Diagnóstico de PRRSV : su importancia
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Diagnóstico de PRRSV : su importancia
“Diagnóstico de PRRSV : su importancia” Fernando A. Osorio Professor Nebraska Center for Virology and School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences University of Nebraska-Lincoln [email protected] Esta platica incluirá: Diagnostico serológico Diagnostico por aislamiento viral Diagnostico molecular PRRSV en un cerdo : Efectividad de diferentes tecnicas de diagnostico en diferentes fases de la infeccion Viremia Carga viral en tejidos Diagnos(co por necropsia y muestreo de animales clinicamente infectados: PCR/AV/IHC/ISH Respuesta total de An@cuerpos (ELISA Idexx) Infeccion con PRRSV 0 1 mo. 2 mos. +/-‐ 5 mos. +1 yr Diagnos(co por serologia ELISA en suero o fluidos orales Diagnos(co viremia PCR/Aislamiento Viral Diagnos(co Infeccion por analisis de fluidos orales PCR Diagnos(co Infeccion por bioensayo o cerdos cen(nelas Animales Reactores Positivos Unicos al PRRS ELISA “Singleton” Animales Reactores Positivos Unicos al PRRS ELISA Alternativas: 1. Repetir ensayo (singleton y sus contactos) 2.Ensayo serologico alternativo Inmunofluorescencia indirecta (IFI) ELISAs de bloqueo o competitivas 3. Bio-ensayo in vivo Immunofluorescencia Indirecta para Serologia de PRRSV 3. Ig andti-Ig procina marcada con fluoresceina 2. Suero del porcino 1. Celulas infectadas con PRRSV y fijadas (Ag) Animales Reactores Positivos Unicos al PRRS ELISA Resultado del Primer test de ELISA Posibles resultados de la repeticion del ensayo Cerdo 1: Sospechado de infeccion Deteccion de PRRSV Por bio-ensayo Necropsia: Pulmon Linfonodos Tonsilas Bazo/Otros tejidos Cerdo 2: 100% susceptible (libre de PRRSV) Inoculacion IP /IM Homogenaado del pool de tejidos ELISA sseroconverssion Viremia Respuesta positiva en Cerdo 2 Que lineas celulares se pueden usar para aislar PRRSV de muestras clinicas? MARC celulas de riñón de mono (Kwang et al 1993) Macrofagos alveolares del cerdo riñón 18h ZMAC Cells No inoculadas Inoculadas con PRRSV ZMAC Zuckermann et al (UIUC, 2010) Eficiencia superior de la linea macrofagica porcina ZMAC para aislar PRRSV , comparada con las celulas MARC-145 y los cultivos de macrofagos alveolares (PAM) Cortesia de Dr. Federico Zuckermann (UIUC) Aislamiento de PRRSV en celulas Practicidad vs. Eficacia Pros Celulas MARC 145 • Linea celular mas • No son sensibles a accesible a laboratorios muchas cepas de PRRSV Cul(vos de Macrofagos • Sensibles a las mayoria Alveolares Porcinos de cepas de PRRSV ( PAM) Linea de macrofagos porcinos ZMAC Contras • MUY sensibles a la mayoria de cepas de PRRSV/Op(ma sensibilidad • Solo 30 % de las PAM replican PRRSV • Dificiles de preparar • Mas dificiles de crecer mantener y estandardizar en diferentes laboratorios RT-PCR para deteccion de PRRSV RT PRRSV PRRSV PRRSV RNA cDNA PCR Plataforma Para el Test de PCR Tiempo Real Cepheid Smart Cycler Cortesia Dra. Jane Christopher-‐Hennings SDSU Reac(vos listos para su uso. pre-‐ montados en el tubo de reaccion y liofilizados Cortesia Dra. Jane Christopher-‐Hennings SDSU Presentacion como kit comercial Cortesia Dra. Jane Christopher-‐Hennings SDSU Principio de Accion de la 5’nuclease (Real-‐Time) PCR Argon Laser Add polymerase, dNTPs, primers, and Taqman probe Charge coupled device Begin PCR DNA R R denature anneal Q Each reporter dye represents one strand of amplified DNA Cortesia Dra. Jane Christopher-‐Hennings SDSU Principio de accion del sistema de faro molecular ( “molecular beacon” )para Real-‐ Time PCR Argon Laser Add polymerase, dNTPs, primers, and molecular beacon Charge coupled device DNA Molecular beacon R Q R Q Each reporter dye represents one strand of amplified DNA Cortesia Dra. Jane Christopher-‐Hennings SDSU Results North American PRRSV Cortesia Dra. Jane Christopher-Hennings SDSU Curva estandar para cuantificar ARN de PRRSV Cortesia Dra. Jane Christopher-Hennings SDSU Muestras de campo (semen). Curva de amplificacion Cortesia Dra. Jane Christopher-Hennings SDSU Carga viral en suero y semen por PCR Boar 2 Boar 1 10000000 copies/ml copies/ml 10000000 100000 1000 1 5 10 15 19 24 29 36 44 58 72 1 86 5 10 15 19 24 29 36 44 58 Days post inoculation Days post inoculation Boar 3 Boar 4 72 86 10000000 copies/ml 10000000 copies/ml 1000 10 10 100000 1000 100000 1000 10 10 1 5 10 15 19 24 29 36 44 58 72 1 86 5 10 15 19 24 29 36 44 58 Days post inoculation Days post inoculation Boar 5 Boar 6 72 86 72 86 10000000 copies/ml 10000000 copies/ml 100000 100000 1000 100000 1000 10 10 1 5 10 15 19 24 29 36 44 58 Days post inoculation 72 86 1 5 10 15 19 24 29 36 44 58 Days post inoculation Cortesia Dra. Jane Christopher-Hennings SDSU Cuantificacion molecular de PRRSV in vivo (viremia) PCR cuantitativa de ultima generacion: PCR digital “a gotita”(droplet digital PCR ddPCR) La muestra amplificar es dividida en 20.000 goticulas identicas ( los DNAs background y el target se distribuyen aleatoriamente) positiva negativa Amplificacion cada gota es una medicion digital independiente Resultado : X copias target (concentracion directa)