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Revista Científica Agropecuaria 17(1-2): 7-15(2013)
© 2013 Facultad de Ciencias Agropecuarias - UNER
EFECTO DE MEDIOS DE CULTIVO EN EL CRECIMIENTO IN VITRO DE
ONCIDIUM BIFOLIUM SIMS. “FEDERAL”
Carlos A. DALZOTTO1*
1
Becario de Iniciación en la Investigación del Proyecto PID UNER 2144. Laboratorio de Cultivo de Tejidos
Vegetales. Facultad de Ciencias Agropecuarias (UNER). Ruta 11, km 10,5 (3101) Oro Verde, Entre Ríos.
* Autor para correspondencia ([email protected])
RESUMEN
El objetivo de este trabajo fue, evaluar el efecto de 4 medios de cultivo
utilizando azúcar refinada, agua de coco y 2 fertilizantes foliares comerciales
adicionados al medio base de Murashige y Skoog, 1962 (MS) durante el
crecimiento in vitro de plántulas de Oncidium bifolium Sims. “federal”. A partir
de 120 plantas de O. bifolium “federal” de 261 días cultivadas in vitro, fueron
repicadas a 4 medios de cultivo (M); M1: MS completo + 30 g.L-1 de sacarosa;
M2: MS a la mitad de la concentración +30 g. L-1 de azúcar refinada + 120 ml.L-1
agua de coco; M3: M2 + 1 g.L-1 fertilizante Peters® (20-20-20); M3: M2 + 1 g.L1
fertilizante Peters® (10-30-20). A los 95 días después del repique los medios
M2, M3 y M4 presentaron los mayores valores promedios en altura de plantas,
número de raíces y materia seca total, sin que se observaran diferencias
significativas (p≤0,05) entre ellos; sí mostraron diferencias significativas
(p≤0,05) con respecto al M1. El M4 fue el que presentó el mayor porcentaje de
plantas con pseudobulbos y la longitud de los mismos mostró diferencias
significativas (p≤0,05) con respecto a los otros medios. El mayor porcentaje de
plantas con brotes correspondió al medio M2; y el número y longitud de los
brotes no presentaron diferencias significativas (p≤0,05) entre los diferentes
medios de cultivo. La relación biomasa aérea/raíz fue superior a 1 en todos los
casos; el mayor incremento de la materia seca en el sistema radical fue
observado en las plantas cultivadas en los medios M2, M3 y M4. Posteriormente,
las plantas fueron extraídas de los frascos, lavadas y plantadas en palo con
musgo de Sphagnum. A los 135 días después del trasplante, la supervivencia de
las plantas fue del 95%, presentando buen y crecimiento y aspecto general.
Palabras clave: orquídeas, crecimiento in vitro, medios de cultivo, rusticación
SUMMARY
Effects of “in vitro” culture media and growing of Oncidium bifolium Sims.
“federal”
The objective of this work was to evaluate the effect of four culture media using
refined sugar, coconut water and two commercial foliar fertilizers added to the
base culture of Murashige y Skoog, 1962 (MS) during the “in vitro” growing of
Oncidium bifolium Sims. “federal” seedlings. From 120 plants of O. bifolium
that were 261 days before cultured in vitro, they were transplanted to 4 culture
*Original recibido (24/04/13)
Original aceptado (06/11/13)
Carlos A. Dalzotto
media (M); M1: MS full strength + 30g.L-1 of saccharose; M2: MS half strength
+ 30g.L-1 of refined sugar +120 ml.L-1 of coconut water; M3: M2 + 1g.L-1 of
Peter fertilizer (20-20-20); M3: M2 +1g.L-1 of Peter fertilizer (10-30-20). Ninety
five days after the transplant the cultures M2, M3 and M4 presented the higher
average values in plants, roots number and total dry matter with no apparent
significant differences (p< 0.05) between them; though they showed significant
differences (p< 0.05) with respect to M1. M4 presented the higher percentage of
seedlings with pseudobulbs and the length thereof showed significant differences
with respect to the other media. The higher percentage of plants with shoots
corresponded to M2 media; and the number and length of the shoots did not
present significant differences (p< 0.05) among the different media. The
area/root biomass relationship was superior to 1 in all cases; the higher increment
in the dry matter of the radical system was observed in plants cultured in M2, M3
and M4 media. Later, the plants were extracted of the jars, washed and planted in
a stick with moss of Sphagnum. After 135 days of the transplantation, the
survival of plants was 95%, showing general good looking and growing.
Key words: orchids; in vitro growth; culture media, rustication
Introducción
Las orquídeas (Orchidaceae) pertenecen
a una de las familias más diversas del reino
vegetal, con aproximadamente 880 géneros
y más de 22075 especies (Stevens, 2008). El
género Oncidium, es un grupo de orquídeas
de origen americano, muchas de ellas
nativas de la Argentina (Freuler, 2008). En
la provincia de Entre Ríos, O. bifolium está
citada como especie epífita nativa cuya
distribución es amplia en toda la zona litoral
y centro norte del país, siendo la provincia
de Buenos Aires su límite austral (Cellini et
al., 2009). En Entre Ríos se encuentra
confinada a los cursos de agua de los arroyos
y en la zona del delta del Paraná. Si bien la
especie tipo suele tener variaciones en
cuanto al tamaño de la flor y pigmentación
de los pétalos, se han producido variaciones
naturales con pétalos sin pigmentación
(amarillo entero) y otros con pigmentación
rojo vináceo uniforme. Estas variedades
naturales han sido denominadas como
“pétalos amarillos” y “federal”, respectivamente y no resulta fácil su localización.
8
El cultivo in vitro es una técnica
biotecnológica de extendido uso tanto en el
campo de la investigación básica y aplicada,
como en producción comercial. Ésta consiste
en una serie de procedimientos que permiten
el crecimiento de pequeñas partes de un
vegetal, cultivadas asépticamente en
condiciones de ambiente y nutrición
controladas (Hartmann y Kester, 1999).
El medio de cultivo empleado en la micro
propagación consiste en una mezcla de sales
inorgánicas y compuestos orgánicos
requeridos para la nutrición de los cultivos y
existen
numerosas
formulaciones
(Flachsland et al., 1996; Mroginski et al.,
2010). Una de las variantes dentro del
cultivo in vitro es la adición de compuestos
orgánicos al medio de cultivo basal (Pierick,
1990). Entre los más utilizados en la
micropropagación de orquídeas se destacan
la utilización de pulpa de frutas y el agua de
coco (Flores – Escobar et al. 2008, 2011;
Stancato et al., 2008; Salazar – Mercado,
2012). En este contexto, la adición de
compuestos orgánicos es de suma
importancia para el desarrollo de las plantas
y favorece en gran medida el crecimiento,
RCA. Rev. cient. agropecu. 17(1-2): 7-15 (2013)
Efecto de medios de cultivo en el crecimiento in vitro de Oncidium bifolium Sims. “federal”
así como la formación de raíces y
pseudobulbos por la alta concentración de
azúcares,
aminoácidos,
antioxidantes,
minerales, ácidos orgánicos y agentes
promotores del crecimiento que contienen
(Moreno Martínez y Menchaca García,
2007). Por otra parte, varios autores (Rego Oliveira y Tadeu de Faria, 2005; Unemoto et
al., 2007; Romero – Tirado et al., 2007;
Pedroso de Moraes et al., 2009), destacan la
importancia en el uso de fertilizantes
comerciales como un medio para facilitar la
preparación de medios de cultivo, y la
reducción de los costos de producción en
varias especies de orquídea.
En vista de lo anterior, el objetivo de este
trabajo fue, evaluar el efecto de 4 medios de
cultivo utilizando azúcar refinada, agua de
coco y 2 fertilizantes foliares comerciales
adicionados al medio basal de Murashige y
Skoog 1962 (MS) durante el crecimiento in
vitro de plantas de O. bifolium Sims.
“federal”.
Materiales y métodos
Esta experiencia se desarrolló en el
Laboratorio de Cultivos de Tejidos Vegetales,
del espacio curricular Fisiología Vegetal, de la
Facultad de Ciencias Agropecuarias (UNER).
Se partió de plantas de O. bifolium “federal” de
261 días cultivadas in vitro. Estas plantas fueron
cultivadas previamente en el mismo laboratorio,
en un medio de cultivo semisólido MS, a la
mitad de la concentración suplementado con 30
g. L-1 de sacarosa y 5 g. L-1 de Agar Agar
Britania; pH 5,6 – 5,8. Estas plantas fueron
transferidas a diferentes medios de cultivo (M)
(Cuadro 1), suplementados con 5 g. L-1 de Agar
Agar Britania y el pH fue ajustado entre 5,6 –
5,8. Los medios de cultivos se esterilizaron en
autoclave a 121 ºC y 1 kg cm2 de presión durante
15 minutos. El agua de coco se extrajo de frutos
frescos.
Se emplearon 6 frascos (repeticiones) de 150
ml conteniendo 30 ml de cada medio de cultivo.
Se cultivaron por frasco 5 plantas de 1 – 1,5 cm
de altura, 4 - 5 hojas y 1 - 3 raíces. Las plantas
repicadas a los diferentes medios de cultivos se
llevaron a cámara de crecimiento a una
temperatura de 24 ± 1 ºC y un fotoperíodo de 16
horas, con luz grow lux e incandescente.
Cuadro 1. Medios de cultivo evaluados durante el crecimiento “in vitro” de plantas de O. bifolium
“federal”
Medios de
cultivos (M)
Composición
M1
MS medio basal completo + 30 g.L-1 de sacarosa grado analítico
M2
Sales de MS a la mitad de la concentración +30 g.L-1 de azúcar refinada + 120
ml.L-1 agua de coco
M3
Sales de MS a la mitad de la concentración + 30 g.L-1 de azúcar refinada + 120
ml.L-1 agua de coco + 1 g.L-1 fertilizante Peters® (NPK, 20-20-20)
M4
Sales de MS a la mitad de la concentración + 30 g.L-1 de azúcar refinada + 120
ml.L-1 agua de coco + 1 g.L-1 fertilizante Peters® (NPK, 10-30-20)
A los 95 días después del repique (ddr) se
evaluaron las siguientes variables:
a) Altura de planta: tomada de la base de
la planta a la punta de la hoja más larga con
calibre digital.
RCA. Rev. cient. agropecu. 17(2): 7-15 (2012)
b) Número de raíces formadas por planta.
c) Ausencia o presencia de pseudobulbos:
expresándose en porcentaje de planta con
pseudobulbo.
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Carlos A. Dalzotto
d) Longitud de los pseudobulbos: en
aquellas plantas que presentaban pseudobulbo se
midió su longitud con calibre digital.
e) Ausencia o presencia de brotes:
expresándose en porcentaje de plantas con
brotes.
f) Altura de los brotes: en aquellas plantas
que presentaban brotes se midió su altura con
calibre digital.
g) Peso seco de biomasa total, biomasa
aérea y biomasa de
raíces: para la
determinación del peso seco se tomaron al azar
15 plantas de cada tratamiento y se pesaron en
una balanza de precisión por separado la biomasa
aérea y las raíces de cada planta, obteniéndose el
peso fresco. Posteriormente se llevaron a estufa a
una temperatura de 85 ºC hasta peso constante y
se pesaron nuevamente obteniéndose el peso
seco de biomasa aérea y el peso seco de las
raíces.
h) Relación biomasa aérea/raíz: dicha
relación se obtuvo a partir de los valores de peso
seco de biomasa aérea y de biomasa de raíces.
Los datos obtenidos de las variables
biométricas a), b), d), f) y g) se analizaron
estadísticamente, a partir de un diseño totalmente
al azar. Se efectuaron análisis de varianza y la
diferencia entre medias empleando la prueba de
Duncan para un nivel de significación del 95 %
(p≤0,05) utilizando el software InfoStat (Di
Rienzo et al., 2008).
Rusticación
Las plantas logradas in vitro fueron
acondicionadas para la etapa de aclimatación exvitro. Para ello se retiraron del medio semisólido
un total de 76 plantas, independientemente del
tratamiento que provenían, se lavaron sus raíces
con agua para eliminar restos de medio y luego
se sumergieron unos minutos en una solución de
fungicida (Carbendazim, 0,1 ml L-1). Las plantas
se colocaron en forma masiva (4 a 7 plantas) en
recipientes de polipropileno de 6 cm de altura x 8
cm de diámetro conteniendo piedra mora partida
de tamaño pequeño hasta ¾ partes de la altura.
Una vez completados los vasos, se colocaron en
una bandeja, se aplicó nuevamente el fungicida
Carbendazim con aspersor manual, y se los
cubrió con una bolsa de nylon para evitar la
pérdida de agua por evaporación y lograr un
efecto de cámara húmeda. En estas condiciones
10
las plantas permanecieron una semana en
laboratorio con luz natural difusa. Posteriormente
las plantas se sacaron de los recipientes y fueron
montadas en palos de Bignonia de 15 cm de
longitud por 1,5 a 3 cm de diámetro sin
esterilizar. En su parte media se apoyaron dos
plantas de O. bifolium “federal”, se les cubrieron
las raíces con musgo de Sphagnum y se ataron
con hilo encerado, de manera que quedaran
firmes en el palo. Las plantas fueron regadas
periódicamente en condiciones de laboratorio
durante 30 días, luego fueron llevadas al
invernáculo. A los 135 días después del
transplante a palo, se evaluó la supervivencia,
altura de plantas, número de brotes por plantas y
presencia de pseudobulbos.
Resultados
Desde los primeros 30 días después del
repique (ddr) se visualizaron diferencias en
el tamaño de las plantas, así como en la
formación de raíces y pseudobulbos en cada
medio de cultivo.
Cuadro 2. Valores medios para altura de planta
de O. bifolium “federal” cultivados en los
diferentes medios de cultivo (M) a los 95 días
después del repique. Letras distintas indican
diferencias significativas (p≤0,05). Coeficiente
de variación 25,19%
Medios de cultivo
(M)
M1
M2
M3
M4
Altura de (mm)
26,4
44,9
48,0
49,2
a
b
b
b
A los 95 ddr los medios de cultivo M2,
M3 y M4 presentaron las medias más altas
para las variables altura de planta (Cuadro 2)
y número de raíces (Cuadro 3), sin que se
observaran
diferencias
significativas
(p≤0,05) entre ellas; pero sí evidenciaron
diferencias significativas (p≤0,05) con
respecto a M1 (Figura 3).
Cuadro 3. Valores medios número de raíces en
planta de O. bifolium “federal” cultivados en los
diferencias significativas (p≤0,05). Coeficiente
de variación 32,76%
Plantas con pseudobulbos (%)
Medios de cultivo
(M)
M1
M4
M2
M3
Número de raíces
3,3
5,9
6,1
7,0
a
b
bc
c
Cuadro 4. Valores medios longitud de
pseudobulbo en plantas de O. bifolium “federal”
cultivados en los diferentes medios de cultivo
(M) a los 95 días después del repique. Letras
distintas indican diferencias significativas
(p≤0,05). Coeficiente de variación 21,55%
Medios de
cultivo (M)
M1
M2
M3
M4
Longitud de
pseudobulbo (mm)
10,1
a
14,0
b
14,3
b
16,8
c
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
M1
M2
M3
M4
Medios de cultivo (M)
Figura 1. Porcentaje de plantas (%) de O. bifolium “federal” con pseudobulbos cultivadas en los
diferentes medios de cultivos, a los 95 días después del repique
El mayor porcentaje de plantas que
lograron
la
formación
de
brotes
correspondió al medio de cultivo M2, siendo
del 67%, mientras que para los medios de
cultivo M1, M3 y M4 fue de 60%, 57% y
50% respectivamente (Figura 2).
Figura 2. Porcentaje de plantas con brotes (%)
en los diferentes medios de cultivos, a los 95 días
después del repique, en O. bifolium “federal”
Porcentaje de plantas con
brotes (%)
El medio de cultivo M4 presentó el
mayor
porcentaje
de
plantas
con
pseudobulbos (77%) y la longitud de los
mismos mostró diferencias significativas
(p≤0,05) con respecto a los medios de
cultivo M1, M2 y M3. El menor porcentaje
de plantas con pseudobulbos (Figura 1) y
longitud (Cuadro 4), correspondió al medio
de cultivo M1.
70
60
50
40
30
20
10
0
M1
M2
M3
M4
Las variables número de brotes por
plantas y longitud de los brotes no
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Carlos A. Dalzotto
presentaron diferencias significativas (p<=
0,05) entre los diferentes medios de cultivo.
Aunque se observó una tendencia en M1 con
menor número y altura de brotes y M4 con
mayor (Cuadro 5).
La materia seca a los 95 días de
crecimiento in vitro en los diferentes medios
de cultivo, indicó un mayor porcentaje
acumulado a nivel raíz en comparación con
la parte aérea (Cuadro 6) y esa diferencia se
destacó aún más en las plantas cultivadas en
el medio de cultivo M4.
M1
Cuadro 5. Valores medios para número de
brotes por plantas y longitud de brotes, en planta
de O. bifolium “federal” cultivados en los
diferencias
significativas
(p≤0,05).
CV:
Coeficiente de variación
M2
Medios de
cultivo
(M)
M1
M2
M3
M4
CV (%)
Número de
brotes
Altura de
brotes (mm)
1,0
1,5
1,8
1,9
60,46
14,7
18,3
18,6
22,2
56,43
M3
a
ab
b
b
a
ab
ab
b
M4
Figura 3. Plantas de O. bifolium “federal” cultivadas “in vitro” a los 95 días después del repique en
los diferentes medios de cultivo (M). A) M1: MS B) M2: MS + agua de coco; C) M3: MS + agua de
coco + fertilizante (20-20-20); D) M4: MS + agua de coco + fertilizante (10-30-20)
Cuadro 6. Porcentaje de materia seca de la biomasa aérea, raíces y total de plantas de O. bifolium
“federal”, cultivadas en los diferentes medios de cultivo (M) a los 95 días después del repique
M1
M2
M3
M4
12
Biomasa aérea
7,73
7,39
7,08
7,07
Materia seca (%)
Biomasa raíces
12,69
13,60
12,51
14,95
Biomasa total
8,12
8,66
8,12
8,44
En relación al peso seco por planta, tanto
en biomasa aérea, raíces y totales, las que
fueron cultivadas en los medios de cultivo
M2, M3, y M4 presentaron los mayores
valores
medios,
no
encontrándose
diferencias significativas (p≤0,05) entre
ellos. Mientras que el medio de cultivo M1
fue el que presentó menor peso seco,
mostrando diferencias significativas en
relación a los demás medios de cultivo (M2,
M3 y M4) (Cuadro 7).
Cuadro 7. Valores medios peso seco por planta en biomasa aérea, raíces y total en O. bifolium
“federal” cultivados en los diferentes medios de cultivo (M) a los 95 días después del repique. Letras
distintas indican diferencias significativas (p≤0,05). CV: Coeficiente de variación
Medios de cultivo
(M)
M1
M2
M3
M4
CV (%)
Biomasa aérea
0,011
0,019
0,024
0,024
16,66
0,030
a
b
b
b
Biomasa aerea
0,025
Raíces
Peso seco (g)
Biomasa raíces
0,002
0,010
0,010
0,011
27,23
a
b
b
b
Biomasa total
0,013
0,029
0,034
0,035
16,42
a
b
b
b
valores de relación fueron de 2, 2,5 y 2,3,
respectivamente.
Peso seco (g)
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000
-0,005
M1
M2
M3
M4
-0,010
-0,015
Figura 4. Partición de biomasa seca aérea y
radical de plantas de O. bifolium “federal” a los
95 días después del repique para los diferentes
medios de cultivo (M)
En cuanto a la relación biomasa
aérea/raíz que es un indicativo del
particionamiento de la materia seca entre los
órganos, fue superior a 1 en todos los casos
(Figura 3 y 4). El medio de cultivo M1 es el
que presentó una mayor relación (6,9), valor
que estaría indicando un mayor acumulo de
materia seca en la biomasa aérea durante el
crecimiento de las plantas bajo condiciones
in vitro. Al contrario, un mayor incremento
de la materia seca en el sistema radical fue
observado en las plantas cultivadas en los
medios de cultivo M2, M3 y M4, cuyos
Discusión
Con el medio de cultivo sin agregado de
agua de coco y fertilizantes (M1), se
obtuvieron la menor altura de plantas, pocas
raíces y menor porcentaje de plantas con
pseudobulbos,
coincidiendo
con
lo
encontrado por Moreno Martínez y
Menchaca García (2007) en Stanhopea
tigrina (Orchidaceae) obteniendo los
mayores valores para las mismas variables al
agregar al medio de cultivo MS, 120 ml de
agua de coco. Salazar – Mercado (2012)
también demostró que la adición de
componentes orgánicos como agua de coco
al medio MS, favoreció un mayor
crecimiento y desarrollo de Cattleya
mendelii (Orchidaceae).
Los medios de cultivos con fertilizantes y
azúcar refinada (M3 y M4), presentaron los
mayores valores promedio para las variables
altura de planta, número de raíces y
porcentaje de plantas con pseudobulbos,
valores que coinciden con datos reportados
por Romero – Tirado et al., 2007, en Laelia
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Carlos A. Dalzotto
anceps (Orchidaceae), al utilizar en el medio
de cultivo el fertilizante Peters® (24-8-16) al
25% (0,5 g/l) más azúcar refinada.
Los mayores pesos secos logrados ya
sean en biomasa aérea, raíces y totales, se
obtuvieron en los medios de cultivo
suplementados con agua de coco y
fertilizantes. Similares resultados se
observaron en la investigación llevado a
cabo por Stancato et al, 2008, al adicionarle
al medio de cultivo fertilizante (NPK, 10-1010 y NPK, 10-30-20) o compuestos
orgánicos (pulpa de manzana, pulpa de
banana o pulpa de tomate) en comparación
al medio basal MS para la especie Miltonia
spectabilis (Orchidaceae).
En la investigación de Rego - Oliveira y
Tadeu de Faria (2005) en un estudio
comparativo de diferentes medios de cultivo
(MS, Knudson C (1946), Vacin & Went
(1949) y medios a base de fertilizantes NPK,
10-5-5 y 10-30-20), obtuvieron que con el
medio conteniendo fertilizante NPK (10-5-5)
lograron la mayor longitud promedio de las
raíces para las especies Catasetum
fimbriatum (Morren) Lindl. y Cyrtopodium
paranaensis Schlt. (Orchidaceae). Mientras
que el medio a base de NPK (10-30-20) tuvo
el mejor promedio en número de raíces, para
Catasetum fimbriatum. En el mismo estudio,
la relación entre materia seca de la raíz y
materia seca de los brotes, los mayores
valores lo lograron en los medios a base de
fertilizantes, para la especie Cyrtopodium
paranaensis.
Unemoto et al, 2007, obtuvieron los
mejores resultados en la propagación in vitro
de Oncidium nanum Lindl. y Cattleya
forbesii Lindl., utilizando un medio de
cultivo con fertilizante foliar NPK, 6-6-8.
Rusticación
A los 135 días después del trasplante ex
vitro, la supervivencia de las plantas fue del
95%, las mismas se presentaron en buenas
condiciones de crecimiento y aspecto
general, sin presentar muerte de órganos
14
(raíces u hojas), con un promedio de altura
de 5,4 cm medidos sobre las plantas madres
las cuales presentaban pseudobulbos de buen
desarrollo y 2 brotes por plantas.
Conclusiones
El medio basal (MS) suplementado con
azúcar refinada y agua de coco junto con el
empleo del fertilizante Peters® 20-20-20 o
10-30-20, tienen el mismo efecto sobre el
crecimiento de O. bifolium “federal”, dando
como resultado plantas más vigorosas con
mayores alturas, número de raíces, peso seco
(biomasa aérea, raíces y totales) y porcentaje
de plantas con pseudobulbos. Los
suplementos utilizados son económicos y de
fácil adquisición en el mercado.
Se obtuvieron plantas aptas para su
transplante ex vitro, con buen desarrollo
radical y tamaño, logrando una alta
supervivencia de plantas, con un bajo
porcentaje de muerte o pérdidas por ataque
de patógenos (5%).
Agradecimientos
El presente trabajo fue financiado por la
Universidad Nacional de Entre Ríos en el
marco del PID-UNER 2144 y es parte del
trabajo final de graduación del autor
defendido en noviembre de 2012.
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