instituto politecnico nacional - Sección de Estudios de Posgrado e

instituto politecnico nacional - Sección de Estudios de Posgrado e

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERIA
MECANICA Y ELECTRICA
SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACION
“Detección de substancias a través de
fluorescencia inducida por láser”
TESIS
Que para obtener el Grado de:
MAESTRO EN CIENCIAS EN INGENIERIA ELECTRONICA
PRESENTA:
ING. ARTURO RONQUILLO ARVIZU
DIRECTOR DE TESIS:
Dr. José Manuel de la Rosa Vázquez
México, D. F. Junio del 2007.
RESUMEN
En este trabajo se mide la fluorescencia de diferentes substancias cuando se excitan con
radiación láser a una longitud de onda de 337.1 nm, y se aplica la técnica MLR
(Regresión Lineal Múltiple) del análisis multivariante con el fin de identificar y
cuantificar los componentes que conforman las substancias. Se midieron los espectros
de fluorescencia de jugos de cítricos puros y el espectro de fluorescencia de una mezcla
de estos, para determinar el porcentaje de cada uno de los jugos en la mezcla. Se
observa que aplicando la técnica MLR no es posible el cálculo del porcentaje de los
componentes cuando los espectros de los componentes son similares.
Por otra parte, se estudian espectros de fluorescencia de tequilas, que normalmente para
su estudio se requiere de evaporación, para determinar por medio de espectroscopia de
masas las partes que los componen, aunque no se pueda conocer la estructura molecular
del tequila. Este método resulta ser poco eficaz por requerir un elevado tiempo de
análisis o la necesidad de una manipulación intensiva de la muestra previa al análisis. A
través del análisis multivariante de componentes principales (ACP) realizado en este
trabajo se pudo clasificar a los diferentes tequilas y relacionar esto con su precio. El
mismo estudio es realizado para clasificar diferentes combustibles derivados del
petróleo. Finalmente se presentan espectros de cultivos celulares que permiten avanzar
en la detección de los componentes que intervienen en el cáncer en humanos.
.
ABSTRACT
In this work we measure the fluorescence of several substances when they are excited
with a laser radiation of 337.1 nm, and we applied the MLR (Multiple Linear
Regression) technique from the multivariant analysis to identify and to quantify the
components that custom the substance under study. The fluorescence spectra from citric
juices were measured as well as the fluorescence spectrum of a mix of the juices to
determine the percentage of each of the juices that conforms the mix. The results show
that the MLR technique does not allow to identifying the percentage of the compounds
when the spectrum of each of them are similar.
Also we studied the spectra of some tequilas, which normally must be separated by
evaporation to find out their components using mass spectrometry, albeit their
molecular structure can not be known. This method has a poor efficiency because it
requires a lot of time to analyze and an intensive manipulation technique for the tequila
under study. Trough the multivariable analysis of Principal Components (ACP) done in
this work was possible to classify the tequilas and relate this with their prices. The same
procedure was applied to classify petroleum compounds. Finally the fluorescence
spectra of cellular cultures are presented, which allows the advance in the detection of
the components in the human cancer.
Agradecimientos
Agradezco a Dios el haberme indicado el camino y el estar siempre
detrás de mi para iluminarme y poder seguir adelante, siempre me
encomendare a él y solicitare su ayuda para resolver mis problemas y como
siempre el los resolverá por mi y seguiré avanzando hasta donde el me
indique.
Agradezco a mis padres: Martín F. Ronquillo Nava y Evangelina
Arvizu Olvera, el haberme orientado por el camino del estudio, por
inculcarme el trabajo como principal herramienta en la vida y por
alentarme para continuar siempre en mis proyectos. Es principalmente a
ellos a quien debo el haberme formado como un hombre de bien, con los
estudios suficientes para abrirme camino en la vida y conocimientos
necesarios para poder enfrentar cualquier reto que se me presente. Mis
Padres con el simple hecho de verme saben lo que me hace falta, lo que
tengo o como estoy y de inmediato intervienen de mil formas para mejorar
la situación. Seria imposible el haber estudiado, e incluso mi vida seria
diferente y muy complicada si no los tuviera.
Gracias a mi esposa Leticia Margarita Calzada García Por su apoyo
incondicional. Es de valorar el enorme sacrificio de una mujer hacia un
hombre que lucha por salir adelante aun después de experimentar la
espera de meses y meses de una beca que parecía que no llegaba. Nunca
claudico ni titubeo, se mantuvo firme con el único propósito de salir
adelante como familia y creo que lo hemos logramos después de mas de 10
años. Ella ha sido el motor que me impulsa a superarme.
Agradezco, el apoyo de todos mis hermanos; Elizabeth, Martín,
Rodrigo, Rey David y Luz Maria, su apoyo y preocupación por mí, mi
familia y mis proyectos. Ellos han estado siempre compartiendo con migo
lo poco o mucho que Dios nos a dado.
Gracias al Dr. José Manuel De La Rosa
a quien admiro por su
dedicación y empeño en lograr sus proyectos a sabiendas de que son
difíciles y a veces casi imposibles, él por su experiencia y estudio logra
ver en los resultados de un análisis lo que los demás no vemos. Su
capacidad de visualizar los proyectos a futuro lo hace decidir si se llevan a
cabo o no.
Gracias al Dr. Francisco Gallegos Funes por su apoyo, comprensión,
confianza y la motivación que nos brinda a todos los estudiantes.
Gracias a todos mis profesores de maestría. Dr. Walter H. Fonseca, Dr.
Roberto Linares, Dr. Argeo Vázquez, Raúl Peña Rivero, M. en C.
Héctor Caltenco y Dr. Alexander Michtchenko. Ellos me transmitieron
muchos conocimientos mismos que llevare por siempre.
Gracias al M. en I. Fernando Macedo Chagolla por todo su apoyo y
confianza desde el primer día que lo conocí me ha brindado su amistad.
Gracias al Ing. Raúl Tecuapacho siempre me ha brindado su Amistad y
confianza, nunca me ha negado su apoyo.
Gracias a todos mis compañeros de maestría en el IPN, Eduardo
Cisneros, Jorge Corredor, David Diego, Javier Tenorio, Carlos Ortega,
Javier y todos los que me ofrecieron su amistad en mi estancia en IPN.
Gracias a la secretaria Mónica que sabe de nuestras necesidades como
estudiantes y que conciente o inconcientemente coopera en todo a nuestro
favor.
Gracias a la secretaria Lourdes que siempre me facilito todos los trámites
e incluso me busco para recordarme los pendientes. Y acepto todas mis
prorrogas que me permitieron inscribirme sin pagar inmediatamente la
inscripción.
Gracias a la UNAM FES Aragón que me formo con los principios de la
ingeniería Mecánica y todos los profesores que me transmitieron sus
conocimientos durante todo ese tiempo.
Gracias al IPN SEPI ESIME que me dio la oportunidad de aumentar mis
conocimientos en el área de ingeniería electrónica.
Sería insuficiente dos hojas para agradecer todo el apoyo que he recibido,
por todos los que me rodean. Estoy conciente de toda ayuda que he
recibido por familiares y amigos, y ninguna es mínima, antes bien muy
valiosa para mí.
INDICE
Resumen……………………………………………………………………….
Objetivo………………………………………………………………………..
Justificación…………………………………………………………………...
Índice de figuras………………………………………………………………
Índice de Tablas………………………………………………………………
Pág.
I
II
III
IV
V
Capitulo 1. Introducción
1.1 Radiación y técnicas espectroscópicas…………………………………..
1.2 Estados excitados………………………………………………………….
1.3 El fenómeno de fotoluminiscencia………………………………………...
1.4 Procesos de desactivación………………………………………………....
1.5 Propiedades del fenómeno de fluorescencia………………………………
1.6 Calibración multivariable………………………………………………….
1.6.1 Clasificación de los métodos de calibración multivariable………….
1.7 Métodos de reconocimiento de pautas…………………………………….
1.7.1 Métodos de reconocimiento de pautas no supervisados……………..
1.7.2 Métodos de reconocimiento de pautas supervisados………………..
Referencias del capitulo 1………………………………………………….
1
2
5
5
6
6
7
9
9
9
10
Capitulo 2 Arreglo experimental
2.1Fuentede excitación………………………………………………………...
2.2 Sistema óptico……………………………………………………………..
2.2.1 Divisor de haz………………………………………………………...
2.2.2 Enfoque de la radiación sobre la muestra……………………………
2.2.3 Concentración de la fluorescencia…………………………………...
2.3 Sistema espectrométrico…………………………………………………..
2.3.1 Fibra óptica…………………………………………………………...
2.3.2 Monocromador………………………………………………………..
2.3.3 Tubo fotomultiplicador (PMT)………………………………………
2.3.4 Configuración de conexión del tubo fotomultiplicador………………
2.4 Fotodiodo para muestreo de la radiación láser…………………………….
2.5 Registro de las señales de radiación láser y fluorescencia………………...
2.5.1 Interfase GPIB bajo la norma IEEE 488……………………………...
2.5.2 Tarjeta GPIB…………………………………………………………
2.6 Envío de señales del osciloscopio a la PC………………………………..
2.7 Control del monocromador……………………………………………….
Referencias del capitulo 2………………………………………………..
11
13
13
13
14
16
16
17
17
18
19
21
21
22
22
22
23
Capitulo 3 Mediciones
3.1 Fluorescencia del sistema………………………………………………….
3.2 Fluorescencia de diluyentes……………………………………………….
3.3 Fluorescencia de cítricos…………………………………………………..
3.4 Fluorescencia de tequilas………………………………………………….
3.5 Fluorescencia de células…………………………………………………...
3.6 Fluorescencia de hidrocarburos…………………………………………...
Capitulo 4
24
25
26
28
29
30
Análisis de datos multivariantes
4.1 Etapas del proceso de análisis de datos multivariantes……………………
4.2 Métodos en el análisis de datos multivariantes……………………………
4.2.1Análisis de componentes Principales (PCA)………………………….
4.2.1.1 Interpretación del PCA…………………………………………
4.2.2 Métodos de reconocimiento de pautas………………………………..
4.3 Análisis cuantitativo………………………………………………………
4.3.1 Clasificación de los métodos de calibración………………………….
4.3.2 Regresión lineal múltiple (MLR)…………………………………….
4.3.3 Regresión lineal múltiple Clásica (CLS)…………………………….
4.3.4 Regresión lineal múltiple Inversa (ILS)……………………………...
4.4 Análisis de los espectros obtenidos………………………………………..
4.4.1Análisis de componentes principales aplicado a espectros
de diferentes tequilas…………………………………………………………..
4.4.2 Regresión Lineal Múltiple aplicado a espectros de mezclas…………
32
34
34
34
36
37
37
38
38
41
42
Referencias del capitulo 4…………………………………………………………….
42
43
47
Conclusiones………………………………………………………………….
Recomendaciones para trabajo a futuro……………………………………….
Acrónimos……………………………………………………………………..
Apéndice A-1………………………………………………………………….
Apéndice A-2………………………………………………………………….
Apéndice A-3………………………………………………………………….
48
49
50
51
55
58
OBJETIVO
El objetivo general de la presente tesis de maestría ha sido la aplicación de
metodologías analíticas basadas en la combinación de medidas espectroscópicas de
fluorescencia inducida por láser con métodos quimiométricos de análisis multivariante.
Las aplicaciones desarrolladas están enfocadas a la determinación de diferentes
espectros de emisión de fluorescencia correspondientes a diferentes sustancias y algunas
mezclas de las mismas. El trabajo de análisis quimiométrico se planteo con dos
objetivos, por un lado la aplicación de métodos de reconocimiento de pautas no
supervisados para el reconocimiento de pautas y relaciones que ayuden a clasificar en
grupos los espectros de diferentes sustancias, por otro lado la aplicación de métodos de
reconocimiento de pautas supervisados para asignar un nuevo espectro al grupo
correcto.
JUSTIFICACION
Desde el punto de vista industrial y científico existe gran interés en el desarrollo de
metodologías analíticas que proporcionen de una gran cantidad de datos la mayor
cantidad de información, que esta sea de calidad y que además lo hagan en el menor
tiempo posible. Esta idea, que es aplicable a cualquier proceso natural, cobra especial
relevancia en sectores como la industria química, la biología y la medicina.
Los métodos de análisis utilizados en los laboratorios frecuentemente tienen ciertas
características que los hacen poco eficaces, como pueden ser un elevado tiempo de
análisis o la necesidad de una manipulación intensiva de la muestra previa al análisis.
Estas características hacen que sean métodos poco adecuadas para un control en línea
de los procesos industriales, el estudio de procesos dinámicos en la química o la
evaluación de una enfermedad.
Los avances instrumentales, la automatización y la incorporación de los ordenadores
en el control y adquisición de señales de instrumentos, permite obtener gran cantidad
de datos en tiempos muy cortos. Poder extraer la información útil de la que no lo es, y
ser capaz de interpretar los datos para que puedan ser utilizados y relacionados con el
parámetro a determinar, se convierte en una tarea compleja dado el gran volumen de
información. Esta problemática a propiciado el desarrollo de métodos quimiometricos
basados en la estadística multivariante, que permitan diseñar
o seleccionar
procedimientos de medida óptimos y obtener la máxima información relevante de los
datos obtenidos.
En base a los factores anteriores se desarrollo este trabajo, combinando las técnicas de
Fluorescencia Inducida por láser (LIF) y análisis de datos multivariables, para avanzar
en la creación de un sistema que permita obtener espectros de fluorescencia de
sustancias, al mismo tiempo que los interprete y entregue información concreta de
una determinada muestra. El objetivo es poder hacer estudios in vivo y in situ de
componentes químicos que representen algún problema de contaminación en diferentes
sustancias (p. ej. Agua u otra bebida), la aparición de células cancerosas en tejido
humano, la adulteración de combustibles o el envenenaamiento de alimentos, entre
otros.
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.1
Figura 1.2
Figura 2.1
Spín del electrón
Diagrama parcial de energía para un sistema fotoluminiscente
Figura 2.2
Diagrama eléctrico del láser de nitrógeno
12
Figura 2.3
Forma de los pulsos emitidos por el láser
12
Figura 2.4
Divisor de haz
13
Figura 2.5
Lente biconvexa para enfocar el haz en la muestra
14
Figura 2.6
Lentes esféricos BK7
14
Figura 2.7
Arreglo de los lentes para enfocar la mayor cantidad de fluorescencia posible en la fibra
Arreglo experimental
óptica
Figura 2.8
Cilindro donde se encuentran integrados el divisor de haz, la lente biconvexa y las
3
4
11
15
15
esferas concentradoras de fluorescencia a la fibra óptica
Figura 2.9
Grafica de los espectros de fluorescencia de dos mediciones con diferentes aberturas de
las rejillas del monocromador a 0.25 μm y 0.5μm
16
Figura 2.10
Principio básico del monocromador
17
Figura 2.11
Configuración para el control del alto voltaje del PMT
18
Figura 2.12
Relación entre los dos diferentes tipos de control del voltaje y el voltaje en el PMT
19
Figura 2.13
Respuesta espectral relativa del fotodetector MRD500
20
Figura 2.14
Circuito de polarización del detector MRD500
20
Figura 2.15
Diagrama de flujo para la obtención de espectros de emisión de fluorescencia
23
Figura 2.16
Interfase de usuario programado en LabView 6i
25
Figura 2.17
Mensaje de verificación de inicialización del monocromador
26
Figura 3.1
Fluorescencia de los tubos de ensayo utilizados cuando se excitan con radiación de 337.1
nm. Aquí se aprecia la radiación láser y su armónico, así como los picos de fluorescencia
24
de la fibra óptica
Figura 3.2
Ausencia de fluorescencia del agua potable cuando es excitada con radiación láser de
337.1 nm. Los picos representan la radiación láser y su armónico
Figura 3.3
Espectros de fluorescencia de los jugos de limón, mandarina y de la
mezcla de ambos
en la misma proporción cuando son excitados con radiación láser de 337.1 nm.
Figura. 3.4
Espectros de fluorescencia de los jugos de toronja, limón y de la mezcla de ambos en la
misma proporción.
25
26
27
Figura 3.5
Espectros de fluorescencia de los jugos de limón, mandarina y de la mezcla de ambos,
así como la suma de los espectros del limón y mandarina divididos entre dos.
27
Figura 3.6
Espectros de fluorescencia de diversos tequilas a) Tequilas Blancos, y b) Tequilas cafés.
28
Figura 3.7
Espectros de Fluorescencia de diversas líneas celulares
29
Figura 3.8
Espectros de fluorescencia de las gasolinas Magna y Premium, y una mezcla de ambas
en igual proporción
Figura 3.9
Espectros de fluorescencia de las gasolinas Magna, Premium, Blanca y petróleo diáfano
y de una mezcla con las mismas cantidades de cada una.
Figura 4.1
Interpretación geométrica de un PCA
Figura 4.2
Clasificación de los espectros de fluorescencia de los espectros de los tequilas, utilizando
Análisis de Componentes Principales. El eje horizontal solo sirve para ubicar el tequila
30
31
35
42
en forma arbitraria y el eje vertical esta relacionado con la intensidad de la fluorescencia
Figura 4.3
Clasificación de los espectros de fluorescencia de los espectros de los tequilas, utilizando
Análisis de Componentes Principales. El eje horizontal solo sirve para ubicar el tequila
44
en forma arbitraria y el eje vertical esta relacionado con la intensidad de la fluorescencia
Figura 4.4
Espectro de fluorescencia, medido y calculado de una mezcla de gasolina magna y
Premium en igual proporción
Figura 4.5
Espectros de fluorescencia de jugos de toronja y de limón, así como de la mezcla de
ambos en igual proporción
45
46
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla
Tabla 1.1
Tabla 2.1
Tabla 2.2
Tabla 4.1
Tabla 4.2
Titulo de la tabla
Tiempos de vida de la fluorescencia y fosforescencia…………………
Principales características del PMT R955………………………………
Principales características del fotodetector MRD500…………………..
Criterios para la clasificación de los métodos de calibración………….
Concentraciones establecidas y calculadas de jugo de toronja y de
limón……………………………………………………………………
Pág.
4
18
19
38
46
Capitulo 1. Introducción.
1.1 Radiación y Técnicas Espectroscópicas
La espectroscopia óptica es una extensa rama de las ciencias físicas, que se ocupa del
estudio de los espectros de radiación electromagnética, generados cuando se aplica
energía a la materia. Este estudio es muy amplio y comprende desde los diversos
métodos para su obtención, su medida y aplicaciones, hasta su interpretación teórica
más profunda en relación con la estructura atómica-molecular de la materia.
Desde el punto de vista de la interacción de la radiación electromagnética con la
materia, un espectro puede definirse como una representación gráfica de la distribución
de intensidad de la radiación electromagnética, emitida o absorbida por una muestra
de sustancia, en función de la longitud de onda (o frecuencia) de dicha radiación [1.1].
Un espectro depende en principio de la separación entre los niveles de energía de la
sustancia. Ahora bien, un sistema molecular puede tener diferentes niveles de energía,
por ejemplo, energía de rotación, asociada al movimiento de giro o rotación de las
moléculas; energía de vibración, debida a las oscilaciones periódicas o vibraciones de
los átomos alrededor de sus posiciones de equilibrio; energía electrónica, que depende
de las posiciones medias de los electrones respecto de los núcleos; energía nuclear,
asociada con la disposición de las partículas componentes de los núcleos atómicos;
energía de orientación de los espines electrónicos y nucleares respecto a un campo
magnético, etc.
Afortunadamente, los distintos tipos de energía de los sistemas atómicos o moleculares
poseen ordenes de magnitud diferentes, por lo que las transiciones entre los
correspondientes niveles de energía dan lugar a emisión o absorción de radiación en
intervalos distintos de frecuencia. Por esto, se puede distinguir distintos tipos de
espectros, según los niveles de energía que intervienen y las técnicas experimentales
utilizadas para su observación.
Los niveles de energía de los núcleos atómicos son los de mayor valor, por lo que las
transiciones entre ellos dan lugar a espectros en la región de mayor frecuencia o de
menor longitud de onda. Estos son los espectros de rayos γ , que proporcionan
información sobre la estructura nuclear, y son prácticamente independientes del entorno
de los núcleos atómicos.
Los niveles energéticos asociados con los electrones internos de los átomos dan lugar a
los espectros de rayos X, en la región de longitudes de onda de 0.05 a unos 10 nm.
Estos espectros son característicos de cada átomo y prácticamente no dependen de los
enlaces químicos, esto es, de la molécula en que se encuentran.
1
Los niveles energéticos de los electrones externos o electrones de valencia de los
átomos, iones atómicos, moléculas o iones moleculares dan lugar a espectros en la
región visible y ultravioleta (de 10 a unos 800 nm) llamados también espectros
electrónicos.
Los espectros de átomos aislados o iones atómicos son de aspecto muy distinto a los
espectros moleculares. Los espectros atómicos consisten en líneas de emisión o
absorción, muy estrechas, a determinadas frecuencias, por lo que se llaman espectros
de líneas, mientras que los espectros electrónicos moleculares, debido a la influencia de
los niveles de vibración y de rotación, presentan zonas de emisión o absorción a
ciertos intervalos de frecuencia, mas o menos anchos, por lo que reciben el nombre de
espectros de bandas.
La energía de vibración de los átomos de una molécula es bastante menor que la
energía electrónica, por lo que las transiciones entre los niveles moleculares de
vibración dan lugar a los llamados espectros infrarrojos, (1μm a unas 100μm).Debido
a la influencia de los niveles de rotación, los espectros infrarrojos son también
espectros de banda.
Las transiciones entre los niveles de rotación de las moléculas, de energía menor que
los de vibración, origina espectros de líneas mas o menos anchas en la región de
microondas (de 1000μm a unos 10 cm) o en el infrarrojo lejano, en el caso de moléculas
muy ligeras.
En la región de ondas de radio y de microondas, pueden aparecer espectros originados
por transiciones entre los niveles de muy baja energía debidos a las orientaciones de
los momentos magnéticos de spin nuclear y electrónico en presencia de un intenso
campo magnético exterior. Estos espectros reciben, respectivamente, el nombre de
espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) y de resonancia magnética
electrónica, llamados también de “spin” electrónico (RSE).
Finalmente, y para los fines de este trabajo, cuando la materia es excitada con radiación
electromagnética de cierta longitud de onda se presenta la emisión de espectros de
radiación con longitud de onda mayor desde dicha materia, fenómeno conocido como
fluorescencia.
1.2 Estados excitados
Cuando se forma un enlace entre dos átomos en una molécula, los orbítales atómicos de
cada uno de los átomos que forman el enlace generan dos orbítales: uno enlazante de
baja energía y otro antienlazante de energía mucho mayor. Si la molécula no está
excitada, los electrones que forman un enlace específico se encuentran ocupando los
orbitales enlazantes, debido a que estos son de energía menor y por lo tanto la molécula
es más estable.
Asociados a cada nivel electrónico se encuentran diferentes niveles vibracionales, por lo
que cuando una molécula es irradiada con energía de cierta frecuencia o longitud de
onda esta puede pasar a diferentes niveles vibracionales de alguno de los estados
excitados So y S1.
2
La mayoría de las moléculas poseen electrones apareados. Los cuales poseen diferente
giro o diferente spin cuando están en el estado basal. En esta situación el momento
magnético producido por el spin es cancelado, haciendo a la molécula diamagnética.
Cuando los pares electrónicos se encuentran apareados se le llama estado singulete. So y
S1 son el primero y segundo estado excitado de un singulete Otra posibilidad es que
durante el proceso de transferencia del electrón del estado basal al estado excitado
cambie su spin y en este caso los dos electrones tengan el mismo giro. Tal estado en
espectroscopia se conoce como triplete y en este caso la molécula es paramagnética ya
que el vector magnético creado por el giro de los dos electrones no se anula sino que se
suma y da un valor neto de momento cuántico magnético de spin. Estos estados se
pueden representar como se muestra en la figura 1.1
Singulete estado basal
Singulete excitado
Triplete excitado
Figura. 1.1 Spín del electrón
La Figura 1.2 es un diagrama parcial de niveles de energía para una hipotética molécula
fotoluminiscente. La línea horizontal S0 representa la energía del estado fundamental de
la molécula, el cual normalmente es un estado singulete, en este nivel electrónico al
igual que en los otros estados excitados se encuentran asociados varios niveles
vibracionales de la molécula. A temperatura ambiente la energía electrónica de
prácticamente todas las moléculas es S0. Las dos líneas de la izquierda representan S1 y
S2, y corresponden respectivamente primero y segundo estado singulete excitado. El de
la derecha T1 corresponde al primer estado triplete excitado. Hay que señalar que el
estado triplete es menos energético que el correspondiente estado excitado singulete.
3
Figura 1.2 Diagrama parcial de energía para un sistema fotoluminiscente.
La fluorescencia surge debido a transiciones radiativas entre estados singuletes de una
molécula, mientras la fosforescencia es causada por transiciones radiativas entre
estados triplete y singulete, ver Tabla 1.1.
Tabla 1.1 Tiempos de vida de la fluorescencia y fosforescencia
Fotoluminiscencia
Fluorescencia
Fosforescencia
Estado excitado singulete
Tiempo de vida ≈ 10 ns
Estado excitado triplete
Tiempo de vida ≈ ms - min
4
1.3 El fenómeno de fotoluminiscencia
El fenómeno de fotoluminiscencia ocurre cuando una sustancia química es excitada por
medio de radiación electromagnética y como consecuencia la sustancia pierde la energía
adquirida reemitiendo ésta en forma parcial o total. Esto es, parte de la energía adquirida
por la sustancia química se consume en choques moleculares y parte se emite en forma
de radiación luminosa. [1.2].
La fluorescencia y la fosforescencia son dos manifestaciones diferentes del fenómeno
fotoluminiscente. Estos dos efectos difieren entre sí en el mecanismo a través del cual
son producidos, y su tiempo de duración. La fluorescencia cesa casi inmediatamente
después de que a la muestra se le deja de irradiar ( ≅ 10 -9 seg.), mientras que la
fosforescencia puede durar varios segundos o minutos en iguales circunstancias. La
fluorescencia no está restringida a un estado físico determinado de la materia, esta
puede existir en gases, sólidos o líquidos.
1.4 Procesos de desactivación
Una vez que la sustancia química ha sido excitada a niveles energéticos superiores, la
desactivación o pérdida de la energía en exceso se puede efectuar a través de diferentes
procesos. El camino más probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el
tiempo de vida del estado excitado. Por tanto, si la desactivación por fluorescencia es
rápida con respecto a los procesos sin radiación, se observa tal emisión.
En la mayor parte de las especies químicas, la desactivación por relajaciones no
radiativas (choques moleculares de la especie excitada con el solvente) es la ruta
favorecida, ya que el número de especies fluorescentes es pequeño en comparación con
las especies no fluorescentes. El fenómeno de fluorescencia está restringido a un
número relativamente pequeño de sistemas que poseen características estructurales y
ambientales que hacen que la velocidad de los procesos de relajación sin emisión de
radiación se reduzca hasta el punto que la relajación con emisión de radiación puede
competir.
El aumento en la temperatura incrementa el número de choques moleculares, por lo que
la desactivación tiende a efectuarse a través de procesos no-radiativos y por lo tanto se
inhibe la fluorescencia. La viscosidad del solvente tiene efectos similares, a mayor
viscosidad menor número de choques moleculares y mayor intensidad de fluorescencia
[1.3].
5
1.5 Propiedades del fenómeno de fluorescencia
Las principales características del fenómeno de fluorescencia son:
1. Debido al proceso de conversión interna y de acuerdo con la regla de Kasha la
posición del espectro de fluorescencia no depende de la longitud de onda de
excitación.
2. El espectro de fluorescencia se desplaza en dirección de longitud de onda mayor
con respecto a la banda de absorción S0→S1 (regla de Stokes) y es
aproximadamente la imagen especular de esta banda.
3. El número de fotones emitidos por unidad de tiempo es proporcional al número
de fotones absorbidos por unidad de tiempo y a la eficiencia cuántica q. [1.3]
(
)
I f = I 0 1 − 10 − D q
(1.1)
donde I0 es la intensidad de la luz incidente, D = ξ c l es la absorbancia de la
solución, ξ es el coeficiente de extinción de la molécula, c la concentración de la
molécula y l la longitud de la trayectoria óptica, q es la eficiencia cuántica de
fluorescencia, definida como la razón del numero de cuantos emitidos desde un
estado excitado entre el numero de cuántos absorbidos durante la transición al
estado excitado por unidad de tiempo. Si la concentración es baja, entonces:
I I = 2.303 ξ c
l I0 q
(1.2)
1.6 Calibración multivariable
Para el análisis de muestras que contienen mezclas de compuestos químicos se han
desarrollado los métodos quimiométricos, los cuales permiten extraer la información
requerida sobre los componentes de interés de las muestras a partir del tratamiento de
datos, sin necesidad de su separación previa. [1.4]
El desarrollo rápido de la quimiometría se debe fundamentalmente a la utilización
masiva de los ordenadores acoplados a la instrumentación moderna [1.5]. Se ha pasado
de hacer medidas puntuales a una longitud de onda (una sola variable), a medidas
espectrales ( muchas variables) con gran contenido de información y, por tanto, los
métodos tradicionales de análisis
y procesado de datos resultan totalmente
insuficientes.
6
1.6.1 Clasificación de los métodos de calibración multivariable
Los métodos de calibración pueden tener una base totalmente empírica o bien estar
soportados por una base teórica que explica el fenómeno físico o químico responsable
de la señal analítica, en nuestro caso (espectroscopia de fluorescencia) la ley de
Lambert-Beer. [1.5]
Se han propuesto diversas clasificaciones de los métodos de calibración. Una es
desde el punto de vista matemático, en función de la dimensión de los datos
disponibles por muestra, los cuales han sido generados por instrumentos de diferente
dimensión. Así los datos pueden ser clasificados como:
a) Datos univariables.
Datos escalares (instrumentos de orden cero), medidas en las que únicamente se obtiene
un valor numérico, un escalar.
b) Datos multivariables.
Datos vectoriales (instrumentos de primer orden), el instrumento proporciona un
vector de datos (ej. espectro) al analizar cada muestra. Los métodos matemáticos
utilizados son los derivados del análisis multivariable.
Matriz de datos (Instrumentos de segundo orden): para cada muestra analizada se
obtiene una matriz de datos. En esta matriz se consideran dos direcciones, las filas y las
columnas, que corresponden, generalmente, a dos tipos diferentes de medida. Además
de la intensidad de la fluorescencia se puede considerar el tiempo de vida de dicha
fluorescencia.
Datos de orden superior (instrumentos de orden superior) la extensión de los
conceptos anteriores nos lleva hacia los instrumentos de orden superior y los datos
obtenidos con ellos. No hay límite en el máximo orden de los datos que pueden ser
obtenidos. Los instrumentos modernos de espectroscopia de fluorescencia pueden
proporcionar la variación de los espectros excitación-emisión con el tiempo,
produciendo una estructura tridimensional de datos por muestra. Una ventaja añadida al
utilizar instrumentos de orden superior es el aumento de la sensibilidad. También en
este caso se pueden aplicar los métodos de análisis de “N-vias”.
Otra clasificación de los métodos de calibración menos matemática es la siguiente:
a) Según la relación entre las variables dependiente e independiente:
-Calibración lineal (descrita por un modelo lineal),
k
y = b0 + ∑ bk x k
(1.3)
k =1
en donde b0 y bk son parámetros a determinar y, xk son las variables independientes.
7
-Calibración no lineal: basada en modelos no lineales como:
y = αx β
en donde α y β son parámetros a determinar.
(1.4)
b) Según la forma de encontrar la relación entre las variables:
Métodos directos: los parámetros de la calibración se calculan directamente a partir de
la señal de cada uno de los analitos.
Métodos indirectos: los parámetros de la calibración se calculan a partir de las señales
de diferentes mezclas de analitos.
- Rígidos – Flexibles: En los rígidos es necesario tener información de todas las
especies presentes que pueden contribuir a la señal, mientras que en los flexibles
únicamente es necesario tener información de los analitos que se desean cuantificar.
-Según cuál sea la variable dependiente y cuál la independiente.
Calibración clásica: esta sigue un criterio directamente relacionado con la ley de
Lamber-Beer. [1.6] La señal analítica actúa como variable dependiente de la
concentración, que es la variable independiente.
Calibración inversa: se utiliza la concentración como variable dependiente y la señal
analítica como independiente.
Teniendo en cuenta esta ultima clasificación, cabe destacar como calibración clásica la
regresión lineal múltiple clásica
(CLS, Classical Least Squares). Dentro de la
calibración inversa la regresión lineal múltiple inversa (ILS, Inverse Least Squares) y
los métodos de regresión sesgados, basados en la reducción de variables. Estos últimos,
teniendo en cuenta la ordenación de los datos cinéticos-espectrofotométricos, se
pueden dividir en dos grandes bloques.
Métodos de desdoblamiento de datos, entre los que destacan la regresión de
componentes principales (PCR), la regresión parcial de mínimos cuadrados (PLS) y la
regresión continua (CR).
Metodos de N-vias; entre los que destacan
(PARAFAC) y el PLS multidimensional (N-PLS).
el análisis de factores paralelos
Los métodos basados en la reducción de variables se caracterizan por que la
información contenida en la señal analítica registrada puede ser concentrada o
reducida a un menor número de variables, sin pérdida de información relevante. La
regresión de las respuestas no se realiza en los datos originales, sino en estas nuevas
variables, simplificándose los modelos y la interpretación de los resultados. Presentan
las ventajas de la calibración inversa, permitiendo realizar el análisis de únicamente
alguno de los componentes que contribuyen a la emisión sin necesidad de tener
información sobre las demás especies presentes. Por tanto, se les incluye también
dentro de los métodos flexibles de calibración.
8
Entre los métodos de calibración no lineal cabe mencionar las redes neuronales
artificiales (ANN) y variantes del PLS (no lineal PLS). Una de las técnicas mas
aplicadas para datos cinético-espectrofotométricos es el filtro de Kalman. Éste requiere
de las variables medidas y de valores iniciales de los parámetros. Su variante, el filtro
Kalman extendido, puede ser aplicado también a modelos no lineales.
1.7 Métodos de reconocimiento de pautas
Los métodos de reconocimiento de pautas pueden ser definidos como un conjunto de
técnicas quimiometricas cuyo objetivo es caracterizar la muestra a partir de un
adecuado tratamiento estadístico de la información recogida. Gran parte de los métodos
de reconocimiento de pautas se dirige a condensar la información multidimensional
obtenida en unas pocas dimensiones y suministrar un criterio estadístico que permita
discernir, con un denominado nivel de confianza, si dos objetos son o no iguales, o si
una muestra pertenece o no a una determinada clase. [1.7,1.8]
1.7.1 Métodos de reconocimiento de pautas no supervisados.
Un problema que aparece en el análisis multivariante es que el volumen inicial de datos
puede dificultar el reconocimiento de pautas y relaciones. El análisis de componentes
principales (ACP) es una técnica para reducir la cantidad de datos, cuando existe una
correlación entre estos, sin perder información relevante.
Además del
análisis de componentes
principales
tenemos el análisis de
(cluster analysis) que es un método para dividir un grupo de
conglomerados
espectros en una serie de clases, de manera que los espectros similares se encuentran
dentro de una misma clase. El análisis de conglomerados busca espectros que se
encuentran próximos en el espacio de las variables.
En los métodos de reconocimiento de pautas no supervisados, no se conoce
previamente la clase a la que pertenecen las muestras. El objetivo de estas técnicas es el
estudiar si en un conjunto grande de muestras existen grupos diferenciados de las
mismas, es decir, si algunas muestras son parecidas entre si y, a la vez, diferentes de las
demás.
1.7.2 Métodos de reconocimiento de pautas supervisados.
En estos métodos se parte de una serie de objetos cuya pertenencia al grupo es
conocida, por ejemplo los espectros de forma individual de los diferentes componentes
de una mezcla. Estos objetos se llaman a veces objetos de entrenamiento o aprendizaje.
El objetivo de los métodos de reconocimiento de pautas supervisado es utilizar estos
objetos para encontrar una regla que permita asignar un nuevo objeto de grupo
desconocido al grupo correcto.
9
El punto de partida del análisis discriminante lineal (ADL) es encontrar una función
discriminante lineal (FDL), Y, que sea una combinación lineal de las variables
originales X1, X2, etc.:
Y = a1 X 1 + a2 X 2 + ... + an X n
(1.5)
Con la calibración multivariante podemos hacer análisis cuantitativo en mezclas,
obteniendo los coeficientes que nos indican la proporción en que están presentes los
componentes en una mezcla.
Referencias.
[1.1] J. Morcillo Rubio, J. M. Orza Segade, “Espectroscopia ”, Alambra, S. A., 1972.
[1.2] R. Lakowicz, “Principles of fluorescence spectroscopy”, Plenum Press, 1983.
[1.3] Agustín. Silva, “Espectroscopia de fluorescencia Laser en Leucocitos de
Humano”
Tesis Maestría, UAM-IZTAPALAPA (1999).
[1.4] D. Peña, “Análisis de datos multivariantes”, Mc Graw Hill, 2000.
[1.5] M. Porcel “Aplicación de técnicas quimiométricas para el desarrollo de nuevos
métodos cinéticoespectrofotométricos de análisis”, Tesis, 2001,
http://www.tesisenxarxa.net/TDX-0111102-111615/index.html
[1.6] J. Ferre, “Calibración multivariante en análisis cuantitativo. EL modelo directo”
http://www.quimica.urv.es/quimio/general/calmul.pdf , 2007-06-08
[1.7] J. C. Millar, J. N. Millar “Estadística y quimiometría para química analítica”,
Prentice Hall, 2002.
[1.8] S. Macho, “Metodologías analíticas basadas en espectroscopia de infarrojo y
calibración multivariante. Aplicación a la industria petroquímica”
http://www.tdx.cesca.es/TESIS_URV/AVAILABLE/TDX-0621102113818//tesis_smacho.pdf
10
Capitulo 2 Arreglo experimental.
El arreglo experimental que se utilizo para medir las emisiones de fluorescencia de las
sustancias bajo estudio se muestra en la figura 2.1.
Figura 2.1 Arreglo experimental.
Para la excitación de las muestras se utilizó un láser de N2, el divisor de haz se utilizó
para reflejar una parte de esa luz hacia un fotodiodo de referencia que sirve para
disparar al osciloscopio. La luz transmitida llega a una lente biconvexa que la enfoca
hacia la muestra que se este analizando, la fluorescencia emitida por esta se enfoca,
utilizando un par de esferas de vidrio, a una fibra óptica que la lleva al monocromador
para descomponerla en sus diferentes longitudes de onda y el PMT (fotomultiplicador)
pueda registrar las intensidades correspondientes a cada longitud de onda en el
osciloscopio. Éste último envía las formas de onda por medio de una interfaz GPIB a
una PC que se encarga de registrarlas e ir extrayendo la información para generar el
espectro de emisión. El monocromador también es controlado desde la PC por medio de
un puerto serie (RS-232) y el software fue desarrollado en LabView 6 de National
Instruments®.
2.1 Fuente de excitación
La fuente de excitación es un láser de nitrógeno, que emite pulsos de luz con una
longitud de onda de 337.1nm (UV) y tienen una duración de 4nS (FWHM).
11
El diagrama eléctrico del láser de nitrógeno se muestra en la figura 2.2
Figura 2.2 Diagrama eléctrico del láser de nitrógeno [2.1].
La energía (E) promedio de los pulsos de emisión es de 1.1μJ y se midió con un
medidor de energía Láser precision corp. "Energy Radiometer" RJ-7610. De acuerdo a
la energía de los pulsos y la duración de estos, la potencia promedio de los pulsos del
láser esta dada por:
P = E / FWHM
(2.1)
Obteniéndose una potencia promedio de los pulsos de luz de 275 W [2.2].
La tasa de repetición de pulsos del láser para estas mediciones se estableció en 35 Hz
aproximadamente, aunque puede variar dependiendo de su tensión de alimentación. La
forma de los pulsos emitidos por este láser se muestra en la figura 2.3
Pulso del láser de Nitrógeno (FWHM = 4nS)
0.7
0.6
Tensión [V]
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
-0.1 0
200
400
600
800
[5 ns/div]
Figura 2.3 Forma de los pulsos emitidos por el láser
12
1000
2.2 Sistema óptico
El sistema óptico es el encargado de adecuar la luz del láser para dividirla en:
•
•
El haz que servirá como referencia para disparar al osciloscopio.
El haz que será concentrado y enfocado en la muestra que se esté
estudiando.
También consta de unos lentes que se encargan de concentrar la mayor cantidad de luz
emitida por fluorescencia de la muestra y dirigirla a una fibra óptica.
2.2.1 Divisor de haz
Como divisor de haz se utiliza un vidrio portaobjetos, el cual tiene un índice de
refracción de 1.5 [2.3] y un espesor de 1.0mm. El láser incide en él con un ángulo de
450, el arreglo básico se muestra en la figura 2.4
Figura 2.4 Divisor de haz
Del divisor de haz solo sale el 81% de la luz, se refleja el 19% [2.2]
2.2.2 Enfoque de la radiación sobre la muestra
Una característica del láser de N2 es su alta divergencia conforme se aleja de su origen,
debido a esto es necesario volver a concentrar este haz en un área lo mas pequeña
posible para obtener mayores intensidades excitación y por lo tanto mayor emisión de
fluorescencia.
En esta etapa se utiliza un lente biconvexo de un diámetro de 3.5 cm. y una longitud
focal de 15 cm. que se colocó después del divisor de haz con el fin de concentrar la luz
trasmitida hacia la muestra. Las dimensiones del haz una vez enfocado en la muestra
son de 1.7 mm x 0.9 mm; Logrando con esto un área de 1.53 mm2. En el diagrama de la
figura 2.5 se muestran los detalles.
13
Figura 2.5 Lente biconvexa para enfocar el haz en la muestra.
El ángulo de incidencia al lente es 0o por lo que la reflexión es del 4%, al entrar a la
lente. Debido a las reflexiones internas, los porcentajes de luz transmitida y reflejada
son los siguientes [2.2]:
Luz reflejada = 7.68%
Luz transmitida = 92.3%
Con lo anterior, se puede conocer el porcentaje de luz total con que radiamos la muestra
que es 75.5% equivalente a una energía de 0.83 μJ del total del láser.
2.2.3 Concentración de la fluorescencia
Una vez que el haz ha sido dirigido a la muestra, la fluorescencia será emitida hacia
todo el espacio, dependiendo de la naturaleza y las dimensiones de ésta. La porción de
luz detectada será determinada por la óptica de colección de la fluorescencia.
El propósito de esta etapa es captar la mayor parte de la fluorescencia provocada por el
haz láser y dirigirla a un punto que puede ser directamente un fotodetector o una fibra
óptica (como es el caso en esta investigación).
Para la realización del sistema de colección se utilizó un par de lentes esféricos
(Edmund Industrial Optics L32-748), figura 2.6, en una configuración para acoplar
fibras ópticas. Estos lentes esféricos son unas excelentes herramientas para mejorar el
acoplamiento de la señal entre fibras ópticas, emisores y detectores ópticos. El material
de que están hechos es BK7, cuyo índice de refracción es 1.51, en este caso los lentes
esféricos tienen un diámetro de 10 mm. La configuración óptica utilizada se muestra en
la figura 2.7.
Figura 2.6 Lentes esféricos BK7
14
Figura 2.7 Arreglo de los lentes para enfocar la mayor cantidad de
fluorescencia posible en la fibra óptica[2.4].
En el interior de una base de aluminio están colocados los lentes esféricos para acoplar
la fibra óptica. Esta base se muestra en la figura 2.8 junto con el cilindro que contiene la
lente biconvexa y el divisor de haz.
Figura 2.8 Cilindro donde se encuentran integrados el divisor de haz, la
lente
biconvexa y las esferas concentradoras de fluorescencia a la
fibra óptica.
15
2.3 Sistema espectrométrico
La componen la fibra óptica, el monocromador, el tubo Fotomultiplicador y el
fotodiodo de referencia. La fibra óptica se encarga de conducir la fluorescencia inducida
por el láser hacia el monocromador, mismo que la descompondrá en sus diferentes
longitudes de onda, la intensidad de cada longitud de onda será convertida por el PMT a
señal eléctrica y observada en un osciloscopio.
2.3.1 Fibra óptica
La fibra óptica utilizada es de cuarzo, diseñada para aplicaciones con luz UV(L38-956
de Edmund Industrial Optics). Esta tiene una cubierta de plástico que provee una
máxima eficiencia en la transmisión debido a la razón núcleo-revestimiento que es 10:1.
La funda es de PVC y esta terminada con puntas de acero inoxidable. Su longitud total
es de 36" (92.5 cm) y tiene un diámetro de 0.250" (6.0 mm).
La Figura 2.9 muestra el espectro de fluorescencia de la fibra óptica utilizada, en el
intervalo de 330 a 450 nm, en este caso la luz del láser (337.1nm) excita directamente a
la fibra óptica misma que presenta fluorescencia a 245, 355, 360, 380 y 405 nm lo cual
se manifiesta de forma sistemática en nuestras mediciones.
0.4
Voltaje (Volts)
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
450
445
440
435
430
425
420
415
410
405
400
395
390
385
380
375
370
365
360
355
350
345
340
335
330
Longitud de onda (nm)
Figura 2.9 Gráfica de los espectros de fluorescencia de la fibra óptica a
diferentes aberturas de las rejillas del monocromador (0.25 μm línea
continua y 0.5μm. linea punteada).
16
2.3.2 Monocromador
Un monocromador se caracteriza por presentar en su salida un haz de radiación de gran
pureza espectral y permitir variar la longitud de onda de la radiación de forma continua
en un amplio intervalo. Los componentes básicos de un monocromador son: Una
rendija de entrada que selecciona un haz de luz entrante; un elemento dispersor; una
rendija de salida que aísla la banda espectral deseada.
El diagrama esquemático del monocromador se muestra en la figura 2.10
Figura 2.10. Principio básico del monocromador
El monocromador utilizado es de la compañía Acton Research® modelo Spectra Pro275 de 0.275 m de longitud focal. Tiene 3 rejillas distintas que permiten seleccionar la
resolución del barrido y es posible controlarlo remotamente por medio del puerto serie
de una PC (RS-232).
Debido a que la fluorescencia inducida por láser se encuentra dentro del espectro visible
en su mayoría, se utiliza la rejilla 1, que es capaz de realizar un barrido desde 100 nm a
750 nm
2.3.3 Tubo fotomultiplicador (PMT)
En la salida del monocromador se pueden tener niveles de luz extremadamente
pequeños por lo que se usó un modulo fotomultiplicador modelo H957 de
Hammamatsu® que proporciona niveles de tensión equivalentes a la cantidad de luz en
la salida del monocromador. Algunas características principales del PMT que utiliza el
modulo utilizado se muestran en la tabla 2.1 [A-1].
17
Tabla 2.1 Principales características del PMT R955 [A-1]
ANCHO ESPECTRAL
Tiempo de respuesta
Sensitividad
Corriente de oscuridad
Tensión de alimentación
160 A 900 NM
2.2 ns
7.4x105 A/W a 400 nm
3 nA
1000V máx
2.3.4 Configuración de conexión del tubo fotomultiplicador
(PTM).
Para controlar el alto voltaje (-400 a -900 V) del PMT tenemos dos opciones como lo
muestra la figura 2.11, puede ser con una fuente variable de 0 a 4 V o bien con un
resistor variable de 0 a 10 KΩ, en base a los valores de uno de estos dos elementos
podemos establecer la ganancia del PMT.
Figura. 2.11 Configuración para el control del alto voltaje del PMT.
18
La relación entre los dos diferentes tipos de control del voltaje y el alto voltaje en el
PMT se muestran en la figura 2.12.
Figura. 2.12 Relación entre los dos diferentes tipos de control del
voltaje en el PMT.
2.4 Fotodiodo para muestreo de la radiación láser
El fotodiodo para muestreo de la radiación láser es un MRD500 de Motorota®, es
utilizado para disparar al osciloscopio y de esta manera asegurar la captura de la señal
del PMT. El uso de este dispositivo es de gran importancia ya que la señal fluorescente
obtenida depende de la muestra que se esta analizando y, de acuerdo a la naturaleza de
dicha muestra se pueden obtener niveles tan pequeños de señal que no sean capaces de
disparar el osciloscopio. El fotodiodo recibe una intensidad de luz láser proveniente del
divisor de haz lo suficientemente grande para generar un pulso de voltaje del orden de
0.6 Vp, el cual permite el disparo del osciloscopio. El fotodiodo permite además
conocer la intensidad de la radiación a la cual se somete la muestra. Las características
principales del fotodiodo utilizado se muestran en la tabla 2.2.
Tabla 2.2 Principales características del fotodetector MRD500 [A-2]
ACHO ESPECTRAL
Tiempo de respuesta
Sensitividad (S)
Corriente de oscuridad
Área de detección
300 A 1150 NM
1 nS
1.2 - 6.6 μA/mW/cm2 a 800 nm
14 nA
0.1225 cm2
19
La figura 2.13 muestra la curva de respuesta espectral relativa del fotodiodo. Para este
caso, la longitud de onda de la luz UV del láser de nitrógeno es 337.1 nm y su tensión
de salida será el 10 % de la tensión obtenida si se excitara con luz de una longitud de
onda de 800 nm (respuesta máxima).
Respuesta espectral relativa
Respuesta relativa (%)
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
Longitud de onda (µm)
Figura 2.13 Respuesta espectral relativa del fotodetector MRD500 [A-2]
En la figura 2.14 se observa el circuito eléctrico utilizado. La salida tiene una
impedancia de 50 Ω.
Figura 2.14 Circuito de polarización del detector MRD500.
20
2.5 Registro de las señales de radiación láser y fluorescencia
Las señales de la radiación láser y la fluorescencia proporcionadas por los
fotodetectores son registradas en un osciloscopio digital Tektronix® 2440 con una tasa
máxima de digitalización de 500 MS/s lo que proporciona un ancho de banda máximo
de 200 Mhz.
El osciloscopio cuenta con una interfase de comunicación GPIB con el estándar IEEE
488 que le permitirá comunicarse con una PC para transferir todas las señales que se
requieran en un tiempo considerablemente corto.
2.5.1 Interfase GPIB bajo la norma IEEE 488
Utilizando una interfase estándar, se pueden diseñar instrumentos que tengan un nivel
básico de compatibilidad con otros instrumentos que cumplan con la norma.
La norma IEEE 488 define tres aspectos de la interfase de un instrumento:
•
•
Mecánica.
Eléctrica.
•
Funcional.
El conector y el cable
Los niveles eléctricos para las señales lógicas y como las señales
son enviadas y recibidas
Las tareas que la interfase de un instrumento puede realizar, tales
como enviar y recibir datos.
El conector GPIB tiene 24 pines, 16 asignados a señales específicas y 8 para tierras. Los
instrumentos pueden conectarse en una configuración lineal, de estrella o una
combinación de ambas. La forma lineal es donde el cable GPIB estará conectado de un
instrumento al siguiente. En la configuración de estrella, todos los cables de los
instrumentos están conectados a un punto en común.
Para mantener las características eléctricas de potencia en el bus, un dispositivo debe
estar conectado mediante un cable de 2 m de longitud como máximo y al menos dos
terceras partes de los instrumentos conectados al bus deben estar encendidos.
Las tensiones requeridas en todos los conectores del bus se basan en la tecnología TTL.
Un “1” lógico corresponde a tensiones > 2 volts y < 5.2 volts
Un “0” lógico corresponde a tensiones > 0 volts y < 0.8 volts
Cada instrumento conectado al bus tiene una única dirección primaria. Se puede asignar
una dirección primaria a cada instrumento en el intervalo de 0 a 31. Con esto se observa
que un solo bus es capaz de controlar hasta 32 instrumentos.
21
2.5.2 Tarjeta GPIB
Para poder establecer la comunicación entre la PC y el osciloscopio se utilizó una
tarjeta GPIB de National Instruments® AT-GPIB/TNT.
Algunas características de esta tarjeta son las siguientes:
•
•
•
•
Transferencia máxima de datos de 1.5 MBytes/s, normalmente 1 MB/s
Compatible con sistemas Windows 95/98/ME
Control simultáneo de hasta 32 instrumentos
Conexión a la PC en las ranuras de expansión ISA
2.6 Envío de señales del osciloscopio a la PC
El osciloscopio es capaz de enviar la señal registrada a una PC en forma de gráfico o
como una lista de datos que corresponden a las variaciones de amplitud con el tiempo
de la señal.
Las señales son enviadas a la PC como un arreglo de datos numéricos que tiene una
longitud de 1024 elementos. Esto permite tener una alta resolución de los niveles de
tensión correspondientes a cada instante de tiempo. Otra ventaja es la facilidad con que
se pueden realizar operaciones matemáticas entre dos o más señales.
El tiempo de transferencia de los datos del osciloscopio (de una sola señal) a la PC es
estimado de aproximadamente 10ms si se considera lo siguiente:
Tasa de transferencia de datos:
Tamaño de los datos enviados:
Número de puntos enviados:
Total de información enviada:
1 Mb/seg = 1024 Kb/seg
10 bytes por punto (1 de inicio, 8 del dato, 1 de cola)
1024 para toda la forma de onda
10240 bytes = 10Kb
Entonces, si en 1 segundo se pueden enviar 1024Kb de información, para enviar 10 Kb
de información se requerirán 9.76 ms (aproximadamente 10ms)
2.7 Control del monocromador
El monocromador Spectra Pro 275 es controlado por medio de la PC haciendo uso de la
interfaz serie RS-232. La PC se encarga únicamente de enviarle los comandos
necesarios para que el mecanismo interno de éste permita el paso de luz
correspondiente a la longitud de onda deseada.
La sintaxis para el envío de este comando es la siguiente:
337.1 GOTO
22
En este caso, el monocromador responde colocando sus espejos de tal manera que solo
pase la luz UV generada por un láser de N2 (correspondiente a la longitud de onda de
337.1 nm)
El algoritmo para la obtención de los espectros de emisión de fluorescencia, así como
la interfase de usuario del sofware desarrollado en LabView de National Instruments®
se muestran en el apéndice A-4.
Referencias
[2.1]
J. de la Rosa, R. Valencia, A. Vázquez, “Studies of the Electrical Behavior of a
Blumlein Type Nitrogen Laser”, Instrumentation & Development, Journal of the
Mexican Society of Instrumentation Vol.3, nr.8. (1997) pags. 39-44.
[2.2]
F. J. Bautista, “Sistema para Medición de Fluorescencia Inducida por Láser (LIF)
Resuelta en Tiempo”, Tesis Maestría, ESIME-IPN (2004).
[2.3]
E. Hecht, “Óptica”, Addison Wesley Iberoamericana (2000).
[2.4]
Catálogo de Edmund Industrial Optics, 2001. Pág.39
23
Capitulo 3 Mediciones.
Con el arreglo experimental del capitulo anterior, se midieron los espectros de emisión
de fluorescencia en el intervalo de 330 a 700 nm de algunas sustancias excitando con
radiación láser de 337.1 nm.
3.1 Fluorescencia del sistema
Los picos de fluorescencia debidos a la fibra óptica, figura 2.9, se visualizan en todas las
mediciones de muestras bajo estudio y pueden variar en magnitud dependiendo de que
la muestra que se este analizando permita pasar mas o menos UV a la fibra óptica.
Con muestras de alta absorción no se observan estos picos de fluorescencia, ya que
estas no permiten el paso de UV a la fibra óptica.
Todas las mediciones en muestras liquidas se realizaron en tubos de ensayo, en estos no
se manifestó la inducción fluorescencia dentro del intervalo de trabajo (330 a 700 nm).
La figura 3.1 muestra una gráfica del análisis de los tubos de ensayo utilizados, en los
cuales se observa la radiación láser (337.1 nm) y su armónico, también se aprecian los
tres picos de fluorescencia de la fibra óptica.
3
2.5
Voltaje (V)
2
1.5
1
0.5
0
300
350
400
450
500
550
600
650
700
Longitud de onda (nm)
Figura 3.1 Fluorescencia de los tubos de ensayo utilizados cuando se
excitan con radiación de 337.1 nm. Aquí se aprecia la radiación láser y su
armónico, así como los picos de fluorescencia de la fibra óptica.
24
Los tubos utilizados son de cuarzo y después de varias mediciones exponiéndolos a la
luz del láser para estudiar su comportamiento, concluimos que los tubos de ensayo no
aportan emisión de fluorescencia, esto permite obtener directamente los espectros de
fluorescencia de la sustancia bajo estudio con los correspondientes picos de
fluorescencia de la fibra óptica, ver figura 2.9.
3.2 Fluorescencia de diluyentes.
El principal diluyente que se utilizo en este trabajo de tesis fue el agua limpia, después
de someter a diferentes muestras de agua potable a la radiación del láser no se observa
ninguna emisión de fluorescencia, obteniendo como resultado la grafica que se muestra
en la figura 3.2 donde solo se observan el pico del láser 337.1 nm y su correspondiente
armónico, esta característica del agua nos permite utilizarla para disolver algunas
sustancias sólidas como azúcar, jabón en polvo, colorantes artificiales, etc. y poder
someterlas a la radiación del láser para estudiar su emisión de fluorescencia.
1.6
1.4
1.2
Voltaje (v)
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
300
-0.2
350
400
450
500
550
600
650
700
Longitud de onda (nm)
Figura. 3.2 Ausencia de fluorescencia del agua potable cuando es excitada
con radiación láser de 337.1 nm. Los picos representan la radiación láser y
su armónico
25
3.3 Fluorescencia de cítricos.
Se tomo como objeto de estudio los jugos de limón y mandarina, sus espectros
individuales y una mezcla de partes iguales de estos, de la misma forma se trabajo con
los jugos de toronja y limón, dichos espectros se muestran en la figura 3.3 y 3.4,
respectivamente. Se aprecia una gran similitud entre los espectros de los jugos de
mandarina y limón, aunque la intensidad de la fluorescencia del limón es prácticamente
el doble de la de la mandarina. Siendo el espectro de la mezcla prácticamente igual al
del limón. Por otro lado, los espectros de los jugos de toronja y limón son
sustancialmente diferentes, y el de su mezcla se aprecia ser una superposición de ambos.
Mandarina
2
Limón
Mezcla
Voltaje (V)
1.5
1
0.5
0
300
-0.5
350
400
450
500
550
600
650
700
Longitud de onda
Figura 3.3 Espectros de fluorescencia de los jugos de limón, mandarina
y de la mezcla de ambos en la misma proporción cuando son excitados
con radiación láser de 337.1 nm.
26
0.25
Toronja R3
0.2
Limon R3
0.15
Mez_Limon-Toronja 50y50 R3
0.1
0.05
0
300
350
400
450
500
550
600
650
700
Figura. 3.4 Espectros de fluorescencia de los jugos de toronja, limón y de
la mezcla de ambos en la misma proporción.
En un intento por interpretar el comportamiento de los espectros, en la figura 3.5 el
espectro de línea gruesa se obtuvo dividiendo cada valor de los espectros de la
mandarina y el limón entre dos y después sumándolos uno a uno, se observa que el
espectro obtenidos matemáticamente no coinciden con el espectro medido, por lo que
no contribuyen de igual manera al espectro de la mezcla.
Mandarina
2
Limón
1.8
1.6
Mezcla
Voltaje (V)
1.4
M/2+L/2
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
-0.2300
350
400
450
500
550
Longitud de onda
600
650
700
Figura 3.5 Espectros de fluorescencia de los jugos de limón, mandarina
y de la mezcla de ambos, así como la suma de los espectros del limón y
mandarina divididos entre dos.
27
3.4 Fluorescencia de tequilas.
Otro objeto de estudio a sido el tequila, en la figura 3.6 se muestran los espectros de
fluorescencia de diferentes tequilas, en la figura 3.6a aparecen los de apariencia
transparente y en la 3.6b los de apariencia entre café y amarillo. En cada una de estas
figuras se cumple que a mayor intensidad de fluorescencia mayor calidad del tequila,
medido por su valor comercial (Corralejo Triple Destilado $280.00, Corralejo reposado
$ 156.00, 1800 Blanco $170.00; Oro Azul Reposado $ 250.00, Jimador Reposado $
100.00, Cuatro Vientos Reposado $90.00 y Casco Viejo Joven $77.00). En el caso de
tequilas blancos las formas de los espectros mostrados en la figura 3.6a son muy
similares. En los tequilas cafés aparece en el caso del Tequila Oro azul un corrimiento
del espectro hacia longitudes de onda más corta.
Figura 3.6 Espectros de fluorescencia de diversos tequilas
a) Tequilas Blancos, y b) Tequilas cafés.
28
3.5 Fluorescencia de células.
También se han obtenido los espectros de las líneas celulares descendientes de células
tumorales humanas C33 H (Cáncer cervical no infectado con virus de papiloma
humano), CaLo H (Cáncer cervical en estadio IIB infectado con virus de papiloma
humano 18), HeLa H (Cáncer cervical en estadio IVB infectado con virus de papiloma
humano 18) y SiHa H (Cáncer cervical infectado con virus de papiloma humano 16)
proporcionadas por la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas (ENCB-IPN). La figura
3.7 muestra el espectro de fluorescencia promedio de varias muestras de cada línea
celular cuando son excitadas por radiación láser de 337.1 nm. El intervalo de tal
fluorescencia coincide en principio con lo normalmente medido en células sanas y es
atribuido a la enzima NADH que existe en el citoplasma de las células [3.1]. Importante
es que aparecen marcadas diferencias entre los diferentes espectros que podrían ser
útiles en el diagnóstico de cáncer.
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
300
350
400
450
500
550
600
-0.1
C33-H
SiHa_H
HeLa
CaLo
Figura. 3.7 Espectros de Fluorescencia de diversas líneas celulares.
29
650
3.6 Fluorescencia de hidrocarburos.
De hidrocarburos se obtuvieron los espectros de las gasolinas Magna, Premium y
Blanca y petróleo diáfano. Del petróleo crudo MAYA no se pudo obtener el espectro de
emisión de fluorescencia debido a su nula transparencia (este es un compuesto negro de
alta densidad y viscosidad), lo cual no permite que la fluorescencia pueda ser detectada.
Las figura 3.8 muestra los espectros de las gasolinas Premium y Magna, así como una
mezcla de ambas en igual proporción. Tanto la gasolina Premium como la Magna
generan espectros de fluorescencia similares cuando son excitados con radiación láser
de 337.1 nm. Al comparar el espectro de la mezcla contra los espectros individuales, se
observa que el espectro de la mezcla esta por encima de ambos. En otras mediciones de
mezclas de sustancias al igual que en esta se ha observado que el espectro de la mezcla
no siempre esta por encima de los espectros de los componentes, en la mayoría de los
casos el espectro de la mezcla esta por de bajo de los espectros de los componentes.
1.2
Gasolina Premium
1
Voltaje (Volts)
Gasolina Magna
0.8
Mezcla Magna y Premium
0.6
0.4
0.2
0
300
350
400
450
500
550
600
650
Longitud de onda (nm)
Figura. 3.8 Espectros de fluorescencia de las gasolinas Magna y Premium,
y una mezcla de ambas en igual proporción.
Se ha observado que algunas sustancias transparentes, tales como el alcohol metílico, el
etílico y el agua no presentan fluorescencia cuando se excitan con radiación láser de
337.1 nm , sin embargo la gasolina blanca a pesar de su transparencia fluórese. En la
figura 3.9 se muestran los espectros de fluorescencia de las gasolinas Magna, Premium
y blanca, así como la del petróleo diáfano y la de una mezcla de todas en la misma
proporción. De la figura 3.9 se aprecia una clara diferencia entre los espectros de las
gasolinas Magna y Premium con los de la gasolina blanca y el petróleo diáfano. El
espectro de fluorescencia de la mezcla se aprecia ser una combinación de los espectros
de los cuatro componentes.
30
700
1.2
Mezcla de Magna, Premium,
Blanca y PetroleoTlap
diáfano
diafano
1
Gasolina Magna
Gasolina Blanca
Voltaje (Volts)
0.8
Gasolina Premium
petróleo diáfano
Petroleo de tlapaleria
0.6
0.4
0.2
0
300
350
400
450
500
550
600
650
Longitud de onda (nm)
Figura. 3.9 Espectros de fluorescencia de las gasolinas Magna, Premium,
Blanca y petróleo diáfano y de una mezcla con las mismas cantidades de
cada una.
Referencias
[3.1]
J. E. Aubin “Autofluorescence of viable cultured mammalian cells” The
Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 27,1, 1979, pp.36-43.
31
700
Capitulo 4
Análisis de datos multivariantes.
Una señal producida por un instrumento de medición puede considerarse como una
colección de datos que difícilmente podrán utilizarse en forma directa. En la mayoría
de los casos se trata de valores de una magnitud física que resulta necesario
correlacionar con la magnitud de la variable de interés. La necesidad de tratar
adecuadamente los datos adquiridos para extraer de estos información relevante, a
llevado al desarrollo de procedimientos de análisis de datos multivariantes que en la
química analítica se denominan análisis quimiométrico. Éstos se podrían definir como
la parte de la química que, usando métodos matemáticos, estadísticos y de lógica
formal, diseña o selecciona procedimientos de medida óptimos y proporciona la
máxima información relevante de los datos analíticos.
La quimiometría abarca un gran número de temas entre los que puede incluirse el
tratamiento de señales, el diseño de experimentos, la optimización de los procesos de
análisis y síntesis, el reconocimiento de pautas, la calibración, entre otros.
La utilización de los métodos quimiométricos[4.1] permite, entre otras cosas, la
identificación de muestras, el análisis de mezclas complejas sin necesidad de
separaciones previas, la posibilidad de determinar simultáneamente varios analitos y
aumentar la sensibilidad respecto a los métodos convencionales. Las principales
ventajas que se derivan son un conocimiento más amplio del problema y la
posibilidad de una alta velocidad de análisis, lo que permite reducir costos y tiempo
de análisis.
4.1 Etapas del proceso de análisis de datos multivariantes
Para llevar a cabo un análisis cualitativo o cuantitativo, es necesario establecer
previamente, modelos capaces de predecir propiedades desconocidas de nuevas
muestras, de las cuales se ha determinado previamente la magnitud de la señal
analítica. [4.2, 4.3]
El modelado de los datos puede definirse como un proceso formado por las etapas
que se describen a continuación.
1.- Preparación del conjunto de entrenamiento. Obtención de un conjunto limitado de
muestras de las que se conozca la propiedad a determinar y que sea representativo de
las muestras para las que se quiere realizar predicciones futuras.
32
2.- Registro de las señales analíticas. La información puede provenir de fuentes muy
diversas, que en nuestro caso son los espectros de fluorescencia de 350 a 700 nm que
se obtienen cuando las muestras son excitadas con luz de 337.1 nm.
3.-Tratamiento previo de los datos.
En esta etapa se minimizan posibles
contribuciones no deseadas, presentes en las señales medidas, que disminuyen la
reproducibilidad y pueden provocar que el sistema presente ciertas características de
no-linealidad, lo que daría lugar a estimaciones menos sólidas.
4.- Construcción del modelo. Selección del modelo que establece la relación entre la
señal analítica y la variable que se desea conocer. El modelo puede tener una base
totalmente empírica o estar soportado por una base teórica que explica el fenómeno
físico o químico responsable de la señal analítica. La optimización del modelo se
realiza ensayando distintos algoritmos, tratamientos matemáticos, intervalos de
longitud de onda, etc.
5.- Validación del modelo. Aplicación del modelo establecido a un número de
muestras de las que se conoce la propiedad a determinar, que no hayan sido utilizadas
en la etapa de construcción del modelo. De esta manera se verifica que el modelo
construido constituye una correcta descripción del conjunto de datos experimentales.
6.- Predicción de nuevas muestras. Utilización del modelo construido y validado
para predecir la propiedad en muestras nuevas de las que se ha determinado
previamente la magnitud de la señal analítica.
En nuestro caso el tratamiento previo de los espectros se puede hacer usando el método
SNV (Standard Normal Variate) basado en el auto escalamiento de cada uno de los
espectros. En primer lugar el espectro a corregir (Xij) se centra restando el valor medio
(la media) del espectro de emisión de fluorescencia ( X i ) a los valores de emisión
obtenidos en cada longitud de onda j; posteriormente se escala el espectro centrado
dividiéndolo por la desviación estándar (Si), hallada al calcular la emisión media del
espectro.
Xi
SNV
=
X ij − X i
(4.1)
Si
El conjunto de espectros tratados de esta forma tiene como media el valor cero y
una varianza igual a uno. Además, son independientes de la escala original de trabajo.
Cumpliendo con el objetivo del tratamiento, que es obtener una escala común para
todos los espectros y así facilitar la comparación de estos.
33
4.2 Métodos en el análisis de datos multivariantes
4.2.1 Análisis de componentes principales (PCA)
Muchas de las herramientas quimiométricas, tanto de clasificación de muestras como
de métodos de calibración, se basan en un análisis previo en componentes principales
(PCA; Principal Component Analysis), que pone de manifiesto las relaciones
existentes entre las diferentes muestras y reduce la dimensionalidad de los datos
experimentales, por lo que es uno de los métodos principales de análisis utilizado en
este trabajo. [4.4]
Al hacer un PCA (y, en general, usando cualquier método basado en reducción de
variables), no se suelen utilizar los datos originales, sino que estos son previamente
tratados. Los tratamientos mas frecuentes son el centrado y el auto escalado.
Consideremos la matriz X de datos donde cada fila representa a una muestra y cada
columna a una variable, y si denominamos X ik al elemento de la matriz que esta en la
fila i y la columna k, se pueden efectuar las siguientes operaciones:
-Centrado por columna: Se calcula el valor medio de cada variable ( X k ) del conjunto
de calibración y se resta a cada punto ( X ik ) de la columna.
X ik
centrado
= X ik − X k
(4.2)
El valor medio corresponde al centro del modelo, y los valores de todas las variables
quedan ahora referidas a este centro, manteniendo las unidades originales.
-Auto escalado: Después de centrar cada columna, se divide el resultado por la
desviación estándar S k de la misma. De esta forma la varianza de cada variable vale
la unidad.
X ik
autoescalado
=
X ik − X k
Sk
(4.3)
Geométricamente es equivalente a cambiar la longitud de los ejes de coordenadas.
4.2.1.1 Interpretación del PCA
El espectro registrado a k longitudes de onda de una muestra puede describirse
matemáticamente como un vector con k coeficientes. Teniendo en cuenta esta
premisa, se puede considerar el espectro de cada muestra como un punto en el espacio
de k dimensiones. Si representamos los espectros de m muestras en este espacio de k
dimensiones, obtenemos una nube de m puntos dispersos, pero si las muestras estan
relacionadas los m puntos aparecerán agrupados. [4.5]
34
El objetivo del PCA es hallar las direcciones en que se ordenan los m puntos para
reducir la dimensión inicial del sistema de un valor k a un valor a ( a<k ), manteniendo
la información relevante del sistema. Geométricamente esto representa un cambio de
ejes, con lo que tendremos a los puntos en un nuevo sistema de coordenadas con
menos ejes que en el inicial. El método busca las direcciones ortogonales que
expliquen la máxima variabilidad de las muestras y las utiliza como nuevos ejes de
coordenadas. Estos nuevos ejes reciben el nombre de componentes principales (PCs).
El primer componente principal es la dirección que explica la máxima variabilidad. El
segundo se escoge de tal forma que sea perpendicular al primero, y que explique la
máxima variabilidad una vez eliminada la variabilidad explicada por el primer
componente principal, y así sucesivamente. Para poder definir matemáticamente estos
nuevos ejes se utilizan los “cargas” que son los cosenos de los ángulos que forman
cada uno de estos nuevos ejes con los antiguos. Las coordenadas de las muestras en
estos nuevos ejes son los “registros”. En la siguiente figura se muestra gráficamente el
acomodo de las componentes principales llevado a cabo por el PCA en un sistema
donde k=3 y a=2.
Figura 4.1 Interpretación geométrica de un PCA.
Matemáticamente la matriz de datos X (en nuestro caso datos espectrales) se
descompone en el producto de dos matrices, T (matriz de scores) y P (matriz de
cargas), mas una matriz E de residuales de X:
A
X = TP + E = ∑ t a p aT + E
T
a =1
35
(4.4)
Siendo t a y p a , el vector de scores y el vector de cargas del a-ésimo componente
principal respectivamente. El superíndice T indica la matriz transpuesta.
Los diferentes componentes principales no contienen la misma información. Los
primeros describen la fuente de variación más importante de los datos, que se puede
asociar a la información más relevante. En cambio, los últimos describen pequeñas
variaciones entre las muestras que pueden ser debidas al ruido instrumental o a errores
experimentales y pueden ser descartados, permitiendo así una reducción importante
del numero de variables.
Resumiendo, se puede decir que el conjunto de datos X, que estaba descrito por
variables correlacionadas, ahora esta definido por componentes principales, que son
variables no correlacionadas en un nuevo sistema de ejes ortogonales.
Existen diferentes algoritmos de cálculo para obtener la matriz T y P, el más conocido
es el algoritmo NIPALS (Nonlinear Iterative Partial Least Squares), muy utilizado
debido a que evita el calculo de todos los componentes principales posibles,
calculando sólo los que son significativos.
Un aspecto fundamental en PCA es la elección del número de componentes principales
que contienen la información relevante del sistema bajo estudio. Se han descrito
varios procedimientos para la estimación del número de componentes principales
significativos. Lo más habitual es representar la varianza explicada (o varianza
residual) en función del número de componentes principales y escoger el número
mínimo para el que no se encuentra una mejora significativa. Esta selección puede
hacerse por simple observación de la grafica.
4.2.2 Métodos de reconocimiento de pautas
Los métodos de reconocimiento de pautas pueden ser definidos como un conjunto de
técnicas quimiométricas cuyo objetivo es caracterizar la muestra a partir del
tratamiento estadístico de la información recogida. Gran parte de los métodos de
reconocimiento de pautas se dirige a condensar la información multidimensional
obtenida en unas pocas dimensiones y suministrar un criterio estadístico que permita
discernir, con un determinado nivel de confianza, si dos objetos son o no son iguales,
o si una muestra pertenece o no a una determinada clase. [4.6]
En función de si se conoce o no previamente la pertenencia de una muestra a una
determinada clase, los métodos de reconocimiento de pautas se clasifican como:
-Métodos no supervisados. En los cuales no se conoce a priori la clase a la que
pertenecen las muestras. El objetivo de estas técnicas es el estudiar si en un conjunto
grande de muestras existen grupos diferenciados de las mismas, es decir, si algunas
muestras son parecidas entre si y, a la vez, diferentes de las demás.
-Métodos supervisados. En estos se conocen a priori las clases presentes en el
conjunto de datos. El objetivo es separar estas clases y encontrar procedimientos que
permitan establecer a que clase pertenece una muestra desconocida.
36
En general, los métodos no supervisados agrupan y los supervisados clasifican. Por
tanto, los métodos supervisados son las técnicas de mayor interés para el químico
analítico ya que gran parte del análisis cualitativo podría englobarse dentro de este
epígrafe.
Para establecer las fronteras de las clases, la mayoría de estos métodos están basados
en la medida de la similitud entre objetos. El objetivo básico en todos los casos es
establecer un criterio matemático que permita expresar de forma paramétrica la
semejanza o disparidad entre dos objetos o entre un objeto y una clase, de forma que sea
posible discriminar a que clase pertenece una muestra. Fundamentalmente existen dos
formas matemáticas de expresar este concepto: medidas de correlación o de distancia.
4.3 Análisis cuantitativo.
Los métodos instrumentales de análisis son métodos relativos, en los que para
determinar la cantidad de analito presente en la muestra es necesario comparar la
propiedad medida con la de un conjunto de patrones de composición conocida.
Uno de los objetivos de los métodos quimiométricos es transformar la señal obtenida
en el análisis instrumental (sin significación química) en información útil para el
analista a través de lo que se conoce como calibración. Es por ello que la calibración,
como etapa integrante del proceso analítico, es de gran importancia y solo podrá
obtenerse una buena precisión y exactitud en los resultados si se aplica el tipo de
calibración adecuado y, evidentemente, de forma correcta.
En el ámbito de la química analítica se define calibración como el proceso que permite
establecer la relación entre la respuesta instrumental y una propiedad determinada de la
muestra, que en determinaciones cuantitativas suele ser la concentración. Esta relación
matemática que relaciona la señal analítica con la concentración se denomina modelo
o ecuación de calibración y la representación gráfica que los relaciona recibe el
nombre de curva de calibración.
4.3.1 Clasificación de los métodos de calibración.
Los métodos de calibración pueden clasificarse de diferentes maneras, en función del
criterio que se utilice. Los más habituales son los que se muestran en la tabla 4.1.
En la calibración univariable se establece la relación matemática entre una única
variable dependiente y una única variable independiente. Cuando intervienen más de
una variable se denomina calibración multivariable. Las calibraciones lineales son
las que relacionan las variables dependientes con funciones lineales de las variables
independientes, o bien con polinomios que son lineales en los coeficientes.
Cuando las funciones no son de este tipo se trata de calibraciones no lineales. Cuando
los parámetros de calibración se conocen directamente a partir de la señal individual de
cada uno de los analitos la calibración es directa. Cuando los parámetros se conocen a
partir de las señales analíticas de mezclas de los componentes, la calibración es
indirecta.
37
En la calibración clásica la variable independiente es la concentración y la variable
dependiente la señal analítica. En caso contrario estamos hablando de calibración
inversa.
Tabla 4.1 Criterios para la clasificación de los métodos de calibración.
Criterio
Dependiendo del numero de variables
Método de Calibración
Univariable
Multivariable
Dependiendo del tipo de función Lineal
matemática
No Lineal
Dependiendo de la obtención de los Directa
parámetros de calibración.
Indirecta
Dependiendo de cual es la variable Clásica
independiente
Inversa
Dentro de la calibración multivariable, los modelos pueden clasificarse en dos grandes
grupos: métodos rígidos, en los que es necesario tener información de todas las
especies presentes que pueden contribuir a la señal, y; métodos flexibles, en los que
únicamente es necesario tener información de las especies que se desea cuantificar,
aunque hayan otras especies o fenómenos físicos que contribuyan
a la señal
registrada.
Tambien se distingue entre métodos de espectro completo donde se utilizan tantas
longitudes de onda como sea posible sin ninguna selección previa, o solo se utilizan
un número reducido de variables. Dentro de los métodos de espectro completo deben
mencionarse los métodos de compresión de variables, basados en la descomposición
de los datos en componentes principales.
4.3.2 Regresión lineal múltiple (MLR)
En el método de regresión lineal múltiple (MLR Multiple Linear Regression) [4.1], se
calcula una relación lineal entre la señal y la concentración aplicando el método de
mínimos cuadrados, y se utiliza tanto en la calibración clásica como en la calibración
inversa. [4.7]
4.3.3 Regresión lineal múltiple Clásica (CLS)
Si tenemos una mezcla con P componentes que cumplen la ley de Beer y contribuyen
todos ellos a la señal registrada, la emisión de fluorescencia a j medida a la longitud de
onda j puede escribirse como:
a j = k j1c1 + k j 2 c 2 + k j 3 c3 + k jp c p + e j
38
(4.5)
Donde ci es la concentración del componente i , e j el error aleatorio asociado a la
medida y k ji es la constante de proporcionalidad de cada uno de los componentes
(producto entre el camino óptico y la absortividad molar del componente
i a la longitud de onda j ).
Si se realizan medidas de emisión de fluorescencia a k longitudes de onda, siendo k>p,
se obtiene el sistema de k ecuaciones:
a1 = k11c1 + k12 c 2 + k13 c3 + k1 p c p + e1
a j = k j1c1 + k j 2 c 2 + k j 3 c3 + k jp c p + e j
(4.6)
a = k c1 + k c 2 + k c3 + k c p + e k
k
k1
k2
k3
kp
Que puede expresarse de forma matricial como:
a = Kc + e
(4.7)
donde a es el vector de las emisiones de fluorescencia de una muestra, de dimensión
( k x l), K la matriz de las constantes, de dimensiones ( k x p), c el vector de las
concentraciones, de dimensión (P x 1) y e el vector de los residuales de las emisiones
que no ajustan correctamente el modelo, de dimensiones ( K x 1).
Utilizando un modelo como el descrito hasta ahora se obliga a la ecuación a pasar por
el origen, con lo que pequeñas diferencias en la línea base de los espectros influyen
sobremanera en los valores calculados por dicho modelo. Para evitarlo es posible
considerar una ordenada en el origen para el ajuste; se puede aumentar la dimensión de
las matrices y añadir a la matriz K una columna de unos y considerar una
concentración c 0 que dé una medida de la desviación respecto al cero. De esta forma,
la ecuación anterior puede reescribirse como:
a j = k j 0 c0 + k j1c1 + k j 2 c 2 + k j 3 c3 + k jp c p + e j
(4.8)
Siendo el valor de k j 0 la unidad. Así, las matrices de la ecuación (4.7) se expresan
como:
⎛a ⎞
⎜ 1⎟
a = ⎜⎜ a j ⎟⎟ ;
⎜⎜ a ⎟⎟
⎝ k⎠
⎛1 k
⎜
11 k12
K = ⎜1 k j1 k j 2
⎜
⎜1 k
k
k1
k2
⎝
k13
k j3
k
k3
k1 p ⎞⎟
k jp ⎟ ;
⎟
k ⎟
kp ⎠
⎛e ⎞
⎛c ⎞
⎜ 1⎟
⎜ 0⎟
c = ⎜ c j ⎟ ; e = ⎜e j ⎟
⎜ ⎟
⎜ ⎟
⎜c p ⎟
⎜e ⎟
⎝ ⎠
⎝ k⎠
(4.9)
Dependiendo del método usado para calcular la matriz K estaremos ante un método de
calibración directa o indirecta.
39
En la calibración directa [4.8], utilizada en este trabajo de tesis, los valores de la
matriz K se pueden estimar a partir de los espectros de los componentes puros de la
mezcla, de manera que, si el camino óptico es constante, cada columna de la matriz es
el espectro de una componente dividido por su concentración.
La concentración de los analitos presentes en la muestra se calcula aplicando una
regresión por mínimos cuadrados que minimice la suma de cuadrados de los residuales
(SCR):
p
∧ ⎞2
∧ ⎞2
k ⎛
k
2 k ⎛
SCR = ∑ e j = ∑ ⎜ a j − a j ⎟ = ∑ ⎜ a j − ∑ K ji c i ⎟
⎠
j =1 ⎝
i =0
j =1 ⎝
j =1
⎠
∧
(4.10)
∧
Donde a j y c i indican respectivamente, emisión y concentraciones calculadas.
Las concentraciones no conocidas de una muestra pueden calcularse a partir de la
expresión:
∧
−1
c = KT K KT a
(4.11)
(
)
∧
Donde c es el vector de concentraciones calculado, a es el vector de las emisiones de la
muestra y los superíndices T y -1 indican matriz transpuesta y matriz inversa,
respectivamente.
La calibración indirecta se efectúa utilizando diferentes mezclas de todos los
componentes. Si se utilizan M muestras de calibración (siendo M>P) se tiene una
matriz de emisiones A de dimensiones (K x M) y una matriz de concentraciones C de
dimensiones (P x M) y la ecuación (4.4) puede escribirse como:
A = KC + E
(4.12)
Siendo E la matriz de los residuales de las emisiones que no ajustan correctamente el
modelo de dimensiones (K x M) y K la matriz de constantes de dimensiones (K x P),
que se debe estimar durante el proceso de calibración.
Los valores de la matriz K son estimados por mínimos cuadrados, minimizando la
suma de los cuadrados de los errores espectrales. En la calibración, la solución por
mínimos cuadrados de la ecuación anterior es [12]:
∧
T T −1
K = AC C C
( )
(4.13)
∧
Donde K es el valor estimado de K. Conocida la matriz K, la predicción de una
muestra de concentración desconocida se efectúa mediante la ecuación (4.11).
40
4.3.4 Regresión lineal múltiple inversa (ILS)
El método de regresión lineal múltiple inversa o ILS (Inverse Least-Squares) asume
que la concentración es función de la emisión, y que el error del modelo es debido a
las concentraciones. El modelo sigue la ecuación inversa de la ley de Beer, y la
regresión se escribe como: [4.9]
ci = b0 + b1 x1 + b2 x 2 + b
x
+e
k −1 k −1 i
(4.14)
donde la concentración actúa como variable dependiente ( ci ), mientras que los valores
espectrales, registrados a distintas longitudes de onda, como variables independientes
( x ).
k
Si se desea conocer la concentración de mezclas que contienen P analitos, para
construir la calibración se registraran los espectros de M muestras de mezclas de los
analitos, para posteriormente resolver la siguiente ecuación:
C = XB + E
(4.15)
donde C es la matriz de las concentraciones, de dimensiones (MxP), X la matriz de la
señal analítica de dimensiones (MxK), E la matriz de los residuales aleatorios de las
concentraciones, de dimensiones (MxP), y B la matriz de los regresores que se calcula
a partir del calibrado, de dimensiones (KxP).
La matriz B se estima por mínimos cuadrados, minimizando el cuadrado de los errores
en las concentraciones, ya que el modelo asume que el error está en las
concentraciones. La solución por mínimos cuadrados de la ecuación de calibración es:
B = (X T X ) X T C
∧
−1
(4.16)
∧
Una vez calculada la matriz B , las concentraciones de los diferentes analitos C para
una nueva muestra se pueden hallar a partir de los datos espectrales X de la muestra
según:
∧T
∧
c = XT B
(4.17)
La utilización de la calibración ILS presenta la ventaja de que no es necesario conocer
todas las especies fluorescentes de la mezcla para la cuantificación de los P analitos de
interés. Sin embargo, los componentes no incluidos en la cuantificación deben estar
presentes en todas las muestras y son modelados implícitamente. Esta característica ha
hecho que el ILS sea ampliamente utilizado como método de calibración en
espectroscopia.
La mayor desventaja de ILS es que el numero de variables no puede ser mayor que el
numero de de muestras, por lo que el modelo se restringe únicamente a unas pocas
longitudes de onda.
41
4.4 Análisis de los espectros obtenidos.
4.4.1 Análisis de componentes principales aplicado a espectros
de diferentes tequilas.
Hacer una clasificación a simple vista de los espectros de los diferentes tequilas
(figura 3.7) es difícil, y más aun los seria si analizáramos más tequilas. Para lo cual se
tendrían mas espectros, muchos muy parecidos y algunos encimados. Aplicando a estos
el análisis de componentes principales obtenemos una clasificación de los mismos,
como lo muestra la grafica de la fig. 4.2.
15
Or
Segunda componente CP2
10
m
Gi
5
C
-5
-10
1
2
3
49
4
71
7.5
72
.08
,4
s
nto
Vie
Su
0
0
o r,
ad
1.3
l, 1
zu
A
o
3
4
l
rra
Co
.75
, -3
Td
a
orr
4C2
l
96
-0.
p,5
Re
e,
blim
9
16
3.7
04
6
7
8
9
sco
Ca
59
81
-8.
,
H
OC
L_
MI
j, Vie
10
0
6.6
41
Sta
,
Fe
Primera componente CP1
TEQUILAS
Figura 4.2 Clasificación de los espectros de fluorescencia de los espectros
de los tequilas, utilizando Análisis de Componentes Principales. El eje
horizontal solo sirve para ubicar el tequila en forma arbitraria y el eje
vertical esta relacionado con la intensidad de la fluorescencia.
En base al análisis anterior, y observando los espectros de los tequilas en la fig. 4.2,
observamos que los espectros de los tequilas oro azul y jimador muestran mayor
intensidad de fluorescencia comparada con la de los demás espectros, por lo tanto
corresponden con los puntos mas altos de la grafica 4.2, así mismo los tequilas sublime
y cuatro vientos, cuyos espectros son muy similares, se encuentran a la misma y de la
misma forma se clasifican los demás espectros. En base a este análisis es posible
identificar los tequilas más no evaluar sus contenidos.
42
59
-6.
02
4.4.2 Regresión Lineal Múltiple aplicada a espectros de
mezclas.
Considerando la regresión lineal múltiple (MLR) y utilizando el método de mínimos
cuadrados clásico (Classical Least Squares CLS), se hace un análisis de los espectros
de jugos y sus mezclas con la finalidad de determinar el porcentaje de sus componentes.
Considerando la ecuación (4.18), en donde la primera matriz corresponde al espectro
de la mezcla, la segunda matriz corresponde a los espectros de los componentes de la
mezcla en forma individual, la tercera matriz corresponde a las concentraciones de los
componentes de la mezcla, y la última matriz corresponde al error ocasionado por el
ruido.
⎡ F350 ⎤ ⎡ S 350 L
⎢ . ⎥ ⎢.
⎥ ⎢
⎢
⎢ . ⎥ = ⎢.
⎥ ⎢.
⎢
(4.18)
⎢ . ⎥ ⎢
⎢⎣ F700 ⎥⎦ ⎢⎣ S 700 L
S 350M ⎤ ⎡ C
L
⎥⎢
.
.
⎥⎢
.
⎥⎢ .
⎥⎢
.
⎥⎢ .
S 700M .⎥ ⎢⎣C M
⎦
⎤ ⎡e
⎤
⎥ ⎢ 350 ⎥
⎥ ⎢ . ⎥
⎥+⎢ . ⎥
⎥ ⎢.
⎥
⎥ ⎢
⎥
⎥ ⎢⎣e700 ⎥⎦
⎦
Se pueden calcular las concentraciones a través de:
C = ( S T S ) −1 S T r
(4.19)
donde C es la matriz de concentraciones, S es la matriz de espectros de los componentes
de la mezcla y r es la matriz del espectro de una mezcla.
Partiendo con los espectros de la mandarina, del limón y una mezcla de ambos en igual
proporción de estos, figura 3.4, se obtiene C = [C Limón=-0.0628 C Mandarina= 1.1565],
lo cual no coincide con las proporciones experimentales.
Con estas concentraciones, sin embargo se puede reconstruir el espectro de la mezcla a
partir de la ecuación (4.20).
F
λmezcla = S λLimón C Limón + S λMandarina C Mandarina + e
(4.20)
Obteniendo como resultado un espectro muy similar al medido, según se muestra en la
figura 4.3.
43
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
300
350
400 450
500
Minimos cuadrados
550
600 650
700
Mandarina y Limon
Figura 4.3. Espectros de fluorescencia medido y calculado (método de
mínimos cuadrados) de la mezcla de mandarina y limón (50 y 50 %).
Es de notarse que los espectros del limón y la mandarina, en todo el intervalo espectral
son muy similares aunque de diferente amplitud, ver figura 3.3. Por lo que en este caso
el método de regresión lineal múltiple no es adecuado para estos casos ya que genera
proporciones erróneas de los componentes
Considerando el mismo análisis aplicado a las gasolinas Magna y Premium (las cuales
poseen también espectros similares) y su mezcla en la misma proporción, a partir de los
espectros mostrados en la figura 3.9. Se obtienen la matriz de coeficientes:
⎡0.0085⎤
C=⎢
⎥
⎣1.1379 ⎦
La cual indica concentraciones que no corresponden con las establecidas
experimentalmente.
Observamos que cuando los espectros de los componentes de una mezcla son muy
parecidos entre si, el método de CLS no es apropiado ya que esto genera mucha
incertidumbre en las predicciones.
La figura 4.4 muestra el espectro medido y el calculado con dichas concentraciones.
44
1.2
1
Voltaje (Volts)
0.8
0.6
0.4
0.2
0
300
350
400
450
500
550
600
650
Longitud de onda (nm)
Mezcla Magna y Premium
r=S1*CA+S2*CB
Figura 4.4 Espectro de fluorescencia, medido y calculado de una mezcla de
gasolina magna y Premium en igual proporción.
La figura 4.5 muestra los espectros reducidos (350 a 650 nm) de fluorescencia de jugos
de limón, toronja (los cuales son muy diferentes) y de la mezcla de ambos en igual
proporción (ver figura 3.5), así como las concentraciones calculadas con la ecuación
4.19, las cuales coinciden en buena medida con la mezcla experimental establecida. En
la tabla 4.2 se muestran las concentraciones establecidas experimentalmente y
calculadas del jugo de toronja y jugo de limón, para diferentes muestras.
45
700
0.12
Voltaje (Volts)
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
350
400
450
500
550
600
650
Longitud de onda (nm)
Toronja2 R3
Limon2 R3
Mez_ToronjLimn 50y50 R3
Figura 4.5 Espectros de fluorescencia de jugos de toronja y de limón, así
como de la mezcla de ambos en igual proporción.
Tabla 4.2 Concentraciones establecidas y calculadas de jugo de toronja y
de limón.
Toronja y
limón
50% y 50%
80% y 20%
60% y 40%
40% y 60%
20% y 80%
70% y 30%
50% y 50%
Concentración del jugo de
toronja
0.4525
0.8201
0.4727
0.1425
0.0889
0.7878
0.4998
46
Concentración del jugo de
limón
0.5741
0.1886
0.5566
0.8643
0.8961
0.2272
0.5289
Referencias.
[4.1]. M. Porcel “Aplicación de técnicas quimiométricas para el desarrollo de nuevos
métodos
cinéticoespectrofotométricos de análisis”, Tesis, 2001,
http://www.tesisenxarxa.net/TDX-0111102-111615/index.html
[4.2]. S. Macho, “Metodologías analíticas basadas en espectroscopia de infarrojo y
calibración multivariante. Aplicación a la industria petroquímica”
http://www.tdx.cesca.es/TESIS_URV/AVAILABLE/TDX-0621102113818//tesis_smacho.pdf
Guimet Vila F. “Olive oil characterization using excitation-emission
fluorescente s
pectroscopy and three-way methods of análisis” Doctoral Thesis Universitat
Rovira i Virgili,
[4.3].
[4.4]. D. Peña, “Análisis de datos multivariantes”, Mc Graw Hill, 2000.
[4.5]. César Pérez “Tecnicas de Análisis Multivariante de datos Aplicaciones con
SPSS”,
Prentice Hall, 2004.
[4.6].
J. C. Millar, J. N. Millar “Estadística y quimiometría para química analítica”,
Prentice Hall, 2002.
[4.7]. UV Spectroscopy Techniques, instrumentation, data
SPECTROMETRY
GROUP) B. J. CLARK, T. FROST , M.A. RUSSELL.
handling
(UV
[4.8]. J. Ferre, “Calibración multivariante en análisis cuantitativo. EL modelo directo”
http://www.quimica.urv.es/quimio/general/calmul.pdf , 2007
[4.9]. J. Ferre, “Calibración multivariante en análisis cuantitativo. EL modelo inverso”
http://www.quimica.urv.es/quimio/general/calmul.pdf , 2007
47
CONCLUSIONES
Se midieron los espectros de fluorescencia de diferentes sustancias con un sistema LIF,
que usa como fuente de excitación un láser pulsado de N2 (337.1 nm) y con el fin de
establecer un método de análisis que permita calcular el contenido de los componentes
en éstas, se usaron los métodos de análisis multivariante de regresión lineal múltiple y
de componentes principales.
El método de regresión lineal múltiple se uso partiendo de la medición de los métodos
de fluorescencia de las componentes de una mezcla y de la mezcla misma, para con
estos determinar el porcentaje de los componentes en la mezcla. Los porcentajes
calculados coinciden con los establecidos experimentalmente sólo cuando los patrones
de los espectros de las componentes difieren entre sí de manera considerable (por
ejemplo jugos de toronja y limón). Cuando este no es el caso (como entre los jugos de
limón y mandarina; o entre los diferentes tipos de gasolina) el método no es útil.
El método de componentes principales permite establecer, partiendo de los espectros de
fluorescencia de sustancias en las que no se conocen los espectros de fluorescencia de
sus componentes (por ejemplo tequilas), una clasificación de estos para ubicarlos en
algún grupo. Este estudio muestra que los espectros de los tequilas analizados poseen
espectros de fluorescencia con patrones muy similares pero con intensidades diferentes,
por lo que el método sólo los puede agrupar en función de estas intensidades.
Experimentalmente se encontró que la intensidad de la fluorescencia de los tequilas está
directamente relacionada con su valor comercial.
48
Recomendaciones para trabajo a futuro
De las conclusiones y resultados del capítulo 3 resulta obvio el requerimiento de
profundizar en el estudio de las diferentes técnicas del análisis multivariable para evitar
las deficiencias del método de regresión lineal múltiple y así poder realizar estimaciones
adecuadas cuando los espectros de fluorescencia de las componentes de una mezcla son
similares, e incluso dar cuenta de componentes que se presentan sólo cuando existe la
mezcla.
Un caso importante por analizar son los resultados mostrados en la figura 3.8, en los que
siendo los espectros de las gasolinas Premium y Magna prácticamente idénticos, cuando
estas se mezclan en iguales proporciones generan otro espectro similar pero de mayor
intensidad.
Así mismo es necesaria la realización de más mediciones alrededor de células cultivadas
para generar una base de espectros de fluorescencia del material biológico que
componen el tejido humano. Dicha información sería de utilidad para la evaluación
cuantitativa de diferentes enfermedades en el cuerpo humano y en particular la del
cáncer.
49
Acrónimos
μm
(PCR)
ACP
ADL
CLS
CR
FWHM
ILS
LIF
MLR
ms
N2
nm
ns
PARAFAC
PC
PLS
PMT
rayos γ
RMN
So y S1
ILS
ANN
FDL
UV
μJ
Hz
GPIB
MS/s
TTL
PVC
Micrómetros
Regresión de componentes principales
Análisis de componentes principales
Análisis discriminante lineal
Regresión lineal multiple (Classical Least Squares)
Regresión continua
Ancho a la mitad del máximo
Inverse Least Squares
Fluorescencia Inducida por Láser
Regresión Lineal Múltiple
Milisegundos
Nitrógeno
Manómetros
Nanosegundos
Análisis Factorial Paralelo (Parallel factor analysis)
Computadora personal
Regresión parcial de mínimos cuadrados
Tubo Fotomultiplicador
Rayos gama
Resonancia magnética nuclear
Primero y segundo estado excitado de un singulete
Regresión Lineal múltiple inversa
Redes Neuronales Artificiales
Funcion Discriminante lineal
Ultravioleta
Microjoules
Hertz
General Propose Bus Interface (Bus-Interfase de Propósito General)
Mega muestras por segundo (Megasamples per second)
Lógica Transistor Transistor (Transistor Transistor Logia)
Polivinilo cloruro (Polyvinyl Chloride)
50
Apéndice A-1
Hojas de datos del fotomultiplicador R955
51
52
53
54
Apéndice A-2
Hojas de datos del fotodetector MRD500
55
56
57
Apéndice A-3
El proceso de obtención de espectros de emisión de fluorescencia se realiza de una
forma programada de acuerdo con el siguiente diagrama de flujo.
Diagrama de flujo para la obtención de espectros de emisión de
fluorescencia
Algunas de las abreviaciones utilizadas en el diagrama de flujo se definen a
continuación.
L_ONDA INICIAL: Es la longitud de onda inicial en donde el monocromador
comenzará el barrido para obtener el espectro. Este valor lo define el usuario en el
programa.
V/DIV: Coloca las escalas de tensión de los canales del osciloscopio, Este valor
también lo define el usuario mediante los controles que aparecen en el programa.
58
SEC/DIV: Aquí se define la escala de tiempo del osciloscopio. Se define en el programa
de usuario
VMAX CH1?, VMAX CH2?: La PC le pide los valores de tensión pico al osciloscopio
correspondientes a la señal presente en los canales 1 y 2 respectivamente.
PROMEDIO DE 256 SEÑALES: En el osciloscopio se realiza el promedio de 256
señales consecutivas con el fin de reducir el ruido aleatorio y enviar una sola señal que
represente el promedio de éstas. Con esto se reduce también el tiempo de transmisión de
información entre el osciloscopio y la PC. Los pulsos de un láser de N2, por generarse a
través de una descarga eléctrica, varían su amplitud dentro de un intervalo por lo que el
proceso de promediación es necesario para obtener señales más estables. Este proceso
es el mas largo de todos (4 segundos si el láser opera a una frecuencia de 60 Hz
aproximadamente).
PEDIR FORMA DE ONDA: Aquí se realiza el proceso de adquisición de los datos
numéricos de la forma de onda presente en cada canal.
GRABAR VMAX1, VMAX2, LONDA: Se guardan los valores correspondientes en
una hoja de cálculo de Microsoft Excel para su posterior graficación.
L_ACT: Es la longitud de onda en que esta posicionado el osciloscopio.
INC L_ACT: Se incrementa la longitud de onda actual de acuerdo a los pasos
incrementales definidos por el usuario en el programa para continuar el barrido.
L_FIN: Longitud de onda final definida también en el programa de usuario.
En el archivo de Excel generado se guarda en la primer columna el valor de la longitud
de onda, después el valor de la tensión pico del canal 1 (pulso de referencia), en la tercer
columna se guarda el valor de tensión pico en el canal 2 (señal del PMT) y por último
en la cuarta columna se guarda la relación de fluorescencia entre los pulsos del láser
esto con el fin de normalizar la señal de fluorescencia con respecto a las variaciones del
láser.
El espectro de emisión se obtiene graficando la cuarta columna (Fluorescencia
normalizada) a cada longitud de onda incluida en el intervalo de barrido.
Interfase de usuario
Con el software desarrollado en LabView de National Instruments® se pueden
seleccionar las condiciones de operación del sistema para la obtención de los espectros
de emisión.
En la siguiente figura se muestra esta interfase editada y posteriormente se da una
pequeña descripción de la función de los controles e indicadores marcados por un
número.
59
Interfase de usuario programado en LabView 6i
Los nombres de los controles de la interfase de usuario son los siguientes:
1. Barra de selección de escala de tiempo
2. Escala de tensión del canal 1
3. Escala de tensión del canal 2
6. Longitud de onda inicial del barrido
7. Incremento o resolución
8. Longitud de onda final del barrido
9. Puerto serial donde se encuentra conectado el monocromador
10. Nombre del archivo en donde se guardarán los datos para graficar el espectro
11. Palanca de selección para la función que se desea realizar
13. Ejecución del proceso
Y los indicadores son los siguientes:
4. Pantalla para desplegado de las señales en el tiempo
5. Barra de progreso en el barrido
12. Pantalla de espectro
60
Operación de la interfase de usuario
Se deben seguir tres pasos para poner en marcha el programa de generación de
espectros.
Paso N.1
Inicialización de comunicación entre el monocromador y la PC
Para ejecutar el programa, el monocromador debe inicializarse solamente la primera
vez, después de esto, no es necesario repetir el proceso a menos que la PC o el
monocromador se apaguen.
Para realizar esta operación, la palanca de selección (11) debe colocarse en la primera
posición (Iniciar Monocromador) y presionar la flecha que corra el proceso (13).
Encender el monocromador y esperar unos segundos. El programa responderá
presentando una pequeña ventana pidiendo que se verifique la leyenda “COMPUTER
CONTROL” en el display del monocromador como lo indica la siguiente figura, si este
mensaje aparece, el monocromador ha iniciado su comunicación correctamente con la
PC, si no es así, se debe repetir el proceso o verificar la conexión al puerto serie.
Inicialización del sistema
Paso N.2
Posicionamiento del monocromador al inicio del intervalo de barrido
Una vez iniciada la comunicación entre el monocromador y la PC éste se debe
posicionar al inicio del rango en el cual se desea hacer el barrido. Para realizar esto la
palanca de selección (11) debe recorrerse hasta la función llamada “Posición Inicial” y
presionar la flecha que corra el proceso (13). El monocromador, ya inicializado, deberá
responder recorriéndose a la posición que el usuario haya definido en el control 6.
61
Paso N.3
Ejecución del barrido
Antes de ejecutar el barrido se debe escribir el nombre de un archivo, en formato
Excel®, en donde se guardarán los puntos del espectro obtenido. Finalmente se cambia
la palanca de función a la segunda posición (Barrido) y se presiona la flecha de
ejecución del proceso (13). Así iniciará el proceso de barrido mostrándose en la barra de
progreso (5) el avance parcial de éste.
Conforme avanza el proceso, en la pantalla de espectro (12) se irá mostrando
parcialmente el espectro obtenido.
El proceso puede interrumpirse en cualquier momento, si así se desea presionando el
botón de stop situado a un costado de
la flecha de ejecución de proceso.
62