Vacunas orales

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Vacunas orales

Vacunas orales : Eficiencia de incorporación
en los alimentos y resultados en ISA Y SRS
Sandra Arcos Peña.
Medico Veterinario-Ingeniero Acuícola
Laboratorio Centrovet
32 Años
“Laboratorio Centrovet”.
Empresa nacional, que desde
1979 se dedica a la investigación, desarrollo y producción en salud animal.
Número de registros por empresas
productoras de vacunas
Empresa Proveedora
Preparación antigénica registradas
Agrovet Ltda.
5
Bayer S.A.
2
Centrovet Ltda.
12
Intervet Chile Ltda.
2
Laboratorios Recalcine S.A.
3
Novartis Chile S.A.
10
Pharmaq AS Chile Ltda.
6
Schering Plough Cía. Ltda.
5
Veterquímica S.A.
2
TOTAL GENERAL
45
Planta de producción de vacunas
-18 profesionales y técnicos.
- Fabricación de acuerdo a
GMP e ISO9001:2008
Capacidad de producción
mes:
-28-30 millones de dosis
vacunas inyectables.
-25 millones de dosis de
vacunas orales.
Vacunas orales registradas (SAG) por
CENTROVET
• Vacuna contra p.salmonis, polvo
liofilizado oral: marzo 2009.
Reg. SAG N° 2027 BP
•Vacuna subunitaria contra ISA, polvo
liofilizado oral : Diciembre 2009
Reg SAG N° 2063 BP
•Próximamente: oral SRS + ISA
IPN oral
Programa seguimiento inmunológico
Agua Dulce
Engorda
1.
Inmunidad Humoral (Títulos de
anticuerpos específicos)
2.
Inmunidad celular (Títulos de
Linfocitos T)
3.
Portación o infección del
patógeno
4.
Reacciones Adversas (RAM)
600 UTA APROX.
Resultado Curva Ac específicos contra P. salmonis-ISAv
Absorbancia 450 nm (UR)
1.40
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600
UTA post vacunación
El problema del booster inyectable
Infección vía de Inyección
Stress asociado al manejo
Ayuno prolongado
Tiempos de Faena
Inmunosupresión post inyección
COSTOS
Vacuna Oral
Los peces son capaces de
absorber y presentar antígeno
en el segundo segmento del
tracto intestinal.
Desventajas:
- Requiere que el pez “coma”
-Integridad del antígeno
- mantenga por un tpo mínimo
Ventajas:
-Ahorro inyección y efectos
relacionados
-Posibilidad de booster(s)
MicroMatrixTM
Sistema de Liberación en el sitio objetivo
MicroMatrix
Gastric Juice
Duodenal Juice
Bacterias/virus(inactivadas)
son encapsuladas en matrices
que las protegen activamente
del pH del estómago.
Estas
matrices
son
hidrolizadas lentamente una
vez que llegan al intestino,
liberando así los antígenos de
la vacuna.
Vacuna Oral contra P. salmonis/ISA
Construyendo la Matriz
1. Antígeno: Elemento que entrega inmunidad específica.
2. Inmunoestimulante y encapsulante: Atrayente de células inmunológicas
(Macrófagos y Linfocitos).
3. Cobertura adherente con elementos nutrientes para flora intestinal:
Liberan el antígeno a la vez que se enriquece la flora intestinal, como se
adhiere, esto ocurre a medida que pasa el tiempo en la mucosa.
4. Cobertor de pH: Moléculas inertes, en presencia de ácido protegen
cualquier elemento que contengan.
MicroMatrixTM
-Dosis: 6 mg de vacuna diaria, durante 10
días. Adsorbida en el alimento.
-La dosis de antígeno diaria es equivalente
al de una inyección.
La Vacuna es
agregada en el
alimento y luego
entregada como
alimento normal
MicroMatrixTM
La Vacuna es Liberada en
el Intestino distal
SRS-MM no es afectada por
El ácido estomacal
Vacuna oral SRS
Estudios en condiciones
controladas
Estudios de primovacunación
-Salmón del Atlántico, 30 gramos de peso.
-Dosis: 6 mg de vacuna diaria, durante 10 días. Adsorbida en el alimento.
-La dosis de antígeno diaria es equivalente al de una inyección.
-Evaluación de
parámetros
inmunológicos y
sobrevivencia al desafío.
Inducción de la respuesta inmune
humoral
Título de anticuerpos Intestinales
Anticuerpos anti-P.salmonis
0.8
0.28
Oral-SRS
Control
Inyectable-SRS
Oral-SRS
0.26
Control
0.24
Inyectable-SRS
Tobar y cols., Vaccine, 2011
13
70
13
70
94
8
61
5
0.0
94
8
0.2
61
5
0.4
0.22
0.20
0.18
0.16
0.14
0.12
0.10
9
24 8
347
7
0.6
9
24 8
347
7
Título de anticuerpos sistémicos
La vacuna SRS-Oral entrega protección eficaz desde
las 300 UTA post vacunación.
% Sobrevivencia
120
100
80
Control
SRS-Oral
60
SRS-Inyectable
40
SRS libre
20
0
0
10
20
30
40
Días post desafío
50
60
Esta protección se mantiene al menos hasta las 600
UTA post vacunación.
% Sobrevivencia
120
100
80
Control
SRS-Oral
60
SRS-Inyectable
40
SRS libre
20
0
0
10
20
30
40
Días post desafío
50
60
La vacuna oral contra SRS no afecta la ganancia de
peso en peces vacunados
120
SRS-Oral
Peso (g)
100
SRS-Inyectable
Control
80
60
40
20
0
610
948
1370
Ensayo de eficacia en
Booster oral SRS
1200
Primer desafío 300 UTA post booster
(1500 UTA totales)
% Sobrevivencia
120
1500 (300 UTA)
100
Control
80
Booster
60
40
20
20
30
40
50
Días post desafío
60
70
Segundo desafío 600 UTA post booster
(1800 UTA totales)
% Sobrevivencia
120
1800 (600 UTA)
100
Control
80
Booster
60
40
20
20
30
40
50
Días post desafío
60
70
Curva de anticuerpos (Ig M anti p.salmonis)
Anticuerpos sistémicos
intestinales
0.35
0.30
Control
Booster 10d
Booster 30d
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
70
0
42
0
0.00
0
98
19
6
29
4
70
0
42
0
Control
Booster 10d
Booster 30d
0.65
0.60
0.55
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
0
98
19
6
29
4
Anticuerpos sistémicos
Vacuna oral SRS
Estudios en condiciones de
cultivo
Incorporación al vacío
Top coating
Vacunas Inyectables y oral aplicadas. 2010
3%
3% 2% 1%
SRS/ISA oral
4%
IPN+SRS
6%
IPN+SRS+Vo
19%
62%
SRS Inyectable
IPN Inyectable
Distribución de aplicaciones de vacuna
oral SRS según especie. Año 2010
trucha
37,9%
Salar
23,6%
coho
38,4%
oral SRS según tipo de agua en vacunación. 2010
Piscicultura
11%
Estuario
20%
Mar
69%
oral SRS según estrategia de Vacunación. 2010
Booster a i.p.
1%
Primovacunación (30 gs)
11%
primovacunación (800 grs)
88%
Vacuna utilizada en primovacunación
con boosters Oral SRS Centrovet. 2010
Centrovet
40%
Otros
Laboratorios
60%
En salmones, no existe una evidencia directa acerca de potenciales
diferencias en la respuesta cuando el booster es SIMILAR al primer
antígeno (Caso Otros Laboratorios) o IDÉNTICO al primer antígeno
(aso Centrovet)
Brotes SRS en el período y grupos
analizados durante 2010
Con Brote
20%
Sin Brote
80%
La presencia de brote no significa ineficiencia de la vacuna:
- Mortalidades bajas (menores o iguales al RPS)
- Manifestación del brote fuera del período de protección
Distribución causa de mortalidad
>2000 UTA
(Estuario)
20%
> 2000
UTA (Mar)
6%
Sin Vacuna
4%
Estuario
70%
La entrega tardía del Booster (en condiciones de bajo título de
anticuerpos) se correlaciona con signología o brote SRS.
Vacuna liofilizada
oral contra ISAv
Vacuna contra ISAv
La estrategia de formular una vacuna virina es compleja a escala industrial :
→ Células hospederas de crecimiento lento
→ Titulo viral bajo: entre 105 y 106; otros labs 108
• Estrategia: Generación de proteínas de superficie del V similares a las
presentes en el virus, en forma Libre y NATIVA
Hemaglutinina
Matriz
Material genético
Proteína de
fusión (NA)
Virus ISA
Vacuna
Beneficio: concentración de proteínas específicas (y necesarias) mucho mayores,
optimizando los boosters de primovacunaciones. Equivalente a 1011 partículas virales.
→ No contiene material genético por lo que no es detectada por métodos de diagnóstico
como el RT-PCR.
Estudios de
Eficacia Vacuna
oral contra ISAv
Vacuna ISA
Concentraciones antigénicas por ml de vacuna en cada
uno de las series pilotos:
Lotes
Antígeno Hemaglutinina/ml
vacuna
Antígeno Neurominidasa/ml
vacuna
Lote 1
6 ug
6 ug
Lote 2
7,5 ug
7,5 ug
Lote 3
9 ug
9 ug
Mortalidad acumulada al ser desafiados
310 UTA post vacunación ISA oral
Mortalidad Vacuna Experimental ISA Oral
310 UTA Post vacunación
Mortalidad Acumulada (%)
100
80
Control
60
VEX ISAVO-200209
VEX ISAVO-230209
40
VEX ISAVO-260209
20
0
0
10
20
30
40
Días post-desafío
50
60
70
100
80
Control
60
VEX ISAVO-200209
VEX ISAVO-230209
40
VEX ISAVO-260209
20
0
0
10
20
30
40
Días post-desafío
50
60
70
100
80
Control
60
VEX ISAVO-200209
VEX ISAVO-230209
40
VEX ISAVO-260209
20
0
0
10
20
30
40
Días post-desafío
50
60
70
Estudios de Eficacia vacuna ISA oral
Mortalidad (%)
Mortalidad acumulada específica post desafío con ISAv
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Serie IO-21220901
Serie IO-22270901
Serie IO-23030901
Grupo Control
1
4
7
10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52
Días post desafío
Grupo
Porcentaje de mortalidad
RPS60
RPS
acumulada
IA – 46120801
19
79
77
IA – 46130801
15
87
82
IA – 46140801
17
82
80
Pesos promedio peces vacunados (ISA oral) y no
desafiados en cada serie mas el grupo control en cada uno
de los tres desafíos (310, 650, y 830 UTA post vacunación).
Peso previo al desafío
25
15
10
5
310 UTA
650 UTA
830 UTA
Control
VEX ISAVO-260209
VEX ISAVO-230209
VEX ISAVO-200209
Control
VEX ISAVO-260209
VEX ISAVO-230209
VEX ISAVO-200209
Control
VEX ISAVO-260209
VEX ISAVO-230209
0
VEX ISAVO-200209
Gramos
20
Estudios de estabilidad de la vacuna
formulada en alimento
Figura 1. Gráfico de mortalidad acumulada post desafío del grupo de peces
vacunados con tres series piloto de vacuna inactivada oral contra ISA,
mezclada con el alimento y mantenida por 30 días a 25 C, y el grupo control
sin vacunar.
Figura 2. Mortalidad acumulada post desafío en un grupo control sin vacunar
y en las tres series piloto de vacuna inactivada oral contra ISAv, formulada y
utilizada inmediatamente después de producida la vacuna.
Tabla 2. Tabla de contingencia para los alores de RPS60 de cada lote de vacuna al vacunar peces con alimento formulado y
utilizado inmediatamente (No incubada) o con alimento formulado y utilizado 30 días después de la formulación (Incubada).
Serie
IO-21220901
IO-22270901
IO-23030901
RPS Clásico
Incubada
79
87
82
No incubada
81
82
84
Estudios de primo vacunación oral contra
ISAv
primovacunación+ booster oral ISA
-Evaluación de sobrevivencia
al desafío.
Curva de mortalidad acumulada en peces control y vacunados contra
ISA
Booster: 1600 UTA; Desafío: 2500 UTA
100
80
85%
Control
60
Vacunado
60%
40
20
20%
0
0
10
20
30
40
50
Días post desafío
2500 UTA
1600 UTA
900
Vacunado +
Booster
Estudios de terreno:
Resumen de vacunaciones
aplicadas 2009 - 2010
ISA según estrategia de Vacunación.
Año 2010
Con booster
27%
Sin booster
73%
ISA inyectable entregada.
Año 2009-2010
Con booster,
18%
Sin booster,
82%
Vacuna utilizada en primovacunación
con boosters Oral ISA Centrovet
Centrovet
25%
Otros
laboratorios
75%
El Booster oral recupera los niveles protectores de
anticuerpos específicos anti p.salmonis e ISA
IgM anti-SRS/ISA
muestreos vacuna+ Booster oral
IgM anti-SRS/ISA
muestreo Vacuna inyectable
1.5
Ventana de
susceptibilidad
2
1
3
1.0
Booster oral
0.5
0
35
63
26
22
20
39
14
66
10
83
28
8
60
0
17
9
60
0
91
0
12
00
17
70
20
66
25
79
32
70
34
60
36
60
38
89
0.0
0
0
4
Cinética de IgM desde la vacunación
Cinética curva anticuerpos vacuna
IgM anti-P.salmonis
inyectable
M uestreos
vacuna SRS Centrovet
Cinética curva anticuerpos vacuna
oral
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
.2
.2
20
53
.7
19
43
.1
16
17
12
69
93
1
6
3
68
9.
6
46
0.
0
0.0
24
6.
1.6
PDI: 600
PDI: 300
Esquema vacunación sugerida
900-1000 pb
UTA
1000
1700-1800
2600
engorda
600 UTA
1.40
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
0
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600
VACUNA LIOFILIZADA ORAL
Vía alimento
Respuesta inmune adquirida
También llamada “adaptativa” ó “adaptable”
Mecanismo de defensa específico, donde participan diferentes tipos de
células.
Linfocitos B
(Inmunidad Humoral)
CD8+
CD4+
Linfocitos T
(Inmunidad celular)
Célula presentadora
de Antígeno
Hemaglutinina
HE
349-351
352-354
motivo
Poca
Virulencia
Media
Virulencia
Alta
Virulencia
Entendiendo las condiciones de éxito de
una VACUNA
Además de los requerimientos básicos de una vacuna (Título,
representatividad, rango de acción, y efectos adversos)
CD8
CD4
B
El cómo mantener este intermediario como un buen respondedor es lo que
marcará la diferencia al momento de evaluar una misma vacuna.
Estudios de Eficacia ISA inyectable
Grupo
RPS60
RPS
% Mortalidad Acumulada
Vacuna 1.1
75 %
72 %
22
Vacuna 1.2
79 %
84 %
13
Vacuna 1.3
82 %
86 %
11
Curva de mortalidad acumulada en peces control y vacunados contra
ISA
Desafío: 600 UTA
100
80%
80
60
Control
40
Vacunado
20%
20
0
0
10
20
30
Días post desafío
600 UTA
40
50
Incorporación al vacío
• Ingresa alimento extrusionado seco al aceitador al vacío,
previamente pesado y se le aplica vacío, esto es, se baja la
presión atmosférica dentro del aceitador a niveles de 70
milibar de presión.
• Se pesa el aceite de pescado según la fórmula en un estanque
utilizando un agitador y a una temperatura promedio de 30°C.
• A ese aceite se incorpora el medicamento previamente
pesado para el batch, y se mezcla por un tiempo no mayor a
de 5 minutos
• se aplica el aceite-medicamento al alimento extrusionado
seco.
• Una vez terminado el aceitado se abre la válvula de entrada
de aire para llegar a la presión atmosférica.
Top coating
• Ingresa a la línea medicados, alimento extruido (producto
terminado) que cumple las especificaciones de calidad
respectivas (proximales garantizados, % Flotación, % polvo y
partido, etc.) y previamente pesado.
• El producto se deposita en un mixer de mezclado; Mientras se
agita por 30 segundos, se incorpora el medicamento
previamente pesado para el batch.
• Se continúa la agitación del mixer por 150 segundos a
velocidad constante, mientras se agrega un 0,1% de de aceite
de pescado por aspersión, que formaran una película de
recubrimiento del pellet medicado
• Se descarga el batch para dar paso a la siguiente.
RPS y RPS 60 obtenidos en los desafíos realizados a peces
vacunados con las tres formulaciones experimentales de
vacuna ISAV a diferentes UTA post vacunación ISA oral
RPS60 Vacuna ISA Oral Experimental
100
100
80
80
VEX ISAVO-200209
60
VEX ISAVO-230209
40
RPS
RPS
RPS Vacuna ISA Oral Experimental
VEX ISAVO-200209
60
VEX ISAVO-230209
40
VEX ISAVO-260209
VEX ISAVO-260209
20
20
0
0
310
650
830
UTA post-vacunación al desafío
310
650
830
UTA post-vacunación al desafío
Crecimiento de P. salmonis para desarrollo
de una Vacuna
Crecimiento en línea de células embrionarias de
Salmón Chinook (CHSE-214)
Infección genera un efecto citopático que es total
alrededor de los 7 días
Los títulos bacterianos oscilan
entre 106 a 107 TCID50/ml de
cultivo
Crecimiento de P. salmonis en células Sf-21
Spodoptera frugiperda
Vacuna con mayor título SRS del mercado
108,47
Birkbeck et al. Infect Immun. 72:3693-3694. 2004.
Vacunas para peces registradas por
CENTROVET
•Monovalentes: IPN, SRS, VO, ISA
•Bivalente: SRS+IPN
IPN+VO
•Trivalente: SRS+IPN+VO
•Cuádruple: SRS+IPN+VO+AS
SRS+IPN+VO+ISA
•Quintuple: SRS+IPN+VO+Ae+ ISA
•Vacunas orales: Oral SRS, oral ISA
•Próximamente: oral SRS+ ISA
IPN oral; IPN inmersión
*Registro Enviado al SAG
Ensayo en “terreno”
• Piscicultura Isla Chiloé
•Vacunados con vacuna triple
• 100 Salmones por grupo, peso prom. 1 Kg
• Dos estrategias de vacunación:
•10 días seguidos
•10 días c/descanso por 2 días
• Booster 1200 UTA post vacunación
Grupos:
Control
MM1
MM1 por 10 días
Estructura del virus ISA
Proteína
Proteínade
defusión
fusión
(NE)
Hemaglutinina
1
2
3
4
5
6
7
8
PROTEINA
HA
• ISA pertenece a la familia
Orthomyxoviridae (influenza) del
género Isavirus
Matriz
RNAs
Membrana
lipídica
• El virus presenta una forma
esférica de 100-130 nm de
diámetro y posee una envoltura
lipídica
PROPIEDADES
1
PB2
Subunidad polimerasa
2
PB1
3
NP
Nucleoproteína
4
PA
5
F
Proteína de fusión
6
HE
Hemaglutinina esterasa
7
P32/NEP/p11
8
M1/p16
Proteína de matriz
• Su genoma esta compuesto por 8
RNAs de hebra simple negativo
Esquema vacunación (primovacunación oral-booster iny)
BOOSTER i.p
1700 pb
UTA
300
300 UTA
900
2100
2800
engorda
Booster oral : cada 900 UTA posterior a las 900 UTA post primo vacunación oral,
900 pb
3700

Vacunas orales

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