Esperma y oviducto: anandamida

Participación de la anandamida en la interacción
espermatozoide oviducto en mamíferos.
Silvina Perez Martinez- Laboratorio de Fisiología de las Gametas
CEFYBO (CONICET_UBA)
Octubre 2007
¿Que necesita un espermatozoide (ESP) para fertilizar a un ovocito?
MADURACIÓN
CAPACITACIÓN
Epidídimo
Tracto reproductor
de la hembra
Proceso de Fertilización
Fertilización
Tránsito de los ESP a través del tracto de la hembra
Tránsito de los ESP a través del tracto de la hembra
Los ESP están sujetos a stress físico durante la eyaculación y
contracciones del tracto reproductor de la hembra y pueden sufrir
daños oxidativos.
„
ƒ Existen distintas estrategias para eludir al sistema inmune en las
diferentes especies de mamíferos
Millones de ESP son inseminados durante la cópula en mamíferos,
solamente unos pocos alcanzan las Trompas de Fallopio u oviducto y
UNO solo es el que fertiliza a un ovocito
„
Transporte de los ESP a través del oviducto-Fertilización
Interacción espermatozoides-oviducto
Para que el espermatozoide (ESP) pueda fertilizar al ovocito es
necesario que haya atravesado una serie de eventos dentro del tracto
reproductor de la hembra que le otorguen la capacidad fertilizante.
„
En la mayoría de las especies de mamíferos, los ovocitos son
fertilizados en las horas cercanas a la ovulación
„
En algunas especies, los espermatozoides (ESP) inseminados esperan
días (equinos, ganado y cerdo) o meses (murciélagos) la llegada del
ovocito. En humanos, hay evidencias de que puede haber fertilización
aún cuando la cópula ocurrió 5 días antes de la ovulación (Wilcox
1995).
„
La adhesión de los espermatozoides a las Trompas de Fallopio u
oviducto es beneficiosa para aumentar su vida media y seleccionar
aquellos con alta calidad.
„
El oviducto es un sitio crítico para seleccionar a los espermatozoides
no capacitados con acrosoma intacto, morfología superior y estructura
normal de la cromatina
„
Interacción espermatozoides-oviducto
Oviducto: Reservorio de espermatozoides
Se produce por la unión de los ESP al epitelio oviductal. Los ESP
mótiles se unen a la superficie apical de las células oviductales
„
„
El oviducto como sitio de almacenamiento de ESP tiene 3 funciones:
1. Previene la polispermia
2. Garantiza la fertilidad del ESP entre el comienzo
del estro y la ovulación.
3. Regula los procesos de capacitación (cambios
en membrana plasmática) e hiperactivación (cambios en la
motilidad) del ESP.
Unión de los espermatozoides al epitelio oviductal
„
La unión ESP-oviducto involucra reconocimiento de carbohidratos:
Fetuin/ác. siálico: el ESP posee moléculas tipo lectina que unen residuos de ácido
siálico
„ Fucoidan/fucosa: pretratamiento de oviducto con fucoidasa inhibe el pegado de los
ESP al oviducto
„
„
„
„
Bovinos: PDC-109 del ESP une fucosa y participa en pegado de ESP al
oviducto
Moléculas tipo selectinas también participan temporalmente en la unión
ESP-oviducto (similar adhesión leucocitos al endotelio)
La unión de los ESP al oviducto mantiene bajos niveles citoplasmáticos de
Ca2+ comparado con los ESP que nadan libremente. Evita capacitación
temprana.
Liberación de los espermatozoides del epitelio oviductal
„No
estaría afectada:
„Disminución
del nº de sitios de unión entre células
„Destrucción enzimática
„
Si estaría afectada:
„
„
Cambios involucrados en la membrana plasmática del ESP; modificación
o eliminación de moléculas (proteínas y colesterol) unidas a la cabeza del
ESP que preparan al mismo para sufrir la reacción acrosomal y
fertilización del ovocito.
Cambios en la motilidad del ESP que proporciona una fuerza tal que
permite vencer la atracción entre células.
Liberación de los espermatozoides del epitelio oviductal
ƒ
El epitelio oviductal podría liberar factores que alteran al ESP (ej:
glicosaminoglicanos sulfatados
ƒ Señales hormonales inducida por la ovulación
ƒ Señales moleculares del folículo preovulatorio
ƒ Señales moleculares provenientes del plasma seminal
Antecedentes Anandamida (AEA)
AEA es un endocanabinoide lipídico y es el primer agonista endógeno para
receptores cannabinoides que se descubrió
„
La AEA se sintetiza en la mayoría de las células a demanda, por la
hidrólisis del NAPE (precursor fosfolipídico de membrana).
„
Una vez generada dentro de la célula, la AEA se libera al espacio intersticial,
difunde o actúa en forma paracrina y/o autocrina.
„
La liberación de AEA es rápidamente eliminada por la acción de la enzima
FAAH ( hidrolasa de ácidos grasos)
„
Este endocannabinoide ejerce sus efectos a través de la activación de
receptores para cannabinoides específicos localizados en la superficie de las
células.
„
Receptores que unen cannabinoides/endocannabinoides
CB2
CB1
ƒ Ampliamente distribuido en SNC
y órganos periféricos
ƒ Ampliamente distribuido en
sistema inmune y órganos
periféricos
ƒAgonistas: AEA, MAEA, WIN55212
Antagonistas: SR141716, AM251
ƒAgonistas: AEA, MAEA, 2-AG
Antagonistas: SR144528, AM630
TRPV1
ƒ Pertenece a familia de receptores TRP:
transient receptor channels
ƒ Distribuido: SNC y periférico.
ƒ Se activa por: capsaicina, RTX, AEA, calor y ácido.
antagonista: capsazepina
Regulación de AEA
„
El efecto de la AEA depende :
1) la concentración en el espacio extracelular,
„ 2) la incorporación a la célula a través de un transportador específico
„ 3) la degradación intracelular por enzima FAAH
„
La actividad de FAAH está regulada por:
„
Esteroides sexuales
„
Citoquinas y prostaglandinas
AEA en Reproducción
Secreción hormonas
gonadotróficas
Ovulación
AEA
Desarrollo embrionario
Fertilización
Capacitación
Reacción acrosomal
Motilidad ESP
AEA en Reproducción
ƒ
Schuel 1987; Berdyshev 1999: los cannabinoides inhiben la fertilización en
Erizo de Mar.
ƒ
Shuel 2002: los fluidos reproductivos humanos, tales como plasma seminal,
fluido oviductal y fluido folicular, poseen AEA.
ƒ
Agonistas del receptor de AEA, tales como AM-365 y THC, inhiben tanto la
motilidad del espermatozoide, la reacción acrosomal y la unión a hemizonas
humanas.
ƒ
Rossato 2005 y Maccarrone 2005: los espermatozoides de mamíferos poseen
receptores funcionales para cannabinoides.
ƒ
Wang 2006 y col.: demostraron que existe un balance crítico entre la síntesis
de AEA mediado por la enzima NAPE-PLD (fosfolipasa D selectiva para N-acylfostatidil-etanolamina (NAPE)) y su degradación por la FAAH, tanto en embrión
como en oviducto de ratón, creando un tono apropiado de AEA para el normal
desarrollo embrionario, transporte oviductal, implantación y preñez.
Regulación del tono de AEA en el oviducto- Schuel H 2006
Resultados- Caracterización del sistema endocannabinoide
ESPERMATOZOIDES
OVIDUCTO
Resultados-Caracterización del sistema endocannabinoide
Resultados-Caracterización del sistema endocannabinoide
nmol AEA/h*mg Prot
4
3
2
1
0
Ampolla
Istmo
Co-cultivo de BOEC y ESP
Oviductos
Cultivo de
10-14 días
Lavados y fijación
Co-cultivo de 1h con
los ESP + agonistas
o antagonistas de
receptores para ECB
Observación
(nº de
/área ó % ESP
unidos
respecto al
control)
Co-cultivo de BOEC con ESP
Resultados- Curva de MAEA
120
100
*
80
*
**
60
40
20
% ESP unidos respecto al control
% ESP unidos respecto al control
120
100
**
80
**
60
40
20
0
0
Control
10-10
10-9
10-8
10-7
10-6
MAEA (M)
C
MAEA (1,4x10-9) AEA (10-9) (M)
EA
+A
M
M
A
EA
on
tro
l
60
40
20
0
EA
**
M
A
100
% ESP unidos respecto al control
120
C
on
tro
+A
l
M
M
M
63 AE
A
A
0
EA
(0
M
+A
,
1
A
um
M
EA
)
63
+A
0(
M
1u
63
m
0
)
(1
0
A
um
M
M
63
)
A
0
EA
(
1
+2
um
51
)
(1
um
)+
63
0(
25
1u
1m
63
)
0
(1
uM
)
M
A
80
25
1(
0,
1u
EA
m
)
+A
M
25
M
1(
A
EA
1u
m
+A
)
M
25
1
(1
0
um
)
AM
25
1
(1
um
)
M
A
C
%ESP unidos respecto al control
Resultados- Curva de Antagonistas de CB1 y CB2
AM251
AM630
120
100
80
60
**
#
40
20
0
*
1
SR
2
2
-7
-9
0
10
10
-7
-9
-1
0
10
10
10
2
SR
2
SR
SR
A+
2
-1
*
AE
SR
10
SR141716
M
A+
A
50
AE
2
0
60
M
10
AE
20
SR
30
A+
l
70
M
60
AE
40
ro
80
nº ESP unidos/0,11 m m 2
#
nt
10
-7
10
-9
70
M
1
1
-1
0
#
Co
SR
SR
11
0
50
SR
10
-1
0+
SR
M
A
1
EA
10
-9
+
SR
M
AE
11
A
07+
M
AE
A
SR
on
tro
l
M
A
EA
C
nº ESp unidos/0,11 mm2
Resultados- Curva de Antagonistas de CB1 y CB2
SR144528
*
40
30
20
10
0
Resultados- Curva de capsaicina (CPS), agonista específico de TRPV1
140
% ESP unidos respecto al control
120
100
*
#
80
*
*
#
60
40
20
0
Control
MAEA
CPS(10-9) CPS(10-8) CPS(10-7) CPS(10-6)
Tratamientos (M)
Ensayo de Preincubación
Drogas a
testear
+
A
15 min
Pre incubación
de ESP
PBS
3
Lavados
Drogas a
testear
1 hora de co-incubación de
ESP-CEO
B
+
15 min
Pre incubación
de CEO
3
Lavados
3 lavados
Fijar y Montar
Resultados-Preincubaciones de BOEC
% E S P u n id o s resp ecto al co n tro l
120
100
80
60
40
20
0
Control
MAEA (10-10)
(M)
MAEA (10-9)
Resultados-Preincubaciones de BOEC
% ESP unidos respecto al control
140
120
100
80
60
**
40
20
0
Control
MAEA
(10-10)
MAEA
SR1+MAEA
-9
(10 )
(10-9)
Tratam ientos (M)
Ensayo liberación de ESP
Drogas a
testear
PBS
Fijar
P3
3 lavados
1 Hora
de co-incubación
ESP-CEO
15 min de
Co-incubacion
con drogas
3 lavados
Fijar y montar
P2
a
(1
08
(1
09
M
)
)
M
SR
1+
CZ
P
ab
et
-A
EA
+C
M
ZP
et
-A
(1
EA
07M
+S
)
R
1
(1
0M
10
et
-A
M
EA
)
+C
ZP
+S
R1
sa
ic
in
et
-A
EA
Co
nt
ro
l
40
M
Ca
p
M
nº espermatozoides unidos/0,11 mm
2
Resultados- Efecto MAEA en la liberación de ESP
80
70
60
50
a
30
20
10
0
Posible mecanismo molecular
Ensayos de funcionalidad espermática de los ESP liberados con MEAE
9
Acrosoma intacto: 80%
9
ESP capacitados: 35%
¾
Ensayos de Reacción acrosomal con inductores fisiológicos
¾
Estudiar su capacidad fertilizante mediante ensayos de unión ( a
zonas pellucidas ) y de fusión al oolema.
Posible mecanismo celular
Hormonas Esteroideas
FAAH
NA
PL PED
1
PV
TR
EtNH2 + AA
AEA
1
CB
N
C
AM
T
AEA (nM)
Capacitación
Hiperactivación
LIBERACIÓN
MUCHAS GRACIAS!!!!!