berenice chavira willys instituto tecnológico de sonora

Transcripción

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA
DIRECCIÓN ACADÉMICA DE RECURSOS NATURALES
DETERMINACIÓN DE TRIPTÓFANO Y TIROSINA
(LIBRES Y PROTEICOS) POR HPLC EN
HIDROLIZADOS DE RESIDUOS DE CAMARÓN
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRA EN CIENCIAS EN RECURSOS
NATURALES
PRESENTA
BERENICE CHAVIRA WILLYS
CD. OBREGON, SONORA
NOVIEMBRE DE 2006
ÍNDICE
Página
DEDICATORIA............................................................................................
i
AGRADECIMIENTOS.................................................................................
ii
ÍNDICE DE TABLAS Y CUADROS.............................................................
vi
ÍNDICE DE CUADROS...............................................................................
vi
ÍNDICE DE FIGURAS.................................................................................
viii
RESUMEN……………………………………………………………………….
ix
I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………...
1
1.1. Antecedentes……………………………………………………………..
1
1.2. Planteamiento del problema…………………………………………….
3
1.3. Justificación……………………………………………………………….
3
1.4. Objetivo………...………………….………………………………………
4
1.4.1. Objetivo general…………………………………………………..
4
1.4.2. Objetivos específicos...............................................................
4
1.5. Hipótesis............................................................................................
4
II. FUNDAMENTACIÓN………………………………………………………...
5
2.1. Hidrolizados protéicos de residuos de camarón…………………….
5
2.1.1. Métodos de obtención………………………………………….
6
2.1.2. Caracterización proximal………………………………………
9
2.1.3. Usos……………………………………………………………..
10
2.2. Triptófano y tirosina…………………………………………………….
10
2.2.1. Estructura química……………………………………………..
11
2.2.2. Características de identificación………………………………
12
2.2.3. Estabilidad……………………………………………………….
16
2.3. Metodología propuesta para la cuantificación de tirosina y
triptófano.........................................................................................
20
2.3.1. Extracción de tirosina y triptófano……………………………
20
2.3.2. Cuantificación de tirosina y tripófano………………………..
21
2.4. Cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC).……………...
23
2.4.1. Conceptos generales………………………………………….
23
2.4.2. Componentes del sistema...................................................
23
2.4.3. Validación de técnicas analíticas.........................................
27
III. MÉTODO……………………………………………………………………..
30
3.1. Ubicación del experimento……………………………………………
30
3.2. Estándares y reactivos………………………………………………..
30
3.3. Equipo y condiciones HPLC………………………………………….
31
3.4. Preparación de las muestras…………………………………………
32
3.4.1. Análisis de humedad…………………………………………..
32
3.4.2. Análisis de proteínas............................................................
34
3.4.3 Extracción de triptófano y tirosina libres……………………..
34
3.4.4 Extracción de triptófano y tirosina proteicos………………...
34
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………….
35
4.1. Análisis proximal...............……………………………………………..
35
4.1.1. Determinación de humedad......................................……….
35
4.1.2. Determinación de proteínas.............................……………...
36
4.2. Tratamiento de la muestra...............................................................
36
4.2.1. Determinación de la cantidad de muestra a analizar............
36
4.2.2. Determinación de las condiciones de hidrólisis....................
37
4.3. Identificación…………………………………………………………….
39
4.4. Condiciones cromatográficas………………………………………….
41
4.4.1. Fase móvil………………………………………………………
41
4.4.2. pH de la fase móvil…………………………………………….
43
4.4.3. Temperatura de la columna…………………………………..
44
4.5. Validación del método………………………………………………….
49
4.5.1. Linealidad y rango……………………………………………..
49
4.5.2. Precisión del método para triptófano y tirosina libres..........
50
4.5.3. Precisión del método para triptófano y tirosina totales........
52
4.5.4. Límite de detección..............................................................
54
4.5.5. Exactitud..............................................................................
54
4.6. Aplicabilidad del método………………………………………………
55
V. CONCLUSIONES…………………………………………………………….
60
BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………….
61
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla
1
Página
Composición proximal de fermentado de 30 días de cabezas
de camarón…………………………………………………………
2
3
9
Análisis proximal de fracción fermentada de desechos de
camarón…………………………………………………………….
9
Condiciones de hidrólisis utilizadas para la extracción de
22
triptófano y tirosina en alimentos………………………………...
4
Condiciones cromatográficas usadas en la determinación de
24
triptófano y tirosina………………………………………………...
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro
Página
1
Condiciones cromatográficas óptimas para el análisis………..
2
Contenido de proteína total de muestras de hidrolizados de
residuos de camarón………………………………….................
3
37
Ensayo de determinación de tiempo de hidrólisis y cantidad
de NaOH 4.2 M a utilizar……………………..…………………..
5
36
Análisis de determinación de la cantidad de muestra a utilizar
en la hidrólisis alcalina……………………………......................
4
31
38
Tiempo de retención (TR) de triptófano y tirosina obtenidos a
diferentes concentraciones de acetato de sodio en la fase
móvil.........................................................................................
6
43
Tiempos de retención de triptófano y tirosina a diferentes
temperaturas, pH 4.5 y una concentración de acetato de
7
sodio 40 mM……………………………..………………………...
45
Concentraciones de las soluciones estándar…………………..
49
8
Datos de calibración del método para los patrones de
triptófano y tirosina………………………………………………..
9
Calibración del método para los patrones de triptófano y
tirosina libres……..…………………………………….…………
10
52
Precisión del método interdías para determinación de tirosina
libre en muestra……………………………………………………
12
51
Precisión del método interdías para determinación de
triptófano libre en muestra………………………………………..
11
50
52
Precisión del método para los patrones de triptófano y
tirosina totales en muestra hidrolizada………………………….
53
13
Datos de recuperación de triptófano y tirosina libres y totales.
55
14
Contenido de triptófano libre y total en muestras liofilizadas y
deshidratadas de hidrolizado de residuos de camarón……….
15
56
Contenido de tirosina libre y total en muestras liofilizadas y
deshidratadas de hidrolizado de residuos de camarón……….
57
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura
Página
1
Estructura química del triptófano………………………………...
12
2
Estructura química de la tirosina…………………………………
13
3
Espectro de emisión de triptófano……………………………….
15
4
Espectro de emisión de tirosina................................................
15
5
Espectros de absorción UV de triptófano y tirosina……………
16
6
Metodología seguida en el experimento………………………..
33
7
Cantidad de triptófano y tirosina obtenidos a 4, 8, 12 y 16
horas de hidrólisis con 3, 6 y 9 ml de NaOH 4.2 M……………
8
Cromatogramas de patrón de triptófano y tirosina. A)
Detección ultravioleta B) Detección por fluorescencia. ………
9
38
40
Cromatograma de la muestra con los picos con y sin
interferencias. A) Cromatograma donde se observan los
picos
de
triptófano
y
tirosina
con
interferencia.
B)
Cromatograma de los picos sin interferencia…………………..
10
42
Cromatogramas del ensayo con 3 diferentes concentraciones
de acetato de sodio de la fase móvil. A) 40 mM, B) 70 mM,
C) 100 mM. ………………………………………………………..
11
Cromatogramas del ensayo con 2 diferentes pH del acetato
de sodio en la fase móvil. A) pH 4.5, B) pH 5.0……………….
12
48
Recta de linealidad de los estándares de triptófano y
tirosina………………………………………………………………
14
47
Cromatogramas del ensayo con 3 diferentes temperaturas de
la columna. A) 26 ºC, B) 30 ºC, C) 34 ºC……………………….
13
46
49
Figura A: Cromatograma típico para la cuantificación
simultánea
de
triptófano
y
tirosina.
A)
libres,
B)
totales.......................................................................................
59
RESUMEN
Tirosina y triptófano son dos aminoácidos aromáticos esenciales cuya presencia nos
indica la calidad nutricional de un alimento. En este trabajo se presenta un método
HPLC para la cuantificación de tirosina y triptófano libres y totales, en la fracción
proteica liofilizada y deshidratada obtenida del residuo de camarón fermentado. Las
condiciones optimizadas para separación y cuantificación HPLC con detección por
fluorescencia de los aminoácidos son las siguientes: columna, Exsil ODS 5 µm;
temperatura de la columna, 26 ºC; fase móvil, 80:20 (v/v) acetato de sodio
40mM:metanol; velocidad de flujo, 0.8 ml/min. Con estas condiciones, la precisión del
método (%, RSD) fue 4.60 para tirosina libre y 4.83 para triptófano libres, mientras que
para tirosina y triptófano totales fue de 1.14 y 1.47, respectivamente. El límite de
detección fue 0.75 mpg/ml para tirosina y 0.31 pg/ml para triptófano. En base a materia
seca, el contenido de tirosina y triptófano libres en las muestras liofilizadas es de 2.38
mg/g proteína y 14.48 mg/g proteína, mientras que en muestras deshidratadas fue de
3.22 mg/g proteína para tirosina y de 12.27 mg/g proteína para triptófano.
Para
tirosina y triptófano totales en muestra liofilizada es de 3.89 mg/g proteína y 19.48
mg/g proteína, respectivamente. Mientras que en muestra deshidratada es de 4.63
mg/g proteína y 15.94 mg/g proteína, para tirosina y triptófano respectivamente. Este
concentrado proteico puede ser un valioso suplemento nutricional en la producción
intensiva de camarón.
I. INTRODUCCIÓN
1.1. Antecedentes
Las proteínas son macromoléculas con funciones biológicas muy importantes ya que
pueden fungir como reguladores biológicos o formar parte de la estructura en los
organismos vivos. El ser humano comúnmente las obtiene de alimentos de origen
animal (carne, leche, huevo, productos marinos) (Murray et al., 1988).
Algunos productos marinos sólo se aprovechan parcialmente, es decir que lo que no
es consumido como alimentos se desecha. Por ejemplo, la cabeza y el caparazón de
camarón y de otros animales como el cangrejo y el pescado. Éstos han
sido
estudiados desde hace tiempo comprobándose en diversas investigaciones que son
una fuente importante de proteínas de buena calidad, además de quitina y colorantes
que pueden aprovecharse. Por ejemplo, Synowiecki et al. (2000), en un estudio sobre
recuperación de proteína de camarón (Crangon crangon) hidrolizada enzimáticamente
obtuvieron un rendimiento del 64.3 % de proteína. En otras investigaciones llevadas a
cabo en cangrejo (Chinoecetes opilio) (Shahidi y Synowiecki, 1991), camarón
(Pandalus borealis) (Andersen, 1990; Shahidi y Synowiecki 1991), salmón del atlántico
(Salmo salar) (Birkeland y Bjerkeng, 2004), camarón blanco (Penaeus vannamei)
(Marina et al., 1997) y residuos de pescado (Meyers y
Lee, 1989) se tuvieron
resultados que prueban en ellos la presencia de proteína aprovechable.
En una investigación donde se llevó a cabo una fermentación láctica con Lactobacillus
plantarum de cabeza de camarón (Macrobrachium vollenhovenii), el análisis de la
composición de nutrientes del hidrolizado obtenido dio un rendimiento de 65.6% de
proteína cruda (Fagbenro y Bello-Olusoji, 1991). Además, de conocer la cantidad de
proteína que tienen los alimentos es necesario estimar su contenido en aminoácidos
esenciales, ya que indica la calidad de la proteína.
Los aminoácidos son sustancias orgánicas que contienen un grupo carboxilo y un
grupo amino unido a su cadena R, que al unirse por enlaces peptídicos forman
cadenas largas llamadas péptidos (hasta 20 aminoácidos unidos), los que a su vez al
unirse forman las proteínas. Algunos de ellos son esenciales, es decir, que el
organismo no es capaz de sintetizarlos por sí solo por lo que tiene que obtenerlos de
manera externa, entre éstos se encuentra el triptófano (Murray et al., 1988).
El triptófano y la tirosina son aminoácidos aromático, constituyentes primordiales de
las proteínas, nutricionalmente esenciales para muchos animales y para el cuerpo
humano en la producción de sustancias importantes para el organismo (Kivi, 2000).
Comúnmente la cuantificación de aminoácidos se realiza tras la ruptura de los enlaces
peptídicos por hidrólisis ácida (HCl 6M) seguida de una derivatización. Sin embargo,
ésta hidrólisis destruye al triptófano por completo (Landry y Delhaye, 1988). Muchos
investigadores consideran al triptófano más estable en medio alcalino que en ácido,
por lo que la hidrólisis básica de proteínas es más recomendable para el análisis del
triptófano (Friedman y Finley, 1971; Friedman y Cuq, 1988; Wu
y Tanoue, 2001;
Hanko y Rohrer, 2002; Ravindran y Bryden, 2004). Por otro lado triptófano no necesita
derivatización ya que es fluorescente por naturaleza, al igual que tirosina (Chen Y
Barkley, 1998).
El triptófano y la tirosina, como otros aminoácidos, después de la hidrólisis de
proteínas, han sido analizados por una variedad de métodos en el pasado.
La cromatografía
de líquidos de alta eficiencia (HPLC) es la técnica analítica de
separación más utilizada
debido a su sensibilidad, fácil adaptación a las
determinaciones cuantitativas exactas, idoneidad para la separación de especies no
volátiles o termolábiles y sobre todo, gran aplicabilidad a sustancias que son de gran
interés en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general
(Skoog et al., 2000).
1.2. Planteamiento del problema
Las determinaciones convencionales de aminoácidos involucran una derivatización
para facilitar la identificación. Sin embargo, triptófano y tirosina
por su estructura
presentan fluorescencia intrínseca, característica que puede aprovecharse para su
identificación y cuantificación. Por lo anterior, en esta investigación, se pretende dar
una respuesta a la siguiente interrogante.
¿Es posible realizar la determinación simultánea por HPLC de triptófano y tirosina en
hidrolizados obtenidos de residuos de camarón sin derivatizar?
1.3. Justificación
En los últimos años en el Sur de Sonora se ha llevado a cabo, con gran aceptación
entre los pescadores de la región, la producción o cultivo de camarón (acuacultura), ya
que ha representado una nueva alternativa a la captura tradicional que ha disminuido
considerablemente; además que ha contado con el apoyo económico de diversos
inversionistas. Sin embargo, después de su descabezado solamente el 65% es
comercializado, el 35% restante es basura y se convierte en contaminante para el
medio ambiente, además de considerarse una pérdida para el productor.
Un grupo de investigadores del Instituto Tecnológico de Sonora ha realizado varios
estudios para el aprovechamiento de la cabeza de camarón mediante fermentación
láctica, obteniéndose una fracción sólida de quitina y una fracción líquida (licor) rica en
proteínas.
En estudios anteriores a esta investigación se han podido cuantificar
algunos
aminoácidos libres, incluyendo tirosina pero no triptófano, que contiene la cabeza de
camarón. Ello se lleva a cabo mediante una derivatización, lo que alarga el tiempo de
preparación de la muestra previo al análisis.
Debido a la necesidad de completar el estudio se pretende desarrollar un método que
permita la cuantificación de triptófano y tirosina libres y totales, sin necesidad de llevar
a cabo una derivatización.
1.4. Objetivo
1.4.1. Objetivo general
Desarrollar y validar un método para la determinación simultánea de triptófano y
tirosina libres y totales en el hidrolizado obtenido por fermentación láctica de residuos
de camarón por cromatografía de líquidos (HPLC).
1.4.2. Objetivos específicos
•
Desarrollar la metodología adecuada para la preparación de las muestras.
•
Optimizar las condiciones cromatográficas para la cuantificación de triptófano
y tirosina.
•
Validar el método HPLC para la cuantificación de triptófano y tirosina.
•
Aplicación del método desarrollado para determinar triptófano y tirosina libres
y totales en muestras liofilizadas y en muestras deshidratadas de hidrolizado
de residuos de camarón.
1.5. Hipótesis
Es posible determinar triptófano y tirosina libres y totales por HPLC sin utilizar
derivatización.
II. FUNDAMENTACIÓN
2.1. Hidrolizados proteicos de residuos de camarón.
Los hidrolizados pueden ser definidos como proteínas que son química o
enzimáticamente convertidas en péptidos de varios tamaños. Los métodos de
hidrólisis químicos son los más utilizados, mientras que los procesos biológicos, que
utilizan enzimas adicionales, también son frecuentemente empleados. Por otro lado, la
hidrólisis enzimática en muy prometedora debido a que sus productos son altamente
funcionales y de gran valor nutritivo (Rustad, 2003).
El uso de desechos de camarón como fuente de hidrolizados de proteínas se ha
incrementado en los últimos años, debido a que estos contienen fracciones valiosas de
proteína y lípidos, así como de vitaminas y minerales (Rustad, 2003). Las proteínas en
estos desechos provienen de residuos de carne retenidos en el tejido conectivo y de
complejos con quitina y sales minerales que forman el exoesqueleto del animal
(Synowiecki y Al-Khateeb, 2003). Estas proteínas están íntimamente asociadas con
minerales, lípidos, pigmentos y quitina; tales compuestos tienen que ser removidos
cuantitativamente para asegurar una alta pureza (Cañipa-Morales y Durán-de-Bazúa,
1997; Percot et al., 2003a).
En la literatura se encuentra muchos métodos para la remoción de proteínas mediante
una hidrólisis, los más utilizados son los químicos y los enzimáticos (Percot et al.,
2003a).
2.1.1. Métodos de obtención
•
Hidrólisis química
Los métodos de hidrólisis química son muy empleados desde hace tiempo. La
hidrólisis se puede efectuar en medio ácido (HCl ó H2SO4) o en medio alcalino
(NaOH). Las condiciones de hidrólisis son drásticas: temperaturas de 100 ºC y baja
presión (Rao et al., 2000).
Usualmente se utiliza una hidrólisis con tratamiento alcalino en la desproteinización de
la quitina de desechos de camarón. Liang et al., (1997) utilizaron NaOH a diferentes
concentraciones y diferentes temperaturas para desproteinizar desechos de camarón
rosado (Solenocera melantho), obteniendo resultados óptimos a 75 ºC y con una
concentración de 2.5 N de NaOH. Por otro lado, Percot et al., (2003b) realizaron una
hidrólisis con NaOH 1M para desproteinizar quitina de desechos de camarón, variando
la temperatura de 16 ºC a 70 ºC y el tiempo de 0 a 200 horas; los resultados obtenidos
muestran que la cantidad de proteína obtenida se incrementa con la concentración de
álcali, en función del tiempo, y diminuye con el aumento de la temperatura. Sin
embargo, la hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio provoca la destrucción de la
cisteína, cistina, arginina y metionina. Además produce cierta recemización de L- a Daminoácidos, esto reduce el valor alimenticio del producto ya que sólo los Laminoácidos son asimilables (Bourgeois y Le Roux, 1986).
Por otro lado, los ácidos también se han utilizado de manera efectiva. El uso de HCl
tiene la ventaja, después de la neutralización con NaOH, de producir cloruro de sodio
que es un importante conservador para el producto. Sin embargo, tiene el
inconveniente de descomponer en forma parcial algunos aminoácidos y destruir por
completo al triptófano (Bourgeois y Le Roux, 1986).
•
Hidrólisis enzimática
Los tejidos proteicos de los desechos de camarón pueden ser hidrolizados y
recuperados
mediante
tratamiento
enzimático
(Gildberg
y
Stenberg,
2001).
Teóricamente al tratar de separar el complejo quitina-proteína del cefalotórax del
camarón se tendrá un rompimiento gradual de los enlaces peptídicos que permiten
que la proteína se desprenda del complejo quitínico y se solubilice en el medio de
reacción (Cañipa-Morales y Durán-de-Bazúa, 1997).
Por otro lado, durante el proceso de extracción de quitina de un desecho de camarón
se obtiene también hidrolizado de proteína. El desecho se somete primeramente a una
desmineralización mediante lavados con agua, después se lleva a cabo una hidrólisis
con alcalasa e NaOH 4 M a 55 ºC y pH 8.5, posteriormente se inactiva la enzima con
HCl 4 M a pH 4.0, se centrifuga y se decolora con carbón. Por último, el hidrolizado se
filtra y se neutraliza a pH 7.0 con NaOH 4 M y se liofiliza. El resultado final es un
hidrolizado enzimático de proteína
de camarón pulverizado, rico en aminoácidos
esenciales (Synoeiecki y Al-Khateeb, 2003).
Gildberg y Stenberg (2001), realizaron hidrólisis de proteínas utilizando la enzima
alcalasa a 40 ºC por 2 horas, después inactivando la enzima con calor (90 ºC, 20 min),
con el fin de deproteinizar quitina de desechos de camarón. Los hidrolizados fueron
separados, enfriados a 4 ºC y finalmente centrifugados. El contenido de proteína cruda
de los hidrolizados fue del 86%.
•
Fermentación láctica
La fermentación, como método de obtención de hidrolizados proteicos, puede ser
considerada como un proceso enzimático; sin embargo, por su importancia, debe ser
tratada como un tema aparte. Las ventajas de éste tratamiento se basan en el hecho
de que no se usan químicos fuertes, por lo tanto es más amigable con el ambiente y
más económico (Cira et al., 2002; Healy et al., 2003). Además, ha sido utilizada como
una alternativa al proceso químico tradicional de desechos de camarón (Healy et al.,
2003). Tal proceso contribuye a la estabilización del sustrato, del cual adicionalmente
se pueden recuperar productos de alto valor agregado como quitina, pigmentos,
proteínas y vitaminas (Cira et al., 2002).
Durante este proceso la hidrólisis de las proteínas se debe, principalmente, a la
actividad proteolítica de las enzimas endógenas y al aprovechamiento de los altos
contenidos de péptidos solubles, aminoácidos libres y amoniaco en el sustrato.
Además se producen ácidos orgánicos, principalmente ácido láctico, que reducen el
pH del medio facilitando su conservación (Fagbenro, 1997).
Fagbenro (1997) utilizó, en la fermentación de cabezas de camarón, un cultivo al 5%
de Lactobacillus plantarum, a 30 ºC y con 15% de melaza como fuente de
carbohidratos, agregando bulbos de cebolla como agente antioxidante de lípidos. El
proceso duró 30 días y se analizó su composición química durante un período de
almacenamiento de 180 días a 30 ºC. Como resultados obtuvo un aumento del
contenido de nitrógeno no proteico durante la fermentación (de 16.5 y 48.3 g de
nitrógeno por 100 g m.s. a los 0 y 30 días, respectivamente), lo que indica un alto
grado de hidrólisis de proteínas a péptidos y aminoácidos libres.
Cira et al., (2002) realizaron una fermentación láctica de cabezas de camarón
(Penaeus sp) utilizando Lactobacillus plantarum, en ella evaluaron 3 diferentes fuentes
de carbono (azúcar de caña, lactosa y suero de leche) a 2 diferentes concentraciones
(10 y 20%), así como dos niveles de inoculación, 5 y 10%. El resultado obtenido
muestra una disminución del contenido de proteína de 46.5% en 0 días de
fermentación a 14.94 % a los 21 días de fermentación, lo anterior indica una
conversión de las proteínas en aminoácidos y péptidos, es decir, se lleva a cabo una
hidrólisis.
En estudios previos realizados por nuestro grupo de investigadores se han realizado
trabajos de fermentación láctica de residuos de camarón para el análisis de
aminoácidos libres por HPLC (López-Cervantes et al., 2006). En estos trabajos se ha
utilizado azúcar de caña al 6.66% como fuente de carbono y un cultivo de
Lactobacillus sp. al 50%. Los resultados del análisis de proteína de los desechos de
camarón muestran un contenido de 14.74%, mientras que el contenido proteico en el
hidrolizado resultado de la fermentación fue de 68.91%, lo que demuestra que este
hidrolizado rico en proteínas que pueden ser aprovechadas.
2.1.2. Caracterización proximal
Los hidrolizados de desechos de camarón contienen cantidades importantes de
proteína por materia seca (aproximadamente 43.38 g/100 g m.s.) (tabla 1), esto los
hace muy apreciados en la industria alimentaria.
Tabla 1. Composición proximal de fermentado de 30 días de
cabezas de camarón.
Componente
Cantidad (g/ 100 g m.s.)
Materia seca
28.41
Proteína cruda
43.38
Lípidos crudos
10.86
Cenizas totales
16.56
pH
4.3
Fuente: Fagbenro, 1997
Cira et al., (2002) reportan un contenido de proteína del 14.9%, en una fermentación
de desechos de camarón de 21 días. Por otro lado Zakari et al., (1998) realizaron una
fermentación láctica de desechos de camarón en un biorreactor horizontal rotatorio,
con el fin de recuperar quitina, en el cual obtuvieron un hidrolizado (licor proteico) cuya
composición proximal se muestra en la tabla 2.
Tabla 2. Análisis proximal de fracción fermentada de residuos
de camarón.
Componente
%
Cantidad (g)
Peso total
-
185-190
Humedad
79.30
-
Proteínas
44.38
82.50
Calcio
9.20
17.0
Quitina
50.08
89.40
Fuente: Zakari et al., (1998)
2.1.3. Usos
Los hidrolizados de desechos de camarón se utilizan ya sea en la elaboración de
saborizantes en dietas humanas, como en alimento proteico en dietas de acuacultura
(Fagbenro, 1997). En la industria alimentaria los concentrados de hidrolizados
proteicos son utilizados ampliamente en sopas y otros preparados alimenticios
similares (Berk, 1976).
Los hidrolizados de proteínas se han utilizado en el
manejo nutricional de
enfermedades gastrointestinales, en pacientes hipercatabólicos y con síndrome de
desnutrición; se han utilizado en la disminución de las reacciones anafilácticas
atribuidas a algunas proteínas y macropéptidos (Berk, 1976). Otros efectos
terapéuticos relacionados con el consumo de los hidrolizados proteicos están
asociados con el incremento de la función detoxificadora del amonio en el tejido
muscular. Además, se cree que los hidrolizados proteicos influyen en la regulación
endocrina de los procesos metabólicos (Morris-Quevedo et al., 2001).
2.2. Triptófano y tirosina
• Triptófano
El triptófano es un aminoácido nutricionalmente esencial que fue descubierto por
Hopkins y Cole en 1901 (Friedman y Cuq, 1988). Es un aminoácido excepcional con
una diversidad de funciones biológicas. Su contribución es importante para el
crecimiento normal y síntesis de proteínas de diversos tejidos. También regula
numerosos mecanismos psicológicos, por ejemplo, es el precursor del neurotransmisor
serotonina (5-hidroxitriptamina), y por lo tanto es importante en la función del cerebro
(Friedman y Cuq, 1988).
Este aminoácido, puede influir sobre el sueño en el ser humano, además, junto con
sus derivados, pueden alterar la conducta. Es un precursor de la vitamina niacina,
estimula la secreción de insulina y hormonas del crecimiento y previene el desarrollo
de hipertensión inducida por cortisona. Interactúa con los carbohidratos y las
micotoxinas y participa en la formación de complejos enzima-enzima inhibidor
(Friedman y Cuq, 1988).
• Tirosina
La tirosina es un aminoácido normal descubierto por Rudolf Karl Ludwig Virchow
(1821-1901) (Oddo, 2006). Se encuentra en cualquier dieta y es captada de la
circulación, por un proceso de transporte activo, hacia el interior axonal del cerebro. La
tirosina también puede ser sintetizada en el organismo a partir de la fenilalanina,
transformación catalizada por una hidroxilasa oxidasa que introduce un grupo oxhidrilo
en la posición para del anillo bencénico. La hidroxilasa de fenilalanina es la enzima
que no existe en la enfermedad congénita fenilcetonuria. La hidroxilación de la tirosina
da origen a las catecolaminas. Otras vías metabólicas dan origen a partir de la tirosina
a: tiroxina, p-hidroxifenilpiruvato, melanina y otras proteínas. Está directamente
relacionada con muchos procesos celulares ya que son controlados a través de la
fosforilación reversible de los residuos de éste aminoácido en las proteínas (Salomón
et al., 2003).
2.2.1. Estructura química
• Triptófano
El triptófano (ácido α-amino-β-indolpropiónico) es uno de los tres aminoácidos
aromáticos esenciales que contiene una anillo de indol en su estructura (figura 1). Uno
de los aspectos más relevantes de su biosíntesis es el mecanismo a través del cual los
anillos aromáticos se forman a partir de precursores alifáticos. La parte aromática está
unida al carbono a través de un carbono metilénico (Murray et al., 1988).
• Tirosina
La tirosina, como el triptófano y la fenilalanina, es un aminoácido de cadena aromática
e hidrófobo, que exhibe, por lo tanto, una solubilidad limitada en agua (figura 2).
Aunque se le considera un aminoácido polar, ya que contiene un solo grupo fenólico
ionizable que se ioniza a pH alcalino; pero, tomando en cuenta sus características de
solubilidad a pH neutro, debe considerarse como un aminoácido hidrófobo (Fenema,
2000).
2.2.2. Características de identificación
Muchos métodos analíticos son utilizados para la identificación de triptófano y tirosina
en alimentos. Cuando los métodos son cromatográficos la identificación se realiza
principalmente con detectores ultravioleta o de fluorescencia (Kivi, 2002).
Fuente: http://www.biopsicologia.net
Figura 1. Estructura química del triptófano.
Fuente: http://www.biopsicologia.net
Figura 2. Estructura química de la tirosina.
La mayoría de las determinaciones de aminoácidos, por detección de fluorescencia,
son realizadas mediante una derivatización. La derivatización de un aminoácido es
llevada a cabo mediante una reacción electrofílica con el grupo α-amino, esto permite
que la molécula emita radiación fluorescente que puede ser detectada con mayor
facilidad. La reacción puede efectuarse tanto en precolumna como postcolumna en las
determinaciones HPLC (Kivi, 2000).
De acuerdo con
Chen y Barkley (1998), los aminoácidos aromáticos triptófano,
tirosina y fenilalanina, ofrecen una
prueba intrínseca
de fluorescencia en la
conformación de proteínas, además de interacciones dinámicas e intermoleculares. La
fluorescencia del cromóforo indol del triptófano es altamente sensible al ambiente,
dando oportunidad ideal para el reporte de conformaciones proteínicas, cambios e
interacciones con otras moléculas, inclusive para su identificación analítica por
métodos fluorimétricos.
Por otro lado, tirosina a pesar de ser fluorescente, en menor proporción en
comparación con el triptófano, generalmente es identificado en conjunto con los demás
aminoácidos mediante una derivatización después de la hidrólisis ácida, tanto por
fluorescencia (Haynes et al., 1991; González-Paramás et al., 2006) como por
ultravioleta (Shang y Wang, 1996; Sánchez-Machado et al., 2003).
Las longitudes de onda utilizadas por los investigadores para la determinación de
triptófano por HPLC con detección de fluorescencia, varía; por ejemplo, Yamada et al..
(1983), determinaron triptófano en cerebro de ratón utilizando una longitud de onda de
excitación de 280 nm y de emisión 350 nm. Kema et al., 2001), determinaron triptófano
en plasma humano y utilizaron una longitud de onda de excitación de 285 nm y de
emisión de 340 nm. Por otro lado Wu y Tanoue (2001), en la determinación de
triptófano en agua utilizaron una longitud de onda de excitación de 336 nm y de
excitación de 445 nm.
En la determinación por HPLC con detección por fluorescencia de tirosina también se
han utilizado diferentes longitudes de onda por los investigadores; por ejemplo, Del
Castillo et al.,(1998) determinaron aminoácidos libres, incluyendo tirosina, en jugo de
naranja comercial, utilizando una longitud de onda de excitación 340 nm y de emisión
de 425 nm. López-Cervantes et al., (2006), utilizaron una longitud de onda de
excitación de 270 nm y de emisión de 316 nm en la determinación de aminoácidos
libres, incluyendo tirosina, en muestras de hidrolizados de residuos de camarón. En la
figura 3 y 4 se muestran los espectros de
emisión de triptófano y tirosina,
respectivamente.
Ninguno de los 20 aminoácidos encontrados en las proteínas absorbe en la zona del
espectro visible. Sin embargo, triptófano y tirosina absorben luz significativamente
entre 260-290 nm en el espectro ultravioleta. La tirosina presenta un máximo a 275 nm
con un hombro a 285 nm. La banda se desplaza a mayores longitudes de onda
cuando se produce la desprotonación del OH del anillo aromático. El triptófano agrupa
al menos tres bandas diferentes bajo el espectro centrado a 280 nm. También
presenta bandas en la zona del UV lejano (figura 5) (Lehninger, 1995).
Fuente: Du, et al. (1988)
Figura 3. Espectro de emisión de triptófano
Fuente: Du, et al. (1988)
Figura 4. Espectro de emisión de tirosina
Fuente: Lehninger, 1990
Fuente: Lehninger, 1995
Figura 5. Espectros de absorción UV de triptófano y tirosina
2.2.3. Estabilidad
•
Efectos de ácidos y bases fuertes
Ningún procedimiento hidroliza completamente a las proteínas en sus aminoácidos
constituyentes sin la pérdida parcial de alguno de ellos. Por lo general, el método que
se elige es la hidrólisis con HCl 6N a 110 ºC en un tubo sellado al vacío, durante 24 a
96 horas (Murray et al., 1988). La hidrólisis ácida destruye al triptófano por completo
quedando el amoniaco como único producto reconocible (Friedman y Finley, 1971;
Arai y Muramatsu, 1982; Friedman y Cuq, 1988; Landry y Delhaye, 1988, 1994;
Fagbenro y Bello-Olusoji, 1991). Por años, los investigadores han considerado al
triptófano más estable en medio alcalino que en ácido, por lo que la hidrólisis básica
de proteínas es más recomendable para el análisis del triptófano, es decir, hidrólisis
con NaOH en vez de HCl (Friedman y Finley, 1971; Friedman y Cuq, 1988; Wu y
Tanoue, 2001; Hanko y Rohrer, 2002; Ravindran y Bryden, 2004).
Hugli y More (1972) determinaron que a temperatura ambiente en presencia de aire,
las soluciones de triptófano puro en ácido clorhídrico diluido (0.1 N) son
particularmente estables. Sin embargo, en presencia de otros aminoácidos comunes el
triptófano contenido en la solución decrece con el tiempo.
Durante la hidrólisis alcalina y utilizando una solución buffer (amortiguadora) de citrato
la destrucción del triptófano a pH 2.2 es significativa. La estabilidad crece por
incremento del pH, por reducción de la temperatura o por el cambio de una solución
amortiguadora de citrato a otra de fosfato de sodio. También se observan pérdidas
cuando una solución de triptófano puro es diluida en hidróxido de sodio en presencia
de aire (Friedman y Cuq, 1988).
Por otro lado, la extracción de tirosina de complejos proteínicos implica, la mayoría de
las veces, tratamiento con ácidos fuertes (principalmente HCl). Haynes et al., (1991)
realizaron una hidrólisis con HCl 6M para la cuantificación de aminoácidos, incluyendo
tirosina, en pepsina y lisozima de huevo blanco, donde demuestra la estabilidad de los
aminoácidos dentro de las primeras 24 horas del estudio. Sin embargo,
Perlman (1963) afirman que, tirosina
Arnon y
es parcialmente descompuestas durante la
hidrólisis con HCl 6N, a 110 ºC por 22, 48 y 72 h.
En cuanto al efecto de la hidrólisis alcalina sobre la estabilidad de la tirosina no existe
mucha información al respecto. Yust et al., (2004) afirman tener una destrucción
parcial de tirosina y fenilalanina en hidrolizados alcalinos de harina de trigo, soya y
cebada.
•
Efecto de la temperatura
El anillo indol de la estructura del triptófano a 130 ºC, con un pH de 4-10, por 30 min y
bajo atmósfera de oxígeno es estable (Friedman y Cuq, 1988). Cuq y Cheftel (1983)
utilizaron un método HPLC con detección por fluorescencia y UV para determinar
triptófano, demostraron que éste, bajo tratamiento térmico, es degradado sólo en
presencia de oxígeno y que ésta degradación incrementa conforme aumenta el tiempo
de exposición, esto confirma que el anillo indol es estable a altas temperaturas pero en
ausencia de oxígeno. En cuanto a los efectos del tratamiento térmico a temperaturas
cercanas a los 100 ºC hay pocos datos correspondientes al proceso industrial o
casero.
•
Racemización
La racemización de aminoácidos ocurre bajo varias condiciones de temperatura, pH y
actividad de agua, y está influenciada por la actividad de otros constituyentes
alimenticios como carbohidratos o lípidos (Liardon y Lederman, 1986).
Los aminoácidos en proteínas son fácilmente racemizados con álcali, en contraste los
aminoácidos libres se racemizan con dificultad. Los efectos de la temperatura en la
recemización del triptófano libre en soluciones básicas fuertes han sido estudiados con
anterioridad. Su completa racemización ocurre a 151 ºC y 185 ºC en 8 h y 2 h,
respectivamente. Después de 18 h a 100 ºC, la isomerización del triptófano libre es de
sólo el 11% (Spies y Chambers, 1949).
Según Liardon y Lederman (1986) el mecanismo de inversión de los aminoácidos bajo
tratamiento alcalino se lleva a cabo mediante la abstracción del α-hidrógeno y la
formación de un carbanión. La tasa de inversión es directamente proporcional a la
probabilidad de formación y a la estabilidad de éste estado intermediario. Estos
autores encontraron en su estudio de racemización de aminoácidos bajo tratamiento
alcalino cuatro factores principales susceptibles de influenciar: 1) el estado libre o
ligado del aminoácido; 2) la cadena lateral del aminoácido; 3) la estructura de la
proteína; y 4) el proceso de desnaturalización de la proteína.
•
Efecto del oxígeno
La presencia de oxígeno influye en gran medida en la estabilidad del triptófano bajo
tratamiento térmico. En una investigación realizada por Friedman y Cuq (1988),
utilizando un método espectrofluorimético de análisis, se estableció la susceptibilidad
del triptófano a la oxidación a 100 ºC en un rango de pH de 2-7 tanto en soluciones de
ácido fuerte como de base fuerte. Pero cuando el oxígeno fue removido la
descomposición decreció rápidamente.
Algunos autores han utilizado diferentes antioxidantes para aumentar la estabilidad a
la oxidación del triptófano durante la hidrólisis. Por ejemplo, Wu y Tanoue (2001)
realizaron experimentos de hidrólisis alcalina para determinar triptófano por HPLC con
detección por fluorescencia en muestras de agua potable, donde utilizaron almidón,
lactosa y ácido ascórbico como antioxidantes. Como resultado encontraron que el
almidón comercial utilizado contenía altos niveles de materiales fluorescentes que
causaron interferencias en la detección. Lactosa y ácido ascórbico no contaminaron al
triptófano y mejoraron su recuperación, aunque ácido ascórbico fue más efectivo.
Concluyeron que el mecanismo protector de la lactosa es muy similar al del almidón,
los polisacáridos remueven trazas de oxígeno durante la hidrólisis incorporándolo en
su estructura evitando que reaccione con el triptófano.
Por otro lado, Hugli y More (1972) utilizaron almidón parcialmente hidrolizado como
antioxidante y como protección al efecto de residuos de carbohidratos de la muestra,
durante la hidrólisis alcalina de proteínas con NaOH 5 N para determinar triptófano.
Como resultado de la adición de almidón se incrementó la recuperación de triptófano
de 91 a 98%.
Otros autores como Spies y Chambers (1949) y Yust et al., (2004) han utilizado la
sustitución de la atmósfera de oxígeno por una de nitrógeno para proteger al triptófano
de la oxidación sin necesidad de agregar antioxidantes.
•
Presencia de carbohidratos
La reacción de Maillard, también conocida como reacción
de oscurecimiento no
enzimático, involucra la reacción de compuestos carbonilos, especialmente azúcares
reductores, con compuestos que poseen aminoácidos libres (Fennema, 2000 ). Spies
y Chambers (1949) analizaron el efecto de glucosa y fructosa en triptófano cuando fue
sometido a 150 ºC por 18 h en NaOH, demostrando que bajo estas condiciones
dichos carbohidratos ejercen un efecto insignificativo en la estabilidad del triptófano. El
triptófano libre en ausencia de otros compuestos reactivos no es relativamente
afectado por temperaturas cercanas a los 100 ºC por 10 horas. Sin embargo, en
presencia de glucosa las pérdidas ascienden al 50% (Friedman y Cuq, 1988).
•
Presencia de otros aminoácidos
La presencia de algunos aminoácidos influye en la destrucción de triptófano durante la
hidrólisis alcalina bajo tratamiento térmico. Spies y Chambers (1949) analizaron el
efecto de 16 aminoácidos en L-triptófano cuando éste es calentado a 150 ºC en NaOH
5 N por 18 h, como resultado obtuvieron que alanina, tirosina, leucina, glicina, histidina
y metionina no causan destrucción de triptófano. En cambio cistina, serina y treonina
causan un 23.7%, 23.9% y 21.7% de destrucción, respectivamente. Concluyeron que
estos aminoácidos no sólo tienen la habilidad de enolizar sino que probablemente la
naturaleza de los grupos amino y carboxilo están involucrados en la relativa facilidad
para racemizar que tienen los aminoácidos en la hidrólisis de proteínas con álcali.
2.3. Metodología propuesta para la cuantificación de tirosina y
triptófano
La determinación de tirosina y triptófano en alimentos es un proceso que involucra una
etapa de extracción y otra de cuantificación.
2.3.1. Extracción de tirosina y triptófano
Muchos métodos sugieren que triptófano y tirosina pueden ser determinados en forma
libre, para lo cual deben liberarse de las proteínas por medio de una hidrólisis. La
extracción común consiste usualmente de una hidrólisis ácida (HCl 6M, 24 h, 120 °C),
que suele modificar las cadenas laterales de algunos aminoácidos, por ejemplo, por
desaminación de los restos de glutamina y asparaginina, desfosforilación de la
fosfoserina y destrucción completa del triptófano. En virtud de reacciones más
complejas, la hidrólisis ácida puede causar la formación de pigmentos y derivados con
sabor y olor a carne (Fennema, 2000).
El triptófano es un caso especial en el análisis de alimentos, ya que algunos de ellos
contienen grandes cantidades de carbohidratos que incrementan en gran medida las
tendencias degradativas de este aminoácido (Kivi, 2000). Por lo tanto, es necesario
suplementar el hidrolizado con triptófano.
Debido a todas las desventajas de la hidrólisis ácida, muchos autores recomiendan la
hidrólisis alcalina para la determinación de triptófano total (NaOH 4 M, 16 h, 120 °C ó
Ba(OH)2). Sin embargo, tirosina al igual que fenilalanina, presentan, una destrucción
parcial (Yust et. al., 2004), también provoca la destrucción de la cisteína, cistina,
arginina y metionina. Por otra parte, se produce cierta recemización a D-aminoácidos,
esto reduce el valor alimenticio del producto, ya que sólo los L-aminoácidos son
asimilables. La hidrólisis al ser moderada, produce un hidrolizado que contiene aun
una proporción importante (50%) de proteína de alto peso molecular (Bourgeois,
1986). En la cuadro 1 se resumen algunos de los métodos usados para la extracción
de triptófano y tirosina de alimentos.
Wu y Tanque, (2001) realizaron hidrólisis alcalina con NaOH 4.2 N a120 ºC por 20 h
para extraer triptófano de sedimentos de lagos. En otra investigación realizada por
Landry y Delhaye (1994) utilizaron hidróxido de bario en la hidrólisis de proteínas de
alimentos para la extracción de triptófano. En cambio, Hagen et al., (1989), utilizaron
HCl 6N a 110ºC por 24 h en la extracción de aminoácidos (entre ellos tirosina) en
papa, trigo y varias legumbres.
2.3.2. Cuantificación de tirosina y triptófano
Muchos métodos analíticos son utilizados para la determinación de tirosina y triptófano
en alimentos y otros sustratos en presencia de otros aminoácidos y constituyentes de
productos biológicos. Casi todos los métodos utilizan hidrólisis ácida, alcalina o
enzimática seguidos por una espectrofotometría, espectrofluorimetría, electroforesis ó
cromatografía, combinaciones de estas y otros (Friendman y Finley, 1971).
Sin embargo, pocos estudios se enfocan en la determinación simultánea de estos dos
aminoácidos, generalmente el estudio se hace por separado o de forma
independiente. Yust et al., (2004) realizan una determinación simultánea de tirosina,
fenilalanina y triptófano en harina de semillas de cereales mediante HPLC con
detección ultravioleta.
En la tabla 3 se muestran algunas investigaciones donde se determina triptófano y
tirosina. Por ejemplo, Landry y Delhaye (1982, 1992, 1994) utilizan una fase móvil de
acetato de sodio con 20% de metanol, una columna en C18 en fase reversa y detección
por fluorescencia para determinar triptófano en muestras de alimentos.
Tabla 3. Condiciones de hidrólisis utilizadas para la extracción de triptófano y
tirosina en alimentos.
Referencia
Sustrato
Analito
Extracción
Ravindran y Bryden
(2004)
Alimentos y
proteínas
Triptófano
NaOH 4.2N, 120 °C, 15 h
Yust et al. ,(2003)
Alimentos y
derivados
Triptófano y tirosina
simultáneamente
NaOH, 100 ºC, 4 h
Wu y Tanoue (2001)
Sedimentos de
lagos
Triptófano
NaOH 4.2N, 120 ºC, 20 h
Hanko y Rohrer
(2001)
Proteína animal
Triptófano
NaOH 4M, 110 °C, 24 h
Albin et al., (2000)
Productos de
soya
Aminoácidos totales,
incluyendo tirosina
HCl 6M, 110 °C y 0, 2, 6, 10,
16, 24, 32, 44, 56 y 72 h.
Landry y Delhaye
(1994)
Alimentos
Triptófano
Ba(OH)2 .8H2O 1.35M, 120 ºC,
16 h, ausencia aire, autoclave
Landry y Delhaye
(1993)
Alimentos de
soya
Triptófano
Ba(OH)2 2.7N (110 ºC, 16 h,
125 ºC, 8 h, 140 ºC, 4 h)
Hagen et al., (1989)
Papa, trigo y
legumbres
Aminoácidos totales,
incluyendo tirosina
HCl 6N, 110 °C, 24 h
Una fase de acetato de sodio/acetonitrilo y una columna de C18 en fase reversa con
detección por ultravioleta fue utilizada por Yust et al., (2004) para la determinación de
triptófano, tirosina y fenilalanina en hidrolizados de seroalbúmina bovina, tripsina y αquimiotripsina. También se han usado combinaciones de buffer de acetato con TEA y
acetonitrilo para la extracción tirosina y otros aminoácidos en muestras de alimentos
(Hagen et al., 1989). En base a lo anterior se puede decir que e uso del buffer de
acetato de sodio como fase móvil es adecuado para la separación de estos
aminoácidos por HPLC. Aunque el buffer de dihidrogenofosfato de potasio también se
ha utilizado con buenos resultados (Krstulovic et al., 1977).
2.4. Cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC)
2.4.1. Conceptos generales
La cromatografía agrupa un conjunto de importantes y diversos métodos que permiten
a los científicos separar componentes estrechamente relacionados en mezclas
complejas, lo que en muchas ocasiones resulta imposible por otros medios. En todas
las separaciones cromatográficas, la muestra se desplaza con una fase móvil, que es
un líquido. La cual se hace pasar por una fase estacionaria con la que es inmiscible, y
que se fija a una columna. Las dos fases se eligen de tal forma, que los componentes
de la mezcla se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria.
Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se
mueven lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario, los componentes que
se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez (Skoog et al., 2001).
HPLC es la técnica analítica de separación más utilizada. Las razones de popularidad
de ésta técnica son su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones
cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o
termolábiles y sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de gran interés
en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general.
Algunos ejemplos de éstos materiales incluyen: aminoácidos, proteínas, ácidos
nucleicos,
hidrocarburos,
carbohidratos,
fármacos,
terpenoides,
plaguicidas
antibióticos, esteroides, especies organometálicas y una variedad de sustancias
inorgánicas (Skoog et al., 2001).
2.4.2. Componentes del sistema
•
Columnas
Las columnas en cromatografía líquida se construyen de ordinario con tubo de acero
inoxidable de diámetro interno uniforme, aunque en algunas ocasiones se encuentran
tubos de vidrio de paredes resistentes. Ejemplos de columnas utilizadas en HPLC son:
columnas analíticas, precolumnas y columnas termostatizadas (Skoog et al., 2001).
Tabla 4. Condiciones cromatográficas usadas en la determinación de triptófano
y tirosina.
Referencia
Analito
Columna HPLC
Fase móvil
Yust et al.,
(2004)
Triptófano,
tirosina y
fenilalanina
Nova-Pack C18 4
µm
Buffer de acetato de
sodio/acetonitrilo (91:9
v/v)
UV 280 nm
Wang, Tang,
(2002)
Triptófano
Nova Pak C18
Buffer de
dihidrogenofosfato de
potasio
Fluorescencia
Ex= 254 nm, Em=
338 nm
Aminoácidos
totales
incluyendo
tirosina
Waters PicoTag
fase reversa
sodio/acetonitrilo
UV 254 nm
Triptófano
ODS-2
Spherisorb
sodio
UV 254 nm
Landry,
Delhaye,
(1994)
Triptófano
C18 fase reversa
Buffer de fosfato de
sodio/20% metanol
UV 280 nm
Fluorescencia
Ex= 285 nm, Em=
345 nm
Kim, (1994)
Triptófano
µBondapak C18
Buffer fosfato de
sodio/20% metanol
UV 280 nm
Kojima et al.,
(1993)
Triptófano
Columna de
Fase reversa
Acetonitrilo/buffer de
fosfato/agua (33:35:32
v/v/v/)
Landry,
Delhaye,
(1992)
Triptófano
Nova Pak C18
fase reversa
sodio/20% metanol
Aminoácidos
totales
incluyendo
tirosina
Waters
( 2.9 x 150 mm)
sodio trihidratado/TEA/
Acetonitrilo
Triptófano
µBondapak C18
Albin et al.,
(2000)
Alegría et al.,
(1996)
Hagen, et al.,
(1989)
Landry,
Detección
Fluorescencia
Fluorescencia
Ex= 285 nm, Em=
345 nm
UV 254 nm
Fluorescencia
Delhaye,
(1980)
sodio/20% metanol
•
Ex= 295 nm, Em=
320 nm
Rellenos de columnas.
En cromatografía de líquidos se han utilizado dos tipos básicos de rellenos, pelicular y
de partícula porosa. El primero consiste en dos bolas de vidrio o de polímero, no
porosas y esféricas con unos diámetros característicos de 30 a 40 µm. En la superficie
de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa de sílice, alúmina, de resina
sintética o de poliestireno-divinilbenceno o de una resina de intercambio iónico. Los
típicos rellenos de partículas porosas para cromatografía de líquidos está formados de
micropartículas porosas con diámetros de entre 3 y 10 µm y con la menor dispersión
posible con respecto a un tamaño determinado. Las partículas son de sílice, alúmina,
de resina sintética o de poliestireno-divinilbenceno o de una resina de intercambio
iónico (Siouffi, 2000).
•
Tipos de columnas
Columnas microbore. Tienen un diámetro interior de 1.0 mm y se utilizan para la
separación de péptidos y proteínas en muestras pequeñas. Estas columnas reducen
significativamente el consumo de solvente. La sensibilidad es alta y los tiempos de
análisis son favorablemente pequeños en comparación con algunas muestras
analizadas en columnas comunes. Algunas marcas comerciales de columnas
cromatográficas, por ejemplo Exsil ODS SGE, están basadas en una tecnología
llamada Silphenylene la cual produce menos pérdidas y largos tiempos de vida en las
columnas comparados con las fases convencionales de polisiloxano. La tecnología
silphenylene involucra la inserción de una molécula de benceno dentro de la estructura
del polímero. Esto resulta en una fase de mayor resistencia a las altas temperaturas:
La modificación del benceno también inhibe las reacciones de ciclisación resultando
en menores pérdidas (Eksteen, 1996).
•
Tipos de detectores
Otro componente importante en un HPLC es el sistema de detección, en donde se
genera una señal eléctrica proporcional a la concentración de los componentes de una
muestra. Entre los detectores que se encuentran en el mercado tenemos los
detectores UV-Vis de longitud de onda fija, de longitud de onda variable, arreglo de
diodos, de barrido rápido de índice de refracción, de fluorescencia, electroquímico, de
conductividad (Siouffi, 2000).
• Detector de Ultravioleta-Visible
En los detectores UV-Vis, los equipos contienen una fuente de radiación para la región
visible y otra para la región ultravioleta. Esta luz se hace incidir sobre una rejilla
holográfica, lo cual dispersa esta luz y produce un espectro de diferentes longitudes de
onda. Estas inciden sobre una abertura o rendija, ajustada de tal manera que sólo
pasa la línea o banda espectral deseada a través de ella. Esta luz de una longitud de
onda específica se hace pasar por la muestra, la cual absorbe un porcentaje
proporcional a la concentración del analito de interés. Después de pasar por la
muestra llega a un fotodetector que la convierte en una señal eléctrica y
posteriormente esta señal es amplificada ya que es muy pequeña. Por último la señal
eléctrica se lleva a un registrador o sistema de manejo de datos. Comercialmente
existen detectores de UV-Vis de longitud de onda fija, longitud de onda variable,
arreglo de diodos y de barrido rápido (Siouffi, 2000).
El diodo-array agrega una dimensión a la capacidad analítica de la cromatografía
líquida por detección UV-Vis, ya que permite que la información cualitativa sea
obtenida mediante la identificación por tiempos de retención.
Hay dos ventajas importantes de la detección por diodo-array. La primera permite que
la mejor longitud de onda sea seleccionada para el análisis real; la segunda está
relacionada con el problema de la pureza del pico, ya que a menudo la forma misma
del pico no revela que corresponde a dos sustancias diferentes (Siouffi, 2000).
• Detector de fluorescencia
El fenómeno de fluorescencia se presenta cuando un electrón que ha sido desplazado
a un nivel de energía más alto por la energía de activación, vuelve a su nivel
energético original liberando un exceso de energía que había absorbido o
almacenado, provocando con ello radiación electromagnética visible. Si el átomo que
lo contiene choca con otra partícula y le cede toda o parte de su energía, la
fluorescencia o disminuye o se inhibe o no aparece (Skoog et al., 2001).
Un detector de fluorescencia consta de los siguientes componentes: una fuente de
radiación luminosa (lámpara de xenón), un monocromador de excitación, un
monocromador de emisión, un sistema óptico, una microcelda de flujo y un tubo
fotomultiplicador (que convierte la señal fotónica en corriente eléctrica) (Siouffi, 2000).
2.4.3. Validación de técnicas analíticas
Validación es la herramienta que permite obtener las pruebas documentales al
respecto. Además permite trabajar con métodos que ofrezcan confianza y seguridad
en los resultados, lo cual minimizará el número de fallos y repeticiones permitiendo un
importante ahorro de costes (APVMA, 2004).
El objetivo de la validación de un método analítico es el demostrar que el
procedimiento, cuando es correctamente aplicado, produce los resultados que son
convenientes para el propósito (APVMA, 2004).
Para iniciar la validación es necesario previamente:
•
Tener perfectamente bien caracterizado el analito.
•
Trabajar con una fórmula definitiva
•
Trabajar suficientemente con el método de análisis como para que nuestro
conocimiento acerca de éste, nos ofrezca garantías de que la validación puede
ser satisfactoria (APVMA, 2004).
No existe una guía oficial que indique la óptima secuencia de experimentos analíticos
necesarios para el desarrollo de un método, ya que esto depende del método en sí
mismo. No obstante, el desarrollo lógico de un método analítico transcurre en
diferentes fases (APVMA, 2004).
•
Selectividad
Capacidad de un método analítico para medio y/o identificar simultánea o
separadamente los analitos de interés, de forma inequívoca, en presencia de otras
sustancias químicas que puedan estar presentes en la muestra. La selectividad de un
método analítico se debería determinar antes de iniciar el estudio de cualquier otro
parámetro de validación, dado que debe conocerse en que grado la respuesta del
método es únicamente proporcionada por el analito, sin interferencia de otras
sustancias relacionadas con él de una u otra forma (FDA, 1996).
•
Linealidad y Rango
La linealidad es la capacidad del método para proporcionar resultados que son
directamente proporcionales a la concentración del analito en la muestra dentro de un
rango establecido. El rango se define como el intervalo entre la concentración superior
e inferior del analito para el cual se ha demostrado la correcta precisión, exactitud y
linealidad del método descrito (FDA, 1996).
•
Precisión del método
La precisión expresa el grado de concordancia (grado de dispersión) entre una serie
de medidas de tomas múltiples a partir de una misma muestra homogénea en las
condiciones prescritas. El objetivo del estudio de la precisión es conocer la variabilidad
o el mas-menos del método de ensayo. Esta variabilidad es debida a errores aleatorios
inherentes a todo método. Como consecuencia de la existencia de éstos errores, los
análisis efectuados, en las mismas circunstancias, no conducen generalmente a
resultados idénticos. Los factores susceptibles de influir sobre los resultados de un
ensayo no pueden ser siempre controlados (analista, equipo instrumental, reactivos,
tiempo, etc.) de aquí la importancia del estudio de precisión. La precisión engloba
diferentes tipos de estudios: repetibilidad (instrumental o del método), precisión
intermedia y reproducibilidad (Sánchez-Machado y López-Cervantes, 2004). La
repetibilidad estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre
las mismas condiciones operativas (por el mismo analista, con los mismos aparatos y
reactivos, etc.) en un mismo laboratorio en un período corto de tiempo. La precisión de
un método analítico se expresa generalmente como el coeficiente de variación (CV) de
una serie de medidas y se calcula matemáticamente de la siguiente forma: CV (%) =
(desviación estándar/media aritmética)(100) (Sánchez-Machado y López-Cervantes,
2004).
•
Exactitud
La exactitud en un procedimiento analítico expresa la proximidad entre el valor que es
aceptado convencionalmente como valor verdadero o valor de referencia y el valor
experimental encontrado. No se debe confundir exactitud con precisión. La precisión
esta relacionada con la dispersión de una serie de medidas, pero no da ninguna
indicación de lo cerca que ésta del valor verdadero (FDA, 1996).
•
Límite de detección y cuantificación
Dado un método determinado, se entiende por límite de cuantificación (LC) de dicho
método, la cantidad mínima de analito presente en la muestra que se puede
cuantificar, bajo las condiciones experimentales descritas, con una adecuada precisión
y exactitud; y por límite de detección (LD) la mínima cantidad de analito en la muestra
que se puede detectar aunque no necesariamente cuantifica bajo dichas condiciones
experimentales (FDA, 1996).
•
Robustez
La robustez de un método analítico se define como, la medida de su capacidad para
permanecer inalterado ante pequeñas pero deliberadas variaciones en ciertos
parámetros, proporcionando idea de su fiabilidad o estabilidad durante su empleo de
rutina. Es por tanto la capacidad que demuestra el procedimiento de análisis para
proporcionar resultados válidos en presencia de pequeños cambios respecto de las
condiciones descritas en el método, susceptibles de producirse durante su utilización
(APVMA, 2004).
III. MÉTODO
3.1. Ubicación del experimento
El experimento se realizó en el laboratorio LV-712 del Instituto Tecnológico de Sonora,
unidad Obregón-Náinari, ubicado en Antonio Caso s/n en Cd. Obregón, Sonora,
México.
3.2. Estándares y reactivos
Los estándares L-triptófano y L-tirosina fueron obtenidos de Sigma (St. Louis, MO,
EUA). Todos las soluciones fueron preparadas con agua ultrapurificada con un
sistema NANO Pure Diamond UV (Branstead International, Dubuque, Iowa, EUA). El
metanol (grado HPLC) fue obtenido de AMD CHOMASOLV (Steinheim, Alemania). El
ácido acético glacial, ácido bórico, ácido clorhídrico, hidróxido de sodio y acetato de
sodio anhidro, todos grado analítico, fueron obtenidos de Productos Químicos
Monterrey (Monterrey, Nuevo León, México).
Los estándares de aminoácidos fueron diluidos en HCl 0.1M a diferentes
concentraciones y calculados para su calibración. El agua ácida utilizada en el análisis
de los aminoácidos libres consistió en agua ultrapura (NANO pure Diamond UV)
acidificada a pH 6.3 con HCl 1M. El NaOH 4.2M utilizado en la hidrólisis de
aminoácidos totales se preparó disolviendo 41.99 g de perlas de NaOH en 250 ml de
agua ultrapura en un matraz volumétrico.
La solución amortiguadora de boratos
utilizada en la dilución de las muestras hidrolizadas consistió de una solución de ácido
bórico 250 mM: se diluyeron 1.743 g de ácido bórico en 90 ml de agua ultrapura, se
ajustó a pH 9 con NaOH 1M y se diluyó a 100 ml con agua ultrapura en un matraz
volumétrico. La fase móvil consistió de una mezcla de solución amortiguadora de
cetato de sodio 40 mM ajustado a pH 4.5 con solución de ácido acético glacial/agua
(1:4), con 20% de metanol.
3.3. Equipo y condiciones HPLC
Para el análisis cromatográfico se utilizó un sistema HPLC (GBC, Dandenong,
Australia) equipado con autoinyector LC1650, desgasificador de solventes LC1460,
bomba cuaternaria LC1150, detector de fluorescencia LC1255S y sistema WinChrom
de análisis de datos cromatográficos.
Las condiciones cromatográficas para la separación simultánea de triptófano y tirosina
se indican en el cuadro 1.
El programa de detector de fluorescencia inició a las
longitudes de onda óptimas para la tirosina por 5.8 min, y posteriormente fueron
cambiadas automáticamente por las longitudes de onda óptimas para el triptófano. El
tiempo total entre inyecciones fue de 20 minutos.
Cuadro 1. Condiciones cromatográficas óptimas para el análisis
Parámetro
Columna
Fase móvil
Velocidad de flujo
Detección
Temperatura
Condiciones
4.6 mm SS Exil ODS 250 mm, 5µm
Sistema isocrático:
sodio:metanol pH 9.0
0.8 ml/min
Buffer
de
Fluorescencia
Triptófano: Ex: 280 nm, Em: 348 nm
Tirosina: Ex: 274 nm, Em: 304 nm
26 ºC
acetato
de
3.4. Preparación de las muestras
• Fermentación de los residuos de camarón
Las muestras de residuos de camarón fueron obtenidas de una procesadora localizada
en el parque industrial de Cd. Obregón, Sonora, México. Primeramente fueron
molidas, congeladas y almacenadas en bolsas de plástico hasta su uso.
Posteriormente fueron fermentadas siguiendo el procedimiento descrito por SánchezMachado, et al. (2005). 500 g de muestra son colocadas en un recipiente, se agrega
inóculo comercial de Lactobacillus sp. (50% v/p), azúcar de caña (6.66% p/p), se
ajusta el pH a 4.5 con ácido cítrico al 25 % y finalmente se incubó a 30 ºC por 24 horas
en una incubadora (HOTPOINT) (figura 6). El fermentado fue separado en una
centrifuga refrigerada (HARRIET, modelo 18/80), a 6 ºC, 6000 rpm por 15 minutos,
para la obtención de la fracción rica en quitina insoluble (sedimento), del líquido rico en
proteínas (licor) y de la fracción de lípidos (astaxantina).
• Obtención de hidrolizados proteicos
Una fracción de las muestras de licor fueron secadas en un liofilizador (LABCONCO,
USA, modelo Freezone 4.5) a -40 ºC y 130 bar de presión. Otras muestras secadas en
condiciones de vacío (NATIONAL, USA, modelo 5831) a 60 ºC por 3 días.
Posteriormente, las muestras se conservaron en un desecador y en la oscuridad hasta
su análisis.
3.4.1. Análisis de humedad
El contenido de humedad de las muestras de desecho de camarón se determinó, por
duplicado, en una estufa de vacío a 60 ºC por 5 horas, hasta tener un peso constante
(AOAC, 1984). Esto con la finalidad de expresar los resultados en base seca.
Cabeza de camarón molida
•
50% Lactobacillus sp
•
6.66% sacarosa
•
Ajuste a pH 4.5 con ácido
cítrico al 25%
Monitoreo de pH, 24 horas
Centrifugación: 6000 rpm, 6 ºC, 15 minutos
Residuo
(quitina)
Licor
(proteínas)
Sobrenadante
(lípidos)
Muestras liofilizadas y
deshidratadas
Dilución a 50 ml con agua
acidificada pH 6.3
Filtrado a través de una
membrana 0.45 µm
Determinación de
triptófano y tirosina
libres por HPLC
Hidrólisis alcalina y
neutralización a pH 9 con
HCl concentrado
Dilución en buffer de boratos pH
9, centrifugación y filtrado en
membrana 0.45 µm
Determinación de
triptófano y tirosina
totales por HPLC
Figura 6. Metodología seguida en el experimento
3.4.2. Análisis de proteínas
El contenido de proteínas de muestras de desechos de camarón se determinó por el
método Rapid Kjeldahl con Rapid Digestor-25 y Rapidstill II Labconco, factor de
conversión 6.5 (AOAC, 1984).
3.4.3. Extracción de triptófano y tirosina libres
Los aminoácidos fueron extraídos de las muestras secas con agua ácida.
Específicamente, 25 mg de muestra seca o liofilizada, finamente pulverizada, fueron
disueltos en un matraz volumétrico de 50 ml con agua acidificada a pH 6.3 con HCl
0.1M, para obtener una concentración de 0.5 mg/ml de muestra. Posteriormente, las
muestras fueron sonificadas (BRONSON, USA, modelo 1510) por 2 minutos para su
completa disolución, filtradas en membrana 0.45 µm y posteriormente analizadas por
HPLC.
3.4.4. Extracción de triptófano y tirosina proteicos
Para la extracción de triptófano y tirosina proteicos se llevó a cabo una hidrólisis
alcalina: 25 mg de muestra fueron colocados en tubos de vidrio, se añadieron 3 ml de
NaOH 4.2 M y se sonificaron por 2 minutos, luego los tubos fueron sellados bajo
atmósfera de nitrógeno e incubadas a 120 ºC por 4 horas.
Los hidrolizados se
enfriaron a temperatura ambiente y después a 4 ºC en un baño de hielo. Se filtraron
a través de filtro Wathman No. 2 y se diluyeron a 50 ml con solución amortiguadora de
boratos pH 9.0 en un matraz volumétrico. Finalmente, alícuotas de esta solución
fueron filtradas a través de membrana Millipore 0.45 µm antes del análisis
cromatográfico.
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El objetivo principal de esta investigación fue desarrollar un método de cromatografía
de líquidos. Para lo cual se optimizaron la cantidad de muestra, las condiciones de
hidrólisis, las condiciones cromatográficas y se realizó la validación del método para
finalmente aplicarlo en la cuantificación de ambos aminoácidos. El método analítico
propuesto permite desarrollar un análisis confiable ya que asegura, mediante su
validación, que el procedimiento es adecuado para determinar estos dos aminoácidos.
4.1. Análisis proximal
4.1.1. Determinación de humedad
El contenido de humedad de muestras de hidrolizados de desechos de camarón fue
de 1.098%.
4.1.2. Determinación de proteínas
El contenido de proteína cruda de los hidrolizados de residuos de camarón se muestra
en el cuadro 2 y están en el rango de 38.20 - 45.11% de proteína.
Cuadro 2. Contenido de proteína total de muestras de hidrolizados de
residuos de camarón.
a
Muestra
% Proteína (m.s.)*
1
36.62 ± 0.53
2
43.51 ± 0.85
3
40.83 ± 1.19
4
38.20 ± 1.11
5
45.11 ± 0.37
6
44.33 ± 0.98
Promedio
41.77 ± 2.97
Media ± desviación estándar, n=2
El promedio de estas 6 determinaciones es de 41.77% de proteína, este valor es
similar al obtenido por otros autores, por ejemplo 40.6% en residuos de camarón
(Cragnon cragnon ) y 41.9% en camarón (Pandalus boreales) (Synoweicki et al., 2000)
y 44.38% en el licor de la fermentación de residuos de camarón (Zakari et al., 1998).
4.2. Tratamiento de la muestra
Para determinar las condiciones de tratamiento primeramente se llevaron a cabo
ensayos para especificar la cantidad de muestra a utilizar, posteriormente se
realizaron pruebas para determinar las condiciones de hidrólisis (cantidad de álcali y
tiempo de hidrólisis).
4.2.1. Determinación de la cantidad de muestra a analizar.
Para la determinación de la cantidad de muestra a utilizar en la hidrolizar se llevaron a
cabo varios ensayos previos. Uno de los experimentos consistió en realizar una
hidrólisis utilizando 25, 50 y 75 mg de muestra con 3 y 6 ml de NaOH 4.2 M a 120º C,
analizados por duplicado (cuadro 3).
Cuadro 3. Análisis de determinación de la cantidad de muestra a utilizar en la
hidrólisis alcalina.
Muestra
(mg muestra-ml NaOH 4.2M)
25 mg-3 ml
Triptófano (mg/g m.s.)*
Tirosina (mg/g m.s.)*
7.23 ± 0.12a
4.27 ± 0.04 a
b
4.68 ± 1.23
b
a
50 mg-3 ml
7.98 ± 2.18
75 mg-3 ml
7.02 ± 0.03
4.37 ± 0.02
25 mg-6 ml
8.24 ± 0.35b
4.85 ± 0.08b
50 mg-6 ml
b
7.82 ± 0.14
4.71 ± 0.07
75 mg-6 ml
7.98 ± 0.04
b
4.82 ± 0.03
a
b
b
*Media ± desviación estándar, n = 2
Niveles no conectados por la misma letra son diferentes
a, b
Para el análisis cromatográfico las muestras de 50 y 75 mg se diluyeron 1:2 y 1:4,
respectivamente, en agua acidificada a pH 6.3 con ácido acético glacial; esto con la
finalidad de evitar la saturación en el cromatograma. Se realizó un análisis de
varianza, que mostró que si hay diferencias significativas entre los tratamientos, para
tirosina y triptófano. Además, se realizó una comparación de medias por la prueba de
rango múltiple de Duncan con un nivel de significancia del 0.05 para determinar
diferencias entre tratamientos, tanto para tirosina como para triptófano, donde muestra
que los tratamientos 25 mg-3 ml y 75 mg-3 ml no son estadísticamente diferentes,
pero sí son diferentes de los tratamientos 50 mg-3 ml, 25 mg-6ml, 50 mg-6 ml y 75 mg6 ml, que a su vez no presentan diferencias significativas entre ellos. En este caso por
motivos de optimización de reactivos se realizó el experimento con 25 mg de muestra
y la hidrólisis con 3ml de NaOH 4.2 M
4.2.2 Determinación de las condiciones de hidrólisis
Para definir la cantidad de NaOH 4.2 M y el tiempo óptimos para la hidrólisis se realizó
otro ensayo en el que se probaron tres cantidades de álcali (3, 6 y 9 ml) y cuatro
diferentes tiempos (4, 8, 12 y 16 horas), siendo un total de 12 ensayos por
duplicado, los resultados se muestran en el cuadro 4.
Cuadro 4. Ensayo de determinación de tiempo de hidrólisis y cantidad de
NaOH 4.2 M a utilizar.
Muestra
(Tiempo hidrólisis-ml
NaOH 4.2 M)
16 h-3 ml
Triptófano
(mg/g m.s.)*
a
7.49 ± 0.26
Tirosina
(mg/g m.s.)*
a
4.50 ± 0.14
12 h-3 ml
7.90 ± 0.84ab
4.59 ± 0.35a
12 h-6 ml
8.38 ± 0.57
abc
8 h-6 ml
8.41 ± 0.30
abc
8 h-9 ml
8.42 ± 0.01abc
bc
a
4.85 ± 0.10
4.71 ± 0.03
a
4.97 ± 0.09a
a
16 h-6 ml
8.50 ± 0.27
8 h-3 ml
8.51 ± 035
12 h-9 ml
8.75 ± 0.11bcd
16 h-9 ml
8.84 ± 0.01
bcdf
4.97 ± 0.03
4 h-3 ml
8.93 ± 0.53
cdf
4.88 ± 0.58
4 h-6 ml
9.05 ± 0.19d
4 h-9 ml
bc
f
9.73 ± 0.02
4.86 ± 0.19
a
4.63 ± 0.33
4.98 ± 0.06a
a
a
4.78 ± 0.03a
4.97 ± 0.02a
*Media ± desviación estándar, n = 2
Niveles no conectados por la misma letra son diferentes
a, b, c, d, f,
En la figura 7 se muestra un gráfico de la cantidad de triptófano y tirosina obtenidos
después de un tratamiento con NaOH 4.2 M a diferentes concentraciones y con
diferentes tiempos de hidrólisis.
Contenido de aminoácido (mg/g m.s.)
12
10
Triptófano
Triptófano
Triptófano
8
4h
6
Tirosina
Tirosina
Tirosina
8h
12h
16h
4
2
0
3ml
3ml
6ml
6ml
9ml
9 ml
Cantidad de NaOH 4.2 M
Figura 7. Cantidad de triptófano y tirosina obtenidos a 4, 8, 12 y 16 horas de
hidrólisis con 3, 6 y 9 ml de NaOH 4.2 M.
Se realizó un análisis de varianza para tirosina donde se muestras que no hay
diferencias significativas entre tratamientos por lo que cualquiera de ellos puede
utilizarse para analizar este aminoácido.
Sin embargo, para triptófano el análisis de varianza muestra que si hay diferencias
significativas entre los tratamientos por lo que se realizó una comparación de medias
por la prueba de rango múltiple de Duncan con un nivel de significancia del 0.05 para
determinar diferencias entre tratamientos utilizados en la hidrólisis.
La comparación de medias para triptófano muestra que hay 5 grupos con diferencias
significativas entre ellos. Pero por cuestiones de optimización de reactivos se utilizó el
tratamiento de 4 h-3 ml que pertenece al grupo 3, tanto para tirosina como para
triptófano. Todos los datos fueron analizados en el paquete estadístico SPSS 12.0.
4.3. Identificación
Para la identificación de triptófano y tirosina se utilizaron los detectores de
fluorescencia y ultravioleta. Al analizar los cromatogramas de los patrones de
aminoácidos se observan más definidos y más grandes en el detector de fluorescencia
(figura 8). Según Chen y Barkley (1998), lo anterior es debido a que triptófano y
tirosina contienen en su estructura un cromóforo indol que es altamente fluorescente y
por lo tanto los hace más visibles para la detección por fluorescencia.
Triptófano y tirosina fueron identificados en la columna cromatográfica por sus tiempos
de retención mediante una comparación con los patrones de referencia originales de
cada uno por separado. Los tiempos de retención obtenidos fueron de 4.24 ± 0.005
min para tirosina y de 8.32 ± 0.02 min, los cuales se obtuvieron calculando el promedio
de los tiempos de retención de 10 ensayos con 2 inyecciones cada uno.
Figura 8. Cromatogramas de patrón de triptófano y tirosina. A) Detección ultravioleta
B) Detección por fluorescencia.
Posteriormente se procedió a la extracción de triptófano y tirosina de la muestra. Al
realizar el análisis HPLC se encontró que, los picos de los aminoácidos de inyecciones
independientes, presentaron el mismo tiempo de retención. En base a lo anterior, se
determinó la presencia de triptófano y tirosina en la muestra.
Durante la optimización de las condiciones cromatográficas se hicieron pruebas con
diferentes longitudes de onda para de eliminar los picos desconocidos que interfieren
con los picos deseados, y que se observan entre los picos correspondientes a tirosina
y triptófano. Para esto, se seleccionaron solamente las longitudes de onda de
triptófano y tirosina (Triptófano: Ex: 280 nm, Em: 348 nm, Tirosina: Ex: 274 nm, Em:
304 nm).
En la figura 9 se observa el cromatograma mostrando las interferencias y otro con las
condiciones de detección de los aminoácidos deseados.
4.4. Condiciones cromatográficas
Diferentes fases estacionarias o empaques de columnas cromatográficas se han
utilizado para cuantificar triptófano y tirosina. En éste trabajo se seleccionó una SS Exil
ODS 5 µm de tamaño de partícula (SGE, Dandenong, Australia). Ésta es una columna
fase reversa, la cual se considera versátil y de amplia aplicación.
4.4.1. Fase móvil
Para la determinación de triptófano y tirosina en alimentos son generalmente utilizadas
diferentes fases móviles en diversas condiciones. La concentración de la fase móvil es
un parámetro que influye en la eficiencia de un sistema HPLC, debido a que los
componentes de una solución migran de acuerdo a las interacciones no covalentes del
compuesto con la columna. Las interacciones químicas de la fase móvil y la muestra,
con la columna, determinan el grado de migración y separación de los componentes
contenidos en la muestra. La fase móvil puede ser alterada en orden para la
manipulación
de
las
interacciones
(http://www.pharm.uky.edu).
de
la
muestra
y
la
fase
estacionaria
Figura 9. Cromatograma de la muestra con los picos con y sin interferencias. A).
Cromatograma donde se observan los picos de triptófano y tirosina con
interferencia. B) Cromatograma de los picos sin interferencia.
En base al procedimiento propuesto por Landry y Delhaye (1992) se seleccionó una
fase móvil compuesta por acetato de sodio y metanol (80:20). Para determinar la
concentración de la fase, a la que los picos se observan más resueltos, se realizó un
ensayo con tres concentraciones diferentes (40, 70 y 100 mM) sin modificar la relación
de componentes de la fase móvil. En la figura 10 se observa el efecto de la
concentración de la fase móvil en los picos cromatográficos, donde a una
concentración de 40 mM los picos eluyen a un menor tiempo de retención debido a
una mayor afinidad de los analitos por la fase móvil (tabla 16). En base a lo anterior se
decidió trabajar con una fase móvil de acetato de sodio 40 mM:metanol. Yust et al,
(2004) analizaron triptófano y tirosina en semillas utilizando una fase móvil de acetato
de sodio 25 mM y obtuvieron que triptófano eluyó a los 6.1 min, mientras que tirosina a
los 2.9 min. Por otro lado Landry y Delhaye, (1992), utilizaron una fase móvil 70 mM
de acetato de sodio/metanol (80:20) en el análisis de triptófano en alimentos, teniendo
un tiempo de retención de 2.77 min. Los tiempos de retención obtenidos por estos
autores son menores a los obtenidos en este trabajo. En contraste, Alegría et al.,
(1996) reportan un tiempo de retención de triptófano, en leche de fórmula, de 27.315
min a una concentración de 34 mM de acetato de sodio en la fase móvil, mientras que
a una concentración de 17 mM el tiempo de retención fue de 25.769 min. Al igual que
en la presente investigación los tiempos de retención para triptófano y tirosina
aumentaron conforme se incrementó la concentración de acetato de sodio en la fase
móvil (cuadro 5).
Cuadro 5. Tiempo de retención (TR) de triptófano y tirosina obtenidos a diferentes
concentraciones de acetato de sodio en la fase móvil.
Tiempo de
retención (min)
Concentración de
acetato de sodio en la
fase móvil
triptófano
tirosina
40 mM
8.323
4.269
70 mM
10.228
5.494
100 mM
10.708
5.537
4.4.2. pH de la fase móvil
Para determinar el pH óptimo al cual los picos de triptófano y tirosina se obtuvieron
mejor resueltos fue necesario realizar ensayos para comparar el efecto del pH del
eluyente, el cual estuvo constituido de acetato de sodio 40 mM:metanol ajustado a 2
diferentes pH (4.5 y 5.0) en una proporción de 80:20 v/v y una temperatura de 26 ºC.
Como puede observarse en la figura 11, en el ensayo realizados a un pH de 4.5 los
picos cromatográficos eluyen en menos tiempo, es decir, el tiempo de retención (4.335
min para tirosina y 8.323 min para triptófano) es menor que a pH 5.0 (5.503 min para
tirosina y 10.804 min para triptófano). Por lo anterior, el pH óptimo determinado para la
elusión de triptófano y tirosina fue de 4.5. Mientras que Alegría et al., (1996) reportan
que a pH 6 el tiempo de retención de triptófano de 46.260 min y a pH 6.8 de 27.315
min. Yust et al., (2004) utilizan un pH de 6.1 teniendo un tiempo de retención de 2.9
min para tirosina y 6.0 min para triptófano. Por otro lado, Landry y Delhaye, (1992)
utilizan una fase móvil de acetato de sodio a pH 4.5 y obtuvieron un tiempo de
retención de triptófano de 2.77 min, mientras que la misma fase móvil a pH 3.0 el
tiempo de retención del triptófano fue de 2.81 min.
El pH de la fase móvil es un parámetro importante para la optimización cuando se
separan compuestos que pueden formar iones, como en el caso de los aminoácidos.
Las variaciones en el pH pueden fácilmente permitir importantes variaciones en la
selectividad por que el grado de ionización del soluto, fase estacionaria y componentes
de la fase móvil pueden afectarse por el pH (Skoog et al., 2000).
4.4.3. Temperatura de la columna
Para determinar el efecto de la temperatura de la columna en la resolución de los
picos de triptófano y tirosina se estudió el efecto de tres diferentes temperaturas: 26,
30 y 34 ºC, utilizando la fase móvil compuesta por acetato de sodio:metanol 40 mM
80:20 v/v, a pH 4.5. Los resultados del ensayo muestran que la mejor resolución se
logra a 26 ºC. Como se observa en el cuadro 6, conforme a aumenta la temperatura
menor es el tiempo de retención y por lo tanto los picos tienden a pegarse o verse
menos resueltos. Lo anterior se observa claramente en el cromatograma C de la figura
12, debido a que se utiliza la mayor temperatura (34 ºC) el tiempo de retención de los
aminoácidos disminuye y eluyen más rápido, ya que a mayor temperatura disminuye la
viscosidad de la fase móvil y tiende a eluir más rápido; esto
ocasiona que,
especialmente el triptófano, eluya en un tiempo en el cual no está programada la
longitud de onda óptima para su detección (280 nm de excitación y 348 nm de
emisión), y por lo tanto se observa más pequeño y menos resuelto.
La influencia de la temperatura se ve reflejada en el número de platos teóricos, éste
parámetro mide la eficiencia del sistema cromatográfico y expresa el número de picos
que pueden aparecer por unidad de tiempo. Al aumentar la temperatura disminuyen
los tiempos de retención y si la temperatura desciende los tiempos de retención son
mayores y los picos tienden a ensancharse (Skoog et al., 2000). Debido a lo anterior
se decidió trabajar con una temperatura de 26° C ya que fue la que presentó mayor
resolución de los picos.
Cuadro 6. Tiempos de retención de triptófano y tirosina a diferentes temperaturas,
pH 4.5 y una concentración de acetato de sodio 40 mM.
Tiempo de
retención (min)
Temperatura
de la columna
triptófano
tirosina
26 ºC
8.330
4.259
30 ºC
6.256
3.342
34 ºC
5.999
3.295
En conclusión las condiciones cromatográficas óptimas determinadas para la
identificación y cuantificación de triptófano y tirosina son: temperatura de la columna,
26º C; velocidad de flujo, 0.8 ml/min; pH de la fase móvil, 4.5; y composición de la
fase móvil, 80:20 (v/v) buffer acetato de sodio:metanol.
Figura 10. Cromatogramas del ensayo con 3 diferentes concentraciones
de acetato de sodio de la fase móvil. A) 40 mM, B) 70 mM,
C) 100 mM.
Figura 11. Cromatogramas del ensayo con 2 diferentes pH del acetato de sodio
en la fase móvil. A) pH 4.5, B) pH 5.0.
Figura 12. Cromatogramas del ensayo con 3 diferentes temperaturas
de la columna. A) 26 ºC, B) 30 ºC, C) 34 ºC.
4.5. Validación del método
4.5.1. Linealidad y rango
El cuadro 7 y la figura 13 muestran las concentraciones de los estándares de triptófano
y tirosina. La curva estándar para triptófano fue lineal en el rango de 1.7 y 8.2 µg/ml,
mientras que para la tirosina el rango fue de 0.4848 y 3.3936 µg/ml.
Cuadro 7. Concentraciones de las soluciones estándar.
Patrón
Triptófano
(µg/ml)
Tirosina
(µg/ml)
1
1.1736
0.4848
2
2.3742
0.9696
3
3.5208
1.4544
4
4.6944
1.9392
5
5.8680
2.4242
6
7.0416
2.9088
7
8.2152
3.3936
25000000
Área
20000000
15000000
Tirosina
Triptófano
10000000
5000000
0
0
2
4
6
8
10
Concentración (µg/ml)
Figura 13. Recta de linealidad de los estándares de triptófano y tirosina.
En la curva de regresión y = bx + a, “x” es la concentración, “y” la respuesta, “b” el
valor de la pendiente, y “a” el término independiente. La pendiente “b” se encuentra
relacionada con la sensibilidad del método de forma que a mayor pendiente mayor
sensibilidad (respuesta del método frente a los cambios de concentración del analito).
El término independiente “a” u ordenada en el origen, es la intersección de la recta con
el eje de las ordenadas y es indicativo del error sistemático. De acuerdo a lo anterior, y
según el valor de la pendiente obtenida en ambas curvas de calibración, se observa
que la sensibilidad del método para el triptófano es mayor que para la tirosina (cuadro
8).
El cuadro 8 muestra que los coeficientes de correlación para triptófano y tirosina son
iguales. El coeficiente de correlación indica el grado de relación entre la variable x y la
variable y, su valor máximo es 1. El valor recomendable para el coeficiente de
correlación es ≥ 0.999 aunque en caso de impurezas se admite ≥ 0.990 (SánchezMachado y López-Cervantes, 2004). La linealidad obtenida sugiere que ésta técnica
resulta adecuada para la cuantificación simultánea de triptófano y tirosina.
Cuadro 8. Datos de calibración del método para los patrones de triptófano y tirosina.
Ecuación
Rango (µg/ml)
Coeficiente de correlación
(r2)
Triptófano
y = 2441800x + 129830
1.17-8.21
0.9998
Tirosina
y = 5691000x + 33345
0.48-3.39
0.9998
Aminoácido
4.5.2. Precisión del método para triptófano y tirosina libres
La precisión del método para la determinación de triptófano y tirosina se realizó
efectuando doce ensayos con la misma muestra el mismo día. Los datos fueron
analizados para expresarlos en forma de desviación estándar relativa de las medias
(% RSD). Los resultados sugieren que el método es más preciso para tirosina (RSD =
4.60 %) debido a que su coeficiente de variación es menor que el de triptófano (RSD =
4.83%). En el cuadro 9 se muestra la precisión para los patrones de los dos
aminoácidos.
Kojima et al., (1993) determinaron triptófano libre por HPLC en muestra de suero
humano donde obtuvieron una precisión con 5.1% de RSD, mientras que Sagara et
al., (1988), obtuvieron una precisión con un %RSD de 5.7 en la determinación de
triptófano libre en muestras de plasma humano, estos valores son similares al obtenido
en esta investigación, 4.83% de RSD. Morita et al., (1990) obtuvieron una % RSD de
0.9% en la determinación de triptófano libre en plasma de suero humano, este valor es
menor al obtenido en esta investigación.
Cuadro 9. Precisión del método para los patrones de triptófano y tirosina libres.
Ensayo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Promedio
Triptófano
(µg/g b.s)
Tirosina
(µg/g b.s)
7.85
4.63
7.90
4.78
8.06
4.80
7.62
4.67
7.45
4.54
4.02
4.32
7.03
4.51
7.90
4.67
7.52
4.50
7.32
4.32
7.19
4.15
7.50
4.28
7.50
4.51
0.36
0.20
4.83
4.60
Desviación
estándar
% RSD
En cuanto a tirosina, López-Cervantez et al., (2006), realizaron determinación de
aminoácidos libres, incluyendo tirosina, en hidrolizados de residuos de camarón donde
obtuvieron una precisión con %RSD de 6.7 que es mayor al obtenido en esta
investigación (%RSD = 4.6). Herbert et al., (2000), determinaron tirosina, entre otros
aminoácidos, en mosto y vino, obtuvieron una precisión con un %RSD de 5.3, valor
similar al de este trabajo (%RSD = 4.6).
Además, se realizó la precisión interdías. Adicionalmente al ensayo de precisión del
método se realizaron dos ensayos más. La precisión se realizó mediante el cálculo del
promedio de los datos de 8 mediciones realizadas 3 veces en intervalos de 10 días.
Los resultados se observan en los cuadros 10 y 11.
Cuadro 10. Precisión del método interdías para determinación de triptófano
libre en muestra.
Período
Promedio*
Desviación
estándar
% RSD
10 días
7.04
0.34
4.83
20 días
7.04
0.16
2.29
30 días
6.57
0.08
1.27
Global
7.37
0.15
2.07
* Promedio de 8 repeticiones
Cuadro 11. Precisión del método interdías para determinación de tirosina
libre en muestra.
Período
Promedio*
Desviación
estándar
% RSD
10 días
4.23
0.19
4.60
20 días
4.30
0.12
2.91
30 días
4.18
0.07
1.75
Global
4.55
0.07
1.54
* Promedio de 8 repeticiones
4.5.3. Precisión del método para triptófano y tirosina totales
También se realizó la precisión del método para la cuantificación de triptófano y
tirosina totales en una muestra hidrolizada. La prueba consistió en aplicar el método
de hidrólisis en una misma muestra con un total de 8 mediciones y analizadas por el
método HPLC descrito. Los datos de este ensayo se muestran en el cuadro 12. Se
puede observar que, también en este caso, el método es más preciso para tirosina
que para triptófano.
Ravindran y Bryden (2005), en su determinación de triptófano total en proteínas
obtuvieron una precisión con un %RSD de 3.77 en muestras hidrolizadas con lizosima.
Por otro lado, Alegría et al., (1996) obtuvieron una precisión del método con un %RSD
de 11.5 en la determinación de triptófano total en fórmulas lácteas infantiles. Mientras
que en esta investigación el % de RSD fue de 1.47 para determinación de triptófano
total en hidrolizados proteicos de residuos de camarón, se observa que la precisión fue
mayor en esta investigación.
Por otro lado, Sánchez-Machado et al., (2003), determinaron aminoácidos totales en
muestras de algas comestibles, obtuvieron una precisión con un %RSD de 3.05 para
tirosina, resultando mayor que el obtenido en esta investigación (RSD = 1.14%).
Vielma-Rondon et al., (2003), determinaron aminoácidos totales en harina de lombriz y
obtuvieron una precisión con un %RSD de 1.95, similar al obtenido en este trabajo.
Los factores susceptibles de influir sobre los resultados de un ensayo no pueden ser
siempre controlados (analista, equipo instrumental, reactivos, tiempo, etc.) de aquí la
importancia del estudio de precisión (Sánchez-Machado y López-Cervantes, 2003).
Cuadro 12. Precisión del método para los patrones de triptófano y tirosina
totales en muestra hidrolizada.
Ensayo
1
2
3
4
5
6
7
8
Promedio
Triptófano
(µg/g m.s)
Tirosina
(µg/g m.s)
9.96
5.70
9.84
5.83
10.03
5.78
9.79
5.63
10.18
5.74
10.11
5.64
10.15
5.76
10.14
5.75
10.02
5.74
0.14
0.08
1.47
1.14
Desviación
estándar
% RSD
4.5.4. Límite de detección
El método utilizado para determinar el límite de detección de la tirosina y triptófano
está basado en la relación señal/ruido, es decir el límite de detección es igual a la
concentración del analito que proporciona una señal 3 veces superior al ruido, de
acuerdo con American Chemical Society (ACS, 1980). El límite de detección para la
tirosina es 0.75 pg/ml y para el triptófano es
0.31 pg/ml que son menores a los
presentados en otros trabajos; por ejemplo, Álvarez, et al. (1999), obtuvieron un límite
de detección de 0.8 pg/ml para triptófano en muestras de cerebro de ratón. En otra
investigación realizada por Sagara et al., (1988) obtuvieron una límite de detección de
17.5 pg/ml de triptófano en muestras de plasma humano.
En cuanto a tirosina, en un estudio realizado por López-Cervantes et al., (2006),
obtuvieron un límite de detección de
0.72 pg/ml en hidrolizados de residuos de
camarón. Sánchez-Machado, et al. (2003), obtuvieron una límite de detección para
tirosina de 0.76 pg/ml en muestras de algas comestibles.
4.5.5. Exactitud
La exactitud es expresada como el porcentaje de recuperación en la valoración de una
cantidad conocida añadida de tirosina o de triptófano sobre la muestra. En los ensayos
de recuperación de tirosina y de triptófano libres se realizaron 6 determinaciones sobre
dos concentraciones de cada aminoácido dentro del rango seleccionado. Lo anterior
se realizó adicionando tirosina (1.52 y 4.47 mg/g materia seca) y triptófano (0.62 y 1.83
mg/g materia seca) antes de la extracción y derivatización.
Los ensayos de recuperación de tirosina y de triptófano totales se realizaron en cuatro
determinaciones de una misma muestra previamente adicionada (3.85 y 1.56 mg/g
materia seca de tirosina y triptófano, respectivamente) antes de la hidrólisis alcalina.
Los resultados se muestran en la cuadro 13, donde se observa que los valores de
recuperación
para aminoácidos libres y para aminoácidos totales son adecuados
considerando los posibles efectos de las condiciones de manipulación, extracción y
derivatización sobre la estabilidad, especialmente del triptófano. En otros estudios se
han obtenido valores de recuperación para triptófano de 96.0% en muestras de
lizosima (Ravindran y Bryden, 2004), de 91.4% en muestras de agua (Wu y Tanoue,
2001) y de 100.7% en muestras de suero humano (Sagara et al., 1988). Mientras que
parea tirosina se han obtenido valores de recuperación de 95.6% en muestras de
algas (Shang y Wang, 1996),
de 93.6% en hidrolizados de residuos de camarón
(López-Cervantes et al., 2006).
Cuadro 13. Datos de recuperación de triptófano y tirosina libres y totales.
Recuperación
Aminoácidos
Libres
Tirosina
Nivel I
Nivel II
%
RSD (%)
85.06 ± 6.52*
97.90 ± 1.20
7.67
1.22
Triptófano
Nivel I
Nivel II
93.80 ± 2.60*
98.60 ± 5.90
2.80
6.00
Totales
Tirosina
Triptófano
96.20 ± 3.07*
85.60 ± 5.50
3.19
7.38
* Media ± desviación estándar, n =6
4.6. Aplicabilidad del método
La aplicación del método se llevó a cabo en 5 muestras liofilizadas y 5 muestras
deshidratadas de diferentes ensayos de fermentación de residuos de camarón, tanto
para la determinación de triptófano y tirosina libres como para totales. Se realizaron
mediciones por duplicados bajo las mismas condiciones descritas en el método HPLC.
Los aminoácidos de interés se identificaron por comparación con el patrón de
aminoácidos. En los cuadros 14 y 15 se muestra el contenido de triptófano y tirosina
libres, respectivamente, en muestras liofilizadas y deshidratadas.
Los resultados obtenidos de tirosina totales en este experimento (3.89 mg/g proteína
m.s.) (cuadro 16) no son similares a los obtenidos por Naczk et al., (2004) quienes
determinaron tirosina total, en cangrejo verde, mediante hidrólisis ácida, teniendo
valores de 34.2 a 35.2 mg/g proteína. En cuanto a contenido de triptófano total en esta
investigación se obtuvo un total de 19.48 mg/g proteína en materia seca. Los mismos
autores
determinaron
triptófano
mediante
hidrólisis
ácida
utilizando
ácido
mercaptoetanolsulfónico como protector, obteniendo resultados de 9.3 a 10.4 mg/g
proteína, tales resultados son menores a los obtenidos en este trabajo.
Shahidi y Synowiecki (1993) determinaron triptófano y tirosina totales en muestras
liofilizadas de surimi, donde tirosina fue determinada mediante hidrólisis ácida
obteniendo un valor de 2.85% del total de proteínas, este valor no es similar al
obtenido en este trabajo que fue de 0.93% de tirosina del total de proteína, para
muestra liofilizada. En cuanto a triptófano, estos autores lo determinaron mediante
hidrólisis ácida utilizando ácido mercaptoetanolsulfónico como protector obteniendo un
resultado de 1.20% del total de proteína, este valor tampoco es similar al obtenido en
esta investigación el cual fue de 4.67% de triptófano del total de proteína en muestra
liofilizada.
Cuadro 14. Contenido de triptófano libre y total en muestras liofilizadas
y deshidratadas de hidrolizado de residuos de camarón.
Muestra
liofilizada
Promedio*
Muestra
deshidratada
Promedio*
mg/g proteína (m.s.)
Triptófano libre
Triptófano total
11.81
19.64
14.10
19.59
14.90
18.51
15.03
19.75
16.55
19.88
14.48 ± 1.73
19.48 ± 0.54
11.71
13.92
14.15
19.50
14.18
19.86
15.47
19.77
12.27
15.94
13.56 ± 1.54
17.80 ± 2.72
* Media ± desviación estándar, n= 5
En otra investigación realizada por Shahidi et al., (1995) en muestra liofilizada de
hidrolizados de proteínas de peces capelin (Mallotus villosus), se determinó tirosina
mediante
hidrólisis
ácida
y
triptófano
con
hidrólisis
ácida
utilizando
ácido
mercaptoetanolsulfónico como protector. El valor de tirosina obtenida fue de 1.07% del
total de proteína, valor similar al obtenido en este trabajo de 1.20%. Mientras que no
es similar para triptófano, de 3.34% del total de proteína por dichos autores y 4.67% en
este investigación.
Cuadro 15. Contenido de tirosina libre y total en muestras liofilizadas
y deshidratadas de hidrolizado de residuos de camarón.
Muestra
liofilizada
Promedio*
Muestra
deshidratada
Promedio*
mg/g proteína (m.s.)
Tirosina libre
Tirosina total
2.43
3.95
2.31
3.98
2.54
3.96
2.66
3.76
1.98
3.80
2.38 ± 0.26
3.89 ± 0.11
3.68
4.32
3.29
4.75
2.69
4.65
3.08
4.09
3.22
4.63
3.19 ± 0.36
4.49 ± 0.27
* Media ± desviación estándar, n= 5
Toma y Meyers (1975) determinaron contenido de aminoácidos en proteína de
desechos de camarón mediante hidrólisis ácida, teniendo como resultado 21.4 mg de
tirosina por gramo de proteína, valor que no es similar al obtenido en esta
investigación (3.89 mg/g proteína) (cuadro 15). Triptófano se destruyó durante la
hidrólisis, por lo tanto no es reportado.
Heu et al., (2003) determinaron contenido de aminoácidos
en músculo fresco y
subproductos de camarón rosado mediante hidrólisis con HCl 6 M a 110 ºC por 24 h,
reportan un contenido de tirosina de 323 y 205 mg/100 g de proteína en músculo
fresco y subproducto, respectivamente. Valores similares a los obtenidos en este
trabajo, 449.26 mg/100 g de proteína para tirosina total en muestra deshidratada,
mientras que para muestra liofilizada el contenido de tirosina fue de 389.0 mg/100 g de
proteína. Triptófano no fue determinado por estos investigadores.
Los resultados obtenidos de tirosina y triptófano totales en muestra liofilizada (3.89 y
19.48 mg/g proteína m.s., respectivamente) son mayores a los de tirosina y triptófano
libres (2.38 y 14.48 mg/g proteína m.s., respectivamente). Lo mismo sucede con los
resultados obtenidos en muestras deshidratadas donde triptófano y tirosina totales son
mayores que los libres. Esto es debido a que, como es de esperarse, la hidrólisis libera
el triptófano ligado a las proteínas el cual se suma al triptófano libre, resultando en una
mayor cantidad, reflejándose en los resultados obtenidos.
Además de lo anterior se observan diferencias entre el contenido de triptófano y
tirosina, tanto libres como totales, en las muestras liofilizadas y deshidratadas,
resultando estas últimas con mayor contenido de aminoácidos libres y totales.
Consideramos
que
es
debido
a
que
ambos
aminoácidos
sufren
cierta
desnaturalización durante el liofilizado.
En la figura 14 se muestran los cromatogramas típicos del hidrolizado proteico
obtenidos de la fermentación láctica de residuos de camarón para la cuantificación de
triptófano y tirosina libres y totales. Como se observa, los picos del cromatograma B,
que corresponde a la muestra hidrolizada, son más grandes que los del cromatograma
A, analizados en las mismas condiciones: con una fase móvil compuesta de buffer de
acetato de sodio 40 mM: metanol (80:20 v/v), con una velocidad de flujo de 0.8 ml/min,
temperatura de columna 26 °C, detectados por fluorescencia.
Figura 14. Cromatograma típico para la cuantificación simultánea de triptófano y
tirosina. A) libres, B) totales.
V. CONCLUSIONES
•
En este trabajo se logró desarrollar un método para la preparación de
muestras de hidrolizado proteico obtenido de fermentación láctica de residuos
de camarón, para la determinación simultánea de triptófano y tirosina libres y
totales.
•
Por otro lado se llegaron a las condiciones cromatográficas óptimas para la
determinación simultánea de estos dos aminoácidos. Una fase móvil de
acetato de sodio en una columna C18 de fase reversa, permitieron la
separación más satisfactoria de ambos aminoácidos utilizando un detector de
fluorescencia a diferentes longitudes de onda.
•
Se logró la cuantificación satisfactoria de triptófano y tirosina sin utilizar
derivatización.
•
El método tiene características satisfactorias con respecto a precisión,
linealidad y recuperación.
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