proteómica - Severo Ochoa - Universidad Autónoma de Madrid

proteómica - Severo Ochoa - Universidad Autónoma de Madrid

II JORNADAS BIENALES DE JÓVENES
INVESTIGADORES EN PROTEÓMICA
La organización de las Jornadas y la edición de este número especial han
corrido a cargo de los siguientes investigadores:
Ana María Maldonado Alconada (Universidad de Córdoba)
Sira Echevarría Zomeño (Universidad de Córdoba)
Raquel González (Universidad de Córdoba)
Jesús Vázquez (CBM-SO, UAM, Madrid)
Montse Carrascal (CSIC-UAB, Barcelona)
Ángel García (Universidad de Santiago de Compostela)
Marina Gay (CSIC-UAB, Barcelona)
Antonio Marcilla (Universidad de Valencia)
Salvador Martínez (CNB-CSIC)
Pablo Martínez-Acedo (CBM-SO-UAM )
Antonio Martínez-Ruiz (Hospital de La Princesa, Madrid)
Angela Moreno (IAS-CSIC, Córdoba)
Pedro Navarro (CBM-SO-UAM)
Ana Oleaga (CSIC, Salamanca)
Miren J. Omaetxebarría (Universidad País Vasco)
Aida Pitarch (Universidad Complutense Madrid)
Manuel Rodríguez (Universidad de Córdoba)
Eva Rodríguez-Suarez (CIC-Biogune)
Cristina Ruíz (INIBIC –A Coruña)
Luis Valledor (Universidad de Oviedo)
Federico Valverde (CSIC Sevilla)
5
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Sede social: Instituto de Biomedicina de Valencia, C.S.I.C.
c/. Jaime Roig, 11. 46010 Valencia
7HO‡)D[
C.I.F.: G-97465629.
Nº. Registro Nacional de Asociaciones: 584180.
http://www.cbm.uam.es/seprot
Junta Directiva:
Fernando J. Corrales.
Presidente
CIMA - Universidad de Navarra, Pamplona
[email protected]
Fernando Vivanco.
Vicepresidente
Universidad Complutense,
Fundación Jiménez Díaz, Madrid
[email protected]
Manuel M. Sánchez del Pino.
Secretario
Centro de Investigación Príncipe Felipe,
Valencia
[email protected]
Eliandre de Oliveira.
Tesorera
Plataforma de Proteómica, Parc Cientific
de Barcelona
[email protected]
Vocales
Ignacio Casal.
CIB, CSIC, Madrid
[email protected]
Concha Gil.
Universidad Complutense de Madrid
[email protected]
Juan Pablo Albar.
CNB, UAM, CSIC, Madrid
[email protected]
Jesús Jorrín.
Universidad de Córdoba
[email protected]
Jesús Vázquez.
CBMSO,CSIC-UAM, Madrid
[email protected]
Juanjo Calvete.
IBV, CSIC, Valencia
[email protected]
Ángel García.
Universidad de Santiago de Compostela
[email protected]
Lucía Monteoliva.
Universidad Complutense de Madrid
[email protected]
Montserrat Carrascal.
IIBB, CSIC, IDIBAPS, Barcelona
[email protected]
PROTEÓMICA
Revista de la Sociedad Española
de Proteómica
Número 5, Febrero 2010
EDITORES RESPONSABLES:
Jesús V. Jorrín
Jesús Vázquez
COMITÉ EDITORIAL:
Juan Pablo Albar
Juan J. Calvete
Montserrat Carrascal
Ignacio Casal
Fernando Corrales
Ángel García
Concha Gil
Ana María Maldonado Alconada
Antonio Martínez Ruiz
Lucía Monteoliva
Ángela Moreno
Eliandre de Oliveira
Manuel Sánchez del Pino
Fernando Vivanco
CORRESPONDENCIA EDITORIAL:
Jesús V. Jorrín Novo (Dpto. de Bioquímica y Biología
Molecular, Universidad de Córdoba. Campus de
Rabanales, Ed. Severo Ochoa (C6), 14071 Córdoba.
E-mail: [email protected])
EDITA:
SEPROT
6
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡129,(0%5(
PROTEÓMICA. Revista de la Sociedad Española de Proteómica
Editada por: Sociedad Española de Proteómica
Periodicidad: Semestral (dos números por año, enero-febrero y julio-septiembre).
Contenidos: se publicarán artículos originales, comunicaciones breves, artículos de revisión, artículos de
difusión, tutoriales, opiniones, notas, resumen de tesis doctorales, y comentarios sobre cualquier aspecto
relacionado con la proteómica. Se priorizarán artículos originales sobre aspectos metodológicos o de aplicación al estudio de sistemas biológicos. Incluye información sobre nuestra Sociedad, personas, grupos e
instituciones que la componen.
Idioma: será el castellano, aunque se admiten contribuciones en otras lenguas, preferentemente inglés.
Distribución: España y Latinoamérica, aunque pretendemos que tenga un carácter internacional mediante
la distribución a otros países. Se enviarán, sin coste alguno, a los socios de la SEProt, Unidades y Servicios,
así como a instituciones y organizaciones públicas o privadas miembros de la sociedad o con actividad
relevante en el campo de la proteómica.
Publicación: habrá una versión impresa, y una versión “on-line” que aparecerá en la página web de la SEProt y de la Universidad de Córdoba.
Editores responsables: Jesús V. Jorrín Novo y Jesús Vázquez
Comité editorial: Juan Pablo Albar, Juan J. Calvete, Montserrat Carrascal, Ignacio Casal, Fernando Corrales, Ángel García, Concha Gil, Ana María Maldonado Alconada, Antonio Martínez Ruiz, Lucía Monteoliva,
Ángela Moreno, Eliandre de Oliveira. Manuel Sánchez del Pino y Fernando Vivanco
Correspondencia Editorial:
Jesús V. Jorrín Novo
Dpto de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba. Campus de Rabanales, Ed. Severo
Ochoa (C6), 14071 Córdoba. E-mail: [email protected]
Instrucciones a los autores:
http://www.cbm.uam.es/seprot/
Envío de los manuscritos:
Mediante correo electrónico ([email protected]).
I.S.S.N.:
1888-0096
Depósito Legal: CO-1005-07
Edita:
SEPROT (Sociedad Española de Proteómica)
www.cbm.uam.es/seprot
Imprime:
Argos Impresores S.L. Córdoba.
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡129,(0%5(
7
Ë1',&('(&217(1,'26
Editorial
Jesús V. Jorrín Novo
17
Las II Jornadas para Jóvenes Investigadores en Proteómica, Córdoba 2010
Jesús Vázquez, Ana M. Maldonado-Alconada, Sira Echevarría-Zomeño, Raquel
González
18
1. BIOINFORMÁTICA
Mesa redonda sobre herramientas en bioinformática
Salvador Martínez-Bartolomé, Pedro Navarro, Alex Campos, Marco Trevisán-Herraz,
Juan Antonio Vizcaíno, Alberto Medina
20
$QHZYHUVDWLOH¿OHWUDQVODWRUIRU3URWHRPLFVVWDQGDUGV
Alberto Medina, Salvador Martínez-Bartolomé, J. Pablo Albar
21
Open-source bioinformatics solutions for the analysis of mass spectrometry-based
proteomics data: pipelines and quantitation
Alexandre R. Campos
22
Java API for MIAPE generation
Emilio Salazar, Miguel A. López, Salvador Martínez-Bartolomé, Alberto Medina, J.
Pablo Albar
25
7KH 3URWHRPLFV ,GHQWL¿FDWLRQV GDWDEDVH 35,'( LWV DVVRFLDWHG WRROV DQG WKH
ProteomeXchange consortium
Juan Antonio Vizcaíno, Florian Reisinger, Richard Côté, Henning Hermjakob
26
Proteopathogen, una base de datos de proteínas para el estudio de la interacción
Candida albicans – hospedador
Vital Vialás, Rubén Nogales-Cadenas, César Nombela, Alberto Pascual-Montano,
Concha Gil
28
Bioinformatics tools for inferring immune-related functions from proteomic data
Gema Sanz, Ángeles Jiménez, Ángela Moreno, Juan J. Garrido
30
%,20$5&$'25(6<3$72/2*Ë$6+80$1$6
3URWHLQWDUJHWVRIR[LGDWLYHVWUHVVLQGXFHGE\+XQWLQJWRQGLVHDVHLQKXPDQEUDLQ
(YDOXDWLRQRIDQ+'PLFHPRGHO7HW+'
M. Alba Sorolla, Isidre Ferrer, José Lucas, Joaquim Ros, Elisa Cabiscol
,GHQWL¿FDFLyQ PHGLDQWH SURWHyPLFD GH SRVLEOHV ELRPDUFDGRUHV SODTXHWDULRV HQ
síndrome coronario agudo
32
8
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Andrés F. Parguiña, Isaac Rosa, Lilián Grigorian-Shamagián, Elvis TeijeiraFernández, Jana Alonso, Rosa Agra, José Ramón González-Juanatey, Ángel García
35
$QiOLVLVGHODH[SUHVLyQGLIHUHQFLDOGHSURWHtQDVHQHOVXHURGHUDWRQHV&%/
VLOYHVWUHV UHVSHFWR D UDWRQHV &%/ GH¿FLHQWHV SDUD &' XWLOL]DQGR XQD
FROHFFLyQFRPELQDWRULDGHKH[DSpSWLGRVProteoMiner\HOHFWURIRUHVLV'
Antonio Rosal, Sonia García-Rodríguez, Esther Zumaquero, Pilar Navarro, Mercedes
Zubiaur, Jaime Sancho
37
'HYHORSLQJ 050$VVD\V IRU 3HSWLGH 4XDQWLWDWLRQ The MIDASTM ZRUNÀRZ DQG
QtrapTM technology
Antonio Serna
38
,QWHOOLJHQW8VHRI5HWHQWLRQ7LPHIRU+LJKHU2UGHU0XOWLSOH5HDFWLRQ0RQLWRULQJ
Multiplexing . Scheduled MRM™ Algorithm
Antonio Serna
40
2EHVLGyPLFD FDUDFWHUL]DFLyQ GHO VHFUHWRPD GHO WHMLGR DGLSRVR GH GLIHUHQWHV
ORFDOL]DFLRQHVDQDWyPLFDV
Arturo Roca-Rivada, Jana Alonso, Omar Al-Massad; Luisa María Seoane, Felipe
Casanueva, María Pardo
40
7RS'RZQSURWHRPLFDQDO\VLVRI&6)SURWHLQVIURP$/6SDWLHQWV
Claudio Diema, Alex Campos, Núria Omeñaca, Eliandre de Oliveira, Joan Guinovart,
Jacques Borg, Marta Vilaseca
43
2SWLPXPPHWKRGGHVLJQHGIRU'',*(RIDUWHULDOLQWLPDDQGPHGLDLVRODWHGE\
laser microdissection
Fernando de la Cuesta, Gloria Alvarez-Llamas, Irene Zubiri, Aroa Sanz- Maroto,
Alicia Donado, Luis. Rodriguez-Padial, Angel Garcia-Pinto, María González-Bardera,
Fernando Vivanco
45
,GHQWL¿FDFLyQ GH SpSWLGRV HVSHFt¿FRV GH FiQFHU FRORUUHFWDO PHGLDQWH HO XVR GH
librerías de fagos T7 impresas en microarrays
Ingrid Babel, Rodrigo Barderas, Victor Moreno, Ivan Cristobo, Gabriel Capellá,
Ignacio Casal
46
'%OXH1DWLYH6'63$*(DQDO\VLVRIPXOWLSURWHLQFRPSOH[HVRIKXPDQHU\WKURF\WH
membrane
Irene Zubiri, Gloria Álvarez-Llamas, Fernando de la Cuesta, María González-Barderas,
Fernando Vivanco
48
5HJXODWLRQ RI HSLWKHOLDOPHVHQFK\PDO WUDQVLWLRQ LQ FRORQ FDQFHU E\ Į
GLK\GUR[\YLWDPLQ'DSURWHRPLFVDSSURDFK
Iván Cristobo, María Jesús Larriba, Vivian De los Ríos, Ingrid Babel, Rodrigo Barderas,
Alberto Muñoz, Ignacio Casal
&RPSUHKHQVLYHSURWHRPLFDQDO\VLVRIKXPDQHQGRPHWULDOÀXLGDVSLUDWH
49
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Juan Casado-Vela, Eva Rodriguez-Suarez, Ibon Iloro, Amagoia Ametzazurra, Nere
Alkorta, Juan A. García-Velasco, Roberto Matorra, Begoña Prieto, Sandra González,
Daniel Nagore, Laureano Simón, Felix Elortza
9
50
,GHQWL¿FDWLRQRIELRPDUNHUVLQFRORUHFWDOFDQFHUSUHSRVWFKHPRWKHUDS\E\
1XFOHLF $FLGV 3URJUDPPDEOH 3URWHLQ 0LFURDUUD\V 1$33$ L),6+ DQG 613V
approaches
María González, Raquel Bartolomé, Jose María Sayagues, María González, Ana Laura
Moro, Elena Andrada, Sahar Sibani, Josh LaBaer, Jacinto García, Alberto Orfao,
Manuel Fuentes
53
'HWHFWLRQRISURVWDWHFDQFHUE\XULQH3URWHRPLFV
Marina Rigau, Nuria Colome, Juan Morote, Mª Carme Mir, Carlos Ballesteros, Marta
Garcia, Miguel Abal, Francesc Canals, Jaume Reventós, Andreas Doll
54
1DQR/&PDVVVSHFWURPHWU\EDVHGSURWHRPLFDQDO\VLVRIVHUXPDQGV\QRYLDOÀXLG
samples from osteoarthritis patients
Patricia Fernández-Puente, Jesús Mateos, Carolina Fernández-Costa, Cristina RuizRomero, Francisco J. Blanco
56
)XQFWLRQDO3URWHRPLFV%HDGV±EDVHGDUUD\V\VWHPIRUELRPDUNHUGLVFRYHU\
Raquel Bartolomé, María González-González, Jose M. Sayagües, Fridtjof LundJohansen, Alberto Orfao, Manuel Fuentes
58
Anticuerpos a la carta combinando expresión in vitro de proteínas, tecnología de
despliegue en fagos y arrays de anticuerpos
Rodrigo Barderas, Ingrid Babel, Iván Cristobo, José Ignacio Casal
59
9DOLGDWLRQRI3(')DVDSRWHQWLDOELRPDUNHUIRU16&/&
Sonia Blanco-Prieto, Nuria Sánchez-Otero, Ana M. Rodríguez-Piñeiro, M. Isabel
Botana-Rial, Francisco J. Rodríguez-Berrocal, María Páez de la Cadena
61
8WLOL]DFLyQ GH 3URWHR0LQHU SDUD HO DQiOLVLV SURWHyPLFR GH PXHVWUDV GH OtTXLGR
VLQRYLDO/6GHSDFLHQWHVFRQRVWHRDUWULWLV
Sonia García-Rodriguez, María D. Pérez-Mezcua, Antonio Rosal-Vela, Victoria
Longobardo, Antonio Larios, Pilar Navarro, Raquel Largo, Gabriel Herrero-Beaumont,
Jaime Sancho, Mercedes Zubiaur
63
Estudio de la Estenosis Aórtica Valvular desde un punto de vista proteómico
Tatiana Martin-Rojas, Felix Gil-Dones, Luis F. Lopez-Almodovar, Fernando de la Cuesta,
Gloria Álvarez-Llamas, Fernando Vivanco, Luis R.. Radial, María G. Barderas
64
0HWDEROLFODEHOOLQJRISULPDU\FXOWXUHKXPDQFDUWLODJHFHOOVWRDQDO\]HWKHHIIHFW
RI,QWHUOHXNLQȕLQWKHH[WUDFHOOXODUPDWUL[PHWDEROLVP
Valentina Calamia, Beatriz Rocha, Patricia Fernández, Jesús Mateos, Cristina RuizRomero, Francisco J Blanco
,GHQWL¿FDWLRQRIGLIIHUHQWLDOSURWHLQVLQOLYHUFHOOVXSRQGHSOHWLRQRISURKLELWLQ
66
10
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Virginia Sánchez-Quiles, Enrique Santamaría, Laura Sesma, Fernando J. Corrales
68
,QWURGXFWLRQWR/XFLG3URWHRPLFV6\VWHPDQHZVROXWLRQIRUSHSWLGHDQGSURWHLQ
SUR¿OLQJ DQG LGHQWL¿FDWLRQ FRPELQLQJ 5HWHQWDWH &KURPDWRJUDSK\ WR 0$/',
72)DQG72)72)0DVV6SHFWURPHWU\
Francesco Tortorella
70
02',),&$&,21(632675$'8&&,21$/(6
/LTXLG&KURPDWRJUDSK\²(OHFWURQ7UDQVIHU'LVVRFLDWLRQDQGLRQPRELOLW\VWXGLHV
RQD472)PDVVVSHFWURPHWHU
Keith Compson, James Langridge, Jeffery Brown, Steven Pringle, Iain Campuzano,
Richard Chapman
71
6WUDWHJLHVIRUSURWHRPLFDQDO\VLVRIEORRGJO\FDWHGSURWHLQV
María Ramírez-Boo, Feliciano Priego-Capote, Alexander Scherl y Jean-Charles
Sanchez
72
+3/&)RVIR&KLSXQDQXHYDWHFQRORJtDSDUDHODQiOLVLVVHOHFWLYRGHIRVIRSpSWLGRV
PHGLDQWH/&06
Isidro Masana. Reinout Raijmakers, Shabaz Mohammed, Albert Heck, Dayin Lin
75
,GHQWL¿FDWLRQRIDQHZSKRVSKRU\ODWLRQVLWHLQ()WUDQVFULSWLRQIDFWRU
Nerea Osinalde, Miren Josu Omaetxebarria, Kerman Aloria, Ana M. Zubiaga, Asier
Fullaondo, Jesús M. Arizmendi
77
(VWDEOHFLPLHQWRGHXQÀXMRGHWUDEDMRHIHFWLYRHQODFDUDFWHUL]DFLyQFXDOLWDWLYD\
cuantitativa del fosfoproteoma
David Ovelleiro, Montserrat Carrascal, Joaquin Abian
79
$SUR[LPDFLRQHVPHWRGROyJLFDVSDUDHOHVWXGLRGHOHVWDGRUHGR[WLROGLVXOIXURGH
proteínas en muestras vegetales
Sira Echevarría-Zomeño, Per Hägglund, Birte Svensson, Ana M. Maldonado Alconada,
Jesús V. Jorrín Novo
81
'HFLSKHULQJ WKH 61LWURV\ORPH RI Arabidopsis thaliana during the defense
response
Ana M. Maldonado-Alconada, Sira Echevarría-Zomeño, Christian Lindermayr, Jörg
Durner, Jesús V. Jorrín-Novo
83
&DUDFWHUL]DFLyQ GH 6JOXWDWLRQLODFLyQ GH SURWHtQDV D QLYHO GH SURWHRPD
'L¿FXOWDGHV
Esperanza Morato, Sira Echevarría Zomeño, Anabel Marina
85
Lainhibicióndelasíntesisdeóxidonítricodurantelacolestasisinducidaexperimentalmente
reduce la lesión hepatocelular al facilitar la homeostasis de nitrosotioles
Laura M. López-Sánchez, Fernando J. Corrales, Montserrat Barcos, Isabel Espejo,
Juan R. Muñoz-Castañeda, Antonio Rodríguez-Ariza
86
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
11
'HVDUUROORGHPHWRGRORJtDVSDUDODGHWHFFLyQGHPRGL¿FDFLRQHVSRVWUDGXFFLRQDOHV
HQ FLVWHtQDV 6QLWURVLODFLyQ \ R[LGDFLyQ PHGLDQWH DSUR[LPDFLRQHV SURWHyPLFDV
EDVDGDVHQPDUFDMHÀXRUHVFHQWH\HOHFWURIRUHVLVELGLPHQVLRQDO
Daniel Tello, Rubén Fernández-Rodríguez, Antonio Martínez-Ruíz
90
$QDO\VLVRIUHYHUVLEOHDQGLUUHYHUVLEOHSURWHLQPRGL¿FDWLRQVXSRQR[LGDWLYHVWUHVV
in Schizosaccharomyces pombe by proteomic approaches
Sarela García-Santamarina, Susanna Boronat, Elena Hidalgo
91
La lipoproteína lipasa de rata se nitra in vivo en respuesta a la administración de
lipopolisacárido
Albert Casanovas, Montserrat Carrascal, Joaquín Abián, Miquel Llobera, M. Dolores
López-Tejero
91
$SSOLFDWLRQRIL75$4UHDJHQWVWRUHODWLYHO\TXDQWLI\WKHUHYHUVLEOHUHGR[VWDWHRI
cysteines
Brian McDonagh, C. Alicia Padilla, J. Antonio Bárcena
93
3527(Ï0,&$&8$17,7$7,9$
6ROXFLRQHV D 5HWRV $QDOtWLFRV HQ 3URWHyPLFD &XDQWLWDWLYD \ 9DOLGDFLyQ GH
Biomarcadores
Isidro Masana
94
/XFHV\VRPEUDVGHODFXDQWL¿FDFLyQFRQL75$4
María luz Valero, Virginia Rejas, Manuel Mateo Sánchez del Pino
96
L75$4EDVHGTXDQWLWDWLYHDQDO\VLVRISURWHLQPL[WXUHVZLWKODUJHIROGFKDQJHDQG
dynamic range
Juan Casado-Vela, María José Martínez-Esteso, Eva Rodríguez, Eva Borrás; Felix
Elortza, Roque Bru-Martínez
98
(YDOXDWLRQRI06EEDVHGSURWHLQTXDQWL¿FDWLRQPHWKRGV
Kerman Aloria, Miren Josu Omaetxebarria, Mikel Azkargorta, Johannes P. C. Vissers,
Asier Fullaondo, Jesús M. Arizmendi
99
'HVDUUROOR GH XQ 0RGHOR (VWDGtVWLFR 8QLYHUVDO SDUD 3URWHyPLFD &XDQWLWDWLYD
0HGLDQWH0DUFDMH,VRWySLFR(VWDEOH
Marco Trevisan-Herraz, Pedro Navarro, Elena Bonzon-Kulichenko, Pablo MartínezAcedo, Daniel Pérez-Hernández, Estefanía Núñez, María Luisa Hernáez, Enrique
Calvo, Montserrat Carrascal, Marina Gay, Inmaculada Jorge, Dolores Gutiérrez,
Joaquín Abian, Concha Gil, Juan Miguel Redondo, Jesús Vázquez
101
/DEHOIUHH4XDQWLWDWLYH$SSURDFKHVLQ&6)%LRPDUNHU'LVFRYHU\
Alex Campos, Jacques Borg, Claudio Diema, Marta Vilaseca, Eliandre Oliveira
A comparison of quantitative proteomics methodologies on a differential experiment
on test samples
103
12
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Joan Josep Bech-Serra, Núria Colomé, Marta Monge, Francesc Canals
105
7ULSOH 4XDGUXSROH 0DVV 6SHFWURPHU\%DVHG 3HSWLGH $VVD\V 8VLQJ ,QWHOOLJHQW
650L650
Reiko Kiyonami, Alan Schoen, Amol Prakash, Huy Nguyen, Scott Peterman, Vlad
Zabrouskov, Andreas Huhmer, Sarah Robinson, Martin Hornshaw, Madalina
Oppermann, Nathalie Selevsek, Bruno Domon
107
3527(Ï0,&$0,&52%,$1$<'(3$5È6,726
5.1 Aspectos generales
Problemas en el análisis proteómico de muestras procedentes de organismos
‘raros’
María Luz Valero, Javier Ortiz, Esther Dionís, Laura Cantero, Manuel Mateo Sánchez
del Pino.
108
5.2 Proteómica de Microorganismos
A) Proteómica de Bacterias
Preparación de extractos proteicos bacterianos para el análisis de glicoproteínas
PHGLDQWHJHOHVELGLPHQVLRQDOHV\FURPDWRJUDItDVGHD¿QLGDG
Alfonso Olaya, Lidia Gómez-Gascón, Manuel J. Rodríguez-Ortega
108
Métodos de enriquecimiento de glicoproteínas bacterianas para su posterior
DQiOLVLV\FDUDFWHUL]DFLyQPHGLDQWHHVSHFWURPHWUtDGHPDVDV
Lidia Gómez-Gascón, Alfonso Olaya y Manuel J. Rodríguez-Ortega
110
Análisis de la enterotoxina A de Staphylococcus aureus HQ OHFKH SRU LRQL]DFLyQ
PHGLDQWH GHVRUFLyQ SRU OiVHU DVLVWLGD SRU PDWUL] DFRSODGD D HVSHFWURPHWUtD GH
PDVDVGHWLHPSRGHYXHORMALDI-TOF
Isabel Sospedra, Carla Soler, Jose Miguel Soriano, Jordi Mañes
112
Comparación de dos técnicas proteómicas aplicadas al análisis de las proteínas de
membrana de Mycoplasma genitalium
Noemí Párraga-Niño, Núria Colomé, Francesc Canals, Jaume Piñol, Josep Antoni
Pérez Pons, Enrique Querol, Mario Ferrer-Navarro
115
Comparative proteomic analysis of collection and clinical-isolate strains of
Stenotrophomonas maltophilia
Mario Ferrer-Navarro, Elias Mongiardini, Gerard Torrent, Raquel Planell, Ana
Calderón, Teresa Falgueras, Isidre Giber, Xavier Daura
116
B) Proteómica de Hongos
Análisis comparativo del proteoma de una cepa industrial de Saccharomyces
cerevisiae en dos condiciones de cultivo
Carlos Luna, Teresa García-Martínez, Miguel Curto, Juan Carlos Mauricio
Estudio proteómico comparativo de células de Saccharomyces cerevisiae libres y
ELRLQPRYLOL]DGDV
118
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Teresa García-Martínez, Juan Carlos Mauricio
13
119
(VWXGLR FRPSDUDWLYR GHO SHU¿O SURWHLFR GH FHSDV VLOYHVWUH %< \ PXWDQWH
WUNGHSaccharomyces cerevisiae en condiciones de ayuno en K+
Miguel Curto, Clara Navarrete, Luis Valledor, María Luisa Hernández, José Ramos,
Jesús Jorrín
121
$QiOLVLV PHGLDQWH '',*( GH OD LQWHUDFFLyQ FRQ VDQJUH GH XQD FHSD GH
Saccharomyces cerevisiae potencialmente patógena aislada de suplementos
dietéticos
Carolina Hernández-Haro, Lucía Monteoliva, Gloria Molero, Concha Gil, María
Molina
123
Análisis comparativo de diferentes aproximaciones para el estudio del proteoma
de Saccharomyces cerevisiae
Dolores Gutiérrez, Mª Luisa Hernaéz, Montserrat Martínez-Gomariz, María Posada,
Concha Gil
124
Applying proteomic technologies to dissect molecular aspect of phytopathogenic
fungi, a Botrytis cinerea approach
Francisco Javier Fernández-Acero, Carlos Garrido, María Carbú, Victoria E. GonzálezRodríguez, Jesús Manuel Cantoral
126
*HOEDVHG SURWHRPLF DQDO\VLV RI Botrytis cinerea. The VLPSOHVW '( UHYHDOV
differences in virulence-related protein abundance among strains
Raquel González-Fernández, Inmaculada Redondo, Jesús V. Jorrín-Novo
128
Proteomic approach to Botrytis cinerea survival structures
Victoria E. González-Rodríguez, Carlos Garrido, Maria Carbú, Jesús Manuel Cantoral,
Francisco Javier Fernández-Acero
130
3HU¿OVHUROyJLFRGHODUHVSXHVWDGHDQWLFXHUSRVIUHQWHDOLQPXQRPDGHCandida en
el pronóstico de las candidiasis invasivas
Aida Pitarch, César Nombela, Concha Gil
131
$QiOLVLV SURWHyPLFR GH OD PDWUL] H[WUDFHOXODU 0( GH ELRSHOtFXODV IRUPDGDV
por mutantes del hongo Candida albicansSDUDJHQHVTXHFRGL¿FDQSURWHtQDVTXH
contienen el dominio CFEM rico en cisteína y genes implicados en glicosilación
Rosario Blanes, Ana M. Pérez, Amelia Murgui, Manuel Casanova, Ángel Domínguez,
José P. Martínez
133
Expresión diferencial de proteínas del citoesqueleto del macrófago tras la
interacción con Candida albicans3UREOHPDVHQODQRUPDOL]DFLyQGHODVPXHVWUDV
Jose Antonio Reales-Calderón, Mª Luisa Hernáez, Mª Dolores Gutiérrez, Gloria Molero,
Concha Gil
5.3 Proteómica de Parásitos
135
14
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
3UREOHPiWLFDHQODLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVGHSDUiVLWRV
Javier Sotillo, Ana Pérez García, María Trelis, Dolores Bernal, Carla Muñoz-Antolí,
José Guillermo Esteban, Rafael Toledo, Antonio Marcilla
136
/DV WpFQLFDV GH SURWHyPLFD DSOLFDGDV DO HVWXGLR GH ODV UHODFLRQHV SDUiVLWR
KRVSHGDGRUHQODGLUR¿ODULRVLVDQLPDO\KXPDQD
Javier González-Miguel, Rodrigo Morchón-García, Ana Oleaga, Mar Siles-Lucas,
Ricardo Pérez-Sánchez, Fernando Simón
138
,GHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVGHNeospora caninum implicadas en procesos de invasión
y virulencia
Virginia Marugán-Hernández, Javier Regidor-Cerrillo, Gema Álvarez-García, Fiona
Tomley, Adriana Aguado-Martínez, Mercedes Gómez-Bautista, Luís Miguel Ortega-Mora
140
$SOLFDFLyQ GH HFXDOL]DGRUHV GH SURWHtQDV SDUD OD LGHQWL¿FDFLyQ GH DQWtJHQRV
minoritarios de la saliva de Ornithodoros moubata
Ricardo Pérez-Sánchez, Ana Oleaga, Mar Siles-Lucas, Verónica Díaz-Martín, Eduardo
de la Torre Escudero, Ana Hernández-González, Raúl Manzano-Román
143
,GHQWL¿FDFLyQ SURWHyPLFD \ DQiOLVLV ELRLQIRUPiWLFR GH SURWHtQDV VHFUHWDGDV SRU
HOSURWR]RRSDUiVLWRTrypanosoma cruziSHUWHQHFLHQWHVDODIDPLOLD0$63Mucin
associated Surface Proteins
Luis Miguel De Pablos ,Gloria González, Víctor Seco Hidalgo, Isabel María Díaz
Lozano, Antonio Osuna
145
([SHULPHQWDOWKHRUHWLFVWXG\RISHSWLGH¿QJHUSULQWVLQLeishmania parasites
M. Auxiliadora Dea-Ayuela, Riccardo Concu, Lázaro G. Perez-Montoto, Eugenio
Uriarte, Francisco Bolás-Fernández, Florencia Ubeira, Humberto González-Díaz
147
3527(Ï0,&$9(*(7$/<$1,0$/
8ELTXLWLQDFLyQGHSURWHtQDVQXFOHDUHVHQODVHxDOL]DFLyQGHOD\XQRGHIRVIDWRHQ
plantas
Marina Trigueros, Mónica Rojas-Triana, Maria Luisa Irigoyen, Javier Paz-Ares,
Vicente Rubio
149
3URWHRPHSUR¿OHDQDO\VLVRIMedicago truncatula leaves in response to Uromyces
striatus
Mª Ángeles Castillejo, Jesús V. Jorrín, Diego Rubiales
150
Análisis proteómico del desarrollo sexual mediado por anteridiógeno en el
JDPHWR¿WRGHOKHOHFKRBlechnum spicant
Virginia Menéndez, Luis Valledor, Ángeles Revilla, Helena Fernández
152
Proteome regulation and epigenetic code during Pinus radiata needle maturation
Luis Valledor, María Jesús Cañal, Christof Lenz, Roberto Rodríguez, Jesús Jorrín
(VWXGLR GH OD UHVSXHVWD DO HVWUpV KtGULFR HQ GRV SREODFLRQHV GH HQFLQD Quercus
153
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
15
ilex subsp. ballota >'HVI@ 6DPS PHGLDQWH XQD DSUR[LPDFLyQ GH SURWHyPLFD
comparativa basada en electroforesis bidimensional
José Valero Galván, Rafael Mª Navarro Cerrillo, Ma Cristina Romero Rodríguez, David
Ariza, Jesús Jorrín Novo
156
'HVDUUROOR\RSWLPL]DFLyQGHOSURFHVRGHH[WUDFFLyQGHSURWHtQDV\HOHFWURIRUHVLV
bidimensional en fruta de hueso
Esther Giraldo Ramos, Amelia Díaz Méndez, Alfredo García Sánchez
158
Comparative proteomic analysis of Arabidopsis wild-type and Fawrky1 transgenic
SODQWV WR FKDUDFWHUL]H WKH IXQFWLRQ RI WKH VWUDZEHUU\ Fragaria x ananassa
)D:5.< SURWHLQ DQG LWV $UDELGRSVLV KRPRORJ $W:5.< WZR SRVLWLYH
regulators of resistance
Alba Ruíz-Ramos, Francisco Amil-Ruíz, Juan Muñoz-Blanco, José Luis Caballero, Ana
M. Maldonado Alconada
160
(OHVWXGLRFRPSDUDWLYRSURWHyPLFR\WUDQVFULSWyPLFRGHODUHVSXHVWDDD]~FDUHVHQ
Arabidosis thaliana PXHVWUDXQDUHODFLyQHQWUHHOPHWDEROLVPR\HOGHVDUUROORÀRUDO
Marina Ribeiro-Pedro, Fátima Ezzahra Said, María Teresa Ruiz, José María Romero,
Federico Valverde
162
$',*(SURWHRPLFDQDO\VLVRIZKHDWÀDJOHDIWUHDWHGZLWK7(55$625%ŠIROLDU
a free amino acid-based biostimulator
María José Martinez-Esteso, Mayte Vilella-Antón, Susana Sellés-Marchart, Anna BottaCatalà, Rafael Piñol-Dastis , Roque Bru-Martinez
164
+LJKWKURXJKSXW ELRORJLFDO DQG IXQFWLRQDO DQDOLV\V RI LQWHUDFWLRQV DPRQJ
tetraspanin associated proteins in T Limphocytes using second generation
proteomics techniques
Daniel Pérez-Hernández, Elena Bonzón-Kulichenko, Pablo Martínez-Acedo, Pedro J.
Navarro, Estefanía Núñez, Marco Trevisan-Herraz, María Yáñez-Mo, Mónica SalaValdés, Mª Ángeles Ursa, Francisco Sánchez-Madrid, JesúsVázquez
167
8VHRI3URWHR0LQHULQ9HWHULQDU\5HVHDUFK
Anna Marco, Gemma Rovira, Anna Bassols
168
La Proteómica como vía para determinar el origen animal de los productos
cárnicos
Miguel Ángel Sentandreu, Paul D. Fraser, Enrique Sentandreu, Leticia Mora, Peter M.
Bramley
170
3pSWLGRVLQKLELGRUHVGHOD(Q]LPD&RQYHUWLGRUDGH$QJLRWHQVLQD,JHQHUDGRVHQOD
digestión in vitro de la carne de cerdo
Elizabeth Escudero, Miguel Angel Sentandreu, Keizo Arihara, Fidel Toldrá
172
3pSWLGRVGHULYDGRVGHODWURSRQLQD7JHQHUDGRVHQMDPyQFXUDGR
Leticia Mora, Miguel Angel Sentandreu, Fidel Toldrá
175
Instrucciones a los Autores
177
17
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
EDITORIAL
Proteómica y las Jornadas caminan y deben caminar de la mano
(OQ~PHURFLQFRHVPRQRJUi¿FR\UHFRSLODORVWUDEDMRVSUHVHQWDGRVHQODV³,,-RUQDGDV
Bienales de Jóvenes Investigadores en Proteómica”. El proyecto, concebido por Jesús Vázquez, tuvo su bautizo en Barcelona, en febrero de hace dos años, y su organización corrió a
cargo de Montse Carrascal y Marina Gay (Proteómica 1, febrero 2008). La segunda edición
se traslada a Córdoba, donde podremos recordar con nostalgia y cariño el periodo 2003-2005,
el que transcurrió entre la primera reunión formal de proteómica en nuestro país (I Jornadas
sobre Proteómica UCO-2003) y el I Congreso de la recién creada SEProt. Como siempre,
¡bienvenidos a esta vuestra casa!
Este número aúna dos de los objetivos prioritarios de nuestra Junta directiva para el
próximo periodo, las Jornadas para Jóvenes Investigadores y la revista Proteómica, lo que,
como co-editor responsable de la segunda, no deja de ser una enorme satisfacción. Estoy
convencido que el éxito de ambos proyectos, en especial de la revista, va a depender, en gran
medida, de ese caminar juntos. Ya, desde esta editorial, quiero hacer una llamada al grupo de
Jóvenes Investigadores de la Sociedad para que os incorporéis al Comité Editorial.
He sido un observador privilegiado, y actor pasivo, del devenir de las Jornadas, desde
que Jesús Vázquez promovió e impulsó la idea. El excelente trabajo realizado por Anita lo he
podido seguir día a día; a pesar de sus continuos desasosiegos, siempre tuve claro, tanto por
el proyecto en sí como por su forma de ser y dedicación, que sería un éxito, tanto en el plano
FLHQWt¿FRFRPRHQHOVRFLDO'HVGHDTXt$QLWDPLPDVVLQFHURDJUDGHFLPLHQWR\FDULxRWDQWR
a nivel personal como en nombre de la Sociedad. Este agradecimiento y cariño ha de hacerse
extensivo a Ángela Moreno, la persona que siempre está sin querer estar, y a Jesús Vázquez,
el único senior al que dan cabida entre los jóvenes, posición que se ha ganado con creces. Los
proyectos no son sólo de una, dos, o tres persona, sino de un buen equipo, y el de las Jornadas
no es una excepción. Anita ha contado con la inestimable ayuda de Mª Carmen Molina Ruiz,
Sira Echevarría Zomeño y Raquel González, y, ¡como no¡ de María Teresa Montero, al frente de
OD6HFUHWDUtD7pFQLFD3HURWRGRHOORQRVLJQL¿FDUtDQDGDVLQHOH[FHOHQWHWUDEDMRHLQLFLDWLYDGH
los coordinadores de las diferentes sesiones, y de, lo último aquí, pero primero de las Jornadas,
los investigadores que han presentado, como norma general, excelentes trabajos.
A todos vosotros, muchísimas gracias!
Jesús V. Jorrín Novo
18
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Las II Jornadas de Jóvenes Investigadores en Proteómica, Córdoba 2010
Jesús Vázquez, Ana M. Maldonado-Alconada, Sira Echevarría-Zomeño, Raquel González
A raíz del éxito de las “I Jornadas Bienales de
Proteómica para Jóvenes Investigadores” (Sitges
TXHGy FODUDPHQWH MXVWL¿FDGD OD FHOHEUDFLyQ
de este evento en los años alternos a los congresos
como parte de las actividades de la Sociedad Española de Proteómica. De hecho, las Jornadas responden a uno de los principales objetivos de la SEProt:
ODRUJDQL]DFLyQGHFRQJUHVRVFLHQWt¿FRVFRQHO¿Q
de promover la comunicación entre los grupos que
usamos la Proteómica. Como bien sabéis, la característica diferencial de estas Jornadas respecto a los
congresos convencionales radica en el énfasis en
contemplar aspectos prácticos y técnicos al mismo
QLYHOTXHORVFLHQWt¿FRV\HQODDSXHVWDGHOD-'SRU
los socios “jóvenes” para organizar este evento. EsWDPRVWUHPHQGDPHQWHDJUDGHFLGRVSRUVXFRQ¿DQ]D
y su apoyo constante.
$O¿QDOL]DUHO&RQJUHVRGH3DPSORQDIHEUHUR
2009) presentamos con mucha ilusión la candidatura
para celebrar las “II Jornadas de Jóvenes Investigadores en Proteómica” en la Universidad de Córdoba, un centro con una trayectoria conocida a nivel
nacional e internacional por los esfuerzos realizados
en esta área y que ha jugado un papel fundamental
en el desarrollo de la Proteómica en España. Además de ser la sede de congresos y de cursos relacionados con la Proteómica, cabe recordar razones
sentimentales e históricas que ligan Córdoba a la
Proteómica. Fue en Córdoba, en febrero de 2003,
donde tuvo lugar el Congreso constituyente de la
Sociedad Española de Proteómica, y también fue
Córdoba la que albergó en 2005 nuestro primer congreso, que coincidió con la creación de la European
Proteomics Association.
En esta ocasión, una vez más, hemos contado
con el apoyo incondicional del Vicerrectorado de
Investigación de la Universidad de Córdoba. Queremos dar las gracias especialmente al Profesor D.
Enrique Aguilar Benítez de Lugo, Vicerrector de
3ROtWLFD &LHQWt¿FD SRU VX D\XGD SDUD OD ¿QDQFLDFLyQ GH HVWH HYHQWR \ SRU FHGHUQRV HO HGL¿FLR GHO
rectorado como sede de estas Jornadas. Sin duda,
ODORFDOL]DFLyQ\ODEHOOH]DGHHVWHHGL¿FLRVXSRQHQ
un aliciente más para participar en las “II Jornadas
Bienales de Jóvenes Investigadores en Proteómica”
que se celebrarán en Córdoba los días 11 y 12 de
febrero de 2010.
Tras la reunión de la JD en marzo del 2009, en la
que se aprobó la candidatura de Córdoba, comenzó
R¿FLDOPHQWHODRUJDQL]DFLyQGHHVWDV-RUQDGDV7RGD
la información en relación a las mismas, que ha
ido actualizando a medida que se concretaban los
contenidos de las sesiones, se puede encontrar en
la dirección http://www.jjip.fundecor.es/, a la que
se puede acceder también a través de la página web
de la Sociedad. En línea con el espíritu de las mismas y sus objetivos, se hizo hincapié en el carácter
ÀH[LEOHGLQiPLFR\SDUWLFLSDWLYRGHHVWHHYHQWR/D
acogida fue excelente y hemos recibido multitud
de propuestas sobre posibles sesiones temáticas,
formas de organizarlas y para participar como coordinadores de las mismas.
Una vez recogida la “lluvia de ideas” el ProJUDPD&LHQWt¿FRVHHVWUXFWXUyHQODVVHLVVHVLRQHV
temáticas que se detallan a continuación, cada una
de ellas coordinadas por expertos en el área (entre
paréntesis): Biomarcadores y Patologías Humanas
(Ángel García de la Univ. de Santiago de Compostela y Cristina Ruíz del INIBIC, A Coruña); Bioinformática (Salvador Martínez de Bartolomé del
CNB-CSIC y Pedro Navarro del CBMSO-CSIC);
Proteómica Microbiana y de Parásitos (Aída Pitarch
de la Univ. Complutense, Antonio Marcilla de la
Univ. de Valencia, Ana Oleaga del CSIC, Salamanca y Manuel Rodríguez de la UCO); Proteómica Vegetal y Animal (Luis Valledor de la Univ. de Oviedo
y Federico Valverde del CSIC Sevilla); Proteómica
Cuantitativa (Miren J. Omaetxebarría de la Univ.
País Vasco y Eva Rodríguez-Suarez del CIC BioguQH\0RGL¿FDFLRQHV3RVWUDQVGXFFLRQDOHV0DULQD
Gay y Montse Carrascal del CSIC/UAB, Antonio
Martínez-Ruiz del Hospital de La Princesa y Pablo
Martínez-Acedo del CBMSO-CSIC).
En esta ocasión hay que destacar una novedad
HQUHODFLyQDOIRUPDWRGHODVVHVLRQHVFLHQWt¿FDV\D
que los coordinadores han tenido total libertad para
organizar sus sesiones de la forma que han considerado más apropiada. Además de comunicaciones
orales seleccionadas por los coordinadores, habrá
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
paneles, mesas redondas con expertos en cada área,
y debates y foros de discusión en los que se tratarán
temas concretos sugeridos y votados previamente
por los socios. Cualquiera que sea el formato de las
sesiones, se ha intentado dar libertad total a los coordinadores y se ha considerado prioritario contemplar
WLHPSRVX¿FLHQWHSDUDODGLVFXVLyQ\HOGHEDWHHQ
línea con el espíritu del evento.
Aunque en el momento de escribir esta reseña
no estaba cerrado el plazo de inscripción, a día de
hoy el número de participantes en estas Jornadas
supera los 150. Hemos recibido 88 comunicaciones,
distribuidas entre las diferentes sesiones temáticas,
enviadas tanto por grupos con una trayectoria de
investigación en proteómica, como por laboratorios
que comienzan a hacer sus primeras incursiones en
HOiUHD$WHQRUGHOQ~PHUR\GHODFDOLGDGFLHQWt¿FD
de los resúmenes recibidos, podemos augurar el
éxito de estas Jornadas. Que será el resultado del
entusiasmo de los socios y del excelente trabajo que
han llevado a cabo los coordinadores de las sesiones
FLHQWt¿FDVFRQWDFWDQGRFRQORVLQYHVWLJDGRUHVSDUD
que participen y envíen sus comunicaciones, y haciendo una investigación exhaustiva de cuales son
las novedades, los retos y las limitaciones técnicas
en sus áreas respectivas. Tenemos que mencionar
que, dado el alto índice de participación, uno de los
principales problemas a los que hemos tenido que
hacer frente durante la organización ha sido “llegar
a un acuerdo” sobre la distribución del tiempo asignado a cada sesión. En el momento de escribir este
resumen estamos todavía intentando resolver esta
FXHVWLyQ \ HVSHUHPRV TXH HO 3URJUDPD &LHQWt¿FR
GH¿QLWLYRVDWLVIDJDDWRGRVSRULJXDO
Convencidos de que el éxito de estas Jornadas
depende también de la difusión de sus contenidos,
tal y como ocurrió en la anterior edición, éstos apa-
19
recen publicados en forma de resúmenes extendidos
en este número de Proteómica. De nuevo, ello ha
sido posible gracias a la labor de revisión y edición
llevada a cabo por los coordinadores. Está previsto
que una vez celebradas las Jornadas, los temas de
discusión y debate y las conclusiones obtenidas seUiQUHÀHMDGRVHQXQQ~PHURSRVWHULRUGHODUHYLVWD
Como viene siendo habitual en los eventos organizados por la Sociedad, las casas comerciales
han respondido con gran generosidad y entusiasmo.
Su participación va mucho más lejos de la aportación económica, pero este año queremos agradecer
especialmente la ayuda que nos han brindado en
HVWHVHQWLGRFRQVLGHUDQGRODDFWXDOVLWXDFLyQ¿QDQciera. Muchas gracias por su generosa participación
D7KHUPR6FLHQWL¿F$JLOHQW7HFKQRORJLHV:DWHUV
Applied Biosystems, Bio-Rad, Isogen, Bruker,
Beckman-Coulter-Izasa, Sigma y Nucliber. Applied
Biosystems patrocina el premio a la mejor comunicación (de entre todas la presentadas, tanto en
formato póster como comunicación oral) y Thermo
6FLHQWL¿FGRQDUiHOSUHPLRDORVRUJDQL]DGRUHVGH
la mejor sesión, ambos dotados de 300€. Queremos
agradecer a todas las casas comerciales el apoyo
inestimable que nos brindan.
De nuevo queremos transmitir nuestro agradecimiento a la JD por su respaldo incondicional, con
Fernando Corrales a la cabeza, y a Ángela Moreno
cuya ayuda ha sido imprescindible. Muchas gracias
también a Mª Carmen Molina por su ayuda y su
empeño en que todos se lleven un recuerdo imborrable de Córdoba. Esperamos que esta edición
tenga como mínimo el mismo éxito que la anterior.
El buen hacer y el entusiasmo demostrado por todos
los participantes nos hace creer que así será. Es un
placer y un honor recibiros a todos en Córdoba los
días 11 y 12 de febrero.
20
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
1. BIOINFORMÁTICA
Coordinadores: Salvador Martínez-Bartolomé y Pedro Navarro
Mesa redonda sobre herramientas en bioinformática
Salvador Martínez-Bartolomé1, Pedro Navarro2, Alex Campos3, Marco Trevisan-Herraz2, Juan
Antonio Vizcaíno4, Alberto Medina1
1
ProteoRed – Laboratorio de proteómica del Centro Nacional de Biotecnología – CSIC, Madrid. 2Laboratorio
de química de proteínas del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa – CSIC, Madrid. 3Plataforma de
3URWHyPLFD3DUF&LHQWL¿FGH%DUFHORQD4(0%/2XWVWDWLRQ(XURSHDQ%LRLQIRUPDWLFV,QVWLWXWH:HOOFRPH
Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge, UK.
El desarrollo y aparición de nuevas tecnologías
aplicadas a la proteómica han dado lugar a un crecimiento espectacular de datos experimentales. La
captura, el almacenamiento, el procesamiento y el
análisis de estos datos es, en numerosas ocasiones,
un cuello de botella que debemos solucionar para
seguir avanzando en el campo.
Pese a que, paralelamente, han aumentado los
proyectos de desarrollo de herramientas y servicios
bioinformáticos aplicados a la proteómica, es muy
difícil conocer todos los recursos disponibles. Muchos de estos proyectos son de software libre [http://
www.ms-utils.org/wiki/pmwiki.php/Main/SoftwareList], y por tanto, disponibles de forma gratuita,
la mayoría de las veces, a través de Internet. La
aparición de la proteómica de segunda generación
y los análisis a gran escala ha permitido los llamados estudios de biología de sistemas, cuyos análisis
serían imposibles de hacer sin herramientas bioinformáticas adecuadas. Por otro lado, es destacable
también el avance en los últimos años de nuevas
técnicas de marcaje isotópico y label-free que permiten realizar estudios de proteómica cuantitativa.
En dichos análisis, es necesario seguir metodologías
estadísticas rigurosas para minimizar la detección de
falsos cambios de expresión. Numerosos grupos de
investigación se resisten a utilizar herramientas no
comerciales, o desconocen la existencia de una alternativa. Otro problema existente relativo al manejo de
los datos en proteómica es el intercambio de dichos
datos entre diferentes plataformas, laboratorios y
herramientas. Es por ello por lo que el desarrollo de
estándares se hace crucial, y es necesario conocer las
herramientas existentes que permiten la conversión
entre los formatos propietarios y los estándares.
Todas estas cuestiones que surgen alrededor de la
proteómica y la bioinformática nos han hecho pensar
que un formato de mesa redonda podría ser ideal en
unas jornadas que pretenden ser un espacio de intercambio de información entre los proteómicos y bioinformáticos españoles. En dicha mesa redonda pretendemos plantear los problemas que más nos preocupan
a los proteómicos y que pueden ser resueltos, al menos
en parte, por medio de recursos bioinformáticos. Por
ello, se realizó una encuesta, cuyos resultados se muestran a continuación (Figura 1), para elegir de entre unos
temas propuestos, los que resultan más interesantes
SDUDODFRPXQLGDGFLHQWt¿FDSURWHyPLFD8QDYH]UHFRpilados los prácticamente 200 votos que se recibieron,
resultaron destacados tres temas principales: herramientas de biología de sistemas, estadística en proteómica cuantitativa y software libre en proteómica.
Figura 1. Número de votaciones obtenidas en la encuesta
con la que se sondearon los temas más interesantes para
la comunidad proteómica española. Los temas propuestos
fueron: “herramientas de biología de sistemas”, “análisis
de resultados en proteómica cuantitativa”, “software libre
en proteómica”, “combinación de motores de búsqueda”,
“estándares en informes de experimentos en proteómica” y
“estándares de formato de datos en proteómica”.
21
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Para la sesión hemos buscado personas con la
VX¿FLHQWH H[SHULHQFLD \ FRQRFLPLHQWRV FRPR SDUD
ser las personas de referencia en el debate sobre
dichos temas:
database) [1], ha participado en estudios de minería
de datos de espectrometría de masas y es participante en el desarrollo de estándares de la iniciativa de
HUPO-PSI [2].
Alberto Medina (CNB-CSIC), pionero de la
proteómica computacional en España, con dilatada
experiencia en temas relacionados con la biología
de sistemas como la búsqueda de anotaciones y los
repositorios de información biológica y proteómica,
así como en temas relacionados con estándares.
Cada uno de ellos realizará una muy pequeña
introducción de los temas propuestos, y seguidamente se aprovechará la mayor parte del tiempo de
la sesión en el intercambio de información entre los
asistentes y nuestros “expertos”.
Alex Campos (PCB), experimentado usuario de
herramientas de software libre aplicadas a la proteómica, así como de estándares y herramientas de
conversión de formato de datos.
Marco Trevisan (CBMSO-CSIC), uno de los
GHVDUUROODGRUHVGHXQVRIWZDUHGHFXDQWL¿FDFLyQGH
uso gratuito para instituciones públicas y conocedor
de los problemas a resolver con la estadística en la
FXDQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDV
Juan Antonio Vizcaíno (EMBL-EBI) integrante
del proyecto PRIDE (35RWHRPLFV ,'(QWL¿FDWLRQV
Creemos que entre los cuatro forman una mesa
muy interesante y esperamos que podamos proporcionar una sesión fructífera para todos.
Referencias
[1]
Vizcaino JA, Cote R, Reisinger F, Foster JM,
Mueller M, Rameseder J, et al. A guide to the
3URWHRPLFV,GHQWL¿FDWLRQV'DWDEDVHSURWHRPLFV
data repository. Proteomics 2009;9:4276-83.
[2]
Orchard S, Hermjakob H y Apweiler R. The
proteomics standards initiative. Proteomics
2003;3:1374-6.
$QHZYHUVDWLOH¿OHWUDQVODWRUIRU3URWHRPLFVVWDQGDUGV
J. Alberto Medina-Aunon1,2, Salvador Martínez-Bartolomé1,2, J. Pablo Albar1,2
1
Proteomics Facility, National Center for Biotechnology (CNB-CSIC), 2Spanish Proteomics Institute
(ProteoRed).
Information derived by proteomics experiments
such as sample preparation and separation, mass
VSHFWURPHWU\SURWHLQLGHQWL¿FDWLRQHWFLVUHSUHsented using different and sometimes incompreKHQVLEOH ¿OH IRUPDWV UHVXOWLQJ QRW YHU\ VXLWDEOH
for daily life. To deal with this problem, several
initiatives have been developed: HUPO-PSI MIAPE
and XML-based formats [1], XML-based repository: PRIDE [2], etc... All of them are contributing
effectively within a Proteomics scope, but some
lacks regarding the translation between some of the
previous schemas are still confusing.
In order to contribute to this situation, we have
developed a new Sun Java application accessible on
the Internet (http://www.proteored.org/). This tool
has been designed using common graphics libraries
and latest XML parsers offering a friendly and easy
LQWHUIDFHDYRLGLQJFRPSOH[FRQ¿JXUDWLRQGLDORJV
Currently, the application is able to manage the
IROORZLQJ¿OHIRUPDWVSURWHRPLFVVWDQGDUGV0,$PE Gel, MS and MSI documents (MS Excel and
XML format), GelML, and PRIDE.
To illustrate this innovative work we realized
two tests, both of them based on the translation
between GelML and MIAPE Gel schemas. Input
¿OHV ZHUH FUHDWLQJ IURP +832 36, 0LFURVRIW
Excel template and 2) ProteoRed MIAPE web site
(www.proteored.org). Both schemas are perfectly
22
complementary: MIAPE Gel presents a lot of information according to protocols, methods and images
and GelML could exchange this information with
other bioinformatics tools. In spite of the fact that
both present a great combination, some problems
appeared during the transformation. For instance,
0,$3(SUHVHQWVDOLQHDOVFKHPDZHOOGH¿QHGSLpeline- whereas GelML is a FUGE based one, dividing the information along several linked sections.
Furthermore, any assumption can be done about the
cardinality of the relationships between both examSOHV)LQDOO\WKHVHLVVXHVPDGHXVWRGH¿QHDVHWRI
FRQ¿JXUDWLRQ¿OHVWRGULYHWKHWUDQVIRUPDWLRQ
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
The described work results a proper correspondence between both formats, allowing a complete translation between MIAPE Gel and GelML schemas.
References
[1]
Martens L, Orchard S, Apweiler R and Hermjakob H. Human proteome organization proteomics standards initiative: data standardization,
a view on developments and policy. Mol Cell
Proteomics 2007; 6: 1666-1667.
[2]
Jones P, Côté RG, Martens L, Quinn AF, Taylor
CF, Derache : +HUPMDNRE H and Apweiler
R. PRIDE: a public repository of protein and
SHSWLGHLGHQWL¿FDWLRQVIRUWKHSURWHRPLFVFRPmunity; Nucl Acid Res. 2006; 34 (Database
issue): D659-D663.
Figure 1. Translation between proteomics standards will
be easier.
Open-source Bioinformatics Solutions for the Analysis of Mass Spectrometrybased Proteomics Data: Pipelines and Quantitation
Alexandre R. Campos
Proteomics Platform, Barcelona Science Park, Barcelona, Spain
The proteomics community has been generating
openly available software framework for systematic
proteomic data analyses and management. Processing
and analysis of proteomics data involves a complex,
PXOWLVWDJHSURFHVVLQFOXGLQJUDZ¿OHSUHSURFHVVLQJ
peptide assignment to MSMS experimental spectra,
SURWHLQ LGHQWL¿FDWLRQ DQG IXUWKHU YDOLGDWLRQ DQG LQ
some cases, MS-based quantitation. Here, I list a
number of freely available and open-source computational tools for the analysis of proteomics data. Par-
ticularly, I focus on available platforms and pipelines,
and software for MS-based quantitation.
1. Platforms and Pipelines for LC-MS and
LC-MS/MS Data Analysis
:LWKWKHDGYHQWRIQHZJHQHUDWLRQRIPDVVVSHFtrometers arose the necessity of developing new
bioinformatics solutions for mining large data sets.
In the past years, we have witnessed a dynamic
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
software development process that embraces various functionalities of data analysis process such
as the preprocessing of MS data, evaluation and
assignment of MS/MS spectra to peptide sequences, comparison and quantitation of multiple LCMS experiments. The burgeoning of proteomics
data has fostered the development of a number of
public domain proteomics pipelines that integrate
a number of open-source, cross-platform tools providing a pluggable development framework for the
SURWHRPLFVVFLHQWL¿FFRPPXQLW\,QWKHIROORZLQJ
VHFWLRQV,EULHÀ\JRRYHUVRPHRIWKHVHSURMHFWV
7KH7UDQV3URWHRPLF3LSHOLQH733http://
tools.proteomecenter.org/software.php
The TPP is a collection of integrated tools for
LC-MS/MS data analysis, developed at the Seattle
Proteome Center (SPC). The suite includes tools
for conversion of instrument vendor’s raw data to
mzXML or mzML formats; conversion of spectral
search engine (Mascot, X!Tandem, Sequest, Phenyx,
OMSSA) results to pepXML format; and statistical
validation of search engine results at the peptide- and
protein-level with PeptideProphet and ProteinProphet, respectively (and iProphet to combine multiple
search results). TPP also supports quantitation analysis for MS1 and MS2 labeling techniques.
&3$6 KWWSVZZZODENH\RUJSURMHFW
home/begin.view
The Computational Proteomics Analysis System (CPAS) is implemented as a Tomcat web-based
application for mining LC-MS/MS proteomic experiments. CPAS is distributed with X!Tandem search
engine and the PeptideProphet and ProteinProphet
validation tools; in addition, it can be also used with
other search engines, including Mascot and Sequest.
7KH0606DQDO\WLFPRGXOHHQDEOHVXVHUVWR¿OWHU
sort, customize, compare, and export experiment
UXQV&3$6FDQDOVREHFRQ¿JXUHGWRSHUIRUP4RU
XPRESS quantitation analyses. In contrast to TPP,
CPAS helps manage information about biological
samples and preparation protocols.
4. TOPP - OpenMS Proteomics Pipeline
http://open-ms.sourceforge.net/TOPP.php
TOPP is a customizable collection of several
small applications, based on OpenMS, an open-
23
source C++ library for LC-MS data management and
analysis. The individual applications of TOPP can
be grouped into several distinct packages: import/
H[SRUWVLJQDOSURFHVVLQJLGHQWL¿FDWLRQTXDQWLWDWLRQ
and analysis. Importing data into TOPP is handled
with the FileConverter, which converts several commonly used MS formats into each other. Supported
formats are mzML, mzData, mzXML, among other
formats. TOPP shares most of the features provided
by other pipelines; in addition, TOPP provides a set
of computational tools for signal preprocessing (e.g.,
denoising, baseline correction, and smoothing), and
processing (e.g., peak picking, deisotoping, centroiding, and feature extraction).
3URWHLRV6RIWZDUH(QYLURQPHQW3UR6(
http://www.proteios.org/
ProSE was initially created as a repository for
proteomics data, and just recently has been extended to automate some data assembly and reporting.
3UR6(UXQVRQ7RPFDWVHUYHUDQGSURYLGHVD:HE
LQWHUIDFHIRUGDWDDFFHVVDQGDQDO\VLV:KDWPDNHV
ProSE different from other platforms is the availability of a programming interface for method developers to write extensions and plug-ins. Extensions
and plug-ins make ProSE a highly customizable platform. One can for instance carry out batch searches
LQ 2066$ DQG ;7DQGHP YLD WKH :HE LQWHUIDFH
and then automatically upload the results to ProSE.
In addition, data can be extracted into dedicated database tables for further work with the results, such
DV ¿OWHULQJ SURWHLQ LQIHUHQFH DQG FRPELQDWLRQ RI
search results.
6. Software for Analysis of MS-based Quantitative Proteomics Data
In the past years, MS-based quantitation has
emerged as a promising core technology for proWHRPLFVSUR¿OLQJ-DIIHHWDO>@KDYHFODVVL¿HGWKH
available MS platforms for quantitative proteomics
into three categories: 1) identity-based methods that
rely on peptide analysis by data-dependent LC-MS/
06DQGSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQE\GDWDEDVHVHDUFKLQJ
2) pattern-only methods that focus on production of
MS-derived protein patterns, and 3) hybrid identity/pattern-based methods use pattern recognition
algorithms to ex post facto assign the identity of
LC-MS peaks against databases of peptide sequence, mass, and retention time built from multiple
24
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Graphical User
Interface?
Operating
System
DTASelect or
pepXML
MS1, MS2 and
Label-free (Id)
Java
Yes
/2:a
MSQuant
Instrument vendor rawe
Mascot results
MS1, MS2 and
Label-free (Id)
.NET
Yes
:LQ
MaxQuant
XCalibur .rawe (high
resolution)
Mascot results
SILAC and labelfree (Id)
.NET
Yes
:LQ
mzXML
pepXML
MS1
C++
Yesb
/2:a
b
XPRESS
Type of
quantitation
Input peptide
LGHQWL¿FDWLRQ
format
MS1/MS2 or mzXML
Input spectra
format
Census
Software
Language
Table 1. Summary of tools for MS-based quantitative proteomics data analysis.
ASAPRatio
mzXML
pepXML
MS1
C++
Yes
/2:a
Multi-Q
mzXML
pepXML
MS2
.NET
Yes
:LQ
iTracker
.mgf or .dta
none
MS2
No
Quant
.mgf
Mascot .dat
MS2
Perl
Matlab or
.NET
/2:a
/2:a
(Matlab)
Libra
mzXML
pepXML
MS2
C++
Yesb
/2:a
APEX
none
pepXML
Label-free (SC)
Java
Yes
/2:a
mzXML
Feature list (e.g.,
msInspect)
pepXML
Label-free (HIP)
C++
No
/2:a
PEPPeR .txt format
Label-free (HIP)
Perl
Yesc
/2:a
SuperHirn
PEPPeR
Yes
msInspect
mzXML
pepXML
Label-free (Id, HIP,
AMT)
Java
Yes
/2:a
IDEAL-Q
mzXML
pepXML
Label-free (HIP)
.NET
Yes
:LQ
msBID
mzXML
pepXML
Label-free (Id)
Java,Perl
No
/2:a
TOPP
mzML
TOPP adapters
MS1, MS2 and
Label-free (Id)
C++
Yes
/2:a
'HFRQ/6¿OHVd or
mzXML
X!Tandem or
Sequest
Label-free (AMT)
.NET
Yes
/2:a
PNNL
pipeline
a The acronym L.O.W. refers to Linux, OSX and Windows
b Using TPP graphical user interface
c Using GenePattern graphical user interface
d 'HFRQ/6¿OHVFDQEHH[WUDFWHGIURPP];0/RUDQXPEHURILQVWUXPHQWYHQGRU¶VUDZIRUPDW
e 7RFRQYHUWLQVWUXPHQWYHQGRU¶VUDZIRUPDWWKHYHQGRU¶V06DQDO\VLVVRIWZDUHPXVWEHLQVWDOOHG
Label-free methods: SC (Spectral Counting); Id (Identity-based); HIP (hybrid identity/pattern-based); and AMT (accurate
mass and time)
MS1: methods based on precursor intensity or area (e.g., 15N, 18O, SILAC)
MS2: methods based on reporter ions in MS/MS (e.g., iTRAQ, TMT)
experiments. As MS-based quantitation remains a
UDSLGO\GHYHORSLQJ¿HOGZLWKPDQ\GLIIHUHQWH[SHrimental approaches, a large number of open-source
(or freely available (academic)) software has been
GHYHORSHG DQG PDGH DYDLODEOH IRU WKH VFLHQWL¿F
community (Table 1).
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3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Java API for MIAPE Generation
Emilio Salazar Donate, Miguel Ángel López García, Salvador Martínez-Bartolomé, J. Alberto
Medina-Aunon, Juan Pablo Albar
ProteoRed, Proteomics Facility, Centro Nacional de Biotecnología (CNB), Consejo Superior de
,QYHVWLJDFLRQHV&LHQWt¿FDV&6,&(0DGULG6SDLQ
The HUPO- PSI (Human Proteome OrganizaWLRQ±3URWHRPLFV6WDQGDUG,QLWLDWLYHDLPVWRGH¿ne community standards for data representation in
proteomics to facilitate data comparison, exchange
DQGYHUL¿FDWLRQ>@
One of these standards is the MIAPE-speci¿FDWLRQV >@ 0,$3( WKH 0LQLPXP ,QIRUPDWLRQ
About a Proteomics Experiment, contains the basic reporting guidelines for proteomics. Although,
these guidelines are an invaluable support for experiments due to its acceptance by the proteomics
UHVHDUFKHUVDQGMRXUQDOVWKHOHYHORIIXO¿OOPHQWIRU
every experiment requires a time consuming duty
from the user side.
The Miape JAVA API (Application Programming Interface) developed by the CNB-ProteoRed
Proteomics Bioinformatics Support group provides the user with a powerful, platform-independent
programmatic interface to store, retrieve and export
MIAPE documents in different formats. The libraries and the documentation are freely available at
www.proteored.org/miape-api
is via the abstract entity Miape, which includes the
information available about the experiment, regardless if it has been generate via XML, manually or
it has been retrieved from the database.
Moreover, the API allows the user to convert
the data from one module to another, favoring the
exchange of information in very different formats.
The modules are:
‡7KHDatabase Manager module: retrieves/stores documents from the ProteoRed Database,
a relational database which has, so far, more
than 700 documents. However, this module
can be easily extended to be used in other
Databases (relational or not).
‡7KHXMLPRGXOHLVDEOHWRSDUVH¿OHVIURP
different XML formats to generate the MIAPE documents.
‡7KHFactory module creates a document manually by programmatically adding the information to the document.
The language of the API is Java, an object-oriented language, massively used in professional and
academia environments due to its maintainability and
ÀH[LELOLW\DVZHOODVLWVSODWIRUPLQGHSHQGHQFH
The aim of the API is to be integrated into third
party software to automatically generate a MIAPE,
decreasing the amount of extra work which this
normally involves. So far, the user must manually
submit this information independently, using the
semi-automatic MIAPE generator tool [3], which
allows the user to create a MIAPE, using templates
with some initial information.
The API is divided in several independent modules, which can be extended for customization,
(see Figure 1). The interaction between the modules
Figure 1. The different modules of the Miape JAVA API and
their interactions.
26
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
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7KH3URWHRPLFV,GHQWL¿FDWLRQVGDWDEDVH35,'(LWVDVVRFLDWHGWRROVDQGWKH
ProteomeXchange consortium
Juan Antonio Vizcaíno, Florian Reisinger, Richard Côté, Henning Hermjakob
(0%/(%,:HOOFRPH7UXVW*HQRPH&DPSXV+LQ[WRQ&DPEULGJH8QLWHG.LQJGRP
Abstract
7KH3URWHRPLFV,GHQWL¿FDWLRQV'DWDEDVH35,DE, http://www.ebi.ac.uk/pride) has become one of
the main repositories of mass spectrometry derived
proteomics data. In this communication we will
summarize the main capabilities of the PRIDE system, including its associated tools. Finally, we will
introduce the ProteomeXchange consortium, as a
collaborative approach to share proteomics data between the most important proteomics repositories.
ebi.ac.uk/olsDQGWKH3URWHLQ,GHQWL¿HU&URVV5Hferencing system [3] (PICR, http://www.ebi.ac.uk/
Tools/picr). OLS provides convenient and powerful
access to a large number of biomedical ontologies
and controlled vocabularies (CVs). PRIDE takes
advantage of OLS to store, structure, and present
any and all metadata annotations on experiments,
proteins, peptides and mass spectra.
7KH35,'(3URWHRPLFV,GHQWL¿FDWLRQVGDWDEDVH
(http://www.ebi.ac.uk/pride) at the European Bioinformatics Institute (EBI) provides users with the
ability to explore and compare mass spectrometry
(MS) based proteomics experiments that reveal details of the protein expression found in a broad range
of taxonomic groups, tissues and disease states [1].
PRIDE stores three different kinds of information:
SHSWLGHDQGSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQVGHULYHGIURP06
or MS/MS experiments, MS and MS/MS mass spectra as peak lists, and any and all associated metadata.
PRIDE is now the recommended submission point
for proteomics data for several journals such as Nature Biotechnology, Nature Methods, Molecular and
Cellular Proteomics, and Proteomics.
The PICR tool on the other hand, is built to overcome one of the most recurrent problems in proteomics: the existence of heterogeneous and changing
LGHQWL¿HUVRUDFFHVVLRQQXPEHUVUHIHUULQJWRWKHVDPH
protein in different databases. PICR is used to map
DOO WKH VXEPLWWHG SURWHLQ LGHQWL¿FDWLRQV LQ 35,'(
to all known accession numbers for those proteins
in the most important protein databases (including
UniProt, IPI, Ensembl and RefSeq, among others).
7KHUHIRUHSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQVLQ35,'(WKDWZHUH
originally derived from different databases, or from
different time points of the same database, thus become fully comparable. In addition to these two established tools, a new application called Database on
Demand [4] (DoD, http://www.ebi.ac.uk/pride/dod)
has recently been added to the PRIDE toolkit. This
tool allows custom sequence databases to be built in
order to optimize the results from search engines for
gel-free proteomics experiments.
1. PRIDE associated tools
2. ProteomeXchange Consortium
PRIDE relies heavily on two additional tools:
the Ontology Lookup Service [2] (OLS, http://www.
One of the reasons why proteomics data sharing
is not a universal fact yet is the heterogeneity of the
27
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
existing proteomics repositories, each repository
having a major focus. This is why the ProteomeXchange consortium was founded [1]. The current
members and the way they interact are represented
in Figure 1. Guidelines for ProteomeXchange subPLVVLRQVDUHEHLQJ¿QDOL]HGhttp://www.proteomexchange.org), and include three mandatory data types
that will have to be included per submission: insWUXPHQW RXWSXW ¿OHV UDZ GDWD SHDN OLVWV DVVRFLDWHGPHWDGDWDDQGSHSWLGHSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQV
A large scale ProteomeXchange pilot submission
has already been performed containing data from
the HUPO Plasma Proteome Project 2 (PPP 2) [5].
Therefore, certain experiments in PRIDE (experiment accession numbers 8172-8544, http://www.
ebi.ac.uk/pride/ppp2_links.doFRQWDLQOLQNVWR¿OHV
stored in the Tranche repository in the “Experiment
View” page. For these experiments, it is therefore already possible to get the original raw data or
VHDUFKHQJLQHRXWSXW¿OHVZKLFKDUHQRWVWRUHGDV
such in the PRIDE system.
Figure 1. 6XPPDU\¿JXUHRIWKH3URWHRPH;FKDQJHFRQVRUWLXPGDWDÀRZ'DWDVXEPLVVLRQVDUHVHQWWRWKHFRQVRUWLXP
via PRIDE or NCBI Peptidome. The ProteomeXchange
partners then ensure data are distributed internally, ultimately giving users the ability to access the data from any
participant database.
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28
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Proteopathogen, una base de datos de proteínas para el estudio de la interacción
Candida albicans – hospedador
Vital Vialás1, Rubén Nogales-Cadenas2, César Nombela1, Alberto Pascual-Montano2, Concha
Gil1,3
1
Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid. 2 Departamento de Arquitectura de Computadores y Automática, Facultad de Ciencias Físicas, Universidad
Complutense de Madrid. 3 8QLGDGGH3URWHyPLFD8&03DUTXH&LHQWt¿FRGH0DGULG)DFXOWDGGH)DUPDFLD
Universidad Complutense de Madrid
Existen en la actualidad repositorios públicos en
la web para el almacenamiento y gestión de datos
SURWHyPLFRVDVtFRPREDVHVGHGDWRVHVSHFt¿FDVGH
hongos. Sin embargo, ninguno de ellos está enfocaGRHVSHFt¿FDPHQWHDOiUHDGHLQYHVWLJDFLyQGHKRQgos patógenos y su interacción con el hospedador y
contiene además datos experimentales proteómicos.
En este contexto presentamos Proteopathogen, una
base de datos orientada a recopilar datos experimentales proteómicos y a facilitar el almacenamiento y
acceso a un amplio rango de información, abarcando
ÀXMRV GH WUDEDMR HQ 3URWHyPLFD GHVGH OD GHVFULSción del experimento que lleva a la preparación de
la muestra hasta los parámetros de espectrometría
GHPDVDV\ORVSpSWLGRVTXHDSR\DQODVLGHQWL¿FDciones. Proteopathogen está actualmente enfocado
hacia Candida albicans y su interacción con macrófagos, sin embargo, datos experimentales relativos
a otras especies de hongos patógenos y células de
mamíferos pueden ser adecuados para la inserción
en la base de datos. Proteopathogen es públicamente
accesible en http://proteopathogen.dacya.ucm.es.
Candida albicans es un hongo patógeno oportunista presente habitualmente en las mucosas humanas. En individuos inmunocomprometidos puede
proliferar excesivamente y provocar candidiasis,
una micosis muy extendida y en ocasiones fatal. En
este sentido, abordar estudios proteómicos sobre
la interacción de Candida con células del sistema
inmune es clave para mejorar nuestra comprensión
del proceso de infección y puede suponer un paso
inicial en investigación básica para el futuro desarrollo de métodos de diagnóstico, vacunas y fármacos antifúngicos.
Respecto a la recopilación de información contenida en Proteopathogen, se han incluido datos correspondientes a tres experimentos. Los dos prime-
ros corresponden a trabajos de interacción Candida
– macrófago [1,2] de los cuales el primero incluye
SURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVGHCandida y el segundo,
38 proteínas de macrófago. El tercer estudio es un
conjunto de experimentos destinados a la extracción
HLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVGHPHPEUDQD\SURWHtnas con anclaje GPI [3] de C. albicans.
Además de la información experimental, y con
el objetivo de proporcionar una visión más amplia
de los datos, se recuperó información relevante de
bases de datos en la web. Se obtuvieron de CGD
>@ LGHQWL¿FDGRUHV VLQyQLPRV RUWyORJRV HQ Saccharomyces cerevisiae, anotaciones de Gene Ontology y anotaciones para las proteínas de Candida,
mientras que en el caso de proteínas de macrófagos
murinos, la información equivalente se obtuvo de
UniProt [5] y de Mouse Genome Database [6]. También se recuperaron de KEGG [7], e información de
estructuras de PDB [8]
En cuanto a la arquitectura de la aplicación,
la estructura básica consiste en una base de datos
MySQL gestionada por la plataforma de desarrollo
web Ruby on Rails que permite crear las tablas y
relaciones entre los datos, manejar las consultas y
mostrar las páginas.
El contexto experimental es tratado en Proteopathogen jerárquicamente, mostrando una aproximación general del estudio, en donde se detallan
DXWRUHV WtWXOR GH OD SXEOLFDFLyQ H LGHQWL¿FDGRU
de PubMed, y dentro de esa descripción general,
los experimentos concretos que dan lugar a las
LGHQWL¿FDFLRQHV
La información sobre una proteína particular se
muestra dividida en secciones (Figura 1). En la sección titulada Protein Basic Information se muestran
el número de acceso de Uniprot, descripción de la
29
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
proteína, especie, evidencia de la existencia, nombre
HVWiQGDUGHOJHQLGHQWL¿FDGRUHVGHEDVHVGHGDWRV
HVSHFt¿FDV GH RUJDQLVPR RUWyORJRV \ VHFXHQFLD
En la sección Experiments se listan aquellos expeULPHQWRV HQ TXH VH KD LGHQWL¿FDGR OD SURWHtQD HQ
particular. Además, y en los casos que las anotaciones estén disponibles, se muestran una o más de las
siguientes secciones: anotaciones de Gene Ontology
con las correspondientes referencias, rutas de KEGG
y CGD, e información estructural de PDB.
En todos los casos, las proteínas aparecen relacionadas con los experimentos a los que pertenecen
de forma que se puede enlazar con la información
UHODWLYD D OD LGHQWL¿FDFLyQ (VWRV GDWRV FRPSUHQden, por una parte parámetros comunes a todas las
SURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVHQFDGDH[SHULPHQWRLQFOXyendo la base de datos de la búsqueda, software de
DQiOLVLVHQ]LPDGHGLJHVWLyQPRGL¿FDFLRQHV¿MDV\
variables y máximo número permitido de cortes no
efectuados. Por otra parte también están presentes
ORVGDWRVTXHVHUH¿HUHQDFDGDLGHQWL¿FDFLyQGRQGH
se muestran la secuencia de los péptidos, su masa
observada y masa teórica y la puntuación.
La interfaz pública de Proteopathogen ofrece
múltiples formas de consultar el contenido. Es posible navegar por la lista de experimentos y visualizar
rápidamente la lista de proteínas pertenecientes a
cada uno de ellos, pero también se puede utilizar el
formulario de búsqueda. Éste acepta varios tipos de
LGHQWL¿FDGRUHV\DGHPiVSHUPLWHUHDOL]DUE~VTXHGDV
por texto libre, recuperando una lista de proteínas
que muestren coincidencias.
Por último, y para mejorar la interactividad con
el usuario, Proteopathogen incluye un formulario
para el envío de datos. Éstos serán revisados por
XQDGPLQLVWUDGRU\XQDYH]YHUL¿FDGRVSRGUiQVHU
incluidos en la base de datos.
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Bioinformatics tools for inferring immune-related functions from proteomic data
Gema Sanz, Ángeles Jiménez, Ángela Moreno, Juan José Garrido
Genómica y Mejora Animal, Departamento de Genética, Universidad de Córdoba, Campus de Rabanales,
14071 Córdoba, Spain
The development of functional genomics technologies has lead to the generation of large amounts
of data that needs to be structured for easier interpretation and full exploitation of the knowledge hidden in huge databases. This is only possible
ZKHQ ZH DSSO\ HI¿FLHQW DQDO\VLV WRROV LQ RUGHU WR
discover new techniques for data storage, querying,
extracting and mining.
In the present study, we use an experimental model of response to infection, based in the exposure of
neutrophils to LPS from Salmonella typhimurium.
Neutrophil activation by LPS involves the production
of reactive oxygen intermediates, release of lipid
mediators and cytokines, adhesion, and phagocytosis.
However, recent studies indicate that a robust transcriptional response, mainly of cytokines, occurs in
neutrophils after LPS stimulation, suggesting that this
LQÀDPPDWRU\FHOOVGRPXFKPRUHWKDQMXVWUHOHDVLQJ
mediators and bactericidal agents [1, 2].
The aim of this study was 2-fold. Firstly,
it was intended to identify novel proteins involved in the swine neutrophils response to LPS by
using a 2-dimensional gel electrophoresis (2-DE)
approach. Despite of the rise of new technologies
in quantitative differential proteomics, 2-DE and
matrix-assisted laser-desorption ionization time of
ÀLJKW PDVV VSHFWURPHWU\ 0$/',72)06 DUH
still the most widespread methods for proteomics
studies [3]. The differences in protein expression
after LPS treatment may lead to the elucidation
RI SURWHLQ IXQFWLRQV RU SDWKZD\V RI LQÀDPPDWRU\
processes, which could be involved in immune response against bacterial pathogens. And secondly, it
used bioinformatics tools such as Ingenuity Pathway
Analysis (IPA, www.ingenuity.com) and Cytoscape
(www.cytoscape.org), to analyze how these altered
proteins interact in a cellular context to perform
certain biological functions.
Figure 1. %LRIXQFWLRQVDQGGLVHDVHVVLJQL¿FDQWO\DOWHUHGWKURXJKWKHWLPHFRXUVH. Differentially expressed proteins were subjected to statistical analysis with a Student´s T-test and those categories with p < 0.05 were listed. The number of proteins in
each category is shown at the right side of the bars.
31
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Blood samples were collected at the slaughterKRXVHIURP¿YH,EHULDQKHDOWK\SLJVDQGQHXWURSKLOV
were isolated with Dextran sedimentation and centrifugation through Ficoll-Paque. For LPS stimulation, the neutrophils were incubated for 6, 9 and 18
hours in presence or absence of 100 ng/ml LPS. Proteins were solubilized and the extracts were pooled
and six replicate 2-DE gels for condition (untreated
cells and treated with LPS) were analysed by 2-DE.
The LPS-induced changes in proteins was subjected
to statistical analysis with a Student’s t test after
FKHFNLQJ QRUPDOLW\ E\ WKH:LONV6KDSLUR WHVW DQG
those spots with p< 0.05 were analyzed by MALDI
TOF-TOF (MS/MS).
The number of differentially expressed proteins
in neutrophils after LPS treatment varied through the
time-course. Up today, 44 and 31 proteins for 6 and 18
KRXUVZHUHLGHQWL¿HGUHVSHFWLYHO\'DWDDQDO\VLVZLWK
IPA revealed that several immune response-related
IXQFWLRQVVXFKDVLQÀDPPDWRU\DQGUHVSLUDWRU\GLVHDse, cellular movement and organization or cell death
were altered during the time-course (Figure 1).
Differentially expressed proteins in each timepoint were subjected to BiNGO plugin of Cytoscape [4] in order to elucidate the relationship among
the altered GO functions through the time course
LQDXQL¿HGFRQFHSWXDOIUDPHZRUN7KHUHVXOWVRI
WKLVDQDO\VLVDUHVKRZQLQ)LJXUH%ULHÀ\LPPXne related functions such as killing and apoptosis
are conserved both at 6 and 18 hours. Similarly,
cellular metabolism was also altered through the
time course.
In conclusion, LPS stimulation alters the patterns
of protein expression in neutrophils, and the present
UHVXOWV UHSUHVHQW WKH ¿UVW FRPSUHKHQVLYH VWXG\ WR
better understanding a complex biological event such
as the swine innate immune response. Bioinformatics
provides many tools for analyzing protein data sets
by visually exploring biological networks, including
well-known examples such as IPA and Cytoscape.
Since these tools can integrate graph drawing, information visualization, network analysis and biology,
we can use them to interpret our results from a proteomic approach in an easy way.
Figure 2. BiNGO analysis for 6 and 18 hours. Nodes represent biological functions categories and edges represent the
LQWHUDFWLRQDPRQJWKHP6WDWLVWLFDOVLJQL¿FDQFHRIHDFKFDWHJRU\LVVKRZQDVJUH\VFDOHZKHUHEODFNLVWKHPRVWVLJQL¿FDQW
function. Node weight indicates the number of interactions.
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2. BIOMARCADORES Y PATOLOGÍAS HUMANAS
Coordinadores: Ángel García y Cristina Ruiz
Protein targets of oxidative stress induced by Huntington disease in human brain
Evaluation of an HD mice model: Tet/HD94
M. Alba Sorolla1, Isidre Ferrer2, José Lucas3 Joaquim Ros1, Elisa Cabiscol1
1
Departament de Ciències Mèdiques Bàsiques, Universitat de Lleida, Spain. 2Institut de Neuropatologia,
Servei d’Anatomia Patològica, IDIBELL-Hospital de Bellvitge, Universitat de Barcelona, Spain. 3Centro de
Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), C/Nicolás Cabrera, 1 Campus Cantoblanco, Universidad
Autónoma de Madrid, Spain.
Huntington disease (HD) is an inherited neurodegenerative disorder characterized by degeneration
of neurons affecting the striatum and the cortex. The
disease involves expansion of CAG trinucleotide
repeats in the huntingtin gene codifying for glutamines in the htt protein [1].
doxal 5-phosphate kinase, potentially leading to a
reduction in PLP availability. PLP is a cofactor of
enzymes involved in neurotransmitter metabolism
(GABA production).
The main goal of this work is to study protein
oxidation in post-mortem tissue samples (striatum) from individuals affected of HD. Moreover,
a conditional HD mouse model is used to evaluate whether similar proteins are affected in these
mice (Tet/HD94) [2]. These mice express a polyQ
sequence of 94 glutamines under the control of a
doxycycline-regulatable promoter and resembles
the human phenotype.
Protein oxidation by reactive oxygen species
can generate carbonyl groups on the side-chain of
several amino acids and these groups can be derivatized by 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) and
GHWHFWHGE\:HVWHUQEORW>@:HSHUIRUPHGD'
gel electrophoresis analysis followed by anti-DNP
:HVWHUQEORWLQRUGHUWRLGHQWLI\R[LGL]HGSURWHLQV
in human brain post-mortem samples obtained from
striatum of HD patients compared to samples of
age and sex-matched controls (Figure 1). A comparison between 8 control-HD pairs was made and
spots that showed a ratio of oxidation level HD/
control > 1.5 (once normalized for protein amount)
ZHUHLGHQWL¿HGE\30)RU06067DEOH7KH
most interesting result was the oxidation of pyri-
Figure 1. Oxyproteome analysis of human samples. Comparative analysis revealed several spots with increased oxidaWLRQOHYHOVLQ+',GHQWL¿FDWLRQZDVSHUIRUPHGDQGSURWHLQV
listed in Table 1.
The results from Tet/HD94 mice show that protein oxidation is increased in HD94 expressing mice
(gene on) in striatum, while no differences are observed in cortex and cerebellum (Fig 2). Also, there
33
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Table 1. ,GHQWL¿FDWLRQRIR[LGL]HGSURWHLQVLQ+'
SPOT
PROTEIN
GENE
ACCESSION
NUMBER
MOLECULAR
0$66'$
1
2
3
112,76
Transitional endoplasmic
UHWLFXOXP$73DVH9&3
VCP
P55072
89322
50,50
5
7,38
+HDWVKRFNFRJQDWHN'D
protein
HSC71
P11142
70898
7
ALDH7A1
P49419
55332
Cytosol aminopeptidase
LAP3
P28838
56131
T-complex protein 1 subunit beta
CCT2
P78371
57452
9
10
ĮHQRODVH
ENO1
P06733
47169
1,79
4,88
13
1*1*GLPHWK\ODUJLQLQH
dimethylaminohydrolase1
14
3\ULGR[DONLQDVH
1,90
DDHA1
O94460
31122
PDXK
O00764
35080
15
16
3,40
5,41
11
12
1,64
2,53
ĮDPLQRDGLSLFVHPLDOGHK\GH
dehydrogenase
8
9,02
423,73
4
6
*OXIDATION
1,82
2,42
47,01
3\UXYDWHNLQDVHLVRHQ]\PHV0
M2
PKM2
P14618
57937
17
15,26
4,86
18
ATP synthase subunit alpha
ATP5A1
P25705
59751
2,32
19
*O\FHUDOGHK\GHSKRVSKDWH
dehydrogenase
GAPDH
P04406
36053
2,28
20
Cytochrome b-c1 complex subunit
2, mitochondrial
UQCRC2
P22695
48413
7,93
CS
O75390
51680
&UHDWLQHNLQDVHXELTXLWRXV
mitochondrial
CKMT1A
P12532
47007
&UHDWLQHNLQDVHVDUFRPHULF
mitochondrial
CKMT2
P17540
47474
Fructose-biphosphate aldolase A
ALDOA
P04075
39395
Citrate synthase, mitochondrial
21
7,51
*The oxidation level is estimated as a ratio between HD and control oxidation signal, divided by the ratio of their protein
amount.
34
is an evident decrease in the pyridoxal 5-phosphate
kinase levels in the HD94 expressing mice (gene
on), that is recovered after 5 months of doxycycline
treatment (gene off), reaching the levels of control
mice. Moreover, this protein seems to be more oxidized in the “gene on” mice (Figure 3).
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
As a conclusion, the human oxyproteome experiments show a clear energetic failure and PLP
metabolism disruption. Moreover, these evidences
are also observed in the mice model, leading to the
hypothesis that possible interventions to increase PLP availability and energy production can be
taken in account.
References
Figure 2. Protein oxidation in Tet/HD94 mice. All mice
were 24 months old. C: control mice; HD: “gene on” mice;
HD+doxy: “gene on” for 19 months + “gene off” for 5
months (doxycycline treatment).
)LJXUH Levels and oxidation of pyridoxal 5-phosphate
NLQDVHLQ7HW+'PLFH$PSOL¿HGVHFWLRQVRIZHVWHUQEORW
anti-PDXK and anti-DNP from 2D gel separation of tissue
extracts from striatum of Tet/HD94 mice.
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35
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
,GHQWL¿FDFLyQPHGLDQWHSURWHyPLFDGHSRVLEOHVELRPDUFDGRUHVSODTXHWDULRVHQ
síndrome coronario agudo
Andrés F. Parguiña1, Isaac Rosa1, Lilián Grigorian-Shamagián2, Elvis Teijeira-Fernández2, Jana
Alonso2, Rosa Agra2, José Ramón González-Juanatey2, Ángel García1
1
Dpto de Farmacología; Universidad de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela. 2Complexo
Hospitalario Universitario de Santiago, Santiago de Compostela
Introducción
La activación plaquetaria y la formación del
trombo juegan un papel fundamental en el síndrome coronario agudo (SCA), principal causa
de muerte en Europa. El SCA es una enfermedad
crónica que se desarrolla durante la vida del individuo a causa de la lenta acumulación de placa de
ateroma en las arterias (aterosclerosis). La placa
de ateroma se va endureciendo poco a poco encerrando en su interior un núcleo lipídico rodeado
SRUXQDFDSDGHQVD\¿EURVDTXHSXHGHGHELOLWDUVH
debido a una serie de razones patológicas y llegar a
romperse dando lugar a la formación de un coágulo. Si este coágulo llega a bloquear las arterias coURQDULDVSXHGHUHGXFLURLQFOXVRLPSHGLUHOÀXMRGH
sangre al corazón (isquemia). Debido a esta falta
de oxígeno en el corazón el paciente, dependiendo
de la gravedad, puede sufrir desde dolor al hacer
ejercicio (angina estable [AE]) hasta una situación
aguda como una angina inestable (AI) o un infarto
de miocardio (IM). Las plaquetas juegan un papel
fundamental en la patogénesis de la aterosclerosis
y el SCA [1]. De hecho, la mayoría de las terapias
existentes para tratar esta enfermedad interrumpen
la activación plaquetaria. Dado que las plaquetas
carecen de núcleo, la proteómica es una herramienta fundamental para su estudio. Por todo ello, el
estudio del proteoma plaquetario en el contexto del
evento agudo podría ayudar a descubrir biomarcadores o dianas terapéuticas que contribuyan a un
mejor tratamiento/diagnóstico de la enfermedad.
Ese ha sido el objetivo del presente trabajo.
Métodos
Basándonos en nuestra experiencia en proteómica de plaquetas [2-5], hemos utilizado la 2-DE para
comparar el proteoma de 18 pacientes con síndrome
coronario agudo sin elevación del segmento ST en
el electrocardiograma (SCASEST) frente al de un
grupo control constituido por 10 individuos con
cardiopatía isquémica crónica estable. La toma de
muestra de los pacientes con SCASEST se hizo en
tres puntos: al ingreso (menos de 24 horas desde el
inicio del evento agudo), a los 5 días y a los 6 meses.
Los grupos se cotejaron de manera que no hubiese
GLIHUHQFLDVVLJQL¿FDWLYDVHQHGDGVH[R\WUDWDPLHQtos. Las plaquetas se procesaron en menos de dos
horas tras la extracción sanguínea. Tras extraer las
proteínas, éstas se separaron mediante electroforesis
bidimensional (2-DE). La primera dimensión fue en
tiras de gradiente inmovilizado de pH (4-7, 24 cm).
Se escogió esa franja de pI porque análisis anteriores que hemos llevado a cabo han demostrado que la
mayor parte de las proteínas plaquetarias detectables
mediante 2-DE se encuentran en dicha región del
proteoma [2]. La segunda dimensión fue en geles del
10% de poliacrilamida. Los geles fueron teñidos con
SYPRO Ruby, y escaneados en un Typhoon 9410
(GE Healthcare). Las imágenes fueron analizadas
utilizando el software Ludesi REDFIN (Suecia).
Resultados
En cada gel se detectaron más de 2300 spots.
Tras el análisis diferencial, se detectaron 55 spots
correspondientes a proteínas que variaban entre los
grupos SCASEST y control (p<0.05 y variaciones
GHLQWHQVLGDG!)LJXUD/DVSURWHtQDVLGHQWL¿cadas mediante espectrometría de masas (MALDITOF/TOF), correspondían a 30 genes diferentes. Los
resultados fueron validados mediante western blot.
/DPD\RUtDGHODVSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVSHUWHQHFHQ
a 3 grupos funcionales: señalización, citoesqueleto
y ruta de secreción/vesículas. Esto concuerda con la
idea de que existe una mayor activación plaquetaria
en pacientes con SCASEST y fue respaldado por la
disminución del número de diferencias en el día 5
tras el ingreso (26 spots diferentes) y a los 6 meses
36
(2 spots diferentes). Algunas de las proteínas identi¿FDGDVHVWiQLQYROXFUDGDVHQODUXWDGHVHxDOL]DFLyQ
GHODLQWHJULQDĮ,,EȕTXHHVXQRGHORVSULQFLSDOHV
responsables del proceso de activación plaquetaria.
Es el caso de ILK, Src y talin. En la mayoría de los
FDVRVODVGLIHUHQFLDVVHGHELHURQDPRGL¿FDFLRQHV
post-traduccionales. También se detectó una menor
presencia de proteínas secretadas en pacientes SCASEST lo que podría deberse al proceso de secreción
que sufren las plaquetas tras activarse. Se observó
como la tendencia era que estas últimas proteínas
estuviesen en mayor cantidad en el plasma pobre en
plaquetas de los pacientes SCASEST.
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Agradecimientos
AG es investigador Ramón y Cajal del Dpto
de Farmacología de la Universidad de Santiago de
Compostela; AFP es becario FPI del mismo deparWDPHQWR/RVDXWRUHVDJUDGHFHQOD¿QDQFLDFLyQGHO
Ministerio de Ciencia e Innovación de España (ref.
SAF2007-61773), la Consellería de Educación de
la Xunta de Galicia y la Fundación de Investigación
Médica Mutua Madrileña.
Bibliografía
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phosphorylation of Dok-1 and Dok-3 leading to
SHIP-1 interactions. Journal of thrombosis and
haemostasis 2009;7:1718-26.
Figura 1. Imagen representativa del proteoma de plaquetas
resaltando los 55 spots que varían entre pacientes SCASEST
y controles crónicos.
Conclusión
Se ha empleado satisfactoriamente la proteómica
GHSODTXHWDVEDVDGDHQ'(SDUDLGHQWL¿FDUSURteínas –provenientes de 30 genes diferentes– que varían entre pacientes SCASEST y controles crónicos.
En próximos estudios investigaremos el papel de las
SURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVHQODSDWR¿VLRORJtDGHO6&$\
exploraremos su uso potencial como biomarcadores
para el tratamiento y/o prognosis de la enfermedad.
37
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Análisis de la expresión diferencial de proteínas en el suero de ratones C57BL/6
VLOYHVWUHVUHVSHFWRDUDWRQHV&%/GH¿FLHQWHVSDUD&'XWLOL]DQGRXQDFROHFFLyQFRPELQDWRULDGHKH[DSpSWLGRVProteoMiner\HOHFWURIRUHVLV'
Antonio Rosal, Sonia García-Rodríguez, Esther Zumaquero, Pilar Navarro, Mercedes Zubiaur,
Jaime Sancho
Departamento de Biología Celular e Inmunología, Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”,
CSIC, Armilla (Granada)
Introducción
La tecnología asociada al ProteoMiner permite
reducir el rango dinámico del proteoma sérico aumentando la concentración de las proteínas poco
abundantes y diminuyendo simultáneamente la concentración de las proteínas más abundantes, consiguiéndose una mayor diversidad de especies proteicas. Una desventaja es que en su formato tradicional
se necesita partir de una concentración de proteínas
relativamente grande, impidiendo su utilización
cuando el material de partida es escaso. En este
estudio se ha utilizado esta técnica en combinación
con la separación de proteínas por electroforesis en
JHOHV'y'HLGHQWL¿FDFLyQSRUHVSHFWURPHWUtD
de masas, para el análisis de la expresión diferencial de proteínas en sueros de ratones B6 silvestres
HQFRPSDUDFLyQFRQUDWRQHVGH¿FLHQWHVSDUD&'
(CD38ko) a partir de volúmenes de sangre relativamente pequeños (100-200 µl).
Material y métodos
El kit ProteoMiner de pequeña capacidad para
análisis por geles 2-D (Bio-Rad) fue utilizado
siguiendo las instrucciones del fabricante. Las
proteínas eluidas de las columnas de hexapéptidos se separaron en geles 1-D (30 µg) o 2-D (50
µg). Para la separación en geles 2-D se utilizó
el sistema Protean IEF (Bio-Rad) en la primera
dimensión y el sistema CRITERION (Bio-Rad)
en la segunda (1). Para la primera dimensión se
compararon dos soluciones diferentes: Solución
I (7M Urea, 2 M Thiourea, 1% ASB-14, 40 mM
Tris, 2 mM TBP y 0.2% Anfolitos) o Solución
II (8 M Urea, 2% CHAPS, 50 mM DTT, 2 mM
TBP y 0.2% Anfolitos). Los geles se tiñeron con
6<3525XE\/DLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVSRU
MS o MS/MS se realizó de forma idéntica a la de
nuestro trabajo previo [1]. El análisis diferencial
se realizó utilizando el software PDQuest Advanced versión 8.0.1.
Resultados
A partir de volúmenes relativamente de suero
relativamente pequeños (200 µl o 10 mg de proteína
total) se obtenía un rendimiento de alrededor del
FRQVX¿FLHQWHFDQWLGDGGHSURWHtQDSDUDDQiOLsis posteriores por 2-D tradicional o 2-D DIGE (la
presencia de Urea y CHAPS en el buffer de eluido
permite la utilización de la técnica 2-D DIGE si
previamente se ajusta el pH a 8.0-8.5 con 1 M Tris).
(OSHU¿OGHEDQGDVREWHQLGDVHQJHOHV'RHOGH
spots en geles 2-D de los eluidos del ProteoMiner
eran claramente diferentes del de los sueros sin fraccionar o de las proteínas no unidas a las columnas,
aunque proteínas mayoritarias como albúmina o
las inmunoglobulinas eran todavía detectables. La
solución II es superior a la solución I en cuanto
al número, la resolución y la calidad de los spots
REWHQLGRVDVtFRPRVXSRVWHULRULGHQWL¿FDFLyQSRU
HVSHFWURPHWUtDGHPDVDV6HLGHQWL¿FDURQSURWHtQDV
séricas que están en un rango de concentración que
va desde µg/L hasta g/L, lo que demuestra que esta
tecnología permite detectar proteínas presentes en
un amplio rango dinámico de concentración.
Conclusiones
La utilización del ProteoMiner en combinación
FRQJHOHV'WLQFLyQFRQ6<3525XE\HLGHQWL¿cación de las proteínas por MS y posterior secuenFLDFLyQGHSpSWLGRVHVSHFt¿FRVSRU0606SHUPLWH LGHQWL¿FDU XQ PD\RU Q~PHUR GH SURWHtQDV SRFR
abundantes, pero reteniendo una representación de
todas las proteínas de partida en sueros de ratón.
38
La utilización de volúmenes reducidos de suero o
plasma (100-200 µl) no es un impedimento para un
análisis diferencial de expresión por técnicas 2-D
DIGE, SELDI-TOF o LC-MS.
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Referencias
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Developing MRM Assays for Peptide Quantitation: The MIDASTMZRUNÀRZDQG
QtrapTM technology
Antonio Serna Sanz
Applied Biosystems
,Q WKH ¿HOG RI SURWHRPLFV PRVW RI WKH LQIRUmation needed on biological samples of interest
extends beyond just the identity of the protein.
2QFH WKH SURWHLQ LGHQWL¿FDWLRQ LV PDGH IURP D
variety of MS and orthogonal experiments, a more
in-depth study is necessary to characterize isoIRUPVVLWHVRISRVWWUDQVODWLRQDOPRGL¿FDWLRQRU
even sites of cleavage after activation or secretion.
Additionally, constructing methods to determine
WKHSUHVHQFHRIDVSHFL¿FSURWHLQRUSHSWLGHLQD
complex mixture is of greater importance as the
¿HOGRIELRPDUNHUGLVFRYHU\DQGYDOLGDWLRQJURZV
Robust and sensitive techniques for this targeted
discovery and characterization of peptides and
proteins are necessary.
The information known about the sample, such
as the protein sequence or a hypothesized postWUDQVODWLRQDO PRGL¿FDWLRQ DOORZV PRUH VSHFL¿F
questions to be addressed. Normal information
dependent acquisition techniques will not always
detect the components of interest if they are of low
abundance, or are poorly amenable to MS analysis.
A more hypothesis-driven acquisition approach
is
TM
often more effective such as the MIDAS worNÀRZ)LJXUHDQG7KHXWLOLW\DQGSRZHURIWKLV
approach is explored here.
Figure 1. Schematic of the Multiple Reaction Monitoring (MRM) scan for high selectivity and sensitivity. Q1 is set to transmit only the parent m/z of the peptide , the collision energy is optimized to produce a diagnostic charged fragment of this
peptide in Q2, and Q3 is set to transmit this diagnostic fragment only. Because of the short dwell times required (10-50 ms)
and the ability to change rapidly between MRM transitions, many components (transitions) in a mixture can be monitored
simultaneously in a single LC/MS/MS run.
39
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
TM
1. Key Features of the MIDAS WorNÀRZRQWKH475$3TM and 5500 Q
TRAPTM Systems
‡([WUHPHO\KLJKVHOHFWLYLW\DQGVHQVLWLYLW\IRU
detecting peptides in complex mixtures.
is detected by MRM, an Enhanced Resolution (ER)
scan can be performed to obtain accurate charge and
m/z information, and then MS/MS is performed. In
many cases the detection of an MRM transition can
EHVXI¿FLHQWIRUFRQ¿UPDWLRQEXWWKH0606GDWD
can provide additional validation of identity.
‡+LJKVHQVLWLYLW\DQGKLJKTXDOLW\0606IRU
FRQ¿UPDWLRQRISHSWLGHVHTXHQFH
‡ 0XOWLSOH 5HDFWLRQ 0RQLWRULQJ 050 FDQ
provide quantitative information between samples.
Figure 2: Creating a reliable MRM-based method for peptide
quantitation is an iterative procedure that takes input from
various sources. Choosing which peptides, and then which
fragment ions, can be based on either 1 previously acquired
MS/MS data or from 2 non-MS based techniques and peptide fragmentation prediction. The next step is to 3 create an
LQVWUXPHQW VSHFL¿F PHWKRG 050WULJJHUHG 0606 PHWKRG
RWKHUZLVHNQRZQDVD0,'$6:RUNÀRZPHWKRGDQGWKHQXVH
this method to 4 acquire data. The selected MRM transitions
are then 5 evaluated for their suitability for quantitative measurements (i.e.signal/noise, intensity, etc.) and the MS/MS is evaOXDWHGIRUKRZZHOOLWFRQ¿UPVWKHSHSWLGH,'7KLVSURFHVVLV
6 repeated until 7 a set of MRM transitions are generated that
reliably identify the peptides and can be used for quantitation.
TM
2. The MIDAS
:RUNÀRZ
Typically in an information dependent acquisition (IDA), peaks are selected from full scan MS
data, and are then used for dependent MS/MS experiments. The MRM scan can also be used as surYH\ VFDQ ZKLFK HQDEOHV WKH XVHU WR LQÀXHQFH WKH
choice of precursor ion selection for MS/MS. In
combination with ab initio prediction of theoretiFDOIUDJPHQWVDQGPRGL¿FDWLRQVRILQWHUHVW050
driven IDA provides all of the advantages of MRM
sensitivity, S/N gains, and high selectivity, with full
VFDQ 0606 GDWD IRU FRQ¿UPDWLRQ DQG HYHQ GDtabase searching. Figure 3 highlights the general
schema utilized in these experiments. Since each
MRM transition is rapid, many of these can be combined in a single survey scan spanning hundreds of
SRWHQWLDO SHSWLGHV DQG PRGL¿FDWLRQV$IWHU D SHDN
)LJXUH. MRM
Initiated Detection and Sequencing using
TM
the MIDAS :RUNÀRZ7KHVHQVLWLYLW\DQGVSHFL¿FLW\RIDQ
MRM scan can be used as a survey scan for Information
'HSHQGHQW$FTXLVLWLRQ,'$WRµGLJGHHSHU¶LQWRDELRORgical sample. The MRM scan detects the peptide at high
VHQVLWLYLW\DQGWULJJHUVDIXOOVFDQ0606IRUFRQ¿UPDWLRQ
of peptide identity.
TM
3. Applications of the MIDAS
:RUNÀRZ
‡7DUJHWLQJORZOHYHOSKRVSKRU\ODWLRQVLWHVRQ
DSURWHLQRINQRZQVHTXHQFHWRLGHQWLI\RUFRQ¿UP
PRGL¿FDWLRQORFDWLRQ
‡9DOLGDWLQJZHDNSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQVE\VSHFL¿FDOO\REWDLQLQJPRUH0606RQDGGLWLRQDOSHSWLdes for that protein
‡ 'HWHFWLRQ RI ORZ OHYHO SURWHLQV LQ FRPSOH[
mixtures
‡4XDQWLWDWLRQRISURWHLQVSHSWLGHVZLWKDFFRPSDQ\LQJ0606IRULGHQWLW\FRQ¿UPDWLRQ
Conclusions
The unique hybrid nature of the triple quadrupoles linear ion traps 4000 Q TRAP® and 5500 Q
TRAP® systems allow for targeted powerful worNÀRZV&RPELQLQJWKHVSHFL¿FLW\DQGVHQVLWLYLW\RI
Multiple Reaction Monitoring (MRM) with the high
quality MS/MS allows for the targeted discovery of
SHSWLGHVDQGSRVWWUDQVODWLRQDOPRGL¿FDWLRQV*RRG
MS/MS can be obtained on peptides at extremely
low amounts on column (1 amol), easily track.
40
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Intelligent Use of Retention Time for Higher Order Multiple Reaction Monitoring
Multiplexing – Scheduled MRM™ Algorithm
Antonio Serna Sanz
Applied Biosystems
The utility of Multiple Reaction Monitoring
(MRM) on triple quadrupole based MS systems
for biomarker verification/validation studies is
currently an active area of investigation, driven
by the well known sensitivity and selectivity attributes of this type of MS approach. As more
extensive protein panels need to be monitored
in a targeted way across multiple samples, higher MRM multiplexing is becoming essential for
throughput. The challenges of assay development and running these large scale studies are
becoming better understood, the need for rapid
assay development, the need for higher multiplexing and the need for more robust assays are
some of the key challenges.
In this work, the unique combination of triple
quadrupole and ion trapping capabilities of the hybrid
triple quadrupole - linear ion trap mass spectrometer
(QTRAP® System) has been utilized to create 100s
RIKLJKTXDOLW\VSHFL¿F050WUDQVLWLRQVIRUPXOWLSOH
peptides to many plasma proteins. Iterative analysis
SURYLGHGUDSLGUH¿QHPHQWRI050SDUDPHWHUVZLthout requiring synthetic peptides. Intelligent use of
retention time using new acquisition software enables
many more MRM transitions to be included in a
single acquisition method, while maintaining good
peak area reproducibility. The analytical reproducibility of the MRM method developed was found to
be extremely high, even in plasma, with the majority
of peptides being measured with %CV<10.
Obesidómica: caracterización del secretoma del tejido adiposo de diferentes
localizaciones anatómicas
Arturo Roca-Rivada1,2,3; Jana Alonso 4; Omar Al-Massadi1,2,3; Luisa María Seoane1,2, Felipe
Casanueva1,2,3, María Pardo1,2
1
Ciber Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición; 2Laboratorio de Endocrinología Molecular y Celular,
Complexo Hospitalario Universitario de Santiago (CHUS/SERGAS); 3 Departamento de Medicina (Universidade de Santiago de Compostela); 4 Laboratorio de proteómica, Instituto de Investigaciones Biómédicas
(CHUS/SERGAS)
En los últimos años el tejido adiposo ha pasado
de considerarse un órgano inerte con función exclusiva de almacén y movilización de ácidos grasos a
FDOL¿FDUVHFRPRHOyUJDQRHQGRFULQRPiVJUDQGH\
dinámico del cuerpo. Desde el descubrimiento de la
leptina como principal hormona reguladora secretada por el tejido adiposo, han ido surgiendo más
moléculas llamadas adipokinas, implicadas en diferentes aspectos de la regulación del metabolismo.
Sin embargo, las adipokinas descubiertas hasta ahora no llegan a explicar convincentemente los complejos mecanismos reguladores de la homeostasis
energética ni el desarrollo de los procesos asociados
a la obesidad u otros desórdenes alimentarios. Bajo
41
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
este contexto es necesaria la búsqueda de nuevas
señales secretadas por este órgano para una mejor
comprensión de su funcionamiento [1].
del secretoma de grasa visceral, 87 de subcutánea
y 91 de gonadal.
Hace tan solo unos pocos años que se empezó a
aplicar las técnicas proteómicas al estudio del tejido
DGLSRVRVLQHPEDUJRGHELGRDGLYHUVDVGL¿FXOWDGHV
técnicas innatas a la naturaleza de este tejido, se ha
avanzado poco comparado con estudios similares
para otro tipo de tejidos. Los estudios sobre la secreción del tejido adiposo son recientes y escasos y
hasta la fecha no se ha realizado un estudio comparativo entre los secretomas de los distintos tipos de
depósitos grasos [1].
Objetivos
1. Optimización y puesta a punto de las técnicas de proteómica para aplicar al estudio de tejido
adiposo procedente de distintos depósitos grasos;
2. Realización de un mapa de referencia de la secreción de tejido adiposo visceral, subcutáneo y
JRQDGDO,GHQWL¿FDFLyQ\FDUDFWHUL]DFLyQGHSURWHtQDV VHFUHWDGDV HVSHFt¿FDV GH FDGD WHMLGR JUDVR
4. Estudio diferencial de los secretomas de los tres
GHSyVLWRVJUDVRVHQGLIHUHQWHVHVWDGRV¿VLROyJLFRV
y nutricionales (ad libitum, ejercicio, anorexia y
REHVLGDG 9DOLGDFLyQ \ HVWXGLR ¿VLROyJLFR GH
SURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVGHLQWHUpV
Métodos
Se ha usado como modelo experimental ratas
macho Sprague Dawley en condiciones ad libitum
para la realización de los mapas de referencia. Los
explantes de tejido adiposo se incubaron in vitro y
los secretomas resultantes se concentraron y precipitaron para ser sometidos a electroforesis bidimensional y espectrometría de masas (MALDI-TOF/
72)/DVSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVVHKDQFDUDFWHUL]DGR\FODVL¿FDGRVHJ~QODEDVHGHGDWRV8QL3URW\
el software del servidor SecretomeP 2.0 atendiendo
a la presencia/ausencia de péptido señal (SignalP) o
su adherencia a una ruta de secreción no clásica. El
estudio de expresión diferencial se está realizando
con el software Ludesi REDFIN 3, Sweden.
Resultados
Hemos completado los tres primeros objetivos
H LGHQWL¿FDGR XQ WRWDO GH SURWHtQDV GLIHUHQWHV
Figura 1. Proteínas comunes secretadas por los tres depósitos grasos. Localización en el secretoma de grasa visceral
El 58% de las proteínas de grasa visceral correspondieron a proteínas secretadas, el 54% en subcutánea y el 45% en gonadal (Tabla 1 y 2). Se han
detectado adipokinas clásicas como la adiponectina
y el retinol-binding protein 4, así como proteínas
todavía no asociadas a este tejido que están siendo
validadas.
Conclusiones
El análisis de los secretomas de tejido adiposo
muestra patrones de secreción diferente dependiendo de la localización anatómica en condiciones ad
libitum (Tabla 2). También se muestra la utilidad de
OD SURWHyPLFD SDUD OD LGHQWL¿FDFLyQ GH DGLSRNLQDV
ya conocidas implicadas en diversos procesos metabólicos, así como de proteínas con funciones no tan
conocidas en este tejido. El siguiente paso será hacer
un estudio diferencial bajo diferentes condiciones
¿VLROyJLFDV
42
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Tabla1. &ODVL¿FDFLyQGHODVSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVSRU0$/',72)72)GHORVWHMLGRVDGLSRVRVYLVFHUDOVXEFXWiQHR\
gonadal según los criterios: Proteínas totales, tipo de secreción y proteínas comunes entre los tres depósitos grasos.
3URWHtQDVLGHQWL¿FDGDVWRWDOHV
Visceral
Subcutánea
Gonadal
91
Proteínas secretadas totales
109
47
49
SignalP
Ruta de secreción no clásica
Proteínas comunes
27
Proteínas secretadas comunes
15
Tabla 2. 3URWHtQDVVHFUHWDGDVFRPXQHVDORVWUHVGHSyVLWRVJUDVRV'HODVSURWHtQDVVHFUHWDGDVHLGHQWL¿FDGDVSRU
MALDI-TOF/TOF sólo 15 son comunes a los tres tipos de depósitos grasos.
Nº Spot
Secretome P2.0
Nombre Proteína
Nº Acceso
1
SignalP
N'DJOXFRVHUHJXODWHGSURWHLQ
*53B5$7
2
SignalP
Serum albumin
$/%8B5$7
SignalP
Calreticulin
&$/5B5$7
4
Alpha-enolase
(12$B5$7
5
Gamma-enolase
(12*B5$7
6
SignalP
Guanine deaminase
*8$'B5$7
7
0.512
Actin, gamma-enteric smooth muscle
$&7+B5$7
SignalP
Cathepsin D
&$7'B5$7
9
SignalP
3URWHLQGLVXO¿GHLVRPHUDVH
3',$B5$7
10
0.575
L-lactate dehydrogenase A chain
/'+$B5$7
11
0.797
Fatty acid-binding protein, adipocyte
)$%3B5$7
12
SignalP
Transthyretin
77+<B5$7
Thioredoxin
7+,2B5$7
14
Ubiquitin
8%,4B&5,*5
15
SignalP
Serotransferrin
75)(B5$7
Agradecimientos
Referencias
CIBERobn (ISCIII), FIS (ISCIII), Merk-Serono
y Fundación MM. A.R. está contratado por el programa Lucas Labrada (Xunta de Galicia); L.M.S.
y M.P. son investigadoras del SNS Miguel Servet
(SERGAS/ISCIII).
[1]
Breitling R. Robust signaling networks of the
adipose secretome. Trends in Endocrinol Metab
2009; 20: 1-7.
43
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Top-Down proteomic analysis of CSF proteins from ALS patients
Claudio Diema1, Alex Campos2, Núria Omeñaca1, Eliandre de Oliveira2, Joan Guinovart3, Jacques
Borg4, Marta Vilaseca1
1
Mass Spectrometry Core Facility, 3 Metabolic engineering and diabetes therapy, Institute for Research in
Biomedicine, Barcelona, Spain. 23URWHRPLF3ODWIRUP6FLHQWL¿F7HFKQLFDO6HUYLFHV%DUFHORQD6FLHQFH3DUN
Spain. 4Medical Faculty Jacques Lisfranc, Jean Monnet University, Saint-Étienne, France
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a form
of motor neuron disease. ALS is a progressive, fatal,
neurodegenerative disease caused by the degeneration
of motor neurons, the nerve cells in the central nervous system that control voluntary muscle movement.
Diagnosis is achieved with clinical evaluation, as well
as electromyography and neuroimaging. However, a
VLJQL¿FDQW QXPEHU RI SDWLHQWV DUH PLVGLDJQRVHG RU
diagnosed after a long delay. Therefore, it is crucial
WR ¿QG SRWHQWLDO ELRPDUNHUV WR LPSURYH HDUO\ DQG
reliable diagnosis. Using a Bottom-Up analysis and
LVREDULF TXDQWL¿FDWLRQ RI FHUHEURVSLQDO ÀXLG &6)
IURP$/6SDWLHQWVZHUHFHQWO\LGHQWL¿HGDSDQHORI
differentially expressed proteins (Borg et. al, submitted). In the present study we applied Top-Down proWHRPLFVWRH[DPLQHPRGL¿FDWLRQVRIWKHVHSURWHLQVLQ
&6)VDPSOHV3RVWWUDQVODWLRQDOPRGL¿FDWLRQV370
and various isoforms of targeted proteins from control
and sporadic ALS (SALS) were characterized.
ALS has largely unknown pathogenesis that typically result in death within a few years from diagnosis [1]. There are currently no effective therapies
for ALS. Clinical diagnosis usually takes several
months to complete and the long delay between
symptom onset and diagnosis, limits the possibilities
for effective intervention and clinical trials [2]. The
establishment of protein biomarkers for ALS may
aid an earlier diagnosis, facilitating the search for
effective therapeutic interventions and monitoring
GUXJHI¿FDF\GXULQJFOLQLFDOWULDOV
Our goal was to identify by Top-Down proteomics
PTMs and isoform variants of targeted CSF proteins in
ALS patients and controls, with the aim of using them
DVDGLDJQRVLVWRRO:HIRFXVHGRQSURWHLQVZKLFKZHUH
found differentially expressed in our previous studies
of CSF from ALS patients (Borg et. al, submitted).
In order to achieve this goal, the following workÀRZ ZDV DSSOLHG )LJXUH &6) SURWHLQ VDPSOHV
were precipitated with acetonitrile [3] and submit-
ted to liquid chromatography- mass spectrometry
(LC-MS) analysis. In detail, Top-Down analysis was
performed by online LC-nanoESI-MS coupling on a
/74)78OWUD7KHUPR6FLHQWL¿FZLWKVLPXOWDQHRXV
fraction collection using the Triversa Nanomate (AdYLRQ%LR6FLHQFHV$%LR6XLWHS3KHQ\O:DWHUV
10 µm RPC 2.0 x 75 mm column with a 5-80% ACN
gradient over 60 min (100 µl/min) was used for intact
protein separations. A 1/250 part from the column
eluent was injected directly to the mass spectrometer through the Triversa Nanomate using nanoESI
chip technology (on line LC-nanoESI-MS, dynamic
Top-Down) and the rest of the eluent was fraction
collected in a multi-well plate through the same Nanomate. According to data obtained by dynamic
7RS'RZQWKHVSHFL¿FUHWHQWLRQWLPHVRIP]LRQV
RILQWHUHVWZHUHYLVXDOL]HGDIWHUZDUGVWKHVHVSHFL¿F
fractions containing ions of interest were infused into
the MS from the multi-well plate and analyzed by
static Top-Down. Protein fragments were obtained
by applying CID or ECD and/or IRMPD on selected
intact proteins ions according to our interest of idenWL¿FDWLRQ370VWXGLHV From 500 to 1000 microscan
averaging was necessary to increase signal to noise
ratio (S/N) and obtain informative fragment spectra
from infused fractions. Obtained data was processed
E\3URVLJKW3&7KHUPR6FLHQWL¿F
In this work, we focused mainly in 4 proteins named apolipoprotein A1, cystatin C, ȕ-microglobulin
and ȕ-microglobulin short isoform.
A truncated isoform of apolipoprotein A1 (Apo
A1) was observed in both control and SALS samples. An isoform of -128 a.m.u of this truncated
Apo A1 form was also detected in both samples
and fragment analysis was consistent with K-10
deletion (natural variant; K missing in Marburg/
Munster 2 isoform). Short and major isoforms of
ȕPLFURJOREXOLQ ZHUH HQFRXQWHUHG 6HYHUDO IUDJPHQWV LQGLFDWHG D PRGL¿FDWLRQ RI UHVLGXH DW SR-
44
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Figure 1. :RUNÀRZDSSOLHGIRULGHQWL¿FDWLRQDQGFKDUDFWHUL]DWLRQRISRWHQWLDOELRPDUNHVIRU$/6
sition 22 (pyroglutamic acid formed from Gln), a
glycosylation at Ser4 or Ser2 and a phosphorylation
in the short isoform. Moreover, further analysis of
cystatin C protein showed a truncated isoform, an
oxidation of the Met14 and a phosphorylation. Table
1 summarized PTMs characterized by Top-Down.
Protein samples collected in multi-well plate at retention times of interest were pooled and digested
ZLWKVSHFL¿FHQ]\PH7KHVHSHSWLGHVZHUHDQDO\]HG
DSSO\LQJQDQR/&0606DQGWKHLGHQWL¿HGSURWHLQV
FRQ¿UPHGWKHUHVXOWVREWDLQHGE\7RS'RZQ
The isoform variants and PTMs detected in this
work, showed the potential of Top-Down applied in
ELRPDUNHU¿HOG1HYHUWKHOHVVWKHVHUHVXOWVPXVWEH
validated in order to use them as a diagnosis tool for
ALS using and independent methodology.
Acknowledgements: The authors would like to
acknowledge Michaela Scigelova and Vlad ZabrousNRYIURP7KHUPR6FLHQWL¿FIRUWKHLUDVVLVWDQFH:H
thank Mark Baumert and Kees Vlak from Advion
Biosciences for technical support and advice.
Table 1. Summary of the PTMs characterized by Top-Down methodology.
Protein
ret.
times
Intact mass**
Apo A1
31.2-31.7
30758.93
28061.47
ß-microglobulin
ß-microglobulin
24.8-25.2
27933.43
28061.40
28224.44
28384.48
27933.43
28061.40
28386.63
PTMs
t, -128.09, missing K107 or term Q
truncated Apo A1(t)
t, +162.9, glycation
13871.84
13928.86
13752.83
13871.82
13928.84
11721.78
11721.78
-17.02, pyro-Glu from Q
11801.76
11883.84
11801.76
-17, +79.96 phosphorylation
-17, +162.05, Glc at S2/4
13334.48
13350.56
13413.51
13334.48
13350.56
13413.51
truncated cystatin C (t)
t, +15.99, M(O)
t, +79.96, phosphorylation
13705.91
21.2-21.9
11741.02
(short isoform)
cystatin C
Major isoform detected
control ALS
23.5-24.5
15789.08
13334.56
45
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
References
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Proteomics, 2008: 5: 249-262.
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biomarkers with a multiplex quantitative proWHRPLFSODWIRUPLQFHUHEURVSLQDOÀXLGRISDWLHQWV
with neurodegenerative disorders. J Alzheimers
Dis. 2006; 9:293-348.
Optimum method designed for 2D-DIGE of arterial intima and media isolated
by laser microdissection
Fernando de la Cuesta1, Gloria Álvarez-Llamas1, Irene Zubiri1, Aroa Sanz-Maroto1, Alicia Donado2,
Luis Rodríguez-Padial4, Ángel García-Pinto2, María González-Barderas*5, Fernando Vivanco1,6
1
Department of Immunology. Fundación Jiménez Díaz, Madrid, Spain. 2Cardiac Surgery Unit. Hospital
Gregorio Marañon, Madrid, Spain. 3Department of Pathology. Hospital Virgen de la Salud, Toledo, Spain.
4
Department of Cardiology. Hospital Virgen de la Salud, Toledo, Spain. 5Department of Vascular Physiopathology. Hospital Nacional de Paraplejicos, SESCAM, Toledo, Spain. 6Department of Biochemistry and
Molecular Biology I, Universidad Complutense, Madrid, Spain.
Introduction
Tissue proteomic studies on atherosclerosis
have traditionally focused on whole artery extracts
from biopsy or necropsy origin. Arterial intima and
media layers are both involved in atherosclerotic
development. In the present work, we describe an
optimum method which employs the combination
of Laser Microdissection and Pressure Catapulting (LMPC) and 2D-DIGE saturation labelling
to investigate the human intima and media subproteomes isolated from atherosclerotic (coronary
and aorta) or non-atherosclerotic (preatherosclerotic coronary) arteries.
Methods
Coronary biopsies from patients undergoing
bypass surgery and coronary and aorta necropsies
were immediately washed in saline and freezed embedded with OCT. Intima and media were isolated
by LMPC with a Microbeam System (PALM Microlaser). Several methods for staining (hematoxilin,
cresyl violet), protein extraction and DIGE labelling
were tested in order to achieve the better protocol
for 2-DE analysis of human arterial layers. First of
all, a spin column chromatographic step with Protein Desalting Spin Columns (Pierce) was assayed
in order to minimize negative effects from remaining stain. In addition, different lysis buffers were
WHVWHGWRDVVXUHHI¿FLHQWH[WUDFWLRQRIDUWHULDOOD\HUV
proteome, which is problematic due to highly acidic
P\R¿ODPHQWSURWHLQVDQGSUHVHQFHRIFDOFLXP
Results
Concerning staining methods, both hematoxilin
and cresyl violet were found to negatively affect
protein extraction and IEF. A chromatographic spin
column step prior to saturation DIGE labelling improved substantially 2-DE gels, permitting the use
of both stains for human arterial layers proteomic
analysis. Ethanol solved cresyl violet minimizes
proteases action and facilitates visualization of arterial tissue. For this reasons this stain was chosen for
further analysis. Optimal DIGE labelling conditions
were set at 1nmol TCEP and 2nmol Dye, so that free
dye deleterious effects were minimized. The addition of SDS, and in a higher extend DTT, on lysis
EXIIHUVLJQL¿FDQWO\LQFUHDVHGSURWHLQVROXELOL]DWLRQ
46
particularly on high molecular weight proteins as
visualized on 2-DE gels. Finally, LMPC method
was checked by LC-MS/MS to assure correct layers
LVRODWLRQDQGSURWHLQVZHUHLGHQWL¿HGIURPLQ
solution digested preatherosclerotic coronary intima
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
and media extracts, respectively. Although some
proteins are common between layers, due to similar
FHOOW\SHVSUHVHQWGLIIHUHQWLDOSURWHLQVDUHVSHFL¿F
of contractile phenotype of VSMCs in the media and
proliferative in the intima.
,GHQWL¿FDFLyQGHSpSWLGRVHVSHFt¿FRVGHFiQFHUFRORUUHFWDOPHGLDQWHHOXVRGH
librerías de fagos T7 impresas en microarrays
Ingrid Babel1, Rodrigo Barderas1, Victor Moreno2, Ivan Cristobo1, Gabriel Capellá2, Ignacio Casal1
1
Laboratorio de proteómica funcional. Centro de Investigaciones Biológicas (CIB) Madrid. 2 Instituto Catalán de Oncología (ICO) Barcelona
El cáncer colorrectal (CCR) es el cáncer con
mayor mortalidad en España por su tardía diagnosis.
$FWXDOPHQWH OD KHUUDPLHQWD GH FODVL¿FDFLyQ GHO
&&5FODVL¿FDFLyQGH'XNHVVHEDVDHQREVHUYDciones histopatológicas como pueden ser la invasión
de la capa muscular intestinal, los nódulos linfáticos
adyacentes o la progresión metastática. Aunque se
han realizado diversos estudios genómicos usando
microarrays de DNA no se ha conseguido obtener
XQDPHMRUFODVL¿FDFLyQ>@/DLGHQWL¿FDFLyQGH
proteínas que puedan revelar diferencias en los estadios de diferenciación neoplásica sería muy importante para el conocimiento de la enfermedad, un
mejor diagnostico del CCR y para el descubrimiento
de nuevas dianas terapéuticas. Aunque se han idenWL¿FDGR PXFKDV SURWHtQDV FRPR GLIHUHQFLDOPHQWH
expresadas en CCR utilizando diferentes técnicas
proteómicas [3] hasta ahora se han descrito muy
SRFDVFRPRPDUFDGRUHVH¿FLHQWHVGH&&5
Los autoanticuerpos presentes en el suero de
pacientes con cáncer son biomarcadores indicativos
GHODHQIHUPHGDGSRUTXHODVSURWHtQDVPRGL¿FDGDV
antes o durante la formación del tumor pueden inducir una respuesta inmune una vez liberadas [4-6].
Así, la caracterización de la respuesta inmune en
pacientes con cáncer constituye una nueva alternaWLYDSDUDODLGHQWL¿FDFLyQGHELRPDUFDGRUHVHVSHFt¿FRVGH&&5~WLOHVSDUDVXGLDJQRVLVWHPSUDQD
En este estudio, hemos usado una estrategia proteómica alternativa a los microarrays de proteinas
recombinantes basada en el uso de microarrays de
IDJRV SDUD LGHQWL¿FDU DXWRDQWLFXHUSRV DVRFLDGRV D
CCR. Se construyeron cuatro librerías de fagos que
contenían cDNA de tejido de pacientes con CCR,
que fueron cribadas con sueros de pacientes con
&&5SDUDLGHQWL¿FDUDTXHOORVSpSWLGRVGHVSOHJDGRV
HQODVXSHU¿FLHGHORVIDJRVUHFRQRFLGRVSRUDXWRDQWLFXHUSRV HVSHFt¿FRV GH &&5 6H LPSULPLHURQ XQ
total de 1536 fagos T7 en soportes de nitrocelulosa
y tras su cribado con 15 sueros normales y 15 tumoUDOHVVHLGHQWL¿FDURQIDJRVLQPXQRJpQLFRVTXH
diferenciaban entre pacientes con CCR e individuos
sanos. El punto de corte del False Discovery Rate
se ajustó a 0.22. De los fagos que mostraron mayor
reactividad en pacientes que en sueros control, únicamente 55 fagos presentaron una secuencia única.
/DLQPXQRUHDFWLYLGDGVHYHUL¿FyPHGLDQWH(/,SA utilizando 5 fagos elegidos por su homología
con una proteína conocida. Dichos 5 Fagos contenían secuencias homólogas a MST1, SLC33A1,
SREBF2, SULF1 y GTF2i. MST1 se describió
como una proteína reactiva a autoanticuerpos de
pacientes con CCR en nuestro estudio previo realizado con microarrays de proteínas humanas [7].
Por otra parte, en un análisis de expresión diferencial de genes SULF1 se observó sobreexpresada en
CCR [8]. Mediante ensayo de ELISA utilizando una
colección de 96 sueros, 50 de pacientes con cáncer
colorrectal y 46 de individuos sanos, se obtuvieron
curvas de ROC (Receiver Operating Characteristic)
con áreas debajo de la curva entre 0.57 y 0.63. Sin
embargo, su poder discriminatorio aumentó hasta
XQDHVSHFL¿FLGDG\VHQVLELOLGDGGH\
47
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
respectivamente, con un área debajo de la curva
de 0.81 tras realizar diferentes combinaciones de
marcadores. Además, el uso de la proteína completa
067DXPHQWDEDODHVSHFL¿FLGDGKDVWDXQ
(área debajo de la curva de 0.86). Un estudio de
competición entre MST1 y el fago correspondiente
preincubando el suero con la proteína recombinante
redujo la unión de las IgG al fago MST1 hasta un
40%, indicando que el péptido desplegado en la suSHU¿FLHGHOIDJRHVXQHStWRSRLPPXQRGRPLQDQWHGH
la proteína completa. Por otra parte, mediante western blot se determinó que la presencia de autoanticuerpos correlacionaba con una mayor expresión de
las proteínas en líneas celulares de cáncer de colon
y de muestras tumorales.
(Q UHVXPHQ HQ HVWH WUDEDMR KHPRV YHUL¿FDGR
un panel de péptidos desplegados en fagos que responden a autoanticuerpos de pacientes con CCR y
que poseen capacidad diagnóstica de la enfermedad.
Finalmente, se han encontrado las mismas proteínas
reactivas a autoanticuerpos en diversas estrategias
SURWHyPLFDV OR TXH FRQ¿UPD OD FRQYHQLHQFLD GHO
despliegue de péptidos en Fagos T7 para la idenWL¿FDFLyQ GH ELRPDUFDGRUHV ~WLOHV HQ FOtQLFD SDUD
diagnosis y tratamiento de cáncer colorrectal.
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Soussi T p53 Antibodies in the sera of patients
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Babel I, Barderas R, Díaz-Uriarte R, MartínezTorrecuadrada JL, Sánchez-Carbayo M, Casal JI.
,GHQWL¿FDWLRQRIWXPRUDVVRFLDWHGDXWRDQWLJHQV
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Madoz-Gúrpide J, López-Serra P, MartínezTorrecuadrada JL, Sánchez L, Lombardía L,
Casal JI Proteomics-based validation of genomic
data: applications in colorectal cancer diagnosis.
Mol Cell Proteomics 2006; 5: 1471-83.
Agradecimientos
Rodrigo Barderas, PhD, tiene un contrato postdoctoral de perfeccionamiento del FIS. Este trabajo se ha realizado gracias al Programa de Biotecnología del Ministerio de Educación y Ciencia
BIO2006-07689.
48
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
2D Blue native SDS-PAGE analysis of multiprotein complexes of human
erythrocyte membrane
Irene Zubiri1, Gloria Álvarez-Llamas1, Fernando de la Cuesta1, María González-Barderas2,
Fernando Vivanco1,3
1
Department of Immunology, Fundación Jiménez Díaz,Madrid, Spain.2Department of Vascular
Pathophysiology. Hospital Nacional de Paraplejicos, Toledo, Spain.3 Department of Biochemistry and
Molecular Biology, Universidad Complutense Madrid
Introduction
Results
Patients with chronic kidney disease in haemodialysis present low quality erythrocytes, showing
KLJKHU ULJLGLW\ :H K\SRWKHVL]H WKDW PHPEUDQH
VWUXFWXUHPD\SOD\DUROHLQWKHÀH[LELOLW\RIHU\WURcytes. Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) is an electrophoretic technique
for high resolution separation of membrane protein
complexes in the mass range of 10KDa to 10MDa.
Here we describe a methodology to perform BNPAGE of erythrocyte membrane complexes followed by a second dimension of tricine-SDS page
for isolating and identifying individual proteins
forming these complexes.
Membrane proteins complexes solubilization
was carried out by testing two different detergents
(digitonin and Triton X-100) at various concentrations (0.1-10% and 0.5-2 %, respectively). Solubilization was always performed for 1 h. 4% Digitonin
UHVXOWHGWREHWKHEHVWRSWLRQLQWHUPVRI¿UVWGLPHQsion resolution, as it was the lowest detergent concentration at which the highest number of distinct
bands can be observed without disturbance from the
detergent in excess. Prior to the second dimension,
protein complexes disruption into individual proteins was optimized by treating the strips with SDS/
ҟPHUFDSWRHWKDQRO VROXWLRQ WHVWHG DW YDULRXV FRPSRVLWLRQV 6'6 ҟPHUFDSWRHWKDQRO
12% SDS treatment for 1h prior to load the strip on
the second dimension provided a higher number of
protein spots detected; however, further increase
of SDS amount negatively affected resolution. 1%
ȕPHUFDSWRHWKDQRO ZDV XVHG DV LWV YDULDWLRQ GLG
QRWVKRZDQ\FKDQJHV,GHQWL¿FDWLRQRIHU\WKURF\WH
membrane protein complexes isolated and analyzed by 2D-BN-PAGE is being carried out by mass
spectrometry.
Methods
Erythrocytes were isolated from plasma after
maturation, washed in 5mM Na2HPO4 pH 8, 1mM
EDTA and 0.9% NaCl and lysed in 5mM Na2HPO4
pH 8, 1mM EDTA and 1mM PMSF. Membrane pellets were frozen at -80º C in 50 mM imidazole / HCl
and 10% glycerol (pH 7) or immediately analyzed.
For BN-PAGE, samples were centrifuged and pellets were solubilized in 50 mM sodium chloride, 50
mM imidazole, 2 mM 6- aminohexanoic acid, 1mM
EDTA (pH 7) and the appropriate detergent. After
centrifugation, 5 µl of 5% glycerol and Coomassie
G-250 in a detergent/dye ratio of 8:1 were added to
the supernatant. Membrane complexes were run in
4-13% acrylamide gradient gels. The second dimension was run in 10% tricine-SDS/PAGE and a silver
VWDLQLQJ SURWRFRO ZLWK PRGL¿FDWLRQV ZDV XVHG IRU
tricine gels [1, 2].
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3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
49
5HJXODWLRQ RI HSLWKHOLDOPHVHQFK\PDO WUDQVLWLRQ LQ FRORQ FDQFHU E\ Į
GLK\GUR[\YLWDPLQ'DSURWHRPLFVDSSURDFK
Iván Cristobo1, María Jesús Larriba2, Vivian De los Ríos3, Ingrid Babel1, Rodrigo Barderas1, Alberto Muñoz2, José Ignacio Casal1
1
Functional Proteomics Laboratory, Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de InvestigacioQHV&LHQWt¿FDV0DGULG2 Department of Cancer Biology, Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto
6ROV´&RQVHMR6XSHULRUGH,QYHVWLJDFLRQHV&LHQWt¿FDV8QLYHUVLGDG$XWyQRPDGH0DGULG0DGULG 3 Proteomics and Genomics Facility, Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de Investigaciones
&LHQWt¿FDV0DGULG
Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a
typical feature of cells undergoing proliferation and
it is a fundamental process in the early stages of carcinoma invasion and metastasis [1-3]. It is a process
characterized by loss of cell adhesion, repression of
E-cadherin expression, and increased cell mobility
(Figure 1).
>Į2+'@DQGLWVDQDORJVDVSUHYHQWLYHDQG
WKHUDSHXWLFDQWLFDQFHUDJHQWV>@Į2+'
GUDVWLFDOO\DOWHUVWKHJHQHH[SUHVVLRQSUR¿OHRIPDQ\
cell types, inhibiting the proliferation and promoting
the differentiation to a normal adhesive epithelial
phenotype of human colon cancer cells [6].
In this study we have investigated the regulaWLRQ DQG ELRORJLFDO DFWLYLW\ RI Į2+' LQ
(07 RI FRORQ FDQFHU FHOOV :H SUHVHQW HYLGHQFH
of the direct regulation of a number of proteins by
Į2+'LQFRORQFDQFHUFHOOV
6:$'+ FRORQ FDQFHU FHOOV ZHUH WUHDWHG
ZLWK Į2+' IRU DQG KRXUV 1XFOHDU
extracts of treated and non-treated cells were used
by triplicate for a proteomic analysis. Proteins were
labeled with CyDye Fluor for their subsequent separation by 2D-DIGE. Comparative analysis of protein
expression patterns was performed with Progenesis
6DPH6SRWVDQG/XGHVL5HG¿QVRIWZDUH'LIIHUHQWLDOO\H[SUHVVHGSURWHLQVZHUHLGHQWL¿HGE\PDVVVSHFtrometry (MS) MALDI-TOF/TOF and subsequently
validated by western-blotting.
Figure 1. Epithelial-mesenchymal transition. During EMT
epithelial cells lose polarity and cell-cell contacts, become
migratory, and divide at a faster rate. The cells can intravasate into lymph or blood vessels, allowing their passive
transport to distant organs.
There is an increasing interest in the active viWDPLQ ' PHWDEROLWH ĮGLK\GUR[\YLWDPLQ '
An average of 1600 spots was detected on 2DDIGE gels. A total of 31 and 19 spots were found
to be differentially expressed at 8 hours with Ludesi and Progenesis software (p <0.05; fold-change
>1.2), respectively; and a total of 84 and 71 spots
at 48 hours (p <0.05; fold-change >1.3). A 36%
of overlapping in spot detection was found between the 2 software. By MS and MS/MS were
XQHTXLYRFDOO\LGHQWL¿HGDQGSURWHLQVIURP
treatment at 8 and 48 hours, respectively. These
proteins were mainly involved in DNA and RNA
regulation, affecting cell morphology, cell assembly, cell organization as well as cellular repair. A
50
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
tofori G. A causal role for E-cadherin in the
transition from adenoma to carcinoma. Nature
1998; 392: 190-193.
number of these proteins were further validated by
ZHVWHUQEORWWLQJFRQ¿UPLQJSUHYLRXVUHVXOWV
In summary, we have investigated the regulation
DQGELRORJLFDODFWLYLW\RIĮ2+'LQ(07RI
colon cancer cells. Through the use of proteomics
WRROVZHKDYHLGHQWL¿HGQXPHURXVSURWHLQVZKRVH
H[SUHVVLRQOHYHOVZHUHDOWHUHGZLWKĮ2+'
treatment, and some of them have been further validated. Our results show evidence of the direct role
RIĮ2+'WUHDWPHQWLQ(07LQFRORQFDQFHU
through the transcriptional regulation of a number of
genes mainly related to cell morphology, cell assembly, cell organization as well as cellular repair.
>@
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&RPSUHKHQVLYHSURWHRPLFDQDO\VLVRIKXPDQHQGRPHWULDOÀXLGDVSLUDWH
Juan Casado-Vela1†, Eva Rodriguez-Suarez1†, Ibon Iloro1†, Amagoia Ametzazurra2, Nere Alkorta1,
Juan Antonio García-Velasco3, Roberto Matorras 4,5, Begoña Prieto4,5, Sandra González5, Daniel
Nagore2, Laureano Simón2, Felix Elortza1*
1
Proteomics Unit, CIC bioGUNE, CIBERehd, ProteoRed, Technology Park of Bizkaia, Derio, Spain, 2Proteomika S.L.; Technology Park of Bizkaia. Derio, Spain. 3Instituto Valenciano de Infertilidad, Madrid, Spain.
4
Hospital de Cruces, Barakaldo, Spain. 5Instituto Valenciano de Infertilidad, Bilbao, Spain
Abstract
7KHHQGRPHWULDOÀXLGLVDQRQLQYDVLYHVDPSOH
which contains numerous secreted proteins repreVHQWDWLYH RI HQGRPHWULDO IXQFWLRQ :H VKRZ KHUH
IRUWKH¿UVWWLPHDQLQGHSWKDQDO\VLVRIWKHSURWHLQ
content of the EFA using proteomic techniques [1].
To achieve this objective, three different but complementary strategies were used. First, in solution
digestion followed by reverse phase high-performance liquid chromatography coupled to tandem
mass spectrometry (HPLC-MS/MS); second, protein separation by denaturing one dimensional elec-
trophoresis (SDS-PAGE) followed by HPLC-MS/
MS analysis. Finally, two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE) followed by
MALDI-TOF/TOF analysis. The combination of the
WKUHH VWUDWHJLHV OHG WR WKH VXFFHVVIXO LGHQWL¿FDWLRQ
of 803 different proteins. An extensive description
RIWKHHQGRPHWULDOÀXLGSURWHRPHZLOOKHOSSURYLGH
the basis for a better understanding of a number of
diseases and processes, including endometriosis,
HQGRPHWULDO FDQFHU DQG HPEU\R LPSODQWDWLRQ :H
believe that the thorough catalogue of proteins presented here can serve as a valuable reference for the
study of embryo implantation and for future biomar-
51
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Figure 1. 6FKHPDWLFYLHZRIWKHWKUHHVWUDWHJLHV$%DQG&IROORZHGIRUWKHDQDO\VLVRIHQGRPHWULDOÀXLGDVSLUDWH
ker discovery involved in pathologic alterations of
endometrial function.
Communication
7KH HQGRPHWULDO ÀXLG LV D FRPSOH[ ELRORJLFDO
ÀXLG ZKLFK LV LQ GLUHFW FRQWDFW ZLWK WKH HQGRPHtrial cavity and contains a multitude of proteins and
proteolytic enzymes secreted from the endometrium. Currently the diagnosis of endometrial diseases such as endometriosis is achieved by invasive
methods that often include laparoscopic surgery
XQGHU JHQHUDO DQDHVWKHVLD 7KH HQGRPHWULDO ÀXLG
can be collected by aspiration in a painless manner
using non-invasive methods. Interest in the protein
content of endometrial secretions has gained much
momentum in recent years and has been suggested
to play a key role in the embryo implantation process. Therefore, differential proteomics of the enGRPHWULDOÀXLGDVSLUDWHSURWHRPHFRXOGJLYHDQHZ
insight to understand the mechanisms involved in
the onset of endometrial pathologies and the process
of embryo implantation [2].
:LWKWKHDLPRIDFKLHYLQJDWKRURXJKGHVFULSWLRQRIWKHSURWHRPHRIWKHHQGRPHWULDOÀXLGDVSLUD-
te we used three different methodological strategies
(A, B and C) that combine chromatographic and
gel separation methods, as depicted in Figure 1.
The integrated proteomic approaches used here led,
IRUWKH¿UVWWLPHWRDWKRURXJKLGHQWL¿FDWLRQRIWKH
catalogue of proteins present in EFA.
Figure 2. Venn diagram comparing the number of proteins
LGHQWL¿HG DIWHU WKH DQDO\VLV RI HQGRPHWULDO ÀXLG DVSLUDWH
with the three different strategies (A, B and C).
52
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
embryo implantation
Protein description
Endometriosis / e
ctopic endometrium
endometrial cancer /
vulvar cancer
Table 1. 3URWHLQV LGHQWL¿HG LQ HQGRPHWULDO ÀXLG DVSLUDWH ()$ LQYROYHG LQ HQGRPHWULDO DOWHUDWLRQV RU LQ HPEU\R
implantation.
Matrix metalloproteinase 9
X
Kyama et al. Fertil. Steril. , 89, 301-310.
Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase
X
Kyama et al. Fertil. Steril. , 89, 301-310.
Annexin A1
X
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X
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+HDWVKRFNSURWHLQ
Annexin A2
Peroxiredoxin 2
Apolipoprotein A1
X
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Mucin 1
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Apolipoprotein A-1
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53
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Moesin
Beta-actin
Tubulin beta chain
F-actin capping protein subunit
beta
WD repeat protein 1
+HDWVKRFNSURWHLQEHWD
Rho GDP-dissociation inhibitor 1
and 2
VLJPDDQGJDPPD
Glycodelin
Beta-2-glycoprotein 1
Sialic acid synthase
Alcohol dehydrogenase [NADP+]
Glutathione transferase omega-1
5LERVHSKRVSKDWHS\URSKRVSKRNLnase II
3RO\U&ELQGLQJSURWHLQ
Ferritin heavy chain
X
The three different strategies followed for EFA
DQDO\VLV $ % DQG & OHG WR WKH LGHQWL¿FDWLRQ RI
391, 489 and 191 proteins, respectively (Figure 2).
Combining the three strategies, we successfully
LGHQWL¿HG SURWHLQV7R FRQFOXGH WKH PRVW UHOHYDQW SURWHLQV LGHQWL¿HG LQ ()$ DQG LQYROYHG LQ
endometrial alterations or in embryo implantation
according to the literature are shown in Table 1.
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SNPs approaches
María González1, Raquel Bartolomé1, Jose María Sayagues1, María González1, Ana Laura Moro1,
Elena Andrada1, Sahar Sibani2, Josh LaBaer2, Jacinto García3, Alberto Orfao1, Manuel Fuentes1,2
1
Centro de Investigación del Cáncer. Universidad de Salamanca-CSIC. Salamanca. Spain. 2Harvard
Institute of Proteomics. Harvard Medical School. Boston. USA. 3Departamento Cirugía. Hospital Clínico
Universitario. Salamanca. Spain
Biomarkers, particularly those with strong positive and negative predictive value, have many potential uses in the diagnosis and treatment of cancer,
including monitoring treatment success, indicating
disease progression and detecting early disease.
2QHSRWHQWLDOO\SRZHUIXODSSURDFKWR¿QGLQJELR-
markers is to exploit patients’ own immune systems, which produce humoral responses to cancer
antigens released by their tumors due to alterations
in protein expression, mutation, degradation, or localization. Antibodies to tumor antigens have been
detected as early as several years before the clinical
54
DSSHDUDQFH RI FDQFHU$OWKRXJK WKH VSHFL¿FLW\ IRU
these responses is high, typically only 5-20% of patients demonstrate a response to any given antigen,
which has limited the usefulness of single antigen
responses as biomarkers. The recent development
of protein microarrays may offer an ideal tool for
screening for immune response to tumor antigens.
These arrays offer the advantage that hundreds to
thousands of different proteins can be printed and
screened simultaneously and only require a few
microliters of serum per assay.
Prof. LaBaer’s group (Harvard Institute of Proteomics) has developed a novel method for producing protein microarrays called nucleic acid programmable protein arrays (NAPPA) that avoids the need
to express and purify the proteins by substituting the
printing of cDNAs on the arrays, which are then
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
transcribed and translated in situ as needed at the
time of the assay. NAPPA has been used successfully to map the pairwise protein interactions of the
human DNA replication complex. Here, we propose
adapting the NAPPA protein microarray technology
IRUXVHLQWKHUDSLGDQGHI¿FLHQWVFUHHQLQJRIVHUD
from cancer patients for antibodies to 1000 known
and potential tumor antigens in a multiplex format
in order to better characterize the immune response
to known tumor antigens, identify new informative
tumor antigens and evaluate the value of using patterns of tumor antigen immune responses as biomarkers in Colorectal Cancer. For the validation of the
possible biomarkers found in 20 different patients
SUHSRVWFKHPRWKHUDS\FXUUHQWO\ZHDUHXVLQJ
iFISH and SNPs approaches with the main goal to
correlate genomics and functional proteomics.
Detection of Prostate Cancer by Urine Proteomics
Marina Rigau1, Núria Colome3, Juan Morote2, Mª Carme Mir2, Carlos Ballesteros2, Marta Garcia1,
Miguel Abal1, Francesc Canals3, Jaume Reventós1, Andreas Doll1
1
Unitat de Recerca Biomèdica, Institut de Recerca. 2Servei d’Urologia. 3Laboratori de Proteòmica, Institut
de Recerca. Hospital Vall d’Hebron, Barcelona
Introduction
Objective
3URVWDWHVSHFL¿FDQWLJHQ36$VHUXPPHDVXUHment in combination with a digital rectal examination (DRE) and transrectal ultrasound-guided biopsy
(TURS) is currently the gold standard for prostate
cancer (PCa) screening in Europe [1]. Nevertheless,
36$DQG'5(ODFNVLJQL¿FDQWVSHFL¿FLW\DQGELRSV\
lacks ideal sensitivity (12-30% false negatives) [2,
3]. Therefore additional biomarkers are needed to
supplement or potentially replace the currently used
diagnostic techniques. As the secreted products from
both, normal prostate epithelial cells as well as PCa
cells, can be detected in the urine of men, their use as
DSUR[LPDOERG\ÀXLGWRGHWHFW3&DLVYHU\DWWUDFWLYH
since they could be the best compromise between
a minimal invasive technique accepted by a wider
range of the male population and the possibility to
obtain enough cells for a correct diagnosis [4, 5].
:HVRXJKWWRGHWHUPLQHDSURWHRPLFSUR¿OHLQ
urine able to distinguish between the presence and
absence of PCa.
0DWHULDO0HWKRGV
:H XVHG D FRPELQDWLRQ RI SURWHRPLF WHFKQROogies in aged matched post-Digital Rectal Exam
(DRE) urine supernatants specimens to identify differentially expressed proteins in patients with PCa.
)LUVWO\ ZH GHSOHWHG KLVWRORJLFDO FRQ¿UPHG 3&D
urine samples and 9 control samples (age-matched
patients with the typical background of benign prosWDWHKLSHUSODV\%3+DWURSK\DQGFKURQLFLQÀDPmation) using ProteoMiner (BioRad), a novel depletion technique that reduces the level of the most
abundant species, while strongly concentrating the
more dilute and rare ones. Then, Two-dimensional
55
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Figure 1. 3URWHLQ LGHQWL¿FDWLRQ E\ SURWHRPLF FRPSDUDWLYH DQDO\VLV $ 3URWHR0LQHU GHSOHWLRQ WHFKQLTXH RYHUYLHZ %
2D-DIGE experiment design, comparison of 9 urine PCa samples against 9 urine control samples. (C) Example of a
representive gel of the DIGE experiment. (D) Example of up-expressed spot in PCa samples. (E) IPA network interaction
RIRYHUH[SUHVVHGSURWHLQVSRWVUHG¿JXUHVDQGXQGHUH[SUHVVHGSURWHLQVSRWVJUHHQ¿JXUHV)050WUDQVLWLRQVRID
WU\SWLFSHSWLGHGHULYHGIURPRQHRIWKHFDQGLGDWHELRPDUNHUSURWHLQV*050EDVHGDEVROXWHTXDQWL¿FDWLRQRIDSHSWLGH
abundance using a labeled synthetic peptide as internal standard.
gel-based proteomic approach (2D-DIGE) coupled
with matrix assisted laser desorption/ionization tiPHRIÀLJKWPDVVVSHFWURPHWU\0$/',72)06
and database mining experiment were performed to
identify novel biomarkers of PCa in urine. Finally,
we validated the candiadate biomarkers using Multiple Reaction Monitoring (MRM)-based assays, conducted by Liquid chromatography in conjunction
with triple quadrupole mass spectrometry (LC-MS/
MS) in a bigger cohort of urine samples.
Results
:HLGHQWL¿HGDSURWHRPLFSUR¿OHRISRWHQtial biomarkers (16 down and 10 up-expressed)
for the detection of PCa in urine. Ingenuity pathways analysis (IPA) showed that the majority of
these proteins are secreted components of several
ZHOONQRZQIXQFWLRQDORIFDQFHUDQGLQÀDPPDWLRQ QHWZRUNV OLNH 1)Ʉ% 3'*)%ȕ DQG 36$ :H
performed MRM-based assays for 15 candidate
biomarkers to quantify these in a sample set of 50
urine supernatants (Figure 1).
Conclusions
These data demonstrate the ability of proteomic analyses to reveal novel biomarkers for PCa
in urine, an important step forward in advancing
accurate diagnosis which is currently the bottleneck
for the ability to cure patients from PCa. MRM is
emerging as a technology that ideally complements
the discovery capabilities of shotgun strategies by
LWV XQLTXH SRWHQWLDO IRU UHOLDEOH TXDQWL¿FDWLRQ RI
analytes of low abundance in complex mixtures,
such urine samples[6]. These biomarkers could be
used to develop a a simple diagnostic test (probably
similar to the ELISA, either multiplex or strips,
reactive to the 4-5 molecules most representative of
WKHGLIIHUHQWLDOSUR¿OHWREHXVHGLQWKHKRVSLWDODQG
outpatient routines.
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Osteoarticular and Aging Research Lab, Nodo Asociado de Proteo-Red. INIBIC-Hospitalario Universitario
A Coruña, Xubias 84, 15006 - A Coruña, SPAIN
Introduction
Osteoarthritis (OA) is the most common rheumatic pathology, characterized mainly by cartilage
degradation [1]. Despite its high prevalence, the
diagnosis methods currently available are limited
and lacked of sensitivity. Therefore, there is a considerable interest pointed in the characterization of
QHZVSHFL¿F2$ELRPDUNHUVLQELRORJLFDOÀXLGV,Q
this work we set up a nLC-MALDI-MS method for
OA biomarker search in complex mixtures, with the
aim of obtaining a standardized protocol for serum
DQGV\QRYLDOÀXLG6)SURWHLQSUR¿OLQJ
Methods
a) Sample preparation and immunodepletion:
Serum and SF samples were obtained from OA patients and control donors. Prior to protein depletion,
SF was treated with hyaluronidase. The 20 most abun-
dant proteins were removed from crude serum and SF
using the Immunodepletion column ProteoPrep® 20
(Figure 1), according to manufacturer’s instructions
(Sigma Aldrich). Depletion of abundant proteins was
checked by SDS-PAGE separation of the proteins and
LGHQWL¿FDWLRQ LQ D 0$/',72)72) V\VWHP
(ABI). For both serum and SF depleted samples, protein concentration was determined using a nanoDrop
LQVWUXPHQW)LVKHU7KHUPR6FLHQWL¿F86$
b) Pre-fractioning of the samples: For serum samples, digestion of the depleted fractions was done
with trypsin, and the peptides obtained were fractionated by strong cation exchange (SCX) liquid
chromatography in a HP 1200 system (Agilent),
using a PolySulfoethyl column (PolyLC). SF proteins were separated by SDS-PAGE, using 10%
acrylamide gels. The gel lanes were divided into 12
sections, excised and proteins were in-gel digested
with trypsin following standard procedures.
57
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
WUDQVSRUW SURFHVVHV )LJXUH $Q HI¿FLHQW
depletion of the 20 most abundant proteins was veUL¿HGDVRQO\RIWKHVHSURWHLQVFRXOGEHLGHQWL¿HG
in the samples. Nevertheless, still a number of other
typically abundant serum proteins such as complement proteins and apolipoproteins were found.
Figure 1. &KURPDWRJUDPRIWKHDI¿QLW\GHSOHWLRQRIWKH
most abundant proteins from human plasma. Inset shows a
6'63$*(RIWKHGLIIHUHQWIUDFWLRQV6HUXPÀRZWKURXJK
fraction (low abundant proteins); 2. Serum bound fraction
(high-abundant proteins); 3. Untreated serum.
c) NanoLC-MS/MS analysis: The serum and
SF peptide fractions were desalted using PorosR2
home-made columns (ABI). Each dried fraction
was re-dissolved and injected on a precolumn (PepMap100), and peptides were desalted and loaded to
D&FROXPQ,QWHJUD¿W&3URWHRSHSŒ,,1HZ
Objetive, USA) to perform the separation. Fractions
were collected from the NanoLC, mixed with matrix
and spotted onto a MALDI plate using a MALDI
Spotter/Micro-Fraction Collector (SunChrom). MS
spectra were acquired for each fraction in a 4800
MALDI-TOF/TOF instrument (ABI).
d) 3URWHLQ ,GHQWL¿FDWLRQ DQG 'DWDEDVH 6HDUFK:
3URWHLQLGHQWL¿FDWLRQZDVFDUULHGRXWXVLQJWKH3URWHLQ3LORWVRIWZDUHY$%,2QO\SURWHLQVLGHQWL¿HG
ZLWKDWOHDVWFRQ¿GHQFHRUD3URW6FRUHRI
were reported. A Global False discovery Rate (FDR)
of 1% was calculated independently with PSPEP sotware. SwissProt database was used to determine the
SXWDWLYHFHOOXODUIXQFWLRQRIWKHLGHQWL¿HGSURWHLQV
Results
:H KDYH VWDQGDUGL]HG WZR DOWHUQDWLYH SURWRcols for the proteomic analysis of human biological
ÀXLGV RQH HPSOR\LQJ OLTXLG FKURPDWRJUDSK\ DQG
the other SDS-PAGE as pre-fractionation method.
8VLQJWKH¿UVWDSSURDFKZHZHUHDEOHWRLGHQtify 105 different proteins in human serum from
OA patients. These proteins are involved mainly in
the immune response (33%), proteolysis (22%) and
Figure 2. )XQFWLRQDOFODVVL¿FDWLRQRISURWHLQVLGHQWL¿HGLQ
(A) serum and (B) SF from OA patients.
%\ WKH VHFRQG DSSURDFK ZH LGHQWL¿HG GLfferent proteins in SF samples from OA donors. As
expected, many of these (76%) were also found in
serum. Some of those had been previously suggested as putative OA biomarkers, such as Gelsolin, Fibronectin, Clusterin or Serum Amyloid P protein. As
happened with serum, the most abundant functional
JURXSRISURWHLQVLGHQWL¿HGLQ6)ZDVLQYROYHGLQ
the immune response (Figure 2), but we also found
in this case many proteins related with metabolism,
transport, cellular proliferation and signalling. Interestingly, we found in the group of 21 proteins
VSHFL¿FDOO\ LGHQWL¿HG LQ 6) D QXPEHU RI SURWHLQV
that are directly involved in cartilage extracellular
matrix (ECM) synthesis, that are listed in Table 1.
Conclusions
:H KDYH VWDQGDUGL]HG WZR DSSURDFKHV IRU WKH
LGHQWL¿FDWLRQRISURWHLQVLQKXPDQELRORJLFDOÀXLGV
after depletion of the 20 most abundant proteins of
plasma. These procedures have allowed us to desFULEHWKHSURWHLQSUR¿OHVRIVHUXPDQG6)IURP2$
SDWLHQWV'HVSLWHWKHKLJKVLPLODULWLHVRIERWKSUR¿OHVZHIRXQGPRUHMRLQWVSHFL¿FSURWHLQVLQ6)2XU
data point out the usefulness of these approaches for
OA biomarker discovery, although further studies
HPSOR\LQJVWDEOHLVRWRSHODEHOOLQJZLOOSUR¿WIURP
TXDQWL¿FDWLRQ RI WKH SRWHQWLDO PDUNHUV WKDW KDYH
EHHQLGHQWL¿HGLQWKLVZRUN
References
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58
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Table 1. 3URWHLQVLGHQWL¿HGVSHFL¿FDOO\LQ6)IURP2$SDWLHQWVWKDWDUHGLUHFWO\LQYROYHGLQFDUWLODJH(&0V\QWKHVLV
Acc. No.|Abbr.
Name
Cellular role
P01033|TIMP1
Metalloproteinase inhibitor 1
Prevents ECM degradation
P16112|PGCA
Aggrecan core protein
ECM component
P49747|COMP
Cartilage oligomeric matrix protein
ECM component
Q15113|PCOC1
Procollagen C-endopeptidase enhancer 1
Collagen synthesis
Q92954|PRG4
Proteoglycan-4
ECM component
Q9H9S5|FKRP
Fukutin-related protein
Glycoprotein synthesis
Q9NQ79|CRAC1
Cartilage acidic protein 1
Cartilage component
)XQFWLRQDO3URWHRPLFV%HDGV±EDVHGDUUD\V\VWHPIRU%LRPDUNHU'LVFRYHU\
Raquel Bartolomé1, María González-González1, Jose M. Sayagües1, Fridtjof Lund-Johansen2,
Alberto Orfao1, Manuel Fuentes1
1
Centro de Investigación del Cáncer. Universidad de Salamanca-CSIC. Spain. 2Immunology Institute.
University of Oslo. Norway.
Despite the immense progress in Molecular Biology and Genetics, only a small fraction of the proteome is understood at biochemical level. Currently,
a development of new methodological strategies in
high-throughput format is needed for applications in
Proteomics, such as Biomarker and Drug Discovery
studies. These new methodologies must be able to
analyze simultaneously hundreds or thousands of
proteins in order to evaluate functionality, stability,
interactions, relative abundance, post-transduction
PRGL¿FDWLRQVHWF
Our group has developed a microspheres array
(Bead-based Array System, BBAS) that allow the
simultaneous analysis of numerous sera and intracellular proteins. The method consist of having different populations of spheres, colored by surface- laEHOLQJZLWKGLIIHUHQWÀXRUHVFHQFHG\HVDQGFRXSOHG
with different antibodies against target proteins. A
wide range of available dyes could potentially be
used to generate complex color codes that are analy]HGE\VWDQGDUGÀRZF\WRPHWUHV
In the experimental process a lysate of B cells
is fractioned by size exclusion chromatography
(FPLC) and incubated with a 1300 populations
array. Each population has a code of dyes and is
VSHFL¿FIRUDSDUWLFXODUWDUJHWSURWHLQ7KHODEHOLQJ
of these target proteins with phycoerythrin (PE)
DOORZVWKHGHWHFWLRQE\ÀRZF\WRPHWU\
This methodology is capable of giving information about the amount of protein present in each
fraction, in addition to protein state (soluble, membrane protein, monomeric vs multimeric, phosphorylated, coupled with other proteins in functional complexes …).
59
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Anticuerpos a la carta combinando expresión in vitro de proteínas, tecnología
de despliegue en fagos y arrays de anticuerpos
Rodrigo Barderas, Ingrid Babel, Iván Cristobo, José Ignacio Casal
Laboratorio de Proteómica Funcional. Centro de Investigaciones Biológicas, c/ Ramiro de Maeztu, 9 28040
Madrid
Los anticuerpos constituyen una importante herramienta para determinar la compartimentalización
celular y la función de sus proteínas diana y para el
análisis de interacciones proteína-proteína. Actualmente, los anticuerpos se utilizan para el diagnóstico de enfermedades mediante inmunoensayos como
ELISA, arrays de anticuerpos,… y, para el tratamiento de enfermedades, como por ejemplo el anti-HER2
(Herceptin) en cáncer de mama. De hecho, los anticuerpos constituyen aproximadamente el 50% de los
medicamentos aprobados por la FDA y la EMEA.
El objetivo de este trabajo consistió en el desarrollo de un nuevo método de obtención de anticuerpos in vitro utilizando solo 5 µg de proteína
mediante la combinación de diferentes técnicas pro-
Figura 1. (VTXHPDGHH[SUHVLyQSXUL¿FDFLyQ\VHOHFFLyQGHDQWLFXHUSRVDODFDUWD/DVSURWHtQDVVHH[SUHVDURQLQYLWUR
\SXUL¿FDURQXVDQGREROLWDVPDJQpWLFDV'\QDEHDGVŠ7$/21Œ$OWHUQDWLYDPHQWHODVSURWHtQDVVHHOX\HURQ\GLDOL]DURQ
frente a PBS para su marcaje con AlexaFluor 647 o, se utilizaron para la selección de anticuerpos recombinantes usando
las librerías de scFvs humanas Mehta I y II.
60
WHyPLFDVH[SUHVLyQ\ SXUL¿FDFLyQGHSURWHtQDV LQ
vitro, selección utilizando Despliegue en Fagos y,
¿QDOPHQWH LGHQWL¿FDFLyQ GH DQWLFXHUSRV UHFRPELnantes mediante el cribaje de array de anticuerpos
con la proteína marcada con AlexaFluor 647.
La aplicación de esta metodología nos ha permitido obtener anticuerpos monoclonales humanos recombinantes (scFvs) frente a cuatro proteínas
-tiorredoxina, GFP, p53 y STK4- de diferente masa
molecular (10-70 kDa), siendo p53 y STK4 proteínas difíciles de expresar. El proceso de expresión,
SXUL¿FDFLyQ\VHOHFFLyQGHORVDQWLFXHUSRVDSDUHFH
resumido en la Figura 1. El procedimiento completo
incluye diferentes pasos. El primer paso consiste
en la expresión de las proteínas in vitro utilizando
YHFWRUHVFRGL¿FDQWHVSDUDODVSURWHtQDVFRPRIXHQWH
de DNA y un sistema de expresión in vitro (Roche)
que permite realizar la transcripción y la traducción
HQXQVRORSDVR/DSXUL¿FDFLyQDKRPRJHQHLGDGGH
las proteínas se realizó utilizando bolitas magnéticas
Talon, mediante el Tag de Histidinas que incorporan
las proteínas en su extremo C-terminal. El segundo
paso consistió en la selección de los anticuerpos monoclonales recombinantes, que se realiza en solución
utilizando las proteínas unidas a las bolitas magnéticas y la librería de anticuerpos humanos Mehta I y
II [1-3]. En total, se realizaron 4 rondas de selección
y se picaron 200 colonias individuales procedentes
de la 3ª y 4ª ronda de selección de anticuerpos frente
a cada proteína. Así, se testaron 400 clones indiviGXDOHV\FORQHVHQWRWDOSDUDLGHQWL¿FDUVF)YV
frente a cada proteína. Finalmente, el tercer paso
FRQVLVWLy HQ OD LGHQWL¿FDFLyQ GH ODV VF)YV HVSHFt¿FDVGHFDGDSURWHtQDTXHVHUHDOL]yLPSULPLHQGR
arrays de nitrocelulosa con los 1600 clones diferentes usando un robot de impresión Omnigrid. La
selección de los clones positivos se realizó cribando
los arrays de anticuerpos impresos en nitrocelulosa
con las proteínas expresadas in vitro marcadas con
HOÀXRUyIRUR$OH[D)OXRU)LQDOPHQWHODVVF)YV
LGHQWL¿FDGDVVHWHVWDURQSRU(/,6$LQPXQRGHWHFFLyQHQPHPEUDQDHLQPXQRÀXRUHVFHQFLD
Creemos que esta nueva metodología para obtener anticuerpos monoclonales humanos recombinantes por combinación de la expresión in vitro de
proteínas, el uso de librerías de anticuerpos humanos
desplegados en fagos y microarrays de anticuerpos
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
scFvs podría convertirse fácilmente en un sistema
de alto rendimiento para obtener anticuerpos monoclonales frente a cualquier antígeno. El proceso
completo requiere solo 5µg de proteínas, solucionando el cuello de botella habitual para la obtención
de anticuerpos, dado que se necesitan grandes cantidades de proteína para la inmunización de animales
\SDUDHOFULEDMHHLGHQWL¿FDFLyQGHORVDQWLFXHUSRV
HVSHFt¿FRVGHFDGDSURWHtQD(OQXHYRSURFHGLPLHQto descrito nos permitió obtener anticuerpos frente
a las cuatro proteínas utilizadas en el estudio STK4,
p53, GFP y tiorredoxina que presentaban funcionalidad tras su impresión en arrays de nitrocelulosa
DUUD\VGHDQWLFXHUSRV\HQ(/,6$LQPXQRÀXRUHVcencia e inmunodetección en membrana.
En resumen, esta nueva aproximación podría ser
usada para la obtención de anticuerpos humanos de
DOWDD¿QLGDG~WLOHVHQGLDJQRVLVGHSDWRORJtDV±GDGD
su funcionalidad en arrays de anticuerpos– e incluso
FRQ¿QHVWHUDSpXWLFRVVLHODQWtJHQRXVDGRHQODVHOHFción de los anticuerpos fuese una diana terapéutica.
Agradecimientos
Rodrigo Barderas, PhD, tiene un Contrato Postdoctoral de Perfeccionamiento del FIS. Este trabajo se ha realizado gracias al Programa de Biotecnología del Ministerio de Educación y Ciencia
BIO2006-07689.
Referencias
>@
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61
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
9DOLGDWLRQRI3(')DVDSRWHQWLDOELRPDUNHUIRU16&/&
Sonia Blanco-Prieto1, Nuria Sánchez-Otero1, Ana M. Rodríguez-Piñeiro1, M. Isabel Botana-Rial2,
Francisco J. Rodríguez-Berrocal1, María Páez de la Cadena1*
1
Dpto. Bioquímica, Universidad de Vigo, As Lagoas Marcosende s/n 36310 Vigo (Spain).
Neumología, CHUVI, Vigo (Spain)
,QWKHVHDUFKIRUPRUHHI¿FLHQWELRPDUNHUVIRU
non-small cell lung cancer (NSCLC) we combined
prefractionation techniques and protein separation
by differential in-gel electrophoresis (2D-DIGE), to
TXDQWLI\SURWHLQFKDQJHVEHWZHHQELRORJLFDOÀXLGV
(serum and pleural effusion) from NSCLC subjects
and benign controls (pneumonia and tuberculosis
individuals, respectively).
Pigment epithelium-derived factor (PEDF) was
WKHVROHSURWHLQLGHQWL¿HGLQERWKÀXLGVDVGLIIHUHQtially expressed in NSCLC patients. PEDF is a 50
kDa secreted glycoprotein that exhibits a duality
with regards to apoptosis and survival [1]. PEDF
has been reported to be present in serum at a concentration of 5 µg/mL [2], corroborating a relative
success in mining down the proteome. It could
be concluded that although immnunodepletion of
KLJKDEXQGDQFHVSHFLHVLPSURYHVSURWHLQSUR¿OLQJ
and several relevant proteins were revealed, most
RI WKH SURWHLQV LGHQWL¿HG VWLOO FRUUHVSRQG WR PRderate and highly abundant ones. Two arguments
PD\EHH[SRVHG¿UVWWKHLPSRVVLELOLW\RIFRYHULQJ
the dynamic range of plasma and plasma-derived
ÀXLGV DQG VHFRQG WKH JDS EHWZHHQ WKH EURDGHU
linearity of DIGE in comparison with the reached
LQ 06 LGHQWL¿FDWLRQ DV PDQ\ RI WKH XQLGHQWL¿HG
spots corresponded to the less intense. Our study
revealed one PEDF spot altered in serum with an
average fold increase of 1.4 in NSCLC samples,
while in the case of pleural effusion there were two
altered forms showing changes of 1.5 and 2 fold
increase in lung cancer patients.
The next step after discovering a potential bioPDUNHULVWKHFRQ¿UPDWLRQRIWKHYDULDWLRQREVHUYHG
on 2D gels; thus, immunodetection of PEDF was
FDUULHGRXWLQ'EORWV:KHQ—JRIGHSOHWHGSURtein were resolved results were contradictory: in the
case of serum (Figure 1) the tendency was an elevated expression in NSCLC though levels were overlapped between cancer and benign control samples,
2
Servicio de
whereas in pleural effusion (Figure 2) the pattern
was opposed as the manifested by DIGE analysis.
This discrepancy could be explained considering
the superior sensitivity of antibody reactions and the
great enrichment in PEDF levels achieved after preIUDFWLRQDWLRQWKDWZRXOGPDVNWKHVLJQL¿FDQWGLIIHrences found by DIGE methodology. Another reason
might be the existence of more PEDF isoforms not
distinguishable by 1D separation.
Figure 1. 1D immunodetection of PEDF on serum depleted
samples.,PPXQRTXDQWL¿FDWLRQRI3(')LQJHOVUHVROYLQJ
10 µg of protein (B) was not consistent between cancer and
control subjects, when dilution of the samples was perforPHG$3(')OHYHOVSURYHGWREHVLJQL¿FDQWO\LQFUHDVHGLQ
NSCLC. Lanes 1, 3, 5, 7: NSCLC samples, lanes 2, 4 ,6, 8:
pneumonia samples. LC: lung cancer; B: benign.
These two hypothesis were tested. First, 1DEORWVZHUHUHSHDWHGGLOXWLQJWKHVDPSOHV¿Qding in serum the same pattern initially obtained in
2D gels: a 1.5 fold increase in PEDF expression in
cancer patients (p = 0.043) (Figure 1). For pleural
effusion (Figure 2), although a slight overall increase
was seen in NSCLC, the pattern was not repetitive.
To assess if there were variations in other PEDF
isoforms not visualized on DIGE gels the molecule
ZDV VSHFL¿FDOO\ LPPXQRGHWHFWHG LQ 'EORWV )RU
ERWKÀXLGVDZLGHSOHWKRUDRILVRIRUPVZDVPDQLfested with more than 12 spots detected (Figure 3),
62
which expanded about 1 pH unit. This variability
DJUHHVZLWKWKHREVHUYHGE\>@IRUSXUL¿HGKXPDQ
3(')DQGLVFDXVHGE\SRVWWUDQVODWLRQDOPRGL¿FDtions. In serum all the isoforms observed displayed
a higher intensity in NSCLC, while for pleural effusion a mixed pattern was generated with an average
1.3 fold increase in NSCLC.
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Literature concerning PEDF expression on lung
cancer is not conclusive, with a described reduction at the transcript level in lung tissues compared
to normal specimens [3]. However, when protein
OHYHOZDVH[DPLQDWHGWKHSUR¿OHZDVUHYHUVHGIRU
adenocarcinoma type, the one we analised, with
18/33 specimens overexpressing PEDF. The overall
increase showed by our work could be a response
of PEDF anti-angiogenic capability to counteract
VEGF induced vasopermeability.
$¿QDOVWHSLQWKHSDWKZD\RIGLVFRYHULQJELRmarkers is to corroborate this discrimination by
feasible and highly sensitive methods (commonly
ELISAs) that could be implemented in the clinical
setting. This requires that the differential expression
observed in fractionated proteomes should hold a
parallel comparison on crude samples, regarding
different histological types.
Figure 2. 1D immunodetection of PEDF on depleted pleural
effusions. Blotting of 10 µg of protein (B) displayed a tendency to increased PEDF levels on benign samples, while
repetition on diluted fractions partially reverse this pattern,
although no statistically differences were achieved. Lanes
1, 3, 5, 7: NSCLC samples, lanes 2, 4 ,6, 8: tuberculosis
samples. MPE: malignant pleural effusion; BPE: benign
pleural effusion.
)LJXUH 2D immunodetection of PEDF. Both in depleted
serum (left) and pleural effusion (right) several PEDF isoIRUPVFRXOGEHGHWHFWHG,PPXQRTXDQWL¿FDWLRQUHYHDOHGGLIIHrent variations between benign- and malignant-origin samples,
though most of the spots showed increased values in tumorGHULYHGÀXLGV/&OXQJFDQFHU%EHQLJQ03(PDOLJQDQW
pleural effusion; BPE: benign pleural effusion; Normal Qty:
normalized quantity (by total density in each blot).
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is reduced in non-small cell lung cancer and
is linked to clinical outcome. Int J Mol Med
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63
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Utilización de ProteoMiner para el análisis proteómico de muestras de líquido
VLQRYLDO/6GHSDFLHQWHVFRQRVWHRDUWULWLV
Sonia García-Rodriguez1, María Dulce Pérez-Mezcua1, Antonio Rosal-Vela1, Victoria Longobardo2,
Antonio Larios2, Pilar Navarro1, Raquel Largo3, Gabriel Herrero-Beaumont3, Jaime Sancho1,
Mercedes Zubiaur1
1
Departamento de Biología Celular e Inmunología, Instituto de Parasitología y Biomedicina López-Neyra
(IPBL-N), CSIC, Granada. 2Servicio de Proteómica, IPBL-N, CSIC, Granada. 3Servicio de Reumatología,
Fundación Jiménez-Díaz, Madrid
Introducción
ProteoMiner o Combinatorial Peptide Ligand
Libraries (CPLL) [1] actualmente están compuestas
de una gran variedad de hexapéptidos sintetizados,
que actúan de ligandos para las proteínas de las
muestras. Y están siendo actualizadas como herramientas de gran utilidad para el mapeo de proteomas
de distintos organismos. Esta herramienta permite
el objetivo de reducir del rango dinámico de concentraciones en diversos tipos de muestras, como
plasma y suero, disminuyendo la concentración de
las proteínas más abundantes y el enriquecimiento en proteínas menos abundantes, de cara a una
LGHQWL¿FDFLyQGHHVWDV~OWLPDVFRPRSDVRSUHYLRD
un posterior análisis proteómico [2]. Proteínas menos abundantes en las muestras biológicas son pote
cialmente de gran interés para el estudio de nuevo
biomarcadores de enfermedad. El ProteoMiner que
se ha utilizado en este trabajo es el distribuido por
BioRad y se basa en una librería de hexapéptidos inmovilizados en una matriz en forma de bolitas y en
XQVRSRWHFURPDWRJUi¿FR/DOLEUHUtDFRQWLHQHJUDQ
variedad de hexapéptidos sintetizados, que actúan
de ligandos para las proteínas de las muestras.
Material y Métodos
Se ha utilizado el ProteoMiner con el objetivo
GHLGHQWL¿FDUQXHYDVSURWHtQDVHQ/6GHSDFLHQWHV
con Osteoartritis. Las muestras se trataron con hialuronidasa (10 U/ml LS, 1h, agitación, 500 rpm,
37 ºC, en Thermomix-Eppendorf, centrifugación
100g, 5 min., 4ºC) [3]. 10 mg de muestra se trataron con ProteoMiner. La recuperación de proteínas
observadas fue inferior al 1/50 del material inicial.
50 µg de muestra de LS tratado con hialuronidasa
y 50 µg muestra eluida tras el ProteoMiner se sepa-
raron en un mismo gel 1-D, NOVEX (Invitrogen),
4-12%, 10 pocillos, buffer MES. Los geles se tiñeURQFRQ6<3525XE\aKUV7$VH¿MDURQHQ
10% de metanol/7% de ácido acético, 60 min. TªA
y se lavaron con agua bidestilada y se escanearon
en un Typhoon.
Resultados
El análisis de imagen de los geles en el Typhoon
indicó que a igual concentración de proteínas, las
muestras eluidas después del ProteoMiner presentaron una disminución de proteínas más abundantes
cómo albúmina e inmunoglobulinas y se observa
también una mejor distribución de proteínas, principalmente de masa molecular <50 kDa bien separadas que no se observaban en las muestras no tratadas. Como primera aproximación se ha realizado
OD LGHQWL¿FDFLyQ GH GLVWLQWDV SURWHtQDV SRU KXHOOD
peptídica, mediante MALDI-TOF. Las bandas de los
geles se picaron mediante un picador automático (3
- 4 spots/banda/pocillo). Las proteínas se reducen,
alcalinizan, se pasan a una placa de 96 pocillos y se
procede a la digestión con tripsina. Los péptidos se
eluyeron mediante centrifugación usando de 5-10
ȝO DO YY$&1 DFHWRQLWULOR \ YY (O
análisis se espectros se analiza por MASCOT en
1&%,QU\6ZLV3URW6ZLVV3URWS”VFRUHGH
6HLGHQWL¿FDURQSRU06SURWHtQDVGLIHUHQWHV
en un total de 3 líquidos sinoviales de las cuales 19
aparecían exclusivamente en los eluidos del ProteoMiner y 29 preferentemente y/o exclusivamente en
los LS no procesados, siendo éstas representantes
de las proteínas más abundantes: albúmina sérica,
alfa-2-macroglobulina, alfa-1-antitripsina, haptoglobina, etc. Por el contrario 15 de las 19 proteínas
TXHVHLGHQWL¿FDURQH[FOXVLYDPHQWHHQORVHOXLGRV
del ProteoMiner tenían masas moleculares de 10-30
64
kDa, siendo 3 de ellas fragmentos de proteínas más
grandes, posiblemente productos de degradación.
Conclusiones
En este primer abordaje se ha demostrado que
HO3URWHR0LQHUHVXQDKHUUDPLHQWDPX\H¿FD]SDUD
conseguir el enriquecimiento en proteínas menos
abundantes en líquidos sinoviales de pacientes con
RVWHRDUWULWLV LGHQWL¿FiQGRVH QXHYDV SURWHtQDV TXH
SXHGHQ WHQHU UHODFLyQ FRQ SURFHVRV LQÀDPDWRULRV
latentes o menos obvios que en otras patologías
articulares como la artritis reumatoide.
Agradecimientos
Ministerio Sanidad y Consumo-ISCIII-FIS,
Proyecto: FIS06/1502 (M.Z.). CSIC; Proyecto:
PI-200820I216 (M.Z.). Junta de Andalucía (J.A.),
Consejería Innovación Ciencia y Empresa y Consejería Educación y Ciencia. Proyecto: PC08-CTS-
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
04046 (J.S. y M.Z.). Ministerio Educación y Ciencia
(MEC)-Ministerio Ciencia e Innovación (MICINN)
Proyecto: SAF-2008-03685 (J.S. y M.Z.). CSICBeca JAE Intro a M.D.P.-M.
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Laboratorio Fisiopatología Vascular, Hospital Nacional de Parapléjicos, SESCAM, Toledo, 2Unidad de Cirugía Cardiaca, Hospital Virgen de la Salud, SESCAM, Toledo, 3Departamento de Inmunología, Fundación
Jiménez Díaz, Madrid,, 4Unidad de Cardiología, Hospital Virgen de la Salud, SESCAM, Toledo, 5Unidad de
Proteómica, Hospital Nacional de Parapléjicos, SESCAM, Toledo
En la actualidad diversos autores han señalado
que la estenosis aórtica degenerativa comparte los
mismos factores de riesgo que la enfermedad coronaria. Además, de compartir características histológicas con las placas ateroscleróticas, lo cual sugiere
TXHODFDOFL¿FDFLyQGHODYiOYXODDyUWLFDHVXQSURFHVR FUyQLFR LQÀDPDWRULR VLPLODU D OD DWHURVFOHURsis. La existencia de datos discordantes con esta
teoría hace necesario el estudio de esta patología
mediante la aplicación de nuevas técnicas proteómicas (2D-DIGE, LC-MS/MS, etc), con el objetivo
de conseguir nuevos datos que puedan contribuir a
la comprensión de los procesos implicados en esta
SDWRORJtDMXQWRFRQODLGHQWL¿FDFLyQGHQXHYRVELRmarcadores pronóstico, diagnóstico y terapéuticos.
La estenosis aórtica (EA) degenerativa es una
enfermedad de elevada prevalencia en los países
desarrollados y es la responsable del mayor número
de reemplazos valvulares aórticos. En la actualidad,
diversos autores han señalado que comparte los mismos factores de riesgo que la aterosclerosis1. Por
ello, parece esencial profundizar en el conocimiento
de la patogenia de la EA degenerativa como paso
previo para establecer medidas de prevención de
dicha enfermedad.
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
65
En la actualidad, el estudio de proteínas individuales, aún siendo esencial, ha sido desplazado
por las estrategias proteómicas que permiten el análisis global de las proteínas de una muestra2. Las
nuevas tecnologías (MALDI-TOF/TOF, LC-MS,
DIGE, MS-IMAGIN…) caracterizan miles de espeFLHVPROHFXODUHVHQFDGDDQiOLVLV\JHQHUDQSHU¿OHV
FRQMXQWRV TXH UHÀHMDQ OD VLWXDFLyQ JHQHUDO GH XQD
muestra 3. Debido a que las proteínas que componen
las válvulas aórticas son esenciales para el correcto
IXQFLRQDPLHQWRGHHVWDVVXLGHQWL¿FDFLyQ\FDUDFWHrización mediante herramientas proteómicas es vital
SDUDFRQRFHUPiVVREUHOD¿VLRORJtDGHODYiOYXOD
aórtica y las posibles patologías de ésta.
Tras la aprobación de la realización del estudio
por el Comité Ético del Hospital Virgen de la Salud
(SESCAM, Toledo) y solicitar el correspondiente
consentimiento informado se incluyeron en el estudio pacientes (n=8) que fueron ingresados en la
Unidad de Cirugía del mismo hospital y que fueron
sometidos a cirugía de reemplazo valvular aórtico.
Como controles se utilizaron válvulas aórtias sanas
(n=8) procedentes de necropsias realizadas en el
Departamento de Anatomía Patológica del Hospital
Virgen de la Salud (Toledo).
Las válvulas fueron homogeniezadas en tampón
de extracción4, centrifugadas y el sobrenadante obtenido correspondiente al extracto proteico se cuanWL¿Fy FXDQWL¿FDGR VLJXLHQGR HO PpWRGR %UDGIRUG
Lowry. Posteriormente se llevó a cabo el análisis
proteómico mediante electroforesis bidimensional
diferencial (2D-DIGE). Las proteínas fueron marcadas siguiendo las instrucciones de la casa comercial (GE.Healthcare). Se llevó a cabo la primera
\ VHJXQGD GLPHQVLyQ \ ¿QDOPHQWH ODV LPiJHQHV
de los geles se capturaron mediante el escáner de
ÀXRUHVFHQFLD 7\SKRRQ *(+HDOWKFDUH (O
análisis de las imágenes se realizó con el programa
DeCyder v6.5 (GE.Healthcare) que detectó 51 manchas proteicas diferencialmente expresadas con p<
0.05 entre válvulas aórtica sin estenosis y válvulas
aórticas con estenosis. Estas manchas proteicas fueron recortadas de los geles, teñidos previamente con
tinción plata, digeridas con tripsina y analizadas con
el espectrómetro de masas 4800 Plus MALDI-TOF/
TOF Analyzer (Applied Biosystems), seguido de
una búsqueda de datos. Las 51 manchas proteicas
correspondían a 18 proteínas diferentes (Tabla 1),
TXH VH FODVL¿FDURQ DWHQGLHQGR D VX IXQFLyQ \ VH
YDOLGDURQPHGLDQWH:%H,+&
Figura 1. (A) Gel 2-DE con las proteínas de diferencia
entre EA y controles. (B) Validaciones de algunas de las
proteínas diferencialmente expresadas realizadas mediante
Inmunohistoquímica (izquierda) y Western-blot (derecha).
C)&ODVL¿FDFLyQSRU*UXSRV)XQFLRQDOHV de las proteínas
LGHQWL¿FDGDVXVDQGR'(\0$/',72)72)FRPELQDdo con LC-MS/MS.
Tabla 1. 3URWHtQDV LGHQWL¿FDGDV SRU HVSHFWURPHWUtD GH
masas (MALDI TOF/TOF) mostrando diferentes niveles de
expresión diferencial entre válvulas aórticas sanas y válvulas aórticas con estenosis, analizadas mediante DeCyder
software v 6.5 con p< 0.05.
66
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Agradecimientos
Beca Esteve de la Sociedad Española de Cardiología. Instituto de Salud Carlos III (FIS PI070537),
Fondo de Investigación Sanitaria de Castilla la Mancha (FISCAM, PI2008/08), Fondo de Investigación Sanitaria de Castilla la Mancha (FISCAM,
PI2008/28), Redes Temáticas de Investigación Cooperativa (RD06/0014/1015).
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Metabolic labelling of primary culture human cartilage cells to analyze the effect
RI,QWHUOHXNLQȕLQWKHH[WUDFHOOXODUPDWUL[PHWDEROLVP
Valentina Calamia, Beatriz Rocha, Patricia Fernández, Jesús Mateos, Cristina Ruiz-Romero,
Francisco J. Blanco
Osteoarticular and Aging Research Lab, Nodo Asociado de Proteo-Red. INIBIC-Hospitalario Universitario
A Coruña, Xubias 84, 15006 - A Coruña, SPAIN
Introduction
,QWHUOHXNLQȕ ,/ȕ LV D SURLQÀDPPDWRU\
cytokine that acts as an arthritic mediator with
the capacity to drive the key pathways typically
associated with osteoarthritis (OA) pathogenesis.
This degenerative joint disease, characterized by
articular cartilage degradation, involve in its initial
stages an increased cellular proliferation and synthesis of matrix proteins, proteinases, growth facWRUV F\WRNLQHV DQG RWKHU LQÀDPPDWRU\ PHGLDWRUV
by cartilage cells. Therefore, research has focused
on the chondrocyte (the unique cell type of cartilage) as the cellular mediator of OA pathogenesis.
Chondrocytes of OA patients, as well as synovial
FHOOV SURGXFH LQFUHDVHG OHYHOV RI LQÀDPPDWRU\
F\WRNLQHVVXFKDV,/ȕ>@7KLVF\WRNLQHVKLIWV
the biology of the chondrocytes towards articular
cartilage degradation by increasing the expression
of matrix metalloproteinases while inhibiting the
expression of genes encoding essential components
of the cartilage extra cellular matrix (ECM).
:HKDYHUHFHQWO\XVHG'(WHFKQRORJ\WRGHVcribe the intracellular proteome of normal and OA
human chondrocytes [2-3]. In the present work,
we have standardized the stable isotope labelling
by amino acids in cell culture (SILAC) technique
on primary culture human articular chondrocytes,
DQGKDYHDSSOLHGIRUWKH¿UVWWLPHWKLVVWUDWHJ\IRU
studying the chondrocyte extracellular matrix metabolism in basal conditions and under the effect of
WKHSURLQÀDPPDWRU\F\WRNLQH,/ȕ
Methods
Cartilage obtained from patients undergoing joint replacement was provided by the Tissue Bank at
67
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
CHU A Coruña. The study was approved by the local Ethics Committee. Chondrocytes released from
cartilage by enzymatic digestion were recovered
DQGSODWHGDWORZGHQVLW\LQ6,/$&Œ'0(0)OH[
(Invitrogen) supplemented with antibiotics, glucose
and 10% FBS. In the case of light media, standard
L-lysine (146 mg/L) and L-arginine (28 mg/L) were
used, while in the heavy media isotope-labelled
L-lysine (13C6), and isotope-labelled L-arginine
(13C6,15N4) were used. Titration assays were performed to minimize the problematic conversion of
heavy Arg to Pro in chondrocyte cell culture. Cell
proliferation and cell viability was tested by cell
count and Trypan Blue dye exclusion. Real-time
PCR analyses were carried out to verify the expression of Collagen II, a typical marker of chondrocyte
cells, under the conditions of study.
Chondrocytes were used at week 2-3 in primary
culture (P1), after making them quiescent by incubation in a medium containing 0% FBS for 24h.
Cells were then washed thoroughly and incubated
in serum-free medium with ,/ȕ DW QJP/ IRU
48 hours. Then, conditioned media were collected
DQGWKHLUSURWHLQVZHUHFRQFHQWUDWHGDQGTXDQWL¿HG
(Figure 1).
Figure 1. ([SHULPHQWDOZRUNÀRZIRUWKHGLIIHUHQWLDOVHFUHWRme analysis of chondrocytes by SILAC and nanoLC-MS/MS.
Heavy and light samples were mixed 1:1, and 4
ȝJ RI HDFK PL[HG VDPSOH ZHUH LQVROXWLRQ UHGXced, alkylated and digested with trypsin. Peptide
PL[WXUHVZHUHGHVDOWHGDQG¿OWHUHGWKURXJKD&
microcolumn, and column eluates were subjected
to nano-LC-MS analysis using a Tempo nanoLC
equipped with a C18 column, and a 4800 MALDITOF/TOF mass spectrometer (Applied Biosystems).
7KHLGHQWL¿FDWLRQDQGTXDQWL¿FDWLRQRISURWHLQVZDV
carried out with Protein Pilot software.
Results
Chondrocytes are responsible of the synthesis
of cartilage ECM components, but in primary culWXUHWHQGHDVLO\WRGHGLIIHUHQWLDWHLQWR¿EUREODVWV
A method for obtaining a complete labelling of the
proteins avoiding the cellular de-differentiation
KDV EHHQ GHYHORSHG :H KDYH PLQLPL]HG WKH$UJ
concentration in order to render it metabolically
unfavourable as a precursor for Pro synthesis, and
YHUL¿HGWKDWWKHVHUHVWULFWHGFRQGLWLRQVGRQRWFRPpromise cell proliferation, viability and expression
of chondrocyte markers such as Collagen II, which
is a proline-rich protein.
Collection and proteomic analysis of the proteins secreted by the chondrocytes allowed the
LGHQWL¿FDWLRQRIDQXPEHURISURWHLQVWKDWKDGEHHQ
previously related with OA pathogenesis, such as
matrix metalloproteinases and cathepsins. InteresWLQJO\PRVWRIWKHSURWHLQVLGHQWL¿HGDUHFDUWLODJH
ECM components (27%) (Figure 2), clearly showing
the usefulness of secretome analysis for the study of
(&0PHWDEROLVP:HFRXOGDOVR¿QGDKLJKQXPEHU
of growth factors, matrix remodelling proteins and
cytokines (6 of them that are known to be involved
LQWKHLQÀDPPDWRU\UHVSRQVHWKDWDUHVHFUHWHGE\
,/ȕWUHDWHGFKRQGURF\WHVLQGLFDWHGWKRVHFHOOXODU
SDWKZD\VWKDWDUHLQGXFHGE\WKLVSURLQÀDPPDWRU\
cytokine in cartilage cells.
Figure 2. )XQFWLRQDOFODVVL¿FDWLRQRIWKHSURWHLQVLGHQWL¿HG
in this work.
Conclusions
:HKDYHVWDQGDUGL]HGWKH6,/$&WHFKQLTXHIRU
the proteomic analysis of human primary cartilage
cells, and we have applied this technology for stuG\LQJ WKH HIIHFW RI WKH SURLQÀDPPDWRU\ F\WRNLQH
,/ȕ D NH\ PROHFXOH LQ WKH 2$ SURFHVV RQ WKH
chondrocyte secretome. The obtained information
will increase knowledge about OA pathogenesis,
and already points out a number of possible markers
of the disease.
68
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
articular chondrocytes: a novel tool for the study
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Virginia Sánchez-Quiles, Enrique Santamaría, Laura Sesma, Fernando J. Corrales
Division of Hepatology and Gene Therapy, Proteomics Unit. Centre for Applied Medical Research (CIMA),
University of Navarra. 31008, Pamplona, Spain
Introduction
Prohibitin (Phb) is a multifunctional protein
participating in a plethora of essential cellular
functions, such as cell signalling, apoptosis, survival
and proliferation, playing a central role in the maintenance of liver homeostasis through the regulation
of central proteins involved in these processes by
means of protein-protein interaction mechanisms.
,QWKHOLYHUGH¿FLHQWSURKLELWLQDFWLYLW\SDUWLFLSDWHV
in the progression of non-alcoholic steatohepatitis
(NASH) and obesity, according to mechanisms that
still must be elucidated. Phb1 plays an essential
role in hepatic functions such as inhibition of cell
proliferation [1, 2] and response to anti-cancer [3] or
carcinogenic agents [4]. Down-regulation of Phb1
is an early event in the development of NASH and
hepatocellular carcinoma (HCC) in experimental
mouse models and humans [5]. All these data suggest that Phb1 may play a prominent role in the
progression of HCC.
Materials and Methods
Phb1 expression was silenced in the human
+&& FHOO OLQH 3/&35) XVLQJ VSHFL¿F VL51$V
(siGL, control cells; siPHB, treated cells). Phb1
levels were analysed by immunodetection assay.
$SRSWRVLVZDVTXDQWL¿HGZLWKWKH&HOO'HDWK'HWHFtion Kit (Roche). Cell proliferation was estimated by
cell counting and with the Cell Proliferation Reagent
:675RFKH,QRUGHUWRH[SORUHWKHPROHFXODU
mechanisms involved in the response of PLC cells
to impaired Phb1 activity we used a combination of
DIGE and mass spectrometry analyses. To increase
WKHHI¿FLHQF\RIWKHSURFHVVF\WRVROLFDQGPLFURsomal subcellular fractions were isolated (Qproteome Cell Compartment Kit, from Qiagen). Enriched
cytosolic and microsomal fractions from siGL and
siPHB cells were compared by DIGE analysis. DiIIHUHQWLDOVSRWVGHWHFWHGDQGTXDQWL¿HGE\'H&\GHU
ZHUHLGHQWL¿HGE\QDQR/&(6,0606472)
Results
Phb1 levels were reduced by 80% upon siRNA
VLOHQFLQJ$SRSWRVLVZDVTXDQWL¿HGDQGDEVRUEDQFH
was 3-fold increased in siPHB cells indicating the
SURDSRSWRWLFHIIHFWRI3KEGH¿FLHQF\)LJXUH'
In addition, Phb silencing severely compromised the
capacity of PLC cells to proliferate in a semisolid
substrate, an inherent property of transformed cells
that is related with their metastatic capacity (Figure
1C). Both cell counting and formazan production
UHYHDOHGDVLJQL¿FDQWUHGXFWLRQRIWKHSUROLIHUDWLRQ
rate of siPHB cells when compared with the control
siGL cells (Figure 1A and B).
DeCyder analysis of DIGE of cytosolic and
microsomal fractions found 76 and 25 spots diffe-
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
rentially represented (T test < 0.05) in siPHB with
respect to siGL cells. MS/MS analysis allowed
WKHLGHQWL¿FDWLRQRIDQGXQLTXHSURWHLQVLQ
the cytosolic and microsomal fractions respectively (Table 1).
69
E\ :HVWHUQ EORW ¿JXUH % LQ VL3+% FHOOV VXJgest ER stress that, in turn, might participate in the
apoptotic response of PLC cells to Phb1 silencing.
In agreement to this hypothesis, we found increased CHOP levels, PARP cleavage and activation of
caspase 12 and downstream caspase 7 (Figure 2A).
ER stress might result from proteasome malfunction
leading to the accumulation of miss-folded polypeptide chains in the cell. Phb1 silencing induced downregulation of proteasome activator complex subunit
DQGVWDWKPLQDVYHUL¿HGE\:HVWHUQEORW)LJXUH
2B) suggesting impairment of proteasome activity.
'H¿FLHQWSURWHDVRPHDFWLYLW\ZDVHYLGHQFHGE\WKH
accumulation of ubiquitinated proteins upon Phb
silencing (Figure 2B).
Figure 1. Cell growth and survival upon Phb1 silencing.
Conclusions
Phb1 silencing in human hepatoma cell line
PLC/PRF5 leads to an increase of apoptotic rate and
an impaired cell proliferation. Down-regulation of
&DOUHWLFXOLQ(5SDQG(UOLQIXUWKHUFRQ¿UPHG
Figure 2. Molecular targets mediating the cellular response
WR3KEGH¿FLHQF\
Table 1,GHQWL¿FDWLRQRISURWHLQVFRUUHVSRQGLQJWRWKHGLIIHUHQWLDOVSRWVDVVLJQHGE\VL*/YHUVXVVL3+%'(JHOLPDJH
analysis.
70
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
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Introduction to Lucid Proteomics System, a new solution for peptide and protein
SUR¿OLQJDQGLGHQWL¿FDWLRQFRPELQLQJ5HWHQWDWH&KURPDWRJUDSK\WR0$/',
TOF and TOF/TOF Mass Spectrometry
Francesco Tortorella
Lucid Sales Manager Europe, Bio-Rad Laboratories
Bio-Rad Laboratories
The Lucid Proteomics System provides a novel
means for top-down proteomic analysis of complex
biological samples by combining the separation
power of SELDI ProteinChip arrays with high-resolution MALDI-TOF and MALDI-TOF/TOF mass
spectrometry.
7KHVSHFL¿FLW\RIWKH3URWHLQ&KLSDUUD\VXUIDFHV
permits sample cleanup directly on the arrays, making the process compatible with crude biological
samples (such as neat urine) and harsh elution buffer
components (salts, urea, etc.) that are not normally
compatible with MS analysis.
6HYHUDOH[DPSOHVRISXUL¿FDWLRQVWUDWHJLHVDQG
LGHQWL¿FDWLRQVZLOOEHGHVFULEHG
71
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
02',),&$&,21(632675$'8&&,21$/(6
Coordinadores: Marina Gay, Montserrat Carrascal, Antonio Martínez-Ruiz y Pablo Martínez-Acedo
Liquid chromatography—electron transfer dissociation and ion mobility studies
on a QTOF mass spectrometer
Keith Compson,James Langridge, Jeffery Brown, Steven Pringle, Iain Campuzano, Richard
Chapman
:DWHUV&RUSRUDWLRQ:\WKHQVKDZH0DQFKHVWHU8.
ETD (Electron Transfer Dissociation) is a MS/
MS technique in which precursor cations are reacted with radical reagent anions to induce fragmentation. Electron transfer from anion to cation, promotes fast and randomised dissociation compared
to collision induced dissociation (CID) and hence
ETD product ion spectra contain predominantly
“c” and “z” type ions and post translational moGL¿FDWLRQVRIWHQUHPDLQLQWDFWSURYLGLQJYDOXDEOH
sequence information.
Here we show how ETD can be implemented
DQG SHUIRUPHG RQ D K\EULG 4,0672) :DWHUV
Synapt) where a supply of reagent from a sealed
ampule is delivered to the intermediate pressure region of the nano ESI source and a high voltage discharge pin was added to the ion source to generate
the reagent anions. Analyte cations were generated
using the standard nanospray source via infusion or
nanoACQUITY UPLC system. For ETD, the ion
source polarity and the quadrupole set mass were
sequentially switched to deliver anions and cations
LQWRWKH75$3WUDYHOOLQJZDYH7:$9(LRQJXLGH
where they reacted to form ETD product ions. Product ions were optionally separated by ion mobility
LQWKH,067:$9(LRQJXLGHRUZHUHDFFHOHUDWHG
LQWR WKH 75$16)(5 7:$9( LRQ JXLGH WR FDXVH
2nd generation collision induced dissociation (CID)
ions prior to mass analysis in the TOF.
Bovine serum albumin (BSA) tryptic peptides
(250fm and 50fm) were separated by nanoAcquity UPLC and a selection of triply charged precursor masses were subsequently selected to generate
LC-ETD spectra. Data were acquired at 1 spectra/
second and the fragment ions were database searched with all spectra matching to BSA with high
probability. High quality data was observed at the
50fm injection level, with ETD data acquired at 1
spectra/second.
Cleavage was observed at almost every amide
bond in the peptide backbone, yielding easy-to-interpret sequence ladders of c and z-ions. This coupled
with the inherent mass measurement accuracy and
resolution of the oa-TOF mass analyser makes the
data easily amenable to de novo sequencing. The
signal intensity of the fragment ions seemed to diminish with decreasing m/z, as previously reported.
In addition to the ETD experiments the mass spectrometer can acquire alternate scans in CID, and as
such data will be compared and contrasted between
ETD and CID on a variety of peptides produced and
separated by nanoscale chromatography.
72
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Strategies for proteomic analysis of blood glycated proteins
María Ramírez-Boo1, Feliciano Priego-Capote2, Alexander Scherl1, Jean-Charles Sanchez1
1
Biomedical Proteomics Research Group, Dpt. of Structural Biology and Bioinformatics, University Medical Center, Geneva, Switzerland. 2 Dpto. de Química Analítica, Universidad de Córdoba, Spain.
$PRQJSRVWWUDQVODWLRQDOPRGL¿FDWLRQV370V
of proteins, non-enzymatic glycation is one of the
less frequently studied in proteomics. Glycated proteins are formed by a non-enzymatic reaction between reducing carbohydrates (e.g., glucose, fructose, ribose or derivatives such as ascorbic acid) with
amino groups located in N-terminal position or in lysine and arginine residues (Figure 1) [1]. Analytical
guidelines required to succeed in the characterization
of glycated proteins at qualitative levels have been
UHFHQWO\SURSRVHG>@,WLQYROYHVWKHLGHQWL¿FDWLRQ
of glycated proteins as well as the elucidation of sugar attachment sites. Nevertheless, there is a demand
for quantitative proteomic strategies that could be
potentially applied for glycation assessment. One of
WKHDUHDVWKDWFRXOGEHQH¿WIURPWKHVHVWUDWHJLHVLV
WKHFOLQLFDO¿HOGGXHWRWKHFUXFLDOUROHRIJOXFRVHDV
an energy source in humans, being the main circulating sugar and, thus, the most relevant molecule in
terms of protein glycation. In fact, there are clinical
evidences relating glycation and pathological conditions associated to hyperglycaemia such as diabetes
mellitus, renal failure or aging [5-7].
Figure 1. Scheme of the glycation process (Maillard reaction).
A set of innovative approaches for analysis of
glycated proteins is here presented by application to
blood samples [8]. Qualitative analysis was carried
out by tandem mass spectrometry (MS) after enGRSURWHLQDVH *OX& GLJHVWLRQ DQG ERURQDWH DI¿QLW\
chromatography (BAC) for isolation of glycated peptides. For this purpose, two MS operational modes
were used: HCD-MS2 and CID-MS3 by neutral loss
scan (monitoring two selective neutral losses typical
RISHSWLGHVPRGL¿HGE\JOXFRVHDWWDFKPHQW
and 84.04 Da). Quantitative analysis was based on the
labelling of proteins with 13C6-glucose incubation in
order to evaluate the native glycated proteins labelled
with 12C6-glucose. As glycation is chemo-selective, it
is exclusively occurring in potential targets for in vivo
PRGL¿FDWLRQV7KLVDSSURDFKQDPHG*O\FDWLRQ,VRWRpic Labelling (GIL), enabled to differentiate glycated
peptides labelled with both isotopic forms resulting
from enzymatic digestion by MS (6 Da mass shift per
glycation site) as shown in Figure 2.
:LWK WZR GLIIHUHQW SXUSRVHV WKLV VWUDWHJ\ KDV
been applied to human plasma and lysates from
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
73
Figure 2. %RWWRPXSSURWHRPLFVZRUNÀRZVXVHGIRUTXDQWLWDWLYHDQDO\VLVRIJO\FDWHGSURWHLQVVKRZLQJWKHODEHOOLQJZLWK
light and heavy glucose.
74
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
HU\WKURF\WHV7KH¿UVWRQHZDVEDVHGRQWKHFKDUDFterization of the native glycated proteome, incubating the clinical samples with 13C6-glucose prior to
DQDO\VLVZLWKWKHFRQYHQWLRQDOSURWHRPLFVZRUNÀRZ
exposed above. Fifty glycated proteins with identi¿FDWLRQRIVXJDUDWWDFKPHQWSRVLWLRQVZHUHGHtected in the analysis of human plasma. Concerning
UHGEORRGFHOOVJO\FDWHGSURWHLQVZLWKLGHQWL¿FDtion of 54 glycation sites were detected without any
protein pre-fractionation step. These proteins are
representative targets to compare between samples
with different glycaemic states and monitor the glycaemic control. The second task was focused on the
assessment of glucose stimuli at different concentrations (0, 5, 10, 30 and 50 mM glucose) in human
SODVPD)RUWKLVSXUSRVH¿YHSODVPDDOLTXRWVZHUH
independently incubated with 0, 5, 10, 30 and 50mM
12
C6-glucose for 24 h and, subsequently mixed with
a plasma aliquot incubated with 30mM 13C6-glucose
for 24 h. Proteomic analysis of these pools has revealed additional information about the biological
effect of different hyperglycemia conditions and the
kinetic of glycation.
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75
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
HPLC-FosfoChip una nueva tecnología para el análisis selectivo de fosfopéptidos
mediante LC/MS
Isidro Masana1. Reinout Raijmakers2, Shabaz Mohammed2, Albert Heck2, Dayin Lin3
1
Agilent Technologies–Barcelona. 2Biomolecular Mass Spectrometry and Proteomics Group, Bijvoet
Center and Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences –Utrecht–Netherlands. 3Agilent Technologies
:DOGEURQQ*HUPDQ\
La fosforilación de proteínas es uno de los más
LPSRUWDQWHVPHFDQLVPRVGHPRGL¿FDFLyQSRVWWUDGXFcional (PTM) para regular la función de las proteínas
en las células. Miles de procesos biológicos, incluyendo la proliferación, migración y apoptosis celular,
implican pasos de fosforilación. Uno de los principales
HVIXHU]RVHQSURWHyPLFDYDGLULJLGRDODLGHQWL¿FDFLyQ
y comprensión de los fosfoproteomas en las células.
El enriquecimiento selectivo de péptidos y
proteínas fosforiladas es necesario para conseguir
una mejor cobertura del fosfoproteoma. El enfoque
QHFHVDULRVFUHDQUHWRVHQFXDQWRDVX¿DELOLGDGURbustez y reproducibilidad. La automatización de las
etapas de enriquecimiento y de separación analítica,
son la mejor manera de conseguir una buena reproducibilidad, inyección a inyección y entre distintos
ODERUDWRULRV(OQXHYRFKLSPLFURÀXtGLFR3KRVSKRchip es un HPLC-Chip reutilizable diseñado para
enriquecimiento y análisis fosfopeptídico [1-2] que
SHUPLWHODDXWRPDWL]DFLyQGHHVHÀXMRGHWUDEDMR
El chip consiste en una multicapa de poliimida
laminada que contiene una zona de enriquecimien-
Figura 1. Diseño del FosfoChip: (A). El FosfoChip incorpora una columna de enriquecimiento encapsulada con: RP-TiO2-RP.
(B). Posición de carga para enriquecimiento de péptidos. (C). Etapa de separación de péptidos a través de columna analítica.
basado en dióxido de titanio es un método particularmente robusto y automatizable con una gran
D¿QLGDGSRUORVIRVIRSpSWLGRV1RREVWDQWHODVP~Otiples micro-válvulas, conexiones y micro-capilares
to con partículas de dióxido de titanio (TiO2),
ÀDQTXHDGD D DPERV ODGRV SRU PDWHULDO GH IDVH
reversa C18 (ver Figura 1). La zona de enriquecimiento está conectada a la columna de separación
76
de fase reversa que acaba en una punta integrada
de nanoelectrospray.
A través del “Chip-cube” (la interfase al MS
del HPLC-Chip), una micro-válvula conecta direcWDPHQWHHOQDQRFURPDWyJUDIRFRQODVXSHU¿FLHGHO
chip. Ello crea un sello de alta presión y cero volumen muerto, y permite la automatización de la
carga de muestras, desalinización, elución desde la
SUHFROXPQDGHHQULTXHFLPLHQWR\VHSDUDFLyQ¿QDO
en la columna analítica mediante un gradiente de la
concentración de solvente orgánico del eluyente. El
FosfoChip se complementa con un kit de reactivos
para el análisis de fosfopéptidos en cualquier sistema HPLC-Chip/MS (Agilent QTOF/QqQ/TOF/Q).
El kit incluye una mezcla acondicionadora y un
estándar para saturar todos los potenciales puntos
de adsorción de fosfopéptidos del HPLC.
El conjunto de columna de enriquecimiento empaquetada con RP1-TiO2-RP2, permite en un sólo
experimento la retención y análisis por separado
de péptidos fosforilados y no fosforilados. El chip
puede operar en dos modos diferentes, según interesen o no los péptidos no fosforilados. En el primer
modo, cuando sólo interesan fosfopéptidos, la gran
mayoría de los péptidos se atraparán inicialmente en
RP1. La elución posterior de péptidos con solvente
orgánico los arrastrará hasta la fase TiO2, donde
sólo se retendrán los fosfopéptidos, desechándose
los péptidos no fosforilados (no retenidos). En la
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
siguiente etapa, los fosfopéptidos se desorben del
TiO2 con un tampón de elución básico, atrapándose
en RP2. Finalmente, se realiza un gradiente para
separar los fosfopéptidos en la columna analítica.
En el modo dual (fosforilados y no fosforilados),
previamente a la separación de los fosfopéptidos, se
lleva a cabo un gradiente de elución de los péptidos retenidos en RP1 dirigiéndolos a la columna
analítica para separar los péptidos no fosforilados
(los fosforilados permanecen retenidos en el TiO2).
Finalmente en un segundo gradiente se realiza la separación de los péptidos fosforilados (previa elución
de estos de la columna de TiO2 a la RP2 como se
indicaba en el párrafo anterior).
Parte experimental
Un lisado de proteínas de células de osteosarcoma
U2OS humano se redujo, alquiló y se digirió con tripsina. Los péptidos resultantes se fraccionaron por cromaWRJUDItD6&;\ȝJGHODIUDFFLyQTXHWHyULFDPHQWH
contenía la mayoría de péptidos ionizados con 1 sola
carga neta (conocida por contener la mayoría de fosfopéptidos), se analizó con un Agilent HPLC-Chip/MS
conectado a un Q-TOF Agilent-6520 y se compararon
los resultados obtenidos mediante el FosfoChip y un
HPLC-Chip standard mediante MS/MS automático.
El 90% de la señal total se encontró en el
³ÀRZWKURXJK´ )LJXUD OD IUDFFLyQ QR UHWHQLGD
Figura 2. Comparación análisis de fosfopéptidos fracción SCX de péptidos mono-cargados de osteosarcoma U2OS humano: (A) con HPLC-Chip estándar. (B) FosfoChip:fracción no retenida en TiO2 (C) FosfoChip: Fracción retenida en TiO2
IRVIRSpWLGRV'1~PHURGHIRVIRSpSWLGRV~QLFRVLGHQWL¿FDGRVFRQ6SHFWUXP0LOO
77
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
en TiO2. El análisis de la fracción retenida en TiO2,
con el motor Spectrum Mill y la base de datos huPDQD ,3, SHUPLWLy OD LGHQWL¿FDFLyQ GH IRVfopéptidos. En contraste, sólo 11 fosfopéptidos se
LGHQWL¿FDURQ FXDQGR OD PLVPD PXHVWUD VH DQDOL]y
con el HPLC-Chip estándar. Como era de esperar,
los componentes mayoritarios no fosforilados, enPDVFDUDURQ OD LGHQWL¿FDFLyQ GH ORV IRVIRSpSWLGRV
en muestras en las que no se realizó el paso de enriquecimiento/ separación en TiO2. Ello es debido
a la falta de tiempo para adquirir en un pico croPDWRJUi¿FR ORV HVSHFWURV GH 0606 GH SpSWLGRV
minoritarios (como los fosforilados), cuando estos
coeluyen con diversos péptidos mayoritarios y se
trabaja en Auto-MS/MS.
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NanoLC/MS/MS Analysis of Phosphopeptides
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,GHQWL¿FDWLRQRIDQHZSKRVSKRU\ODWLRQVLWHLQ()WUDQVFULSWLRQIDFWRU
Nerea Osinalde1, Miren Josu Omaetxebarria1, Kerman Aloria2, Ana M. Zubiaga3, Asier Fullaondo3,
Jesus M. Arizmendi1
1
Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of the Basque Country, Leioa, Spain.
Proteomics Core Facility-SGIker (ProteoRed), University of the Basque Country, Leioa, Spain.
3
Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque
Country, Leioa, Spain.
2
The E2F transcription factor family (E2F1-8)
is required for the regulation of a number of genes
involved in several essential cellular processes.
It is for that reason that the activity of E2Fs must
be carefully controlled. Reversible phosphorylation is one of the main regulatory mechanisms
controlling the activity of proteins that has also
been described for E2Fs. Several phosphorylation
events have already been described for E2F1 but
WKHRQHVGHVFULEHGVRIDUDUHLQVXI¿FLHQWWRFRPpletely understand how this transcription factor is
regulated. In order to identify new phosphorylation
sites, E2F1 was immunoprecipitated and following
protease mediated digestion was loaded onto TiO2
microcolumns. The enriched fractions were analyzed by LC-MS/MS. This methodology allowed the
LGHQWL¿FDWLRQRIDQHZ()SKRVSKRU\ODWLRQVLWH
not described to date.
Introduction
E2Fs (E2F1-8) play a central role in cell cycle
progression, DNA damage repair, apoptosis, cell
differentiation and development. Each of this family
members are known to regulate more than one cellular process depending on the stimuli they are subjected to. For instance, E2F1-dependent transcription is
essential for cell proliferation but depending on the
cellular context can also trigger cell death. That is
why E2F-dependent transcription needs to be tightly
regulated. Transcriptional activity of each E2F is
modulated at various levels. Not only protein-protein interaction and subcellular localization but also
SRVWWUDQVODWLRQDOPRGL¿FDWLRQVVXFKDVDFHW\ODWLRQ
and phosphorylation have been proven to regulate
DQGGHWHUPLQHWKHVSHFL¿FUROHVRI ()V )RU LQVtance, it is known that the DNA binding capacity
78
of E2F1 is reduced when Ser375 is phosphorylated
[1] while phosphorylation of Ser31 and Ser364 following DNA damage has been reported to stabilize
E2F1 itself and also promote its apoptotic pathway
[2]. However it cannot be ruled out the possibility to
¿QGPRUHSKRVSKRU\ODWLRQHYHQWVLQ()
To gain a better understanding of how E2F1
is regulated, we looked for new phosphorylation
events it may suffer. Immunoprecipitation of E2F1
followed by LC-MS/MS analysis of TiO2 enriched
SKRVSKRSHSWLGHV)LJXUHOHGWRWKHLGHQWL¿FDWLRQ
of a novel phosphorylation site for E2F1.
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
+'06PDVVVSHFWURPHWHU:DWHUVLQWHUIDFHGWRD
1DQR$FTXLW\83/&6\VWHP:DWHUV7KHVDPSOH
was loaded onto a Symmetry 300 C18 precolumn.
The precolumn was connected to a BEH130 C18 coOXPQ:DWHUV0DVFRWVHDUFKHQJLQHhttp://www.
matrixscience.com ZDV XVHG IRU SURWHLQ LGHQWL¿cation. Bioinformatics: Phosphorylation site- and
motif-prediction tools were used. Netphos 2.0 [4]
and Phosida [5] were used for the prediction of putative phosphorylation sites in E2F1. Additionally,
Phosida was used for kinase prediction of putative
phosphorylation sites. http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ and http://www.phosida.com/
Results and discussion
$ QHZ SKRVSKRU\ODWLRQ VLWH ZDV LGHQWL¿HG IRU
E2F1. Manual validation of the spectra allowed the
assignment of the phosphorylation to residue Ser307
(Figure 2).
Figure 1. Strategy for the analysis of phosphorylation in
E2F1. E2F1 was immunoprecipitated, protease-digested and
the resulting peptides were enriched by TiO2 and analyzed
by LC-MS/MS.
Materials and methods
Immunoprecipitation of E2F1 transcription
factor: A cell extract from 293T cells overexpressing E2F1 was incubated with an antibody against
E2F1. After washing, proteins were eluted with
0.1M glycine pH 2.5 at 25ºC O/N. Samples were
neutralized with 1.5M TrisHCl pH 8.8. In-solution
digestion of the immnoprecipitated fractions: Protein eluates were reduced with dithiothreitol, alkylated with iodoacetamide and digested O/N at 25ºC
with GluC. Titanium Dioxide (TiO2) enrichment
of phosphorylated peptides: Preparation and use of
TiO2 microcolumns for phosphopeptide enrichment
was performed essentially as previously described
by Larsen et al., 2005 [3]. LC-MS/MS: Titanium
enriched fractions were analyzed in a SYNAPT
Figure 2. 0606VSHFWUDRIWKHLGHQWL¿HGSKRVSKRSHSWLGH
for E2F1 transcription factor. Among the four possible phosphorylable residues for the phosphopeptide 301ETVGGISPGKTPSQE315, it was possible to assign the phosphorylation
site to residue Ser307.
Bioinformatic analysis was also performed to
predict possible phosphorylation sites in E2F1. According to NetPhos 2.0 predictor, the phosphorylaWLRQSUHGLFWHGVFRUHIRUWKHLGHQWL¿HGVLWHLQ()
is 0.997, which reinforces our result. Moreover,
phosphorylation database Phosida predicted that the
kinase involved in the phosphorylation of Ser307
would be CDK2. It has already been described that
E2F1 can form a stable complex with cyclinA/CDK2
and that CDK2 can phosphorylate E2F1 regulating
this way its DNA-binding activity [1].
$FNQRZOHGJHPHQWV
N.O. is a recipient of University of the Basque
Country fellowship for PhD studies. This work has
79
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
been funded by Etortek and Saiotek grants from the Industry Department of the Basque Government. Proteomics Core Facility-SGIker is supported by UPV/EHU,
MICINN, GV/EJ, ESF and ProteoRed agencies.
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(VWDEOHFLPLHQWRGHXQÀXMRGHWUDEDMRHIHFWLYRHQODFDUDFWHUL]DFLyQFXDOLWDWLYD
y cuantitativa del fosfoproteoma
David Ovelleiro, Montserrat Carrascal, Joaquin Abian
/3&6,&8$%,,%%&6,&(GL¿FLR0&DPSXV8$%%HOODWHUUD%DUFHORQD6SDLQ
La determinación de puntos de fosforilación en
proteínas es una de las áreas de la proteómica con
mayor interés en la actualidad. Los últimos avances
HQODLQVWUXPHQWDFLyQ\HQODVWpFQLFDVGHSXUL¿FDFLyQ
están permitiendo la detección de formas fosforiladas
de péptidos a muy bajas concentraciones y con gran
¿DELOLGDG/DFDUDFWHUL]DFLyQGHOGHQRPLQDGRIRVIRproteoma hace posible la obtención de instantáneas
del estado de fosforilación de un determinado orgaQLVPR\VXFXDQWL¿FDFLyQHQGLIHUHQWHVHVWDGRV1R
obstante, debido a las utilización de métodos de enULTXHFLPLHQWR\DORVEDUULGRVHVSHFt¿FRVXWLOL]DGRV
en el análisis por espectrometría de masas, el análisis
de los datos generados aumenta sensiblemente en
complejidad respecto a otros análisis proteómicos
clásicos. Es por tanto necesario el establecimiento de
XQÀXMRGHWUDEDMRHVSHFt¿FRSDUDIRVIRSURWHyPLFD
con objeto de responder a las diversas necesidades
que las técnicas involucradas requieren.
1. Peculiaridades de los datos obtenidos en
ODLGHQWL¿FDFLyQGHIRVIRSpSWLGRV
En el analisis de fosfopéptidos mediante técnicas de shotgun proteomics deben tenerse en cuenta
las siguientes consideraciones:
‡/DHYDOXDFLyQGHODFRQ¿DQ]DHQODLGHQWL¿FDción de fosfoproteínas en base al número de
SpSWLGRV LGHQWL¿FDGRV QR VLHPSUH HV SRVLEOH
dado que en las etapas de enriquecimiento gran
parte de los péptidos no fosforilados se eliminan. La información analítica reportada debe
por tanto tener en cuenta todas las proteínas a
las que apuntan estos péptidos únicos, tanto a
efectos cualitativos como cuantitativos.
‡ (O Q~PHUR GH PRGL¿FDFLRQHV D WHQHU HQ FXHQWD GXUDQWH OD LGHQWL¿FDFLyQ GH ORV HVSHFWURV GH
IUDJPHQWDFLyQ DO PHQRV PRGL¿FDFLRQHV YDriables para S/T/Y en MS2, y dos más para S/T
en MS3) y las características espectrales de los
fosfopéptidos (pérdida preponderante del grupo
fosfato) facilitan la aparición de falsos positivos.
La utilización de bases de datos señuelo nos permite obtener una estimación de la proporcion de
falsos positivos en el conjunto de fosfopéptidos
validados (FDR o False Discovery Rate) [4, 5].
‡ 8Q HOHPHQWR FODYH HQ OD DVLJQDFLyQ GH SXQWRVGHIRVIRULODFLyQHVODFRUUHFWDLGHQWL¿FDFLyQ
GHODPLQRiFLGRPRGL¿FDGRFXDQGRH[LVWDPiV
de una alternativa posible. En estos casos, los
buscadores en base de datos como SEQUEST,
80
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
3KHQ\[ X 2066$ VXHOHQ WHQHU GL¿FXOWDGHV
para distinguir entre las distintos posiciones de
fosforilación y pueden dar lugar a asignaciones
incorrectas. Por este motivo son precisos análiVLVDGLFLRQDOHVHVSHFt¿FRVFRQREMHWRGHYDOLGDU
estas asignaciones o corregirlas. Entre los métodos descritos para estos análisis [6,7], uno de los
más populares es la puntuación Ascore.
FLyQ\FXDQWL¿FDFLyQGHIRVIRSpSWLGRVDVtFRPRHO
almacenamiento de la información obtenida en cada
paso en un único formato de almacenamiento llamado ³SKRV¿OH´. Dicho formato de almacenamiento
permite una fácil conversión a formatos usables por
el investigador (ie. Excel) o la exportación de la información a una base de datos como Lymphos [10].
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Figura 1. ,QIRUPDFLyQ JHQHUDGD HQ HO ÀXMR GH WUDEDMR \
contenida en el archivo de almacenamiento phosFile.
El formato estándard más utilizado para almacenar la información analítica en proteómica es el
XML. Uno de los estándares más recientes de archivo
XML para el almacenamiento de datos analíticos es
el mzIdentML [8]. Sin embargo, la complejidad y
diversidad de la información recopilada en un experimento proteómico hacen que estos estándares sean
KR\ SRU KR\ LQVX¿FLHQWHV SRU OR TXH HV QHFHVDULR
evaluar otras alternativas de almacenamiento. Por
otra parte, es también importante establecer un procedimiento para la incorporación de la información
experimental utilizando diferentes MIAPE asociadas
al experimento, teniendo especial importancia aquí
el modelo MIASPPE [9] (“Minimum Information
About Sample Preparation for a Phosphoproteomics
Experiment”). En la Figura 1 se presenta el esquema
JHQHUDOGHOÀXMRGHWUDEDMRXWLOL]DGRHQODLGHQWL¿FD-
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
81
$SUR[LPDFLRQHVPHWRGROyJLFDVSDUDHOHVWXGLRGHOHVWDGRUHGR[WLROGLVXOIXUR
de proteínas en muestras vegetales
Sira Echevarría-Zomeño1, Per Hägglund2 P, Birte Svensson2, Ana María Maldonado Alconada1,
Jesús V. Jorrín Novo1
1
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Grupo de Bioquímica y Proteómica Vegetal y Agrícola,
Universidad de Córdoba, España. 2 Department of Systems Biology, Technical University of Denmark,
Lyngby, Denmark
Resumen
Para el estudio del estado redox (tiol-disulfuro)
de las proteínas, se utilizan técnicas de bioquímica
clásica y de proteómica, incluidas aquellas de segunda generación (DIGE, ICAT), basadas en el marcaje
HVSHFt¿FRGHUHVWRVGHFLVWHtQD'LFKDVWpFQLFDVGH
proteómica se han empezado a usar en el estudio de
los mecanismos que median procesos de desarrollo y
respuesta a estreses en humanos, mamíferos, organismos modelo tales como Escherichia coli, y en menor
medida en plantas. Sin embargo, su potencial dista
mucho de ser totalmente explotado. El objetivo de
este trabajo es el de optimizar el uso de las técnicas
DIGE e ICAT para el estudio del proteoma redox, utilizando Arabidopsis thaliana como sistema modelo.
La aplicación de estas técnicas ha puesto de mani¿HVWR VX XWLOLGDG SDUD OD FDUDFWHUL]DFLyQ GHO HVWDGR
redox de las proteínas, pero también a demostrado la
importancia de incluir en los experimentos controles
adecuados para cada paso del protocolo.
Se conoce como proteoma redox al conjunto de
proteínas susceptibles de cambiar su estado de oxidorreducción en respuesta a algún estímulo. Estas modi¿FDFLRQHVTXHDIHFWDQSULQFLSDOPHQWHDORVUHVLGXRV
de cisteína, pueden ser irreversibles (como la oxidación a ácido cisteico), lo que conlleva la pérdida de
actividad biológica, o reversibles, en los que el grupo
tiol se puede oxidar a puente disulfuro (cisteína-cisWHtQD'LFKDVPRGL¿FDFLRQHVUHYHUVLEOHVFRQVWLWX\HQ
mecanismos de regulación de la actividad, vida media
y patrón de interacción de la proteína [1-4].
En un experimento típico dirigido a la caracterización del proteoma redox, se utilizan técnicas basadas
HQJHO\FURPDWRJUi¿FDVHLQFOX\HQHWDSDVGHLH[tracción proteica, ii) marcaje de tioles libres mediante agentes tiol-reactivos (iodoacetamida, maleimida,
glutatión) unidos a algún tipo de elemento marcador,
FRPRELRWLQDRVXVFRQMXJDGRVDQWtJHQRVRÀXRURFURPRVPRQREURPRELPDQHÀXRUHVFHtQDLLLSXUL¿FDFLyQRVHSDUDFLyQSRUFURPDWRJUDItDRHOHFWURIRUHVLV \ LY FXDQWL¿FDFLyQ H LGHQWL¿FDFLyQ PHGLDQWH
análisis de imagen y espectrometría de masas.
Las técnicas de proteómica cuantitativa de segunGDJHQHUDFLyQTXHLPSOLFDQHOPDUFDMHHVSHFt¿FRGH
restos de cisteína, tales como DIGE o ICAT, se han
empezado a utilizar en estudios del estado redox de
proteínas en diversos sistemas como mamíferos [5],
bacterias [6] y en menor medida, en plantas [7]. Para
caracterizar el estado redox de las proteínas en Arabidopsis thaliana, en nuestro grupo se están optimizando las técnicas redox-DIGE y oxICAT. Estas técnicas
se basan en el marcaje diferencial de los residuos oxidados y los reducidos. En nuestro caso, este marcaje
se llevó a cabo en la misma muestra, en lugar de en
GRVPXHVWUDVGLIHUHQWHV(OÀXMRGHWUDEDMRVHJXLGRVH
detalla en la Figura 1. La preparación de la muestra
se llevó a cabo a pH ácido, lo que evita intercambios
tiol-disulfuro y oxidaciones espontáneas, que se dan
a pHs 7-9 [8]. Para poder utilizar los dos agentes
en el mismo tubo de ensayo, fue necesario eliminar
el exceso de reactivo en cada paso del proceso. En
el experimento, se incluyeron controles en los que
las muestras se redujeron completamente desde el
principio, de manera que sólo uno de los reactivos
marcadores debería detectarse en los resultados.
La aplicación de ambas técnica puso de maQL¿HVWRODXWLOLGDGGHODVPLVPDVSDUDGLVFULPLQDU
entre residuos oxidados y reducidos. Sin embargo,
a la vista de los resultados de los controles con
PXHVWUDV UHGXFLGDV QR PRVWUDGRV OD H¿FLHQFLD
del proceso de marcaje es menor de la esperada,
demostrando que la inclusión de este tipo de controles es de gran importancia para evaluar la validez
del experimento y corregir el error generado por el
marcaje residual.
82
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Figura 1. Esquema de las técnicas redox-ICAT (A) y redox-DIGE (B). Tras la extracción proteica, los marcajes se realizaron
con ambos agentes en el mismo tubo de ensayo.
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3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
83
Deciphering the S-Nitrosylome of Arabidopsis thaliana during the defense
response
Ana M. Maldonado-Alconada1, Sira Echevarría-Zomeño1, Christian Lindermayr2, Jörg Durner2,
Jesús V. Jorrín-Novo1
1
Agricultural and Plant Biochemistry and Proteomics Research Group, Dept. of Biochemistry and Molecular
Biology, University of Cordoba, Spain. 2Institute of Biochemical Plant Pathology, Helmholtz Zentrum
München - German Research Center for Environmental Health, D-85764 Neuherberg, Germany
The biological effects of nitric oxide (NO) are
mainly mediated through S-nitrosylation of cysteine
WKLROV:HKDYHXVHGWKHELRWLQVZLWFKPHWKRGFRPbined with mass spectrometry analysis to identify
targets of S-nitrosylation in Arabidopsis thaliana
cell suspension cultures and leaves challenged with
the pathogenic bacteria Pseudomonas syringae pv.
tomato. The NO targets belong to different functional categories, and include proteins previously
LGHQWL¿HGLQSODQWVDQGPDPPDOVDVZHOODVQRYHO
targets. Our data support the idea that NO orchestrates the whole plant physiology through covalent
PRGL¿FDWLRQRISURWHLQV
One of the earliest events occurring in plants
following pathogen infection is a strong oxidative
burst and increases in the NO level being the correct intracellular balance between these molecules
crucial for the establishment of resistance [1, 2].
The reversible covalent binding of NO to a speci¿F F\VWHLQH UHVLGXH 6QLWURV\ODWLRQ LV WKH PDLQ
mechanism by which NO exerts its function and
VHYHUDO FDQGLGDWHV KDYH EHHQ LGHQWL¿HG LQ SODQWV
[3, 4]. In order to uncover the role of this type of
PRGL¿FDWLRQGXULQJEDVDOUHVLVWDQFHWKH¿UVWOLQHRI
active defense in plants) and R-mediated resistance
DVWURQJIRUPRIUDFHVSHFL¿FUHVLVWDQFHZHDLP
to identify S-nitrosylated proteins in Arabidopsis
plants and cell extracts challenged with virulent Pst
and avirulent Pst avrRpt2.
Protein extracts were subjected to the biotin
switch method converting S-nitrosylated Cys to
biotinylated Cys [3]. Extracts (10 mg for protein
SXUL¿FDWLRQDQGµg for detection of biotinylated
SURWHLQVZHUH¿UVWLQFXEDWHGZLWKP0PHWK\O
methanethionsulfonate (MMTS) and 2.5% SDS for
blocking free cys residues. Treatment with GSNO
(500 µM) was used to generate S-nitrosothiols in
vitro and the treatment with the reducing agent DTT
(20mM) was performed as a control that the labelling observed corresponds to originally S-nitrosylated proteins. Biotinylated proteins were visualized
by immunoblotting using anti-biotin antibody and
ZHUHSXUL¿HGE\DI¿QLW\FKURPDWRJUDSK\RQDQHXtravidin matrix, and bound proteins were eluated
with 100 mM β-mercaptoethanol. For protein idenWL¿FDWLRQWKHSXUL¿HGSURWHLQVZHUHWU\SVLQGLJHVWHG
and subjected to LC/MS/MS analysis using a Surveyor/MicroAS HPLC system in tandem with an
/74 PDVV VSHFWURPHWHU 7KHUPR)LVKHU 6FLHQWL¿F
USA). The MS/MS spectra obtained were analysed
using the Bioworks 3.2 software (ThermoFisher
6FLHQWL¿F86$DQGWKH6(48(67VHDUFKHQJLQH
(Thermo, MA), against a non-redundant NCBI and
MSDB databases and their reverse, allowing for vaULDEOHF\VWHLQHPRGL¿FDWLRQE\β-mercaptoethanol
and organism restriction to Arabidopsis. The FDR
value was adjusted to 1% taking as a reference the
Xcorr values obtained from the search using the
reverse database (DCn >0.1).
The results obtained indicate more intense labeling following P. syringae infection, especially those
from PstavrRpt2- treated samples. In addition more
6QLWURV\ODWHG SURWHLQV ZHUH SXUL¿HG IURP OHDYHV
or cells challenged with P.syringae compared to
control and non-treated samples. This indicates that
leaves and cells undergoing a defense reaction contain higher levels of S-nitrosothiols, which is consistent with the increased NO production during the
incompatible interaction [2].
7KH12WDUJHWSURWHLQVLGHQWL¿HGFRYHUEDsically any process of cellular physiology and include cytoskeleton proteins (11%), enzymes involved
84
in carbon and nitrogen mobilization (41%), pathogen- and stress-related proteins (10%), enzymes of
the antioxidant defense system (6%) and signaling
and regulating proteins (14%). The majority of the
NO targets were not exclusive to a given treatment,
which is in agreement with the dynamic nature of
S-nitrosylation, and suggests that the right balance
between both redox states are needed for the correct
function of the protein.
Comparison of S-nitrosylation targets in animal
V\VWHPV > @ ZLWK WKH SURWHLQV LGHQWL¿HG LQ WKLV
work and in previous studies in plants [4] reveals
common targets between animals and plants. About
RIWKHSURWHLQVLGHQWL¿HGKHUHUHSUHVHQWQRYHO
potential targets for S-nitrosylation, while others
KDYHEHHQLGHQWL¿HGLQSUHYLRXVVWXGLHVLQDQLPDOV
and plant systems.
These results provide clues on the possible NO
targets during basal and R-mediated resistance, and
VXJJHVWWKDW12VSHFL¿FPRGL¿FDWLRQRIWKHVHHQzymes allows the coordinated modulation of redox
signalling and orchestrates the outcome of compaWLEOH DQG LQFRPSDWLEOH LQWHUDFWLRQV :KLOH ZH DUH
planning to identify the cys residues involved and
SHUIRUP PXWDWLRQDO VWXGLHV ZLWK SXUL¿HG SURWHLQV
and transgenic of selected candidates, we have
conducted infection experiments with Arabidopsis
loss-of-function insertion mutants for redox- and
defense-related genes. The differential behaviour
of these mutants from wild-type control plants in
both, compatible and incompatible interactions, and
the monitoring of the progress of disease symptoms
provide evidence that these mutants are compromised in the activation of basal and R-mediated
defense responses.
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
$FNQRZOHGJHPHQWV
7KLV ZRUN ZDV FDUULHG RXW ZLWK ¿QDQFLDO VXpport from the Spanish “Ministerio de Educación
\&LHQFLD´3URMHFW%,2:HWKDQN,Qmaculada Redondo for her technical assistance.The
MS analysis was conducted at the Proteomics Unit
(SCAI) at Cordoba University. SEZ is supported by
a by a grant from the the Spanish “Ministerio de
Educación y Ciencia”.
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85
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Caracterización de S-glutationilación de proteínas a nivel de proteoma.
'L¿FXOWDGHV
Esperanza Morato López1, Sira Echevarría Zomeño2, Anabel Marina Ramírez1
1
Servicio de Proteómica. C.B.M. “Severo Ochoa”. CSIC-UAM
2
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Córdoba
La S-glutationilación no solo es una respuesta
celular al estrés oxidativo, también es un mecanismo para la regulación postraduccional dinámica de
proteínas reguladoras, estructurales y metabólicas.
Estudios recientes han demostrado su implicación
en la regulación de la señalización y rutas metabólicas de sistemas celulares [1, 2]. Por todo ello se
están desarrollando métodos analíticos y proteómicos que permitan la caracterización de estas modi¿FDFLRQHVGRQGHODSULQFLSDOOLPLWDFLyQDQLYHOGH
espectrometría de masas que hemos encontrado en
nuestro laboratorio es la “calidad” de los espectros
de fragmentación MS/MS.
Recibimos en nuestro laboratorio unas muestras para la caracterización de glutationilaciones.
(OREMHWLYRGHOWUDEDMRHUDODLGHQWL¿FDFLyQGHVLWLRV
de glutationilación de proteínas en el proteoma de
Arabidopsis thaliana tras la infección con la cepa
no virulenta de Pseudomonas syringae. Disponíamos del proteoma no infectado (NI), del proteoma
incubado 4 h con un placebo (MgCl) y del proteoma infectado 4 h con la cepa de P. syringae. De
cada proteoma disponíamos de tres condiciones: sin
agente reductor, tratada con glutatión (GSH) y tratada con glutatión disulfuro (GSSH). Comenzamos
el trabajo con las tres condiciones de la muestra NI,
para lo cual confeccionamos tres geles SDS-PAGE,
UHVSHFWLYDPHQWH FRQ HO ¿Q GH GLJHULU OD PXHVWUD
en gel concentrador y, de esta manera, limpiar el
proteoma [3] (el tampón de muestra no contenía
beta-mercaptoetanol ni DTT). Los péptidos obtenidos tras las digestiones se analizaron mediante
LC-MS empleando un espectrómetro de masas LTQ
7KHUPR)LVKHU6FLHQWL¿F3DUDODLGHQWL¿FDFLyQGH
péptidos se empleó el software SEQUEST (Thermo
)LVKHU 6FLHQWL¿F LQFOX\HQGR OD JOXWDWLRQLODFLyQ
FRPRPRGL¿FDFLyQYDULDEOH
Al analizar los resultados observamos un alto
Q~PHURGHJOXWDWLRQLODFLRQHVLGHQWL¿FDGDVWDQWRHQ
la muestra NI como en la NI+GSH. El número de
SpSWLGRV LGHQWL¿FDGRV FRQ XQ ;FRUU ! IXH PX\
similar (aproximadamente 200), así como fueron
similares los valores de este parámetro entre los
péptidos de ambas muestras. Analizamos de modo
manual los espectros MS/MS con mejores puntuaFLRQHVVLQFRQ¿UPDUQLQJXQDJOXWDWLRQLODFLyQHQOD
muestra NI, pero demostrando S-glutationilación
para la muestra NI+GSH. Las conclusiones preliminares de estos resultados son que este abordaje no
SHUPLWHOD³DXWRPDWL]DFLyQ´HQODLGHQWL¿FDFLyQGH
glutationilaciones en proteomas ya que no es posible
establecer un punto de corte, puesto que espectros
con el mismo valor de Xcorr pueden ser asignados
FRPR LGHQWL¿FDFLRQHV FRUUHFWDV R LQFRUUHFWDV (O
estudio en profundidad de los espectros MS/MS da
una explicación a este hecho y es la “idiosincrasia”
GH ORV PLVPRV SDUD HVWH WLSR GH PRGL¿FDFLyQ /D
gran mayoría son especies M+3H+, probablemente
debido a que en el glutatión el enlace entre el aspártico y la cisteína es tal que queda expuesto un
nuevo extremo -NH2 susceptible de protonación.
Esto acompleja el patrón de fragmentación a la par
que, en péptidos grandes, se pierde la zona alta del
espectro (m/z > 2000). Son espectros con un alto
nivel de “background” cuando los valores de Xcorr
no son > 4, y se asemejan mucho a espectros de
“contaminantes”. Este hecho hace que un espectro con mal aspecto que no se corresponda con el
péptido candidato tenga la misma puntuación, en
ocasiones, que el que si se corresponde. Dentro del
“background” podemos encontrar fragmentos procedentes del glutatión [4] como pérdida del glutámico,
de todo el glutatión o de parte del mismo, pero no
todos los fragmentos del espectro se pueden asignar
a este patrón extra de fragmentación.
En consecuencia, las puntuaciones obtenidas
empleando SEQUEST son, mayoritariamente, bajos, aún en las asignaciones correctas, lo que hace
muy difícil establecer un criterio de calidad que es
LPSUHVFLQGLEOH SDUD HO HVWXGLR GH PRGL¿FDFLRQHV
86
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
a gran escala. El examen manual de los espectros
sería impensable, solo factible cuando estudiamos
PRGL¿FDFLRQHVSDUDXQDSURWHtQD~QLFD
Quizás, un mayor conocimiento del mecanismo
de fragmentación de estos péptidos pueda dar lugar
D XQD PHMRUD HQ OD LGHQWL¿FDFLyQ FRUUHFWD GH ORV
mismos y, de esta forma, hacer posible el estudio de
HVWDPRGL¿FDFLyQDQLYHOGHSURWHRPD
regulatory device from bacteria to humans”.
Trends in Biochemical Sciences 2008; 34,
2:85-96.
[3]
Bonzon-Kulichenko E, Pérez-Hernández D,
Núñez E, Martínez-Acedo P, Navarro P, Trevisan-Herraz M, Ramos MC, Sierra S, MartínezMartínez S, Ruiz-Meana M, Miró-Casas E,
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>@
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D, Milzani A. “Protein S-glutathionylation: a
La inhibición de la síntesis de óxido nítrico durante la colestasis inducida
experimentalmente reduce la lesión hepatocelular al facilitar la homeostasis
de nitrosotioles
Laura M. López-Sánchez1, Fernando J. Corrales2, Montserrat Barcos3, Isabel Espejo3, Juan R.
Muñoz-Castañeda1, Antonio Rodríguez-Ariza1
1
Hospital Universitario Reina Sofía. Unidad de Investigación, IMIBIC, Córdoba, 2Universidad de Navarra,
Hepatology and Gene Therapy Unit, Pamplona, 3Hospital Universitario Reina Sofía. Servicio de Análisis
Clínicos, Córdoba
Introducción
Las intervenciones que faciliten el metabolismo
del óxido nítrico (NO) en etapas colestásicas tempranas pueden ayudar a mantener el estado redox de las
proteínas hepáticas. Además, escasos estudios han
explorado la participación de la S-nitrosilación de
proteínas y el metabolismo de nitrosotioles (SNO)
en la lesión hepatocelular por colestasis.
Metodología
6HGLYLGLHURQUDWDVPDFKR:LVWDUJHQ
4 grupos (n=10): operación simulada (OS), ligadura
del conducto biliar (BDL), y ratas BDL tratadas
con el inhibidor de síntesis de NO S-metilisotiourea
(SMT, 25 mg/Kg) o con ácido tauroursodeoxicólico
(TUDCA, 50 mg/Kg). La función hepática y NO
plasmático se analizaron mediante ensayos bioquímicos. La proliferación ductular se determinó en
cortes teñidos con hematoxilina-eosina y se con¿UPy FRQ LQPXQRWLQFLyQ HVSHFt¿FD FLWRTXHUDWLQD
GHFRODQJLRFLWRVPDGXURV/D¿EURVLVKHSiWLFD
se determinó mediante tinción con tricrómico de
Masson. Se analizó la expresión de la bomba exportadora de productos conjugados (Mrp2), afectada
en diversos modelos experimentales de colestasis,
mediante western blot, y la de iNOS y la enziPDQLWURVRJOXWDWLyQUHGXFWDVD*6125FRGL¿FDGD
por el gen ADH5 en humanos) por RT-PCR. Las
SURWHtQDV6QLWURVLODGDVVHGHWHFWDURQ\SXUL¿FDURQ
con el método “biotin-switch”, una aproximación
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
metodológica que permite el marcado selectivo de
las nitrosoproteínas con biotina, en el que los tioles
libres se bloquean con metil metanotiosulfonato, a
continuación los SNO son reducidos selectivamente
FRQ DVFRUEDWR \ ¿QDOPHQWH ORV WLROHV QXHYDPHQWH
formados reaccionan con HPDP-biotina. Las proteínas biotiniladas se detectaron mediante un antiFXHUSRDQWLELRWLQDRSXUL¿FDURQXWLOL]DQGRHVWUHSWDYLGLQD\VHLGHQWL¿FDURQSRUDQiOLVLVSURWHyPLFR
con HPLC acoplado a ESI-MS/MS.
Resultados
Figura 1. Marcadores séricos de función hepática en ratas
BDL.
87
Después de 7 días, el inhibidor de iNOS fue
mucho mas efectivo que TUDCA en reducir la lesión hepatocelular, con una disminución de enzimas
hepáticas y de bilirrubina circulantes (Figura 1) y
XQJUDGRVLJQL¿FDWLYDPHQWHPHQRUGHSUROLIHUDFLyQ
GXFWXODU\¿EURVLVSHULSRUWDO>@$PERVWUDWDPLHQtos recuperaron los niveles basales del transportador
canalicular Mrp2 cuya expresión se inhibe durante
la colestasis (Figura 2), pero sólo el tratamiento
FRQ607GLVPLQX\yVLJQL¿FDWLYDPHQWHORVHOHYDGRV
niveles plasmáticos de NO y de proteínas hepáticas
S-nitrosiladas en las ratas BDL (Figuras 3 y 4). La
expresión de GSNOR hepática, que regula la homeostasis de SNO y los niveles de proteínas S-nitrosiladas, mostró un acusado descenso en ratas BDL,
que se recuperó tras el tratamiento con SMT, pero no
FRQ78'&$)LJXUD6HLGHQWL¿FDURQSURWHtnas hepáticas que se encontraban S-nitrosiladas en
ratas BDL (Tabla 1), incluyendo enzimas mitocondriales que participan en la síntesis de ATP y el metabolismo de ácidos grasos, dos procesos que se ven
alterados en colestasis. Además, dos de las proteínas
LGHQWL¿FDGDVIXHURQOD6DGHQRVLOPHWLRQLQDVLQWHWDsa (también llamada metionina adenosiltransferasa,
MAT), y la betaína-homocisteina S-metiltransferasa
(BHMT), dos importantes enzimas implicadas en el
ciclo de la metionina cuya alteración es frecuentemente observada en procesos colestásicos.
)LJXUDProducción de NO y expresión del gen Nos2 en
ratas BDL.
Figura 2. Expresión de la proteína Mrp2 en ratas BDL.
Figura 4. Detección de proteínas S-nitrosiladas en ratas
BDL. *Lisado hepático incubado in vitro con GSNO.
88
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Tabla 1. 3URWHtQDV6QLWURVLODGDVLGHQWL¿FDGDVPHGLDQWH/&0606HQOLVDGRVGHKtJDGRVGHUDWDV%'/
Nombre de la proteína
Proteínas del citoesqueleto
ĮDFWLQD
Número de
Número
acceso NCBI de péptidos
Cobertura de
VHFXHQFLD
Localización
P62738
1
10
Cit
P04691
1
4
Cit
S-adenosil metionina sintetasa tipo 1
P13444
1
6
Cit
Aldehido deshidrogenasa, microsomal
P30839
2
5
RE
$73VLQWDVDVXEXQLGDGĮ
P15999
1
2
Mit
Betaina-homocisteina S-metil-transferasa 2
Q68FT5
1
4
Cit
Carbamoil-fosfato sintasa 1
P07756
13
20
Mit
Carboxilesterasa 3 precursor
P16303
3
7
RE
Dihidroxiacetona quinasa
Q4KLZ6
2
6
RE
10-formiltetrahidrofolato deshidrogenasa
P28037
2
3
Cit
Fructosa-bifosfato aldolasa B
P00884
3
11
Cit
Glutamato deshidrogenasa 1
P10860
1
5
Mit
Hidroximetilglutaril-CoA sintasa
P22791
3
17
Mit
3-cetoacil-CoA tiolasa
P13437
1
8
Mit
L-lactato deshidrogenasa, cadena A
P04642
1
6
Cit
Acido graso CoA ligasa, cadena larga 1
P18163
2
9
Mit
Malato deshidrogenasa
P04636
1
21
Mit
Piruvato carboxilasa mitocondrial precursor
P52873
2
6
Mit
P34058
1
6
Cit
PDI
P04785
2
9
RE
Riboforina 1
P07153
2
7
RE
Glutatión S-transferasa Mu 1
P04905
2
28
Cit
Glutatión S-transferasa Mu 2
P08010
3
22
Cit
P62632
1
4
Cit
P02770
3
12
Sec
7XEXOLQDFDGHQDȕ$
Enzimas metabólicas
Chaperonas moleculares
+63ȕ
(Q]LPDVGHGHWR[L¿FDFLyQ
Proteínas de señalización
)DFWRUGHHORQJDFLyQĮ
Otras
Albúmina de suero, precursor
89
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Figura 5. Actividad GSNOR hepática y expresión del gen Adh5 en ratas BDL.
Conclusiones
Referencias
1XHVWURV UHVXOWDGRV DSR\DQ HO EHQH¿FLR WHUDpéutico de inhibir la síntesis de NO, en un contexto
colestásico, al facilitar la homeostasis de nitrosotioles. y proporcionan dianas de S-nitrosilación que
posibilitarán el desarrollo de nuevas terapias en dolencias colestásicas.
[1]
Agradecimientos
Financiado por FIS PI 07/0159
López-Sánchez LM, Corrales FJ, Barcos M, Espejo I, Muñoz-Castañeda JR, Rodríguez-Ariza
A. Inhibition of nitric oxide synthesis during
induced cholestasis ameliorates hepatocellular
injury by facilitating S-nitrosothiol homeostasis. Lab Invest. 2009 Oct 5. DOI: 10.1038/
labinvest.2009.104.
90
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
'HVDUUROORGHPHWRGRORJtDVSDUDODGHWHFFLyQGHPRGL¿FDFLRQHVSRVWUDGXFFLRQDOHV
HQFLVWHtQDV6QLWURVLODFLyQ\R[LGDFLyQPHGLDQWHDSUR[LPDFLRQHVSURWHyPLFDV
EDVDGDVHQPDUFDMHÀXRUHVFHQWH\HOHFWURIRUHVLVELGLPHQVLRQDO
Daniel Tello, Rubén Fernández-Rodríguez, Antonio Martínez-Ruíz
Hospital Universitario de La Princesa, Madrid, España
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (RNS) pueden jugar un papel fundamental
en mecanismos de señalización celular en diversos
SURFHVRV ¿VLRSDWROyJLFRV (QWUH ORV PHFDQLVPRV
moleculares por los que actúan, van cobrando imSRUWDQFLD YDULRV WLSRV GH PRGL¿FDFLyQ UHYHUVLEOH
en cisteínas entre ellas la nitrosilación, tiolación y
formación de ácido sulfénico, además de la formaFLyQGHSXHQWHVGLVXOIXURHVSHFt¿FRV'HELGRDHOOR
en los últimos años se ha puesto gran interés en la
aplicación de diferentes métodos proteómicos para
ODGHWHFFLyQHLGHQWL¿FDFLyQGHHVWDVPRGL¿FDFLRQHV
postraduccionales “nitroxidativas”.
El método de “biotin switch” abrió paso a la
LGHQWL¿FDFLyQ SURWHyPLFD GH SURWHtQDV 6QLWURVLODGDV\VHKDPRGL¿FDGRGHVSXpVSDUDGHWHFWDURWUDV
PRGL¿FDFLRQHVHQFLVWHtQDV'LFKRPpWRGRVHEDVD
HQ OD VXVWLWXFLyQ GH OD PRGL¿FDFLyQ QLWURVRWLRO R
cisteína oxidada) por biotina, previa reducción esSHFt¿FD GHO WLRO R[LGDGR DVFRUEDWR HQ HO FDVR GH
nitrosotioles y DTT en el caso de cisteínas oxidadas). Una evolución del clásico “biotin switch” es el
GHQRPLQDGR³ÀXRUHVFHQFHVZLWFK´HQHOFXDOVHKD
VXVWLWXLGRODELRWLQDSRUXQÀXRUyIRURFRQFDSDFLGDG
para reaccionar con tioles libres.
+HPRVGHVDUUROODGRXQPpWRGRGH³ÀXRUHVFHQFH
VZLWFK´FRQPDOHLPLGDÀXRUHVFHtQDFRPRPDUFDdor, y empleando electroforesis bidimensionales,
SDUDODLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDV6QLWURVLODGDVOR
TXHQRVKDSHUPLWLGRLGHQWL¿FDUSURWHtQDVVHQVLEOHV
a nitrosocisteína (CysSNO) en células endoteliales
y denotar la importancia de la ruta de la tiorredoxina
reductasa en la eliminación de nitrosotioles en maFUyIDJRVDFWLYDGRV>@(QHVWHFDVRODLGHQWL¿FDFLyQ
se ha conseguido correlacionando el aumento en la
VHxDO FRUUHVSRQGLHQWH D OD ÀXRUHVFHtQD FRQ HO SDtrón de proteína total marcada con un reactivo que
detecta proteína total en solución neutra (Lucy-565),
de forma que pudiéramos obtener ambos patrones
ÀXRUHVFHQWHVGHIRUPDVLPXOWiQHDHQHOPLVPRJHO
Este tipo de metodología proteómica la estamos
DSOLFDQGRDODGHWHFFLyQHLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVFRQFLVWHtQDVR[LGDGDVHQODUHVSXHVWD¿VLROyJLFD
a hipoxia en diversos sistemas celulares. Se ha susWLWXLGRHOPDUFDGRUÀXRUHVFHQWHPDOHLPLGDÀXRUHVceína por Bodipy-FL, el cual presenta carga neta
neutra, con lo que se elimina el desplazamiento en la
migración de las proteínas en el isoelectroenfoque.
Para observar diferencias pequeñas entre diferentes
condiciones estamos aplicado una metodología baVDGDHQGRVÀXRUyIRURV/DVPXHVWUDVVHPDUFDQFRQ
Bodipy-FL o Bodipy-TMR y se cargan en el mismo
gel bidimensional. Sin embargo, el análisis detallado
de los resultados en ambos esquemas, para relacionarlos con el patrón de proteína total, requiere de un
cambio en los protocolos de análisis respecto a los
paquetes de software preparados para los esquemas
habitualmente utilizados.
Referencias
[1]
Tello D, Tarín C, Ahicart P, Bretón-Romero R,
/DPDV 6 0DUWtQH]5XL]$$ ³ÀXRUHVFHQFH
switch” technique increases the sensitivity
RI SURWHRPLF GHWHFWLRQ DQG LGHQWL¿FDWLRQ RI
S-nitrosylated proteins. Proteomics 2009; in
press. Published online with DOI 10.1002/
pmic.200900070.
91
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$QDO\VLVRIUHYHUVLEOHDQGLUUHYHUVLEOHSURWHLQPRGL¿FDWLRQVXSRQR[LGDWLYHVWUHVV
in Schizosaccharomyces pombe by proteomic approaches
Sarela García-Santamarina, Susanna Boronat, Elena Hidalgo
Departament de Ciències Experimentals i de la Salut. Universitat Pompeu Fabra
Reactive oxygen species (ROS) (H2O2, OH·, O2-.)
generated as a consequence of the oxygen metabolism
in aerobic organisms, have important roles in cell signalling. However, if they reach concentrations beyond
homeostatic levels they generate a situation of oxidative stress where damages to cellular components are
produced. In the case of H2O2, even physiological levels may produce a chronic low level of stress, which
progressively drives the cell into the aging process.
In order to understand the consequences of an
oxidative stress situation in the cell, it is important
to unravel which are the primarily biological targets
of ROS and which are the consequences of such
reactivity. Here we report the study of different tySHVRIPRGL¿FDWLRQVWKDW526SURGXFHLQSURWHLQVLQ
Schizzosacharomyces pombe, under exogenous oxidative stress, by adding H2O2 to the culture media,
and also under endogenous oxidative stress, using
mutant strains defective for ROS scavengers.
By 1D electrophoresis, we observe that reverVLEOH GLVXO¿GH ERQG IRUPDWLRQ LV LQFUHDVHG XSRQ
both stresses, and in the case of H2O2 treatment,
the kinetics correlates with oxidative activation of
the S. pombe H2O2VHQVRU3DS:HDOVRVKRZKRZ
shifting the growth of the mutant strains from an
anaerobic condition to an aerobic one results in
differential irreversible carbonylation of proteins.
:HDUHH[WHQGLQJWKHVHVWXGLHVWRWKHSURWHRPHOHYHO
WRLGHQWLI\WKHWDUJHWSURWHLQVRIERWKVWUHVVHV:H
KDYH HVWDEOLVKHG D PRGL¿FDWLRQ RI WKH ,&$7 SURWRFROWRTXDQWLI\WKHH[WHQWRIUHYHUVLEOHPRGL¿HG
cysteines. In addition, we have established a 2D
electrophoresis approach to identify targets of carERQ\O PRGL¿FDWLRQV SURGXFHG E\ R[LGDWLYH VWUHVV
This would allow us to study the consequences of
LUUHYHUVLEOHDQGUHYHUVLEOHSURWHLQPRGL¿FDWLRQVDQG
their biological relevance after situations of intrinsic
and extrinsic oxidative stresses.
La lipoproteína lipasa de rata se nitra in vivo en respuesta a la administración
de lipopolisacárido
Albert Casanovas1, Montserrat Carrascal2, Joaquín Abián2, Miquel Llobera1, M. Dolores LópezTejero1
1
Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona, Barcelona,
España. 2CSIC/UAB Proteomics Laboratory, IIBB-CSIC-IDIBAPS, Universitat Autònoma de Barcelona,
Bellaterra, España.
La lipoproteína lipasa (LPL) juega un papel
central en el metabolismo lipídico hidrolizando los
triacilgliceroles (TAG) plasmáticos. Una de las respuestas metabólicas características a la infección es
la hipertrigliceridemia, que es consecuencia, al menos en parte, de la disminución de la actividad LPL
de los tejidos. La administración de lipopolisacárido
(LPS) provoca una inhibición de la actividad LPL
tisular a nivel postranscripcional [1,2] y un aumento
de la producción de óxido nítrico (NO). Estudios
anteriores han propuesto una relación causa/efecto
entre el aumento de la síntesis de NO y la disminución de actividad LPL tisular [2] aunque no se
ha determinado si esta interacción es directa o está
92
mediada por otros factores. En este trabajo hemos
estudiado la potencial nitración in vivo de la LPL en
respuesta a la administración de LPS en rata.
La administración de LPS produce un aumento
de los TAG circulantes, de la expresión de la óxido
nítrico sintasa inducible, de la producción de NO y
una disminución generalizada de la actividad LPL en
tejidos. De manera preliminar evaluamos la sensibilidad de la LPL a la nitración, tratando in vitro LPL
bovina con peroxinitrito, una especie reactiva del
QLWUyJHQR516/DQLWUDFLyQGHWLURVLQDVVHKDGH¿nido como un marcador de la interacción de proteínas
con RNS. Así, la nitración de la LPL bovina tratada
con peroxinitrito se determinó mediante Western blot
DQWLQLWURWLURVLQD \ PHGLDQWH OD LGHQWL¿FDFLyQ SRU
espectrometría de masas en tándem (MS/MS) de
VHFXHQFLDVHVSHFt¿FDVGHOD/3/TXHFRQWHQtDQWLURsinas nitradas. Para la localización de nitrotirosinas
mediante espectrometría de masas se compararon
tres estrategias distintas de fragmentación MS/MS:
(1) MS/MS dependiente de datos de los péptidos
más abundantes, (2) MS/MS dependiente de datos de
SpSWLGRVSUHVHQWHVHQXQDOLVWDGHLRQHVSUHGH¿QLGD
y (3) MS/MS secuencial siguiendo una lista de iones
SUHGH¿QLGD)LJXUD
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alta para este modo de barrido. Este análisis permitió
detectar 8 residuos nitrados in vitro en la LPL bovina
(Figura 1). El alto grado de homología entre la LPL
bovina y la de rata permitieron el uso de los espectros
MS/MS de péptidos nitrados de la LPL bovina como
espectros de referencia para el análisis de una potencial nitración in vivo de la LPL de rata en respuesta a
la administración de LPS. Para el estudio de la LPL
GHUDWDPHGLDQWHKHUUDPLHQWDVSURWHyPLFDVSXUL¿FDmos parcialmente la enzima a partir de homogenado
GHFRUD]yQPHGLDQWHFURPDWRJUDItDGHD¿QLGDGDKHparina-Sepharose y resolvimos isoformas de pI de la
LPL mediante electroforesis en 2 dimensiones, como
describimos en trabajos anteriores [3]. Las isoformas
de pI de la LPL se recortaron del gel, se digirieron
con tripsina y los péptidos obtenidos se analizaron
mediante MS/MS secuencial siguiendo una lista de
LRQHVSUHGH¿QLGD)LJXUD(VWHDQiOLVLVOOHYyDOD
LGHQWL¿FDFLyQGHWUHVUHVLGXRVGHWLURVLQDQLWUDGRVin
vivo (en las posiciones 94, 164 y 316) en la LPL de
corazón de rata tratada con LPS (Figura 1).
(VWHHVWXGLRHVHOSULPHURHQLGHQWL¿FDUUHVLGXRV
nitrados en la LPL, tanto in vivo como in vitro, y
demuestra que la LPL es una diana de las RNS en el
contexto de la endotoxemia [4]. Así, estos resultados
sugieren que la nitración puede constituir un mecanismo nuevo de regulación de la actividad LPL tisular y abren las puertas a futuros estudios dirigidos
DODQiOLVLVGHHVWDPRGL¿FDFLyQHQRWUDVVLWXDFLRQHV
en las que se ha propuesto que la LPL puede estar
regulada por NO.
Referencias
Figura 1. Alineación de las secuencias de la LPL bovina y
de rata y localización de las tirosinas nitradas detectadas.
En la secuencia se indican las tirosinas nitradas detectadas
HQOD/3/ERYLQDSXQWDVGHÀHFKDQHJUDV\HQOD/3/GH
UDWDSXQWDVGHÀHFKDEODQFDVXWLOL]DQGRXQDHVWUDWHJLDGH
fragmentación MS/MS secuencial sobre un listado de iones
SUHGH¿QLGR(QJULVVHLQGLFDODPi[LPDFREHUWXUDHVSHUDble con el listado de iones barridos, mientras que la cobertura detectada experimentalmente se muestra en negrita. El
péptido señal se indica en cursiva. Los aminoácidos están
numerados empezando por el extremo N-terminal de la proteína madura. LPLb, LPL bovina; LPLr, LPL de rata.
La primera estrategia de fragmentación ofreció la
máxima cobertura de secuencia, mientras que el tercer método permitió detectar un mayor número de
tirosinas nitradas, mostrando una sensibilidad más
[1]
Gouni I, Oka K, Etienne J y Chan L. Endotoxininduced hypertriglyceridemia is mediated by
suppression of lipoprotein lipase at a post-transcriptional level. J Lipid Res 1993;34:139-46.
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93
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Application of iTRAQ reagents to relatively quantify the reversible redox state
of cysteines
Brian McDonagh, C. Alicia Padilla, J. Antonio Bárcena
Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Córdoba, Instituto Maimónides de
Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC), Spain
The dynamic nature of the proteome ensures that
the cell is able to respond to environmental, genetic,
biochemical and pathological perturbations. How
the proteome responds to these stimuli is of considerable interest as it can relate to the cells stress
response and can take the form of post-translational
PRGL¿FDWLRQV DQG LQWHUSURWHLQ LQWHUDFWLRQV ZLWK
subsequent effects on translation and transcription.
Improvements in mass spectrometry has lead to the
development of a number of techniques to quantify
the abundance of proteins within any given sample,
WKHVH LQFOXGH LVRWRSH FRGHG DI¿QLW\ WDJV ,&$7
stable isotope labelling of amino acids in cell culture (SILAC) isobaric tags for relative and absolute
TXDQWL¿FDWLRQ L75$4 +RZHYHU PHDVXULQJ WKH
relative quantity of a protein between two samples
does not tell us anything about the functional state
of the protein itself, this is especially important in
reference to redox proteins that contain thiol switches and are susceptible to activation or inactivaWLRQ:HKDYHXVHGWKHUHGR[VHQVLWLYH\HDVWHQ]\PH
alcohol dehydrogenase, which has a decrease in the
number of free thiols and loss of activity in response
to oxidative stress. This protein contains two cysteine containing tryptic peptides that are amenable to
06DQDO\VLV:HKDYHDSSOLHGL75$4WHFKQRORJ\
to these peptides to relatively quantify the reversible
redox state of cysteine peptides both in a control and
test state, in a single analysis.
94
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4. PROTEÓMICA CUANTITATIVA
Coordinadores: Miren J. Omaetxebarría y Eva Rodríguez-Suárez
Soluciones a Retos Analíticos en Proteómica Cuantitativa y Validación de
Biomarcadores
Isidro Masana
Agilent Technologies – Barcelona
/DFXDQWL¿FDFLyQGHSpSWLGRV\SURWHtQDVHVWiDGquiriendo cada vez una mayor importancia en proteómica. A medida que se van descubriendo potenciales
FDQGLGDWRVDELRPDUFDGRUHVVXFRQ¿UPDFLyQ\YDOLGDción -cada vez más- requiere herramientas analíticas
FDSDFHVGHFXDQWL¿FDUGHFHQDVFHQWHQDVGHSpSWLGRV
concretos, en un gran número de muestras con muy
elevada sensibilidad y reducido tiempo de análisis.
La nano-cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas con la tecnología de triple cuadrupolo (nano-LC/MS-QQQ) en su modalidad de MRM
(“Multiple Reaction Monitoring”) proporciona hoy
en día la mayor sensibilidad, robutez y selectividad
SDUDODFXDQWL¿FDFLyQGH³FRPSXHVWRVGLDQD´³WDUJHW
compounds”) en muestras complejas. La modalidad
MRM también ofrece una alta precisión y un tiempo
GHFLFORPX\UiSLGRSDUDSRGHUFXDQWL¿FDUKDVWDXQRV
pocos miles de péptidos en un solo análisis. Todo ello
la convierte en la tecnología ideal para aplicaciones
cuantitativas y especialmente para la validación de
marcadores biológicos con alto rendimiento.
Retos analíticos: elevada sensibilidad
Comparando equipos de igual gama, los QqQ en
MRM son capaces de proporcionar sensibilidades del
orden de 20 veces mejores que otros sistemas de MS/
MS que siempre proporcionan el espectro completo.
&RQ4T4VHSXHGHQOOHJDUDFXDQWL¿FDUGHVGHQLYHOHV
muy bajos de atomoles con buena repetibilidad (Figura 1). Su mayor sensibilidad se debe a:
1º La total focalización de la detección por MRM
en sólo los iones precursores y producto de interés (estos se irán programando en el tiempo).
2º Al efectuar MS/MS en el espacio, la sensibilidad del proceso de detección en un QqQ no se
ve reducida por la coelución con otros péptidos
mayoritarios. Con respecto a sistemas basados
HQUHDOL]DU0606HQHOWLHPSRFRQ¿QDPLHQWR
atrapado temporal de los iones en un espacio),
los QqQ proporcionan una mayor y más robusta
sensibilidad - menos “entorno dependiente”pues ésta sólo se ve afectada por cambios en la
respuesta debida a interacciones en el proceso de
ionización de péptidos coeluyentes. En sistemas
EDVDGRVHQHOFRQ¿QDPLHQWRGHLRQHVDGHPiV
es habitual perder sensibilidad en la detección
de péptidos minoritarios cuando éstos coeluyen
con otros de mayoritarios o contaminantes del
sistema; éstos generan una saturación de cargas
en el espacio de atrapado de los iones que reduce la sensibilidad (por reducción en el tiempo de
acumulación o cambio en la m/z medida).
'HVGHHOSXQWRGHYLVWDFURPDWRJUi¿FRORVVLVtemas basados en nano-cromatografía (como p.e. el
sistema HPLC-Chip/MS) [1] serán los que mayor
sensibilidad proporcionen. Una buena cromatografía
será también importante para minimizar las posibles
supresiones en la ionización, y reducir así efectos
adversos de la matriz de la muestra o coeluciones
con péptidos mayoritarios. Otra posibilidad es la de
utilizar sistemas de preconcentración selectiva del
tipo de péptidos de interés; destaca el nuevo HPLC/
Fosfo-Chip [2-3] que incluye una precolumna de
óxido de titanio y permite automatizar la preconcentración selectiva de los péptidos fosforilados y
su análisis por separado del resto de péptidos no
fosforilados (que suelen estar presentes a concentraciones mucho más elevadas).
95
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Figura 1. &XDQWL¿FDFLyQ FRQ 7ULSOH &XDGUXSROR GH DPRO D IPRO GH SHUR[LGDVD HQ VXHUR KXPDQR MRM péptido
ALELFR2+ (480.3 Î 630.4).
Desde el punto de vista de preparación de muesWUDVXDGHFXDGDVLPSOL¿FDFLyQD\XGDDPHMRUDUPX\
considerablemente la sensibilidad. Eliminar proteínas
mayoritarias [4], fraccionar las proteínas o péptidos
por pI (Offgel Electroforesis) [5], por cromatografía
(mRP-C18, SCX,..) o con los tradicionales geles son
herramientas todas ellas muy útiles. Eliminar las 14
proteínas mayoritarias~94% proteína total (Hu-14
Column) y luego fraccionar la fracción de proteínas
minoritarias por pI con un sistema de Offgel Electroforesis, que permite recoger directamente la muestra
en solución líquida (compatible con LC/MS) con
elevada resolución (hasta 0,1 unidades pI), es muy
útil para separar isoformas y facilitar el estudio de
PRGL¿FDFLRQHVSRVWWUDGXFFLRQDOHV
QDQRÀXMRORVEDVDGRVHQGLYLVLyQGHÀXMRVXHOHQVHU
los que proporcionan volúmenes de retardo del gradiente más pequeños (en algunos sólo unos pocos
centenares de nL) y permiten análisis más rápidos.
Otro punto a considerar es la rapidez del detecWRU3DUDXQDEXHQDFXDQWL¿FDFLyQVHUHTXHULUiQXQRV
10-15 puntos de medida a lo largo del pico (mínimo
HQIXQFLyQGHODQFKRGHOSLFRFURPDWRJUi¿FR\GHOQžGHSpSWLGRVFRHOX\HQWHVDFXDQWL¿FDUVH
SRGUiGH¿QLUHOWLHPSRPi[LPRGHPRQLWRUL]DFLyQ
de cada transición. Los QqQ más rápidos permiten
medir hasta +200 transiciones MRM distintas por
segundo, unas 20 veces más rápido que el resto de
sistemas MS/MS que, a lo sumo, suelen llegar a
10 MS/MS por segundo y limitan el nº de péptidos
FRHOX\HQWHVTXHVHSXHGHQFXDQWL¿FDU
Retos Analíticos: Rapidez
La elevada variabilidad de los sistemas biológicos conlleva tener que evaluar un elevado nº de
individuos de cada una de las poblaciones sujetas a
estudio, que exigirá el uso de métodos optimizados
SDUDXQDQiOLVLVUiSLGRUREXVWR\FRQVX¿FLHQWHVHQsibilidad de los péptidos de interés. Para ello conviene disponer de sistemas de nano-cromatografía rápidos; capaces de proporcionar un mínimo volumen
de retardo del gradiente, para evitar que el cambio
de composición del eluyente tarde mucho tiempo
(5-10min) en llegar a columna y retrase todo el
cromatograma (primeros péptidos eluyendo al cabo
de 10-15min). De los diversos tipos de sistemas de
Referencias
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María Luz Valero, Virginia Rejas, Manuel Mateo Sánchez del Pino
Laboratorio de Proteómica. Centro de Investigación Príncipe Felipe. Avda. Autopista del Saler 16. 46012
Valencia
/D FXDQWL¿FDFLyQ GH ODV GLIHUHQFLDV HQWUH GRV
RPiVHVWDGRV¿VLROyJLFRVGHXQVLVWHPDELROyJLFR
es una de las tareas más importantes y difíciles en
proteómica. En los últimos años se están desaUUROODQGRPpWRGRVGHFXDQWL¿FDFLyQEDVDGRVHQOD
espectrometría de masas como complemento a las
técnicas más clásicas basadas en 2D PAGE. Los
métodos más populares utilizan marcajes isotópicos
diferenciales siendo uno de los más utilizados el
sistema iTRAQ (Applied Biosystems).
Para obtener la máxima información de un experimento iTRAQ es fundamental un adecuado diseño del
mismo. Según el problema biológico que queramos
abordar será necesario utilizar un número de replicas
ELROyJLFDVVX¿FLHQWHSDUDGLVFHUQLUODVYDULDFLRQHVLQtrínsecas a la muestra [1; 2] de las debidas al problema
biológico en estudio. En el caso de experimentos complejos con elevado número de réplicas que impliquen
varios experimentos iTRAQ será necesario introducir
en todos los experimentos un estándar interno que
permita posteriormente un análisis global de todas las
muestras presentes en el estudio.
Preparación de la muestra
Una vez se dispone de un diseño experimental
claro el primer paso es la preparación de las muestras. En nuestra experiencia es mejor partir de la
mayor cantidad de proteína recomendada para evitar
problemas debidos al exceso de reactivos, como la
formación de precipitados y la obturación de los
VLVWHPDVFURPDWRJUi¿FRV
Una vez elegidas y disponibles las muestras a
analizar hemos de ponerlas en un medio adecuado
para el análisis. En general, la precipitación es el
método más usado en este paso. Para la elección del
medio para redisolver las proteínas hay que tener en
cuenta que sea compatible con los tratamientos de
reducción, alquilación y digestión. Además, para
el marcaje posterior ha de evitarse la presencia de
aminos reactivos en el medio y de otros posibles
QXFOHy¿ORVFRPRWLROHV&RQHVWDVUHVWULFFLRQHVHQ
ocasiones es difícil disolver la muestra, siendo necesaria una puesta a punto para cada tipo de extracto
proteico. Tras disolver la muestra es necesario reali]DUXQDFXDQWL¿FDFLyQ¿DEOHGHODFDQWLGDGWRWDOGH
proteína presente en cada muestra.
Marcaje y separación de los péptidos
Las muestras marcadas diferencialmente se
combinan y se elimina el exceso de reactivos y compuestos que podrían potencialmente interferir con la
cromatografía líquida o el análisis de MSMS de los
péptidos. En la mayoría de aplicaciones es necesario prefraccionar la mezcla de péptidos ya que las
muestras suelen ser demasiado complejas para un
único análisis LCMSMS.
97
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Hay diferentes métodos de separación de péptidos que pueden aplicarse en este punto. La elección
de uno u otro dependerá del tipo de péptidos que
queramos separar y de la disponibilidad de equipos.
En el laboratorio habitualmente realizamos cromatografía C18RP a pH básico [3; 4], cromatografía
SCX y, más recientemente, también mediante IEF
[5] en gradientes de pH inmovilizados (3-10NL,
7 cm, GE). En todos los casos se prefraccionan de
200 a 400 µg de péptidos y suele ser necesario una
tratamiento posterior de limpieza y/o concentración
antes del análisis por LCMSMS.
Fragmentación de los péptidos
Para el análisis por MSMS de los péptidos marcados es necesario ajustar los parámetros respecto
a los que utilizaríamos para los péptidos no marcados. En el caso de los espectrómetros de masas
QTOF de ABI (QStar) este ajuste es muy sencillo, y
consiste en incrementar los valores de intercept de
la ecuación |CE|0=(slope)*(m/z)+(intercept) usada
para calcular la energía de colisión para cada ión. El
incremento es mayor para los péptidos derivatizados
con iTRAQ 4 plex que con iTRAQ 8plex. Con otro
tipo de espectrómetros de masas su puesta a punto
es más compleja [6].
Análisis de resultados
Con los péptidos analizados se ha de proceder
DODLGHQWL¿FDFLyQ\FXDQWL¿FDFLyQGHODVSURWHtQDV
presentes en las muestras. El hecho de que ambas
determinaciones se realicen simultáneamente supone una gran ventaja respecto a los sistemas de
FXDQWL¿FDFLyQEDVDGRVHQODVHSDUDFLyQGHODVSURWHtQDVHQJHO/DLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVVHKDFH
de manera convencional indicando simplemente la
PRGL¿FDFLyQTXtPLFDXWLOL]DGD
(O KHFKR GH TXH OD FXDQWL¿FDFLyQ VH UHDOLFH D
nivel de MSMS hace que las relaciones S/N sean
mejores. En este punto cabe destacar que según el
instrumento utilizado en el análisis el rango lineal
para la determinación de estas áreas será diferente.
3DUDODFXDQWL¿FDFLyQVHXWLOL]DQWRGRVORVHVSHFWURV
DVLJQDGRVDSpSWLGRVFRQXQDFRQ¿GHQFLDDGHFXDGD
y en los que haya sido posible medir las áreas de los
iones reporteros con bajo error.
3RURWURODGRDOUHDOL]DUODFXDQWL¿FDFLyQKDGH
tenerse en cuenta que se ha podido introducir un
error experimental diferente en la manipulación de
cada muestra, así como la pureza de los distintos
reactivos usados. Ha de comprobarse también que
QR VH KDQ XWLOL]DGR SDUD FXDQWL¿FDU SpSWLGRV TXH
pertenezcan a varias proteínas (isoformas) o cuya
asignación sea dudosa.
Si todo esto se realiza adecuadamente la técnica
nos permitirá disponer de un elevado número de
SURWHtQDV FXDQWL¿FDGDV HQ XQ SHULRGR GH WLHPSR
razonable.
Referencias
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Roque Bru-Martínez2
1
Proteomics Platform. CIC bioGUNE, CIBERehd, ProteoRed. Technology Park of Bizkaia, Building 800.
Derio, Spain. 2Grupo de Proteómica y Genómica Funcional de Plantas. Departamento de Agroquímica
y Bioquímica. Facultad de Ciencias. Universidad de Alicante. Spain. 3Servicio Proteómica. Universidad
Pompeu Fabra. Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona. Dr Aiguader 88. 08003 Barcelona, Spain
Quantitation of changes in protein abundance
is key to discovering novel biomarkers. Currently,
reverse phase liquid chromatography coupled to
tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) can
be used to quantify changes in protein expression
levels. Nevertheless, quantitative analysis of protein
mixtures by HPLC-MS/MS is still hampered by the
wide range of protein expression levels, the high dynamic range of protein concentrations and the lack
of reliable quantitation algorithms. In this context,
we describe two different samples (4-protmix and
8-protmix) suitable for relative protein quantitation
using isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation (iTRAQ). Using the 4-protmix, relative protein changes of up to 24-fold were measured. The
8-protmix allowed the quantitation of the relative
protein changes in a mixture of proteins within the
range of two orders of magnitude in concentration
and 10-fold differences in relative abundance.
Figure 1. Schematic view of the preparation of the
4-protmix.
The two reference samples proposed here (4-protmix and 8-protmix) cover a wide range of protein
fold changes and protein concentrations, respectively, which can be used to optimize the settings used
during acquisition with different mass spectrometers
and to test the performance of different quantitation
algorithms used for iTRAQ experiments.
Three technical replicates corresponding to 800
fmol of 4-protmix and 8-protmix were analyzed by
HPLC-MS/MS using two platforms, a ChipLC coupled to a 6530 Q-ToF (Agilent Technologies) and a
1200 nano-HPLC (Agilent Technologies) coupled to
DQ/742UELWUDS7KHUPR)LVKHU6FLHQWL¿F$VDUHsult, the analysis of the 4-protmix and the 8-protmix
OHGWRWKHVXFFHVVIXOLGHQWL¿FDWLRQDQGTXDQWLWDWLRQRI
all proteins in the samples (Tables 1 and 2).
Figure 2. Schematic view of the preparation of the
8-protmix.
As shown here, we were able to detect up to
24-fold changes in protein ratios. The standard deYLDWLRQıZDVW\SLFDOO\ORZHUWKDQEXWUDQJHG
IURP ı WR ı 7KH KLJKHVW ı FRUUHsponded to the highest protein fold change in our
samples (24-fold).
99
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Table 1. 4-protmix iTRAQ protein relative quantitation. A: ChipLC coupled to a 6530 Q-ToF and analysed using MASCOT.
B: 1200 nanoHPLC coupled to LTQ Orbitrap and analysed using Proteome Discover.
Table 2. 8-protmix iTRAQ protein relative quantitation measured with LTQ Orbitrap and analysed using Proteome
Discover.
In conclusion, we described two different samples suitable for iTRAQ analysis that can be used to
assess the performance of different mass spectrometers and quantitation algorithms. A considerable part
of the proteome of a typical biological sample falls
within the fold change and dynamic range windows
of these two samples.
Evaluation of MSEEDVHGSURWHLQTXDQWL¿FDWLRQPHWKRGV
Kerman Aloria1, Miren Josu Omaetxebarria2, Mikel Azkargorta2*, Johannes P. C. Vissers4, Asier
Fullaondo5, Jesus M. Arizmendi1,2
1
Proteomics Core Facility-SGIker (ProteoRed). University of the Basque Country. Leioa, Spain. 2 Department
of Biochemistry and Molecular Biology. University of the Basque Country. Leioa, Spain. 3 Proteomics Core
Facility. CIC bioGUNE. Derio, Spain. 4 :DWHUV&RUSRUDWLRQ0DQFKHVWHU8QLWHG.LQJGRP5 Department of
Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology. University of the Basque Country. Leioa, Spain
* Current address: Proteomics Core Facility. CIC bioGUNE. Derio, Spain
/&06 EDVHG SURWHLQ TXDQWL¿FDWLRQ PHWKRGV
have recently gained popularity as powerful technologies capable of addressing protein expression
analysis in complex samples. As an alternative to
isotope labeling methodologies, which are samplenumber and sample-type dependant and require
special labeling chemistries, label-free approaches
afford greater experimental design and less sample
100
manipulation. A relatively new label-free approach
based on MSE or data independent acquisition mode
was applied in this study [1, 2]. Unlike the traditional LC-MS/MS strategy, no precursor ion selection
and fragmentation is applied and the acquisition
method is based on alternating the collision energy
of sequential scans applied to the gas cell between
low and elevated states (Figure 1). MSE based acquisition collects information on all the isotopes of all
charge-states of the eluting peptide precursor across
the chromatographic peak width. MSE provides accurate mass data for precursor and product ions
ZKLFK DUH XVHG IRU SURWHLQ LGHQWL¿FDWLRQ DQG DOVR
precursor ion intensity measurement for relative
SURWHLQ TXDQWL¿FDWLRQ )XUWKHUPRUH DEVROXWH SURtein amount can be estimated by comparing the top
three ionising peptides of each protein with a known
amount of an internal standard [3]. In this study we
evaluated the utility of estimated absolute quanti¿FDWLRQ DQG FRPSDUDWLYH DQDO\VLV RI LRQ FXUUHQWV
IRUWKHSXUSRVHRIUHODWLYHSURWHLQTXDQWL¿FDWLRQRQ
data acquired using the data independent acquisition
method. Our results indicate that MSE based labelIUHH TXDQWL¿FDWLRQ LV D UREXVW DQG D UHSURGXFLEOH
DSSURDFKIRUUHODWLYHSURWHLQTXDQWL¿FDWLRQLQFRPplex samples.
Two mixtures (ECOLI_1 and ECOLI_2) of digested ADH1_YEAST, PGYM_RABIT, ENO1_
<($67DQG$/%8B%29,1SURWHLQV:DWHUV&RUporation) were prepared at a relative molar ratio for
each protein of 1:1, 1:0.5, 1:2 and 1:8 respectively
and spiked into a digested E. coli cytosolic protein
PL[WXUH :DWHUV &RUSRUDWLRQ 'DWD LQGHSHQGHQW
acquisition analyses were performed with a nanoAcquity UPLC system interfaced to a SYNAPT
+'06 :DWHUV &RUSRUDWLRQ PDVV VSHFWURPHWHU
and samples were run in quintuplicate. Data were
SURFHVVHG VHDUFKHG DQG TXDQWL¿HG ERWK DEVROXWH
and relative, with a beta release of ProteinLynx GlobalSERVER v2.4 software. Absolute protein quanWL¿FDWLRQ ZDV FRQGXFWHG ZLWK D VWDQGDUG SURWHLQ
added to the sample (ADH_YEAST) and its amount
SURYLGHG WR WKH LGHQWL¿FDWLRQ VRIWZDUH$EVROXWH
protein values were used to express relative quanti¿FDWLRQUHVXOWVEHWZHHQGLIIHUHQWVDPSOHV7KHUHODWLYHTXDQWL¿FDWLRQVRIWZDUHSHUIRUPVDFRPSDULVRQ
between different samples based on deconvoluted
peptide intensities and probabilistic relative protein
TXDQWL¿FDWLRQLVVXEVHTXHQWO\FDOFXODWHG
In this analysis a total of 525 different proteins
ZHUHLGHQWL¿HGSURWHLQ)'5 LQ(&2/,B
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
and 428 in ECOLI_2 samples. 257 proteins in
(&2/,BDQGLQ(&2/,BZHUHLGHQWL¿HGLQ
RU PRUH UHSOLFDWHV RI WKHP ZHUH LGHQWL¿HG
in both samples (Figure 2. A, B) and therefore, reODWLYHO\TXDQWL¿HG%RWKTXDQWL¿FDWLRQDSSURDFKHV
comparative analysis of estimated absolute amount
and ion current (probability) based, accurately determined the relative protein ratio of the eukaryotic
proteins spiked into an E. coli protein matrix (taEOH:HDOVRXVHGWKLVDSSURDFKIRUWKHUHODWLYH
TXDQWL¿FDWLRQRIWRWDOSURWHLQH[WUDFWVIURP:7DQG
E2F2-/- T lymphocytes. 736 proteins were idenWL¿HG DQG ZHUH FRQVLGHUHG IRU TXDQWL¿FDWLRQ
purposes. Obtained results indicate that both quanWL¿FDWLRQDSSURDFKHVHTXDOO\GHWHUPLQHSURWHLQH[pression trends although numerical ratios can vary
due to differential handling of protein isoforms and
differences in statistical analyses (data not shown).
Overall we can conclude that label-free LC-MSE
type of analysis has proven to be a robust and reproGXFLEOHDSSURDFKIRUUHODWLYHSURWHLQTXDQWL¿FDWLRQ
in complex samples. Furthermore, relative quanti¿FDWLRQEDVHGRQHVWLPDWHGDEVROXWHTXDQWL¿FDWLRQ
and on ion current comparison consistently measured protein expression ratios.
Table 1. Expected and experimental ratios obtained for
ALBU_BOVIN, ENO1_YEAST and PGYM_RABIT proteins.
Expected
ratio
Ratio based
on absolute
TXDQWL¿FDWLRQ
Ratio
based on
comparative
ion current
albu_
bovin
8.0
6.95
7.61
eno1_
yeast
2.0
1.91
2.04
pgym_
rabit
0.5
0.54
0.55
Protein
Figure 1. Schematic of MSE mode of analysis ¿JXUHIURP
Waters Corporation).
101
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
This work was supported by grants from the
Basque Government Department of Industry (Etortek and Saiotek to J.M.A.). Proteomics Core Facility-SGIker is supported by UPV/EHU, MICINN,
GV/EJ, ESF and ProteoRed agencies.
Figure 2. *UDSKLFDOUHSUHVHQWDWLRQRILGHQWL¿HGSURWHLQV. A.
1XPEHURISURWHLQVLGHQWL¿HGLQ(&2/,BDQG(&2/,BSHU
number of replicates. B. Venn diagram of overlapping proteins
LGHQWL¿HGLQRUPRUHUHSOLFDWHVLQ(&2/,BDQG(&2/,B
[1]
Silva JC, Denny R, Dorschel CA, Gorenstein
MV, Kass IJ, Li GZ, et al. Quantitative proteomic
analysis by accurate mass retention time pairs.
Anal Chem 2005;77:2187-200.
[2]
Li GZ, Vissers JP, Silva JC, Golick D, Gorenstein
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accounting of multiplexed precursor and product
ion spectra from the data independent analysis
of simple and complex peptide mixtures. Proteomics 2009;9:1696-719.
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Silva JC, Gorenstein MV, Li GZ, Vissers JP and
*HURPDQRV6-$EVROXWHTXDQWL¿FDWLRQRISURteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition. Mol Cell Proteomics 2006;5: 144-56.
Desarrollo de un Modelo Estadístico Universal para Proteómica Cuantitativa
Mediante Marcaje Isotópico Estable
Marco Trevisan-Herraz1, Pedro Navarro1, Elena Bonzon-Kulichenko1, Pablo Martínez-Acedo1,
Daniel Pérez-Hernández1, Estefanía Núñez1, María Luisa Hernáez2, Enrique Calvo4, Montserrat
Carrascal3, Marina Gay3, Inmaculada Jorge1, Dolores Gutiérrez2, Joaquín Abian3, Concha Gil2,
Juan Miguel Redondo4 , Jesús Vázquez1
1
Laboratorio de Química de Proteínas y Proteómica, Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa” (CSICUAM), Madrid (CBMSO). 2Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense
de Madrid (UCM). 3Laboratorio de Proteómica, Instituto de Investigaciones Biomédicas de Barcelona (IIBBCSIC) (IDIBAPS). 4Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares, Madrid (CNIC)
Aunque en la actualidad existen diferentes métodos de marcaje isotópico para la realización de
estudios de proteómica cuantitativa, los modelos estadísticos para el tratamiento de los datos obtenidos
están todavía muy poco desarrollados. La mayoría
de los modelos asumen distribuciones normales de
los datos y la existencia de varianzas homogéneas,
que no se han demostrado en la práctica. En el laboratorio de J. Vázquez hemos desarrollado recientemente un nuevo modelo estadístico jerárquico de
efectos aleatorios para el análisis de los datos de
expresión diferencial obtenidos por marcaje con
18
O/16O y espectrometría de masas de trampa iónica
lineal [1]. La validez de este modelo, que considera por separado las fuentes de error debidas a la
manipulación de la muestra, la preparación de los
SpSWLGRV\ODFXDQWL¿FDFLyQSRUHOHVSHFWUyPHWURGH
masas, ha sido demostrada en experimentos masivos
de hipótesis nula [1] y ha sido validada en varios
modelos biológicos de diferente naturaleza [2]. En
el presente trabajo hemos abordado un proyecto
cooperativo a gran escala entre varios grupos de investigación con el objetivo de extrapolar dicho modelo estadístico, de forma general, a los métodos de
marcaje isotópico más comunes (SILAC y iTRAQ),
y a otros espectrómetros de masas.
102
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Figura 1. Descripción del software que conforma la plataforma QuiXoT.
Como modelo biológico se ha empleado un
único cultivo celular de Saccharomyces cerevisiae,
control (muestra A), marcado con aminoácidos SILAC (A*) o tratado con H2O2 (B) (UCM), y se han
realizado experimentos comparativos a gran escala
A vs B y A vs A mediante 18O/16O y iTRAQ, y A*
vs B y A* vs A mediante SILAC. Las muestras se
digirieron en el CBM utilizando un nuevo método
de gel concentrante [2] y los péptidos resultantes
se marcaron y separaron en 24 fracciones mediante
la técnica Off-gel [2]. Las fracciones fueron analizadas usando un LTQ (CBM, IDIBAPS) en modo
convencional o PQD, un LTQ-Orbitrap (CNIC) y
un MALDI-TOF-TOF (UCM). Cada uno de los
H[SHULPHQWRV SHUPLWLy OD FXDQWL¿FDFLyQ GH HQWUH
\ SpSWLGRV /D H¿FLHQFLD GH PDUFDMH
por 18O se determinó usando el método cinético
[3]. Los resultados de los experimentos de hipótesis
nula se utilizaron para el modelado de los pesos
estadísticos y para el análisis de normalidad de las
poblaciones a los diferentes niveles, según describimos previamente [1].
Nuestros resultados demuestran que el modelo estadístico jerárquico es válido, de forma universal, para todos los tipos de marcaje y todos los
espectrómetros de masas utilizados, obteniéndose
distribuciones que superan los test de normalidad
a nivel de medida, a nivel de péptido y a nivel de
proteína. El modelo global ha sido implementado
en la plataforma informática QuiXoT, en la que se
han desarrollado interfaces para la entrada de datos
obtenidos por los diferentes motores de búsqueda,
equipos y métodos de marcaje (Figura 1).
El análisis de los datos arroja unas varianzas
a nivel de péptido que son consistentemente semejantes para todos los métodos de marcaje posdigestión, mientras que en el caso de SILAC la
varianza es prácticamente nula. Por otra parte, la
varianza a nivel de medida en modo MS (SILAC,
18
O) es algo menor en el Orbitrap en relación con el
LTQ, aumentando considerablemente en el modo
PQD-MS/MS (iTRAQ) en el LTQ. Finalmente la
varianza a nivel de proteína es muy baja y similar
en todos los casos. Estos resultados demuestran la
coherencia del modelo y establecen por primera
vez un marco de referencia estadístico común para
comparar las prestaciones relativas de los diferentes
equipos y métodos de marcaje. Este modelo, por
RWUDSDUWHGHYXHOYHLQIRUPDFLyQVREUHOD¿DELOLGDG
de los cambios de expresión obtenidos y ofrece un
103
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
estricto control sobre las posibles fuentes de error
del experimento.
El desarrollo de un modelo estadístico de validez
universal y de una plataforma informática común
permite por primera vez el análisis sistemático y la
GHWHFFLyQ GH FDPELRV GH H[SUHVLyQ VLJQL¿FDWLYRV
de forma semiautomática en cualquier experimento
de expresión diferencial a escala masiva mediante
técnicas de marcaje isotópico estable.
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Serrano H, Alfranca A, et al. Statistical model
to analyze quantitative proteomics data obtained
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quantitative high-throughput analysis of proteomes by 18O labeling Mol Cell Proteomics
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Proteomics 2007;6:1274-86.
/DEHOIUHH4XDQWLWDWLYH$SSURDFKHVLQ&6)%LRPDUNHU'LVFRYHU\
Alex Campos1, Jacques Borg2, Claudio Diema3, Marta Vilaseca3, Eliande Oliveira1
1
Proteomics Platform, Barcelona Science Park, Barcelona, Spain. 2Neurochemistry Lab, Faculty of Medicine, Saint
Etienne, France. 3Mass Spectrometry Core Facility, Institute for Research in Biomedicine, Barcelona, Spain
Mass Spectrometry (MS) has emerged as one of
the most promising core technologies for discovery
of diagnostic, prognostic and therapeutic protein
biomarkers. Despite its rapid technological developments, MS-based assays have also raised major
concerns regarding its reproducibility, sensibility
and throughput, and hence its potential application
in the clinical and regulatory settings. To address
these concerns, we explore relevant quality assurance benchmarks for MS-based quantitative CSF
ELRPDUNHUGLVFRYHU\:HDUJXHWKDWWKHURDGWRDUHSURGXFLEOHDQGVXI¿FLHQWO\UREXVWELRPDUNHUGHYHlopment technology entails the understanding of the
limits of each process, including sample handling,
instrument setup, and bioinformatics tools.
Despite the increasing clinical interest in bioÀXLGVDVVRXUFHIRUELRPDUNHUGLVFRYHU\LWVGLVWLQFWLYHQDWXUHLPSDUWVVLJQL¿FDQWFKDOOHQJHVIRUFXUUHQW
proteomics technologies. The immense dynamic
range of human plasma proteins, which spans 10 to
12 orders of magnitude, poses a major limiting facWRUIRULQGHSWKSURWHRPLFVSUR¿OLQJ7RRYHUFRPH
this problem, enrichment techniques and orthogonal
fractionation strategies are routinely applied in proteomics studies prior to MS analysis. Biomarkers
of “interest” could be enriched with the selection of
a biological material that is in close proximity with
the disease source. In this regard, the cerebrospinal
ÀXLG&6)LVDWUHDVXUHWURYHIRUELRPDUNHUGLVFRvery in neurological diseases. Because of its direct
contact with the brain’s extracellular space, CSF is
a valuable reporter of processes that occur in the
central nervous system. Although CSF shares some
RIWKHSURWHLQFRQWHQWRIEORRGWKHERQD¿GHORFDOO\
produced brain’s proteins are found in higher concentration in the CSF compared to blood [1].
Platforms combining removal of high abundance proteins using multi-component immunodepletion systems (IDS) followed by multidimensional protein/peptide fractionation are currently
the mainstay of unbiased proteomic biomarker discovery. At the present, a number of commercial
IDS are available for highly selective removal of
most abundant human plasma proteins. To the best
104
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Figure 1. Distribution of the APEX values (left side) for the CSF proteome following depletion with IgY-HSA or IgY-14, and
no depletion (y-axis on log scale). Pie charts (right side) depict the CSF protein content in context of their abundance. (HSA,
KXPDQVHUXPDOEXPLQ&FRPSOHPHQW&67&\VWDWLQ&/$0$/DPLQLQĮDQG0$&)0LFURWXEXOLQDFWLQ
Figure 2. AMT quality control metrics. (A) 2D display of the CSF AMT database. (B) 3D perspective plot of the peptide
matches between IgY14-depleted sample and the AMT database (axis: mass and retention time error). (C) Heatmap of similarity score between LC-MS features of IgY14-depleted sample and AMT database. Best alignment is found using a dynamic
programming algorithm that determines the transformation function with maximum likelihood.
of our knowledge, all commercial IDS have been
devised to deplete plasma (or serum) samples and
LWVSHUIRUPDQFHLQRWKHUELRÀXLGVKDVQRWEHHQHYDluated yet. To address this problem, we carried out
CSF depletion (in triplicate) using either Sigma’s
Seppro systems designed to immunodeplete HSA
(IgY-HSA) or the 14 most abundant proteins (IgY /DEHOIUHH FRPSXWDWLRQDOO\ PRGL¿HG VSHFWUDO
counting method for Absolute Protein EXpression
(APEX) measurements was used to assess the deple-
ted and undepleted samples in the context of protein
content stoichiometry and achieved dynamic range
(Figure 1). Our results show that IDS originally devised to deplete blood’s most abundant proteins are
GH¿FLHQWLQGHSOHWHWKHPRVWDEXQGDQW&6)SURWHLQV
:HWKHUHIRUHSURSRVHDOLVWRIWDUJHWSURWHLQPRVW
abundant) to be depleted in CSF for downstream
06SUR¿OLQJ)LJXUH±WRSSLHFKDUW
The advent of a new generation of robust MS
instruments with very high resolution and mass ac-
105
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
curacy has inspired the development of new quantitative approaches [2]. In particular, label free hybrid identity/pattern-based approaches have gained
SRSXODULW\LQWKHELRPDUNHUGHYHORSPHQW¿HOG>@
Such approaches use pattern recognition algorithms
to ex post facto assign the identity of LC-MS peaks
against databases of peptide sequence, mass, and
retention time built from multiple experiments. Here
we employ the accurate mass and time (AMT) strategy to identify and quantify peptides/proteins from
unfractionated CSF samples using msInspect plaWIRUP>@2XUDQDO\VLVZRUNÀRZH[WHQGVDQGFRPELQHV H[LVWLQJ RSHQVRXUFH SODWIRUPV IRU /&í06
067UDQV3URWHRPLF3LSHOLQHDQG/&í06PV,QVpect) data analysis. A peptide accurate mass and LC
elution time AMT database was initially generated
using MS/MS following extensive multidimensional
LC separations to provide the basis for subsequent
SHSWLGHLGHQWL¿FDWLRQV2XU&6)$07GDWDEDVHFRQtains >2,000 entries from a total number of ~7,500
LGHQWL¿HGSHSWLGHVZKLFKWUDQVODWHVLQWRFRQ¿-
GHQW&6)SURWHLQLGHQWL¿FDWLRQV)LJXUH,QFRQclusion, hybrid identity/pattern-based approaches
are amenable for high throughput quantitative proteome analyses in biomarker discovery pipelines.
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A comparison of quantitative proteomics methodologies on a differential
experiment on test samples
Joan Josep Bech-Serra, Núria Colomé, Marta Monge, Francesc Canals
Laboratori de Proteòmica, Programa de Recerca en Oncologia Mèdica. Institut de Recerca. Hospital Vall
d’Hebron, Barcelona
7KH¿HOGRISURWHRPLFVLQFOXGHVDZLGHQXPEHU
of technologies aimed to the analysis of large number
of proteins, representing ideally the entire proteome,
in the same experiment. In its early stages , mass
spectrometry-based proteomics was successfully
used to the qualitative characterization of complex
mixtures of proteins, leaving the quantitative aspects
in a secondary role, essentially because of the lack
of suitable technologies for quantitative analysis of
such complex mixtures. However, in the last years,
a wide number of strategies have been developed
LQRUGHUWRJLYHWRWKHSURWHRPLFV¿HOGUREXVWWRROV
to obtain reliable quantitative data. Those strategies
include both 2D-gel based and non-based methodoORJLHV,QWKH¿UVWJURXS'',*(PHWKRGRORJ\LV
EDVHGRQWKHODEHOLQJZLWKGLIIHUHQWÀXRURFKURPHV
enabling the simultaneous separation of different
samples in the same 2D-gel, which allows to over-
come reproducibility problems inherent to the 2D
procedure and internal standardization of spot volume measurements, providing a robust quantitative
comparison technique. Alternatively, a number of
gel-free quantitative techniques can be used. Some
of them are based on non-isobaric isotope labeling,
such as ICAT, ICPL or SILAC labeling methodologies, the quantitative data being obtained from
the from the MS data, by integrating extracted ion
chromatograms of the heavy-light peptide pair masses. A second group which includes iTRAQ or TMT
reagents is based on isobaric labeling that introduce
different reporter fragments in the derivatized peptides. Quantitative data is in this case obtained at
the MS-MS level, from the relative intensities of
the reporter fragment ions. Finally, a third group
of label-free methods uses different approaches for
quantitative comparison of LC-MS data.
106
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
In order to evaluate and compare the performance of different quantitative proteomics methods,
we have prepared a set of two test samples to be
compared quantitatively. The samples consist on a
matrix of cytoplasmatic E. Coli proteins, of medium
complexity (around 100 proteins), to which four
standard mammalian proteins have been spiked in
different amounts, ranging from the fmol to the
pmol level per microgram of total protein.. The ratios of the spiked proteins between the two samples
have been chosen to range form 1.5:1 to 5:1.
This should result in a more comprehensive quantitative information, since all tryptic peptides will
be derivatized at the N-terminus. The weakness of
this strategy is that digestion of the two samples
has to be run independently, which can introduce
technical bias. To minimize the problem of a possible imbalance, both labeling schemes are run in
parallel on sample aliquots. This way the balance
correction derived from the protein level labeling
experiment can be used to normalize the data from
the second experiment.
These samples have been analyzed by different
methodologies (Figure 1):
ICPL labeled samples have been analyzed in
four independent LC-MS runs in order to assess
reproducibility.
- 2D-DIGE, using four technical replicas of each
sample on a 4 2D-gel experiment.
- Labeling with ICPL reagents at the protein
level, followed by tryptic digestion and analysis
by LC-MS. This is the standard procedure for this
methodology, but has the drawback that only lysine
FRQWDLQLQJ SHSWLGHV ZKLFK KDYH EHHQ PRGL¿HG E\
the reagent can be used for quantitation. This results
RIWHQLQDODUJHSDUWRIWKHLGHQWL¿HGSURWHLQVODFNLQJ
quantitative information.
- Labeling with ICPL at peptide level. In order
to overcome this problem, we have explored an
alternative procedure introducing the ICPL labeling
step after tryptic digestion of the protein mixtures.
- iTRAQ Labeling. The samples have been
analyzed using an 8-plex iTRAQ reagent, using four
different reporter masses for each of the samples,
and analyzed by LC-MALDI.
- Label-free quantitation. Four LC-MS runs of a
tryptic digest of each sample have used to quantitatively compare the two samples using Progenesis LCMS software for alignment and statistical analysis
of the LC-MS maps.
The results of all the quantitative proteomics
methods used have been evaluated in terms of accuracy and reproducibility, and their performance and
robustness is discussed.
Figure 1. 6FKHPHRIWKHPHWKRGVFRPSDUHGIRUWKHUHODWLYHTXDQWL¿FDWLRQRIWZRWHVWVDPSOHV
107
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Triple Quadrupole Mass Spectromery-Based Peptide Assays Using Intelligent
650L650
Reiko Kiyonami1, Alan Schoen1, Amol Prakash1, Huy Nguyen1, Scott Peterman1, Vlad Zabrouskov1,
Andreas Huhmer1, Sarah Robinson1, Martin Hornshaw1, Madalina Oppermann 1, Nathalie Selevsek2, Bruno Domon2
1
7KHUPR)LVKHU6FLHQWL¿F2 ETH Zurich, Switzerland
Introduction
The commonly used SRM technique provides
sensitive and precise quantitative results by monitoring one or several primary SRM transitions per
targeted compound. Recently this technique was
H[WHQGHGWRVLPXOWDQHRXVO\FRQ¿UPWKHLGHQWLW\DQG
quantify multiple compounds in one HPLC/MS run
by monitoring eight or more SRM transitions per
compound. The bottleneck of this approach is that
only a limited number of compounds can be targeted
in one run because of the time required to monitor
each transition. The newly developed instrument
FRQWUROVRIWZDUHFDQXVHWKHVSHFL¿FLW\RIDVPDOO
subset of SRM transitions to simultaneously quanWLI\DQGLQWHOOLJHQWO\WULJJHUWKHIXOOOLVWIRUFRQ¿Umation, thereby allowing the analysis of up to 1000
compounds in a single LC-MS run.
Experimental
A triple quadrupole mass spectrometer equipped
with a nanoLC pump and a nanospray source was
used. The intelligent SRM method utilizes SRM
VSHFL¿FLW\LQWZRZD\V7KH¿UVWLVFRPSRXQGVSHFL¿FTXDQWL¿FDWLRQXVLQJDWLPHEDVHG650DFTXLsition, which monitors several primary transitions
for each compound. The second is a data dependent
SRM acquisition, which monitors both those primary and additional secondary transitions and is
triggered only when the intensities of all primary
650WUDQVLWLRQVVLPXOWDQHRXVO\H[FHHGWKHGH¿QHG
intensity threshold. For large scale screening experiments, the dynamic exclusion was used to trigger
secondary acquisition only once for each peak for
SURYLGLQJ VXI¿FLHQW VWUXFWXUDO LQIRUPDWLRQ WR FRQ¿UPWKHFRPSRXQG¶VLGHQWLW\ZLWKRXWSHUWXUELQJWKH
TXDQWL¿FDWLRQREWDLQHGZLWKWKHSULPDU\650OLVW
Results and discussion
The technique was applied to quantify preciVHO\ DQG FRQ¿UP LGHQWLW\ RI SHSWLGHV LQ FRPSOH[
biological samples, including yeast cell lysates,
and pesticides in orange oil. By monitoring multiple transitions, it is possible to use very low intensity thresholds to accurately trigger the data
dependent SRM scan. The trigger is the leading
edge of the LC peak and relatively independent of
the LC peak intensity. Using known LC peak widths, the strongest intensity point to obtain the data
dependant scan is easily anticipated. Instead of a
full product ion scan, high quality SRM spectra
monitor eight or more transitions at that point. The
resulting eight spectra are assembled into a pseudo
full scan MS/MS spectra that can be used for con¿UPLQJ WKH LGHQWLW\ RI WKH SHSWLGHV E\ PDWFKLQJ
them to reference spectra stored in a library. Using
a constant cycle time allows enough points across
the peaks from the primary SRM scans for precise
TXDQWL¿FDWLRQ:LWKWKLVDSSURDFKWKHLQVWUXPHQW
LVDEOHWRFRQ¿UPDQGTXDQWLI\PRVWWDUJHWHGSHStides in the low attomol range.
108
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
5. PROTEÓMICA MICROBIANA Y DE PARÁSITOS
Coordinadores: Aída Pitarch, Antonio Marcilla, Ana Oleaga y Manuel Rodríguez
5.1 Aspectos generales
Problemas en el análisis proteómico de muestras procedentes de organismos ‘raros’
María Luz Valero1, Javier Ortiz2, Esther Dionís1, Laura Cantero1, Manuel Mateo Sánchez del Pino1
1
Laboratorio de Proteómica. Centro de Investigación Príncipe Felipe. Avda. Autopista del Saler 16. 46012
Valencia. 2SCSIE. Universitat de Valencia
/RVPpWRGRVDFWXDOHVGHLGHQWL¿FDFLyQGHSURteínas se basan generalmente en la comparación de
la información de MS (o MS/MS) obtenida con la
información de secuencias de proteínas que existe
en diferentes bases de datos.
Aunque algunas bases de datos incluyen un elevado número de proteínas, como por ejemplo NCBI
con aproximadamente 8500000 secuencias, no todos
los organismos están representados por igual. Así,
en NCBI existen 508911 proteínas humanas y el
número decae drásticamente hasta 110313 para rata,
un organismo ampliamente utilizado en experimentación. Y el número es mucho menor para otros
organismos de alto interés como parásitos (54542
entradas para Trematoda), vegetales (13955 para
Citrus) o especies marinas de alto interés económico
(2353 entradas para Clavicipitaceae).
En muchos casos es necesario recurrir a la secuenciación de novo que requiere de espectros de
MS/MS de gran calidad y es costosa en cantidad de
muestra y tiempo de análisis, por lo que su aplicabilidad es limitada.
Aún así existen algunas estrategias que pueden aplicarse en el caso de disponer sólo de información de MS
y MS/MS parcial. En algunos casos pueden utilizarse
herramientas químicas para la mejora de los espectros
de MS/MS. Mientras que en otros las herramientas son
bioinformáticas, y nos permitirán obtener más información de las diferentes bases de datos existentes.
5.2 Proteómica de Microorganismos
A) Proteómica de Bacterias
Preparación de extractos proteicos bacterianos para el análisis de glicoproteínas
PHGLDQWHJHOHVELGLPHQVLRQDOHV\FURPDWRJUDItDVGHD¿QLGDG
Alfonso Olaya, Lidia Gómez-Gascón, Manuel J. Rodríguez-Ortega
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Veterinaria, Universidad de Córdoba
Resumen
Las glicoproteínas bacterianas, por sus funciones y localización, son potenciales dianas para vacu-
nas. Sin embargo, su estudio mediante electroforesis
ELGLPHQVLRQDO \ FURPDWRJUDItDV GH D¿QLGDG ELHQ
mediante la química de la hidrazida y del ácido
aminofenilborónico o bien mediante reconocimien-
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
WRSRUOHFWLQDVSUHVHQWDQXQDVHULHGHGL¿FXOWDGHV
como la presencia de ADN o azúcares libres en la
muestra respectivamente. Para intentar solventarlas
nos centramos en la optimización del proceso de
obtención de extractos proteicos totales, tanto en
cuanto a calidad como a rapidez.
La glicosilación bacteriana es un proceso recientemente descrito y del cual todavía existen muchas
incógnitas. Todas las glicoproteínas procarióticas
descritas, en función de su localización, pueden claVL¿FDUVH HQ FLQFR JUDQGHV WLSRV GH SDUHG FHOXODU
DVRFLDGDVDPHPEUDQDDVRFLDGDVDOSLORRÀDJHOR
glicoproteínas secretadas y exoenzimas, y celulares
(cuya localización en la célula no está muy clara y se
cree que, más bien, son contaminaciones citoplasmáticas) [1]. Esto, junto con sus funciones [1], que poQHQGHPDQL¿HVWRFRQWDFWRFRQHOKRVSHGDGRUHQHO
proceso de infección, convierte a las estas moléculas
en potenciales dianas para vacunas, nuestro principal
objetivo para estirpes del género Streptococcus.
Dos de las aproximaciones que se están llevando
a cabo son la electroforesis bidimensional (2-DE)
en geles de poliacrilamida y las cromatografías de
D¿QLGDGEDVDGDVHQODTXtPLFDGHODKLGUD]LGDODGHO
iFLGRDPLQRIHQLOERUyQLFR\HQODDOWDHVSHFL¿FLGDG
hacia las glicoproteínas que exhiben las lectinas [2].
Los principales problemas que nos encontramos
en la 2-DE tienen que ver con el enfoque de las proteínas debido a la presencia de ADN, que provoca
desenfoque horizontal y vertical de las proteínas,
y la propia naturaleza altamente hidrofóbica de las
glicoproteínas asociadas a membranas. En cuanto
a las cromatografías nos encontramos con el problema por contaminación con azúcares libres que
LQWHU¿HUHQHQODD¿QLGDGGHODVJOLFRSURWHtQDVSRU
la hidrazida y el ácido aminofenilborónico. En base
a estos problemas hemos de conseguir una preparaFLyQGHODPXHVWUDH¿FLHQWHHQFXDQWRDOUHQGLPLHQWR
de obtención de proteínas, pureza, medio en las que
se encuentren éstas y rapidez.
Para optimizar el método de extracción de proteínas totales hemos probado una serie de protocolos, con variaciones desde sus fuentes originales
para adaptarlos a nuestros organismos. Tras cultivar
las bacterias se resuspenden en distintos tampones
para romper por ultrasonidos (10 ciclos de 20 segundos) tras tratamiento con mutanolisina (150 U/
ml, a 37ºC, O/N) debido al grosor de la pared celular
de los estreptococos. La presencia de ADN en las
muestras se comprueba mediante electroforesis en
109
gel de agarosa al 1% y espectrofotometría, y la de
azúcares libres mediante la reacción de Fehling y el
método de la antrona.
1) Rotura en presencia de tampón de rehidratación
de 2-DE (Urea 7M, Tiourea 2M, Tritón X-100
&+$36'77P0/DH¿FLHQFLD
de rotura y rendimiento de obtención de proteínas es grande. Sin embargo, al no poder descartarse la fracción en la que se ha incubado con
mutanolisina (y que contiene proteínas de unión
a pared, liberadas por la acción de la enzima),
el tampón se diluye. Otros inconvenientes son
que las proteínas resuspendidas en este tampón
no pueden ser tratadas enzimáticamente en solución y permanecen los azúcares y el ADN.
Para eliminar los contaminantes anteriores debe
cambiarse de tampón mediante, por ejemplo,
precipitación de proteínas, con la consecuente
SpUGLGD GH SURWHtQDV 8OWUD¿OWUDU SDUD GLDOL]DU
es imposible al formarse cristales de urea en la
membrana, que la obstruyen y da lugar a una
gran pérdida de proteínas.
2) Rotura en tampón Tris 50 mM pH 8 tras trataPLHQWRFRQPXWDQROLVLQD/DH¿FLHQFLDGHURWXUD
y obtención de proteínas es menor. Sin embargo presenta una serie de ventajas con respecto
al anterior tampón, como que las muestras se
obtienen en un tampón más apto para las croPDWRJUDItDVGHD¿QLGDG\GHSHQGLHQGRGHOSURtocolo en concreto, también para la 2-DE. 2A)
Precipitación con Tricloroacético [3]. Da lugar
a un rendimiento en la recuperación de proteína
total bajo. 2B) Rotura a pH 10 e incubación
con Benzonasa [3] a pH 8, 500 U/ml a 37ºC,
1,5 h. Se elimina el ADN por completo pero no
ORVD]~FDUHV6LQHPEDUJRVHSXHGHXOWUD¿OWUDU
fácilmente. 2C) Incubación con espermina [4]
5 mM tras subir el pH de la muestra a 10 antes
de la rotura y añadir 20 mM de EDTA. En estas
condiciones la ratio proteína recuperada/ADN
en las muestras es muy bueno. Sin embargo, al
tratarse de una molécula cargada, la 2-DE se ve
comprometida y, aunque el efecto que tendría
sobre los distintos análisis glicoproteicos no se
ha ensayado aún, este hecho obliga a cambiar
GH WDPSyQ PHGLDQWH SRU HMHPSOR XOWUD¿OWUDción. 2D) Incubación con DNAasa I (4 µg/ml)
y RNAasa (4 µg/ml) [5] a 37ºC, 1,5 h. Con estas concentraciones se sigue observando restos
de ADN, siendo además necesario un paso de
OLPSLH]DGHD]~FDUHV(3XUL¿FDFLyQGHSURWHt-
110
nas con Fenol/Cloroformo/Alcohol Isoamílico
(25:24:1 v/v/v) [3]. La cantidad de proteínas
recuperadas es baja.
5RWXUDFRQ75,5HDJHQW6LJPD/DH¿FLHQFLDGH
rotura es buena, sin embargo, la cantidad de proteínas recuperadas tras seguir el protocolo es baja.
Para aumentar la resolución y el enfoque de
las proteínas en 2-DE se están ensayando, en los
extractos totales potencialmente más idóneos para
nuestro estudio, el detergente ASB-14, el DeStreak
y el método de cargado de las tiras de IPG mediante
“cup loading”.
Agradecimientos
(VWHWUDEDMRKDVLGR¿QDQFLDGRSRUHOSUR\HFWR
SAF2008-00733 del Ministerio de Ciencia e Innovación, Gobierno de España.
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
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Métodos de enriquecimiento de glicoproteínas bacterianas para su posterior
análisis y caracterización mediante espectrometría de masas
Lidia Gómez-Gascón, Alfonso Olaya, Manuel J. Rodríguez-Ortega
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Veterinaria. Universidad de Córdoba
Resumen
8QDGHODVIRUPDVPiVFRPXQHVGHPRGL¿FDFLRnes postraduccionales de proteínas es la glicosilación.
Se estima que más del 50% de las proteínas conocidas, así como el 80% de las proteínas de membrana,
están glicosiladas. En contra de lo que se creía, se ha
demostrado que los procariotas también poseen glicoproteínas. Las glicoproteínas bacterianas parecen
HVWDUDVRFLDGDVDODVXSHU¿FLHGHOPLFURRUJDQLVPR
Este hecho sugiere por tanto que están implicadas
en la interacción de la bacteria con el hospedador y
por tanto puede existir una relación directa con la capacidad patógena del microorganismo. El objeto de
este estudio consiste en desarrollar una metodología,
PHGLDQWHGLYHUVDVFURPDWRJUDItDVGHD¿QLGDGSDUDHO
HQULTXHFLPLHQWR\SXUL¿FDFLyQGHJOLFRSURWHtQDVGH
bacterias del género Streptococcus.
En contra de lo que estaba establecido hasta
hace unos años, recientemente se ha demostrado que
los procariotas producen glicoproteínas [1]. Estas
SDUHFHQ HVWDU DVRFLDGDV D OD VXSHU¿FLH GHO PLFURorganismo, lo que sugiere que están implicadas en
la interacción con el hospedador y por tanto, con la
capacidad patógena del microorganismo. Hay dos tipos de glicosilación en procariotas: N-glicosilación,
en la cual los glicanos están unidos a un residuo de
asparagina, y O-glicosilación, en la cual está unido a
un residuo de serina, treonina o tirosina [1,2].
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Para el enriquecimiento de glicoproteínas, los
métodos que hemos utilizado se basan en cromaWRJUDItDV GH D¿QLGDG XVDQGR OHFWLQDV DVt FRPR OD
química de la hidrazida y del ácido aminofenilborónico [1,3].
/DVOHFWLQDVVRQSURWHtQDVTXHVHXQHQHVSHFt¿camente a motivos oligosacarídicos, reconociendo
cada una a un subgrupo de especies de glicanos.
Para asegurar el reconocimiento del mayor número de glicoproteínas, se está poniendo a punto
una batería de lectinas: Canavalia ensiformis lectin (ConA), que reconoce principalmente residuos
deĮPDQRVD\ĮJOXFRVDUlex europaeus lectin
8($ UHFRQRFH UHVLGXRV GH Į/IXFRVD Triticum vulgaris lectin :*$ UHFRQRFH grupos Nacetilglucosamina (GlcNAc) y ácido siálico; Arachis hypogaea lectin $+ UHFRQRFH ȕJDO!
galNAc; y Bandeiraea simplivifolia lectin (BC-1)
UHFRQRFHĮJDODFWRVD\ĮJDO1$F
Los extractos proteicos se separaron mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%, y posWHULRUPHQWHVHWUDQV¿ULHURQDPHPEUDQDVGHQLWURFHlulosa, las cuales se bloquearon con gelatina al 3%, se
hibridaron con cada una de las cinco lectinas, se incubaron con estreptavidina-HRP y se revelaron mediante
quimioluminiscencia. [1,2,4]. Resultados preliminares
han indicado hasta ahora que tanto la ConA como la
AH son las lectinas que reconocen un mayor número
de glicoproteínas ya que revelan un mayor número de
bandas a partir de extractos totales (Figura 1).
111
zona. Para ello se está poniendo a punto una cromatografía con una resina de hidrazida (Bio-Rad). En
primer lugar las muestras se oxidan con peryodato
sódico, y después la muestra se hace pasar por la
resina para permitir la formación de los enlaces
hidrazona. El resto de proteínas no glicosiladas se
eliminan mediante lavados. Posteriormente las glicoproteínas se digieren con tripsina y se recogen
mediante lavados los péptidos generados, que corresponden a las proteínas glicosiladas, quedando
los glicopéptidos unidos a la resina. Los N-glicopéptidos pueden recuperarse de la resina digiriendo con
la glicosilasa PNGasa F, ya que esta enzima corta
el sitio de unión del glicano a la asparagina. Para
OLEHUDUORV2JOLFRSpSWLGRVVHUHDOL]DȕHOLPLQDFLyQ
con dimetilamina al 26%, que convierte las serinas y
treoninas glicosiladas en alanina y ácido 2-aminobutírico respectivamente [1-2-3,6]. Tras hacer pasar la
tripsina por la resina para digerir las proteínas retenidas y analizar los péptidos mediante nano-LC/MS/
06 VH LGHQWL¿FDURQ PXFKDV SURWHtQDV FLWRSODVPiWLFDV
en principio no esperadas.
Figura 2. Gel teñido con Coomassie de proteínas obtenidas
WUDVSXUL¿FDUFRQiF$PLQRIHQLOERUyQLFRH[WUDFWRVWRWDOHV
de Streptococcus pneumoniae. Calles de izquierda a dereFKDHOXLGRÀRZWKURXJKH[WUDFWRWRWDO
Figura 1. Blotting con lectinas de extractos totales de Streptococcus pneumoniae. Calles de izquierda a derecha: ConA,
A.H., WGA, UEA-I, BC-I.
El segundo método de enriquecimiento está basado en la química de la hidrazida [6], mediante la
cual dicho grupo funcional reacciona con los grupos
cis-diol de los residuos de azúcares, previamente
oxidados a aldehídos, para formar un enlace hidra-
El tercer método consistió en la cromatografía
GH D¿QLGDG XVDQGR OD TXtPLFD GHO iFLGR DPLQRIHnilborónico, que forma enlaces covalentes con los
grupos cis-diol de residuos de glucosa, manosa y
galactosa en condiciones de alcalinidad, dando lugar a diésteres, siendo estos enlaces reversibles en
condiciones ácidas. Se usó como tampón de unión
a la resina taurina 50 mM /NaOH, pH 8.7 + 20 mM
MgCl2, y de elución igual al anterior pero con 50
mM Tris/HCl, pH 7.5 [1, 2, 5]. El eluido se separó
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida
al 12% (Figura 2), y las bandas se analizaron por
0$/',72)06LGHQWL¿FiQGRVH~QLFDPHQWHSURteínas citoplasmáticas. Además, el eluido se digirió
112
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
en solución con tripsina y se analizó mediante ESIMS/MS, dando también como resultado principalmente
proteínas citoplasmáticas.
Agradecimientos
[3]
Greis K. et al. Selective Detection and Site$QDO\VLVRI2*OF1DF0RGL¿HG*O\FRSHSWLGHV
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mas.20187.
Análisis de la enterotoxina A de Staphylococcus aureus en leche por ionización
mediante desorción por láser asistida por matriz, acoplada a espectrometría de
PDVDVGHWLHPSRGHYXHOR0$/',72)
Isabel Sospedra, Carla Soler, Jose Miguel Soriano, Jordi Mañes
Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública, Ciencias de la Alimentación, Toxicología y Medicina
Legal. Facultad de Farmacia. Universitat de València
Resumen
Las bacterias del género Staphylococcus son microorganismos de amplia distribución, causantes
de numerosas intoxicaciones alimentarias debido,
en gran medida, a su capacidad de producir enterotoxinas. La enterotoxina del serotipo A es la que con
más frecuencia aparece en los brotes de intoxicación alimentaria. En el presente trabajo se desarrolla
una técnica de análisis de muestras de leche por
MALDI-TOF para la detección de la enterotoxina
$HVWD¿ORFyFLFD(VWHPpWRGRSUHVHQWDFRPRYHQtajas sobre las técnicas actualmente utilizadas su
JUDQHVSHFL¿FLGDG\HOHYDGDUDSLGH]/RVUHVXOWDGRV
obtenidos mostraron la efectividad de la extracción
utilizada demostrando la utilidad del método de
análisis utilizado.
Staphylococcus aureus es una bacteria patógena,
de amplia distribución en la naturaleza, asociada a
infecciones generalizadas y brotes alimentarios [1].
$OJXQDVHVSHFLHVGHHVWD¿ORFRFRVVRQSURGXFWRUDV
de una familia de proteínas no glicosiladas de bajo
peso molecular (Mr 22-31.000) conocidas como enterotoxinasHVWD¿ORFyFLFDV6(V Estas enterotoxinas son causa de intoxicaciones alimentarias por la
ingesta de productos contaminados, principalmente
de origen cárnico y lácteo [2-3] destacándose la enterotoxina A [4], que es la que con mayor frecuencia
se asocia a brotes de intoxicación alimentaria y que
es extremadamente potente.
113
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
El presente trabajo pretende detectar la presencia
de enterotoxina A en muestras de leche utilizando un
método de extracción rápido y sencillo y detección
por MALDI TOF.
6HXWLOL]ySDWUyQGHHQWHURWR[LQD$SDUDIRUWL¿car a dos niveles diferentes 1 ml de leche procedente
de supermercados locales. La extracción de la enterotoxina se llevó a cabo por precipitación de las
caseínas de la leche con diclorometano (DCM)/H2O
5% ácido acético y centrifugación (6000 rpm). Las
proteínas contenidas en el sobrenadante se separaron
por electroforesis 1D-SDS-PAGE en gel de poliacrilamida al 10% y se tiñeron con azul de Coomassie.
Las zonas del gel que contenían la enterotoxina (2530KD) se cortaron y fueron sometidas a digestión
WUtSWLFDFRQOD¿QDOLGDGGHREWHQHUORVIUDJPHQWRV
peptídicos correspondientes a la enterotoxina A.
La digestión en gel se realizó siguiendo una
adaptación de protocolos estandarizados [5] con
PRGL¿FDFLRQHVPHQRUHV3RVWHULRUPHQWHVHSUHSDUDron las muestras en MTP AnchorChip (BrukerDaltonics), mediante la técnica de doble gota seca (depósito de matriz y evaporación de la misma; depósito
de la muestra y evaporación de la misma), utilizando
¶—/GHiFLGRĮFLDQRKLGUR[\FLQDPLFRFRPR
matriz, preparado a saturación en una mezcla de
DFHWRQLWULORiFLGRWULÀXRURDFpWLFR¶DO
(TA 0’1%) y diluido 1:2 en TA 0’1%. Las muestras
(0’5 µL) fueron analizadas en un Espectrómetro de
0DVDVGHWLSR0$/',72)5HÀH[,9GH%UXNHU
'DOWRQLFV /D LGHQWL¿FDFLyQ GH ODV SURWHtQDV VH
realizó utilizando el motor de búsqueda MASCOT
(Matrixscience, UK).
Figura 1. Imagen del aislamiento de la enterotoxina A de
las proteínas del suero de la leche en gel de poliacrilamida
teñido con azul de Comassie.
/D)LJXUDPXHVWUDODH¿FDFLDGHOPpWRGRGHH[tracción junto con la separación por electroforesis
en gel para aislar la enterotoxina de la matriz láctea.
Los resultados obtenidos tras la digestión tríptica
Tabla 1. 6HFXHQFLDVSHSWtGLFDVLGHQWL¿FDGDVSRU0$/',72)WUDVODGLJHVWLyQWUtSWLFDGHHQWHURWR[LQD$GH6WDSK\ORFRFcus aureus.
Rango de
péptidos
[M + H]+calculada
[M + H]+observada
Secuencia de péptidos
16-27
1229.65
1230.67
SELQGTALGNLK
28-35
1119.51
1120.55
QIYYYNEK
42-55
1741.87
1742.92
ESHDQFLQHTILFK
56-74
2305.02
2306.10
*))7'+6:<1'//9')'6.
104-118
1650.71
1651.76
TACMYGGVTLHDNNR
124-134
1281.73
1282.75
.93,1/:/'*.
125-134
1153.64
1154.69
93,1/:/'*.
135-144
1127.61
1128.65
QNTVPLETVK
148-160
1512.81
1513.84
KNVTVQELDLQAR
149-160
1384.72
1385.75
NVTVQELDLQAR
167-178
1433.64
1434.66
YNLYNSDVFDGK
218-233
1912.88
1913.94
TINSENMHIDIYLYTS
114
de las bandas del gel y el análisis de los péptidos
por MALDI-TOF aparecen en la Figura 2, donde
se muestran los fragmentos de enterotoxina A procedentes de la leche junto con el espectro obtenido
del patrón. En la muestra de leche sólo aparecen 8
GHORVIUDJPHQWRVLGHQWL¿FDGRVHQHOSDWUyQSHUR
HVWRVVRQVX¿FLHQWHVSDUDFRQ¿UPDUODSUHVHQFLDGH
enterotoxina A (Tabla1). Con el método propuesto
VH FRQVLJXH XQD EXHQD SXUL¿FDFLyQ \ DLVODPLHQWR
GH OD HQWHURWR[LQD$ DVt FRPR XQD LGHQWL¿FDFLyQ
precisa de su presencia en muestras de leche.
Figura 2. Espectros de masas MALDI-TOF de las digestiones con tripsina. (A) Espectro correspondiente a patrón de
WR[LQDHVWD¿ORFyFLFD$%(VSHFWURFRUUHVSRQGLHQWHDOD
enterotoxina A aislada de la muestra de leche.
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Conselleria de Sanitat el soporte de esta investigación. Generalitat
Valenciana (072/2009).
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and Matthias Mann Mass, Spectrometric Sequencing of Proteins from Silver-Stained Polyacrylamide Gels, Anal. Chem. 1996; 68: 850-858.
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
115
Comparación de dos técnicas proteómicas aplicadas al análisis de las proteínas
de membrana de Mycoplasma genitalium
Noemí Párraga-Niño1, Núria Colomé2, Francesc Canals2, Jaume Piñol1, Josep Antoni Pérez Pons1,
Enrique Querol1, Mario Ferrer-Navarro3
1
Laboratorio de Biología Molecular, Instituto de Biotecnología y Biomedicina, Universidad Autónoma de
Barcelona (IBB-UAB). 2Instituto de Investigación del Hospital Universitario Vall d’Hebrón. 3Laboratorio
de Biología Computacional y Proteómica, Instituto de Biotecnología y Biomedicina, Universidad Autónoma
de Barcelona (IBB-UAB)
Los micoplasmas representan uno de los sistemas biológicos más simples descritos hasta el momento y son un buen ejemplo de célula mínima
autoreplicativa. Este género se caracteriza por la ausencia de pared celular y por presentar un genoma de
reducido tamaño. Las infecciones causadas por Micoplasmas suelen estar asociadas al sistema urogenital y al tracto respiratorio, provocando en muchos
casos infecciones crónicas. Mycoplasma genitalium,
el microorganismo de estudio en este trabajo, infecta
el sistema urogenital humano provocando cervicitis
en mujeres y uretritis en hombres. Es sabido que en
muchos microorganismos patógenos la patogenicidad reside en proteínas expuestas en la membrana.
(Q XQ HVWXGLR SUHYLR VH GH¿QLy HO SHU¿O SURWHLFR
de Mycoplasma genitalium mediante 2DE. Uno de
los principales problemas de la electroforesis bidimensional es la baja representación de proteínas de
PHPEUDQD&RQHOREMHWLYRGHLGHQWL¿FDUSURWHtQDV
de membrana de M. genitalium se han aplicado dos
metodologías proteómicas diferentes con su posterior
comparación. Las metodologías utilizadas en este
estudio han sido el fraccionamiento de las proteínas
hidrofóbicas en Tritón X-114 y posterior 2DE, y el
PDUFDMH HVSHFt¿FR GH ODV UHJLRQHV H[SXHVWDV HQ OD
membrana con biotina, su captura con estreptavidina
LQPRYLOL]DGD\ODSRVWHULRULGHQWL¿FDFLyQPHGLDQWH
LC-MS/MS. La aplicación de estas técnicas ha perPLWLGRQRVyORLGHQWL¿FDUSURWHtQDVGHPHPEUDQDGH
este microorganismo sino también comparar ambos
métodos para poder discutir las ventajas e inconvenientes de cada uno de ellos.
116
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Comparative proteomic analysis of collection and clinical-isolate strains of
Stenotrophomonas maltophilia
Mario Ferrer-Navarro1, Elias Mongiardini1, Gerard Torrent1, Raquel Planell1, Ana Calderón3,
Teresa Falgueras,3 Isidre Gibert,1 Xavier Daura1,2
1
Institut de Biotecnologia i de Biomedicina (IBB), Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), E-08193
Cerdanyola del Vallès (Barcelona). 2Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), E-08010
Barcelona. 3Hospital Municipal de Badalona, Badalona Serveis Assistencials, E-08911 Badalona (Barcelona)
Stenotrophomonas maltophilia is a Gram-negative pathogen with emerging nosocomial incidence
[1]. It has been associated with several clinical syndromes, primarily in relation to the opportunistic infection of immunocompromised patients. Although
not an inherently virulent pathogen, its ability to
colonise respiratory-tract epithelial cells and medical-device surfaces makes it a ready coloniser of
hospital settings.
Antibiotic treatment of S. maltophilia is greatly
hampered by extensive drug resistance [2]. Besides
PRUH VSHFL¿F UHVLVWDQFH PHFKDQLVPV LWV FDSDFLW\
WR IRUP ELR¿OPV FRQIHUV WKH EDFWHULXP DGGLWLRQDO
protection in front of the immune system, antibiotics
and disinfectants [3].
The genomes of two different strains have been
recently sequenced and compared [4] but no expression-pattern studies have been performed yet. In this
communication, we present a comparative proteome
analysis of four strains with different infective capacities, ATCC 13637 and the new clinical isolates
M30, UV74 and E77.
0DWHULDOV0HWKRGV
centrifuged. DIGE labeling: Samples were labeled
as follows: Clinical strains with Cy3 (green), ATCC
13637 strain with Cy5 (red) and the internal standard with Cy2 (Blue). 50 µg of each sample were
mixed and the resulting 150 µg were loaded onto
the IPG strips. 2-D Gel Electrophoresis: The IPG
strips were 24cm long and the pH range was from 3
to 10 lineal and 4 to 7. The sample was loaded with
the cup-loading system. The second dimension was
performed in 12.5% polyacrylamide gels. Gels were
performed in triplicate for statistical analysis. Image
analysis: Images were acquired immediately using
a Typhoon scanner (GE Healthcare) and the image
analysis was carried out with Samespots software
(Nonlinear dynamics). In-Gel Tryptic Digestion:
After image analysis silver staining of the gels was
performed. The selected spots were excised from
the acrylamide gel, and immediately destained and
digested. MALDI-MS Analysis:ȝORIVDPSOHZDV
PL[HG ZLWK ȝO RI +&&$7KLV PL[WXUH ZDV DQDO\]HGZLWKDQ8OWUDÀH[0$/',72)%UXNHU)RU
PMF analysis, the MASCOT search engine (Matrix
Science) was used with the following parameters:
one missed cleavage permission, 50 ppm measurePHQWWROHUDQFHDQGDWOHDVW¿YHPDWFKLQJSHSWLGH
masses. In the searches, methionine oxidation and
cystein carbamidomethylation were taken into acFRXQWDVYDULDEOHPRGL¿FDWLRQV
Bacterial strains and growth
Three new S. maltophilia strains were isolated.
M30 from a patient with decubitus ulcer. E77 from
sputum and UV74 from patient with a vascular ulcer .ATCC 13637 and clinical isolated S. maltophilia strains were cultured in LB media to reach
exponential growth. Total protein extract: 20ml of
culture were washed with PBS and resuspended in
lysis solution (8M urea, 2M thiourea, 2.5% CHAPS,
2% ASB-14, 40mM Tris-HCL pH 8.8, 0.5% IPG).
Then, samples were disrupted by sonication and
Conclusions
A differential expression analysis of the proteomes of newly isolated clinical strains of S. maltophilia and the laboratory strain ATCC 13637 has
been performed (Figure 1). Eye-inspection of the gel
images readily suggests the existence of substantial
differences between the two proteomes under the exSHULPHQWDOFRQGLWLRQV7KHLGHQWL¿FDWLRQRIGLIIHUHQtially expressed proteins in these strains shall provide
117
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
the basis for the interpretation of their phenotypic
differences at a biomolecular level, with a special
focus on infection and resistance mechanisms.
LQIHFWLRQ2WKHULGHQWL¿HGSURWHLQVDUHLQYROYHGLQ
protein synthesis (Spot nº 3, 4, 5, 13 and 17) and in
amino acid metabolism (spot nº 12, 15 and 20).
$FNQRZOHGJHPHQWV
AntiPathoGN is supported by funding under the
Seventh Research Framework Programme of the
European Union (ref. HEALTH-F3-2009-223101).
The Authors thank Francesc Canals, from Unitat de
Proteòmica of Hospital Vall d’Hebron for his valuable advice on image adquisition.
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Figure 1. DIGE of the M30 and the ATCC 13637 S. maltophilia strains
On average, around 1500 spot features were
detected on each analytical gel. Statistical analysis
of gels allowed the detection of about 300 spots with
VLJQL¿FDQWFKDQJHVEHWZHHQWKHFOLQLFDOLVRODWHVDQG
$7&&VWUDLQV:HKDYHLGHQWL¿HGGLIIHUHQWLDOO\
expressed proteins. Interestingly, some of these proteins (Spot nº 9, 16 and 21) are involved in the fatty
acid metabolism. Moreover, a protein involved in
the poliketide sugar unit biosynthesis has also been
LGHQWL¿HG 6SRW Qž 7KH XSUHJXODWLRQ RI WKHVH
proteins in the some of the clinical strains suggests
a different membrane lipopolysaccharide composiWLRQ ZKLFK LQ WXUQ FRXOG EH UHODWHG ZLWK ELR¿OP
formation and pathogenesis. A number of proteases
are upregulated in the clinical strains (Spot nº 2, 14,
22 and 23) that could also be potentially relevant to
118
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
B) Proteómica de Hongos
Análisis comparativo del proteoma de una cepa industrial de Saccharomyces
cerevisiae en dos condiciones de cultivo
Carlos Luna1, Teresa García-Martínez1, Miguel Curto2, Juan Carlos Mauricio1
1
Departamento de Microbiología. 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de
&yUGRED&DPSXVGH5DEDQDOHV(GL¿FLR6HYHUR2FKRD
La levadura Saccharomyces cerevisiae es uno de
los organismos modelo utilizados en Biología Molecular, y además es un organismo que tiene un gran
valor comercial. La mayoría de los estudios sobre
proteómica de levadura se ha realizado sobre cepas
de laboratorio, y existen pocos datos sobre levaduras
de interés industrial. Saccharomyces cerevisiae es
un microorganismo anaerobio facultativo. Durante
el proceso de fermentación, la levadura se adapta
¿VLROyJLFDPHQWHDGLVWLQWRVHVWUHVHVFRPRVRQHOHvada presión osmótica, agotamiento de la fuente de
carbono como la glucosa y la aparición de etanol,
que le es tóxico. Durante la fermentación alcohólica,
&KHQJ\FRODERUDGRUHV>@KDQLGHQWL¿FDGRHQ]LPDV
implicadas en las rutas de las pentosas fosfato, glicolisis, gluconeogénesis, biosíntesis del glicerol y
también proteínas de choque térmico. El objetivo de
HVWHHVWXGLRKDVLGRFRPSDUDUHOSHU¿OSURWHyPLFR
de una levadura industrial en dos medios de cultivo:
medio fermentativo con glucosa y medio oxidativo
con glicerol y etanol.
La levadura Saccharomyces cerevisiae G1, aislada de un vino de la D.O Montilla-Moriles, creció
en dos condiciones: en un medio fermentativo, medio completo YPD compuesto por 17% de glucosa,
1% de extracto de levadura, 2% peptona bacteriológica; y en un medio oxidativo formado por 0.67% de
YNB, ácido glutámico 10mM, 1% de glicerol y 15%
de etanol. Finalizado el experimento, las células de
levadura se recogieron por centrifugación a 3.000
x g a 4º C durante 10 minutos. Posteriormente, se
realizó una lisis física con bolas de vidrio y una lisis
química con 20 ml totales de tampón de extracción
compuesto por tampón Tris 100 mM, a pH 8,0,
PMSF 1mM, EDTA1 mM, DTT2 mM, y un cóctel
de inhibidores de proteasas (Roche). El extracto
de proteínas se precipitó con TCA-Acetona-DTT
0.07% durante 24 horas a -20ºC. Se resuspendió en
tampón de solubilización (Urea 8M, 2% CHAPS
\ '77 P0 /D FXDQWL¿FDFLyQ GH SURWHtQDV VH
determinó mediante el método Bradford [2]. IEF2D: Se utilizaron tiras con gradientes de pH inmovilizados (IPG) de 17 cm, de gradiente no lineal
3-10, (Bio-Rad). Se rehidrataron pasivamente durante 2 horas con 500 µg de proteína en 300 µL de
tampón de solubilización (Urea 8M; 2% CHAPS;
0,5% tampón IPG 5-8, 3-10, 30 mM DTT, y azul
de bromofenol 0.01%) [3]. Las tiras se cargaron
en IEF CELL (Bio-Rad) para ser enfocadas por su
SXQWRLVRHOpWULFRFRQXQSURJUDPDHVSHFt¿FR/RV
geles de poliacrilamida al 13% fueron sometidos
a electroforesis en PROTEAN II CELL. Los geles
fueron teñidos con azul de coomassie G-250 durante
24 h por el método descrito por Mathesius y colaboradores [4]. Las imágenes fueron adquiridas con
un densitómetro GS-800 calibrado y se analizaron
con el software PDQuest 8.0.1 (Bio-Rad). Se calcularon los puntos isoelétricos según la distribución
de las tiras, y los pesos moleculares según el patrón
GHSHVRVREWHQLGRV\UHÀHMDGRVHQORVJHOHVFRQORV
marcadores correspondientes. Ciertos spots obtenidos tanto en fermentación como en medio oxidativo
están secuenciados mediante MALDI-TOF/TOF en
el Centro de Genómica y Proteómica - Unidad de
Proteómica - Facultad de Farmacia. Universidad
&RPSOXWHQVHGH0DGULG3DUTXH&LHQWt¿FRGH0Ddrid (UCM-PCM).
Hemos obtenidos 477±20 spots en geles de fermentación. En el caso geles de medio oxidativo se
KDQFXDQWL¿FDGR“VSRWVWRWDOHV
6HKDQLGHQWL¿FDGR“VSRWVTXHHVWiQSUHsentes tanto en los geles correspondientes al medio
de fermentación como en los geles pertenecientes al
medio oxidativo, éstos son los spots comunes.
Se ha observado que la expresión de los spots en
geles de medio oxidativo está mucho menos acen-
119
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
tuada que en los geles de fermentación, así como
que el número total de spots expresados es menor
que en el caso de fermentación.
Se ha comprobado que las proteínas en ambos
geles bidimensionales pertenecen fundamentalmente a la glicolisis, gluconeogénesis y biosíntesis de
glicerol. Por otro lado, se han encontrado proteínas
expresadas en medio oxidativo que no están presentes en medio de fermentación. Estas proteínas
se relacionan con el estrés oxidativo y actualmente
están siendo estudiadas. La mayoría de las proteíQDVFXDQWL¿FDGDVVHHQFXHQWUDQHQODEDVHGHGDWRV
de SwissProt de Saccharomyces cerevisiae (www.
expasy.ch/sprot).
Agradecimientos
(VWHWUDEDMRKDVLGR¿QDQFLDGRSRUHO0LQLVWHULR
de Ciencia e Innovación (INIA) proyecto RTA200800056-C02-02 y FEDER.
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0DWKHVLXV8.HLM]HUV61DWHUD+$:HLQPDQ
JJ, Djordjevic MA, Rolfe BG. Establishment
of a root proteoma reference map for the model
legume Medigaco trunculata using the expressed sequence tag database for peptide mass
¿QJHUSULQWLQJ3URWHRPLFV
Estudio proteómico comparativo de células de Saccharomyces cerevisiae libres
y bioinmovilizadas
Teresa García-Martínez, Juan Carlos Mauricio
'HSDUWDPHQWRGH0LFURELRORJtD8QLYHUVLGDGGH&yUGRED&DPSXVGH5DEDQDOHV(GL¿FLR6HYHUR2FKRD
Tradicionalmente, la levadura Saccharomyces cerevisiae se ha usado en alimentación, principalmente
por su producción de etanol en bebidas alcohólicas
durante miles de años. La avanzada biotecnología de
las células inmovilizadas en procesos fermentativos
de interés aporta una serie de ventajas técnicas y
económicas frente a los sistemas convencionales de
células libres [1]. Nuestro grupo de investigación ha
puesto a punto un sistema de bioinmovilización que
consiste en una co-inmovilización espontánea de un
KRQJR¿ODPHQWRVRPenicillium chrysogenum H3) y
una levadura (Saccharomyces cerevisiae G1), en ausencia de compuestos químicos de unión y de soporWHVH[WHUQRVPHGLDQWHODFUHDFLyQDUWL¿FLDOPHQWHGH
condiciones adecuadas para favorecer una simbiosis
[2]. Al inmovilizado creado, que son esferas huecas
de ambos microorganismos, lo hemos denominado
“biocápsulas de levadura”, y éstas pueden ser aplicadas a diversos procesos fermentativos. El objetivo
de este trabajo ha sido realizar un estudio proteómico
comparativo entre las células de levadura en forma
libre y en forma bioinmovilizada en el medio de formación de las biocápsulas de levadura.
Los microorganismos usados en este estudio han
sido una cepa de Saccharomyces cerevisiae var. capensis G1, aislada de un vino bajo crianza biológica
de la D.O. Montilla-Moriles y un hongo, Penicillium
chrysogenum H3, aislado del ambiente. El medio
de cultivo y las condiciones en las que se produjo la
bioinmovilización fueron: medio YNB que contiene
ácido glucónico como fuente de carbono, amonio
como fuente de nitrógeno y tamponado a pH 7. Dos
matraces Erlenmeyer de 250 mL con 150 mL de medio de formación de biocápsulas se inocularon con
4 x 106 células de G1/mL y un asa de siembra del
hongo H3. Se incubaron a 28ºC en un agitador orbital
a 200 rpm durante 7 días, formándose durante este
120
tiempo las biocápsulas de levadura. Para el estudio de
las células de levadura libres se procedió de la misma
PDQHUDVLQODLQRFXODFLyQGHOKRQJR¿ODPHQWRVR/DV
células de levadura inmovilizadas se extrajeron del
inmovilizado por rotura mecánica y agitación vigorosa en una solución de NaCl 100 mM, posteriormente las células de levadura se separaron de las hifas
SRUGRV¿OWUDFLRQHVVXFHVLYDVSULPHURSRUXQ¿OWUR
Millipore de 180 µm y después por otro de 30µm).
Ambos tipos de células de levadura se recogieron por
centrifugación a 3000 x g a 4º C durante 10 minutos.
La lisis celular tanto de las células de levadura libres
como las procedentes del inmovilizado se realizó
en un Vórtex- Genie2 con DTT, bolas de vidrio, y
los tampones 1 y 2 necesarios para la extracción de
las proteínas. Tampón 1: SDS (5%); TRIS-HCl (0.5
M); pH 7.5 y tampón 2: Thiourea (2 M); urea (7 M);
CHAPS (4 %); DTT (1%); Pharmalite 3-10 (2 %) [3].
La precipitación de proteínas se hizo con Tricloroacético (TCA) al 10% diluido en acetona fría. La concentración de proteínas de los extractos celulares se
determinó mediante el método descrito por Bradford
[4]. Se realizó una electroforesis bidimensional: para
la primera dimensión se utilizaron tiras IPG de 17
cm, con gradiente de pH no lineal +N3-10 (Bio-Rad)
fueron rehidratadas con 150 µg de proteína en 300 µL
de tampón de solubilización. El isoelectroenfoque se
llevó a cabo en un PROTEAN IEF CELL (Bio-Rad)
a una corriente constante de 50 µA per tira hasta 40
000 Vh. Para la segunda dimensión (SDS-PAGE), las
proteínas se separaron en geles al 13% de poliacrilamida en un PROTEAN II CELL. Los geles corrieron
a una corriente constante a 60 mA per gel. Los geles preparativos fueron teñidos con CBB G-250 [5]
0HUFN*HUPDQ\/DLGHQWL¿FDFLyQGHODVSURWHtQDV
se realizó en la Unidad de Proteómica, de la UCO,
miembro de ProteoRed, usando MALDI-TOF para
VXLGHQWL¿FDURQHQOD%DVHGH'DWRVGH6ZLVV3URW\
Trembl del Proteoma de Levaduras de S.cerevisiae,
(www.expasy.ch/sprot). Los geles se analizaron mediante el programa PD-Quest 8.0.1 (Bio-Rad).
Después de 7 días, la levadura libre en el medio
de formación de biocápsulas solamente se dividió una
vez (una generación), lo que era de esperar puesto que
este medio no es fermentativo para la levadura. Sin
embargo, la levadura inmovilizada creció algo más,
VHJXUDPHQWHDH[SHQVDVGHOKRQJR¿ODPHQWRVR
El número de spots encontrados en los geles de
las células libres de levadura fue aproximadamente
del doble de los observados en los geles de las células
de levadura inmovilizadas. Esta gran disminución
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
en el nivel de proteínas de las células inmovilizadas
puede ser debido a que la levadura reduzca su sínWHVLVSRUTXHYLYHDH[SHQVDVGHOKRQJR¿ODPHQWRVR
en forma de simbiosis. La totalidad de las proteínas
FXDQWL¿FDGDV VH HQFXHQWUDQ HQ OD EDVH GH GDWRV GH
SwissProt de Saccharomyces cerevisiae y en ambos
casos abundan las proteínas de la glicolisis. En células bioinmovilizadas, se observa una disminución de
proteínas básicas de bajo peso molecular. En la actualidad, se está continuando con el análisis de proteínas
de estos geles en estas dos condiciones ensayadas.
En conclusión, el análisis proteómico de ambos
geles bidimensionales muestra una disminución importante del número de spots en las células de levaGXUDFRLQPRYLOL]DGDVFRQHOKRQJR¿ODPHQWRVR/D
mayor disminución corresponde a proteínas básicas
de bajo peso molecular.
Agradecimientos
(VWHWUDEDMRKDVLGR¿QDQFLDGRSRUHO0LQLVWHULR
de Ciencia e Innovación (INIA) proyecto RTA200800056-C02-02 y FEDER.
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legume Medigaco trunculata using the expressed sequence tag database for peptide mass
¿QJHUSULQWLQJ3URWHRPLFV
121
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
(VWXGLR FRPSDUDWLYR GHO SHUILO SURWHLFR GH FHSDV VLOYHVWUH %< \
PXWDQWHWUNGHSaccharomyces cerevisiae en condiciones de ayuno en K+
Miguel Curto1, Clara Navarrete2, Luis Valledor3, María Luisa Hernández4, José Ramos2, Jesús
Jorrín1
1
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba, 14071 Córdoba, España.
Departamento de Microbiología, Universidad de Córdoba, Córdoba, España. 3 Departamento de Biología de
2UJDQLVPRV\6LVWHPDVÈUHDGH¿VLRORJtDYHJHWDO8QLYHUVLGDGGH2YLHGR2YLHGR(VSDxD4Departamento
GH 0LFURELRORJtD ,, )DFXOWDG GH IDUPDFLD 8QLYHUVLGDG &RPSOXWHQVH GH 0DGULG 3DUTXH &LHQWt¿FR GH
Madrid (UCM-PCM). Madrid, España.
2
Resumen
Se ha llevado a cabo el estudio comparativo del
proteoma de las cepas silvestre (BY4741) y mutante
(trk1,2) de Saccharomyces cerevisiae en condiciones
limitantes de K+, utilizando electroforesis bidimensional acoplada a MS. En respuesta al ayuno en
K+ se observó un marcado descenso del contenido
en proteínas en extractos celulares y del número de
spots en geles bidimensionales, tanto en la variedad
silvestre como la mutante. Los spots que presentaron
diferencias cualitativas o cuantitativas, estadísticaPHQWH VLJQL¿FDWLYDV HQWUH FHSDV VH DQDOL]DURQ SRU
espectrometría de masas (MALDI-TOF-TOF). Tras
ODLGHQWL¿FDFLyQPHGLDQWHE~VTXHGDHQEDVHGHGDWRV
(UniProtKB-SwissProt; limitada a la taxonomía de
Saccharomyces cerevisiae (Baker’s yeast)) las proteínas se agruparon de acuerdo a su función. El ayuno
en potasio causó una disminución en enzimas del
metabolismo energético y del metabolismo de aminoácidos, así como a proteínas de respuesta a estrés.
Este trabajo forma parte del proyecto TRANSLUCENT (http://www.translucent-network.org/),
cuyo objetivo es analizar los mecanismos implicados en la homeostasis catiónica [1] usando
como sistema modelo S. cerevisiae. Mediante una
aproximación de proteómica de expresión diferencial basada en electroforesis bidimensional, se ha
LQWHQWDGR LGHQWL¿FDU FDPELRV HQ HO FRQWHQLGR HQ
proteínas como resultado de la doble mutación en
ORVJHQHVTXHFRGL¿FDQSURWHtQDVWUDQVSRUWDGRUDVGH
K+ (TRK1 y TRK2) [1], y en condiciones de ayuno
en K+. En un trabajo preliminar, el proteoma de las
dos cepas (silvestre y doble mutante) se comparó en
las fases exponencial y estacionaria de la curva de
crecimiento, con concentraciones óptimas (50 mM
ClK) de K+ en el medio [2]. Se realizaron extracciones de proteínas [3] y geles bidimensionales (IEF en
el rango de pH 5-8; SDS-PAGE 12 %; tinción con
&RRPDVVLHFRORLGDO>@GH:7\trk1,2 a 0 (control),
30, 60, 180 y 300 tras la eliminación del K+. Se detecto un descenso progresivo con el tiempo de ayuno
tanto en el contenido en proteínas del extracto como
en el número de spots resueltos, siendo este efecto
más acusado en la cepa mutante que en la silvestre
(Figura 1). Se picaron los spots que mostraron diferencias cualitativas o cuantitativas, estadísticamente
VLJQL¿FDWLYDVHQWRWDOVHVRPHWLHURQDGLJHVWLyQ
tríptica, analizándose los péptidos resultantes por
MS (MALDI-TOF-TOF). Tras la búsqueda en bases
de datos (UniProtKB-SwissProt; limitada a la taxonomía de Saccharomyces cerevisiae (Baker’s yeast))
XWLOL]DQGRHOVRIWZDUH0$6&27>@VHLGHQWL¿FDURQ
171 proteínas, que se agruparon según su función
(Figura 2). El ayuno en potasio causó una disminución en enzimas del metabolismo energético y del
metabolismo de aminoácidos, así como a proteínas
GHUHVSXHVWDDHVWUpV(QWUHODVSURWHtQDVLGHQWL¿FDdas, las relacionadas con el estrés y/o reacciones de
defensa, metabolismo de nucleótidos y transcripción,
fueron las que presentaron mayores cambios entre
cepas, siendo más abundantes en la cepa silvestre.
Agradecimientos
Agradecemos el trabajo desarrollado, por la Dra.
Hanna Sychrova (Departamento del transporte de
PHPEUDQD,QVWLWXWRGH¿VLRORJtD5HSXEOLFD&KHFD
Praga), con las cepas de S. cerevisiae usadas en este
trabajo. Así como al proyecto “Gene interaction
networks and models of cation homeostasis in Saccharomyces cerevisiae –TRANSLUCENT” por
¿QDQFLDUHVWHWUDEDMR
122
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Referencias
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Figura 1. A. Contenido en proteínas en extractos de la cepa
silvestre y doble mutante a distintos tiempos tras la eliminación de K+ del medio. B. Número de spots resueltos en
dichos extractos, en el rango de pH 5-8 y Mr 6-95 KDa.
Figura 2. Agrupación funcional de las proteínas afectadas
por el ayuno en potasio. A. Cepa silvestre; B. Doble mutante. Datos expresados en porcentaje.
123
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Análisis mediante 2D-DIGE de la interacción con sangre de una cepa de Saccharomyces
cerevisiae potencialmente patógena aislada de suplementos dietéticos
Carolina Hernández-Haro, Lucía Monteoliva, Gloria Molero, Concha Gil, María Molina
Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia (UCM). Plaza Ramón y Cajal s/n, Madrid, Spain.
La levadura Saccharomyces cerevisiae es conocida por su papel en la elaboración de pan y de
bebidas alcohólicas tales como el vino, la cerveza
o la sidra. Además, esta levadura es también consumida en forma de suplementos dietéticos y de
probióticos lo que implica el consumo de las células
GH OHYDGXUD YLYDV /RV HIHFWRV EHQH¿FLRVRV HQ HO
hospedador derivados de este consumo son conocidos; sin embargo, no se han estudiado los posibles
efectos indeseables, sin duda debido a que S. cerevisiae se ha considerado siempre un microorganismo
seguro para uso alimentario. En los últimos años,
la bibliografía clínica muestra que la incidencia de
infecciones causadas por S. cerevisiae ha aumentaGRGHPDQHUDVLJQL¿FDWLYDHQSDFLHQWHVLQPXQRGHprimidos [1], por lo que actualmente S. cerevisiae
se incluye en el grupo de “patógenos oportunistas
emergentes” [2-3]. Para estudiar la posible relación
entre la ingesta de células vivas de S. cerevisiae,
a través del consumo de suplementos dietéticos y
probióticos, y las infecciones en humanos, se probó
la virulencia de diferentes cepas en modelo murino
de infección sistémica observándose un 50% de
muerte de ratones con una de las cepas, por lo que se
planteó el análisis de los posibles rasgos de virulencia asociados a estos S. cerevisiae patógenos [4]. El
REMHWLYRGHHVWHWUDEDMRHVODLGHQWL¿FDFLyQGHSURteínas potencialmente implicadas en la virulencia,
para lo cual se ha realizado un estudio comparativo
de la expresión diferencial mediante el sistema 2DDIGE de proteínas de extractos citoplasmáticos de
una cepa procedente de dichos suplementos dietéticos caracterizada como virulenta y una cepa de
laboratorio avirulenta. Las muestras se obtuvieron
tras la interacción de las células de levadura con
sangre humana a distintos tiempos (0, 1.5 y 3 horas)
a 37ºC y en condiciones semiaeróbicas. Se utilizó la
sangre humana debido a que la diseminación de la
levadura en el torrente sanguíneo constituye una etapa esencial para el desarrollo de infección sistémica.
Los extractos de proteína de tres réplicas biológicas
VHPDUFDURQFRQORVÀXRURFURPRV&\R&\\HO
estándar interno con Cy2 y se separaron en 9 geles
TXHWUDVODGHWHFFLyQGHÀXRUHVFHQFLDVHDQDOL]DURQ
con el módulo BVA (Biological Variation Analysis)
del software DeCyder. Se realizaron comparaciones
entre cepas y entre tiempos de interacción con sangre mediante análisis 2-ANOVA detectándose: 43
manchas proteicas de expresión diferencial al comparar los distintos tiempos (2-ANOVA-condición
WLHPSR GHODVFXDOHVVHKDQLGHQWL¿FDGR
25, 391 manchas proteicas al comparar las 2 cepas
(2-ANOVA-condición cepa < = 0.05) de las cuales
VH KDQ LGHQWL¿FDGR \ PDQFKDV SURWHLFDV DO
comparar las distintas cepas en los distintos tiempos
(2-ANOVA-interacción < = 0.05) de las cuales se
KDQ LGHQWL¿FDGR (QWUH HVWDV SURWHtQDV VH HQcuentran proteínas metabólicas, chaperonas y ATP
sintasas. Además, podemos destacar que entre las
SURWHtQDVGHH[SUHVLyQGLIHUHQFLDOLGHQWL¿FDGDVWDPbién se encuentran proteínas de la sangre. Esto podría ser debido a una fuerte unión de estas proteínas
DODVOHYDGXUDV$FWXDOPHQWHVHHVWiQLGHQWL¿FDQGR
el resto de las proteínas de expresión diferencial.
Carolina Hernández Haro es becaria FPI del
0,&,11(OWUDEDMRHVWi¿QDQFLDGRSRUHOSUR\HFWR
AGL2006-12710-C02-02/ALI de la DGICYT del
MEC. Proyecto coordinado con el grupo de investigación de las Dras. Amparo Querol y Mª Teresa
Fernández-Espinar del IATA (Valencia).
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Análisis comparativo de diferentes aproximaciones para el estudio del proteoma
de Saccharomyces cerevisiae
Dolores Gutiérrez1, Mª Luisa Hernaéz1, Montserrat Martínez-Gomariz1, María Posada1, Concha Gil2
1
2
8QLGDGGH3URWHyPLFD8QLYHUVLGDG&RPSOXWHQVHGH0DGULG3DUTXH&LHQWt¿FRGH0DGULG8&03&0
Departamento de Microbiología II. Facultad de Farmacia. Universidad Complutense de Madrid
En los últimos años el gran desarrollo de los
espectrómetros de masas y las técnicas de fraccionamiento de péptidos y proteínas ha permitido el
estudio de muestras complejas de proteínas. A pesar
de ello aún estamos lejos de conseguir el análisis
completo de proteomas o subproteomas.
Saccharomyces cerevisiae es un organismo modelo desde el inicio en proteómica, para estimar la
capacidad real de una tecnología dada en el estudio
profundo de un proteoma. Además, cuando esta
levadura esta creciendo en fase logarítmica hay evidencias de que más de 4500 proteínas son expresadas en un amplio rango dinámico, desde 100 copias
por célula para aquellas proteínas menos abundantes
hasta millones de copias por célula para las proteínas más abundantes. En la actualidad, se ha cubierto
más del 50% de su proteoma, aplicando diferentes combinaciones de fraccionamiento y diferentes
equipamientos de espectrometría de masas [1]
La electroforesis bidimensional en geles de
poliacrilamida (2D-PAGE) ha demostrado ampliamente su utilidad en la capacidad de separación de
proteínas aportando gran información acerca del
contenido proteico celular [2]. Sin embargo, presenta algunas desventajas importantes, como la
limitada cantidad de muestra que se puede cargar
en el gel, y la inadecuada resolución de proteínas
hidrofóbicas o de elevado peso molecular. AlterQDWLYDPHQWH ODV WpFQLFDV FURPDWRJUi¿FDV SDUD OD
separación de péptidos y proteínas permiten reducir
la complejidad de la muestra y aumentar el número
GHSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDV
La técnica de separación mediante isoelectroenfoque en solución resuelve proteínas o péptidos en
función de su punto isoeléctrico (pI). Las fracciones
resultantes están en solución lo que permite acoplarlas a un segundo paso de fraccionamiento como
cromatografía líquida y su posterior análisis por
espectrometría de masas en tandem (MS/MS). Esta
metodología parece altamente efectiva y reproduciEOHVLHQGRLQFOXVRFRPSDWLEOHFRQODFXDQWL¿FDFLyQ
de proteínas por marcaje con iTRAQ [3].
En este trabajo hemos diseñado cuatro aproximaciones proteómicas diferentes en los que se
combinan diversas técnicas de fraccionamiento y
análisis por espectrometría de masas para comparar
la capacidad de las distintas estrategias para la caracterización del proteoma de esta levadura (Figura
1). Los experimentos se detallan a caontinuación:
Experimento 1: Proteínas intactas son separadas
mediante isoelectroenfoque, utilizando tiras de 12
cm con un rango de PH de 3-10 con una resolución
de 0.6, seguido de digestión tríptica de cada fracción
y nano-RP-HPLC acoplada on-line a ESI-MS/MS
(LTQ) y off-line a MALDI-MS/MS (4800 MALDI72)72)GH$SSOLHG%LRV\VWHPVSDUDODLGHQWL¿FDción de proteínas. Experimento 2: Digestión tríptica
del extracto proteico seguido de separación de los
péptidos según pI mediante Off-Gel usando las mismas tiras que para la separación de proteínas. Las diferentes fracciones se separaron mediante RP-HPLC
acoplado a MS/MS de la misma manera que en el
experimento 1. Experimento 3: Digestión de proteínas seguida de cromatografía bidimensional off-line
(SCX y nano-RP-HPLC) acopladas a espectrometría
125
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Figura 1. Esquema de trabajo de los cuatro experimentos
de masas en tandem en la misma forma que los experimentos anteriores. Experimento 4: Separación
de proteínas mediante SDS-PAGE. Se corta el gel en
12 bandas, cada una de éstas se digiere por separado
y los péptidos extraídos se analizan mediante nanoRP-HPLC y espectrometría de masas en tandem
como se ha detallado anteriormente.
/D ¿QDOLGDG GH HVWH HVWXGLR HV FRPSDUDU HO
efecto de las cuatro estrategias en relación a la
LGHQWL¿FDFLyQ GHO SURWHRPD GH S. cerevisiae y
analizar la capacidad de las distintas técnicas de
fraccionamiento para detectar proteínas de baja
abundancia. Este estudio nos facilitará información
para decidir cuál es la aproximación de elección,
con la tecnología que disponemos, para el análisis
de mezclas complejas.
Agradecimientos
El análisis proteómico se ha realizado en la Unidad de Proteómica de la UCM-PCM, miembro de
Proteored.
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3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Applying proteomic technologies to dissect molecular aspect of phytopathogenic
fungi, a Botrytis cinerea approach
Francisco Javier Fernández-Acero, Carlos Garrido, María Carbú, Victoria E. González-Rodríguez,
Jesús Manuel Cantoral
Laboratory of Microbiology, Marine and Environmental Sciences Faculty, University of Cádiz, Pol. Río San
Pedro s/n, Puerto Real, 11510, Cádiz, Spain
Abstract
Two dimensional gel electrophoresis (2-DE)
plus mass spectrometry (MS) have been widely used
to study the proteome of a good number of tissues,
plants, animals or microorganisms. However, few
of them have been carried out to study the proteome
of phytopathogenic fungi. These organisms are responsible of several plant diseases in different crops
around the world, causing very important economic
losses to the farmers. There are several reasons to
explain the lack of proteomic studies describing fungal plant pathogen proteomes. The main aim of this
work is to tackle the strategies to overcome these
SUREOHPVLHE\WKHPRGL¿FDWLRQRISURWHLQH[WUDFtion protocols, or using microbiology techniques to
decrease the analytical variability.
Main text
Fungal plant pathogens are one of the main responsible of farmer losses. By way of example, the
annual consumption of fungicides against phytopathogenic fungus Botrytis cinerea (Botrycides) moves
about 10% of global fungicide market, which would
mean 540 million per year [1]. Moreover, the losses
increase with the value of agricultural losses, quanWL¿HGEHWZHHQDQGPLOOLRQ(XURVSHU\HDU
The losses caused by B. cinerea in French vineyards
are between 15% and 40% per year, depending on
weather conditions. In Holland, B. cinerea produces
DORVVLQÀRZHUFURSVDQGLQ6SDLQ
in the strawberry crops. Annual average expenditure
on fungicides against Botrytis, is around 3 million
Euros in tomato crops, 2 million in strawberry and
3 million in grapewine crops (BASF, personal communication). The genus Botrytis is an ascomycetes
¿ODPHQWRXVIXQJXVZKLFKLQFOXGHVDODUJHQXPEHU
of pathogenic species capable of infecting a variety
of crops. Some species are able to infect a single
crop, such as B. tulipae, B. squamosa or B. fabae,
pathogen to tulips, bean and onions respectively.
However, B. cinerea is able to attack more than 200
species, including tomatoes, strawberries and grapes, three of the most important crops in Andalusia.
7KLVIXQJXVKDVJUHDWÀH[LELOLW\SUHIHUDEO\LVDEOH
to attack fruit (grapes, strawberries, tomatoes, etc.),
ÀRZHUVEXWDOVRLVDEOHWRDWWDFNVWHPVOHDYHVDQG
seeds. Moreover, it is also capable to attack many
different plants (grapevine, tomato, Arabidopsis,
roses, etc.), in different organs of the same plant
(fruits, leaves, petals and other structures of the
same plant). Furthermore, the disease may appear
directly “in planta” or during storage and distribution of fruits. These data show the relevance of this
pathogen that is being currently considered as a model organism in all those experimental approaches to
the study of plant-pathogen interaction.
The fact that there are only few reports on the
proteome of phytopathogenic fungi is mainly due
WRSUREOHPVVXFKDVWKHGLI¿FXOW\LQREWDLQLQJIXQgal protein extracts or the lack of available fungal
protein databases [2]. An effective protein extraction is a key step for obtaining a good resolution
avoiding streaking in the 2-DE gels. It will allow
us to remove contaminants (i. e. nucleid acid, salts,
lipids, pigments) which may disturb the proteins
focusing. However, it is especially relevant when
WKH ELRORJLFDO VRXUFH LV D ¿ODPHQWRXV IXQJXV GXH
to its richness in cell wall polysaccharides, and the
mechanical resistance of the fungal cell wall. This
problem has been overcome by using phenol based protocol [3]. On the other hand, the amount of
genomic resources is increasing continuously, and
DERXWIXQJDOJHQRPHSURMHFWVDUHEHLQJ¿QLVKHG
(Broad Institute, MIT, Harvard). This information is
FUXFLDOWRJHWVLJQL¿FDQWQXPEHURISRVLWLYHSURWHLQ
LGHQWL¿FDWLRQKLWV,QVSLWHRIWKHVHSUREOHPVVHHPWR
be overcame, there are still some points that become
127
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
FULWLFDODSURWHRPLFDSSURDFKWR¿ODPHQWRXVIXQJDO
proteome. In spite of other aspects, we are especiaOO\LQWHUHVWHGLQWZRPDMRU¿HOGVLWRGHFUHDVHWKH
levels of variability founded in these studies, and (ii)
WRLQFUHDVHWKHEHQH¿WREWDLQHGIURPWKHODUJHOLVWRI
LGHQWL¿HGSURWHLQV
Calculations of analytical and biological variability are directed to quantify the variations associated with the 2-DE experiments and differences in the
level of protein expression between independent replicates [4]. The averages of analytical and biologiFDOFRHI¿FLHQWVRIYDULDQFHDUHXVHGWREHFDOFXODWHG
[5]. Only those changes consistently present in all
the extract replicates, whose quantitative differences
are higher than the corresponding biological and
analytical variance, should be considered [2]. In
spite of the levels obtained in fungal approaches are
similar to the obtained variability in plant or microRUJDQLVPVWXGLHV>@:HKDGXVHGPRQRFRQLGLDO
isolates in attempt to decrease these levels, but the
UHVXOWV UHPDLQ KLJK 2Q WKH RWKHU KDQG WKH ¿QDO
results obtained in a proteomic approach use to be
DODUJHOLVWRILGHQWL¿HGSURWHLQV7KHUROHRIHDFK
protein is also discussed for its biological relevance,
or used “in further studies”. This information is very
important and interesting, but if we apply our own
and particular “optics”, we assume the risk of information losses in other parallel biological process. As
an interesting tool is the website PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships;
ZZZSDQWKHUGERUJ WKDW DOORZV WKH FODVVL¿FDWLRQ
RILGHQWL¿HGSURWHLQVLQGLIIHUHQWFDWHJRULHVDFFRUding to (i) its biological process or (ii) its molecular
function, based on Gene Ontology. This information
PD\KLJKOLJKWVRPHLQIRUPDWLRQZKLFKLVGLI¿FXOWWR
extract directly from a protein list. In this sense, an
algorithm to elucidate the drug target-likeness of a
protein has been published [7]. This work could improve the development of new therapeutic targets to
¿JKWDJDLQVWVHYHUDOGLVHDVHV8QIRUWXQDWHO\DWWKLV
moment is not feasible to develop similar approach
to analyse new candidates for fungicide design (personal communication).
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Botrytis cinereaLVDSK\WRSDWKRJHQLF¿ODPHQWRXV
fungus, which infects more than 200 plant species [1],
FDXVLQJVLJQL¿FDQW\LHOGORVVHVLQDQXPEHURIFURSV
There are a number of isolates of B. cinerea that differ
LQWKHLUYLUXOHQFHDJDLQVWVSHFL¿FFURSV>@,QWKHODVW
few years, B. cinerea has been adopted as an important model system in molecular phytopathology fungi
studies [1]. In the post-genomics era, Proteomics has
became in a powerful tool which can contribute to understand biology, infection strategies, and lyfe cycle
of this fungus, to identify virulence factors, and, on
the bases of them, to develop crop protection strategies. Up to date only a few proteomics studies have
been published on this organism [3-7]. In this work,
we present a preliminary gel-based proteomic analysis
of mycelium extracts from six different strains of B.
cinerea:HXVHGDVVWDUWLQJSRLQWRQHGLPHQVLRQDO
HOHFWURSKRUHVLV'(DQGSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQE\
MALDI-TOF/TOF. This work is part of an European research project (BOTBANK EUI2008-03686)
within Plant-KBBE, intended at develop a collection
of mutants of B. cinerea and validate the creation of
this library with the characterization of the mutant
lines whose infectious cycle is affected.
B. cinerea strains used were B05.10 (from Prof.
Dr. Paul Tudzynski lab, Münster, Germany), CECT
2100, 2850, 2996 and 20518 (from Spanish Type Culture Collection) and BOLC (provided by Dr. Angel
Villegas from IAS, Córdoba, Spain, and isolated from
lentil infected plants). Three independent (biological)
UHSOLFDWHVHDFKRQHFRUUHVSRQGLQJWRP/ÀDFNV
FRQWDLQLQJP/RIPRGL¿HG&]DSHN'R[PLQLPDO
medium (2% w/v sucrose, 0.3% w/v NaNO3, 0.1% w/v
K2HPO4, 0.05% w/v KCl, 0.05% w/v MgSO4·7H2O,
pH 5.0) were inoculated with mycelium taken from
solid cultures grown on cellophane membrane with
potato dextrose agar. The cultures were grown for 6
days at 21ºC with agitation (120 rpm) in darkness.
0\FHOLD ZHUH KDUYHVWHG E\ ¿OWUDWLRQ 7KH SURWHLQ
precipitation method used was TCA/acetone-phenol/
methanol for recalcitrant tissues described in [8]. Fifteen µg of protein were subjected to SDS-PAGE [9],
using the Criterion System (Bio-Rad) with precast Criterion Stain Free Gels, Tris-HCl, 4-20% linear gradient (Bio-Rad). The protein band pattern was analyzed
using the Image Lab software (Bio-Rad). The bands
were cutted out and digested with trypsin. The MS of
tryptic peptides was analyzed in a 4800 Proteomics
Figure 1. SDS-PAGE of mycelium protein extracts of six different strains of B. cinerea.,GHQWL¿HGSURWHLQVDUHLQGLFDWHGE\
DUURZV81XQLGHQWL¿HGSURWHLQ
129
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Analyzer MALDI–TOF/TOF mass spectrometer (Applied Biosystems). The 3 most abundant peptide ions
were subjected to MS/MS analysis. A PMF search
and a combined search (+MS/MS) were performed in
nrNCBI database of proteins using MASCOT.
)LJXUHVKRZVWKHSURWHLQSUR¿OHRIWKHP\Felium extract from the six strains studied (B05.10,
2100, 2850, 2996, 20518 and BOLC). There were
VLJQL¿FDWLYHTXDOLWDWLYHDQGTXDQWLWDWLYHGLIIHUHQFHV
LQWKHSURWHLQSUR¿OHDPRQJVWUDLQV6HYHUDOSURWHLQV
ZHUHLGHQWL¿HGE\0$/',72)72)0606DQDOysis (Figure 1). Some of them have been reported
to be involved in pathogenicity in B. cinerea or in
other phytopathogenic fungi, such as malate dehydrogenase [5], woronin body major protein [10],
peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPI) [11] and
PIC5 protein [12], or implicated in fungal growth
and differentiation, such as nucleoside diphosphate
kinase [13]. The abundance of these proteins was
different among isolated (Figure 1).
:RUNLVQRZLQSURJUHVVLQGLIIHUHQWGLUHFWLRQV
i) analysis of spores and culture media in wild-type
strains; ii) analysis of mutants, obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation
(ATMT) and affected in infectious cycle; and iii)
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This work was supported by the Spanish “Ministerio de Ciencia e Innovación” (BOTBANK
Proyect: EUI2008-03686), the “Junta de Andalucía” and the “Universidad de Córdoba” (AGR 164).
Thanks to Consuelo Gómez from SCAI (Córdoba,
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Fernandez-Acero FJ, Colby T, Harzen A, Cantoral
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130
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Proteomic approach to Botrytis cinerea survival structures
Victoria E. González-Rodríguez, Carlos Garrido, Maria Carbú, Jesús Manuel Cantoral, Francisco
Javier Fernández-Acero
Laboratory of Microbiology, Marine and Environmental Sciences Faculty, University of Cádiz, Pol. Río San
Pedro s/n, Puerto Real, 11510, Cádiz, Spain
Abstract
The ascomycete Botrytis cinerea is a phytopathogenic fungus infecting a high number of crops, causing
VLJQL¿FDQW \LHOG ORVVHV LQ WKHVH FURSV LQ$QGDOXVLD
(Spain). In the last few years, B. cinerea has been
adopted as an important model system in molecular
phytopathology. Several approaches have been applied
to this fungus to unravel its mechanisms of infection.
These studies have revealed the complexity and wide
variety of infection strategies used by B. cinerea. This
study presents an initial approach to characterize the
proteins content of two principal structures of resistance: conidia and sclerotia, which constitutes the princiSDOLQRFXOXPRIWKHIXQJXVLQWKH¿HOGV$IWHU'(
the majority of the spots were found from 5 to 8 of
pI values, presenting a Mr from 14 to 105 kDa. After
SURWHLQLGHQWL¿FDWLRQZLOOEHGRQHRXUPDLQDLPLVWR
¿QGWKRVHSURWHLQVLQYROYHGLQSULPDU\SODQWOHVLRQ
sclerotia. Both, conidia and sclerotia, were homogenized by using FastPrep Instrument (Q-BIOgene,
Valencia, USA), 12 cycles of 30 second and 6.0 of
speed. Protein extraction was developed following
Fernandez-Acero et al [2]. Protein concentration
was determined by using the RC-DC Protein Assay
(Bio-Rad). 2-DE was developed following Fernandez-Acero et al [2] using Immobilized pH gradient
(IPG) strips (Bio-Rad, 7 cm,) 3-10 or 5-8 linear pH
gradient (Figure 1).
Main text
Botrytis cinerea Pers. Fr. is a phytopathogenic
DVFRP\FHWHWKDWFDXVHVVLJQL¿FDQW\LHOGORVVHVLQD
substantial number of crops. In the last years, many
research advances regarding the infection process
developed by this pathogen have been made. Lately,
SURWHRPLFVWHFKQRORJLHVKDYHDOORZHGWKHHI¿FLHQW
FKDUDFWHUL]DWLRQDQGLGHQWL¿FDWLRQRIDODUJHQXPber of proteins from B. cinerea [1-3]. However, a
special interest is focused in those proteins involved
in the initial steps of plant infection process due to
these proteins are excellent candidates for fungicide
design or targets to design diagnosis techniques.
Conidial suspensions (1 x 108 cond/mL) were
obtained from 15 days B. cinerea 2100 (Spanish
type culture collection) malt agar plates following
Carbu et al [4]. Sclerotia were obtained from B.
cinerea strain 992.1-89 (University of Cádiz culture collection) maintained during 30 days in malt
agar, at 22ºC to obtain a stock of well maturated
Figure 1. '(JHOIURPWKH¿UVWSURWHRPLFDSSURDFKWRFRQLdia (left) and sclerotium (right), showing the protein separaWLRQLQ,3*XSDQGGHGH¿QLWLYH,3*GRZQ
Obtained proteins from ungerminated conidial
suspension showed that most of the stained spots
were allocated between pI 5 and 8. The distribution
of the spots attending to its molecular weight (Mr)
was found from 14.7 to 105.7 kDa. Those spots
presented in all the three replicates were used to
calculate the analytical variability of the experiment.
One hundred and eight spots were used obtaining
% CV average of 42.05 %, which is similar to our
previous experiments. Two dimensional gels from
Sclerotia present more diverse content. In spite that
both structures show similar pI distribution, the
molecular weight was between 3.1 to 158.8 kDa,
showing a wider distribution. The obtained % CV
131
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
result was 44.61% by using 205 protein spots. This
UHSRUWVKRZVWKH¿UVWSURWHRPLFDSSURDFKWRB. cinerea conidial germination, representing its initial step.
Moreover, our initial results with sclerotia seem to
coincide with the previous studies with Sclerotinia
sclerotiorum [5] presenting a mayor protein with 3436 kDa and 3 isoforms with a pI of 6.2, 6 and 5.8.
Our gels show 6 isoforms with a Mr about 41 kDa,
and a pI of 5.23, 5.51, 5.65, 5.81, 5.94 and 6.19 as
a mayor component. In spite of the observed differences and waiting the results from MALDI TOF/
TOF, we assume that our protein is the same, a Ssp1
protein involved in sclerotia development.
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3HU¿OVHUROyJLFRGHODUHVSXHVWDGHDQWLFXHUSRVIUHQWHDOLQPXQRPDGHCandida
en el pronóstico de las candidiasis invasivas
Aida Pitarch, César Nombela, Concha Gil
Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid
Las candidiasis invasivas son infecciones de
notable morbilidad y mortalidad, en pacientes severamente inmunocomprometidos y enfermos críticos [1]. El hallazgo de nuevos biomarcadores de
pronóstico para estas infecciones oportunistas puede
suponer un nuevo camino para tomar decisiones
terapéuticas más precisas e individualizadas que
podrían a su vez mejorar la evolución clínica de estos pacientes. Para esta búsqueda, pueden ser útiles
técnicas globales de alto rendimiento tales como la
inmunoproteómica clásica o el análisis del proteoma serológico (SERPA) [2]. Diferentes estrategias
SERPA (basadas en electroforesis bidimensional
seguida de “western-blotting” y espectrometría de
masas) han permitido el descubrimiento de varios
biomarcadores clínicos y dianas terapéuticas para
estas micosis oportunistas [2-5].
&RQHO¿QGHLGHQWL¿FDU\YDOLGDUXQQXHYRPptodo de pronóstico para las candidiasis invasivas,
se combinó la tecnología SERPA con análisis bioinformáticos para examinar, en un estadio precoz de
LQIHFFLyQORVSHU¿OHVVHUROyJLFRVGHODUHVSXHVWDGH
anticuerpos frente al inmunoma de Candida en 45
pacientes con candidiasis invasivas que tuvieron un
desenlace fatal o favorable.
Análisis de conglomerados jerárquicos bidimensionales y del componente principal de los patrones
de reactividad de anticuerpos séricos frente a 31
proteínas inmunogénicas de Candida separaron con
precisión pacientes con estas micosis oportunistas
en dos grupos con pronósticos diferentes (aquellos
que sobrevivieron de los que fallecieron durante
el proceso infeccioso). Estos subgrupos fueron inGHSHQGLHQWHV GH ODV FDUDFWHUtVWLFDV GHPRJUi¿FDV
132
y clínicas de la población de estudio. Análisis supervisados con validaciones cruzadas permitieron
LGHQWL¿FDU XQ SDQHO GH FLQFR DQWLFXHUSRV FRPR OD
mejor combinación para predecir el pronóstico de
ODVFDQGLGLDVLVLQYDVLYDV6XUREXVWH]VHFRQ¿UPy
en otro grupo de pacientes con estas micosis oportunistas. Este panel permitió determinar, en un estadio
precoz de infección, el riesgo de un pronóstico fatal
en pacientes con estas infecciones invasivas, así
FRPRGH¿QLUJUXSRVGHSDFLHQWHVHQDOWRULHJRTXH
SXHGH EHQH¿FLDUVH GH WHUDSLD DQWLI~QJLFD 0RGHlos de regresión logística indicaron que este panel
proporcionaba un poder discriminatorio adicional
sobre factores de pronóstico conocidos para estas
infecciones invasivas.
(VWRV UHVXOWDGRV SRQHQ GH PDQL¿HVWR TXH VH
puede predecir el pronóstico en pacientes con candidiasis invasivas mediante la evaluación de un número relativamente pequeño de biomarcadores. Si
VH FRQ¿UPD HQ HVWXGLRV GH FRKRUWHV SURVSHFWLYRV
multicéntricos, éstos serán de enorme utilidad para
WRPDUGHFLVLRQHVWHUDSpXWLFDVPiVHVSHFL¿FDVHLQdividualizadas.
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
cia y Tecnología (proyecto BIO-2009-07654) por las
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Agradecimientos
Los autores expresan su más sincero agradeciPLHQWRDOD&iWHGUD([WUDRUGLQDULD0HUFN6KDUS
Dohme (MSD) en Genómica y Proteómica, a la Red
Española para la Investigación en Enfermedades
Infecciosas (REIPI) del Ministerio de Salud y Consumo e Instituto de Salud Carlos III – FEDER (proyecto RD06/0008/1027), a la Comunidad de Madrid
(proyecto S-SAL-0246/2006 DEREMICROBIANA-CM), y a la Comisión Interministerial de Cien-
133
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
$QiOLVLVSURWHyPLFRGHODPDWUL]H[WUDFHOXODU0(GHELRSHOtFXODVIRUPDGDVSRU
mutantes del hongo Candida albicansSDUDJHQHVTXHFRGL¿FDQSURWHtQDVTXHFRQtienen el dominio CFEM rico en cisteína y genes implicados en glicosilación
Rosario Blanes1, Ana M. Pérez1, Amelia Murgui2, Manuel Casanova1, Ángel Domínguez3, José P.
Martínez1
1
Departamento de Microbiología y Ecologia, 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad
de Farmacia, Universitat de València/Estudi General (UVEG), Valencia, e 3Instituto de Microbiología Bioquímica, Universidad de Salamanca, Salamanca (España)
Introducción
Candida albicans es un hongo patógeno oportunista capaz de producir graves infecciones sistémicas en indivíduos inmunocomprometidos. Entre los
DWULEXWRVELROyJLFRVTXHOHFRQ¿HUHQDC. albicans
su potencial patogénico, la capacidad de formar
biopelículas parece jugar un papel esencial. Las
biopelículas son comunidades celulares altamente
organizadas con una compleja estructura tridimensional, adheridas a un sustrato sólido (biológico o
no biológico), en la que las células se encuentran
embebidas en una matriz exocelular (ME) formada
por polisacáridos, proteínas y otros componentes
minoritarios. La ME juega un papel crítico en el
mantenimiento de la integridad estructural de las
biopelículas y en la protección de las células frente a
factores externos adversos como el sistema inmunitario y/o el tratamiento con antimicrobianos [1]. Por
lo tanto, un mejor conocimiento a nivel molecular
y funcional de los constituyentes mayoritarios de la
ME podría ser esencial en el desarrollo de nuevas
estrategias para el diagnóstico, prevención y control
de las candidiasis [2].
La formación de biopelículas es un proceso biológico muy complejo durante el cual las células
fúngicas deben establecer múltiples interacciones
con el entorno ambiental. En este contexto, se ha
descrito la presencia en C. albicans de una familia
de proteínas que contienen un dominio formado
por 8 cisteínas, denominado CFEM (common in
several fungal extracellular membrane proteins), y
TXH SXHGHQ DFWXDU FRPR UHFHSWRUHV GH VXSHU¿FLH
en transducción de señales, y como moléculas de
adhesión en las interacciones huésped-parásito [3].
Nuestro grupo dispone de una colección de cepas
FRQPXWDFLRQHVHQJHQHVTXHFRGL¿FDODVtQWHVLVGH
proteínas de la familia CFEM, en concreto los genes
PGA10 (también designado como RBT51 y HPB1) y
WAP1, que forman biopelículas muy frágiles y con
poca capacidad de adherencia al sustrato (Figura
1) frente a lo observado en la cepa parental CAI4URA3 (Fig. 1) [4]. Por otro lado, dado que los resultados descritos en la bibliografía [5] indican que
el componente mayoritario presente en la ME de las
biopelículas formadas por C. albicans son carbohidratos, también se consideró interesante determinar
la capacidad de formar biopelículas de mutantes de
HVWHKRQJRGH¿FLHQWHVHQJOLFRVLODFLyQ(QFRQFUHto se estudiaron mutantes para los genes MNN9 y
ALG5, que al igual que en el caso anterior formaron
biopelículas muy frágiles y con poca capacidad de
adherencia al sustrato (Figura 1).
Figura 1. Aspecto macroscópico de las biopelículas formadas por las diferentes cepas de C. albicans analizadas.
Material y métodos
Biopelículas de 48 h formadas por las cepas de
C. albicans analizadas fueron tratadas con etanol al
60% durante 60 min. Los extractos etanólicos resulWDQWHV IXHURQ FRQFHQWUDGRV PHGLDQWH OLR¿OL]DFLyQ
valorándose su concentración proteica mediante el
método de Bradford [6]. Seguidamente se determinó el patrón polipeptídico asociado a cada extracto
mediante electroforesis bidimensional en geles de
134
poliacrilamida del 12% (en la segunda dimensión).
/RVSHU¿OHVSURWHLFRVVHPXHVWUDQHQOD)LJXUD
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
análisis proteómico por espectrometría de masas
(MALDI/MALDI-TOF).
Referencias
Figura 2. Análisis mediante electroforesis bidimensional
en geles de poliacrilamida de los extractos obtenidos por
tratamiento con etanol al 60% de las biopelículas formadas
por las diferentes cepas de C. albicans estudiadas y que se
muestran en la Fig. 1.
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Resultados y Conclusiones
El análisis comparativo de los diferentes extracWRV KD SXHVWR SXVR GH PDQL¿HVWR OD H[LVWHQFLD GH
diferencias cualitativas y cuantitativas en los respecWLYRVSHU¿OHVSURWHLFRV)LJXUDGHWHFWiQGRVHHVpecies que se expresan diferencial y/o mayoritariamente en la ME de la cepa parental (CAI4-URA3) o
de las cepas mutantes para los genes PGA10, WAP1,
MNN9 y ALG5. La identidad de estos polipéptidos
está siendo investigada en estos momentos mediante
135
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Expresión diferencial de proteínas del citoesqueleto del macrófago tras la
interacción con Candida albicans: Problemas en la normalización de las
muestras
Jose Antonio Reales-Calderón1, Mª Luisa Hernaez2, Mª Dolores Gutiérrez2, Gloria Molero1,
Concha Gil1,2
1
Departamento de Microbiología II. Facultad de Farmacia. Universidad Complutense de Madrid. 2Unidad
GH3URWHyPLFD8QLYHUVLGDG&RPSOXWHQVHGH0DGULG3DUTXH&LHQWt¿FRGH0DGULG8&03&0
Abstract
El estudio del citoesqueleto de macrófagos murinos en la interacción con Candida albicans resulta
de gran interés por los importantes cambios que ocurren en una célula fagocítica tras entrar en contacto
con un “cuerpo extraño”. La fagocitosis conlleva
alteraciones en el citoesqueleto de actina, tubulina
y miosina y de las proteínas que se asocian a ellas
$US &RURQLQD :$63 :$9(« (VWXGLRV
previos basados en la obtención de subproteomas
de macrófagos utilizando una extracción secuencial
y analizados mediante 2D-DIGE, nos ha permitido
observar un gran número de proteínas en la fracción enriquecida en citoesqueleto que aumentan su
expresión tras interaccionar con C. albicans. Sin
HPEDUJRVyORSURWHtQDVSXGLHURQVHULGHQWL¿FDGDV
&RQREMHWRGHLGHQWL¿FDUXQPD\RUQ~PHURGHSURteínas hemos puesto a punto un método más especí¿FRSDUDODH[WUDFFLyQ de proteínas de citoesqueleto.
Utilizando esta estrategia nos hemos encontrado con
que se produce un aumento considerable en la cantidad de proteína tras la interacción en comparación
FRQHOFRQWUROGL¿FXOWDQGRODQRUPDOL]DFLyQGHODV
muestras a analizar.
fracción por cromatografía líquida, aumentando el
Q~PHURGHSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDV\UHYHODQGRTXH
en la muestra extraída con el kit había muy pocas
proteínas propias de citoesqueleto.
Obtención de las muestras de citoesqueleto
Utilizando protocolos de extracción más espeFt¿FRVSDUDSURWHtQDVGHFLWRHVTXHOHWRHOHJLPRVHO
GHVFULWRSRU)XQFKDO>@OLJHUDPHQWHPRGL¿FDGR'Lcho método se basa en la utilización independiente de
dos tampones con diferente concentración de sales:
un tampón con alto contenido en sales (High-salt),
FRQHOFXDOVHH[WUDHODIUDFFLyQHQULTXHFLGDHQ¿ODmentos intermedios de citoesqueleto; y otro de bajo
contenido en sales (Low-salt), con el que se extraen
IXQGDPHQWDOPHQWH¿ODPHQWRVLQWHUPHGLRVWXEXOLQDV
actinas y proteínas asociadas al citoesqueleto.
El análisis preliminar de las muestras por croPDWRJUDItDOtTXLGDSXVRGHPDQL¿HVWRXQHQULTXHFLmiento muy importante en proteínas de citoesqueleto con respecto a la fracción extraída con el kit.
Extracción de las muestras de iTRAQ
Resultados Previos
Estudios previos de nuestro laboratorio de las
proteínas presentes en diferentes subproteomas obtenidos por extracción secuencial con el kit ProteoExtract® Subcellular Proteome Extraction Kit
de Calbiochem y analizadas por DIGE, mostraron
muchas proteínas con expresión diferencial en la
fracción enriquecida en citoesqueleto. Sin embarJR SRFDV SURWHtQDV SXGLHURQ VHU LGHQWL¿FDGDV SRU
encontrarse en muy baja concentración (RealesCalderón J. A.; Martínez-Solano L.; Molero G.;
Gil C.; resultados no publicados). Se analizó esta
Se realizó la extracción de proteínas de citoesqueleto con estos dos tampones, partiendo de un
número constante de macrófagos, y realizamos 3
UpSOLFDV ELROyJLFDV$O FXDQWL¿FDU REVHUYDPRV XQ
aumento considerable (150%) de la cantidad de proteína de citoesqueleto en las muestras extraídas con
el tampón High-salt procedentes de macrófagos que
habían interaccionado con C. albicans con respecto
a los macrófagos control. Dichas diferencias en la
cantidad de proteína no se producían en las muestras
extraídas con el tampón Low-salt, como se puede
observar en la Figura 1.
136
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Vamos a comenzar el análisis de las muestras
extraídas con el tampón Low-salt, el cual no plantea
problemas de concentración y después se procederá
al análisis de las muestras extraídas con el tampón
High-salt, donde hay un aumento del 150% de las
proteínas tras la interacción con la levadura.
Figura 1. Geles monodimensionales teñidos con Coomasie
Coloidal de muestras enriquecidas en proteínas de citoesqueleto. Izquierda: Tampón High-salt; Derecha: Tampón
Low-Salt. Cnt: Macrófagos control; Int: Macrófagos tras
la interacción con C. albicans.
Para realizar el iTRAQ habría que igualar la
concentración de las muestras antes de marcar. Si
lo hiciéramos con las muestras extraídas con el tampón High Salt, estararíamos aumentando las concentraciones de las proteínas de la muestra de los
macrófagos control, alterando los resultados de la
FRPSDUDFLyQ&RQHOREMHWRGHFXDQWL¿FDUHVWDH[presión diferencial tan importante, hemos decidido
igualar en el número de células de partida en todos
ORVFDVRV\UHVXVSHQGHUHQHOPLVPRYROXPHQ¿QDO
antes de marcar con iTRAQ.
Agradecimientos
Los autores expresan su agradecimiento a la
Comisión Internacional de Ciencia y Tecnología
SUR\HFWR %,2 SRU ODV D\XGDV ¿QDQcieras recibidas.
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3UREOHPiWLFDHQODLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVGHSDUiVLWRV
Javier Sotillo1, Ana Pérez García1, María Trelis1, Dolores Bernal2, Carla Muñoz-Antolí1, José
Guillermo Esteban1, Rafael Toledo1, Antonio Marcilla1
1
2
Departamento de Biología Celular y Parasitología, Facultat de Farmàcia, Universitat de València.
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultat de Biologia, Universitat de València
El principal problema al que se enfrentan los
investigadores que trabajan en proteómica parasitaria es la falta de genomas completos de los parásitos estudiados. Tan solo se encuentran disponibles
los de Schistosoma mansoni y Schistosoma japonicum, [1,2], además de numerosas entradas de
DNA depositadas en bases de datos. El hecho de que
existan tantas entradas de Schistosoma en bases de
GDWRVGHSURWHtQDVKDSRVLELOLWDGRODLGHQWL¿FDFLyQ
de numerosas proteínas de otros trematodos como
los echinostomátidos [3]. Sin embargo, no siempre
pueden usarse bases de datos de otros parásitos para
ODLGHQWL¿FDFLyQGHELGRDODIDOWDGHKRPRORJtDHQWUH
proteínas. Ha de tratarse de proteínas conservadas
que mantengan una cierta homología entre diferentes géneros de parásitos. Además, en el caso de
SchistosomaFDVLODPLWDGGHSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDV
de sus transcriptomas no tienen función conocida o
VRQLQFOXVRHVSHFLHHVSHFt¿FDV>@
En el caso de Echinostoma, no sólo no se tiene
el transcriptoma entero, sino que existen muy pocas
137
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
ESTs. Tan solo existe una biblioteca de ESTs disponible para Echinostoma parensei. Además, esta
biblioteca puede considerarse muy pobre con 358
secuencias depositadas si la comparamos con otros
trematodos como Fasciola hepatica o Schistosoma
haematobium (con más de 15000 ESTs cada uno).
&XDQGRVHLQWHQWDLGHQWL¿FDUHOSURWHRPDGHE. caproni, sólo un pequeño porcentaje de las moléculas anali]DGDVVRQLGHQWL¿FDGDVFRUUHFWDPHQWH)LJXUD
Otra de las limitaciones con la que se encuentran los investigadores que trabajan en proteómica
nostomátidos como la enolasa, la GST, la GAPDH,
la aldolasa o la Hsp-70 [3,6].
Sin embargo, sigue siendo de vital importancia
el dedicar tiempo y esfuerzo en la secuenciación
de nuevas EST o de genomas completos de paráVLWRV TXH D\XGHQ D OD LGHQWL¿FDFLyQ GH SURWHtQDV
y que puedan ser de utilidad en la investigación
con otros parásitos del mismo orden. Además de la
secuenciación genómica, también las herramientas
bioinformáticas podrían contribuir al progreso en
proteómica parasitaria.
Figura 1. 3RUFHQWDMHVGHLGHQWL¿FDFLyQSRU3URWHLQ3LORWGHSURWHtQDVGH(FKLQRVWRPDFDSURQL. Debido a la poca información
~WLOHQODVEDVHVGHGDWRVVyORVHORJUDLGHQWL¿FDUHOGHWRGRVORVSpSWLGRVFXDQGRVHXVDXQFXWRII!
parasitaria es la escasez de material parasitario.
Los estudios de proteínas se encuentran limitados
por la sensibilidad de la espectometría de masas, y,
en última instancia, dependen en gran medida de la
cantidad y calidad de material disponible. Debido
a la costosa obtención de materiales procedentes
GHOSDUiVLWRVHKDFHPX\GLItFLOODLGHQWL¿FDFLyQGH
proteínas parasitarias. Para la mayoría de parásitos
(incluido Echinostoma) es muy difícil su cultivo in
vitro, y se depende únicamente de su obtención a
SDUWLUGHKRVSHGDGRUHVGH¿QLWLYRV$GHPiVFRPR
la mayoría tienen ciclos complejos donde intervienen varios hospedadores intermediarios, además
GHO KRVSHGDGRU GH¿QLWLYR SRFRV LQYHVWLJDGRUHV
pueden disponer del ciclo completo en su laboratorio, habiéndose de conformar con las muestras
que les llegan de otros laboratorios, hospitales o
pacientes aislados.
Una de las posibles soluciones que pueden ayuGDU HQ OD LGHQWL¿FDFLyQGH SURWHtQDV HV XVDU DQWLcuerpos heterólogos en diferentes técnicas como la
de western-blot. Gracias a la mayor sensibilidad de
esta técnica respecto de las tinciones de geles, se
minimiza la limitación por falta de material en la
LGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDV$XQTXHHVWDWpFQLFDVyOR
se pueda usar con proteínas altamente conservadas
y pueda ser una técnica muy cara en algunos casos
(si se emplean diferentes anticuerpos comerciales),
KDVHUYLGRSDUDLGHQWL¿FDUPXFKDVSURWHtQDVGHHFKL-
Agradecimientos
(O SUHVHQWH HVWXGLR IXH ¿QDQFLDGR SRU HO SURyecto CGL-2005-0231/BOS del Ministerio de
Educación y Ciencia (España) y FEDER (EU),
los proyectos GV07/006, GVPRE/2008/049 y
PROMETEO/2009/081 de la Conselleria d’Educació
de la Generalitat Valenciana. Este trabajo ha sido
llevado a cabo mientras el primer autor (J.S.) era
EHQH¿FLDULRGHXQDEHFDSUHGRFWRUDOGHO0LQLVWHULR
de Educación y Ciencia (Spain) y el segundo autor
de las becas BC06-284 y BC08-098 de la Universitat de València.
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Las técnicas de proteómica aplicadas al estudio de las relaciones parásito/
KRVSHGDGRUHQODGLUR¿ODULRVLVDQLPDO\KXPDQD
Javier González-Miguel1, Rodrigo Morchón-García1, Ana Oleaga2, Mar Siles-Lucas2, Ricardo
Pérez-Sánchez2, Fernando Simón1
1
Laboratorio de Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad de Salamanca. 2Laboratorio de
Parasitología, IRNA Salamanca (CSIC)
Resumen
En el presente trabajo se emplean técnicas de
electroforesis 2D, western blot y espectrometría de
masas para analizar la existencia de una base molecular en las relaciones que 'LOR¿UDOLDLPPLWLV establece con sus diferentes hospedadores. Se han idenWL¿FDGRVLPLOLWXGHV\GLIHUHQFLDVHQODVPROpFXODV
parasitarias que parecen jugar un papel fundamental
en dichas relaciones, en cada hospedador.
'LUR¿ODULDLPPLWLV es el agente causante de la
GLUR¿ODULRVLV FDUGLRSXOPRQDU FDQLQD \ IHOLQD \ GH
OD GLUR¿ODULRVLV SXOPRQDU KXPDQD 7DQWR HO GHVDrrollo del parásito, como las implicaciones clínicas,
son diferentes en cada uno de sus 3 hospedadores. En el perro los vermes adultos de D. immitis
pueden vivir durante más de 7 años produciendo
PLFUR¿ODULDV\ODHQIHUPHGDGWLHQHJHQHUDOPHQWH
un desarrollo crónico. En el gato los adultos viven solamente 2 años y las infecciones son siempre
DPLFUR¿ODUpPLFDV/DSDWRORJtDWLHQHXQFXUVRLPprevisible y habitualmente agudo. En el hombre,
D. immitis no alcanza el estado adulto. En algunas
ocasiones, vermes preadultos se alojan en una rama
de la arteria pulmonar, donde embolizan y causan un
nódulo pulmonar benigno que puede confundirse
con cáncer en radiología. La comprensión de las
UHODFLRQHVSDUiVLWRKRVSHGDGRUHQODGLUR¿ODULRVLV
precisa de datos sobre las moléculas del parásito y
el papel que desempeñan, tanto en el estímulo de
los mecanismos patológicos e inmunes, como de
los mecanismos de supervivencia. Las técnicas de
proteómica son una herramienta muy útil para idenWL¿FDU GLFKDV PROpFXODV \ DQDOL]DU VXV IXQFLRQHV
En el presente trabajo, el proteoma de D. immitis
y los inmunomas obtenidos en cada hospedador,
se relacionan los datos biológicos y clínicos de la
enfermedad en cada uno de ellos.
Se utilizó un extracto antigénico soluble de vermes adultos de D. immitis (DiSB). El proteoma
de D. immitis fue obtenido mediante electroforesis
2D del extracto DiSB. Las proteínas se tiñeron con
QLWUDWRGHSODWDRVHWUDQV¿ULHURQDPHPEUDQDVGH
nitrocelulosa para la realización del western blot 2D,
en las que se incubaron con pools de sueros de los
diferentes hospedadores infectados y de controles
sanos. Los spots que contenían proteínas inmunógenas, se escindieron manualmente de los geles 2D
y fueron enviadas al Servicio de Proteómica del
&1,& SDUD VX FRUUHVSRQGLHQWH LGHQWL¿FDFLyQ SRU
espectrometría de masas [1].
139
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Tras la electroforesis 2D, el extracto DiSB resolvió más de 400 spots, la mayor parte con pIs entre
5 y 8, y con un amplio intervalo de PMs (10-170
kDa). Los western blot 2D revelaron, en los casos de
análisis con sueros de perros, gatos y humanos con
GLUR¿ODULRVLV XQ WRWDO GH \ spots de D.
immitisGHORVFXDOHV\IXHURQLGHQWL¿FDdos y se correspondieron con 19, 32 y 23 proteínas,
respectivamente. A continuación, se determinó la función molecular y el proceso biológico en el que están
LPSOLFDGDVODVSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVVHJ~QODVEDVHV
de datos Gen Ontology y Swiss-Prot/UniProt.
La mayor parte de las proteínas inmunógenas
LGHQWL¿FDGDVSHUWHQHFtDQDWUHVJUXSRVIXQFLRQDOHV
(Figura 1), que son fundamentales en las relaciones
SDUiVLWRKRVSHGDGRUHQODGLUR¿ODULRVLVSURWHtQDVGH
choque térmico (Hsps), enzimas del metabolismo
energético y enzimas redox. Como se observa en la
tabla 1, dentro de las Hsps y las enzimas redox, los
gatos reconocen más proteínas que los humanos, y
estos últimos a su vez, más que el hospedador canino. Por otra parte, desde el punto de vista del metabolismo energético, la ruta glicolítica del parásito es
ampliamente inhibida por los tres hospedadores, no
obstante, D. immitis es un fermentador homoláctico
y la principal enzima de la glicolisis anaerobia, la
lactato deshidrogenasa, es tan solo bloqueada por
gatos y humanos.
Figura 1. Procesos biológicos en los que están implicadas
las proteínas inmunógenas del extracto DiSB reconocidas
por perros, gatos y humanos. Datos expresados como porcentaje del total de proteínas reconocidas por cada hospedador. Los grupos funcionales discutidos en el presente
trabajo se hallan recuadrados.
Estos resultados sugieren que las diferencias
biológicas y clínicas existentes entre los diferentes
Tabla 1. Proteínas inmunógenas del extracto DiSB reconocidas por perros, gatos y humanos en los grupos funcionales de
proteínas de choque térmico, enzimas del metabolismo energético y enzimas redox.
Función
Proteínas de
choque térmico
Proteína
Perros
Gatos
Humanos
Hsp 70
X
X
X
X
X
X
X
sHsp
Proteína OV25-1
sHsp p27
Enzimas del
metabolismo energético
Enzimas redox
X
Enolasa
Fructosa-bisfosfato aldolasa
X
X
X
X
X
X
GAPDH
Triosa-fosfato isomerasa
Fosfoglicerato mutasa
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Fosfoglicerato quinasa
Glucosa-fosfato isomerasa
Lactato deshidrogenasa
X
X
X
X
X
X
Fumarasa
X
X
Aldo/queto oxidorreductasa
Tiorredoxina peroxidasa
Precursor de Glutatión peroxidasa
Glutatión transferasa
X
X
X
X
X
Hipotética oxidorreductasa FAD dep.
Precursor de transglutaminasa
Disulfuro isomerasa
X
X
X
X
X
X
140
hospedadores de D. immitis tienen una base molecular. El acortamiento del ciclo vital de los vermes
de D. immitis en el gato y el humano, con respecto
a lo que ocurre en el perro, podría relacionarse con
una mayor capacidad para bloquear con anticuerpos,
algunas proteínas fundamentales implicadas en los
mecanismos de generación de energía y de evasión
de la respuesta inmune por parte del parásito.
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Referencias
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,GHQWL¿FDFLyQ GH SURWHtQDV GH Neospora caninum implicadas en procesos de
invasión y virulencia
Virginia Marugán-Hernández1, Javier Regidor-Cerrillo1, Gema Álvarez-García1, Fiona Tomley2,
Adriana Aguado-Martínez1, Mercedes Gómez-Bautista1, Luís Miguel Ortega-Mora1
1
SALUVET. Departamento de Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de
Madrid.2Division of Microbiology. Institute for Animal Health. Reino Unido
La neosporosis bovina es una de las principales
causas de fallo reproductivo en el ganado bovino a
nivel mundial [1]. Neospora caninum, agente etiológico de esta enfermedad, es un protozoo intracelular
obligado perteneciente al phylum Apicomplexa y reODFLRQDGR¿ORJHQpWLFDPHQWHFRQToxoplasma gondii.
([LVWH XQD GLYHUVLGDG LQWUDHVSHFt¿FD GHPRVWUDGD
entre aislados de N. caninum desde el punto de vista genético [2] y fenotípico (patogenicidad in vivo,
tasas de crecimiento e invasión in vitro) (RegidorCerrillo y col., manuscrito enviado).
Por otra parte, en la invasión de la célula hospedadora están implicadas tres tipos de organelas
secretoras, micronemas, roptrias y gránulos densos.
En concreto, las roptrias han sido descritas como
factores de virulencia en T. gondii [3]. Se ha idenWL¿FDGRXQJUDQQ~PHURGHSURWHtQDVGHURSWULDVHQ
T. gondii mientras que en N. caninum únicamente
NcROP2 ha sido caracterizada [4].
Por todo ello, el objetivo del presente estudio fue
UHDOL]DUXQDQiOLVLVGLIHUHQFLDOGHORVSHU¿OHVGHH[presión proteica entre distintos aislados de N. caninum para dilucidar los mecanismos implicados en la
virulencia del parásito. Por otro lado, se procedió a la
LGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVURSWULDVSRWHQFLDOPHQWHUHlacionadas con los procesos de invasión y virulencia.
Los extractos proteicos empleados fueron obtenidos a partir de taquizoítos -fase de replicación
rápida- mantenidos en cultivos celulares de células
0$5&\SRVWHULRUPHQWHSXUL¿FDGRVPHGLDQWH
columnas desaladoras PD-10.
OBJETIVO 1: La técnica DIGE fue empleada
en el estudio comparativo de expresión proteica
diferencial de aislados que presentaron diferencias
de patogenicidad: dos aislados virulentos (Nc-Liv
y Nc-Spain7) y uno naturalmente atenuado (NcSpain1H). Se realizaron seis réplicas de geles y que
fueron analizadas con el software DeCyder v6.0.
Las manchas proteicas con una abundancia relativa
mayor o menor que 1,3 con una p < 0,05 (t de Student) fueron consideradas diferencialmente expresadas. Algunas de estas manchas fueron escindidas del
gel para su posterior análisis por MALDI-TOF.
2%-(7,923DUDODLGHQWL¿FDFLyQGHODVSURWHtnas de roptrias se obtuvieron fracciones enriquecidas
en organelas secretoras a partir de los taquizoítos de
Nc-Liv mediante fraccionamiento subcelular. Sobre
las fracciones enriquecidas en roptrias se llevó a cabo
ODLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVORFDOL]DGDVHQXQUDQJR
de peso molecular de 37 a 250 kDa, mediante nanocromatografía líquida acoplada a espectrometría de
masas en trampa iónica LQT linear.
141
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
En ambos estudios proteómicos se empleó el
algoritmo MASCOT frente a las bases de datos del
NCBI nr y ToxoDB v5.1 para llevar a cabo las idenWL¿FDFLRQHVSURWHLFDV
y en la invasión. Además, se observó una mayor
abundancia de la proteína de membrana NcPDI, y
de aquellas de organelas como NcMIC1, NcROP8
y NcNTPasa en aquellos aislados más virulentos,
todas ellas relacionadas con los mecanismos de invasión y proliferación.
Resultados y conclusiones
OBJETIVO 2: A partir de las fracciones subcelulares enriquecidas en roptrias se obtuvo un amplio
Q~PHURGHLGHQWL¿FDFLRQHV7DEOD$OJXQDVGHODV
nuevas proteínas, denominadas “ROP”, presentaron
homólogos en T. gondii, si bien no siempre estaban
situadas en el mismo locus. Por otra parte, la aparición de una serie de kinasas y fosfatasas indica
la existencia de posibles factores de virulencia, y
OD LGHQWL¿FDFLyQ GH SURWHtQDV ³521´ LQGLFDUtD OD
existencia de la “unión móvil” durante el proceso
de invasión, tal como ocurre en T. gondii.
OBJETIVO 1: Un total de 124 manchas proteicas mostraron una expresión diferencial. Nueve
al comparar Nc-Liv y Nc-Spain1H, 50 al hacerlo
con Nc-Liv y Nc-Spain 7 y 65 entre Nc-Spain7 y
Nc-Spain1H. A partir de ellas se consiguió la idenWL¿FDFLyQGHPDQFKDVFRUUHVSRQGLHQWHVDSURteínas que se detallan en la Tabla 1. Entre ellas, se
observaron variaciones en algunas isoformas de las
proteínas actina y miosina dependientes del aislado, implicadas ambas en la motilidad del parásito
Tabla 1. Proteínas de roptrias de N. caninum.
Proteína
pI/Mr
N'D
Teórico
Identidad
Nº
péptidos
Secuencia
1ž$FFHVR
Abundancia
Función
NTPase
5,56/69,6
34
21
NCLIV 145870
NcSp7>NcSp1H*
1F/LY•1F6S+
Captación
de purinasvirulencia
aspartyl-tRNA synthetase
5,95/62,8
48
13
NCLIV 082700
NcSp7>NcSp1H
1F/LY•1F6S+
Síntesis de
proteínas
microneme-associated
protein (NcMIC1)
4,79/50,1
46
18
gi 17226315
NcSp7>NcSp1H
1F/LY•1F6S+
Invasión
elongation factor 2
5,93/94
38
29
NCLIV 081030
NcSp7>NcSp1H
1F/LY•1F6S+
Síntesis de
proteínas
glucose-6-phosphate
dehydrogenase
8,59/112,6
21
17
NCLIV 010690
NcSp7>NcSp1H
1F/LY•1F6S+
Metabolismo
ROP8
6,29/43,2
66
23
NCLIV 000700
NcSp7>NcSp1H
1F/LY•1F6S+
Invasiónproliferación
myosin light chain
4,55/24,9
46
18
NCLIV 000030
NcSp7<NcSp1H
NcLiv=NcSp1H
Invasiónmotilidad
glycine
hydroxymethyltransferase
6,26/55,2
43
10
NCLIV 123730
NcSp7<NcSp1H
NcLiv=NcSp1H
Metabolismo
SURWHLQGLVXO¿GH
isomerase
5,18/53,2
62
26
NCLIV 051400
NcSp7>NcSp1H
NcLiv>NcSp1H
Plegamiento de
proteínas
actin
5,05/42,6
72
24
NCLIV 020800
NcSp7<NcSp1H
NcLiv<NcSp1H
Invasiónmotilidad
6-phosphogluconate
dehydrogenase
6,28/55,2
45
24
NCLIV 140400
NcSp7>NcSp1H
NcLiv=NcSp1H
Metabolismo
porin
8,87/31,5
48
14
NCLIV 090640
NcSp7<NcSp1H
NcLiv=NcSp1H
Transporte
transmembrana
* >LQGLFDXQLQFUHPHQWRVLJQL¿FDWLYRHQODDEXQGDQFLDGHODSURWHtQDHQWUHORVDLVODGRV•GHQRWDODWHQGHQFLDGH
LQFUHPHQWRHQODH[SUHVLyQS! & Resultados mostrados por la isoforma mayoritaria.
142
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
(VWHHVWXGLRKDSHUPLWLGRLGHQWL¿FDUXQDVHULHGH
proteínas potencialmente implicadas en procesos de
invasión y virulencia. Estas proteínas podrían cons-
tituir un nuevo arsenal de dianas terapéuticas e inmuQRSUR¿OiFWLFDVIUHQWHDODLQIHFFLyQSRUN. caninum.
Tabla 2. 3URWHtQDVLGHQWL¿FDGDVH[SUHVDGDVGHIRUPDGLIHUHQFLDOHQWUHDLVODGRVGH1FDQLQXP
Proteína de N. caninum
Homólogo en T. gondii
Mismo
locus
Identidad
3RVLWLYRV
surface protein rhoptry
rhoptry 1
SI
65.9
28
38
ROP8
ROP8
NO
348
43
64
rhoptry antigen
rhoptry protein 5
SI
213
53
67
surface protein rhoptry
rhoptry protein 5
SI
282
51
63
rhoptry antigen
rhoptry 1
NO
70.5
29
38
Rhoptry neck protein 4
rhoptry neck protein 4
SI
902
65
78
rhoptry neck protein 2
SI
2209
72
81
rhoptry neck protein 3
SI
3262
78
88
hypothetical protein
rhoptry neck protein 8
SI
4298
82
91
hypothetical protein
protein kinase
SI
758
80
89
conserved hypothetical protein
hypothetical protein
acid phosphatase
acid phosphatase
SI
741
88
92
mitogen-activated protein
kinase-related
Protein kinase domain protein
NO
99
27
46
Subtilisin-like serine protease
subtilisin-like protein
TgSUB1
SI
373
62
73
subtilase family serine protease,
subtilisin
SI
1123
57
67
serine/threonine protein
phosphatase,
serine/threonine protein
phosphatase
SI
2265
69
82
Subtilisin-like serine protease
subtilisin-like serine protease
SI
1193
100
100
Agradecimientos
Agradecemos a Rick Oakes y Vanesa Navarro
su excelente apoyo técnico. El trabajo proteómico
ha sido realizado por el Servicio de Proteómica
UCM-PCM, miembro de la red ProteoRed. VMH
HVWi¿QDQFLDGDSRUXQDD\XGD)3,GHO0,&,11(O
SUHVHQWHWUDEDMRKDVLGR¿QDQFLDGRSRUHOSUR\HFWR
AGL 2007-60132/GAN.
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143
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
$SOLFDFLyQ GH HFXDOL]DGRUHV GH SURWHtQDV SDUD OD LGHQWL¿FDFLyQ GH DQWtJHQRV
minoritarios de la saliva de Ornithodoros moubata
Ricardo Pérez-Sánchez, Ana Oleaga, Mar Siles-Lucas, Verónica Díaz-Martín, Eduardo de la Torre
Escudero, Ana Hernández-González, Raúl Manzano-Román
Laboratorio de Parasitología Animal. IRNASA. CSIC. Salamanca
Resumen
El extracto salival (SGE) de la garrapata Ornithodoros moubata contiene una proteína antigénica
(Om44) de interés para el desarrollo de una vacuna
anti-O. moubata. Om44 es minoritaria en el SGE,
ORTXHGL¿FXOWDVXGHWHFFLyQHLGHQWL¿FDFLyQ(OWUDtamiento del SGE con un ecualizador de proteinas
permite concentrar a Om44 hasta niveles perfectamente detectables en geles 2D teñidos con plata e
LGHQWL¿FDU D ODV SURWHtQDV SUHVHQWHV HQ HO VSRW FRrrespondiente, aunque para ello haya que recurrir a
la secuenciación de novo por estar O. moubata muy
poco secuenciada.
Ornithodoros moubataHVXQDUJiVLGRHQGy¿OR
africano que se refugia en el interior de las madrigueras de los animales salvajes, de las pocilgas
domésticas e incluso de las viviendas humanas.
vestigación de vacunas antigarrapata como método
alternativo de control.
En trabajos anteriores nuestro equipo inició el
desarrollo de una vacuna anti-O. moubata inmunizando cerdos con un extracto proteico de glándulas
salivales (SGE) de este argásido. El SGE indujo una
respuesta inmunitaria capaz de reducir hasta en un
70% las tasas de alimentación y reproducción del argásido. El antígeno inductor de esta respuesta es una
proteína de 44 kDa (Om44) que se une a la molécula
P-selectina del hospedador, lo que previsiblemente
bloquea las respuestas hemostáticas mediadas por
la P-selectina y permite a la garrapata completar la
ingesta de sangre [1].
Consecuentemente, nuestro siguiente objetivo
IXH OD LGHQWL¿FDFLyQ GH 2P FRPR SDVR SUHYLR
para su clonación y obtención en forma recombi-
Figura 1. SGE sin ecualizar separado en geles 2D (12% acrilamida, pH 3-10) teñidos con plata (A) y Sypro rubi (B). Western
blot con suero de cerdo vacunado con SGE (C).
Sus principales hospedadores son los facoceros, los
cerdos y las personas, a los que puede transmitir
graves enfermedades como la Peste porcina africana y la Fiebre recurrente humana. La eliminación
de esta garrapata del medio sinantrópico puede
facilitar el control de las citadas enfermedades.
Los inconvenientes del uso de acaricidas en la
lucha contra las garrapatas han favorecido la in-
QDQWH$ERUGDPRVGLFKDLGHQWL¿FDFLyQPHGLDQWHXQD
estrategia proteómica clásica: separación del SGE
en geles 2D, localización del spot correspondiente
a Om44 y análisis del mismo por espectrometría
de masas. Esta estrategia se enfrentó con dos problemas. El primero es que Om44 es minoritaria en
el SGE y, aunque su spot sí se detecta en western
blot 2D usando sueros de cerdos vacunados, no es
144
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
visible en geles 2D teñidos con plata o con Sypro
Rubi (Figura 1). Para solucionar este problema, el
SGE se trató con un equalizador de proteínas [2]
utilizando el kit ProteoMiner Protein Enrichment
(Bio-Rad). El SGE ecualizado se resolvió en geles
2D y se analizó en western blot 2D, lo que permitió
localizar y cortar el spot correspondiente a la Om44
(44 kDa, pI 6,8), claramente visible ahora en geles
2D teñidos con plata (Figura 2).
Solucionado el primer problema, el segundo al
que nos enfrentamos fue que O. moubata está aun
muy poco secuenciado, como ocurre en general con
RWUDVJDUUDSDWDV>@(VWRGL¿FXOWDODLGHQWL¿FDFLyQ
por comparación de huellas peptídicas y espectros
de fragmentación, obligándonos a recurrir a la secuenciación de novo de péptidos trípsicos de Om44.
El inconveniente de la secuenciación de novo es que
es caro y sus resultados no siempre garantizan la
LGHQWL¿FDFLyQ>@/DYHQWDMDHVTXHODVVHFXHQFLDV
peptídicas de novo pueden utilizarse como base para
el diseño de oligonucleótidos con los cuales abordar
ODDPSOL¿FDFLyQ\FORQDMHGHOF'1$FRGL¿FDQWHGH
Om44 sin conocer a priori la identidad de la pro-
teína. Los resultados de la secuenciación de novo
de los péptidos procedentes del spot de la Om44
VH PXHVWUDQ HQ OD WDEOD 6H KDQ LGHQWL¿FDGR proteínas, lo cual plantea un nuevo problema: ¿cuál
de ellas es la proteína Om44?. Teniendo en cuenta
parámetros proteómicos, como el score, pI y peso
molecular, y biológicos, como su localización citoplasmática, pensamos que enolasa o actina pueden
VHU 2P (O UHVWR GH ODV SURWHtQDV LGHQWL¿FDGDV
quizá sean contaminaciones, aunque no podemos
descartar que algunas de ellas tengan un homólogo
en O. moubata con un peso molecular y pI compatibles con los del spot analizado.
Figura 2. SGE equalizado separado en geles 2D (12%
acrilamida, pH 5-8) teñidos con plata (A). Western blot con
suero de cerdo vacunado con SGE (B).
Tabla 1. 3URWHtQDVLGHQWL¿FDGDVSRUVHFXHQFLDFLyQGHQRYRDSDUWLUGHOVSRWFRUUHVSRQGLHQWHD2P
Numero
de acceso
Proteína
Péptido
Score
pI / MW
teóricos
Función
P06733
Enolasa. Homo sapiens
239
175,5
6.73 /
47024
Glucólisis,
Fibrinolisis
4/*:
Actina. Ornithodoros moubata
217
5.29 /
41793
Estructural
P25705
$73VLQWKDVHVXEXQLWĮPLWRcondrial precursor. H. sapiens
520
P09867
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1. Bos taurus
56
B7Q349
Elongation factor-1. Ixodes
scapularis
P15252
VVIGMDVAASEFFR252
20
AGFAGDDAPR29
LCYVALDFEQEMATAASSSSLEK239
94,6
1
EIVTNFLAGFEA531
80,8
9.16 /
59750
Síntesis de ATP
GFGFVTYATVEEVDAAMNAR75
55,1
9.27 /
34196
Procesamiento y
transporte de RNA
111
NMITGTSQADCAVLIVAAGTGEFEAGISK129
52,6
9.13 /
50753
Biosíntesis de proteínas
1
Elongation factor
Hevea brasiliensis
43
SGPLQPGVDIIEGPVK58
50,4
P81605
1
43
ENAGEDPGLAR53
50,2
P0ACT0
1
HTH-type transcriptional regulator acrR. Escherichia coli
Dermcidin. Homo sapiens
5.04 /
14721
6.09 /
11283
5.66 /
24766
42,8
AQLGVQAFADALLIIPK449
42,0
6.24 /
58024
Chaperona
Plegamiento de
proteínas
AEMIELNDR107
40,9
5.16 /
52844
Estructural.
Filamentos citoesqueleto
40,3
9.65 /
23283
Biosíntesis de proteínas
Chaperone containing
T-complex protein 1 subunit z.
Homo sapiens
433
P24789
Vimentin-1/2
Xenopus laevis
99
1
1
Posibles contaminantes
Regulación de la
trancripción
RAAIIMR168
P40227
Translation initiation factor
IF-3. Mycoplasma pulmonis
Antimicrobiano.
162
1
Q98QV2
Alérgeno
141
ELGIDTLNR149
145
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
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,GHQWL¿FDFLyQSURWHyPLFD\DQiOLVLVELRLQIRUPiWLFRGHSURWHtQDVVHFUHWDGDVSRU
el protozoo parásito Trypanosoma cruziSHUWHQHFLHQWHVDODIDPLOLD0$63Mucin
associated Surface Proteins
Luis Miguel De Pablos ,Gloria González, Víctor Seco Hidalgo, Isabel María Díaz Lozano,
Antonio Osuna
Instituto Biotecnología. Universidad de Granada. Grupo de Parasitología Bioquímica y Molecular
Resumen
El agente causal de la tripanosomiasis o enfermedad de Chagas es el protozoo parásito Trypanosoma cruzi. Dicho parásito es un organismo intracelular obligado que utiliza una enorme cantidad de
tipos celulares para multiplicarse. Durante el proceso de entrada e invasión celular, T. cruzi secreta una
serie de proteínas encargadas del reconocimiento
de la célula hospedadora y la posterior entrada del
protozoo en ella.
(QHOSUHVHQWHWUDEDMRVHGHVFULEHODLGHQWL¿FDFLyQ
de dos proteínas pertenecientes a la familia MASP
(Mucin Associated Surface Protein) secretadas tras dos
horas de interacción célula-parásito. Las secuencias de
estas proteínas poseen las características básicas de la
familia MASP con dos regiones hidrofóbicas en los
extremos N- y C- terminal y una región central en el
cual existen sitios para la N-glicosilación. Tras mapear
epítopos de tipo MHC-I en las secuencias encontramos
varias regiones en las proteínas que podrían compor-
tarse potencialmente como posibles lugares que estimularan la generación de una respuesta inmune celular
frente a T. cruzi. Como conclusión, consideramos que
ODVSURWHtQDV0$63LGHQWL¿FDGDVSXHGHQVHUSRWHQciales antígenos inmunógenos y posibles herramientas
diagnósticas para evaluar una respuesta humoral frente
a éstas durante el transcurso de la enfermedad.
Trypanosoma cruzi HV XQ SURWR]RR ÀDJHODGR
perteneciente al Orden Kinetoplástida y agente etiológico de la tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas, estimándose en unos 16-18 millones
las personas infectadas principalmente en Centro y
Sudamérica [1, 2]. La familia MASP (Mucin Associated Surface Protein) descrita por primera vez tras
el desarrollo y posterior publicación de los datos del
genoma de T. cruzi, constituye una extensa familia
génica que representa el 6% del genoma del parásito
aproximadamente [3]. Las MASPs, pueden mosWUDUPRGL¿FDFLRQHVSRVWWUDGXFFLRQDOHVVLPLODUHVD
las de las mucinas, describiéndose como proteínas
N-glicosiladas [4]. Las aproximaciones proteómi-
146
cas realizadas, muestran como la expresión de las
MASPs es pequeña en comparación con el número
de genes encontrados. Si bien no se conocen los
mecanismos que han permitido la expansión de la
familia de las MASPs en T. cruzi, la presión inmune pudiera constituir la fuerza inductora que ha
provocado la amplia presencia de genes masp en el
genoma del trypanosomatidos.
Se estudió el medio de interacción célula-parásito, incubándose durante dos horas la fase trypomastigota metacíclica de T. cruzi con células Vero
HQPRQRFDSD8QDYH]SXUL¿FDGRHOPHGLRVHVHOHFcionaron diferentes bandas en geles de SDS-PAGE
XQLGLPHQVLRQDOHV SDUD VX SRVWHULRU LGHQWL¿FDFLyQ
mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF
y MALDI-TOF-TOF) y análisis mediante trampa
iónica de los péptidos fragmentados.
8QD YH] LGHQWL¿FDGDV ODV VHFXHQFLDV PHGLDQWH
los motores de búsqueda Mascot y proteome discover, estas se analizaron en busca de motivos estructurales mediante el paquete de software bioinformático de ExPASy (http://www.expasy.ch/tools/).
Además se realizó un mapeo de epítopos para éstas,
utilizando los programas BIMAS y SYFPEITHI.
7UDV HO DQiOLVLV SURWHyPLFR LGHQWL¿FDPRV GRV
nuevas proteínas pertenecientes a la familia MASP
de T. cruzi. Estas proteínas poseen pesos moleculares de 52 kDa y 5 kDa, siendo secretadas durante el
proceso de invasión celular por parte del parásito.
Tras la búsqueda de motivos estructurales encontramos que existían dos regiones N- y C- terminal altamente hidrofóbicas, un lugar para N-Glicosilación
y en el caso de la proteína de 52 kDa un lugar de
unión a ATP/GTP (P-loop).
Estas proteínas poseen potenciales epítopos de
clase MHC-I principalmente en los extremos de
las secuencias coincidiendo con las regiones más
hidrofóbicas de éstas. Los epítopos se sitúan en las
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
posiciones conservadas para esta familia, generándose un panel de péptidos potencialmente positivos
para ser expuestos por moléculas MHC-I.
La obtención en el medio de interacción célulaparásito de dos miembros pertenecientes a la familia
MASP indica que proteínas pertenecientes a esta familia son capaces de secretarse y de poseer una posible implicación en la entrada del parásito en la célula
hospedadora. Además los epítopo encontrados demuestra como estas secuencias están potencialmente
implicadas en la generación de una respuesta inmune
celular frente al parásito. Por tanto, la familia MASP
será en un futuro objeto de nuestros estudios tanto
como posible diana terapéutica como herramientas
diagnósticas debido a su clara exposición al sistema
inmunitario durante una infección por T. cruzi.
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147
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
([SHULPHQWDOWKHRUHWLFVWXG\RISHSWLGH¿QJHUSULQWVLQLeishmania parasites
M. Auxiliadora Dea-Ayuela1, Riccardo Concu2, Lazaro G. Perez-Montoto3, Eugenio Uriarte3,
Francisco Bolás-Fernández4, Florencia Ubeira2, Humberto González-Díaz2
1
Faculty of Experimental and Health Sciences, Department of Chemistry, Biochemistry and Molecular
Biology, Cardenal Herrera University, 46113, Moncada, Valencia, Spain. 2Faculty of Pharmacy, Department
of Microbiology and Parasitology, 3Faculty of Pharmacy, Department of Organic Chemistry University
of Santiago de Compostela, 15782 Santiago de Compostela, Spain. 4Faculty of Pharmacy, Department of
Parasitology, Complutense University, 28040, Madrid, Spain
Abstract
The number of protein and peptide structures
parasites, their hosts, and other organisms, released to Protein Data Bank (PDB) and Gen Bank without functional annotation has increased. Using
Proteomics tools such as MASCOT, we can perform
function annotation of these proteins if we have
Mass Spectra (MS) outcomes and there are in databases known template proteins with known function
and high similarity scores if not these methods may
not succeed. Consequently, there is a high demand
for Quantitative Structure-Activity Relationships
(QSAR) equations to predict these functions from
SURWHLQ ' VWUXFWXUH DQGRU VHTXHQFH :H WUDLQHG
and validated a new 3D-QSAR equation based on a
0DUNRY&KDLQ0RGHO0&0WKDWFODVVL¿HVSURWHLQ
by their possible mechanism of action according
WR(Q]\PH&ODVVL¿FDWLRQ(&QXPEHU[1] using a
LeishmaniaSHSWLGHPDVV¿QJHUSULQWVPRGHO7KH
methodology proposed here is essentially new, and
enables prediction of all EC classes with a single
equation without the need for an equation for each
class or nonlinear models with multiple outputs. In
addition, the model may be used to predict whether
one peptide presents a positive or negative contribution of the activity of the same EC class.
Materials and methods
Stationary promastigotes proteins of the Leishmania infantum strain LEM75 were analyzed by
two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis
(2D-PAGE) employing an immobilized linear pH
4-7 gradient for isoelectric focusing. Proteins were
visualized by silver stain and spots of interest were
excised from preparative 2D gels, and then analyzed
by MALDI-TOF and/or MALDI-TOF/TOF mass
spectrometry. [2]
In order to predict protein function we used
WKH(OHFWURVWDWLFNDQG+,173RWHQWLDOVȝN7KHVH
values were used as inputs to construct the QSAR
model. The average general potentials depend on the
absolute probabilities pk(j) and the total potential
with which the amino acid j-th interact with the rest
of amino acids. All calculations were carried out
with our in-house software MARCH-INSIDE [3].
Results
The model predicts EC for 106 out of 151
(70.2%) oxidoreductases, 178/178 (100%) transferases, 223/223 (100%) hydrolases, 64/85 (75.3%) lyases, 74/74 (100%) isomerases and 100/100 (100%)
ligases, as well as 745/811 (91.9%) non-enzymes.
:HDOVRJLYHDQH[DPSOHLOOXVWUDWLQJWKHVWXG\3HStide Mass Fingerprints (PMFs) of new protein sequences of parasites proteins when traditional alignment search procedures fail. First, we obtained the
2D-Electrophoresis (2DE) localization of the spot
for a new protein from Leishmania infantum :H
also give MALDI TOF MS characterization and
results of MS MASCOT search and detected that all
templates with possible enzyme or any other action
have low similarity score and/or unknown function.
Then, we decided to carry out prediction with our
46$50&0PRGHORIWKHFRQWULEXWLRQWRVSHFL¿F
enzyme action of 29 peptides found in the PMF of
the new query protein. As the QSAR bases on 3D
information, we had to predict previously possible
3D structures of these peptides using Molecular Dynamic (MD) methods. Some of the more interesting
peptides were predicted with positive contribution
WRVRPHVSHFL¿FHQ]\PHDFWLRQVZKLFKFRLQFLGHG
ZLWKDGGLWLRQDO%/$67DOLJQPHQW¿QGLQJV
148
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Conclusion
References
This combined strategy may be used to identify
and predict peptides of proteins from parasite and/
or their hosts when classic proteomics tools fails;
which may be of interest in drug or vaccine develoSPHQWDQGRUGUXJWDUJHWLGHQWL¿FDWLRQ
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149
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
6. PROTEÓMICA VEGETAL Y ANIMAL
Coordinadores: Luis Valledor y Federico Valverde
Ubiquitinación de proteínas nucleares en la señalización del ayuno de fosfato
en plantas
Marina Trigueros, Mónica Rojas-Triana, Maria Luisa Irigoyen, Javier Paz-Ares, Vicente Rubio
Departamento de Genética Molecular de Plantas. Centro Nacional de Biotecnología-CSIC. Campus de la
UAM. Cantoblanco. Madrid
(O SpSWLGR XELTXLWLQD 8E HV XQ PRGL¿FDGRU
postraduccional implicado en prácticamente todos
los aspectos de la biología celular de los eucariotas
[1]. La ubiquitinación, mediada por enzimas E3
8EOLJDVDHVSHFt¿FDVIXQFLRQDJHQHUDOPHQWHFRPR
una señal de marcaje de proteínas para su posterior degradación vía el proteosoma. Sin embargo,
la Ub también está implicada en la regulación de
la función de proteínas a través de cambios en su
capacidad para interaccionar con otras proteínas o
sustratos, control de su localización subcelular o de
VXVXVFHSWLELOLGDGSDUDVHUGLDQDGHRWUDVPRGL¿FDciones postraduccionales [1].
En plantas, la Ub está asociada a diversos procesos de señalización y respuesta a estrés, incluyendo
el ayuno de fosfato [2]. Este último es un nutriente
esencial para el desarrollo de cualquier organismo.
La implicación de la Ub en el control de la homeostasis de Pi se basa en parte en la caracterización
del gen PHO2 de Arabidopsis. Este gen controla la
distribución de Pi entre la raíz y la parte aérea de la
planta [3]. La proteína PHO2 es similar a enzimas
con actividad E2/E3 Ub ligasa, aunque su función
bioquímica y sus posibles proteínas diana se descoQRFHQ3RURWUDSDUWHQXHVWURJUXSRKDLGHQWL¿FDGR
5 E3 Ub ligasas nucleares cuya expresión depende
del aporte de Pi al medio y que afectan a la expresión de genes de respuesta al ayuno de Pi. Estos
resultados sugieren que la señalización del ayuno de
Pi en plantas implica el control de la acumulación
de proteínas reguladoras mediado por la ruta de ubiquitinación y degradación por el proteosoma (UPS).
3URSRQHPRVGRVHVWUDWHJLDVFRQHO¿QGHHYDOXDUHO
papel regulador de la ruta UPS en la regulación de
la respuesta a dicho estrés; una dirigida, analizando el efecto que tiene la sobreexpresión de las 5
(8EOLJDVDVLGHQWL¿FDGDVHQHOSURWHRPDQXFOHDU
bajo distintos aportes de Pi. La otra, mas genérica,
WUDWDQGR GH LGHQWL¿FDU SURWHtQDV UHJXODGRUDV FX\D
acumulación dependa de la concentración de Pi en
el medio y de la presencia/ausencia de inhibidores
del proteosoma. Durante el desarrollo de este congreso se mostrarán nuestros avances más recientes
siguiendo ambas aproximaciones.
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150
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Proteome profile analysis of Medicago truncatula leaves in response to
Uromyces striatus
Mª Ángeles Castillejo1, Jesús V. Jorrín2, Diego Rubiales1
1
2
Departamento de Agronomía y Mejora, IAS (CSIC), Córdoba. Departamento de Bioquímica y Biología
Molecular, ETSIAM, Universidad de Córdoba
Summary
The two-dimensional electrophoresis (2-DE)
OHDISURWHLQSUR¿OHRIIRXU0HGLFDJRWUXQFDWXODJHnotypes displaying different phenotypes in response
to rust (Uromyces striatus) inoculation has been studied. Quantitative as well as qualitative differences
were observed between non-inoculated and inoculated plants. Differential spots were analyzed by
MALDI-TOF/TOF mass spectrometry and a total of
SURWHLQVZHUHLGHQWL¿HGEHORQJLQJWRWKHIXQFWLRnal category of metabolism with a high proportion
being photosynthetic and stress-related proteins.
Introduction
Alfalfa rust (U. striatus) is an important disease
of worldwide distribution, being particularly damaging in alfalfa (Medicago sativa) grown for seed
SURGXFWLRQ>@:HKDYHFKRVHQM. truncatula as a
more tractable biological system to study the proteomic response to rust. Genotypes were selected
based on its differential responses to U. striatus infection [1, 2]: A17, susceptible; Grc.098 showing posthaustorial resistance; F11.008 and Paraggio showing
pre-haustorial resistance. Leaf proteins from non-inoculated and rust inoculated M. truncatula plants were
extracted and resolved by 2-DE, and the differential
spots were analyzed by mass spectrometry.
Methodology
M. truncatula seedlings were inoculated when
the third trifoliate leaf was completely expanded.
Leaves were collected 48 hours post inoculation
(hpi) for microscopic observations [1]. For proteomics analyses, inoculated and non-inoculated plants
were sampled 24 and 48 hpi. Proteins from leaf
tissue were TCA/acetone extracted [3] and resolved
by 2-DE. Gels were silver and SyproRuby stained
and the images were analysed with the PD-Quest
software (BioRad). Those spots that showed statisWLFDOO\VLJQL¿FDQWGLIIHUHQFHVS”LQLQWHQVLW\
were considered for further analysis. Differential
spots were excised from gels and digested with tripsin. Peptide fragments from digested proteins were
then subjected to mass spectrometry. A PMF (peptiGHPDVV¿QJHUSULQWLQJVHDUFKZDVSHUIRUPHGRYHU
non-redundant MSDB database using the MASCOTsearch engine.
Results and Discussion
Differences in rust responses among genotypes
were evident 48 hpi (table 1). Of the appressoria
successfully formed on a stoma, less were able to
penetrate the stoma and form a substomatal vesicle
(SV) on F11.008 and Paraggio than on the other genotypes. Differences were also found in the rate of
KDXVWRULDIRUPDWLRQZKLFKZDVVLJQL¿FDQWO\ORZHU
in F11.008 and Paraggio genotypes. However units
associated with host cell necrosis was markedly
higher in Grc.098. Of a total of 37 differential spot
SURWHLQVEHWZHHQWUHDWPHQWVZHUHLGHQWL¿HGDIWHU
0$/',72)72)DQGGDWDEDVHVHDUFK:HIRXQG
an increase of stress-related proteins in pre-haustoULDOJHQRW\SHVWDEOH¿JXUHDQGWZRSURWHLQVEHlonging to other functional categories (glycine-rich
RNA binding protein and malate dehydrogenase)
which have been involved in transcriptional regulation by different effectors related to plant defense
UHVSRQVHV>@:HFRQFOXGHWKDWWKHH[SUHVVLRQRI
proteins was different in relation to susceptibility/
resistance of the genotypes studied at early stage of
the infection and the clear increase of stress-related
proteins only in the genotypes with pre-haustorial
resistance makes us suspect that these proteins may
be involved in the stop of parasite development before forming haustoria.
151
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Table 2. ,GHQWL¿HGSURWHLQVWKDWFKDQJHGLQUHVSRQVHWR8VWULDWXVLQRFXODWLRQ a
Molecular
function
Metabolism
Medicago truncatula genotypes
AI
*UF
)
Paraggio
RuBisCO small
FKDLQ>Ĺ@
RuBisCO small
FKDLQ>Ļ@
RuBisCO small subunit (4)
>Ļ@
0DODWHGHK\GURJHQDVH>Ĺ@
RuBisCO large
VXEXQLW>Ļ@
RuBisCO activase
>Ĺ@
Ferredoxin-NADP
UHGXFWDVH>Ĺ@
Nucleic acid
binding/
Transcription
Glycine-rich RNA
ELQGLQJSURWHLQ>Ĺ@
Elongation factor
Tu, chloroplast
SUHFXUVRU>Ļ@
Glycine-rich RNA binding
SURWHLQ>Ĺ@
Ascorbate peroxidase >Ĺ@
Defense and
stress-related
Glutathione peroxidise
[new]
*OXWDWKLRQHWUDQVIHUDVH>Ĺ@
,QSDUHQWKHVHVLQGLFDWHQXPEHURIWLPHVWKLVSURWHLQKDVEHHQLGHQWL¿HG>Ĺ@LQGLFDWHLQFUHDVHDQG>Ļ@GHFUHDVHLQ
intensity of protein.
a
$FNQRZOHGJPHQWV
The authors thanks to European Union Grain Legumes Integrated Project, Spanish project
AGL2008-01239/AGR and Andalusian project P07$*5IRU¿QDQFLDOVXSSRUW
References
Figure 1. 2DE image gel of M. truncatula leaves proteome.
$UURZVLQGLFDWHVLGHQWL¿HGSURWHLQV$3;DVFRUEDWHSHUR[Ldase), EF-Tu (elongation factor Tu), FR (ferredoxin-NADP
reductase), GP (glutathione peroxidise), GRP (glycine-rich
RNA binding protein), GST (glutathione transferase), MA
(malate dehydrogenase), RUB (RubisCo), RUBa (RubisCo
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Table 1. Microscopical analysis of the early development of
U. striatus on M. truncatula x
Appr.
penetrated
forming SV
(%)
Number of
haustoria/
colony
Colonies
whit necrosis
A17
75.0 a
1.8 a
0b
Grc.098
76.1 a
1.5 a
51 a
F11.008
42.3 b
1.0 b
0 b
Paraggio
31.8 b
0.03 c
0b
Genotypes
x
Values with letters in common in each column are not sigQL¿FDQWO\GLIIHUHQWS/6'WHVW
152
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Análisis proteómico del desarrollo sexual mediado por anteridiógeno en el
JDPHWR¿WRGHOKHOHFKRBlechnum spicant
Virginia Menéndez, Luis Valledor, Angeles Revilla, Helena Fernández
Area de Fisiología Vegetal, Departamento B.O.S. Facultad de Biología. Universidad de Oviedo
Los helechos actuales son un legado genético
de gran valor. Se trata de plantas vasculares con una
organización primitiva cuyo ciclo vital consta de
una fase gametofítica (haploide) y otra esporofítica
(diploide), que se hallan separadas en el espacio y en
HOWLHPSR/DIRUPDFLyQGHOHVSRUR¿WRVHSURGXFHHQ
HOVHQRGHXQJDPHWR¿WRTXHHVXQDHVWUXFWXUDPRUfológicamente muy sencilla y también muy vulnerable a factores ambientales. La reproducción sexual
en este conjunto de especies implica la formación de
órganos sexuales femeninos (arquegonios) y masculinos (anteridios) en distintas secuencias cronológicas. Una de estas secuencias implica la formación
inicial de órganos femeninos seguida de la formación de los órganos masculinos que es controlada
por la presencia de un sistema anteridiógeno. Este
sistema inductor se ha relacionado tradicionalmente
con las giberelinas [1], aunque en Blechnum spicant
aún no se conoce su naturaleza química exacta [2-4].
(QDXVHQFLDGHHVWDVVXVWDQFLDVHOJDPHWR¿WRHVKHUmafrodita (Ceratopteris) o femenino (Blechnum), y
éste, una vez alcanzada la madurez, producirá y secretará activamente anteridiógeno que actuará sobre
ORV JDPHWR¿WRV HQ GHVDUUROOR LQGXFLHQGR HQ HOORV
la masculinidad. Este mecanismo está destinado a
evitar la autofecundación.
(OJDPHWy¿WRGHOKHOHFKRTXHDSHQDVFRQVWDGH
una única capa de células y no presenta interacciones
con el tejido esporofítico, se presenta como un sistema experimental ideal para profundizar en el estudio
de procesos del desarrollo sexual en plantas.
En este trabajo, se han empleado por primera
vez técnicas proteómicas para estudiar la expresión
GLIHUHQFLDOGHSURWHtQDVHQWUHJDPHWR¿WRVTXHVHKDQ
desarrollado en presencia y en ausencia de sustancias con acción anteridiógena.
En primer lugar se extrajeron anteridiógenos de
FXOWLYRVGHJDPHWR¿WRVDGXOWRVVLJXLHQGRHOPpWRGR
de Yamauchi [5], y posteriormente se añadieron a
medio de cultivo MS para generar un sistema de in-
ducción de masculinidad. A este medio se añadieron
JDPHWR¿WRV GH GtDV GH HGDG \ WUDV XQ SHULRGR
de cultivo de 20 dias, se caracterizaron (estado de
desarrollo, órganos sexuales) y se compararon con
JDPHWy¿WRVGHOPLVPRRULJHQFXOWLYDGRVHQPHGLR
de cultivo sin anteridiógeno (Control).
$PERVWLSRVGHJDPHWR¿WRVVHWULWXUDURQHQQLtrógeno líquido (50 mg de peso seco por muestra) y
ODSURWHtQDVHSXUL¿FyPHGLDQWHH[WUDFFLyQIHQyOLFD
seguida de precipitación en acetato de amonio en
metanol descrito por Carpentier [6]. La concentración de proteínas se midió por medio de Bradford
y las muestras se almacenaron a -80ºC hasta que
se realizó el isoelectroenfoque. Para ello se utilizaron 10 tiras de 24 cm con un rango de pH 3-10
no lineal, que fueron rehidratadas todas a la vez de
forma pasiva con 550 µg de proteína en 450 µL de
tampón de solubilización. El isoelectroenfoque se
realizó siguiendo las recomendaciones del fabricante (GE Healthcare). Una vez terminado el enfoque
las tiras fueron equilibradas posteriormente almacenadas a -80ºC.
La segunda dimensión SDS-PAGE se llevó a
cabo en geles de poliacrilamida al 13%. Posteriormente se tiñeron con azul de Coomassie coloidal
G-250 durante 20 horas (3 veces) siguiendo el protocolo de Mathesius et al. [7]. Las imágenes de los
geles se adquirieron con un densitómetro y se analizaron con software PDQuest 8 (Biorad). Tras una
revisión manual, se contabilizaron 581 spots bien resueltos. Solo se consideraron spots que aparecieran
en al menos 3 de los 5 geles. Se asignaron valores
perdidos empleando el algoritmo KNN aplicado de
forma secuencial (R environment). Posteriormente
se normalizó la intensidad de los spots y, para reducir la dependencia de la media y la varianza, se
realizó una transformación logarítmica. Tras aplicar
XQDSUXHEDWFRQĮ VHGH¿QLHURQVSRWV
como diferencialmente expresados.
153
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Se aplicó un análisis de componendes principales
a todos los spots, permitiendo el PC2 la separación de
las muestras en dos grupos. Teniendo en cuenta los
análisis uni y multivariables se seleccionaron para su
LGHQWL¿FDFLyQDTXHOORVORVVSRWVTXHPRVWUDURQXQ
p-valor más bajo en el caso de la prueba T, y aquellos
FRQFRH¿FLHQWHVGHFRUUHODFLyQPD\RUHVGHSDUD
los componentes principales 1-3.
/DLGHQWL¿FDFLyQGHORVVSRWVGLIHUHQFLDOHVSHUmitió describir por primera vez en helechos las
rutas metabolicas cuya expresión varía en relación
con el desarrollo sexual dependiente de la acción
del anteridiógeno.
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Biosystems Deutschland, Frankfurter Strasse 129-B, Darmstadt, Germany. 3Biochemistry and Molecular
Biology. University of Córdoba. Campus de Rabanales. E-14071 Córdoba, Spain
Needle differentiation is a very complex process
which leads to the formation of a mature photosynthetic organ. This fact implies important changes in
protein accumulation and gene expression which
must be regulated, amongst others, by epigenetic
PHFKDQLVPV :H KDYH FRPSDUHG VRPH HSLJHQHWLF
PRGL¿FDWLRQV'1$PHWK\ODWLRQ+LVWRQH+.3m,
Histone H3K93m and acetylated Histone H4) present
in immature (1 month old) and mature (12 month
old) Pinus radiata needles (Figure 1a), determining
DWLVVXHVSHFL¿F'1$PHWK\ODWLRQ)LJXUHEDQG
the differential expression levels of histone epigenetic marks, being the levels of acetylated Histone H4
and Histone H3K43m, associated to gene expression,
higher in immature needles whereas the Histone
H3K93m was only found in mature needles (Figure
1c). This could be explained by the fact that chromatin needs to be altered and restructured during the
differentiation to regulate gene expression [1].
To determinate which genes and proteins
showed as differential during needle development
154
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Figure 1. a) Mature (top) and immature (bottom) needle fascicles. b) Immunodetection of 5-mdC. In 3D view the intensity
RIHDFKÀXRUHVFHQFHSRLQWLVUHSUHVHQWHGODUJHUYHUWLFDOEDUVLQGLFDWHKLJKHUÀXRUHVFHQFHLQWHQVLW\F5HSUHVHQWDWLYHEORWV
VKRZLQJWKHTXDQWL¿FDWLRQRI$F++.3m and H3K93m on protein extracts from immature (I) and mature (M) scions. The
left lane corresponds to Coomassie stained MW standards.
we have also characterized and compared proteome
and transcriptome of immature and mature needles.
Immature needles are characterized by a low tissue
differentiation and high morphogenetic capability
whereas mature needles are a specialized photosynthetic organ, which do not show morphogenetic
FDSDELOLWLHV'(SUR¿OHVGHWHUPLQHGIROORZLQJD
previously described protocol [2], showed variations
in the relative abundance of 280 spots from a total
of 856 that were studied whereas transcriptomic
analyses (substractive library building and determination of differential expression by macroarray
and real time PCR) resulted in the description of
176 differentially expressed genes in immature and
mature needles. The joint analysis of proteomic and
transcriptomic data that was performed provided
a broad overview of differentially expressed genes and proteins associated with needle maturation.
Some spots and genes related to photosynthesis and
oxidative phosphorylation were overexpressed in
mature needles. On the other hand immature needles
were characterized by the overexpression of biosynthesis-, cell division- and differentiation-related
proteins [3]. A joint data analysis of proteomic and
transcriptomic results provided a broader view over
differentially expressed pathways associated with
needle maturation. Energy metabolism pathways,
with photosynthetic and oxidative phosphorylation
related proteins and genes, were overexpressed in
mature needles. Amino acid metabolism, transcription and translation pathways were overexpressed in
immature needles. Interestingly, stress related proteins and defense mechanisms were characteristic
of immature tissues, a fact that may be linked to the
trees’ need to defend the needles in young stages or
the higher growth rate and morphogenetic competence exhibited by this tissue [3].
From these functional groups we have selected
¿YH JHQHV UHODWHG WR SKRWRV\QWKHVLV RBCA), regulation of gene expression (MSI1, CSDP2), leaf
elongation (CYP78A7) and stress (SHM4) to further
LQYHVWLJDWHLWVVSHFL¿F'1$PHWK\ODWLRQ$OORIWKHVHJHQHVVKRZHGGLIIHUHQWLDOKLVWRQHPRGL¿FDWLRQV
detected by Chromatin Immunoprecipitation, furthermore CYP78A7 and CSDP2 showed a sequence
ULFKLQ&S*LQLWVSURPRWHUDQG¿UVWH[RQ6SHFL¿F
DNA methylation patterns related to tissue differentiation were found for CSDP2>@7KLVLVWKH¿UVW
GHVFULSWLRQ RI D VSHFL¿F JHQH UHJXODWLRQ EDVHG RQ
epigenetic mechanisms in conifers.
155
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Figure 2. Master gel combining spots of B1 and B12 protein extracts (a). Three sections of the 2-DE gels showing two representative B1 and B12 gels (b). Red and green arrows up and down accumulated spots, respectively, while black arrows point
spots only detected in one kind of protein extract.
)LJXUHCSDP2 showed a differential methylation pattern of cytosines. The callus tissue, without any methylated cytosines,
showed the highest expression level of this gene and the higher proportion of AcH4 and H3K43m (all epigenetic marks associated
with gene expression). One of these marks, H3K43m, was lost in mature needles, the tissue which showed the lowest expression
level. (Valledor et al., in preparation)
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156
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
(VWXGLRGHODUHVSXHVWDDOHVWUpVKtGULFRHQGRVSREODFLRQHVGHHQFLQDQuercus
ilex subsp. ballota 'HVI 6DPS PHGLDQWH XQD DSUR[LPDFLyQ GH SURWHyPLFD
comparativa basada en electroforesis bidimensional
José Valero Galván1, Rafael Mª Navarro Cerrillo2, Ma Cristina Romero Rodríguez1, David Ariza2,
Jesús Jorrín Novo1
1
Grupo de Bioquímica, Proteómica Vegetal y Agrícola. Departamento de Bioquímica y Biología
Molecular. Córdoba, España. 2 Departamento de Ingeniería Forestal. ETSIAM, Universidad de Córdoba.
Córdoba, España
Resumen
La encina (Quercus ilex subsp. ballota) es una
de las especies forestales más importantes del Bosque Mediterráneo, siendo ampliamente utilizada en
programas de conservación forestal, reforestación
y otras practicas silvícolas. El éxito de dichas prácticas depende, en gran medida, de la supervivencia
de las plántulas, siendo el estrés por sequía la principal causa de mortalidad tras el transplante. Es
por ello que la selección de “individuos plus” con
tolerancia a estrés hídrico es de gran importancia.
Los mecanismos de respuesta a estrés en encina
y su variabilidad poblacional han sido muy poco
estudiados. En el presente trabajo se ha evaluado,
mediante una aproximación de proteómica comparativa basada en geles bidimensionales, la respuesta
diferencial de dos poblaciones de encina a la sequía.
Aunque dicha aproximación revela diferencias en la
intensidad de manchas entre tratamientos, no lo hace
entre poblaciones, sin que, por otro lado, hayamos
podido asociar las diferencias observadas al carácter más o menos tolerante de la población utilizada.
Ello puede ser debido a la intensidad y duración del
HVWUpVDODVGL¿FXOWDGHVGHOVLVWHPDH[SHULPHQWDOR
limitaciones de la técnica.
Nuestro grupo de investigación esta trabajando
en un proyecto de investigación (Variabilidad, catalogación, respuesta a estreses y propagación clonal
de encina (Q. ilex), DECOVA, AGL2009-12243C02-02), dirigido, entre otros objetivos, a estudiar la
respuesta de la encina a estrés producido por sequía
utilizando una aproximación multidisciplinar, proteómica incluida [1, 2]. La proteómica en especies
IRUHVWDOHVQRHVIiFLOGHELGRDVXGL¿FXOWDGFRPR
sistema experimental (variabilidad genética alta,
ciclo de vida largo, ausencia de entradas en bases
de datos de DNA genómico, ESTs o proteínas). No
REVWDQWHVXHVWXGLRHVWDMXVWL¿FDGRGDGDODLPSRU-
Figura 1. A) Imagen de hojas y raíz de plantas de las dos poblaciones utilizadas a los 28 días del tratamiento de sequía. SSA
(población almeriense), GSE (población sevillana). B) Gel 2-DE representativo de extractos de hoja de encina. La imagen
corresponde a una muestra de la población SSA a los 28 días del tratamiento de sequía. En la tabla se indican las proteínas
LGHQWL¿FDGDVFRUUHVSRQGLHQWHVDPDQFKDVGLIHUHQFLDOHVHQWUHWUDWDPLHQWRV
157
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
tancia económica y medioambiental de la especie,
componente principal de la “dehesa” y el Bosque
Mediterráneo. Mediante una aproximación de proteómica de expresión diferencial basada en electroforesis bidimensional se han analizados cambios
HQHOSHU¿OSURWHLFRGHGRVSREODFLRQHVGHHQFLQD
[Almería (SSA) y Sevilla (GSE)] [3] sometidas a
HVWUpVKtGULFRPHGLDQWHULHJRGH¿FLWDULRGtDV
Previamente se caracterizó la respuesta de las dos
poblaciones mediante parámetros de crecimiento,
potencial hídrico, humedad relativa en raíz y hojas,
\H¿FLHQFLDIRWRVLQWpWLFDUHVXOWDGRVQRSXEOLFDGRV
A tenor de los resultados obtenidos se concluyó que
la población SSA fue más tolerante, mientras que la
población GSE fue la más susceptible (Figura 1A).
Estos resultados son similares a los obtenidos en
plántulas de encina sometidas a diferentes niveles
de estés hídrico [1, 2] y a otras especies forestales
como el caso del genero Populus [5], sin que hasta la
fecha, y en especies forestales, se haya concluido de
forma contundente la base molecular de la respuesta
a estrés, y si las consecuencias del estrés.
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Las proteínas de hoja (300 mg) de plantas de un
año de crecimiento (control, plantas regadas cada
tres días; tratamiento de sequía, plantas no regadas
a los 28 días) fueron extraídas usando el protocolo
de precipitación TCA-FENOL [4]. Las condiciones
de electroforesis, tinción, análisis de los geles y esWDGtVWLFRHLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVVHUHDOL]DURQ
como lo indica Maldonado et al. [4].
[2]
Echevarría-Zomeño S, Ariza D, Jorge I, Lenzc
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(Submited).
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Después de la tinción de los geles y análisis de
las imágenes se detectaron alrededor de 350-370
manchas. Tras el análisis estadístico se concluyo
que existían 40 manchas diferenciales entre tratamientos y tan solo 4 entre poblaciones (muestras
control). Dado el carácter de especie huérfana de enFLQDHOSRUFHQWDMHGHLGHQWL¿FDFLyQIXHEDMRPHQRV
del 50 % de las manchas diferenciales. En general,
se observó como consecuencia del tratamiento de
sequía un descenso en la intensidad de manchas
correspondientes a proteínas fotosintéticas, fosfoglicerato-quinasa (glicólisis), peroxiredoxinas (estrés
oxidativo) y una glucanasa (proteína de defensa
frente a patógenos) (Figura 1B). Por el contrario se
observó un aumento de intensidad de la glutamina
sintetasa y la s-adenosil-metionina sintetasa. No se
HQFRQWUDURQGLIHUHQFLDVHVWDGtVWLFDPHQWHVLJQL¿FDtivas entre las dos poblaciones analizadas, tanto en
controles como en tratamiento de sequía.
Referencias
158
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Desarrollo y optimización del proceso de extracción de proteínas y electroforesis
bidimensional en fruta de hueso
Esther Giraldo Ramos1, Amelia Díaz Méndez1, Alfredo Garcia Sánchez2
1
Departamento de Vegetales II. Instituto Tecnológico Agroalimentario (INTAEX) 2 Centro de Investigación
“Finca La Orden-Valdesequera”
La fruta de hueso es muy inestable y se deteriora
muy rápido a temperatura ambiente. El almacenamiento a bajas temperaturas para prolongar su vida
puede afectar negativamente a la calidad de la fruta,
GHELGRDOGHVDUUROORGHGHVRUGHQHV¿VLROyJLFRVFRnocidos como daños por frió (DF) [1]. La incidencia
de estos daños es mayor en unas variedades que
en otras [2], por lo tanto su severidad parece tener
un componente genético [3]. Conocer los procesos
moleculares puede permitir diseñar procedimientos
para inducir resistencia o disminuir la sensibilidad al
DF. El estudio de la proteomica comparativa es cada
vez más atractivo en la biología de plantas dada
las amplias bases de datos de secuencia genómicas y EST que proporcionan grandes oportunidades
SDUD LGHQWL¿FDU SURWHtQDV /D HOHFWURIRUHVLV ELGLmensional (2D) constituye actualmente el método
PiVH¿FLHQWHSDUDODVHSDUDFLyQGHSURWHtQDV\DTXH
permite separar cientos, incluso miles de proteínas
en un solo experimento. En este trabajo se presenta
la optimización de la extracción y separación de
proteínas mediante geles bidimensionales a partir
del problemático tejido de la fruta. Las proteínas
fueron extraídas de la pulpa del melocotón y la nectarina mediante un método ya descrito [4] con ligeUDVPRGL¿FDFLRQHV3DUWLPRVGHJUDPRVGHSROYR
de pulpa de melocotón o nectarina, pulverizados en
mortero con nitrógeno liquido, resuspendidos en 10
ml de tampón de extracción (100 mM TRIS pH 8.8,
5 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 Mm PMSF y 30% de
sacarosa), más fenol saturado en TRIS (pH 8.8) en
proporción 1:1 (v/v), mezclamos vigorosamente y se
dejó reposar las muestras durante 10 minutos a 4ºC
antes de centrifugar (10.000g; 15 minutos; 4ºC), se
recuperó la fase fenólica se añadió 1:5 (v/v) volúmenes de Acetato Amónico 100 mM en metanol y
se dejó a -20ºC toda la noche. También se probó en
este paso el empleo de ácido tricloroacético (ATC)
en lugar de Acetato Amónico, sin embargo los resultados fueron decepcionantes. Tras la precipitación, las muestras fueron centrifugadas (10.000g; 15
minutos; 4ºC), y el precipitado lavado 2 veces con
acetona fría, y se dejó secar al aire para eliminar los
restos de acetona. Finalmente el precipitado de proteínas se resuspendió en tampón de rehidratación (7
M Urea, 2 M thiurea, 4% CHAPS, 2% Pharmalyte,
40 mM DTT). Debido a la baja calidad de los geles,
causados por la presencia de sales y contaminantes
no proteínicos, se decidió el empleo del PlusOne
2-D Clean-Up kit. El precipitado limpio fue disuelto
en tampón (7M Urea, 4% (p/v) CHAPS, 1% (v/v)
tampón de inmobilización gradiente de pH 3-11
(GE Healthcare), 0,037 DTT y 0,002% (p/v) azul
de bromofenol, conteniendo una tableta de Mini
Protease Inhibitor Cocktail (Roche) por cada 10 ml
de tampón). La concentración de proteínas extraídas
fue determinado utilizando el PlusOne Quant Kit
(GE Healthcare). En el Isoelectroenfoque, se utilizarón 150 mg de proteínas/ geles teñidos con plata
y 300 mg/ geles teñidos con azul de Coomassie para
la rehidratación pasiva de tiras de isoelectroenfoque
(IEF) de 13 cm con pH 3-11 “no lineal” (al menos
12 horas). Tras la rehidratación se procedió al IEF a
100, 200, 500 y 1000 V durante 1 hora cada uno, un
paso de gradiente hasta 8000 V durante 2:30 horas
y 8000 V durante 1 hora en un Ettan IPGphor Manifold (GE Healthcare) a 20ºC y con una corriente
máxima de 50 uA/gel. A continuación las tiras fueron incubadas 30 minutos en Tampón de equilibrado
(0,075 M Tris, 6 M urea, 29.3% (v/v) glicerol, 2%
(p/v) SDS y 0,002% (p/v) azul de bromofenol), los
primeros 15 minutos con 0,065 M DTT y la segunda
incubación con iodoacetamida (0,135 M). La electroforesis SDS PAGE se realizó en geles (20x20 cm)
de poliacrilamida 12,5% (p/v) utilizando tampones
>@D:SRUJHO\ž&GXUDQWHWRGDODQRFKH
Los geles fueron teñidos mediante las tinciones de
plata, (silver-stain GE Healthcare) y azul Coomassie (GE Healthcare). Los geles obtenidos fueron
escáneados y calibrados con el software labscan
6 (GH Healthcare) (Figuras 1 y 2). La mayoría de
los protocolos de extracción incluyen un paso de
159
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
precipitación con ATC para incrementar la concentración de proteínas y ayudar a la eliminación de
contaminantes [6], sin embargo en ciertas ocasiones,
como es nuestro caso, provoca una co-extracción de
contaminantes, este es el principal problema de los
tejidos de fruta carnoso, que presentan un alto nivel
tanto de polisacaridos de pared celular como de pectinas [7]. Una alternativa ya descrita [8] y adoptada
por nuestro grupo en el protocolo de extracción fue
solubilizar las proteínas con fenol y precipitar con
acetato amónico. En este caso se consiguió una alta
calidad y cantidad de extracción de proteínas libres
de contaminantes. Ya que el fenol ofrece una mayor
estabilidad proteica al minimizar la proteolisis durante la extracción [9]. Por otro lado el melocotón y
la nectarina presentaron un comportamiento similar
en la extracción de proteínas. La electroforesis 2D
es actualmente el método de elección para los estuGLRV GH FRPSDUDFLyQ GH SHU¿OHV SURWHLFRV \D TXH
se trata de una técnica muy resolutiva empleada
frecuentemente en los análisis proteómicos, que permite la generación de datos fácilmente evaluables,
así como su comparación cuantitativa [10].
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:HKDYHJHQHUDWHG$UDELGRSVLVSODQWVRYHUH[SUHVVLQJWKHVWUDZEHUU\)D:5.<JHQHWKDWH[KLELW
enhanced resistance to pathogen infection, and
used a proteomic approach to identify differentially accumulated proteins when compared to the
FRUUHVSRQGLQJ:7DQGPXWDQW$Wwrky75 parental
OLQHV 7KH LGHQWL¿FDWLRQ RI WKH SURWHLQV VKRZLQJ
VLJQL¿FDQWGLIIHUHQFHVZLOOJLYHXVVRPHFOXHVRQ
the signaling networks in which these two factors
might be involved.
Plant resistance involves the reprogramming of
host cells which relies on major changes in gene
H[SUHVVLRQ7KHLGHQWL¿FDWLRQRIWKHPROHFXODUPHchanisms that translate recognition of pathogens into
appropriate transcriptional outputs resulting in resistance is a valuable tool in directing programs aimed
at generating resistant varieties [1]. Nevertheless, relevant crops of agronomical interest usually contain
FRPSOH[JHQRPHVPDNLQJGLI¿FXOWPROHFXODUVWXGLHV
This is the case of the interaction between strawberry
(Fragaria x ananassa), an important agronomical
fruit crop, and Colletotrichum acutatum, a pathogen
which infection causes severe yield losses.
In a previous work we used the molecular resources of the model plant Arabidopsis for studying
this plant-pathogen interaction, and characterize Fa
WRKY1WKH¿UVWPHPEHURIWKH:5.<IDPLO\RI
WUDQVFULSWLRQDO UHJXODWRUV LGHQWL¿HG LQ VWUDZEHUU\
>@:5.<IDFWRUVDUHFHQWUDOSOD\HUVRISODQWSK\siology and orchestrate the defense transcriptome
IRUHI¿FLHQWDFWLYDWLRQRIWKHSODQWGHIHQVHUHVSRQVH
against a range of biotic and abiotic stresses [3].
In strawberry, Fa WRKY1 gene is modulated du-
ring fruit ripening and strongly up-regulated following Colletotrichum infection, and treatments
with defense-related hormones. :H GHPRQVWUDWHG
WKDW )D:5.< DQG LWV$UDELGRSVLV KRPRORJ$W
:5.<DFWDVSRVLWLYHUHJXODWRUVGXULQJWKHDFWLYDWLRQRIEDVDOWKH¿UVWOLQHRIDFWLYHGHIHQVHLQ
plants) and R-mediated resistance (a strong form of
UDFHVSHFL¿FUHVLVWDQFHLQ$UDELGRSVLV$Wwrky75
T-DNA insertion mutants were more susceptible
to virulent and avirulent isolates of the pathogenic
bacteria Pseudomonas syringae, while overexpression of Fa WRKY1 in At wrky75 mutant and wildtype reverts the enhanced susceptible phenotype
of the mutant, and even increases resistance. The
resistance phenotype of these transgenic plants was
uncoupled to the expression of the tipical PATHOGENESIS RELATED (PR) signalling pathway associated with resistance, suggesting differences in
the way of action between both factors in order to
activate the defense response.
In order to investigate the mode of action of
$W:5.< DQG )D:5.< DQG WR LGHQWLI\ WKH
targets of these factors we are using a differential
expression proteomics strategy, consisting in 2- DE
combined with MS [4].
Here we present the proteomic analysis carried
RXWWRFRPSDUHWKHOHDISURWHLQSUR¿OHRIWUDQVJHQLF
Arabidopsis plants overexpressing Fa WRKY1 and
WKHFRUUHVSRQGLQJ:7DQGPXWDQW$Wwrky75 parental lines to identify proteome alterations due to
the expression of this strawberry gene under normal
physiological conditions. This constitutes a previous and neccesary step for further comparisons
of these lines, that exhibit enhanced resistance and
161
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
susceptibility, in response to pathogen infection or
hormone treatment.
7KHLGHQWL¿FDWLRQRIWKHSURWHLQVVKRZLQJVLJQL¿FDQWGLIIHUHQFHVEHWZHHQWKHFAWRKY1 overexpressing lines and their controls (mutant and wild
type plants) will give us some clues on the signalling networks in which these two factors might be
involved, in addition to defense-related signaling.
$FNQRZOHGJHPHQWV
This work was supported by grants PROFIT
010000-2001-100, 2002-81, 2003-32 and 2004-2
from MCYT, Proyecto de Excelencia P07-AGR02482 and grants to Grupo CVI278 from Junta de
Andalucía, Spain. Alba Ruíz-Ramos y Francisco
Amil-Ruíz thank the Junta de Andalucía, Spain for
their predoctoral grants.
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162
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
El estudio comparativo, proteómico y transcriptómico, de la respuesta a azúcares en
Arabidosis thaliana PXHVWUDXQDUHODFLyQHQWUHHOPHWDEROLVPR\HOGHVDUUROORÀRUDO
Marina Ribeiro-Pedro, Fatima Ezzahra Said, María Teresa Ruiz, José María Romero, Federico
Valverde
Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis. CSIC-Universidad de Sevilla. Av. Américo Vespucio, 49.
41092 Sevilla, Spain
El desarrollo vegetal está bajo el control de
complejos programas genéticos que permiten generar múltiples respuestas a cambios ambientales. La
transcriptómica y la proteómica han surgido como
potentes herramientas para profundizar en el conocimiento de los mecanismos regulatorios que los
controlan. En particular, la proteómica vegetal, es
un campo de investigación emergente ya que, al
LGHQWL¿FDU \ FXDQWL¿FDU ODV SURWHtQDV SUHVHQWHV HQ
determinadas condiciones, proporciona información
funcional sobre los mecanismos moleculares básicos. En nuestro laboratorio estudiamos los cambios
que ocurren en el proteoma nuclear de A. thaliana en
UHVSXHVWDDOVXPLQLVWURGHD]~FDUHV+HPRVLGHQWL¿cados varias proteínas posiblemente implicadas en
esta señalización incluidos factores de transcripción,
como FRIGIDA, y otras proteínas señalizadoras.
reguladora y moduladora de los azúcares es conocida desde hace tiempo. Sin embargo, se sabe
poco sobre su mecanismo molecular, es decir, qué
factores de transcripción y proteínas reguladoras
intervienen en esta respuesta. Para responder a esta
incógnita hemos diseñado y optimizado un protocoORGHSURWHyPLFDQXFOHDUTXHQRVSHUPLWDLGHQWL¿FDU
proteínas implicadas en la respuesta a azúcares. Más
recientemente, y con objeto de profundizar en el
conocimiento de dicho mecanismo, hemos iniciado
un acercamiento transcriptómico mediante la utilización de microarrays y estudios más detallados
GHORVWUDQVFULWRVTXHFRGL¿FDQSURWHtQDVSRWHQFLDOmente implicadas en la regulación por azúcares. De
la comparación de ambas aproximaciones podremos
sacar datos que ayuden a comprender la respuesta a
azúcares.
Las complejas interacciones moleculares que
subyacen los procesos de desarrollo vegetal pueden
abordarse en la actualidad mediante un conjunto
YDULDGRGHWpFQLFDVPDVLYDVTXHSHUPLWHQLGHQWL¿FDU
las moléculas biológicamente más relevantes [1].
Entre ellas, la transcriptómica permite el análisis
global de la expresión del genoma en determinadas
FRQGLFLRQHV ¿VLROyJLFDV PLHQWUDV TXH OD SURWHyPLFDSHUPLWHLGHQWL¿FDU\FXDQWL¿FDUODVSURWHtQDV
involucradas [1, 2]. Dado que, por una parte, son las
proteínas los componentes directos de las cascadas
de señalización y rutas bioquímicas, y que no existe
correspondencia directa entre gen-proteína, la proteómica vegetal emerge como la mejor herramienta
SDUD UHÀHMDU OD FRPSOHMLGDG \ GLQDPLVPR GH ORV
sistemas vegetales.
Proteómica. (QQXHVWURSURWRFRORSXUL¿FDPRV
núcleos de A. thaliana var. Col-0 cultivadas en medio MS (control) y medio MS suplementado con 3%
(p/v) de sacarosa, extrayendo las proteínas nucleares
con sulfato de amónio/deoxicolato en condiciones
nativas. Luego se eliminan los contaminantes por
¿OWUDFLyQHQJHOHQXQDFROXPQDGH6HSKDGH[\VH
enriquecen las muestras en potenciales factores de
WUDQVFULSFLyQ PHGLDQWH FURPDWRJUDItD GH D¿QLGDG
en una matriz de heparín-sulfato. En condiciones
desnaturalizantes se extraen las proteínas con fenol
y luego se precipitan con una mezcla de acetato de
DPRQLR\PHWDQRO(QORVSDVRVFURPDWRJUi¿FRVVH
HPSOHy HO VLVWHPD b.7$)3/&Π/DV IUDFFLRQHV
proteicas se sometieron a una electroforesis bidimensional: isoelectroenfoque en strip5HDG\6WULSŒ
IPG y separación en SDS-PAGE en geles Criterion
XT Bis-Tris (Bio-Rad). Los geles fueron teñidos
con SYPRO Ruby, nitrato de plata o Coomassie
coloidal. Las proteínas de interés fueron analizadas
mediante espectrometría de masas MALDI-TOF e
LGHQWL¿FDGDV FRQ HO SURJUDPD 0$6&27 3DUD ORV
Las plantas son organismos sésiles y responden
D FDPELRV GHO DPELHQWH PRGL¿FDQGR VXV FDUDFWHUtVWLFDV ¿VLFRTXtPLFDV >@ (Q QXHVWUR ODERUDWRULR
estamos interesados en estudiar los cambios a nivel
molecular que ocurren en el núcleo de A. thaliana
en respuesta al suministro de azúcares. La función
163
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
análisis de Western blot se utilizaron anticuerpos esSHFt¿FRVJHQHUDGRVHQHOODERUDWRULRRDQWLFXHUSRV
control de casas comerciales.
Transcriptómica. 3DUDHODQiOLVLVGHORVSHU¿OHV
de expresión en presencia de azúcares se extrajo
RNA total de plántulas de A.thaliana var. Col-0 cultivadas en medio MS o MS con sacarosa mediante
HOPpWRGRGHO7UL]RO\VHSXUL¿FDURQHQFROXPQDV
“RNeasy” (Qiagen). Se hibridaron 3 muestras biológicas de cada condición experimental en “GeneChips” de Affymetrix (Unidad de Genómica, CNB)
y los datos se analizaron mediante LiMMA con el
software FIESTA (http://bioinfogp.cnb.csic.es). Los
resultados fueron posteriormente analizados con
los programas disponibles en red en el “Bio-array
Resource” (http://bar.utoronto.ca). En función de
los resultados obtenidos se procedió al análisis, mediante QPCR, de los genes de interés.
Figura 1. Comparación funcional, entre transcriptómica y proteómica, de la respuesta a sacarosa. $&ODVL¿FDFLyQIXQFLRQDO
de los genes cuya expresión se altera (represión FDR<-2 ó
LQGXFFLyQ)'5!HQSUHVHQFLDGHVDFDURVD%&ODVL¿FDFLyQ
funcional de las proteínas cuya producción (incremento ó
disminuición) se altera en presencia de sacarosa.
Una vez desarrollado y utilizado el protocolo de
forma rutinaria, hemos iniciado la optimización de
los pasos más críticos. Asimismo, hemos comparado
varios métodos de extracción de proteínas nucleares,
entre ellos la extracción en presencia de 6M guanidina, en condiciones de alta sal y con fenol. Los
Tabla 1. ,GHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVHQHVWHHVWXGLR
Category
Protein
Carbon metabolism
RNA and DNA metabolism
Cell cycle
Folding
Unknown
ATG
number
CPC
ATMYB3R4
GLP3
TF2
ARAC7
T3F24.4
F5F19.6
JR1
T204.11
Regulation of timing of transition from vegetative to
reproductive phase
Transcription factor activity
Transcription factor
Response to cold
MyB-like transcription factor
GTP-binding protein implicated in signal transduction
F-Box related protein
Signalling
Signalling
Signalling
3XWDWLYH5,1*]LQF¿QJHUSURWHLQ
Signalling
at3g53410
ESM1
TGG1
TGG2
PYK10
SAD1
MSH2
TPLATE
PBP1
Sugar related protein
Sugar related protein
Sugar-related protein
Hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds
mRNA splicing, export, and degradation.
Damaged DNA reparation
Cytokinesis protein targeted to the cell plate
Protein folding
at3g14210
at5g26000
at5g25980
at3g09260
at5g48870
at3g18524
at3g01780
at3g16420
RNA-binding
Unknown
at3g24255
JAL22
Unknown
at2g39310
FRI
Signalling, gene
regulation
Description
resultados obtenidos demuestran que se obtiene una
PD\RUH¿FLHQFLDPHGLDQWHODH[WUDFFLyQFRQJXDQLdina que con los otros métodos por separado, mientras que la utilización secuencial de ambos (alta sal
y fenolización) es comparable a la extracción con el
caotropo. A titulo de comparación hemos aplicado
varios métodos de tinción de geles, entre los que la
at4g00650
at2g46410
at5g11510
at5g20630
at1g05055
at4g28950
at1g47350
at1g52000
at3g16470
at3g16450
tinción con coomassie coloidal nos ha proporcionado
la mejor resolución y compatibilidad con los análisis
de espectrometría de masas. Del total de proteínas
LGHQWL¿FDGDVKDVWDHOPRPHQWRKHPRVDQDOL]DGRODV
que presentaban expresión diferencial en presencia
o ausencia de sacarosa y se muestran en la Tabla 1
en base a su función. Se observa que el grupo más
164
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Figura 2. Estudio de los niveles de expresión de FRIGIDA
y detección de la proteína en plántulas de A. thaliana, en
respuesta a sacarosa. A) Análisis, por QPCR, de los niveles de transcripto de FRIGIDA en plántulas (Wt col y Sf2
col) crecidas en medio MS y medio MS suplementado con
3% de sacarosa. B) Análisis, mediante Western blot, de la
presencia de FRIGIDA en extractos nucleares y citosólicos de plántulas Wt col y Sf2 col crecidas en las mismas
condiciones de ensayo. Cabe mencionar que FRIGIDA se
detecta exclusivamente en las fracciones nucleares (banda
de 57 Kda aprox.) y que en presencia de sacarosa parece
aumentar su producción. La banda de 20 Kda corresponde
a la Histona H3, utilizada como control de la integridad y
pureza de las fracciones.
Referencias
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Hochholdinger F, Sauer M, Dembinsky D, Hoecker N, Muthreich N, Saleem M, Liu Y.Proteomic
dissection of plant development. Proteomics
2006; 6:4076-4083.
representado corresponde a proteínas implicadas
en mecanismos de señalización y regulación de la
expresión génica, como es el caso de FRIGIDA cuya
expresión parece aumentar en presencia de sacarosa.
Una situación similar puede comprobarse a nivel
GHOSHU¿OGHH[SUHVLyQ)LJXUDE6LQHPEDUJR\
en el caso particular de FRIGIDA, no parece existir
una relación directa entre gen-proteína ya que, en
presencia de sacarosa, una mayor producción de
SURWHtQD)LJXUDEQRSDUHFHUHÀHMDUVHDQLYHOGHO
correspondiente transcrito (Figura 2a). Mediante el
uso combinado de estas herramientas (Proteómica
y Transcriptómica) hemos mostrado que podemos
aumentar la comprensión de los mecanismos biológicos, ya que permite la integración y la intersección
de la información transcripcional, traduccional y
post-traduccional.
[2]
Chen S y Harmon AC. Advances in plant proteomics. Proteomics 2006; 6:5504-5516.
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Casal, JJ. Fankhauser C, Coupland G, Blázquez
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$ ',*( SURWHRPLF DQDO\VLV RI ZKHDW ÀDJ OHDI WUHDWHG ZLWK 7(55$625%Š
foliar, a free amino acid-based biostimulator
María José Martinez-Esteso1, Mayte Vilella-Antón1, Susana Sellés-Marchart2, Anna Botta-Català3,
Rafael Piñol-Dastis3, Roque Bru-Martinez1
1
Grupo de Proteómica y Genómica Funcional de Plantas. Dpto. Agroquímica y Bioquímica, IMEM Ramon
Margalef, Universidad de Alicante; 2Unidad de Genómica y Proteómica, SSTTI, Universidad de Alicante;
3
Departamento I+D Fisiología Vegetal, BIOIBERICA, S.A.
Abstract
In this work, we have undertaken a proteomic
approach using DIGE in order to explore molecular
mechanisms potentially involved in the biostimulating effect of Terra-Sorb® foliar on wheat applied at
ÀDJOHDIVWDJH3URWHLQVLGHQWL¿HGXSDQGGRZQUHJXODted suggest an improvement of wheat productivity by a
combination of an enhanced CO2¿[DWLRQDPRUHDFWLYH
protein synthesis and a decrease of oxidative stress.
165
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Table 1. 3URWHLQVGHUHJXODWHGLQZKHDWÀDJOHDIWUHDWHGZLWK7HUUD6RUEŠ)ROLDU1RUPDOLVHGVSRWVYROXPHVIRU&21752/
and TREATED samples.
Protein Information
Ref.
Spot
Protein
Description
Norm. Vol.
Accession No.
CONTROL
Terra-Sorb
73 EF-Tu Chl-1
translational elongation factor Tu
125540125
1
1,412
10 EF-Tu Chl-2
14 EF-Tu Chl-3
translational elongation factor Tu
translational elongation factor Tu
125540125
125540125
1
1
1,371
1,301
18 RUBISCO LBP-B-1
RuBisCO large subunit-binding protein
subunit beta, chloroplast
2493650
1
1,256
122 RUBISCO LBP-B-2
RuBisCO large subunit-binding protein
subunit beta, chloroplast
2493650
1
1,231
30 RUBISCO LBP-B-3
RuBisCO large subunit-binding protein
subunit beta, chloroplast
2493650
1
1,176
8 RUBISCO LBP-A-1
RuBisCO large subunit-binding protein subunit
alpha, chloroplast precursor
134102
1
1,4
12 RUBISCO LBP-A-2
RuBisCO large subunit-binding protein subunit
alpha, chloroplast precursor
134102
1
1,328
11 RUBISCO LBP-A-3
RuBisCO large subunit-binding protein subunit
alpha, chloroplast precursor
134102
1
1,284
56
RUBISCO-L
(fragmento?)-1
RuBisCO large subunit. Ribulose bisphosphate
carboxylase large chain, N-terminal domain.
548677
1
1,825
62
RUBISCO-L
(fragmento?)-2
RuBisCO large subunit. Ribulose bisphosphate
carboxylase large chain, N-terminal domain.
548677
1
1,611
5 RUBISCO A-1
RuBisCO activase A chloroplast precursor
12643756
1
1,43
9 RUBISCO A-2
RuBisCO activase A chloroplast precursor
12643756
1
1,413
89 RUBISCO A-3
RuBisCO activase A chloroplast precursor
12643756
1
1,274
RUBISCO A-A
(Precursor?)
RuBisCO activase A chloroplast precursor
12643756
1
1,184
40 PRK-1
Phosphoribulokinase, chloroplast precursor
125580
1
1,087
46 PRK-2
Phosphoribulokinase, chloroplast precursor
125580
1
1,037
71 HSP90
Heat schock protein 90kDa
556673
1
1,47
33 EF-G Chl
Elongation factor G, chloroplast precursor
(EF-G)
125549171
1
1,113
36 EF-G Chl
Elongation factor G, chloroplast precursor
(EF-G)
125549171
1
1,108
32 PGM
phosphoglycerate mutase
32400802
1
-1,264
34 GA3PDH
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
15222111
1
-1,27
29 ATP-CF1-A
ATP synthase CF1 alpha subunit
14017569
1
-1,273
22 pEF-G Chl
putative Elongation factor G, chloroplast
precursor (EF-G). Fragmento?
125549171
1
-1,289
170
131 Cu/Zn SOD
Cu/Zn superoxide dismutase
1568639
1
-1,34
13 Cu/Zn SOD
Cu/Zn superoxide dismutase
1568639
1
-1,476
166
Communication
Proteomics has been shown as successful approach to analyze the response of plants to external
VWLPXOXV>@:HSHUIRUPHGDSURWHRPLFDSSURDFK
in order to study the effects of Terra-Sorb ® foliar
RQZKHDWOHDYHVDWWKHÀDJOHDIVWDJH%%&+
7HUUD6RUEŠIROLDUD/ĮDPLQRDFLGEDVHGSURduct from enzymatic hydrolysis with a high ratio of
free-to-total amino acids, was applied two and three
days following foliar by spraying treatment. Flag
leaf samples were taken from independent control
(C) and treated plots (T).
A quantitative DIGE approach was used to compare the proteomes of T vs C plants in four biological
replicates. After SameSpots v3.0 gel analysis, 37 deregulated spots were selected out of 918 detected, with
an ANOVA p<0.05. As shown in table 1, 26 protein
spots encoded by 12 different genes were successfuOO\LGHQWL¿HGE\Q/&0606LQD;&7SOXV,7PDVV
spectrometer (Agilent) (SpectrumMill Proteomics
:RUNEHQFKDVVHDUFKHQJLQH1&%,QUDVGDWDEDVH
)RXU VSRWV LGHQWL¿HG DV 58%,6&2 DFWLYDVH$
chloroplast precursor (RBA) were up-regulated by
treatment with Terra-Sorb ® foliar. This enzyme
produces ATP-dependent conformational changes in
RUBISCO, making the inactivated enzyme to re-enter the catalytic cycle. Phosphoribulokinase has been
detected with a slight increase in abundance, which
LVFRQVLVWHQWZLWKDQHQKDQFHPHQWRIFDUERQ¿[DWLRQ
In addition, RUBISCO large subunit-binding protein
subunits alpha and beta (RUBISCO LBP A and B),
that assists RUBISCO folding, have been found upregulated in treated leaves. These results together
suggest that Terra-Sorb ® foliar promotes RUBISCO
DFWLYLW\DQGWKXVHQKDQFHGFDUERQ¿[DWLRQ
7KUHHXSUHJXODWHGVSRWVLGHQWL¿HGDVFKORURSODVW
elongation factors Tu (EF-Tu Chl), G (EF-G Chl) and
heat shock protein 90 (HSP-90) indicate a potentially
enhanced protein synthesis and folding to produce
functional proteins upon Terra-Sorb ® foliar treatment.
Plants invest an important amount of the photosynthetic energy in biosynthesis of amino acids, thus the
application of exogenous amino acids via foliar may
give rise to an enhancement of protein synthesis.
Among those down-regulated spots four proWHLQVKDYHEHHQLGHQWL¿HGFKORURSODVW$73DVHDOSKD
subunit, phosphoglyceromutase (PGM), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GA3PDH) and
Cu/Zn superoxide dismutase (Cu/Zn SOD). There is
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
DVOLJKWGHFUHDVHRIWKHWKUHH¿UVWSURWHLQVFRQVLVWHQW
with a decrease in consumption of the product of
photosynthesis 3-phosphoglycerate for catabolism,
thus this product might be accumulated in a reservoir
as a sugar. The decrease of a superoxide dismutase
VSHFL¿FIRUVFDYHQJLQJRIWKHVXSHUR[LGHJHQHUDWHG
by photooxidation of O2 in PS-I (Cu/Zn SOD) is
consistent with a lower oxidative stress state.
According to results, the three major molecular
effects found of spraying wheat with Terra-Sorb ®
IROLDURQWKHÀDJOHDISURWHRPHVXSSRUWWKHSK\VLRlogical effects described upon treatment of other
crops with Terra-Sorb ® foliar foliar such as increase of plant photosynthetic activity and chlorophyll
content, promotion of rapid recovery from stress and
improvement of nutrient absorption [2].
Figure 1. 2D reference gel image showing the location of
selected spots down- regulated (upwards arrowhead) and
up-regulated.
$FNQRZOHGJHPHQWV
The technical support and helpful discussions of
Ramón Sánchez Pérez and Cándido Marín Garrido
are very acknowledged. The DIGE and protein idenWL¿FDWLRQ DQDO\VLV ZHUH FDUULHG RXW DW 6HUYLFLR GH
Proteómica de la Universidad de Alicante, a PROTEORED member (www.proteored.org). This work
was supported by Bioibérica, S.A.
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3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
167
High-throughput biological and functional analisys of interactions among tetraspanin associated proteins in T Limphocytes using second generation proteomics
techniques
Daniel Pérez-Hernández1&2, Elena Bonzón-Kulichenko1, Pablo Martínez-Acedo1, Pedro J. Navarro1,
Estefanía Núñez1, Marco Trevisan-Herraz1, María Yáñez-Mo2, Mónica Sala-Valdés2, Mª Ángeles
Ursa2, Francisco Sánchez-Madrid2, JesúsVázquez1
1
Laboratorio de Química de Proteínas y Proteómica, CBMSO. 2Hospital Universitario La Princesa y Centro
Nacional de Investigaciones Cardiovasculares CNIC
The tetraspanin superfamily of transmembrane
proteins is clustered in compact structural groups
forming specialized membrane microdomains (Tetraspanin Enriched Microdomains, TEM or TERM).
Through heterolog and homolog interactions, tetraspanins regulate signalling processes mediated by
cellular adhesion molecules, growth factor receptors
and costimulatory proteins. The presence in TERMs
of Major Histocompatibility Complex (MHC) I and
II molecules also suggest that tetraspanins partici-
pate in antigen presentation. Furthermore, they participate as viral correceptors in certain situations and
are involved viral growth in infected cells [1].
In spite of the growing interest for these proteins,
the cytosolic interactions by which tetraspanins are
involved in various receptor activation pathways, their
cytoskeleton anchorage and in general the protein
ligands that interact with these proteins are poorly
known. In this work we have made a systematic analy-
Figure 1. Systems Biology analysis of the proteins that interact with the peptide baits belonging to CD81, ICAM-1 and EWI-2.
Proteins with the same molecular or biological function are clustered. The same colour belongs to the same bait or the same
combination of the three peptide baits. Links between proteins are previously validated by IPA.
168
sis of interacting partners of different proteins that are
presented in TERMs [2]. This was accomplished by
“pull-down” techniques and high-throughput protein
LGHQWL¿FDWLRQRIWKHFDSWXUHGOLJDQGVE\PDVVVSHFtrometry. For this end, synthetic biotinylated peptides
spanning the C-terminal cytoplasmic end of these proteins were incubated with extracts from lymphoblast
cell models, and then captured using Streptavidin-sepharose microbeads. Proteins interacting with the peptide baits were subjected to digestion and the resulting
peptides systematically analyzed by HPLC-linear ion
trap MS/MS mass spectrometry. Proteins from more
WKDQ SXOOGRZQ DQDO\VLV FODVVL¿HG LQ GLIIHUHQW
H[SHULPHQWV ZHUH DXWRPDWLFDOO\ LGHQWL¿HG IURP WKH
0606VSHFWUDLQDKXPDQGDWDEDVH:HLGHQWL¿HG
PRUHWKDQKXPDQSURWHLQV¿OWHULQJZLWKS5DWLR
software developed by our group with an error rate of
SURWHLQLGHQWL¿FDWLRQQHYHUVXSHULRUWR>@
:HGHYHORSHGDUREXVWVWDWLVWLFDOFULWHULRQEDVHG
RQWKHQXPEHURISHSWLGHVRIHDFKSURWHLQLGHQWL¿HG
in all the partners in the same pull down experiPHQWS:HDOVRFRQ¿UPHGWKHLQWHUDFWLRQV
EHWZHHQ WKH LGHQWL¿HG SURWHLQV DQG WKH EDLWV FRQsidering the reproducibility in all the experiments.
0RUHWKDQVSHFL¿FLQWHUDFWLRQVZHUHGLIIHUHQtially clustered revealing strong relationships among
groups of peptide baits.
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
or IPA) (Figure 1). Interacting proteins from different baits were found to share biological functionality, and the groups of interactions showed a strong
functional and biological relationship among them.
This information suggests that proteins which link
the citosolic domains of tetraspanins form a coherent network of interactions with their functional
role between T lymphocytes and vascular endothelium in the processes of diapedesis.
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The validated proteins have been analyzed using
System Biology tools (Ingenuity Pathways Analysis
Use of ProteoMiner in Veterinary Research
Anna Marco, Gemma Rovira, Anna Bassols
Departament de Bioquímica i Biologia Molecular. Facultat de Veterinària. Universitat Autònoma de Barcelona. 08193 Cerdanyola del Vallès
One of the main applications of serum proteoPLFV LV WKH LGHQWL¿FDWLRQ RI QHZ ELRPDUNHUV IRU
animal disease or animal production. However, potential obstacles to these studies are the poor perforPDQFH RI DI¿QLW\ VHUXP GHSOHWLRQ PHWKRGV EDVHG
on human antigens when using animal samples. In
WKHSUHVHQWVWXG\ZHKDYHDQDO\]HGWKHHI¿FLHQF\
and reproducibility of the ProteoMiner® beads with
bovine and porcine serum samples.
:KHQORRNLQJIRUELRPDUNHUVVHUXPLVSRWHQtially the most valuable biological sample, because
it contains thousands of different proteins and peptides and it is the most easily accessible, noninvasive,
and widely collected sample [1]. Unfortunately, its
content is dominated by a handful of high-abundant
proteins, with their estimated concentration exceeding the low-abundant proteins highly by 10 orders
of magnitude [2]. This large dynamic range exceeds
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
the analytical capabilities of traditional proteomic
methods, making the detection of lower abundance
serum proteins extremely challenging. In particular,
most potential biomarkers are among those lowabundance proteins, secreted into the bloodstream
by tissues or cells because of the disease process.
To detect these low-abundance proteins using
currently available technologies, it is advisable to
UHPRYHWKHPRVWDEXQGDQWSURWHLQV¿UVW0DQ\VWUDtegies have been developed for the removal of albumin and other high-abundance proteins; however
WKH\KDYHDKLJKVSHFL¿FLW\IRUKXPDQRUODERUDWRU\
animal proteins [3]. Recently, a new method for
capturing low-abundance proteins has been commercially available, which is known under the trade
name of ProteoMiner® and it is based on the use
of a combinatorial peptide binding library, which
DI¿QLW\FDSWXUHV DQG DPSOL¿HV WKH ORZDEXQGDQFH
proteome [4].
Proteomics constitutes an interesting approach
to veterinary medicine and animal production. In
this sense, porcine and bovine livestock are the
most interesting species due to their economical
interest. Surprisingly, there are very few applications of serum proteomics to veterinary science.
The ProteoMiner technology, since it is not based
on an immunological approach, should be species
independent, and thus of potential application to
samples of veterinary interest.
The objective of the present work was to analyze
WKHHI¿FLHQF\DQGUHSURGXFLELOLW\RIWKH3URWHR0LQHU
system with bovine and porcine serum samples.
Blood was collected from the coccygeal vein in
Holstein cows and from the cava vein in Duroc x
/DQGUDFH[/DUJH:KLWHSLJVLQDYDFXWDLQHUWXEH
with no added chemicals. Serum samples were treated with the ProteoMiner beads (Bio-Rad, Hercules,
CA, USA); a relationship 1:10 (mg protein:µl resin)
was used to optimize the yield of the procedure. First
dimension was performed on pH 3-10, 24 cm Immobiline DryStrips (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)
under reducing and denaturing conditions. Then,
strips were reduced and alkilated with equilibration
buffer (50mM Tris-HCl pH 8.8, 6M urea, 30% (v/v)
glycerol, 2% (w/v) SDS and bromophenol blue) and
1% (w/v) DTT or 2.5% (w/v) IAA, respectively. The
second dimension was performed with home-made
12% polyacrylamide gels. Protein staining was performed with silver, following the Berkelman and
169
Stendstedt protocol [5]. Gels were scanned with the
Image Scanner III (GE Healthcare).
After treatment with the ProteoMiner system, a
substantial enrichment of the low-abundance proteins was achieved and new spots were detected,
whereas albumin and the light and heavy chains of
immunoglobulins were less represented (Figure 1).
7KHVHUHDJHQWVDUHEDVHGRQWKHDI¿QLW\ELQGLQJRI
all kind of proteins and thus they intend to capture
and amplify the low-abundance proteome.
Figure 1. Two-dimensional electrophoresis of bovine and
porcine serum after treatment with the ProteoMiner beads:
a) control, non-depleted serum; b) bound fraction (“enriched” serum).
Reproducibility is necessary for accurate downstream analysis. To assess this characteristic in the
3URWHR0LQHU V\VWHP ¿YH WHFKQLFDO VHUXP UHSOLFDtes from cow and pig were prepared from aliquots
of the same sample and run on a one dimensional
SRO\DFU\ODPLGHJHOXVLQJȝJSURWHLQSHU
lane. Gels were stained with silver and scanned
as described above. Densitometry was performed
ZLWKWKH0XOWL*DXJHVRIWZDUH)XML¿OP$VVHHQ
in Figure 2, the ProteoMiner system presents good
reproducibility.
Figure 2. Reproducibility analysis of the enriched lowabundance proteome achieved with the ProteoMiner beads
on bovine and porcine samples. Densitometry of the bound
fraction (“enriched” serum) obtained from one-dimensional
SDS-PAGE gels is shown.
These results clearly demonstrate that the ProteoMiner system is useful for bovine and porcine
VHUXPVDPSOHV:KLOHWKLVLVQRWDGHSOHWLRQPHWKRG
170
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
to remove high abundance proteins, like others used
IRUKXPDQELRPDUNHULGHQWL¿FDWLRQWKH3URWHR0LQHU
treatment will decrease the amount of these highabundance proteins. This kind of strategies should
widen the number of applications in serum animal
proteomics.
This work was funded by grant AGL200602364/GAN from the Spanish “Ministerio de EduFDFLyQ\&LHQFLD´3DUWRIWKHIXQGLQJZDV¿QDQFHG
by the FEDER program from the European Union.
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La Proteómica como vía para determinar el origen animal de los productos
cárnicos
Miguel Ángel Sentandreu1, Paul D. Fraser2, Enrique Sentandreu1, Leticia Mora1, Peter M.
Bramley2
1
Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), P.O. Box 73, 46100 Burjassot, Valencia.
España. 2 Center for Systems and Synthetic Biology, School of Biological Sciences, Royal Holloway,
8QLYHUVLW\RI/RQGRQ(JKDP7:(;5HLQR8QLGR
Resumen
En el presente trabajo se describe el desarrollo
de un método para detectar la presencia de carne
de pollo en mezclas de carne haciendo uso de la
tecnología proteómica. Es un método simple y
robusto que incluye una etapa de extracción de
proteínas musculares, enriquecimiento de la proteína diana mediante isoelectroenfoque, digestión
con tripsina de la misma y análisis de un péptido
ELRPDUFDGRU HVSHFt¿FRV GH OD HVSHFLH DYLDU PHdiante LC-ESI-MS/MS. Esta metodología ha permitido detectar la presencia de un 0,5 % de carne
de pollo contaminando carne de cerdo. Además
de su sencillez, el método presenta la ventaja de
poder aplicarse indistintamente al análisis de carne
fresca y cocinada, representando una alternativa
interesante a los métodos que se están empleando
actualmente para el control del origen animal de
los productos cárnicos.
Texto principal
Los principales casos de adulteración en productos cárnicos se relacionan con la sustitución de carne
de elevada calidad por carne de un menor coste con
REMHWR GH SRGHU REWHQHU XQ EHQH¿FLR HFRQyPLFR
adicional. Para poder controlar el fraude que supone esta forma de proceder es necesario disponer de
métodos de análisis robustos, sensibles y precisos.
De entre las tecnologías más empleadas hasta el
momento para este propósito hay que destacar los
inmunoensayos y los análisis de ADN. A pesar del
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
gran avance que ha supuesto la introducción y el
desarrollo de estas técnicas, existen importantes
limitaciones cuando éstas se aplican al análisis de
productos cárnicos procesados ya que las agresivas
condiciones empleadas durante el procesado de la
FDUQHSXHGHQLQÀXLUQHJDWLYDPHQWHHQHOUHFRQRFLmiento de las proteínas diana o del ADN [1]. Los
recientes avances en las técnicas de espectrometría de masas aplicadas al campo de la proteómica
constituyen una alternativa interesante a través de la
LGHQWL¿FDFLyQGHSpSWLGRVELRPDUFDGRUHVHVSHFt¿FRV
de cada especie animal. En el presente trabajo se ha
VHOHFFLRQDGRXQSpSWLGRELRPDUFDGRUHVSHFt¿FRGH
la especie aviar para poder detectar esta carne en
cualquier tipo de mezcla de carne tanto fresca como
cocinada. Para ello, un gramo de distintas mezclas
de carne de pollo se homogeneizaron con 10 mL de
tampón Tris, pH 8,0, centrifugándose a continuación
durante 20 min a 10000 rpm. Se recogió el precipitado obtenido y se solubilizó en el tampón Tris pH 8.0
conteniendo 6M de urea y 1 M de thiourea. Se tomo
el volumen necesario de este extracto para fraccionar
2,5 mg de proteínas totales por isoelectroenfoque en
el intervalo de pH 4-7 empleando un fraccionador
OFFGEL 3100 (Agilent). De la fracción donde se
localizó la cadena ligera de mosina 3 se tomaron 20
µL para realizar una digestión con tripsina. Después
GH OD GLJHVWLyQ VH DMXVWy HO YROXPHQ¿QDO GH FDGD
muestra a 30 µL, analizando los péptidos contenidos
Figura 1. Resumen esquemático del método desarrollado
para detectar cuantitativamente la presencia de la carne de
pollo en las distintas mezclas de carne.
171
en este extracto mediante LC-ESI-MS/MS (Thermo
(OHFWUyQ &RUS /D LGHQWL¿FDFLyQ GH SpSWLGRV VH
realizó a partir de los espectros MS/MS empleando
MASCOT como algoritmo y la base de datos de
SURWHtQDV 1&%,QU /D FXDQWL¿FDFLyQ GHO SpSWLGR
seleccionado como biomarcador de la especie aviar
en distintas mezclas de carne conteniendo diferentes
porcentajes de carne de pollo se realizó mediante
la adición de 5 picomoles del péptido seleccionado
marcado con isótopos estables 13C6/15N (Técnica
$48$/DLQWHJUDFLyQGHORVSLFRVFURPDWRJUi¿cos correspondientes tanto al péptido nativo como al
péptido pesado se realizó manualmente. La cantidad
de péptido nativo en cada muestra se determinó por
comparación de las áreas de cada pico.
El método que se ha desarrollado en el presente
trabajo se esquematiza en la Figura 1. Las proteínas
de los distintos extractos de carne se fraccionaron
mediante isoelectroenfoque en medio líquido. En
OD )LJXUD VH SXHGH REVHUYDU HO SHU¿O GH SURWHtnas obtenido en SDS-PAGE para las fracciones
OFFGEL correspondientes a los valores de pH más
ácidos. Como se puede apreciar, las fracciones 3
y 4 contienen una sola banda de proteína, correspondiente a la cadena ligera de miosina 3 (MLC3).
(VWRFRQ¿UPDHOXVRGHOLVRHOHFWURHQIRTXHHQPHGLR
líquido como vía adecuada para el enriquecimiento
de MLC3 como proteína diana para la posterior
hidrólisis con tripsina y generación de péptidos po-
Figura 2. SDS-PAGE al 12 % correspondiente a las nueve
primeras fracciones obtenidas después de separar las proteínas de una mezcla de carne (1 % de pollo en carne de
cerdo) con el fraccionador de proteínas en solución OFFGEL 3100 de Agilent. El isoelectroenfoque se realizó en el
intervalo de pH 4-7. Se indica la posición en el gel de la
cadena ligera de miosina 3 (MLC3).
172
tenciales biomarcadores de cada especie animal. El
presente trabajo se ha centrado en la selección de
un péptido biomarcador para detectar la presencia
de pollo en mezclas de carne. Como criterios de
selección se tuvo en cuenta que el péptido elegido
IXHUD HVSHFt¿FR GH OD HVSHFLH DYLDU DVt FRPR TXH
su detección fuera posible aun en aquellos casos
en los que la carne de pollo esté presente en bajas
cantidades en el producto. De este modo, se llevó
a cabo el protocolo de trabajo de la Figura 1 empleando una mezcla de carne conteniendo un 1%
de pollo en carne de cerdo. Después de realizar la
hidrólisis con tripsina de las fracciones OFFGEL 3
y 4 (Figura 2), el análisis mediante LC-ESI-MS/MS
GHORVSpSWLGRVJHQHUDGRVSHUPLWLyODLGHQWL¿FDFLyQ
GHO SpSWLGR ELRPDUFDGRU H VSHFt¿FR GH OD HVSHFLH
aviar 37ALGQNPTNAEINK49 procedente de MLC3.
/D FXDQWL¿FDFLyQ GH HVWH SpSWLGR HQ PH]FODV GH
carne conteniendo distintos porcentajes de carne
de pollo (0, 0,5, 1, 2, 5 y 10 %) se realizó mediante
la adición de su homólogo marcado con isótopos
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
estables (+7 Da) al extracto enriquecido en MLC3
después del fraccionamiento en OFFGEL (Figura
1). De este modo se obtuvo una buena correlación
lineal (R2 = 0,9921) entre el porcentaje de carne de
pollo añadido a la mezcla y la cantidad del péptido
biomarcador seleccionado, determinada por LCESI-MS/MS. El método desarrollado en el presente
WUDEDMRHVSUHFLVR\VHQVLEOHDGHPiVGHVHU¿DEOHHQ
el análisis de alimentos sometidos a un tratamiento
térmico elevado. Los resultados obtenidos permiten
D¿UPDUTXHODDSUR[LPDFLyQSURWHyPLFDSXHGHVHU
una alternativa de interés a los métodos empleados
actualmente para resolver el problema de la determinación de las especies cárnicas.
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Péptidos inhibidores de la Enzima Convertidora de Angiotensina I generados
en la digestión in vitro de la carne de cerdo
Elizabeth Escudero1, Miguel Angel Sentandreu1, Keizo Arihara2, Fidel Toldrá1
1
Instituto de agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC). 2Faculty of Animal Science, School of
Veterinary Medicine and Animal Sciences, Kitasato University
Resumen
El objetivo principal de este trabajo se ha centrado en la generación de péptidos inhibidores de
la Enzima Convertidora de Angiotensina I (ECA)
después de la digestión de carne de cerdo mediante
la acción secuencial de pepsina y pancreatina, simulando las condiciones del sistema digestivo. El
hidrolizado fue analizado directamente mediante
nanoLC-ESI-MS/MS, estudiando seguidamente las
secuencias obtenidas a partir de los espectros MS/
06/RVUHVXOWDGRVREWHQLGRVSRQHQGHPDQL¿HVWR
el potencial de las proteínas de la carne de cerdo
como fuente de péptidos antihipertensivos después
de la digestión gastrointestinal.
Estudios recientes han demostrado el potencial
de la carne de cerdo al generar péptidos biologicamente activos con capacidad para regular numerosos procesos en el organismo [1], lo que otorga a la
carne un valor añadido. En trabajos anteriores se han
descrito péptidos con acción antioxidante, antimicrobiana o antihipertensiva por ejemplo [2]. La acción antihipertensiva ejercida por algunos péptidos
es debida a su capacidad para inhibir la actividad
ECA. En el presente estudio, se ha investigado la
posibleactividad inhibidora de la ECA de los péptidos generados en la digestión de las proteinas del
músculo esquelético del cerdo por acción de las
enzimas gastrointestinales. El proceso de digestión
fue simulado in vitro usando pepsina y pancreatina
173
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
de manera secuencial. El hidrolizado obtenido fue
posteriormente analizado mediante nanoLC-ESIMS/MS utilizando un sistema Ultimate nano-LC
acoplado a una fuente de iones nanoelectrospray y
un espectrómetro de masas cuadrupolo-tiempo de
vuelo (Q-TOF) QSTAR XL. Todos los espectros
MS/MS fueron interpretados utilizando los algoritmos MASCOT y Paragon. De este modo se lograron
LGHQWL¿FDUXQDEXHQDSDUWHGHORVSpSWLGRVSUHVHQWHV
en el hidrolizado; sin embargo, sólo aquellos con los
requerimientos de tamaño y estructura adecuados
para ser potenciales inhibidores de la ECA fueron
sintetizados. La actividad inhibidora de la ECA de
los péptidos sintetizados se realizó según el método
desarrollado por Sentandreu y Toldrá [3].
/RV SpSWLGRV TXH VH LGHQWL¿FDURQ HQ HO KLGURlizado y fueron posteriormente sintetizados para
conocer su capacidad de inhibir la actividad ECA
se muestran en la Tabla 1. A modo de ejemplo, en la
Figura 1 se muestra el espectro de MS/MS correspondiente al péptido KAPVA.
Este pentapéptido mostró la mayor inhibición
de la actividad ECA con un valor de IC50 de 46.56
µM. KAPVA contiene una alanina en posición Cterminal. Éste amino ácido parece desempeñar un
papel importante en su unión con la ECA [4]. La
presencia de prolina en la antepenúltima posición
del extremo C-terminal también parece promover
la unión del péptido con la enzima [5]. Por su parte,
el péptido PTPVP también mostró una notable inhibición de la ECA, con un valor de IC50 de 256.41
µM. Éste péptido contiene un residuo de prolina
en último y antepenúltimo lugar (Tabla 1). El resto de secuencias ensayadas mostraron moderada
inhibición de la ECA. Se sabe que los péptidos de
pequeño tamaño presentan una mayor facilidad para
ser absorbidos en el tracto intestinal que los péptidos grandes [6]. Además, los péptidos que contienen prolina son generalmente más resistentes a la
digestión enzimática [7]. En consecuencia, cabe
esperar que los pentapéptidos KAPVA y PTPVP que
mostraron una notable inhibición de la ECA y que
además contienen residuos de prolina en sus secuencias, puedan mostrar una actividad antihipertensiva
in vivo [8]. Los resultados obtenidos sugieren que
ODGLJHVWLyQ¿VLROyJLFDGHODVSURWHtQDVGHODFDUQH
de cerdo puede promover la generación de péptidos
bioactivos, apoyando la idea de que la carne de
cerdo puede ser una buena fuente de constituyentes
saludables. No obstante, son necesarios estudios in
YLYR SDUD GHPRVWUDU VL ORV SpSWLGRV LGHQWL¿FDGRV
pueden ejercer una acción antihipertensiva real.
Agradecimientos
Figura 1. Espectro MS/MS del ion 527.321+ obtenido del
análisis del hidrolizado de cerdo mediante nanoLC-ESI-MS/
MS. Se muestran los iones y y b encontrados por MASCOT
(resaltados en negrita).
Damos las gracias al Centro de Investigación
Príncipe Felipe (CIPF) Proteomics core facility
(miembro de Proteored), y en especial a Luz Valero, por su valiosa contribución en el análisis de
espectrometría de masas.
174
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Tabla 1. ,GHQWL¿FDFLyQGHSpSWLGRVSUHVHQWHVHQHOKLGUROL]DGRGHSURWHtQDVPHGLDQWHQDQR/&(6,0606REWHQLGRSRU
digestión enzimática de la carne de la carne de cerdo. La actividad inhibidora in vitro de la ECA está expresada como IC50
(concentración de péptido necesaria para inhibir el 50% de la actividad ECA original).
tiempo
de
retención
masa calc
masa obs
secuencia
25,2
28,54
31,6
35,43
36,01
36,89
47,18
59,06
60,35
64,87
589,29
445,26
526,31
509,28
519,27
526,32
650,32
569,34
603,35
569,34
589,96
446,26
527,32
511,33
520,28
527,32
651,33
570,35
604,36
570,36
MMVPI
IGGSI
KAPVA
PTPVP
YPGIA
NIIPA
MYPGIA
VIPEL
INDPF
VLPEI
proteína origen de cerdo
(NCBI accesion no. )
cytocromo P450 3A46 (NP001128296)
beta-actina (ABI29185)
titina (XP001925902)
titina (XP001925902)
beta-actina (ABI29185)
GAPDHb (ABI29187)
beta-actina (ABI29185)
GAPDH (ABI29187)
GAPDH (ABI29187)
titina (XP001925902)
posición
394-398
343-347
4784-4788
4216-4220
308-312
203-207
307-312
218-222
31-35
4316-4320
IC50
(µM)
>1000
n.aa
46,56
256,41
n.a
>1000
641,02
799,24
n.a
>1000
Actividad inhibidora de la ECA no encontrada. bGliceraldehido 3-fosfato dehidrogenasa
a
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175
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Péptidos derivados de la troponina T generados en jamón curado
Leticia Mora, Miguel Angel Sentandreu, Fidel Toldrá
Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), Apartado de correos 73, 46100, Burjassot,
Valencia, España
Resumen
/DWURSRQLQD7HVXQDSURWHtQDPLR¿EULODUSUHsente en el músculo estriado con importantes funciones estructurales y reguladoras. Esta proteína
se degrada fácilmente durante el condicionamiento
post-mortem de la carne aunque todavía se desconocen los detalles de su degradación y la secuencia
de los péptidos generados en procesos más largos
como el curado del jamón.
La degradación de la troponina T (TnT) se ha
correlacionado positivamente con el ablandamiento
post-mortem de la carne [1], relacionándola también
FRQODFDOLGDG¿QDOGHODPLVPD>@/RVFDPELRV
que sufren las proteínas musculares durante el procesado del jamón curado han sido ampliamente estudiados, observándose cambios en proteínas estructurales como la TnT [4]. La hidrólisis observada en
las proteínas estructurales ayudan a entender como
VHJHQHUDODWH[WXUD\HOÀDYRUWtSLFRHQHOMDPyQ
FXUDGR (Q HVWH WUDEDMR KD VLGR SRVLEOH LGHQWL¿FDU
cuatro péptidos generados a partir de la proteolisis
de la TnT durante el curado del jamón haciendo uso
de la tecnología proteómica.
Se tomaron 50 g de músculo Biceps femoris de
una pieza de jamón curado para realizar una extracción y posterior desproteinización, obteniendo un
extracto de péptidos. Parte del extracto obtenido (5
mL) se fraccionó por medio de cromatografía de exclusión molecular en una columna Sephadex G-25.
Las fracciones correspondientes a un mayor tamaño molecular se concentraron e inyectaron en un
sistema de cromatografía líquida de alta resolución
equipado con una columna Symmetry C18 (250 x
4.6 mm) y un colector de fracciones automático. Las
fracciones obtenidas después de esta cromatografía
se analizaron posteriormente en un espectrómetro
de masas MALDI-TOF/TOF empleando el ácido
α-ciano-4-hidroxicinámico como matriz. La inter-
pretación de los espectros se realizó utilizando el
algoritmo MASCOT y la base de datos NCBInr.
De los resultados obtenidos se evidencia la intensa degradación proteica que tiene lugar durante
la elaboración de jamón curado. La Figura 1 muestra
el espectro de masas MALDI-TOF de la fracción
eluida a una concentración del 20% de acetonitrilo
en la cromatografía de fase reversa. El espectro de
masas muestra las masas moleculares de los iones monocargados ([M + H]+) 2811.42, 2690.42,
\ORVFXDOHVVHLGHQWL¿FDURQFRPR
los péptidos 1, 2, 3, y 4. En la Tabla 1 se muestran
las secuencias de los cuatro fragmentos de TnT idenWL¿FDGRVDSDUWLUGHORVHVSHFWURV0606REWHQLGRV
por espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF a
partir de las fracciones de jamón curado.
Figura 1. Espectro de masas MALDI-TOF obtenido a partir
de la fracción eluída al 20% de acetonitrilo en cromatografía de fase-reversa.
Las calpaínas (EC 3.4.22.17) participan en la
proteolisis del músculo post-mortem principalmente
durante la primera etapa del proceso de curado debido a su baja estabilidad en presencia de elevadas
concentraciones de sal y pH ácidos, tal como ocurre
en las etapas posteriores del curado. De acuerdo con
los resultados obtenidos por algunos autores tras
incubar TnT de músculo esquelético de conejo bajo
condiciones de baja temperatura y alta fuerza iónica
[5], la enzima µ-calpaina podría ser la responsable
del sitio de corte Leu81-Met82, correspondiente al
176
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Table 1. 6HFXHQFLDVGHORVIUDJPHQWRVGH7Q7LGHQWL¿FDGRVQMDPyQFXUDGRXWLOL]DQGRHVSHFWURPHWUtDGHPDVDV0$/',
TOF/TOF.
Péptido Masa observada (Da)
1
2912.48
2
2811.42
3
2643.37
4
2515.27
Residuo en P1
56
L
T
59
P
60
K
57
57
H[WUHPR &WHUPLQDO GH ORV SpSWLGRV LGHQWL¿FDGRV
en el presente estudio (Tabla 1). Sin embargo, aunTXH HVWRV DXWRUHV WDPELpQ LGHQWL¿FDURQ HO VLWLR GH
corte Thr57-Ala58, no podemos asegurar que esta
enzima sea la responsable del extremo N-terminal
del péptido 2, ya que este mismo péptido también
KDVLGRLGHQWL¿FDGRFRQXQDWKUHRQLQDDGLFLRQDOHQ
el extremo N-terminal (péptido 1, Tabla 1), lo que
sugiere una posible acción de las aminopeptidasas
en la generación de este sitio de corte. El efecto de
la m-calpaína en músculo de cerdo ha sido también
HVWXGLDGR LQ YLWUR > @ FRQ¿UPDQGR HO VLWLR GH
corte Thr57-Ala58.
(VWH HVWXGLR SRQH GH PDQL¿HVWR OD UHOHYDQFLD
que pueden tener las calpaínas en la hidrólisis de la
TnT durante el curado del jamón. De hecho, parte
GH ORV UHVXOWDGRV REWHQLGRV FRQ¿UPDQ DOJXQRV GH
ORV VLWLRV GH FRUWH SUHYLDPHQWH LGHQWL¿FDGRV SRU
otros autores.
Secuencia Identificada
TAPKIPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL
81
APKIPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL
60
81
KIPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL
61
81
IPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL
58
Referencias
>@
2OVRQ'*3DUULVK)&'D\WRQ:5*ROO
D. E. Effect of Postmortem Storage and Calcium
$FWLYDWHG)DFWRURQ0\R¿EULOODU3URWHLQVRI%R-
Residuo en P'1
82
M
82
M
82
M
82
M
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>@
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amino acid sequences of troponin T fragments,
including 30 kDa one, produced during postmortem aging of bovine longissimus muscle. Meat
Science 2004; 67: 19-24.
Agradecimientos
Beca FPU del Ministerio de Educación y Ciencia
(España), beca AGL2007-65379-C02-01/ALI del Ministerio de Educación y Ciencia (España) y FEDER.
Especialmente al Servicio de Proteómica del Centro
de Investigación Príncipe Felipe (CIPF) por su contribución al análisis por MALDI-TOF/TOF.
81
177
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Instrucciones a los autores
http://www.cbm.uam.es/seprot/
Envío de los manuscritos: Mediante correo electrónico [email protected]
ProteómicaHVODUHYLVWDR¿FLDOGHOD6RFLHGDG(VSDxRODGH3URWHyPLFD6XSHULRGLFLGDGVHUiVHPHVWUDOHQHro-febrero y julio-septiembre) y será publicada por el Servicio de Publicaciones de la Universidad de Córdoba.
Esta revista publicará artículos originales y comuQLFDFLRQHVEUHYHVGHFRQWHQLGRFLHQWt¿FRRWpFQLFR
así como artículos de revisión, tutoriales y opiniones,
notas, resúmenes de tesis doctorales o comentarios
sobre cualquier aspecto relacionado con la proteómica. Incluirá información sobre nuestra Sociedad y
sobre los socios, grupos e instituciones que la componen. El idioma será el castellano, aunque se admitirán
contribuciones en otras lenguas, preferentemente el
inglés. Aunque Proteómica se distribuirá preferentemente en España y Latinoamérica, pretende tener un
carácter internacional, extendiendo su distribución a
otros países. Esta revista se envía, sin coste alguno, a
los socios de la SEProt, a Unidades y Servicios que
trabajen en este campo, y a instituciones y organizaciones públicas o privadas vinculadas a la sociedad o
con actividad relevante en el campo de la proteómica.
Existirá una versión impresa, editada por el Servicio
de Publicaciones de la UCO, y una versión “on-line”
que aparecerá en la página web de la SEProt y de la
Universidad de Córdoba.
Todas las contribuciones serán revisadas por el
comité editorial, y su formato deberá ajustarse a las
instrucciones que se adjuntan. Los artículos originales, las comunicaciones breves, las revisiones y los
WXWRULDOHVVHUiQHYDOXDGRVFLHQWt¿FDPHQWHSRUXQRR
dos revisores elegidos por el comité editorial. Todas
ODVFRQWULEXFLRQHVUHÀHMDQODRSLQLyQGHVXVDXWRUHV
y no necesariamente la opinión del Comité Editorial
ni de la Junta Directiva de la SEProt.
Los manuscritos se enviarán por correo electrónico, a la dirección [email protected] Los artículos
originales, las revisiones y los tutoriales deberán
ir acompañados de una carta de presentación del
trabajo (cover letter) y tendrán una extensión máxima de 15 páginas A4; las comunicaciones breves
también deberán incluir una carta de presentación y
tendrán una extensión máxima de 8 páginas A4. Los
resúmenes de las Tesis Doctorales pretenden ser una
forma de comunicar el trabajo realizado durante el
periodo doctoral, a la vez que os ayudará a daros a
conocer, por lo que el resumen debe de ir acompañaGRGHXQDSHTXHxDUHVHxDELEOLRJUi¿FDGHOJUXSRGH
investigación. La extensión no debe de ser superior
a 4 páginas. El resto de las contribuciones tendrá
una extensión máxima de 4 páginas. Para el cálculo
de la extensión se tendrán en cuenta, además del
WH[WRODV¿JXUDVODVWDEODVODVLOXVWUDFLRQHV\ODV
referencias. No se considera la publicación en color
en la versión impresa, por lo que las ilustraciones,
IRWRJUDItDV\JUi¿FRVDSDUHFHUiQHQEODQFR\QHJUR
Deberán enviarse, en archivos separados, por una
SDUWHHOWH[WR\ODVWDEODVSUHIHUHQWHPHQWHHQ:RUG
\ SRU RWUD ODV ¿JXUDV HQ IRUPDWR SGI D GSLGHUHVROXFLyQ\DOWDPDxRGHLPSUHVLyQ¿QDO
/RV DXWRUHV GHEHUiQ YHUL¿FDU TXH ORV GHWDOOHV GH
ODV¿JXUDVVHLPSULPHQDSDUWLUGHORV¿FKHURVFRQ
la calidad requerida y que el texto que incluyan las
¿JXUDVVHDOHJLEOHDOWDPDxRGHUHSURGXFFLyQ¿QDO
/DVWDEODV\OH\HQGDVGH¿JXUDVGHEHQLUDO¿QDOGHO
texto. El texto debe ajustarse al siguiente formato:
letra Times New Roman, tamaño 12, doble espacio,
SiJLQDV\OtQHDVQXPHUDGDVMXVWL¿FDFLyQWRWDO
Los artículos originales deben tener las siguientes secciones:
Portada. Incluirá el título, la lista de autores
QRPEUH\DSHOOLGRV\VX¿OLDFLyQ\ORVGDWRV
completos del autor con el que se mantendrá la
FRUUHVSRQGHQFLD/D¿OLDFLyQGHORVDXWRUHVHQ
el caso de que exista más de una, se indicará
mediante un símbolo en formato superíndice
detrás del nombre de cada autor.
Resumen (máximo de 250 palabras) y palabras
clave (máximo de 6, separadas por comas).
Introducción. Deberá evitarse una revisión dePDVLDGR H[WHQVD GHO WHPD \ GHEHUi MXVWL¿FDU
adecuadamente el contenido del trabajo.
178
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
Materiales y métodos. Esta sección deberá ser
breve, limitándose a describir los procedimientos
que sean novedosos y referenciando aquellos ya
GHVFULWRV/DVGHVFULSFLRQHVWHQGUiQHOVX¿FLHQWH
detalle para permitir la repetición de los experimentos.
[4]
Kyte J. Mechanism in Protein Chemistry, Garland Publishing, Inc., 1995.
[5]
Castillejo MA. Análisis de los cambios de expresión producidos por un inhibidor de quinasas en
células endoteliales. Tesis Doctoral, Universidad
de Córdoba, 2005.
Resultados.
Con objeto de facilitar la edición de los manuscritos
VHKDSUHSDUDGRXQ¿FKHURGHHVWLORSDUDHOSURJUDPD
EndNote denominado Proteomica.ens, accesible desde
QXHVWUDSiJLQDZHE3DUDSRGHUXVDUHVWH¿FKHURKD\
que colocarlo en el subdirectorio Styles del EndNote.
Discusión. Los Resultados y la Discusión podrán agruparse en una única sección.
Referencias.
Agradecimientos.
Las abreviaturas se incluirán como nota al pié
de página la primera vez que aparezcan en el texto.
Como norma general, no deben incluírse abreviaturas ni en el título ni en el resumen.
(OVLVWHPDGHFLWDVELEOLRJUi¿FDV\UHIHUHQFLDV
a partir del número 3 de la revista, será un formato
basado en la revista Journal of Proteomics. Las referencias se citarán en el texto mediante números entre
corchetes cuadrados de acuerdo a su orden de citación: cita simple[1], cita de varias referencias[2-4],
cita de referencias alternadas[1, 3-5]. Todas las referencias deben ser numeradas de forma consecutiva.
Las referencias a trabajos que no hayan sido publicados no se incluirán en la sección de Referencias;
dichos trabajos deberán citarse, en el texto y entre
paréntesis de acuerdo al siguiente formato: (Corrales F, Jorrín J, resultados no publicados), (Corrales
F, Jorrín J, manuscrito enviado), (Jorrín J, Corrales
F, comunicación personal).
Las publicaciones serán citadas en la sección
de Referencias según su orden de aparición y de
acuerdo a los siguientes ejemplos:
>@
6WRUH\-'\7LEVKLUDQL56WDWLVWLFDOVLJQL¿FDQFH
for genomewide studies. Proc Natl Acad Sci U
S A 2003;100:9440-5.
[2]
Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I, Kristensen
DB, Steen H, Pandey A, et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a
simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics 2002;1:376-86.
>@
6WXOWV-7+HQ]HO:-:RQJ6&\:DWDQDEH&
,GHQWL¿FDWLRQRI(OHFWUREORWWHG3URWHLQVE\3HStide Mass Searching of a Sequence Database en
Mass Spectrometry in the Biological Sciences
(editores: Burlingame A.L. y Carr S.A.), Humana
Press, Totowa, New Jersey 1996, pp. 151-70.
/DVWDEODV\¿JXUDVOOHYDUiQQXPHUDFLyQDUiELFD
y se citarán en el texto en el siguiente formato: taEOD¿JXUD/DVWDEODVGHEHUiQOOHYDUXQWtWXOR\
podrán incluir notas a pie de tabla, que se referirán
al contenido de la tabla usando símbolos en formato
VXSHUtQGLFH 7RGDV ODV ¿JXUDV GHEHUiQ OOHYDU XQD
leyenda conteniendo un titulo lo más representativo
SRVLEOHGHOFRQWHQLGRGHOD¿JXUDHQQHJULWD\XQ
texto explicativo lo más conciso posible; la descripFLyQGHWDOODGDRODLQWHUSUHWDFLyQGHOD¿JXUDHQVX
caso, deberá hacerse en el texto del manuscrito.
Las comunicaciones breves deben ajustarse al
mismo formato que los artículos originales, y contendrán un resumen (máximo 250 palabras), una lista de
palabras clave (máximo de 6, separadas por comas),
una única sección conteniendo el texto principal,
y las referencias y agradecimientos, además de las
WDEODV\¿JXUDV(OWH[WRSULQFLSDOGHEHUiLQWURGXFLU
adecuadamente el tema, explicar la metodología utilizada, y comentar y discutir los resultados.
Los artículos de revisión y los tutoriales tendrán
un formato libre pero deberán incluír un Resumen
(máximo 250 palabras) y una lista de palabras clave
(máximo de 6, separadas por comas). El resto de
las contribuciones tendrá un formato libre. Todas
las contribuciones deberán respetar el formato de
ORVDUWtFXORVRULJLQDOHVHQFXDQWRDWDEODV¿JXUDV
abreviaturas y referencias.
Los resúmenes de las Tesis Doctorales incluirán
los siguientes apartados: título de la tesis, autor,
GLUHFWRUHV \ D¿OLDFLyQ IHFKD \ OXJDU GH OHFWXUD
dirección web donde se puede consultar la tesis
completa, si existe, resumen del trabajo (este apartado puede organizarse según el criterio del autor),
XQD¿JXUDRHVTXHPDTXHLOXVWUHORVGDWRVDSRUWDGRV
en la tesis, bibliografía, reseña del grupo de investigación en el que se ha realizado el trabajo (máximo
200 palabras). Se puede incluir una foto del grupo.