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Esc. Técnica ORT
GUIA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
LABORATORIO III
Determinación de proteínas - Biuret
OBJETIVOS:
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Realizar una curva de calibración con la solución patrón de proteína.
Determinar el contenido de proteínas solubles presentes en una muestra incógnita utilizando
la técnica de Biuret.
INTRODUCCIÓN:
El método de Biuret es una de las técnicas más sencillas para la determinación de proteínas solubles.
Las sustancias que contienen dos o más enlaces peptídicos forman un complejo púrpura-violeta con
sales de cobre (II) alcalinas. Es posible que el color se desarrolle por la formación de un ion
coordinado, tetra cúprico, con dos grupos amidas adyacentes. El desarrollo del color es diferente para
cada proteína, y su intensidad se puede determinar espectroscópicamente a 540nm. La cuantificación
de la proteína se lleva a cabo con una curva patrón, utilizando el principio de la ley de Lambert – Beer
MATERIALES:
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Espectrofotómetro
Cubetas/tubos de espectrofotómetro para muestras
Solución patrón de proteína: disolución alcalina de gelatina disecada 2 % p/v
Reactivo de Biuret
Disolución de tartrato alcalino
Pipetas 10ml; 5ml; 2ml
Vasos de precipitados
Tubos de ensayo
Gradilla
Pro pipetas
Pipetas Pasteur.
PROCEDIMIENTO:
1. Conectar el espectrofotómetro y encenderlo por lo menos 15 minutos antes de comenzar las
mediciones. De forma tal que el equipo se encuentre estabilizado al iniciar el práctico;
siguiendo las instrucciones del ayudante ajustar cada equipo llevando a 0 de Transmitancia.
2. Preparar 6 tubos donde prepararán las soluciones de la curva de calibración y 1 o más tubos
para las muestras incógnitas.
3. Utilizando las pipetas adecuadas preparar, con la solución patrón de concentración 2% p/v de
proteína; la dilución de tartrato alcalino y el reactivo de Biuret, las diluciones de acuerdo a la
siguiente tabla:
Prof. Ana Carolina Cappella
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GTP TEC-03
2014
Esc. Técnica ORT
GUIA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
LABORATORIO III
Determinación de proteínas- Biuret
Tubo
Disolución patrón
de proteína (ml)
Disolución de tartrato
alcalino (ml)
Reactivo de
Biuret (ml)
1
0,00
5,00
5,00
2
0,25
4,75
5,00
3
0,50
4,50
5,00
4
1,00
4,00
5,00
5
1,50
3,50
5,00
6
2,00
3,00
5,00
Concentración de
proteína (g/l)
GTP TEC-03
2014
Absorbancia
4. Preparación de la muestra incógnita:
a. Tomar alícuotas de 1ml de las disoluciones incógnitas y colocarlas en tubos de
ensayo previamente rotulados.
b. Agregar a cada tubo de ensayo 4ml de la disolución de tartrato alcalino y 5ml del
reactivo de Biuret
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Homogeneizar el contenido de cada tubo.
Incubar durante 10 minutos a 37°C
Las mediciones se realizarán a una λ= 540nm. Comenzar haciendo la lectura del blanco.
Continuar con las lecturas del resto de las diluciones de la curva
Medir y anotar la absorbancia de cada muestra incógnita.
Construir la curva de calibración: Absorbancia en función de la concentración de proteína
(g/l). Calcular el coeficiente de calibración.
Una vez establecida la ecuación de la curva de calibración y el coeficiente, determinar la
concentración de proteína en las muestras incógnitas teniendo en cuenta los factores de dilución.
RESULTADOS:
1. Graficar la curva de calibración indicando la ecuación de la recta y el coeficiente.
2. Indicar en el gráfico la medida de la absorbancia de la muestra incógnita y calcular la
concentración de proteínas en las muestras.
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