente.
12.6. Los resultados del ensayo deben interpretarse en
conjunción con la información obtenida mediante estudios
epidemiológicos, la evaluación clínica del paciente y otros
procedimientos diagnósticos.
2.
Steere AC, Grodzicki RL, Kornblatt AN, Craft JE, Barbour AG,
Burgdorferi W, et al. (1983)
3.
The spirochetal etiology of Lyme disease.
N Engl J Med 308: 733-40.
Hansen K. (1994)
En pacientes con neuroborreliosis, la síntesis intratecal de
anticuerpos comienza habitualmente durante la segunda semana
tras la aparición de los síntomas neurológicos. La producción
de IgG y/o de IgM específicas es detectable, en el ≈ 80% de los
pacientes con neuroborreliosis definida, en el inicio de la tercera
semana, y en todos los pacientes 6-8 semanas tras la aparición de
los síntomas neurológicos.8
4.
Lyme neuroborreliosis: Improvements of the laboratory diagnosis and a
survey of epidemiological and clinical features in Denmark 1985 - 1990.
Acta Neurol Scand (suppl. 151); 89: 1-44.
Kristoferitsch W. (1989)
5.
Neuropathien bei Lyme borreliosis.
Vienna: Springer Verlag.
Pachner AR, Steere AC. (1985)
La ausencia de producción intratecal de anticuerpos o la presencia
de anticuerpos específicos en el LCR a causa de la trasudación
de suero o a la contaminación sanguínea del LCR da índices de
anticuerpos ≤0.
The triad of neurologic manifestations of Lyme disease: meningitis,
cranial neuritis, and radiculoneuritis.
Neurology; 35: 47-53.
Stiernstedt GT, Granström M, Hederstedt B, Sköldenberg B. (1985)
13. VALORES ESPERADOS
Un índice de anticuerpos específicos ≥ 0,3 indica siempre síntesis
intratecal de anticuerpos específicos.
14. CARACTERÍSTICAS DE EFICACIA ESPECÍFICAS
Se probaron con el ensayo IDEIA Lyme Neuroborreliosis
muestras emparejadas de LCR y de suero de 25 pacientes con
neuroborreliosis de Lyme temprana clínicamente definida.
IDEIA Lyme Neuroborreliosis
Positivo a la presencia de anticuerpos
IgG producidos intratecalmente
Negativo a la presencia de anticuerpos
IgG producidos intratecalmente
Positivo a la presencia de anticuerpos
IgM producidos intratecalmente
Negativo a la presencia de anticuerpos
IgM producidos intratecalmente
Positivo a la presencia de anticuerpos IgG
y/o IgM producidos intratecalmente
Negativo a la presencia de anticuerpos IgG
e IgM producidos intratecalmente
Número de
pacientes
18
6.
7.
8.
7
12
9.
13
19
6
Se halló un índice de anticuerpos específicos ≥0,3 del tipo IgG en
el 72%, y del tipo IgM en el 48%, de los
25 pacientes con neuroborreliosis de Lyme temprana. Sólo
un paciente presentó síntesis de IgM específica sin síntesis
concomitante de IgG. No obstante, algunos pacientes con
índices de IgG bajos mostraron índices de IgM ≥0,3. Por ello, las
evidencias diagnósticas aumentan examinando tanto la síntesis
de IgG específica como la síntesis de IgM específica. 19 de los
25 pacientes (76%) con neuroborreliosis de Lyme temprana se
identificaron con el ensayo IDEIA Lyme Neuroborreliosis.
14.1. REACTIVIDAD CRUZADA
Un resultado positivo siempre indica síntesis intratecal de
anticuerpos contra B. burgdorferi, excepto cuando se analizan
muestras de pacientes con neurosífilis. Las muestras de estos
pacientes pueden dar resultados falsos positivos. No obstante,
el índice de anticuerpos específicos contra B. burgdorferi
permanece habitualmente bajo. Además, un hallazgo uniforme
es que tanto los anticuerpos de LCR como los anticuerpos séricos
que producen reacciones cruzadas pertenecen a la clase IgG3.
El significado de la activación de células B policlonales intratecales
como causa de "falsos positivos" de IgM es desconocido3 .
15. REFERENCIAS
1.
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improves serodiagnosis in Lyme disease.
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synthesis of Borrelia burgdorferi-specific immunoglobulin G, A, and M.
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Antigens of Borrelia burgdorferi recognized during Lyme disease.
Appearance of a new immunoglobulin M response and expansion of
the immunoglobulin G response late in the illness.
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10. Karlsson M, Möllegard I, Stiernstedt G, Henriksson M, Wretlind B.
(1988)
Characterization of antibody response in patients with Borrelia
meningitis.
Serodiagn Immunother Infect Dis; 2: 375-86.
11. Wilske B, Schierz G, Preac-Mursic V, von Busch K, Kühbeck R, Pfister
HW, et al. (1986)
Intrathecal production of specific antibodies against Borrelia burgdorferi
in patients with lymphotic meningoradiculitis (Bannwarth’s syndrome).
J Infect Dis; 153: 304-14.
12. Hansen K, Cruz M, Link H. (1990)
Oligoclonal Borrelia burgdorferi-specific IgG antibodies in cerebrospinal
fluid in Lyme neuroborreliosis.
J Infect Dis; 161: 1194-202.
13. Karlsson M. (1990)
Western immunoblot and flagellum enzyme-linked immunosorbent
assay for serodiagnosis of Lyme borreliosis.
J Clin Microbiol 28: 2148-50.
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