FITOPATOLOGÍA
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FITOPATOLOGÍA Tema 7. DIAGNÓSTICO DE VIRUS VEGETALES (DIAGNOSIS II) Por qué los virus requieren de técnicas especiales de diagnóstico ? Son parásitos OBLIGADOS e INTRACELULARES Son parásitos NO CELULARES (ACELULARES) Son partículas o moléculas de ADN o ARN + proteínas NO SON VISIBLES con equipos ópticos comunes. Provocan importantes enfermedades PERSISTENTES E INCURABLES. NO SIEMPRE PRESENTAN SÍNTOMAS VISIBLES (LATENCIA) REQUIEREN DE MÉTODOS O TÉCNICAS ESPECIALES PARA SU DIAGNÓSTICO POSTULADOS DE KOCH 1. EL AGENTE CAUSAL DEBE ESTAR O HABER ESTADO ASOCIADO CON LA ENFERMEDAD Y VICEVERSA. SINTOMATOLOGÍA (PUEDE CONFUNDIRSE CON FITOTOXICIDAD) NO PRESENTAN SIGNOS. 2. EL AGENTE PATÓGENO DEBE SER AISLADO AL ESTADO PURO, EN PLANTAS HOSPEDANTES PARA ESTUDIAR SUS CARACTERÍSTICAS MORFOLOGICAS, SEROLÓGICAS, MOLECULARES, PROPIEDADES IN VITRO. No se cultivan, cómo los aíslo? Con qué métodos los detecto o estudio sus propiedades? MÉTODOS BIOLÓGICOS, SEROLÓGICOS O MOLECULARES 3. UNA PLANTA HOSPEDANTE SANA DE LA MISMA ESPECIE Y EDAD AL SER INOCULADA CON EL AGENTE AISLADO EN CONDICIONES FAVORABLES DEBERÁ REPRODUCIR LOS SÍNTOMAS CARÁCTERISTICOS DE LA ENFERMEDAD, Pruebas de patogenicidad? TRANSMISIBILIDAD 4. EL AGENTE FITOPATÓGENO DEBE SER REAISLADO DEL HOSPEDANTE INOCULADO AL ESTADO PURO E IDENTIFICADO CON EL AISLADO PRIMERAMENTE. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE VIRUS DE PLANTAS 1- MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA Estudia la ARQUITECTURA DE LAS PARTÍCULAS VIRALES (forma y tamaño) Requiere de instrumental sofisticado Requiere de técnicos especialistas (capacitación) Es poco sensible Consume mucho tiempo No siempre se puede identificar la especie o el género 2- TÉCNICAS BIOLÓGICAS ESTUDIA LAS CARACTERISTICAS DEL VIRUS A TRAVÉS DE SU EXPRESIÓN EN PLANTAS HOSPEDANTES (BIOENSAYOS) SINTOMATOLOGÍA RANGO DE HOSPEDANTES – PLANTAS INDICADORAS TRANSMISIBILIDAD ANÁLISIS DE LAS PROPIEDADES “IN VITRO” Punto de inactivación termal (PIT) Punto de dilución final (PDF) Desecamiento Longevidad “in vitro” SINTOMATOLOGÍA •Son indispensables para la valoración de los daños provocados por las virosis. •Son en muchos casos los únicos recursos para un reconocimiento rápido en el cultivo. • En pocos casos sirve por si sóla como método de diagnóstico. Ej Corcovo del tabaco causado por GRSV Peste negra del tomate i- SISTÉMICOS (CAMBIOS DE COLOR) • MOSAICOS (HOJAS) •MOTEADOS (HOJAS) •ESTRIADO (TALLOS) Fotos de otra autoría. SISTÉMICOS (CAMBIOS DE COLOR) QUEBRADO (FLORES) ANILLADOS (FRUTOS) Fotos de otra autoría. SISTÉMICOS (DEFORMACIONES) •CORDÓN DE ZAPATOS (HOJAS) •AMPOLLADURAS •HENDIDURAS (TRONCOS) Fotos de otra autoría. SISTÉMICOS (NECROSIS) Fotos de otra autoría. SISTÉMICOS (DETENCIÓN DE CRECIMIENTO, ENANISMO, ACHAPARRAMIENTO) Fotos de otra autoría. ii-SÍNTOMAS LOCALES (LESIONES CLORÓTICAS O NECRÓTICAS Fotos de otra autoría. SINTOMATOLOGÍA iii-AUSENCIA DE SÍNTOMAS • INAPARIENCIA, • ENMASCARAMIENTO • RECUPERACIÓN RANGO DE HOSPEDANTES BIOENSAYOS RANGO DE HOSPEDANTES conjunto de plantas que pueden ser infectadas por un virus determinado. Plantas indicadoras son aquellas que responden de forma consistente y distintivas frente a las infecciones virales en condiciones de invernáculo. Pueden manifestar síntomas locales o sistémicos INOCULACIÓN MECANICA TRANSMISIBILIDAD EN LA NATURALEZA los VIRUS pueden transmitirse por: INSECTOS POLEN SEMILLA (Virus del Mosaico del pepino, Mosaico común de la soja) CUSCUTA (holoparásita) ÓRGANOS DE PROPAGACIÓN VEGETATIVA (yemas de citrus CTV, Psorosis; en tubérculos de papa PVY, en estacas c. de azúcar ScMV) ÁCAROS (Fam. Eriophydae) NEMÁTODES (Nepovirus – Xiphinema, Longidorus, Trichodorus) HONGOS (Olpidium brassicae - necrosis del tabaco) CONTACTO ENTRE PLANTAS ENFERMAS A SANAS (TMV, PVX) CON LA INTERVENCIÓN DEL HOMBRE: POR EL HOMBRE (HERRAMIENTAS, LABORES CULTURALES, ETC) INJERTO (TODOS) INOCULACION MECÁNICA (RANGO DE HOSPEDANTES) TRANSMISIÓN POR INSECTOS RELACIÓN VIRUS -VECTOR Adquisición Incubación Transmisión Persistente Trips – TSWV Circulativo propagativo > 1 HORA Días a Semanas Toda la vida No persistente Pulgón – PVY No circulativo No propagativo Pocos segundos NO TIENE Pocos minutos Semi-persistente Pulgón – CTV Circulativo No propagativo Minutos a horas Horas a días Depende de la adquisición PROPIEDADES IN VITRO •Punto de inactivación termal (PIT) Es la máxima temperatura que soporta el jugo viroso tratado durante 10 minutos sin perder su infectividad. •Punto de dilución final (PDF) Es la máxima dilución que soporta el jugo viroso sin perder su efectividad. •Desecamiento Es la capacidad de las partículas virosas de soportar el desecamiento de los tejidos donde se hallan incluidas, sin perder su infectividad. •Longevidad “in vitro” Es el máximo tiempo que un virus permanece infectivo en el extracto vegetal, mantenidos en tubos cerrados, a temperatura de laboratorio. Ej. Tobacco Mosaic Virus: PIT 92ºC, PDF 1/1.000.000, Desec. 50 años Interpretación de los resultados de las técnicas biológicas Los resultados se comparan con valores o respuestas YA DETERMINADAS Y VALIDADAS PARA CADA ENTIDAD VIRAL CONOCIDA (BIBLIOGRAFÍA , BANCOS DE DATOS) SIRVEN PARA CARACTERIZAR UN VIRUS. Son engorrosas, costosas, insumen mucho tiempo. Ninguna por si sola permite la identificación de un virus. Siempre es necesario complementar dos o mas técnicas. 3 - TÉCNICAS SEROLÓGICAS SERODIAGNÓSTICO = DIAGNÓSTICO MEDIANTE SEROLOGÍA = TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS ESTUDIA LAS PROPIEDADES DE LA CUBIERTA PROTÉICA DE LOS VIRUS. SE BASAN EN LA IDENTIFICACIÓN DE UN VIRUS (EL ANTÍGENO) A TRAVÉS DE LA REACCIÓN CON SUS ANTICUERPOS ESPECÍFICOS. REACTIVOS EN SEROLOGÍA ANTÍGENO cualquier sustancia capaz de inducir una respuesta inmune cuando es introducida en un animal apropiado, lo que implica producción de nuevos anticuerpos. Molécula AJENA al hospedante. complejidad y de peso molecular. Proteínas, glúcidos, polímeros de ácidos nucleicos, VIRUS, BACTERIAS, HONGOS O ALGUNOS DE SUS CONSTITUYENTES REACTIVOS EN SEROLOGÍA ANTICUERPOS son moléculas proteicas (inmunoglobulinas) producidas en respuesta al antígeno que las originó. Circulan en el suero sanguíneo (ANTISUERO) y se unen específicamente con el/ los antígenos que los originaron. Existen distintos tipos: IgG (80 %), IgA, IgM, IgD y IgE. Se localizan en suero sanguíneo Reaccionan ESPECÍFICAMENTE con “su Antígeno” mediante uniones no covalentes. OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS Los fitopatógenos inoculados en animales vertebrados desencadenan “respuesta inmune” sin provocar enfermedad a los mismos. Se pueden producir anticuerpos inyectando virus fitopatógenos purificados en animales. Los anticuerpos técnicas. se emplean en diferentes INMUNIZACIÓN VIRUS VIRUS VIRUS PURIFICADOS Antígenos Anticuerpos ESPECÍFICOS Para inmunizar el animal se inyecta el virus purificados con un adyuvante (sustancias que estimulan la respuesta inmune, aumenta la producción de anticuerpos). La sangría del animal se realiza varias semanas después de la inmunización. La sangre se centrifuga, se precipita la fraccion sólida y se separa el suero (donde están los anticuerpos = antisuero) TÉCNICAS SEROLÓGICAS PRUEBAS CON MOLÉCULAS INDICADORAS O MARCADORES se emplean anticuerpos y/o antígenos que están unidos a moléculas que tienen actividad propia y amplifican el poder de la prueba aumentando su sensibilidad. Marcadores radioactivos Marcadores fluorescentes. Ensayos inmunoenzimáticos E.L.I.S.A. marcadores enzimáticos ELISA (Enzime Linked Inmunosorbent Assay) E ANTICUERPOS: especificidad para reconocer al antígeno que lo originó ENZIMA: actividad catalítica CONJUGADO ENZIMÁTICO: Anticuerpo marcado con una enzima •La interacción específica Ag - Ac es reconocida por la acción de una enzima unida a uno de los reactivos. Distintas técnicas: DAS ELISA, NC ELISA, etc DAS - ELISA (Double sandwich antibody – ELISA) ESQUEMA DE LA TECNICA Anticuerpos conjugados con enzima Sustrato Virus (Antígeno) Anticuerpos Celda 1- COBERTURA DE LA PLACA CON ANTICUERPOS (SENSIBILIZACION) 2- PREPARACION Y AGREGADO DE LA MUESTRA (ANTIGENO) LAVADO 3- AGREGADO DEL CONJUGADO ENZIMATICO 4- ADICIÓN DEL SUSTRATO LAVADO LECTURA DE LOS RESULTADOS Lectura de absorbancia a longitud de onda de 405 nm mediante un ESPECTROFOTÓMETRO de lectura vertical . INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS La presencia de color (mayores valores de absorbancia) indica la presencia del virus, la intensidad del color puede usarse para estimar la concentración de virus en la muestra. VENTAJAS ALTA ESPECIFICIDAD ALTA SENSIBILIDAD ( 1- 10 NG/ML) SIMPLICIDAD RAPIDEZ (LOS RESULTADOS SE OBTIENEN EN POCAS HORAS) NUMEROSAS MUESTRAS SIMULTÁNEAMENTE (96 CELDAS/PLACA) NO REQUIERE TRATAMIENTO ESPECIAL DE LAS MUESTRAS (EXTRACTO CRUDO) POCO INFLUENCIADA POR LA MORFOLOGÍA DE LOS PATÓGENOS EL MÉTODO ELISA ES, POR LEJOS, LA TÉCNICA INMUNOLÓGICA MÁS UTILIZADA EN AGRICULTURA PARA LA IDENTIFICACION DE VIRUS TÉCNICAS SEROLÓGICAS: Aplicaciones Baja concentración de patógenos en la muestra Gran número de muestras (lotes de papa semilla, semillero de caña de azúcar) Rigor científico del análisis (Certificación de yemas de citrus, papa semilla, controles cuarentenarios) Análisis de material asintomático (Inapariencia, latencia) Urgencia en entrega de los resultados Concentración o movimiento de los virus en la planta 4- TÉCNICAS MOLECULARES DE DIAGNÓSTICO ESTUDIA O DETECTA LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS O GENES DE LOS VIRUS SE BASAN EN LA PRESENCIA DE SECUENCIAS ÚNICAS EN LOS ACIDOS NUCLEICOS DEL GENOMA DE CADA VIRUS. REQUIERE DEL CONOCIMIENTO PREVIO DE LAS SECUENCIAS GENÉTICAS DEL VIRUS A DETECTAR (GENE BANK). Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Es una herramienta de extrema utilidad tanto por su sensibilidad y especificidad como por su simplicidad. Consiste en la multiplicación "in vitro" de una o unas pocas cadenas de ácido nucleico (DNA o RNA) de una longitud discreta hasta niveles tales que permitan su fácil detección en geles de agarosa. Se fundamenta en los mecanismos naturales de la replicación del ácido desoxirribonucleico (DNA) Representación esquemática de la molécula de DNA REPLICACIÓN 1- Es semi-conservativa, REQUIERE UNA HEBRA MOLDE (ADN VIRAL) 2- Requiere de CEBADORES (FRAGMENTOS DE ADN ESPECÍFICO Y COMPLEMENTARIO AL ADN VIRAL) para comenzar 3- La enzima POLIMERASA SINTETIZA LAS NUEVAS CADENAS Nueva hebra sintetiz ada La secuencia ADN VIRAL a detectar (amplificar) se somete a 30 ciclos de copiado en un pequeño tubo de ensayo.MOLDE. OH H H 3' H CH2 O O Base CH2 A O T O - P O H H H H O H H H CH2 O H O Base O P O O O- P O Base O Base CH2 G O H H HO H O C P O 5' O - O H H H H H O CH2 O O P O P O CH2 O O - O P - - P O H O H H HO - O Base O H O O Base O O H H O CH2 H H Base O P O O Deoxiribonuc leósido 5' trif osf ato a ser incorporado. - O OH H Pi rofo sfato i norgán ico l ib erado H O CH2 Base O P O O Dirección de síntesis de la nueva c adena de DNA - O OH H H O CH 2 O O P - O Base O OH H H O La polimerasa termoestable es la que sintetiza múltiples copias de una hebra de ADN complementaria a la porción de ADN comprendida entre los dos cebadores H O Fragmentos cortos de ADN (cebadores) complementarios a porciones específicas del acido nucleico viral se adhieren al ADN VIRAL. Hebra molde Síntesis de DNA: La adic ión de deoxiribonuclótidos al extremo 3' de una c adena polinucleotídica es la reac ción f undamental para la síntes is de DNA. El apareamiento de bases entre los deoxiribonucleótidos inc orporados y la c adena molde es la guía para la f ormación de la nueva c adena que tendrá una secuencia nucleótidica complementaria. ETAPAS DE CADA CICLO 1-Desnaturalización del DNA, 2-hibridación de cebadores y 3-extensión de la nueva cadena DNA con sus cadenas complementarias desnaturalizadas 5' 3' Primers 5' 3' Síntesis de DNA 5' 3' 3' 5' específicos PROGRAMA DE TERMOCICLADO Materiales necesarios Para desarrollar una reacción de PCR se colocan en un tubo de microcentrífuga los siguientes reactivos: DNA molde (ADN VIRAL) CEBADORES (DISEÑADOS EN FUNCIÓN AL VIRUS A DETECTAR) DNA polimerasa, Desoxirribonucleósidos trifosfato (A,T,C,G) Tampón adecuado TERMOCICLADOR Para visualizar la reacción GELES DE AGAROSA CUBA ELECTROFORESIS TRANSILUMINADOR Partiendo de una molécula de DNA y asumiendo una eficiencia del 100% en cada ciclo se obtienen: N° de ciclos 3 5 10 20 30 31 32 N° de doble cadenas con la longitud prevista 2 8 256 262.144 268.435.456 536.870.912 1.073.741.824 EL PRODUCTO DE LA PCR PUEDE DETECTARSE USANDO ELECTROFORESIS EN GEL, POR CORRIENTE ELECTRICA SE SEPARAN A LAS MOLECULAS DE DISTINTOS TAMAÑOS. LUEGO LOS FRAGMENTOS SE TIÑEN EN EL GEL CON UN PIGMENTO ESPECÍFICO PARA ACIDOS NUCLEICOS. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 1 2 3 4 5 6 Calles 1: marcador de peso molecular Calle 2: Testigo positivo TMV Calles 3-5: muestras problema infectadas con TMV Calle 6: muestra sin infeccion de TMV LA VISUALIZACION DE UNA BANDA DEL TAMAÑO APROPIADO INDICA LA PRESENCIA DEL VIRUS PARA EL CUAL SE DISEÑARON LOS CEBADORES Bibliografía complementaria Fernandez Valiela, M.V. 1995. Virus patógenos de las plantas y su control. Tomos 1 y 2. 4ta Edición. Ramallo, J.C. y S. Hongn. 1997. Síntomas, propiedades, transmisión y diagnóstico de virus vegetales. Serie didáctica Nº 33. FAZ, UNT. Agrios, G. 1985. Fitopatología.